KR101048721B1 - 루코스포리디움 속 미생물의 결빙방지 단백질 유전자, 그를 포함하는 재조합 벡터 및 그 유전자로 암호화된 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 북극 스발바드 군도에서 분리한 루코스포리디움 속 (Leucosporidium sp .) 미생물의 결빙방지 단백질을 암호화하는 유전자, 이를 포함한 재조합 벡터, 그의 형질전환체 및 상기 유전자로부터 발현되는 결빙방지 단백질에 관한 것이다.

본 발명에 의한 결빙방지 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하는 경우, 형질전환 세균을 이용하여 결빙방지 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있어 결빙방지 단백질의 대량 생산에 유용하다.

루코스포리디움 속 미생물, 결빙방지 단백질, 호냉성 효모, 열적이력현상

Description

루코스포리디움 속 미생물의 결빙방지 단백질 유전자, 그를 포함하는 재조합 벡터 및 그 유전자로 암호화된 단백질 {Antifreeze protein gene derived from Leucosporidium sp., the recombinant vector harboring the gene, and recombinant ice binding protein produced by the plasmid}

본 발명은 결빙방지 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

보다 상세하게는 루코스포리디움 속 (Leucosporidium sp .) 미생물로부터 유래한 결빙방지 단백질을 암호화하는 유전자, 이를 포함하는 재조합 벡터, 그의 형질전환체 및 상기 유전자로부터 발현되는 결빙방지 단백질에 관한 것이다.

결빙방지 단백질 (Antifreeze protein, 이하 AFP)이란 얼음과 결합하여 얼음 결정의 성장을 막는 특징을 가진 단백질로서 얼음결합 단백질 (Ice-binding protein) 이라고도 불리는데, 극지, 알파인, 혹한지 등에 서식하는 생물이 냉해를 극복하기 위한 기작으로 생합성하는 것으로 알려져 있다 (DeVries, A. L. et al . (1969) Science 163: 1074-1075; DeVries, A. L. et al . (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913).

극지 생물이 저온에 적응하기 위해 세포 밖으로 분비하는 AFP는 얼음결정과 수소결합을 통해 결합하며, AFP가 부착하지 않는 곳에서는 비정형적으로 얼음결정의 성장이 일어나서 얼음 표면에 깊은 골짜기(pit)가 생긴다. 이러한 작용에 의하여 AFPs가 부착된 부위와 부착되지 않는 부위에 뚜렷한 경계를 관찰할 수 있다.

1971년 해산 어류로부터 결빙방지 단백질의 존재가 알려진 이후로 꾸준한 연구를 통해 한 종류의 AFGPs(Antifreeze Glycoproteins)와 네 종류의 AFPs의 존재 및 구조가 밝혀졌다 (DeVries, A. L. et al . (1969) Science 163: 1074-1075; DeVries, A. L. et al . (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913; Fletcher, G. L. (1981) Canadian Journal of Zoology 59: 193-201; Chao, H. et al . (1994) Protein Science 3 (10): 1760-1769; Fletcher G. L. et al . (1982) Canadian Journal of Zoology 60: 348-355; Davies, P. L. and Hew, C. L. (1990) FASEB Journal 4(8): 2460-2468; Xue, Y. Q. et al . (1994) J. Mol. Biol. 237 (3): 351-353)

현재, 대구와 넙치를 비롯한 17종의 어류에서 결빙방지 단백질이 생산되는 것이 알려졌으며, 극지 규조, 당근 및 민들레를 비롯한 27종 이상의 고등 식물에서도 결빙방지 단백질이 생산되는 것이 알려져 있다 (DeVries, A. L. et al . (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913; Hincha, D. K. et al . (1992) J. Plant Physiol. 140: 236-240; Sun, X. Y. et al . (1995) Can. J. Microbiol. 41 (9): 776-784; Griffith, M. et al . (1997) Physiologia Plantarum. 100 is. 2: 327-332; Smallwood, M. et al . (1999) Biochemical Journal. 340: 385-391; Janech MG. et al., (2006) J. Phycol. 42, 410-416).

