SK179497A3 - Method for producing recombinant polypeptides or proteins and a food product containing them - Google Patents
Method for producing recombinant polypeptides or proteins and a food product containing them Download PDFInfo
- Publication number
- SK179497A3 SK179497A3 SK1794-97A SK179497A SK179497A3 SK 179497 A3 SK179497 A3 SK 179497A3 SK 179497 A SK179497 A SK 179497A SK 179497 A3 SK179497 A3 SK 179497A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- afp
- sequence
- protein
- product
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 81
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 87
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 60
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title claims description 53
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 31
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 56
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 37
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 101710123134 Ice-binding protein Proteins 0.000 claims description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 12
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 claims description 9
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 claims description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 235000012465 frozen bakery product Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000012470 frozen dough Nutrition 0.000 claims description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 5
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 174
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 62
- 239000000047 product Substances 0.000 description 49
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 25
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 24
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 23
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 23
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 20
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 18
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 16
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 16
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 13
- 241000269907 Pleuronectes platessa Species 0.000 description 13
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 241000269785 Zoarces americanus Species 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000269858 Anarhichas lupus Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- BTGMTHBOODBMHN-SUHMBNCMSA-N N-[3-[1-[[(3S)-2-hydroxy-5-oxooxolan-3-yl]carbamoyl]cyclopropyl]-2,4-dioxo-1-propan-2-ylpyrimidin-5-yl]-2-methyl-4-(naphthalen-2-ylamino)benzamide Chemical compound CC(C)n1cc(NC(=O)c2ccc(Nc3ccc4ccccc4c3)cc2C)c(=O)n(c1=O)C1(CC1)C(=O)N[C@H]1CC(=O)OC1O BTGMTHBOODBMHN-SUHMBNCMSA-N 0.000 description 1
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000287462 Phalacrocorax carbo Species 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000961042 Pseudopleuronectes americanus Ice-structuring protein A Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- PHMHDRYYFAYWEG-UHFFFAOYSA-N Rhapontigenin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C=CC1=CC(O)=CC(O)=C1 PHMHDRYYFAYWEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108010031299 Type III Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 101150055123 afp gene Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003653 coastal water Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- -1 during regrowth Chemical compound 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000007914 freezing tolerance Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108010063431 methionyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
- A23G9/00—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor
- A23G9/32—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
- A23G9/38—Frozen sweets, e.g. ice confectionery, ice-cream; Mixtures therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Freezing, Cooling And Drying Of Foods (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka expresie peptidu proti zamrznutiu z morských rýb v potravinárskom organizme a jej použitia v potravinárskych výrobkoch.
Doterajší stav techniky
Krv polárnych rýb je chránená pred zamrznutím prítomnosťou peptidov proti zamrznutiu. Tieto peptidy proti zamrznutiu sa môžu klasifikovať do štyroch typov podľa ich štruktúr (Davies a Hew, 1990). AFP (antifreeze peptide) typu I sú bohaté na alanín s pravidelne od seba vzdialenými treonínovými a asparagínovými zvyškami a majú konformáciu a-skrutkovice. AFP typu II majú charakteristicky vysoký obsah (8 %) cysteínu. AFP typu III sú, malé (dlhé približne 64 aminokyselín) , globulárne peptidy. Posledná skupina, glykoproteíny proti zamrznutiu, má opakovaný tripeptidový motív, na ktorý je naviazaný špecifický disacharid. Všetky tieto peptidy majú vlastnosť nekoligatívneho zníženia bodu mrazu a inhibície rastu kryštálov ľadu. Tieto znaky môžu nájsť uplatnenie pri zmene stavu kryštálov ľadu v mrazených výrobkoch. Keďže je nepravdepodobné, že by sa izolácia týchto peptidov čistením z krvi rýb vôbec niekedy stala ekonomicky životaschopným procesom, hľadal sa spôsob hromadnej produkcie AFP s použitím modernej biotechnológie.
Prvé práce o produkcii peptidov proti zamrznutiu mikroorganizmami sa sústredili na expresiu AFP typu I aj v kvasinkách, aj v Escherichia coli (Varren a spol., 1993, McKown a spol., 1991). Keďže E. coli je schopná produkovať toxíny, táto baktéria sa vo všeobecnosti nepovažuje za bezpečnú (GRAS - generally regarded as safe), ktorá spôsobuje problémy pri jej použití na produkciu AFP, určených na použitie v potravinárskom priemysle.
- 2 Sú známe kvasinkové kmene, ako Saccharomyces cerevisiae, ktoré sa považujú za GRAS organizmy a na rozdiel od E. coli majú schopnosť vylučovať heterológne proteíny do rastového média, čo uľahčuje ďalšie spracovanie produktu. Kvasinka je preto atraktívnym hostiteľským organizmom na produkciu radu heterológnych proteínov (Romanos a spol., 1992).
Prvé správy o produkcii AFP v kvasinkách sa týkajú medzibunkovej akumulácie fúzie syntetického AFP typu I so skráteným proteínom A zo Staphylococcus aureus (Varren a spol., 1993). Tvrdilo sa, že tento peptid chráni kvasinku pred škodlivými účinkami mrazenia. Nie je opísaná žiadna mimobunková produkcia AFP typu I ako taká. Nič sa neuvádza, čo sa týka iných typov AFP.
V tomto laboratóriu sa skonštruovali kvasinkové transformanty, nesúce vektor expresie, obsahujúci syntetický gén pre prírodný AFP typu I (HPLC6) platesy zimnej (Driedonks a spol., 1995) a toto je opísané v prihlasovateľovej PCT prihláške VO 94/03617, teraz zrušenej. Vylučovanie účinného monoméru AFP týmito kvasinkami sa nedalo demonštrovať, Jedi ným spôsobom, ako dosiahnuť významnú účinnosť inhibície rekryštalizácie ľadu, bolo uskutočniť expresiu multimérov AFP typu I, určených na umožnenie ich následného spracovania endogénnou kvasinkovou proteázou, aby sa získali účiné monoméry (Driedonks a spol., 1995). Tento prístup, hoci nakoniec umožňuje produkciu účinného AFP typu I, vyústil do vylučovania čiastočne spracovaných heterogénnych foriem multimérnych AFP. Následné spracovanie na získanie účinného peptidu ako monoméru sa považovalo za neprijateľné na účely priemyselnej výroby. Okrem mimoriadnej námahy a nákladov by takéto pridanie mohlo tiež viesť k problémom pri získavaní povolenia na použitie v potravinách. To po prvé v dôsledku použitia chemikálií, aby sa získali účinné monoméry, a po druhé v dôsledku expresie neprírodných sekvencií.
Preto sa zdalo byť nemožným použiť potravinársky organizmus na expresiu a vylučovanie účinného monomérneho AFP jednoduchým a účinným spôsobom, ktorý by poskytoval priemyselne prijateľný proces, použiteľný pri výrobe potravín.
Pokúšajúc sa vyhnúť problémom, ktoré prináša expresia AFP typu I v kvasinkách, pokúsili sme sa uskutočniť expresiu AFP typu III zo sliznáča amerického v kvasinkách. AFP typu III sú malé globulárne proteíny a domnievali sme sa, že na tento účel by mohli byť vhodnejšie na expresiu v kvasinkách než a-skrutkovicový AFP typu I.
AFP typu III sa nachádzajú v krvi polárnych rýb, ako je sliznáč americký (Macrozoarces americanus) a vlkouš severný (Davies a Hew, 1990). Uvádza sa, že frakcionácia krvi sliznáča amerického odhaľuje prítomnosť najmenej 12 rôznych druhov AFP typu III (Obr. 1, Hew a spol., 1984, Davies a Hew, 1990). Tieto peptidy sú vysoko homologické, zdieľajúc najmenej 60 % aminokyselinovej identity, a mutagenéza in vitro demonštrovala skupinu povrchových zvyškov, spoločnú pre všetky druhy AFP sliznáča amerického, ktoré sú potrebné na naviazanie na ľad (Chao a spol., 1994). Ukazuje sa, že záporný náboj kyseliny glutamínovej (Glu) v polohách 23 a 36 sa podieľa na termickej stabilite a termickej hysteréznej účinnosti polypeptidu (Li ä spol., 1991). Zdá sa, že asparagín (Asn) v polohe 14, treonín (Thr) v polohe 18 a glutamín (Gin) v polohe 44, nasledujúce tri zachované aminokyseliny, sú tiež kľúčovými zvyškami v účinnosti viazania AFP-III na ľad (Chao a spol., 1994).
Podarilo sa nám uskutočniť expresiu HPLC-1 variantu AFP typu III sliznáča amerického v kvasinkách, ale nepodarilo sa nám dosiahnuť vylučovanie dostatočne účinného monoméru AFP typu III. Toto zjavne nevyriešilo vyššie uvedené problémy.
Okrem toho sme zistili, že HPLC-1 AFP typu III, vyprodukovaný kvasinkami, vykazoval neočakávane nízku špecifickú účinnosť v porovnaní s AFP prípravkami, izolovanými z krvi sliznáča amerického. Táto nízka účinnosť by mohla byť spôsobená nesprávnym zbaľovaním peptidu alebo inherentne nízkou špecifickou účinnosťou HPLC-1 variantu. Pokračovanie v tomto smere výskumu na produkciu účinnejších AFP než tých, ktoré sa zistili v platese zimnej, určite nevyzeralo sľubne.
Tiež sme frakcionovali AFP, získané z krvi sliznáča amerického, do rôznych HPLC frakcií a analyzovali ich re kryštalizačnú aktivitu, aby sme sa presvedčili, ktorá iná frakcia než HPLC-1 by potenciálne mohla byť užitočná pre naše požadované použitie. HPLC-12 sa ukázal byť jedinou frakciou z 12 frakcií AFP typu III, ktorá bola účinná pri inhibícii rekryštalizácie pri testovaných koncentráciách. Zistili sme teda, že HPLC-12 by mohol byť zaujímavý, keby sme dokázali vyriešiť problémy pri jeho rekombinantnej produkcii, ktoré sa zistili pre AFP typu I a HPLC-1 AFP typu III.
Z hľadiska vyššie uvedených pokusov aj s AFP typu I, aj s AFP typu III sa celkom neočakávane zistilo, že expresia nukleovej kyseliny v kvasinkách, kódujúca aminokyselinovú sekvenciu, stanovenú pre HPLC-12 AFP typu III, vedie k produktu, ktorý sa expresuje a vylučuje ako monomér a nevykazuje zníženú účinnosť. Bol teda k dispozícii pozoruhodne vhodný spôsob produkcie s použitím technológie rekombinantnej DNA na výrobu čistého, účinného AFP.
Ďalej bolo zistené, že rekombinantný HPLC-12, vylučovaný kvasinkami ako monomér, môže ako taký vykazovať vysokú účinnosť peptidov proti zamrznutiu· zmesi AFP, izolovanej z krvi sliznáča amerického. Táto účinnosť proti zamrznutiu je takmer dvojnásobná voči účinnosti AFP typu I z platesy zimnej. Naviac tento produkt je oveľa účinnejší v rekryštalizačných štúdiách a oveľa vhodnejší na požadované použitie než iné AFP.
Aminokyselinové zloženie, sekvencie a nukleotidové sekvencie rôznych AFP typu III, vyskytujúcich sa v prírode, už boli známe. Davies a Hew (1990) uvádzajú ich prehľad a odkazujú na články Li a spol. z r. 1985 a Hewa a spol. z ,r. 1988, pokiaľ ide o sekvencie HPLC-1, 4, 5 až 7, 9, 11 a 12, ako boli stanovené pre sliznáča amerického na základe cDNA klonov genómovej DNA ryby vo fágoch. V Protein Science v r. 1994 Chao H. a spol. opisujú, ako sa synteticky syntetizuje a expresuje izoforma HPLC-12 AFP typu III v E. coli pre dvojrozmerné NMR štúdie, aby sa napomohlo pochopenie vzťahov štruktúra/funkcia v proteínoch proti zamrznutiu a aby sa definovali motívy na viazanie ľadu. Nukleová kyselina potom mutuje, aby sa vyprodukoval mutovaný polypeptid AFP typu
III, pričom uvedenými mutantami sú prolinové mutanty. Hodnota termickej hysterézie nemutovaného rekombinantného HPLC-12 sa porovnala s AFP, izolovaným zo sliznáča amerického, t.j. AFP typu III. Aktivitné profily boli opísané ako nerozlíšiteľné v rámci štandardných odchýliek. Neuvádza sa žiadne porovnanie s inými typmi AFP. Neuvádza sa žiadny náznak abnormálne vysokej hodnoty termickej hysterézie, v skutočnosti nie je uvedená vôbec žiadna hodnota. Nič sa neuvádza s ohľadom na akýkoľvek účinok na rekryštalizačné vlastnosti. Zdôrazňujeme, že účinky na termickú hysteréziu nesúvisia s rekryštalizačnými vlastnosťami. Hodnoty termickej hysterézie vypovedajú o sile väzby a nedávajú mieru účinnosti proti zamrznutiu ako rekryštalizačná štúdia. Sú známe príklady proteínov, ktoré vykazujú vysoké hodnoty hysterézie, ale žiadny účinok na rekryštalizáciu a vice verša, čo ilustruje neprítomnosť korelácie.
Vysoká AFP účinnosť rekombinantného HPLC-12 bola úplne neočakávaná vzhľadom na výsledky, získané pre rekombinantný HPLC-1,. a vzhľadom na to, čo bolo napísané v publikáciách, týkajúcich sa AFP. Hodnoty termickej hysterézie frakcií AFP typu III, ako sa získali na Sephadex stĺpci frakcionáciou AFP typu III zo sliznáča amerického, získaných z krvi, sú uvedené v článku Hewa a spol., 1984, v tabuľke 1, ako aj hodnoty pre AFP z platesy (= typ I) a AFP z kormorána veľkého (= typ II). Tieto hodnoty sa stanovili pre frakcie, získané z krvi príslušných druhov, nie pomocou technológie rekombinantnej DNA. Ukázalo sa, že sú len malé rozdiely v účinnostiach medzi AFP, pričom najúčinnejší je QAE-A. QAE-A bol jedným z 5 rôznych variantov, ktoré sa dali oddeliť na QAE Sephadex stĺpci, a neskôr sa ukázalo, že je odvodený od HPLC-12. Avšak rozdiely sú opísané ako také malé, že spadajú do rámca odchýliek v dôsledku chýb merania. Rozdiely v hodnotách termickej hysterézie Hew a spol. sami jasne odmietli v tom istom článku ako irelevantné. Tvrdia, že Väčšina AFP zo sliznáča amerického vykazovala termickú hysteréziu, porovnateľnú s hysteréziou, zistenou pre iné známe AFGP a AFP. V neskoršej literatúre sa neuvádzajú žiadne hodnoty termickej hysterézie pre rôzne typy ani porovnania medzi typom I a typom III. Neuvádzajú sa žiadne poznatky ani návrhy, čo sa týka rekryštalizačných účinkov rôznych frakcií. Preto sa nedalo očakávať, že ktorýkoľvek samotný AFP typu III by vykazoval omnoho vyššiu špecifickú účinnosť pre inhibíciu rastu kryštálov ' ľadu než AFP z platesy zimnej. Tiež nebolo opísané ani navrhnuté, že HPLC-12 vykazuje omnoho vyššiu účinnosť než ktorýkoľvek AFP typu I peptid alebo iný AFP typu III peptid.
Na otestovanie, či AFP účinnosť HPLC-12 typu III bude vyššia, sme frakcionovali AFP prípravok zo sliznáča amerického, vytvorený z krvi cez HPLC, a testovali sme jednotlivé peptidové zložky na ich schopnosť inhibovať rast kryštálov ľadu. Zistili sme, že HPLC-12 variant mal najvyššiu špecifickú účinnosť. Ostatné zložky nevykázali detekovateľnú účinnosť pri koncentrácii, ekvivalentnej 100 mg rybieho AFP typu III na ml.
Spôsob prípravy čistého potravinárskeho polypeptidu podľa vynálezu vykazuje AFP účinnosť takmer dvojnásobnú vzhľadom na účinnosť AFP typu I. Pretože sa môže vylučovať ako monomér na rozdiel od AFP typu I, robí ho to ideálnym na výrobu vo veľkom, keďže vyžaduje oveľa menej ďalšieho spracovania než AFP typu I, vyrobený rekombinantnou technológiou. Naviac expresia vo forme monoméru znamená, že sa dá vyrábať produkt, ktorý je takmer totožný s v prírode sa vyskytujúcim peptidom v krvi sliznáča amerického. Takýto produkt ľahšie povolia používať v potravinách λ' dôsledku jeho blízkej podobnosti s v prírode sa vyskytujúcim AFP v prírodnom potravinárskom organizme, v sliznáčovi americkom.
Spôsob podľa vynálezu nám teraz dovoľuje vyrábať po prvý raz vo veľkom, s nízkymi nákladmi a veľmi ľahko rekombinantné AFP typu III HPLC-12 typu, ktoré majú inherentne vyššiu špecifickú účinnosť než AFP typu I z platesy zimnej. Peptidy typu III proti zamrznutiu podľa tohto vynálezu sú najsľubnejšími kandidátmi na použitie v potravinových výrobkoch, ktoré sú určené na zmrazenie, ako je zmrzlina a mrazené cesto a iné mrazené pekárske výrobky, v dôsledku ich vy7 sokých špecifických účinnosti pri inhibicii rekryštalizácie.
Ďalšia výhoda spočíva v skutočnosti, že vylučovanie produktu expresie ako aktívneho peptidu, s výhodou ako monoméru, sa teraz môže uskutočňovať in situ v procese výroby potraviny, čím sa eliminuje potreba pridania AFP ako takého. Teraz sa môže stať možnou výroba fermentačných produktov s použitím kvasinky, schopnej vylučovať polypeptid, v podstate zodpovedajúci HPLC-12 AFP typu III vo fermentačnom procese, pričom sa in situ produkcia polypeptidu, v podstate zodpovedajúceho HPLC-12 AFP typu III, uskutočňuje bez toho, aby vyžadovala prídavné kroky, ako je čistenie polypeptidu a jeho následné pridanie do procesu výroby potraviny. Tiež skvalitnenie rastlín, ovocia alebo zeleniny a transgénnych zvierat alebo ich častí s lepšími vlastnosťami pri zmrazení v dôsledku in situ expresie polypeptidu, v podstate zodpovedajúceho HPLC-12 AFP typu III, je teraz možné.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je spôsob výroby zlepšeného produktu, pričom zlepšenie spočíva v modifikácii procesov rastu kryštálov ľadu, ovplyvňujúcej veľkosť a tvarové charakteristiky ľadu najmä pri opätovnom raste, čím sa napríklad minimalizuje potenciálne poškodenie zmrazením, napríklad zabránením alebo inhibíciou rekryštalizácie ľadu vo výrobku pri zmrazovaní, pričom uvedený spôsob zahrnuje pridanie polypeptidu alebo proteinu s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou sekvencii HPLC-12 AFP typu III, ktorý vykazuje AFP účinnosť vyššiu, než je účinnosť AFP typu I z platesy zimnej, k nezlepšenému produktu alebo k prísade alebo zmesi, normálne používanej pri príprave nezlepšeného produktu, pričom uvedené pridanie rekombinantného polypeptidu alebo proteinu sa uskutočňuje v množstve, dostatočnom na ovplyvnenie rastu kryštálov ľadu. Produktom môže byť potravinársky výrobok alebo biologický materiál. Biologickým materiálom môže byť napríklad zvierací orgán alebo tkanivo alebo rastlinný materiál. Najmä sa môže pridať rekombinantný
- 8 polypeptid. Tento polypeptid bude s výhodou potravinárskeho typu, aby sa poskytol konečný produkt potravinárskeho typu. Spôsob podľa tohto vynálezu, v ktorom je výrobkom potravinársky výrobok, je výhodný. Špecifickým uskutočnením vhodného polypeptidu je kvasinkový AFP, ako je ilustrované v príkladoch. Spôsob výroby podľa tohto vynálezu, zameraný na prípravu zlepšeného výrobku, vykazujúceho zlepšené vlastnosti pri zmrazení, môže vhodne zahrnovať pridanie AFP, získaného v novom spôsobe prípravy polypeptidu, ktorý tiež spadá do rámca tohto vynálezu a je vysvetlený ďalej v opise.
Termín polypeptid alebo proteín s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou sekvencii HPLC-12 AFP typu III zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu rovnakú, ako je aminokyselinová sekvencia HPLC-12, izolovaného zo sliznáča amerického, a tiež zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši jednou alebo dvoma aminokyselinami od známej aminokyselinovej sekvencie, ale stále kóduje polypeptid s tou istou AFP účinnosťou ako prírodný proteín. Mutácie alebo zmeny i
sa nemôžu vyskytovať .v aminokyselinách, o ktorých je známe, že sú podstatné pre účinnosť polypeptidu. Preto sa s výhodou prolínové zvyšky neodstraňujú ani nenahradzujú. Akékoľvek rozdiely v aminokyselinovej sekvencii sú s výhodou tichými mutáciami, v dôsledku čoho sú substitúcie konzervatívnymi substitúciami, ktoré nemenia hydropatický profil polypeptidu a teda sa predpokladá, že neovplyvňujú silne štruktúru a účinnosť polypeptidu, t.j. aminokyselina s hydrofóbnym bočným reťazcom sa s výhodou zamení len za inú aminokyselinu s hydrofóbnym bočným reťazcom a aminokyselina s hydrofilným bočným reťazcom sa s výhodou zamení len za inú aminokyselinu s hydrofilným bočným reťazcom. Aminokyselinová homológia medzi HPLC-12 a HPLC-1 je menšia než 60 %. Možno očakávať, že aminokyselinová sekvencia, vykazujúca homológiu nad 60 %, s výhodou nad 70 % a najvýhodnejšie nad 80 %, bude reprezentatívna pre polypeptid, ktorý vykazuje podobné vlastnosti ako HPLC-12 a teda sa tiež považuje za v podstate zodpovedajúci HPLC-12. Okrem toho polypeptid, kódovaný touto aminokyselinovou sekvenciou, by mal vykazovať prinajmenšom AFP
-J
- 9 * .
účinnosť takú, akú má AFP typu I z platesy zimnej a s výhodou najmenej AFP účinnosť prírodného HPLC-12. AFP účinnosť sa dá stanoviť uskutočnením porovnaní rekryštalizačnými štúdiami s použitím radu zriedení polypeptidu, ktorého účinnosť sa má stanoviť, a rovnakých množstiev a zriedení AFP typu I a/alebo prírodného HPLC-12, získaného z krvi sliznáča amerického. Spôsob, ktorým sa taká rekryštalizačná štúdia dá uskutočniť a vyhodnotiť, je ilustrovaný v príkladoch. Polypeptid, ktorý vykazuje ktorúkoľvek alebo viaceré z vyššie uvedených charakteristík, sa môže považovať za v podstate zodpovedajúci HPLC-12.
Spôsob výroby zlepšeného výrobku, pričom zlepšenie spočíva v zlepšených vlastnostiach v dôsledku modifikácie procesov rastu kryštálov ľadu, ovplyvňujúcej veľkosť a tvarovú charakteristiku ľadu, najmä pri opätovnom raste, čím sa napríklad minimalizuje potenciálne poškodenie mrazením, napríklad zabránením alebo inhibíciou rekryštalizácie ľadu v produkte pri zmrazovaní, pričom uvedený proces zahrnuje pridanie hostiteľského organizmu, schopného expresie potravinárskeho rekombinantného polypeptidu alebo proteínu s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou sekvencii HPLC-12 AFP typu III, k nezlepšenému produktu ako takému alebo k prísade alebo zmesi, normálne používanej pri príprave nezlepšeného produktu a následne podrobenie hostiteľského organizmu podmienkam takým, že nukleotidová sekvencia, kódujúca HPLC-12 AFP typu III, sa expresuje v produkte alebo v prísade alebo zmesi uskutočnením spôsobu prípravy polypeptidu podľa tohto vynálezu, ako je opísaný inde v opise, naviac ku krokom, ktoré sa normálne uskutočnia pri príprave nezlepšeného produktu, tiež spadá do rámca tohto vynálezu. Týmto produktom môže vhodne byť potravinársky výrobok alebo biologický materiál. Biologickým materiálom môže byť napríklad zvierací orgán alebo tkanivo alebo rastlinný materiál. Najmä sa môže pridať rekombinantný polypeptid. Tento polypeptid bude s výhodou potravinárskeho typu, aby sa poskytol konečný produkt potravinárskeho typu. Spôsob, v ktorom je produktom, ktorý sa má zlepšiť, potravinový produkt, je vý hodný. Špecifickým uskutočnením vhodného polypeptidu pre spôsob podľa tohto vynálezu je kvasinkový AFP, ako je ilustrované v príkladoch. Hostiteľský organizmus sa môže alebo zničiť alebo poškodiť v priebehu alebo po procese produkcie, aby sa uvoľnil AFP polypeptid alebo proteín do zmesi alebo prísady produktu alebo do produktu samotného. Takáto deštrukcia alebo poškodenie sa môže uskutočniť viacerými spôsobmi, ktoré sú známe odborníkom v tejto oblasti, pričom sa musí dbať na to, aby sa proces neuskutočnil pri príliš tvrdých podmienkach, aby sa zabránilo strate AFP účinnosti polypeptidu alebo proteínu. Alternatívne sa v procese produkcie môže použiť hostiteľský organizmus, schopný vylučovať AFP polypeptid alebo proteín v prísade alebo zmesi alebo potravinárskom produkte ako takom. Napríklad pekárske kvasnice môžu byť hostiteľským organizmom v procese výroby potravinárskeho produktu, ako je pekársky výrobok. Spôsob výroby sa môže uskutočniť, ako je bežné, pričom jediným rozdielom je pridanie odlišných kvasníc, t·j· kvasníc, obsahujúcich DNA1 štruktúru, umožňujúcu· expresiu a vylučovanie polypeptidu alebo proteínu, v podstate zodpovedajúceho HPLC-12 AFP typu III, v ceste pred alebo počas pečenia, čím sa umožní výroba cesta alebo pečeného výrobku so zlepšenými vlastnosťami pri zmrazení. Analogicky spôsoby, v ktorých sa použijú baktérie, ako sú baktérie mliečneho kvasenia, tvoria vhodné uskutočnenia tohto vynálezu. Spôsoby výroby syrov a jogurtov alebo iné procesy výroby potravín, vyžadujúce fermentáciu, spadajú do typu procesov, krytých týmto vynálezom .
Spôsob výroby na zlepšenie produktov podľa tohto vynálezu sa s výhodou uskutoční bez toho, aby sa požadovalo pridanie proteáz alebo chemikálií po tom, čo sa rekombinantný polypeptid alebo proteín s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou HPLC-12 AFP typu III, expresoval alebo vylúčil, aby sa získal AFP polypeptid alebo proteín ako monomérny produkt.