일반적으로 얼음은 녹는 과정에서 다시 얼음결정이 형성되는 재결정화(re-crystallization) 과정을 거치기도 하는데, 이 때 형성되는 큰 얼음결정은 세포에 비가역적인 손상을 초래하는 경우가 많다. 따라서 AFP의 주요한 역할은 얼음의 결정 형성 및 재결정화를 억제하여 얼음에 의해 발생될 수 있는 손상을 감소시키는 것이다. AFP는 얼음결정 형성을 억제하기 때문에 물의 어는점과 녹는점의 차이를 가져오게 되는 데 이 현상을 열적 이력(thermal hysteresis) 활성이라고 하며 AFP의 활성을 정량적으로 나타내는 지표가 된다. 열적이력 현상은 나노리터 오스모미터(nanolitre osmometer)라는 장치로 쉽게 측정할 수 있다. 얼음 표면에 결합된 결빙방지 단백질은 열역학적으로 유리한 얼음의 성장을 방해하게 된다. 그러나 현재까지 극지 효모에서 분리한 AFP나 결빙방지 활성에 대한 연구는 보고된 바가 없다.

AFP 및 해당 유전자는 유용하게 사용될 수 있으며 그 활용 범위 또한 광범위하다. 어류 AFP 유전자를 발현하는 식물의 경우, 냉해 저항성을 가진다는 연구가 진행되고 있으며, 또한 대장균, 효모, 혈소판, 적혈구, 난자와 정자, 토끼 간 등의 냉동 보존에 사용될 수 있다 (Davies, (1987) New biotechnol. 1, 1057-1063; Cutler, (1989) J. Plant Physiol. 135, 351-354; Parody-Morreale et al. (1988) Nature 333, 782-783; Rubinsky et al . (1992) Cryobiology 29, 69-79; Carpenter & Hansen, (1992) Proc Natl Acad Sci U.S.A 89, 8953-8957; Lee et al . (1992) Cryo-Letters 13, 59-66).

최근에는 AFP가 육각 이중피라미드를 형성하는 성질을 이용하여 냉동 수술시 선택적으로 암세포 및 종양을 파괴하는데 AFP를 사용한 보고도 있다 (Koushafer et al . (1997) J Surg Oncol 66, 114-121). 그 밖에 AFP는 얼음의 미세구조가 질감에 영향을 미치는 아이스크림, 해동 시 우수한 보존 상태를 요하는 냉동식품 등 다양한 분야에 활용될 수 있다 (Margesin et al. (2007) Naturwissenschaften 94, 77-99). 특히 국제공개 제 WO 92/22581호에는 식물에서 분리한 AFP를 아이스크림에서 얼음 결정형태를 조절하는 데 사용하는 방법을 제시하고 있으며, 국제공개 제WO 99/37782호에는 화본과 초본에서 분리한 AFP를 아이스크림이나 냉동 요구르트와 같은 식품에 사용하는 방법을 제시하고 있다.

위와 같은 특징을 가진 AFP는 고부가가치의 신 기능성 바이오소재로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

호냉성 효모인 루코스포리디움 속 (Leucosporidum sp.) 미생물은 북극의 다산기지 주위 호수 얼음에서 분리한 진핵생물로 루코스포리디움 속 미생물이 저온에 적응하기 위해 AFP를 생산 세포외로 분비하는 것으로 본 발명자가 AFP 탐색 중에 밝혀졌고 이 단백질과 해당 유전자를 확보하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 극지에서 서식하는 효모인 루코스포리디움 속 (Leucosporidium sp .) 미생물이 저온에 적응하기 위해 발현하는 결빙방지용 단백질 유전자의 서열을 제공하고, 이러한 결빙방지 단백질 유전자를 포함하는 형질전환체를 배양하여 경제적으로 활성이 향상된 결빙방지 단백질을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AFP를 암호화하며, 성숙-전 단백질(pre-mature AFP)을 암호화하는 서열번호 2 또는 성숙 단백질(mature AFP)을 암호화하는 서열번호 4 염기서열을 가지는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 유전자로부터 암호화되며 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 AFP 단백질을 제공한다.

아울러 본 발명은, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 AFP 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

마지막으로 본 발명은, 본 발명에 따른 결빙방지 단백질을 포함하는 결빙방지제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 극지 효모 루코스포리디움 속 미생물의 AFP 유전자를 확보한 후 대장균을 이용하여 발현시켜 대량생산을 가능하게 한다. 특히, 진핵 생물에서 발현되는 결빙방지 단백질이 당화 과정을 필요로 하는 것과 달리 본 발명에 의한 결빙방지 단백질을 대장균 등을 통해 발현시키는 경우에는 단백질 합성 후 변형(post-translational modification) 과정을 거치지 않아도 충분한 활성을 나타냄으로써, 대량 발현 및 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 AFP를 암호화하며, 성숙-전 단백질(pre-mature AFP)을 암호화하는 서열번호 2 또는 성숙 단백질(mature AFP)을 암호화하는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 유전자를 제공한다.