Použitie polypeptidu alebo proteínu s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou HPLC-12 AFP typu III, v ktoromkoľvek z vyššie opísaných uskutočnení ako prísady v produkte na zlepšenie uvedeného produktu, pričom uvedené zlepšenie spočíva v zlepšených vlastnostiach v dôsledku modifikácie procesov rastu kryštálov ľadu, ovplyvňujúcej veľkosť a tvarovú charakteristiku ľadu, najmä pri opätovnom raste, čím sa napríklad minimalizuje potenciálne poškodenie zmrazením, napríklad zabránením alebo inhibíciou rekryštalizácie ľadu v produkte pri zmrazovaní, pričom uvedené použitie sa uskutoční spôsobom, ktorý je ako taký známy pre AFP, aby sa získala vyššia špecifická účinnosť proti zamrznutiu, než sa dá získať s AFP z platesy zimnej, spadá do rámca tohto vynálezu. Produktom je s výhodou potravinový produkt. Týmto produktom môže byť vhodne biologický materiál. Proteínom alebo polypeptidom môže byť rekombinantný proteín alebo polypeptid.
Výhodným uskutočnením tohto spôsobu alebo použitia na zlepšenie produktov je spôsob alebo použitie, pri ktorom je produktom produkt, určený na zmrazenie. Pre potravinové vý. í robky je vhodným príkladom zmrzlina. Ako sme uviedli vyššie, zaujímavé je tiež cesto a pekárske výrobky.
Potravinárske výrobky, obsahujúce potravinársky rekombinantný polypeptid alebo proteín s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou HPLC-12 AFP typu III, v ktoromkoľvek z vyššie opísaných uskutočnení ako prísadu v potravinárskom výrobku na zlepšenie uvedeného produktu, pričom uvedené zlepšenie spočíva v zlepšených vlastnostiach v dôsledku modifikácie procesov rastu kryštálov ľadu, ovplyvňujúcej veľkosť a tvarové charakteristiky ľadu, najmä pri opätovnom raste, čím sa napríklad minimalizuje potenciálne poškodenie zmrazením, napríklad zabránením alebo inhibíciou rekryštalizácíe ľadu vo výrobku pri zmrazovaní, spadajú do rámca tohto vynálezu. Takýto potravinársky výrobok neobsahuje v prírode sa vyskytujúce jedlé organizmy, ako je sliznáč americký, len obsahuje sekvencie, kódujúce polypeptid alebo proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, zodpovedajúcu aminokyselinovej sekvencii HPLC-12 zo sliznáča amerického vo forme a počte, v akých sa vyskytujú v prírode v sliznáčovi americkom. Vhodnou kategóriou produktov podľa tohto vynálezu sú neživočišne produkty. Inou vhodnou kategóriou je kategória človekom vyrábaných produktov. Rastlinné produkty sú tiež vhodnými príkladmi výrobkov podľa tohto vynálezu. Potravinárske výrobky podľa tohto vynálezu sa dajú získať spôsobom alebo použitím na zlepšenie produktu v ktoromkoľvek z vyššie opísaných uskutočnení.
Konkrétne sa tiež nárokuje potravinový produkt, obsahujúci potravinársky rekombinantný hostiteľský organizmus so zlepšeným znášaním mrazu, pričom uvedené zlepšenie spočíva v zlepšených vlastnostiach v dôsledku modifikácie procesov rastu kryštálov ľadu, ovplyvňujúcej veľkosť a tvarové charakteristiky ľadu, najmä pri opätovnom raste, čím sa napríklad minimalizuje potenciálne poškodenie zmrazením, napríklad zabránením alebo inhibíciou rekryštalizácie ľadu v produkte pri zmrazovaní, pričom uvedený potravinársky hostiteľský organizmus obsahuje a/alebo je obklopený potravinárskym rekombinantným polypeptidom alebo proteínom s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou HPLC-12 AFP typu III, v ktoromkoľvek z vyššie opísaných uskutočnení a/alebo schopný expresie a/alebo vylučovania takého polypeptidu alebo proteínu pred zmrazením.
Takýto rekombinantný, potravinársky, hostiteľský organizmus ďalej tiež spadá do rámca ochrany týmto vynálezom. Tak aj potravinársky, rekombinantný, hostiteľský organizmus, schopný expresie prinajmenšom AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie, pričom uvedená nukleotidová sekvencia sa nachádza v DNA konštrukcii, uvedená DNA konštrukcia nie je prítomná v prírodnom hostiteľskom organizme a uvedená DNA konštrukcia obsahuje v danom poradí (a) silný, voliteľne indukovateľný promótor, účinný v hostiteľskom organizme, (b) ATG štartovací kodón, ktorý môže byť prítomný vo voliteľnej DNA signálnej sekvencii, schopnej vylučovať proteín, vyprodukovaný hostiteľským organizmom počas expresie AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie z (c), uvedenej ďalej, pričom táto signálna sekvencia môže byť homologická alebo heterológna s AFP kódujúcou nukleotidovou sekvenciou a je v čítacom rámci s ATG štartovacím kodónom, (c) najmenej jednu nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu amínokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu, pričom uvedená nukleotidová sekvencia je v čítacom rámci s ATG štartovacím kodónom, a voliteľne (d) stop kodón, viazaný na 3’ koniec AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie.
Vhodné uskutočnenia takéhoto rekombinantného, hostiteľského organizmu sú opísané ďalej v spôsobe prípravy polypeptidu a tieto organizmy sú nárokované ako také.
Vynález sa ďalej zameriava na spôsob prípravy rekombinantných polypeptidov alebo proteínov, vykazujúcich účinnosť pri modifikovaní rastu a tvaru kryštálov ľadu, takzvaných rekombinantných peptidov proti zamrznutiu (AFP), vykazujúcich špecifickú účinnosť proti zamrznutiu vyššiu, než je účinnosť AFP z platesy zimnej,
1) kultiváciou potravinárskeho, hostiteľského organizmu pri podmienkach, pri ktorých sa uskutočňuje alebo indukuje expresia prinajmenšom AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie, pričom uvedená nukleotidová sekvencia sa nachádza v DNA konštrukcii, uvedená DNA konštrukcia nie je prítomná v prírodnom hostiteľskom organizme a uvedená DNA konštrukcia obsahuje v danom poradí (a) silný, voliteľne indukovateľný promótor, účinný v hostiteľskom organizme, (b) ATG štartovací kodón, ktorý môže byť prítomný vo voliteľnej DNA signálnej sekvencii, schopnej vylučovať proteín, vyprodukovaný hostiteľským organizmom počas expresie AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie z (c), uvedenej ďalej, pričom táto signálna sekvencia môže byť homologická alebo heterológna s AFP kódujúcou nukleotidovou sekvenciou a je v čítacom rámci s ATG štartovacím kodónom, (c) najmenej jednu nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu amínokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu, pričom uvedená nukleoti dová sekvencia je v čítacom rámci s ATG štartovacím kodónom, a voliteľne (d) stop kodón, viazaný na 3’ koniec AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie.
Tento spôsob môže ďalej voliteľne zahrnovať odobratie produktu, vytvoreného expresiou z AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie, získaného z nej ďalším spracovaním spôsobom, ktorý je ako taký známy. Aby sa dosiahlo vylučovanie produktu expresie nukleotidovej sekvencie, kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu, DNA konštrukcii môže ďalej obsahovať signálnu sekvenciu pre hostiteľský organizmus, ktorá umožňuje vylučovanie hostiteľom v priebehu kultivácie hostiteľa. Hostiteľským organizmom je s výhodou mikroorganizmus. Vhodnými potravinárskymi mikroorganizmami sú huby, ako sú kvasinky, a baktérie, ako sú baktérie mliečneho kvasenia. Kvasinkové bunky Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis sú príkladmi vhodnej hostiteľskej bunky. Odborník v oblasti fermentačných procesov pri výrobe potravín bude vedieť, ktoré kvasinkové bunky sú vhodné a ktoré systémy na transformáciu a expresiu sú dostupné (Romanos a spol., Campbell a Duffus). Baktérie mliečneho kvasenia Lactobacillus, Streptococcus a Bifidobacterium sú tiež príkladmi vhodných bakteriálnych hostiteľských organizmov, z ktorých sú známe mnohé kmene a pre ktoré existujú vhodné systémy na transformáciu a expresiu, ako vie každý odborník, skúsený v práci s rekombinantnou DNA baktérií, spojených s produkciou mliečnych výrobkov (Gasson, 1993). FDA má zoznam potravinárskych organizmov, ktorý je prístupný pre verejnosť. Odborník v tejto oblasti pozná organizmy, ktoré sa považujú za potravinárske, t.j. majú priznaný štatút GRAS (všeobecne uznané za bezpečné). Konkrétne organizmy, spojené s fermentáciou potravinárskych výrobkov v mliekárenstve, sú vhodné.
Termín nukleotidová sekvencia, kódujúca aminokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu zahrnuje ľubovoľnú nukleotidovú sekven ciu, kódujúcu presne aminokyselinovú sekvenciu prírodného HPLC-12 zo sliznáča amerického. Takáto nukleotidová sekvencia sa môže odlišovať v dôsledku degenerácie genetického kódu, t.j. skutočnosti, že rôzne nukleotidové kodóhy kódujú tú istú aminokyselinu. Okrem toho nukleotidová sekvencia, kódujúca aminokyselinovú sekvenciu, ktorá sa líši jednou alebo dvoma aminokyselinami od známej aminokyselinovej sekvencie, ale stále kóduje polypeptid s tou istou AFP účinnosťou ako prírodný proteín, je tiež zahrnutá do rámca tohto vynálezu. Mutácie alebo rozdiely nesmú byť v aminokyselinách, o ktorých je známe, že sú podstatné pre účinnosť polypeptidu. Preto sa prolínové zvyšky s výhodou neodstraňujú ani nenahradzujú. Akékoľvek rozdiely v aminokyselinovej sekvencii sú s výhodou tichými mutáciami, v dôsledku čoho substitúcie sú konzervatívnymi substitúciami, ktoré nemenia hydropatický profil polypeptidu a teda sa predpokladá, že silne neovplyvňujú štruktúru a účinnosť polypeptidu, t·j- aminokyselina s hydrofóbnym bočným reťazcom sa s výhodou zamení len za inú aminokyselinu s hydrofóbnym bočným reťazcom a aminokyselina s hydrofilným bočným reťazcom sa s výhodou zamení len za inú aminokyselinu s hydrofilným bočným reťazcom. Aminokyselinová homológia medzi HPLC-12 a HPLC-1 je menšia než 60 %. Možno očakávať, že aminokyselinová sekvencia, vykazujúca homológiu nad 60 %, s výhodou nad 70 % a najvýhodnejšie nad 80 %, bude reprezentatívna pre polypeptid, ktorý vykazuje podobné vlastnosti ako HPLC-12, a teda sa tiež bude považovať za v podstate zodpovedajúci HPLC-12. Termín v podstate zodpovedajúca teda zahrnuje nukleotidové sekvencie, kódujúce aminokyselinové sekvencie, ktoré vykazujú viac než 60%-nú homológiu s aminokyselinovou sekvenciou prírodného HPLC-12. Okrem toho polypeptid, kódovaný touto aminokyselinovou sekvenciou, by mal vykazovať prinajmenšom AFP účinnosť takú, akú má AFP typu I z platesy zimnej a s výhodou najmenej AFP účinnosť prírodného HPLC-12. AFP účinnosť sa dá stanoviť uskutočnením porovnaní rekryštalizačnými štúdiami s použitím radu zriedení polypeptidu, ktorého účinnosť sa má stanoviť, a AFP typu I a/alebo prírodného HPLC-12, získaného z krvi sliznáča amerického, v tých istých zriedeniach ako polypeptid, ktorý sa má testovať, t.j. porovnaní tých istých hmotnosť/objem polypeptidu alebo proteínu. Spôsob, ktorým sa taká rekryštalizačná štúdia dá uskutočniť a vyhodnotiť, je ilustrovaný v príkladoch. Polypeptid, ktorý vykazuje ktorúkoľvek alebo viaceré z vyššie uvedených charakteristík, sa môže považovať za v podstate zodpovedajúci HPLC-12.
Vo výhodnom uskutočnení podľa tohto vynálezu sú DNA konštrukcie a podmienky kultivácie hostiteľského organizmu také, že sa vylučuje monomérny polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou, v podstate zodpovedajúcou sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu. DNA konštrukcia teda s výhodou nebude expresovať za sebou dimér alebo multimér aminokyselinovej sekvencie, v podstate zodpovedajúcej sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu. Produkcia dimérov alebo polymérov bude vyžadovať prídavné ďalšie kroky spracovania, alebo môže zabrániť vylučovaniu účinného polypeptidu. DNA konštrukcia preto s výhodou bude obsahovať nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu, v monomérnej forme. Prirodzene, DNA konštrukcia môže obsahovať viaceré kópie nukleotidovej sekvencie, kódujúce aminokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III proteínu, v monomérnej forme za sebou.
Ďalšie výhodné uskutočnenie podľa tohto vynálezu zahrnuje DNA konštrukciu, v ktorej nukleotidová sekvencia, kódujúca aminokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III, obsahuje výhodné kodóny hostiteľského organizmu procesu. To je výhodné z hľadiska skutočnosti, že translačná účinnosť sa zvyšuje, ak sa vyhneme určitým kodónom v konkrétnych hostiteľských organizmoch. Výhodné použitia kodónov v prokaryotoch, v kvasinkách a rastlinách líšia sa od použitia kodónov, zisteného v platese zimnej. Napríklad kodóny GCA, GCG a GCT spolu zodpovedajú za viac než 65 % alanínových kodónov známych génov E. colt, S. cerevisiae a Z. mays, zatiaľ čo zodpovedajú za menej než 25 % alanínových kodónov v rybách, ako je platesa zimná. Podob né je to v prípade treoninových kodónov ACA, ACG a ACT (PCT/US90/02626). Použitie kodónov, ako ich preferujú baktérie mliečneho kvasenia a kvasinky, sa dá odvodiť z literatúry, špecifickej pre tieto skupiny mikroorganizmov. Odborník v oblasti technológie rekombinantnej DNA s týmito konkrétnymi organizmami na expresiu bude vedieť, ktoré kodóny sú výhodné .
Ak je hostiteľským organizmom kvasinka, výhodné uskutočnenie DNA štruktúry bude obsahovať DNA pre-sekvenciu α-párového faktora S. cerevisiae ako signálnu sekvenciu. V ďalšom uskutočnení tiež môže obsahovať pro-sekvenciu α-párového faktora S. cerevisiae medzi touto pre-sekvenciou a AFP kódujúcou nukleotidovou sekvenciou, v dôsledku čoho sú pre-sekvencia, pro-sekvencia a AFP kódujúca nukleotidová sekvencia v tom istom čítacom rámci. Alternatívne, ak je hostiteľským organizmom kvasinka, výhodné uskutočnenie DNA konštrukcie bude obsahovať invertázovú signálnu sekvenciu S. cerevisiae, predchádzajúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje AFP.
Ak je hostiteľským organizmom kvasinka, výhodné uskutočnenie DNA konštrukcie bude obsahovať indukovateľný GAL7 promótor alebo konštitutívny GAPDH promótor Saccharomyces cerevisiae. Pre iné hostiteľské organizmy sú vhodné promótory na včlenenie do DNA konštrukcie dobre známe.
Nasledujúce odkazy na literatúru sú citované ako uvádzajúce príklady možných transformačných systémov alebo ich prvkov: pre kvasinky Campbell a Duffus, pre rastliny PCT/US90/02626 a van Elzen a spol. (1985) a pre zvieratá Hanahan (1988).
Pred týmto podaným vynálezom sa nevyrábal žiadny v podstate izolovaný a vyčistený potravinársky, rekombinantný polypeptid alebo proteín, v podstate ekvivalentný HPLC-12 AFP typu III, vykazujúci takú vysokú AFP účinnosť. Po prvý raz sa vyrobil v podstate izolovaný potravinársky, rekombinantný polypeptid alebo proteín, v podstate ekvivalentný HPLC-12 AFP typu III, vykazujúci AFP účinnosť vyššiu než z platesy zimnej. Vynález pokrýva v podstate čistý a izolovaný rekom binantný, potravinársky polypeptid alebo proteín, vykazujúci zlepšené vlastnosti v dôsledku modifikácie procesov rastu kryštálov ľadu, ovplyvňujúcej veľkosť a tvarové charakteristiky ľadu, najmä pri opätovnom raste, čím sa napríklad minimalizuje potenciálne poškodenie zmrazením, napríklad zabránením alebo inhibíciou rekryštalizácie ľadu pri zmrazovaní, takzvané rekombinantné peptidy proti zamrznutiu (AFP), vykazujúce AFP účinnosť vyššiu, než má rovnaké množstvo AFP typu I z platesy zimnej, pričom uvedený polypeptid alebo proteín má aminokyselinovú sekvenciu, v podstate zodpovedajúcu sekvencii HPLC-12 AFP typu III. Takéto rekombinantné polypeptidy a najmä rekombinantné polypeptidy alebo proteíny, vykazujúce vyššie uvedenú modifikovanú účinnosť, ako je účinnosť inhibície rastu kryštálov ľadu, takzvané rekombinantné peptidy proti zamrznutiu (AFP), vykazujúce špecifickú účinnosť proti zamrznutiu vyššiu než AFP z platesy zimnej, pripravené spôsobom podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich uskutočnení tohto vynálezu, tiež spadajú do rámca tohto vynálezu.
Materiály a metódy
Kmene a podmienky rastu
Na amplifikáciu plazmidov sa použil E. coli kmeň JM109 (endAl, recAl, syrA96, thi, hsdR17, rk, mk+ relAl supE44, Yanish-Perron a spol., 1985). Na transformáciu viacnásobne kopírujúcich integračných plazmidov sa použil 5. cerevisiae kmeň SU50 (MATa, cir°, leu2, his4, canl; Verbakel, 1991). E. coli transformanty sa vybrali na Luria agarové platne, obsahujúce 100 pg ampicilínu/ml; Sambrook a spol. (1989). Kvasinkové kmene sa udržovali na selektívnych YNB-platniach (0,67 % Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokyselín, 2 % glukózy, 2 % agaru), doplnených esenciálnymi aminokyselinami (histidin 20 μg/ml( uracil 20 pg/ml). To isté kvapalné médium sa použilo na pre-kultúry, ktoré rástli 48 hodín pri 30 °C a zriedili sa 1 : 10 v YP médiu (1 % Difco kvasinkový extrakt, 2 % Difco peptón), obsahujúcom 5 % galaktózy na indukovanie GAL7 promótora.
Plazmidy
Relevantné detaily o plazmidoch, obsahujúcich AFP-III, sú uvedené v tabuľke 1.
Transformácia
Transformácia JM109 sa uskutočnila podľa Chunga a spol. (1989) . Transformácia kvasinkových kmeňov sa uskutočnila elektroporáciou, najmä ako opísali Becker a spol. (1991). Transformanty sa opätovne získali na selektívnych YNB-platniach. Odborník v tejto oblasti si bude vedomý toho, že sú možné rôzne transformačné metódy. Alternatívy závisia od organizmu, ktorý sa má transformovať, a sú dobre zdokumentované v rôznych príručkách, ako sú Sambrook a spol. (1989) a Campbell a Duffus (1988).
Molekulovobiologické postupy
Reštrikčné enzýmy a DNA modifikačné enzýmy sa použili tak, ako odporúčal dodávateľ,.
Oligonukleotidy sa syntetizovali na zariadení Applied Biosystems 380A DNA syntetizátor a čistili sa štandardnými postupmi.
Čistenie AFP-III
AFP-III zo sliznáča amerického, Macrozoarces americanus, sa čistil z krvi rýb, ulovených v pobrežných morských vodách Nového Foundlandu. Vzorka AFP-III sa pripravila centrifugáciou zrazeného rybieho séra, ako opísali Hew a spol. (1984).
Katiónovýmenná chromatografia
Katiónovýmenná chromatografia sa uskutočnila na Mono S stĺpci (HR5/5, Pharmacia Biotech) na SMART systéme (Pharmacia Biotech). Pufrom vzorky bolo 10 mM Na2HP04/NaH2P04 (Merck), pH 6,0 a eluovanie sa uskutočnilo s 0 až 0,5 M NaCl (Merck) lineárnym gradientom s prietokom 100 μΐ/min.. Peptidy sa detekovali zariadením μ Peak Monitor (Pharmacia Biotech) pri 214 a 280 nm. Frakcie sa zberali, monitorujúc 214 nm signál s použitím integrovaného SMART systém zberača frakcií, teplota systému sa nastavila na 15 °C.
Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia s reverznými fázami
Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia s reverznými fázami (RP-HPLC) sa uskutočnila s použitím μΡΡΟ C4/C18 SC2.1/10 stĺpca (Pharmacia Biotech) na SMART systéme (Pharmacia Biotech). Vzorka sa naniesla na stĺpec v 0,06%-nej kyseline trifluóroctovej (TFA, Merck) v Milli Q vode (rozpúšťadlo A) a eluovalo sa s použitím 80 % acetonitrilu (Merck), 0,054 % TFA v Milli Q vode (rozpúšťadlo B). Použitý štandardný gradient sa naprogramoval nasledovne: 0 min. 100 % rozpúšťadla A, 5 min. 100 % rozpúšťadla A, 10 min. 65 % rozpúšťadla A, 50 min. 40 % rozpúšťadla A, 55 min. 0 % rozpúšťadla A, 57,5 min.' 0 % rozpúšťadla A a pri 58 min. 100 % rozpúšťadla A s prietokom 100 μΐ/minúlu. Peptidy sa detekovali zariadením μ Peak Monitor (Pharmacia Biotech) pri troch vlnových dĺžkach 214, 256 a 280 nm. Frakcie sa zberali, monitorujúc 214 nm signál s použitím integrovaného SMART systém zberača frakcii, teplota systému sa nastavila na 20 °C.
AFP-III izoformy 1, 2 a 3 sa oddelili pomocou modifikovaného gradientu: 0 min. 100 % rozpúšťadla A, 10 min. 60 % rozpúšťadla A, 35 min. 55 % rozpúšťadla A, 36 min. 45 % rozpúšťadla A, 45 min. 45 % rozpúšťadla A, 46 min. 0 % rozpúšťadla A, 50 min. 0 % rozpúšťadla A, 50,1 min. 100 % rozpúšťadla A a 60 min. 100 % rozpúšťadla A. Pufre a všetky detaily SMART systému sú tie isté ako tie, ktoré sa použili so štandardným gradientom.
Elektroforéza na dodecylsíran sodný-polyakrylamidovom géli % polyakrylamidových Tricine gélov (Novex) sa nanieslo na Xcell bunku pre elektroforézu (Novex) podľa návodu dodávateľa. Pufer vzorky bol od Novex-u a pozostával z 3,0 ml TRIS-HC1 3,0M, 2,4 ml glycerolu, 0,8 g SDS, 1,5 ml 0,1 % Coomassie modrá G, 0,5 ml 0,1%-nej fenolovej červenej a 5 % β-merkaptoetanolu, konečný objem sa nastavil na 10 ml s použitím destilovanej vody (pH = 8,45). Kvapalný pufer bol tiež od Novex-u a obsahoval 12,1 gramov TRIS, 17,9 gramov Tricine a 1 gram SDS v celkovom objeme 1 1 destilovanej vody, pH hodnota bola približne pH 8,3. Gél sa zafarbil s použitím 10 % Coomassie Brilliant modrej R250 (Bio-Rad), rozpustenej v roztoku 40 % etanolu (Merck), 10 % kyseliny octovej (Merck) a 50 % destilovanej vody, tento roztok sa zohrieval v mikrovlnovej rúre 45 sekúnd, potom sa gély farbili 15 minút na rotačnej miešačke. Gély sa odfarbili roztokom 10 % etanolu (Merck), 7,5 % kyseliny octovej (Merck) a 82,5 % destilovanej vody. V prípade stanovovania molekulovej hmotnosti sa použili predfarbené značkovače MARK12 (Novex).
Vesternový prenos
I ’ k
Novex Tricine gély sa preniesli s použitím trans-prenosového média (Bio-Rad) na westernový transprenosový modul (Novex) podľa protokolu dodávateľa. Po prenose sa membrána zablokovala 5 % odstredeného mlieka v 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, a potom sa inkubovalo v 1 % odstredeného mlieka v 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 0,1 % Tween 20, pH 7,4 a monoklonálnom antisére proti peptidom proti zamrznutiu zo sliznáča amerického. Získali sa dve rôzne protilátky (dary od M.M. Gáni, Unilevel Research, Colworth House Laboratory), jedna na stanovenie S skupín a druhá na stanovenie Q skupiny. Inkubácia sa uskutočnila cez noc pri teplote miestnosti za mierneho miešania. Neabsorbované protilátky sa odstránili premytím inkubačným pufrom (3x5 min.). Membrána sa inkubovala s druhou protilátkou (kozí antimyší IgG (H + L), konjugát alkalickej fosfatázy; BioRad, Richmond) 2 hodiny pri teplote miestnosti. Enzým sa získal s použitím BCIP/NBT.
- 22 Tryptické trávenie
Na trávenie trypsínom sa vzorka rozpustila v 0,1 M NH4HCO3 pufri s pH 8,3. Trypsín (spracovaný TPCK, Vorthington, Millipore Corporation) sa pridal v pomere enzým : substrát 1 : 100. Po 30 minútach sa skontrolovalo. pH a ešte raz sa pridalo to isté množstvo trypsinu. Inkubácia sa uskutočnila cez noc pri 37 °C. Trávenie sa zastavilo pridaním TFA, aby sa dosiahla hodnota pH 2. Peptidy sa oddelili pomocou RP-HPLC na SMART systéme (Pharmacia).
Analýza sekvencie N-terminálnych aminokyselín
Analýza sekvencie N-terminálnych aminokyselín sa uskutočnila na zariadení LF 3000 Protein Sequencer (Beckman) podľa protokolu dodávateľa. PTH-deriváty aminokyselín sa analyzovali na automatizovanom RP-HPLC systéme, systém Gold (Beckman).
Stanovenie proteínov analýzami aminokyselín
AFP-III vzorky sa hydrolyzovali v 6 M HC1, obsahujúcej 1 % fenolu, vo vákuu pri 110 °C 24 hodín a potom sa vysuši- li. Analýzy sa uskutočnili na aminokyselinovom analyzátore Alpha plus radu 2 (Pharmacia Biotech) s použitím protokolu dodávateľa.
Rekryštalizačné štúdie
Vzorky, ktoré sa mali testovať na AFP-III účinnosť, sa zmiešali so sacharózovým práškom, aby vznikol 30% (objem.) sacharózový roztok. Časť tohto roztoku sa umiestnila na podložné sklíčko mikroskopu, prikryla sa krycím sklíčkom, aby sa zabránilo odparovaniu, a uložila na chladiaci stolček Linkám THMS, pripojila sa na Linkám CS 196 chladiaci systém a riadila sa riadiacim prístrojom Linkám TMS 91. Tento roztok sa prudko ochladil na -40 °C (δ 99 °C/min.) a potom sa zahrial na -6 °C. Rast kryštálov ľadu sa sledoval mikroskopicky v priebehu 30 minútovej inkubácie pri -6 °C.