본 발명에서 사용된 결빙방지 단백질 유전자는 한국 해양 연구원 부설 극지 연구소(Korea Ocean Polar Research Institute, KOPRI)가 북극 스발바드 군도의 호수 얼음을 채집한 후 평판배지에서 순수 분리하고 ribosomal internal transcribed spacer 1(ITS1), ITS2 및 5.8S 유전자 분석결과(Connell et al. (2008) Microb Ecol 56, 448-459)에 따라 루코스포리디움 속 AY30으로 명명한 효모에서 유래한 것이다.

본 발명에서는 루코스포리디움 속 AY30이 세포 밖으로 분비하는 결빙방지 단백질을 암호화하는 유전자를 확보하여 대장균에서 발현할 수 있도록 한 것이다.

결빙방지 단백질을 암호화하고 있는 유전자 서열을 확보하기 위하여 PCR 기법을 사용하였다. 알려진 결빙방지 단백질들은 아미노산 서열이 다양하여 degeneracy primer를 제작하기 위한 보존된 서열을 구하기 힘들다. 따라서 본 발명 에서는 전체 지놈 서열을 확보하여 informatics 기법으로 결빙방지 단백질 유전자 서열을 확보하여 보다 specific한 primer를 제작하였다. 종래의 지놈 분석은 대단히 많은 시간과 노력이 들어가야 한다. 본 발명에서는 pyrosequencing 기술을 이용하여 대략적인 지놈 서열을 확보하고 결빙방지 단백질을 암호화하고 있는 영역의 염기서열을 확보 하였다. 이 서열들은 특정 유전자를 PCR하기 위한 primer 제작에 대단히 유용하다.

구체적으로, 결빙방지 단백질을 분비하는 루코스포리디움 속 AY30의 genomic DNA를 분리하여 지놈 서열을 분석한 결과 대략 16 M 정도의 염기서열을 확보하였다. 이 서열들은 짧게는 100 bp에서 크게는 수 kbp의 단편(contig)들로 확보 되었다. 이러한 지놈 서열에서 목적으로 하는 결빙방지 단백질을 암호화하고 있는 부분을 찾기 위하여, 얻어진 염기서열을 database로 만들고 기존의 알려진 Typhula ishikariensis의 결빙방지 단백질(BAD02891)의 아미노산 서열을 이용하여 이것과 유사한 아미노산을 암호화 하는 부분을 함유한 영역을 검색(tBlastN)하였다. 결빙방지 단백질은 어류, 곤충, 세균, 식물 등 다양한 종에서 보고되었으며 또한 그 구조나 아미노산 서열들이 매우 다양하다. T. ishikariensis는 곰팡이이며 이는 효모에 보다 가까운 종이며 그 결빙방지 단백질의 아미노산 서열은 효모의 그것과 가장 유사할 것이다.

검색 결과 T. ishikariensis의 결빙방지 단백질과 높은 유사성을 가지는 결빙방지 단백질을 암호화하는 영역을 가진 약 2.8 kb 크기의 단편을 얻을 수 있었다. pyrosequencing 결과로 확보된 염기서열은 93% 정도의 정확성으로 분석된 것이어서 보다 정확한 염기서열 분석을 위하여 forward primer gF(표 1 참조)와 reverse primer gR(표1)을 제작하고 약 2 kb 정도 영역을 PCR 한 후 primer walking 법에 따라 ABI 자동염기서열분석을 통하여 정확히 다시 염기서열을 분석하였다(서열번호 1). 진핵생물에 속하는 효모는 그 지놈 서열에 inton을 가지고 있다. 본 발명에서 밝혀진 결빙방지 단백질 유전자 역시 8개의 intron을 가지고 있었으며 각 intron은 정확히 GT-AG rule에 따라 50-68 nts(nucleotides) 정도의 크기였다.