Na štúdiu s HPLC čistenými peptidmi sa vzorky z RP-HPLC stĺpca, obsahujúce vyčistené AFP-III izoformy, dvakrát sušili v zariadení Speed Vac Concentrator (Savant) po jednom rehydratačnom kroku v Milli Q vode. Po druhom kroku sušenia sa vzorky solubilizovali v 100 μΐ Milli Q vody a pH sa skontrolovalo, aby sa získala istota, že všetok TFA sa z RP-HPLC pufrovacieho systému odstránil. Vzorky sa zriedili na hodnotu absorbancie 0,700 pre lambda = 214 nm, čo je ekvivalentné približne roztoku 0,1 μβ/πιΐ rybieho AFP-III. Aby sa zaručilo, že vzorky obsahovali rovnaké množstvo AFP-III, neskôr sa kontrolovali aminokyselinovou analýzou. Keď sa použili vyčistené vzorky, AFP-III izoformy, ich čistota sa kontrolovala analýzou sekvencie N-terminálnych aminokyselín .
Fed-batch fermentácia
Očkovací postup: kultúra príslušného transformantu rástla v 25 ml minimálneho média a kultivovala sa cez noc pri 30 ’C a 300 ot./min.. Kultúra sa potom preniesla do 1000 ml trepacej fľaše, obsahujúcej 500 ml YP, obsahujúceho 2 % glukózy, a kultivovala sa cez noc pri 30 °C a 300 ot./min.. Táto kultúra sa použila ako očkovacia látka pre fed-batch experiment.
Použilo sa nasledujúce dávkové médium: 110 g glukózy.IH2O, doplnených do 500 g demineralizovanou vodou. 25 g Trusoy, 50 g kvasinkového extraktu (Ohly), 10,5 g K2HPO4, 5 ml 1000 X Egli vitamínový roztok, 50 ml 100 X Egli stopových kovov (Egli, 1980), 0,25 g L-histidín.HC1 (Sigma), 3 g MgSC>4. , 2 g odpeňovača do 4500 g s demineralizovanou vodou. Glukózový roztok sa sterilizoval teplom a vitamínový roztok sa samostatne sterilizoval filtračné. Všetky ostatné zložky sa sterilizovali teplom vo fermentore. Teplota sa udržovala na 30 °C a pH na hodnote 5,0. Fermentor sa naočkoval a bunky sa kultivovali s prietokom vzduchu 2 1/min.
a rýchlosťou miešadla 600 οΐ./min.. Po 18 hodinách sa začala fáza plnenia.
Použilo sa nasledujúce plniace médium: 1100 g glukózy.IH2O, doplnených do 1750 g demineralizovanou vodou.
62,5 g kvasinkového extraktu (Ohly), 30 g K2HP04, 5 ml 1000 X Egli vitamínového roztoku, 50 ml 100 X Egli stopových kovov (Egli, 1980), 6,25 g L-histidín.HC1 (Sigma), 6,25 g MgSO4.7H2O, 2 g odpeňovača do 850 g s demineralizovanou vodou.
Plniaca pumpa sa udržovala pri konštantnej RQ hodnote (pomer vyprodukovaných molov C02 a spotrebovaných molov O2) 1,05 na základe softvérových nástrojov, ako ich opísal Keulers (1993). Kultúra sa odobrala po 37 hodinách.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. Izoformy AFP typu III. Zarámované oblasti reprezentujú oblasti identity a šrafované aminokyseliny sú tie, ktoré sa . identifikovali ako dôležité pre vlastnosti peptidov proti zamrznutiu.
Obr. 2. Syntetický gén, kódujúci AFP typu III HPLC1.
Obr. 3. Schematická reprezentácia konštrukcie pUR7700, plazmidu, nesúceho syntetický AFP-III gén.
Obr. 4. Reštrikčná mapa kvasinkového vektora expresie pUR2778.
Obr. 5. Schematická reprezentácia konštrukcie pUR7701, plazmidu, nesúceho invertázovú signálnu sekvenciu.
Obr. 6. Schematická reprezentácia konštrukcie pUR7702, plazmidu, nesúceho syntetický AFP-III gén, viazaný rámcovo k invertázovej signálnej sekvencii.
Obr. 7. Schematická reprezentácia konštrukcie pUR7703, plazmidu, nesúceho syntetický AFP-III gén, spojený rámcovo s pre-pro vylučovacou signálnou sekvenciou pre párový faktor.
Obr. 8. Schematická reprezentácia konštrukcie pUR7704, viacnásobne kopírujúceho rDNA integračného vektora, nesúceho syntetický AFP-ΙΙΪ gén, viazaný rámcovo k invertázovej signálnej sekvencii.
- 25 Obr. 9. Schematická reprezentácia konštrukcie pUR7706, viacnásobne kopírujúceho rDNA integračného vektora, nesúceho syntetický AFP-III gén, spojený rámcovo s pre-pro vylučovacou signálnou sekvenciou pre párový faktor.
Obr. 10. Elučný záznam peptidov proti zamrznutiu zo sliznáča amerického z Mono S stĺpca.
Chromatogram peptidov proti zamrznutiu, oddelených HPLC s reverznými fázami.
Obr. 12. Chromatogram Mono S SI peptidov proti zamrznutiu, oddelených HPLC s reverznými fázami.
Obr. 13. Chromatogram Mono S S2 peptidov proti zamrznutiu, oddelených HPLC s reverznými fázami.
Obr. 14. Chromatogram Mono S S3 peptidov proti zamrznutiu, oddelených HPLC s reverznými fázami.
Obr. 15. Chromatogram Mono S S4 peptidov proti zamrznutiu, oddelených HPLC s reverznými fázami.
Obr. 16. Chromatogram Mono S SI peptidov proti zamrznutiu, oddelených HPLC s reverznými f á.zami.
Obr. 17· Syntetický gén, kódujúci spojovací proteín AFP typu III HPLC12 a invertázovej signálnej sekvencie.
Obr. 18. Schematická reprezentácia plazmidu pUR7718.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Konštrukcia syntetického génu, kódujúceho AFP typu III
Nukleotidová sekvencia, kódujúca HPLC I peptid proti zamrznutiu, optimalizovaná na expresiu v Saccharomyces cerevisiae, sa skonštruovala nasledovne: syntetizoval sa súbor 12 oligonukleotidov (invafpl, invafp2, invafp3, invafp4, invafp5, invafp6, invafp7, invafp8, invafp9, invafplO, invafpil a invafpl2), najmä obsahujúcich DNA sekvenciu zrelého AFP, expresovaného v prednostne používaných S. cerevisiae kodónoch. Syntetický gén bol navrhnutý tak, aby obsahoval 5’ jednoreťazcové oblasti, kompatibilné s PstI a HindlII
- 26 generovanými kohéznymi koncami (Obr. 2).
Na zostavenie syntetického AFP génu sa 50 pmol každého z oligonukleotidov rozpustilo v 12 μΐ vody, inkubovalo sa 2 min. pri 95 °C a priamo sa uložilo na lad. Po tomto denaturačnom kroku sa oligonukleotidy fosforylovali v konečnom objeme 20 μΐ, obsahujúcom 2,5 mM ATP, 5 mM DTT a asi 10 U polynukleotidovej kinázy, po dobu 40 min. pri 37 C, po čom nasledovala 2-minútová denaturácia pri 95 °C a uloženie na lad. 10 μΐ každého fosforylovaného oligonukleotidu sa zmiešalo s jeho naj komplementárnejším DNA oligonukleotidom, aby sa získal dvojreťazcový útvar. Po 2 min. inkubácie pri 95 ’C na denaturáciu sa každý duplex pomaly ochladil na 30 °C. Opäť sa 10 μΐ všetkých šiestich duplexných zmesí spojilo a inkubovalo sa v konečnom objeme 100 μΐ, obsahujúcom 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, 8 mM DTT a 40 gg/ml želatíny a 10 U DNA ligázy, po dobu dvoch hodín pri 20 °C. Ligačná zmes potom precipitovala a opätovne sa rozpustila v 30 μΐ TE-pufra. 15 μΐ tejto zmesi sa uložilo na 2 %-ný agarózový
I gél ä z gélu sa vysekol DNA pás očakávanej veľkosti (približne 224 bázových párov) a nakoniec sa vyčistil procesom Gene Clean II, ako odporúča dodávateľ.
Získaný DNA fragment sa potom naviazal na Pstl/HindlII linearizovaný vektor pTZ19R (Pharmacia) a transformoval sa do E. coli JM 109 štandardnými postupmi. Plazmid DNA niekoľkých transformantov sa izoloval mierne modifikovanou minipreparačnou metódou alkalickou lýzou a analyzoval sa reštrikčnou analýzou s niekoľkými enzýmami. Sekvencia inzertu, obsiahnutá v jednom takomto plazmide, sa potvrdila Sangerovým dideoxy sekvenovaním dvojreťazcového plazmidu (Sanger a spol., 1977). Táto prechodná štruktúra, obsahujúca kódujúcu oblasť kazety syntetického AFP-III, sa nazvala pUR7700 (Obr. 3) .
Príklad 2
Konštrukcia kvasinkových vektorov expresie, obsahujúcich syntetický gén, kódujúci AFP-III HPLC-1
Syntetický AFP-III gén, nesený pUR7700, neobsahuje žiadnu informáciu, potrebnú na expresiu tohto peptidu v kvasinkách. Aby sa dosiahla expresia a vylučovanie tohto génu, musia sa urobiť štruktúry, obsahujúce translačné fúzie AFP-III génu s vhodnou signálnou sekvenciou vylučovania, a tieto fúzne sekvencie sa musia dostať pod kontrolu promótora kvasinkového génu.
Vhodné signálne sekvencie vylučovania sa dajú vybrať z viacerých kvasinkami, génov, kódujúcich proteíny, účinne vylučované napríklad invertázu, kódovanú SUC2, alebo α-párový faktor, kódovaný MFal a MFa2. Aby sa dosiahla vhodná fúzia s invertázovou signálnou sekvenciou, generoval sa PCR fragment, obsahujúci invertázovú signálnu sekvenciu, časť GAL7 promótora a vhodné miesto reštrikčného enzýmu, aby sa zabezpečila rámcová fúzia invertázovej signálnej sekvencie so syntetickým AFP-III génom.
Aby sa získal tento fragment, navrhol sa PCR primér, invafpl4, s nasledujúcou sekvenciou:
I
NheI BamHI
| 3’ CCA AAA | CGT CGG | TTT | TAT AGA | CGATCG | CCTAGGGC 5’ invafpl4 |
| G F | A A | K | I S | A | |
| Tento | primér | sa | použil | ako 3 ’ | primér v PCR reakcii |
v kombinácii s 5’ primérom PG7 05 AF (Verbakel, 1991), ktorý hybridizuje so sekvenciou, zistenou v GAL7 promótore. S použitím pUR2778 plazmidu DNA ako matrice (Obr. 4, van Gorcom a spol., 1991) reakcia generovala približne 243 bp fragment. Tento fragment sa eluoval z agarózového gélu a čistil sa postupom Gene Clean podľa návodu výrobcu. Vyčistený fragment sa potom natrávil Sací a BamHI a výsledný, približne 88 bp fragment sa naviazal na príslušné miesta v plazmide pTZ19R. Ligačná zmes sa zaviedla do E. coli JM109 transformáciou a plazmid DNA sa izoloval z jedného transformantu a sekvenoval sa, aby sa potvrdila identita klonovaného inzertu. Tento plazmid sa označil ako pUR7701 (Obr. 5).
Aby sa dosiahla rámcová fúzia invertázovej signálnej sekvencie so syntetickým AFP-III, gén pUR7700 sa natrávil NheI a HindlII a izoloval sa približne 196 bp fragment a naviazal sa na približne 2911 bp fragment, vytvorený natrávením pUR7701 pomocou NheI a HindlII. Výsledný plazmid sa pomenoval pUR7702 (Obr. 6).
Podobným spôsobom sa generoval PCR fragment, obsahujúci pre-pro signálnu sekvenciu α-párového faktora, s použitím priméru MFaAFPIII ako 3’ priméru:
NheI
3’ CTA TTT TCT CTC CGA CTT CGATCGCC 5’ MFaAFPIII
D K R E A E A
PCR fragment, obsahujúci časť GAL7 promótora, a celú pre-pro α-párový faktor kódujúcu sekvenciu, sa generoval z pUR2660 (VO 94/03617) DNA natrice s použitím MFaAFPIII a PG7 05 AF ako primérov. pUR2660 obsahuje sekvenciu pre-pro α-párového faktora pod kontrolou GAL7. promótora.. Výsledný, približne 462 bp fragment sa čistil, ako je opisné vyššie, a natrávil sa Sací a NheI. Takto získaný, približne 292 bp fragment sa naviazal do približne 3025 bp fragmentu, získaného natrávením pUR7702 pomocou Sací a NheI. Plazmid DNA z niekoľkých E. coli JM109 transformantov, získaný z tohto spojenia, sa sekvenoval, aby sa potvrdilo, že bol klonovaný správny fragment. Jeden z týchto plazmidov sa označil ako pUR7703 (Obr. 7).
Na konštruovanie plazmidov, schopných expresie AFP-III kazety v kvasinkách, sa fúzie syntetický gén-signálna sekvencia zaviedli do rôznych kvasinkových vektorov expresie nasledovne:
Približne 278 bp SacI/HindlII fragment pUR7702 a približne 488 bp SacI/HindlII fragment pUR7703, ktoré nesú fúzie invertázy a α-párového faktora s AFP-III, sa klonovali nezávisle s použitím štandardných metód do kvasinkových vektorov expresie, tiež natrávených Sací a HindlII. Oba tieto vektory expresie nesú S. cerevisiae GAL7 promótor tak, že vloženie génov v mieste Sací umožňuje GAL7 riadenú transkripciu vložených génov.
pUR7704 (Obr. 8) sa pripravil vložením invertázovej signálnej sekvencie AFP-III kazety z pUR7702 do viacnásobne kopírujúceho ribozomálneho DNA integračného vektora pUR2778, a pUR7706 (Obr. 9) je pUR2778, obsahujúci AFP-III kazetu α-párového faktora, odvodenú od pUR7703, vloženú medzi miesta Sací a HindlII.
Príklad 3
Expresia AFP-III v S. cerevisiae
Plazmidy pUR7704 a pUR7706 sa linearizovali natrávením Hpal, ktorý smeruje integráciu plazmidov do kvasinkovej rDNA oblasti, potom sa postupne nezávisle zaviedli do S. cerevisiae kmeňa SU50 elektroporáciou. Transformanty sa vybrali na základe ich schopnosti rásť v neprítomnosti leucínu. Aby sa dosiahla expresia klonovanýčh AFP-III génov, transformanty, nesúce pUR7704 alebo pUR7706, sa najprv nechali rásť 40 hodín v kvapalnom minimálnom médiu pri 30 °C, potom sa postupne zriedili 1 : 10 v čerstvo pripravenom indukčnom médiu (kvasinkový extrakt 1 %, Difco peptón 2 %, galaktóza 5 %) a inkubovali sa pri 30 ’C ďalších 48 hodín. Na konci tejto doby sa vzorky supernatantu kultúry testovali na ich schopnosť inhibovať rast kryštálov ľadu.
Rast kryštálov ľadu sa skúmal mikroskopicky v priebehu 30 minútovej inkubácie pri -6 ’C. Dalo sa jasne demonštrovať, že vzorky supernatantu, získané z kvasiniek, nesúcich syntetický AFP-III gén, mali inhibičný účinok na rast kryštálov ľadu v porovnaní s podobnými kontrolnými vzorkami, pripravenými zo supernatantov z netransformovaných kvasiniek alebo kvasiniek, nesúcich vektor expresie, ale neobsahujúcich syntetický AFP-III gén. Avšak účinnosť inhibície rekryštalizácie kvasinkami vyprodukovaného materiálu bola významne nižšia než účinnosť ekvivalentného množstva rybieho AFP prípravku.
Na ďalšiu analýzu vyprodukovaného peptidu proti zamrznutiu sa 10 ml vzorky indukovanej kultúry pUR7704 a pUR7706 transformantov centrifúgovali 5 min. pri 4000 οΐ./min. a bunky a supernatanty sa pozberali a skladovali pri -20 °C. Denaturácia SDS polyakrylamidového gélu elektroforézou sa použila na oddelenie proteinov a AFP sa detekoval westernovým prenosom s použitím anti-AFP špecifickej monoklonálnej protilátky.
Prítomnosť pásu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou
6,5 kD vo vzorkách supernatantov z kvasinkového transformantu, nesúceho pUR7704 a pUR7706, jasne ukazuje, že tieto transformanty sú schopné produkovať AFP-III. Peptid sa čistil HPLC s reverznými fázami a stanovila sa N-terminálna sekvencia. Táto sekvencia demonštrovala, že HPLC-1 peptid bol správne spracovaný a vylúčený kvasinkou.
Príklad 4
Identifikácia najúčinnejšiehopodtypu peptidu proti’ zamrznutiu zo sliznáča amerického
Izoformy z AFP-III sa čistili s použitím dvojstupňového postupu. Najprv sa vzorka vložila na katiónovýmenný Mono S stĺpec a eluovala sa s použitím opísaného gradientu. Záznam z eluovania je znázornený na obr. 10. Zo stĺpca sa izolovali jedno neretardované maximum (Q maximum) a štyri eluované maximá (SI až S4). SI reprezentuje proteín s najmenšou schopnosťou viazania k Mono S katiónovýmennému stĺpcu pri týchto podmienkach a S4 obsahuje proteín s najvyššou schopnosťou viazania k tomuto stĺpcu. Frakcie zodpovedajúce maximám sa pozberali a vložili na RP-HPLC stĺpec s použitím opísaného gradientu. Chromatogram z celého materiálu je znázornený na obr. 11. Frakcie, zodpovedajúce maximám sú AFP-III izoformy a sú číslované od 1 do 12 podľa ich správania na tomto stĺpci s použitím určených podmienok. Všetky AFP-III izoformy eluujú medzi 25 a 45 minútami. RP-HPLC chromatogramy Q a SI až S4 frakcií sú znázornené na obr. 12 až 16. Každá z frakcií poskytuje iné AFP-III izoformy a v tabuľke 2 je sumarizované, ktorá AFP izoforma sa vyskytovala v každom maxime. Frakcie, pozberané z Mono S a RP-HPLC stĺpcov, sa testovali myším anti-AFP-III antisérom a všetky izoformy od SI po S4 dali pozitívnu reakciu na antisérum S typu, izoforma 12 z Q skupiny reagovala pozitívne na antisérum Q typu. N-terminálna aminokyselinová sekvencia sa stanovila z piatich z izoforiem (tabuľka 3). AFP-III HPLC frakcia, zodpove• dajúca maximu č.7 bola kontaminovaná rybím lyzozýmom, ale ostatné identifikované aminokyselinové sekvencie sa dali ‘ priradiť k známym sekvenciám AFP-III izoforiem. Na účinnosť proti zamrznutiu sa testovali rovnaké množstvá čistených proteínov.
Ako dokazuje štúdia inhibície rekryštalizácie, len HPLC-12 izoforma AFP-III ukázala významnú účinnosť proti zamrznutiu. Aby sa potvrdilo toto zistenie, AFP-III izoformy zo sliznáča amerického sa rekonštituovali v prítomnosti a neprítomnosti HPLC-12 izoformy. Prípravok úplne rekonštituovaného peptidu zachoval účinnosť surového rybieho pri-, pravku, zatiaľ čo prípravok, neobsahujúci HPLC-12 izoformu, ukázal silne zníženú účinnosť proti zamrznutiu, ako dokazuje štúdia rekryštalizácie.
Použitím tryptického natrávenia izoformy 12 sa stanovila celková aminokyselinová sekvencia. Zistilo sa, že táto t sekvencia bola identická so sekvenciou, opísanou v literatúre (Davies a Chow, 1990).
Príklad 5
Konštrukcia syntetického génu, kódujúceho HPLC-12 variant AFP typu III
Nukleotidová sekvencia, kódujúca HPLC-12 peptid proti zamrznutiu, spojená s invertázovou signálnou sekvenciou a s použitím kodónu, optimalizovaného na expresiu v Saccharomyces cerevisiae, sa skonštruovala nasledovne: syntetizoval sa súbor 15 oligonukleotidov (HPLC12.1, HPLC12.2,
HPLC12.3, HPLC12.4, HPLC12.5, HPLC12.6, HPLC12.7, HPLC12.8, HPLC12.9, HPLC12.10, HPLC12.il, HPLC12.12, HPLC12.13, HPLC12.14 a HPLC12.15), obsahujúcich najmä DNA sekvenciu zrelého AFP, expresovaného vo výhodne používaných S. cerevisiae kodónoch. Syntetický gén sa navrhol tak, aby obsahoval jednoreťazcové oblasti, kompatibilné so Sacia HindlII generovanými kohéznymi koncami (Obr. 17).
Pre súbor syntetických HPLC-12 génov sa 50 pmol každého z oligonukleotidov rozpustilo v 12 μΐ vody, inkubovalo sa 2 minúty pri 95 °C, a priamo sa uložilo na lad. Po tomto denaturačnom kroku sa oligonukleotidy fosforylovali v konečnom objeme 20 μΐ, obsahujúcom 2,5 mM ATP, 5 mM DTT a asi 10 U polynukleotidovej kinázy, 40 min. pri 37 °C, po čom nasledovali 2 min. denaturácie pri 95 'C a uloženie na ľad. 10 μΐ každého fosforylovaného oligonukleotidu sa zmiešalo s jeho naj komplementárnejším DNA oligonukleotidom, aby sa získal duplexný útvar. Po 2 min. inkubácii pri 95 °C na denaturáciu sa každý duplex ochladil pomaly na 30 °C. Opäť sa 10 μΐ každej z duplexných zmesí spojilo a inkubovp.lo v konečnom objeme 100 μΐ, obsahujúcom 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 8 mM MgC12, 8 mM DTT a 40 pg/ml želatíny a 10 U DNA ligázy, dve hodiny pri 20 °C. Ligačná zmes potom precipitovala a opätovne sa rozpustila v 30 μΐ TE-pufra. 15 μΐ zmesi sa vložilo na 2%-ný agarózový gél a DNA pás očakávanej veľkosti (približne 291 bázových párov) sa vysekol z gélu a nakoniec sa čistil postupom Gene Clean II, ako odporúča dodávateľ.
Tento fragment sa naviazal na vektorový fragment, odvodený z viacnásobne kopírujúceho integračného vektora pUR2778 natrávením pomocou Sací a HindlII. Sekvencia inzertu sa potvrdila a výsledný plazmid sa pomenoval pUR7718 (Obr. 18) .
Plazmid pUR7718 sa linearizoval natrávením pomocou Hpal, ktorý smeruje integráciu plazmidu do kvasinkovej rDNA oblasti, a potom sa zaviedol do S. cerevisiae kmeňa SU50 elektroporáciou. Výsledné transformanty sa vybrali podľa ich schopnosti rásť v neprítomnosti leucínu.
Aby sa dosiahla expresia klonovaného HPLC-12 génu, transformanty, nesúce pUR7718, najprv rástli 40 hodín v kvapalnom minimálnom médiu pri 30 °C, potom sa zriedili 1 : 10 v čerstvo pripravenom indukčnom médiu (kvasinkový extrakt 1 %, Difco peptón 2 %, galaktóza 5 %) a inkubovali sa pri 30 °C ďalších 48 hodín. Na konci tejto doby sa vzorky supernatantu kultúry testovali na ich schopnosť inhibovať rast kryštálov ľadu.
Výsledky (rekryštalizačná štúdia) jasne ukazujú, že supernatanty kultúry mali vysoké hladiny účinnosti proti zamrznutiu. Porovnanie týchto výsledkov s výsledkami, získanými pre kvasinkovú expresiu HPLC-1 variantu, ukázalo, že supernatant z transformantu, ktorý vyprodukoval najnižšiu hladinu HPLC-12 účinnosti proti zamrznutiu, presiahol túto účinnosť pre najlepší HPLC-1 transformant.
Fed-batch fermentácia sa uskutočnila s SU50 transformantom, nesúcim pUR7718. Na konci plniacej fázy sa bunky pozberali centrifugáciou v centrifúge Jouan LR 5.22 s použitím 1 1 nádob počas doby 30 min. pri 4650 ot./min. (7200 g),. Supernatant sa testoval na účinnosť proti zamrznutiu testom inhibície rekryštalizácie ľadu. Nezriedený supernatant jasne zabraňuje rastu kryštálov, čo demonštruje prítomnosť vysokých hladín účinného peptidu proti zamrznutiu v supernatante kultúry.
Vesternový prenos supernatantu z tejto fermentácie ukázal, že sa vylúčil materiál AFPIII-HPLC12. Zdanlivá molekulová hmotnosť kvasinkami vyprodukovaného HPLC12 bola ekvivalentná molekulovej hmotnosti rybami produkovaného HPLC12. Čistenie a aminokyselinové sekvenovanie kvasinkami vyprodukovaného peptidu potvrdili, že tento materiál bol nerozlíšiteľný od HPLC12 peptidu, vyprodukovaného sliznáčom americkým .
- 34 Literatúra
Campbell, I and Duffus, J.H., (1988) Yeast, a practical approach. IRL press, Oxford.
Chao, H., Davies, P.L., Sykes, B.D. and Sonnichsen, (1993) Use of proline mutants to help solve the NMR solution structure of Type III antifreeze proteín. Proteín Science 2 1411-1428.
Chao, H., Sonnichsen, F.D., DeLuca, C.I., Sykes, B.D. and Davies, P.L. (1994) Structure-function relationships in the globular type III antifreeze proteín: identification of a cluster of surface residues required for binding to ice. Proteín Science 3 1760-1769.
Chung, C.T., Niemela, S,L., Miller, R.H., (1989), One-step preparation of competent E.coli: Transformation and storage of bacterial cells in the samé solution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86; 2172-2175.
Davis, P. L. and Chow, H. L., (1990), Biochernistry of fish antifreeze proteins, The FASEB. Journal 4 R2460-2468.
Driedonks, R.A., Toschka, H.Y. van Almkerk, J.W, Schäffers and Verbakel, J.M.A. (1995) Expression and secretion of antifreeze peptides in the yeast Saccharomyces cerevisiae Yeast 11.
Egli, T. (1980), Wachstum von methanol assimelerende Hefen, PhD Thesis, Zurich no 6538.
van den Elzen et al. (1985) Plánt Mol Biol., 5: 149-154.
Erhart, E., Hollenberg, C.P., (1981), Curing of Saccharomyces cerevisiae 2pm DNA by transformation. Curr. Genet., 3, 83 -89 . .
- 35 Fletcher, G.L. Hew, C.L. Joshi, S.B. and Wu, Y. (1994) Antifreeze polypeptide-expressing microorganisms useful in fermentation and frozen storage of foods. US Patent application.
Gasson, M.J., (1993), progress and potential in the biotechnology of lactic acid bacteria F.E.M.S. microbiology Reviews 12 3-20.
Hanahan, (1988) Ann. Rev. Genetics 22: 479-519.
Hew, C.L. Slaughter, D., Shashikant, B.J., Fletcher G.L. and Ananthanarayanan V.S. (1984) Antifreeze peptides from the Newfoundland Oceán Punt Macrozoarces americanus: presence of multiple and compositionally diverse components. J. Comp Physiol B. 155, 81-88.
Hew, C. L., Wang, N-C., Joshi, S., Fletcher, G. L., Scott, G. K., Hayes, P. H., Buettner, B. and Davies, P. L., (1988) , Multiple genes provide the basis for antifreeze protein diversity and dosage in Oceán Punt. J. Biol. Chem. 263, 12049-12055.
Keulers, M., (1993) PhD thesis technical university of Eindhoven
Li, X., Trinh, K. Y. and Hew, C. L. (1992), Expression and characterization of an active and thermally more stable recombinant antifreeze polypeptide from Oceán Punt, Macrozoarces americanus, in Escherichia coli: improved expression by modification of the secondary structure of the mRNA. Protein Engineering 4 995-1002.
McKown, R.L. and Warren G.J. (1991) Enhanced survival of yeast expressing an antifreeze gene analogue after freezing. Cryobiology 28, 474-482.
| Romanos, M. A., Scorer, | C. A. and Čiare, J. | J. , | (1992), |
| Foreign Gene expression | in yeast: a review, | Yeast | 8 423- |
| 488 . | |||
| Sambrook, J., Fritsch, | E.F. , Maniatis, | T., | (1989). |
Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977), DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.
Sonnichsen, F. D., Sykes, B. D., Chao, H. and Davies, P.
L·., (1993), The non-helical structure of antifreeze protein type III, Science 259, 1154-1157.
Toschka H. Y., Verbakel, J.M., Almkerk J.W.. (1992), PCTPatent Application WO94/03617 with priority of 29 July 1992 from Dutch patent Application 92202338.7 Process for producing Antifreeze Peptides (AFP's).
Van Gorcom, R. F. M., Hessing, J. G. M., Maat, J. and Verbakel, J. M. A., (1991) Xylanase Production. Internátional Patent WO 91/19782.
Verbakel, J. M. A.., (1991) , Heterologous gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. PhD. Thesis, University of Utrecht.
Warren, G.J., Hague, C.M., Corroto, L.V. and Mueller, G.M.
(1993) Properties of engineered antifreeze peptides. FEBS Letters 321, 116-120.
Yanisch-Perron, C., Viera, J., Messing, J., (1985), Improved M13 phage cloning veciors and hos't strains: Nucleotide sequence of the M13 mpl8 and pUC19 vectors. Gene
33, 103-119.
- 38 Tabuľka 1
Plazmidy, obsahujúce AFP-III
| Názov plazmidu | Relevantné charakteristiky |
| pUR7700 | pTZ19, nesúci HPLC-1 syntetický gén |
| pUR7701 | pTZ19, nesúci invertázovú signálnu sekvenciu |
| pUR7702 | pTZ19, nesúci spojovací gén pre invertázovú signálnu sekvenciu-HPLC-1 |
| pUR7703 | pTZ19, nesúci spojovací gén pre signálnu sekvenciu párového faktora a-HPLC-1 |
| pUR7704 | Kvasinkový vektor expresie, nesúci spojovací gén pre invertázovú signálnu sekvenciu -HPLC-1 |
| pUR7706 | Kvasinkový vektor expresie, nesúci spojovací gén pre signálnu sekvenciu párového faktora a-HPLC-1 |
| pUR7718 | Kvasinkový vektor expresie, nesúci spojovací gén pre invertázovú signálnu sekvenciu -HPLC-12 |
Tabuľka 2
Mono S frakcie, obsahujúce AFP-III 3 izoformy
| Mono S frakcia | AFP 3 izoforma |
| Q | 12 |
| SI | 4 5 6 |
| S2 | 1 2 3 11 |
| S3 | 7 |
| S4 | 7 9 |
- 40 *
Tabuľka 3
N-terminálna aminokyselinová sekvencia AFP-III izoforiem
Lyzozým zo sliznáča amerického, peptid, ktorý sa predtým označovval ako AFP 3 izoforma 7:
Lys-Val-Phe-Asp-Arg- ?-Glu-Trp-Ala-Arg-Val-Leu-Lys-Ala-Asn21
-Gly-Met-Asp-Gly-Tyr-Arg-Gly- Ile-Ser-Leu-Ala-Asn-Trp-Val- ? 30
-Leu-Ser-Lys-Trp-Glu-Ser-?-Tyr-?-ThrIzoforma číslo 9:
i '10
Ser-Gln-Ser-Val- Val-Ala-Thr-Tyr-Leu- Ile-Pro-Met-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Pro-Ala-MetIzoforma číslo 12:
10
Asn-Gln-Ala-Ser- Val-Val-Ala-Asn-Gln-Leu- Ile-Pro- Ile-Asn-Thr-Ala-Leu41 Tabuľka 4
Aminokyselinová sekvencia tryptických peptidov AFP-III izoformy číslo 12
Peptid č. 1:
N-koniec 1-23
10
Asn-Gln-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-Gln-Leu- Ile-Pro- Ile-Asn-Thr23
-Ala-Leu-Thr-Leu-Val-Met-Met-Arg
Peptid č. 2: 24 až 39 , 1 ( ,10
Ser-Glu-Val-Val-Thr-Pro-Val-Gly- Ile-Pro- Ala-Glu-Asp- Ile-Pro-Arg
Peptid č. 3: 40 až 47
Leu-Val-Ser-Met-Gln-Val-Asn-Arg
Peptid č. 4: 48 až 61
10
Ala-Val-Pro-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Met-Pro-Asp-Met-Val-Lys
Peptid č. 5: 62 až 66
Gly-Tyr-Pro-Pro-Ala
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob výroby rekombinantných polypeptidov alebo proteínov, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje1) kultiváciu potravinárskeho hostiteľského organizmu pri podmienkach, pri ktorých sa uskutočňuje alebo sa indukuje expresia prinajmenšom AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie, pričom uvedená nukleotidová sekvencia je obsiahnutá v DNA konštrukcii, pričom uvedená DNA konštrukcia nie je prítomná v prírodnom hostiteľskom organizme a uvedená DNA konštrukcia obsahuje v uvedenom poradí (a) silný, voliteľne indukovateľný promótor, účinný v hostiteľskom organizme, (b) ATG štartovací kodón, ktorý môže byť prítomný vo voliteľnej DNA signálnej sekvencii, schopnej vylučovať proteín, vyprodukovaný hostiteľským organizmom počas expresie AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie z (c), uvedenej ďalej, pričom táto signálna sekvencia môže byť homologická alebo heterológna s AFP kódujúcou nukleotidovou sekvenciou a je v čítacom rámci s ATG štartovacím kodónom, (c) najmenej jednu nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu, ktorá má najmenej 80%-nú homológiu so sekvenciou AFP typu III proteínu HPLC12, pričom uvedená nukleotidová sekvencia je v čítacom rámci s ATG štartovacím kodónom, a voliteľne (d) stop kodón, viazaný na 3’ koniec AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie, a voliteľne
- 2) odohranie produktu, expresovaného z AFP kódujúcej nukleotidovej sekvencie, získaného z nej.2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že DNA konštrukcia obsahuje signálnu sekvenciu pre hostiteľský organizmus, umožňujúcu vylučovanie produktu expresie nukleotidovej sekvencie, kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu, ktorá má najmenej 80%-nú homológiu so sekvenciou AFP typu III proteínu HPLC12, hostiteľom počas kultivácie hostiteľa.3. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa t ý m, že hostiteľským organizmom je mikroorganizmus.4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že hostiteľským organizmom je kvasinka.5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že DNA signálnou sekvenciou je DNA pre-sekvencia α-párového faktora zo S. cerevisiae.6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že promótorom je indukovateľný GAL7 promótor alebo konštitutívny GAPDH promótor zo Saccharomyces cerevisiae.7. Potravinársky, rekombinantný, hostiteľský organizmus, získatelný spôsobom podľa nároku 1.8r V podstate čistý a izolovaný rekombinantný, potravinársky polýpeptid alebo proteín, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá má najmenej 80%-nú homológiu so sekvenciou AFP typu III proteínu HPLC12.9. Potravinový výrobok alebo biologický materiál, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polýpeptid alebo proteín s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá má najmenej 80%-nú homológiu so sekvenciou AFP typu III HPLC12, a/alebo hostiteľský organizmus, schopný expresie rekombinantného polypeptidu alebo proteínu s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá má najmenej 80%-nú homológiu so sekvenciou AFP typu III HPLC12, pričom uvedeným potravinovým výrobkom alebo biologickým materiálom nie je jedlý organizmus, prirodzene obsahujúci uvedený polýpeptid alebo proteín v uvedenej forme alebo množstve.10. Výrobok podľa nároku 9,vyznačujúci sa tým, že je to výrobok, určený na zmrazenie.11. Výrobok podlá nároku 10, vyznačujúci sa rým, že týmto výrobkom je zmrzlina.12. Výrobok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že týmto výrobkom je mrazené cesto alebo mrazený pekárenský výrobok.13. Výrobok podľa nároku 9,vyznačujúci sa t ý m, že biologickým materiálom je zvierací orgán alebo tkanivo alebo rastlina.14. Výrobok podľa nároku 9,vyznačujúc i sa tým, že polypeptidom alebo proteínom je rekombinantný polypeptid alebo proteín.15. Výrobok podľa nároku 9,vyznačujúci sa tým, že polypeptidom alebo proteínom je potravinársky polypeptid alebo proteín.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95201842 | 1995-07-05 | ||
| EP95202732 | 1995-10-10 | ||
| PCT/EP1996/002936 WO1997002343A1 (en) | 1995-07-05 | 1996-07-01 | Expression of ocean fish antifreeze peptide in a food grade organism and its application in food products |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK179497A3 true SK179497A3 (en) | 1998-07-08 |
Family
ID=26139472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1794-97A SK179497A3 (en) | 1995-07-05 | 1996-07-01 | Method for producing recombinant polypeptides or proteins and a food product containing them |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6914043B1 (sk) |
| EP (2) | EP1614753B1 (sk) |
| JP (2) | JP3926843B2 (sk) |
| CN (1) | CN1149285C (sk) |
| AT (1) | ATE305509T1 (sk) |
| AU (1) | AU723039B2 (sk) |
| BR (1) | BR9609325A (sk) |
| CA (1) | CA2226101C (sk) |
| CZ (1) | CZ698A3 (sk) |
| DE (1) | DE69635225T2 (sk) |
| DK (1) | DK0836646T3 (sk) |
| ES (2) | ES2248819T3 (sk) |
| HU (1) | HUP9802321A3 (sk) |
| PL (1) | PL324437A1 (sk) |
| SK (1) | SK179497A3 (sk) |
| TR (1) | TR199701752T1 (sk) |
| WO (1) | WO1997002343A1 (sk) |
Families Citing this family (66)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2315662A (en) * | 1996-07-26 | 1998-02-11 | Unilever Plc | Antifreeze peptides in frozen foods |
| GB2315661B (en) | 1996-07-26 | 2000-05-03 | Unilever Plc | Frozen food product |
| SK9099A3 (en) * | 1996-07-26 | 1999-06-11 | Unilever Nv | Frozen confectionery products |
| HUP0001550A3 (en) | 1997-03-14 | 2001-02-28 | Unilever Nv | Frozen food product |
| AU7037098A (en) * | 1997-03-14 | 1998-10-12 | Unilever Plc | Frozen food product containing anti-freeze peptides |
| AU7207998A (en) * | 1997-03-14 | 1998-10-12 | Unilever Plc | Frozen food product |
| GB9801410D0 (en) | 1998-01-22 | 1998-03-18 | Unilever Plc | Frozen food product |
| WO2000053025A1 (en) * | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Unilever Plc | Ice confection |
| GB9929696D0 (en) | 1999-12-15 | 2000-02-09 | Unilever Plc | Processes and organisms for the production of anti-freeze proteins |
| ZA200303353B (en) | 2000-12-13 | 2004-04-30 | Unilever Plc | Method for the production of a heterologous protein by a fungus. |
| JP4228068B2 (ja) * | 2001-11-21 | 2009-02-25 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 魚類由来の不凍タンパク質 |
| AU2003274102B2 (en) * | 2002-12-20 | 2007-01-25 | Unilever Ip Holdings B.V. | Preparation of antifreeze protein |
| US7098589B2 (en) * | 2003-04-15 | 2006-08-29 | Luminus Devices, Inc. | Light emitting devices with high light collimation |
| JP2004344033A (ja) * | 2003-05-21 | 2004-12-09 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 魚類が有する不凍タンパク質 |
| US20080026127A1 (en) * | 2003-12-10 | 2008-01-31 | Nigel Malcolm Lindner | Frozen Confectionery Product Comprising Ice Structuring Proteins |
| US20050129810A1 (en) * | 2003-12-10 | 2005-06-16 | Good Humor- Breyers Ice Cream Division Of Conopco Inc | Frozen confectionery product |
| EP1926389B8 (en) * | 2005-09-23 | 2009-03-04 | Unilever PLC | Low ph aerated products |
| WO2007039066A1 (en) * | 2005-09-23 | 2007-04-12 | Unilever Plc | Process for producing a frozen aerated composition |
| ZA200800990B (en) * | 2005-09-23 | 2009-08-26 | Unilever Plc | Process for producing a frozen aerated composition |
| ATE394935T1 (de) * | 2005-12-21 | 2008-05-15 | Unilever Nv | Gefrorene belüftete süssspeisen |
| CA2617548C (en) * | 2006-01-31 | 2014-04-08 | Unilever Plc | Aerated compositions comprising hydrophobin |
| AU2007225747A1 (en) | 2006-03-13 | 2007-09-20 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Protein having ice nucleation activity |
| ES2382100T3 (es) * | 2006-10-20 | 2012-06-05 | Nestec S.A. | Péptidos estructurantes del hielo de origen láctico |
| BRPI0705417B1 (pt) * | 2006-12-20 | 2016-08-16 | Unilever Nv | produto alimentício aerado e processos para a produção de um produto alimentício aerado |
| CA2681594C (en) * | 2007-03-26 | 2015-06-02 | Unilever Plc | Aerated food products being warm or having been heated up and methods for producing them |
| US20100112179A1 (en) * | 2007-03-26 | 2010-05-06 | Andrew Richard Cox | Aerated food products being warm containing soluble and/or insoluble solids and methods for producing them |
| US20100291630A1 (en) * | 2007-10-18 | 2010-11-18 | Andrew Richard Cox | Method for producing a foaming agent |
| KR101700711B1 (ko) * | 2007-11-21 | 2017-01-31 | 로스킬드 유니베르시테트 | 얼음-결합 활성을 포함하는 폴리펩티드 |
| US20100112139A1 (en) * | 2008-03-28 | 2010-05-06 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Foaming Agents Comprising Hydrophobin |
| MX2011004080A (es) * | 2008-10-16 | 2011-07-28 | Unilever Nv | Solucion de hidrofobina conteniendo antiespumante. |
| ES2395224T3 (es) | 2008-12-16 | 2013-02-11 | Unilever Nv | Procedimiento para extraer hidrofobina de una disolución |
| EP2397483A1 (en) * | 2009-02-13 | 2011-12-21 | Kaneka Corporation | Plant extract containing antifreeze substance and method for producing same |
| US8394444B2 (en) * | 2009-05-29 | 2013-03-12 | Conopco, Inc. | Oil-in-water emulsion |
| US8357420B2 (en) * | 2009-05-29 | 2013-01-22 | Conopco, Inc. | Oil-in-water emulsion |
| CA2704702C (en) * | 2009-06-02 | 2018-06-12 | Unilever Plc | Aerated baked products |
| US20110151064A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-23 | Conopco, Inc., D/B/A Unilever | Particulate frozen confection |
| ES2392150T3 (es) | 2010-01-22 | 2012-12-05 | Unilever N.V. | Procedimiento de fabricación de partículas congeladas |
| JP2011229504A (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-17 | National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology | 生産性および不凍活性を向上させた改変型不凍タンパク質とその製造方法 |
| JPWO2012026596A1 (ja) * | 2010-08-26 | 2013-10-28 | 株式会社ニチレイフーズ | 熱ヒステリシス活性増加方法、熱ヒステリシス活性の熱失活の低減方法、及び熱ヒステリシス活性増加用組成物 |
| EP2731452B1 (en) * | 2011-07-11 | 2015-08-12 | Unilever PLC | Frozen confection with gel coating |
| US9513045B2 (en) | 2012-05-03 | 2016-12-06 | Whirlpool Corporation | Heater-less ice maker assembly with a twistable tray |
| US10426159B1 (en) | 2012-05-24 | 2019-10-01 | The Trustees Of California State University | Highly efficient enhancers for antifreeze protein activity |
| US8925335B2 (en) * | 2012-11-16 | 2015-01-06 | Whirlpool Corporation | Ice cube release and rapid freeze using fluid exchange apparatus and methods |
| US9518770B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-12-13 | Whirlpool Corporation | Multi-sheet spherical ice making |
| US9518773B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-12-13 | Whirlpool Corporation | Clear ice maker |
| US9310115B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-04-12 | Whirlpool Corporation | Layering of low thermal conductive material on metal tray |
| US9273891B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-03-01 | Whirlpool Corporation | Rotational ice maker |
| US9470448B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-10-18 | Whirlpool Corporation | Apparatus to warm plastic side of mold |
| US9476629B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-10-25 | Whirlpool Corporation | Clear ice maker and method for forming clear ice |
| US9557087B2 (en) | 2012-12-13 | 2017-01-31 | Whirlpool Corporation | Clear ice making apparatus having an oscillation frequency and angle |
| US9410723B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-08-09 | Whirlpool Corporation | Ice maker with rocking cold plate |
| US9500398B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-11-22 | Whirlpool Corporation | Twist harvest ice geometry |
| WO2014202089A2 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Roskilde Universitet | Variants of anti-freeze polypeptides |
| EP3077517B1 (en) | 2013-12-02 | 2018-10-17 | DSM IP Assets B.V. | Ice structuring protein |
| US9624418B2 (en) | 2014-04-15 | 2017-04-18 | Baker Hughes Incorporated | Antifreeze proteins for use in downhole fluids |
| WO2016065269A2 (en) | 2014-10-23 | 2016-04-28 | Whirlpool Corporation | Method and apparatus for increasing rate of ice production in an automatic ice maker |
| EP3302076A1 (en) | 2015-06-02 | 2018-04-11 | DSM IP Assets B.V. | Use of ice structuring protein afp19 expressed in filamentous fungal strains for preparing food |
| US11110176B2 (en) | 2016-11-25 | 2021-09-07 | The Board Of Trustees Of The California State University | Composition and method for the protection of proteins, cell components and cells during temperature stress |
| CN108118077A (zh) * | 2016-11-30 | 2018-06-05 | 中南大学 | 一种酶法水解三文鱼胶原制备抗氧化肽与抗冻肽的工艺 |
| CN107746870A (zh) * | 2017-10-26 | 2018-03-02 | 浙江海洋大学 | 一种金枪鱼鱼骨明胶抗冻肽及其制备方法 |
| US10739053B2 (en) | 2017-11-13 | 2020-08-11 | Whirlpool Corporation | Ice-making appliance |
| EP3765484A4 (en) * | 2018-03-14 | 2021-12-22 | Ba, Yong | PEGYLATED ANTIFREEZE PROTEINS AND PROCESSES FOR PREPARATION AND USE |
| US10907874B2 (en) | 2018-10-22 | 2021-02-02 | Whirlpool Corporation | Ice maker downspout |
| CN111808903B (zh) * | 2020-07-06 | 2023-03-31 | 浙江工业大学 | 一种安全高效蛋白抗冻剂及其制备方法和应用 |
| WO2024076237A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Wageningen Universiteit | Improved ice-binding proteins based on twist constrained helices |
| CN116064709B (zh) * | 2022-11-02 | 2024-05-24 | 山东省海洋科学研究院(青岛国家海洋科学研究中心) | 一种天然抗冻肽及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5118792A (en) * | 1989-05-10 | 1992-06-02 | Dna Plant Technology Corporation | Ice crystal growth suppression polypeptides and method of making |
| US5849537A (en) * | 1989-09-19 | 1998-12-15 | Miller Brewing Company | Method of expressing antifreeze proteins in yeast |
| EP0511317B1 (en) * | 1990-01-17 | 1998-04-22 | The Regents Of The University Of California | Composition to improve survival of biological materials |
| WO1991012718A1 (en) * | 1990-03-01 | 1991-09-05 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Enhanced cryopreservation with thermal hysteresis peptide |
| WO1994003617A1 (en) * | 1992-07-29 | 1994-02-17 | Unilever N.V. | Process for producing anti-freeze peptides |
| US5676985A (en) * | 1994-10-12 | 1997-10-14 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Antifreeze polypeptide-expressing microorganisms useful in fermentation and freezing of foods |
| GB2315661B (en) | 1996-07-26 | 2000-05-03 | Unilever Plc | Frozen food product |
| SK9099A3 (en) | 1996-07-26 | 1999-06-11 | Unilever Nv | Frozen confectionery products |
| ATE287451T1 (de) | 1996-07-26 | 2005-02-15 | Unilever Nv | Gefrorenes lebensmittelprodukt das hitzestabiles gefrierschutzprotein enthält |
| WO2000053025A1 (en) | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Unilever Plc | Ice confection |
| GB9929696D0 (en) * | 1999-12-15 | 2000-02-09 | Unilever Plc | Processes and organisms for the production of anti-freeze proteins |
| CN108415412A (zh) | 2011-08-29 | 2018-08-17 | 克朗设备公司 | 车辆导航控制接口 |
-
1996
- 1996-07-01 DK DK96924879T patent/DK0836646T3/da active
- 1996-07-01 AT AT96924879T patent/ATE305509T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-07-01 CN CNB961965010A patent/CN1149285C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-01 AU AU65190/96A patent/AU723039B2/en not_active Ceased
- 1996-07-01 EP EP05075582.6A patent/EP1614753B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-01 TR TR97/01752T patent/TR199701752T1/xx unknown
- 1996-07-01 CA CA002226101A patent/CA2226101C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-01 JP JP50482897A patent/JP3926843B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-01 ES ES96924879T patent/ES2248819T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-01 SK SK1794-97A patent/SK179497A3/sk unknown
- 1996-07-01 DE DE69635225T patent/DE69635225T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-01 ES ES05075582T patent/ES2420105T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-01 WO PCT/EP1996/002936 patent/WO1997002343A1/en active IP Right Grant
- 1996-07-01 HU HU9802321A patent/HUP9802321A3/hu unknown
- 1996-07-01 PL PL96324437A patent/PL324437A1/xx unknown
- 1996-07-01 EP EP96924879A patent/EP0836646B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-01 BR BR9609325A patent/BR9609325A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-07-01 CZ CZ986A patent/CZ698A3/cs unknown
- 1996-07-02 US US08/673,876 patent/US6914043B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-08-08 JP JP2003290511A patent/JP3921461B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-03 US US10/934,009 patent/US7297516B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11508451A (ja) | 1999-07-27 |
| BR9609325A (pt) | 1999-05-25 |
| MX9800016A (es) | 1998-07-31 |
| JP3926843B2 (ja) | 2007-06-06 |
| DE69635225T2 (de) | 2006-03-16 |
| ATE305509T1 (de) | 2005-10-15 |
| DK0836646T3 (da) | 2005-12-19 |
| CA2226101A1 (en) | 1997-01-23 |
| JP3921461B2 (ja) | 2007-05-30 |
| EP0836646B1 (en) | 2005-09-28 |
| PL324437A1 (en) | 1998-05-25 |
| TR199701752T1 (xx) | 1998-05-21 |
| ES2248819T3 (es) | 2006-03-16 |
| EP0836646A1 (en) | 1998-04-22 |
| AU723039B2 (en) | 2000-08-17 |
| WO1997002343A1 (en) | 1997-01-23 |
| HUP9802321A2 (hu) | 1999-02-01 |
| JP2004043484A (ja) | 2004-02-12 |
| CA2226101C (en) | 2009-06-23 |
| EP1614753A2 (en) | 2006-01-11 |
| CN1193999A (zh) | 1998-09-23 |
| CZ698A3 (cs) | 1998-05-13 |
| DE69635225D1 (de) | 2006-02-09 |
| CN1149285C (zh) | 2004-05-12 |
| HUP9802321A3 (en) | 2000-10-30 |
| EP1614753A3 (en) | 2006-07-19 |
| US7297516B2 (en) | 2007-11-20 |
| EP1614753B1 (en) | 2013-05-29 |
| US6914043B1 (en) | 2005-07-05 |
| US20050205833A1 (en) | 2005-09-22 |
| AU6519096A (en) | 1997-02-05 |
| ES2420105T3 (es) | 2013-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK179497A3 (en) | Method for producing recombinant polypeptides or proteins and a food product containing them | |
| Tsujimoto et al. | Cryoprotective effect of the serine-rich repetitive sequence in silk protein sericin | |
| CN101918437B (zh) | 具有冰结合活性的多肽 | |
| Yuan et al. | Site-directed mutagenesis of the hinge region of nisinZ and properties of nisinZ mutants | |
| US6916782B1 (en) | Gene coding for heliomicine and use thereof | |
| EP2280990B1 (en) | Nisin derivatives and the use thereof | |
| Shin et al. | Structure–activity analysis of SMAP-29, a sheep leukocytes-derived antimicrobial peptide | |
| Akca et al. | Genes and derived amino acid sequences of S-layer proteins from mesophilic, thermophilic, and extremely thermophilic methanococci | |
| RU2250267C2 (ru) | Бактериоцин против листерий | |
| KR101048721B1 (ko) | 루코스포리디움 속 미생물의 결빙방지 단백질 유전자, 그를 포함하는 재조합 벡터 및 그 유전자로 암호화된 단백질 | |
| WO2014202089A2 (en) | Variants of anti-freeze polypeptides | |
| Simons et al. | Overproduction of bovine β-casein in Escherichia coli and engineering of its main chymosin cleavage site | |
| MXPA98000016A (en) | Expression of ocean fish antifreeze peptide in a food grade organism and its application in alimentic products | |
| WO1994004682A1 (en) | Bacteriocin | |
| KR100427408B1 (ko) | 형질전환된 피키아 파스토리스ＧＳ１１５／ｐＰＩＤＥ（ＫＣＴＣ １０３２ＢＰ）로부터디펜신의 생산방법 | |
| PT706567E (pt) | Familia de peptidos designados xenoxinas | |
| EP0323489A1 (en) | Preparation of novel protein sweeteners | |
| EP0627486A1 (en) | New extracellular superoxide dismutase, a process for preparing the same and compositions containing the same | |
| EP2338904A1 (en) | Nisin derivatives and the use thereof | |
| JPH07196688A (ja) | 新規な生理活性ポリペプチド、その製造方法及び用途 | |
| CN101665533A (zh) | 蛋白质活性多肽及其编码基因、表达载体、表达菌及应用 | |
| HU217102B (hu) | Tisztított neurotróf faktor és eljárás előállítására |