이름	서열(5'-3')	비고
gF	TTTCCAGGAGGGTAGCAATG	genome PCR 용
gR	TGCACAAACCAGCAGAAGGA	genome PCR 용
12F	CGGGACCTTCTCGGAATA	3’-RACE 용
12mF	CATATG CAGCGCGACCTCTCCGT	Nde I site
12mR	TCTAGA TTAAAGCCACTGGCG	Xba I site

진핵생물의 유전자를 원핵생물인 대장균에서 발현시키기 위해선 intron이 없는 서열이 필요하다. 따라서 결빙방지 단백질을 암호화하는 cDNA를 확보해야 한다. 본 발명에서는 결빙방지 단백질의 지놈 서열을 이용하여 full-length cDNA를 확보하기 위한 forward primer 12F(표 1 참조)를 제작하고 3’-RACE를 실시하여 전체 (untranslational region) 과 40 nt의 3’-UTR을 가지고 있었으며, 261 개의 아미노산으로 구성된 ORF(open reading frame)로 구성되어 있었으며 그 크기는 약 26 KDa으로 계산되었다. N-terminal 쪽 20 개의 아미노산은 signal peptide로 예측되었다. 서열번호 3에 효모의 결빙방지 단백질의 성숙-전 아미노산 서열을 나타내었다.

상기 결빙방지 단백질의 아미노산 서열을 이미 알려진 결빙방지 단백질의 서열과 비교한 결과를 도 1 에 나타내었다. 본 발명의 결빙방지 단백질은 어류, 곤충, 식물에서 밝혀진 것과 유사성이 없었으며, 곰팡이, 버섯, 세균에서 밝혀진 것과 높은 유사성을 나타내었다.

또한 본 발명은, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

대장균에서 대량 발현 시킬 결빙방지 단백질은 신호 펩타이드를 제외한 241개의 아미노산을 암호화하는 성숙 AFP 유전자가 사용되었다. 신호 펩타이드는 효모의 세포내에서 생산되어 세포 밖으로 분비될 때 제거 되고 성숙 AFP가 세포 밖에서 작용한다. 이 신호 펩타이드는 대장균에서 세포 분비 신호로 작용하지 않기 때문에 필요가 없는 것이다.

대장균에서 외래 단백질을 대량 발현 시킬 때 발현된 단백질이 원래 목적의 기능을 하기위한 구조를 가지지 못하는 불용성 상태로 발현되는 경우가 많다. 이는 그 구조를 풀어 주고 다시 정상적인 구조가 되도록 하는 과정을 거쳐야만 사용할 수 있고 그 방법 또한 복잡하다. 따라서 본 발명에서는 결빙방지 단백질이 수용성 상태로 발현될 수 있도록 하였는데, 우선 expression vector의 선택에 있어서 수용성 단백질 발현율이 높은 것으로 알려진 pCold expression vector를 사용하였다. pCold expression vector는 대장균 유래 cold-shock gene의 promoter를 사용하며 따라서, 15℃에서 발현 시켜 수용성 단백질 생산 효율을 향상시킨 것이다. 또한 본 발명에 실제 사용된 pCold I vector (도 2)는 외래 유전자가 발현되었을 때, N-ternimal 쪽에 발현율을 높이는 TEE(translation enhancing element) 서열과 발현된 단백질을 쉽게 정제 할 수 있도록 His-Tag 서열, 그리고 두 서열을 제거하여야 할 경우 절단할 수 있는 Factor Xa 서열을 가지고 있다. pCold I vector에 효모의 성숙 결빙방지 단백질을 삽입하기 위해 Nde I과 Xba I 제한효소를 사용하였다. 이 두 제한 효소를 사용함으로써 pCold I vector의 MCS(multi cloning site)를 대부분 제거할 수 있다.

벡터에 삽입 될 성숙 AFP 유전자는 PCR을 통하여 확보하였는데 여기에 사용된 forward primer 12mF와 reverse primer 12mR(표 1 참조)은 각각 Nde I과 Xba I site를 가지도록 제작되었다. pCold I vector에 성숙 AFP 유전자를 삽입하여 재조합 pCI12mAFP plasmid를 확보하였다(서열번호 4). 이 재조합 plasmid에 의해 발현되는 결빙방지 단백질은 약 26 kDa의 크기를 가지는 것으로 계산되었다.

최종적으로 발현을 위한 대장균은 E. coli BL21(DE3)를 사용하였다. 형질 전환된 대장균에서 재조합 단백질을 발현 시킨 후 그 발현 양상을 조사하였다. 대장균을 파쇄하고 이들 수용성 및 불용성 분획으로 각각 나누어 분석해 보았다(도 3 참조). 동일한 재조합 plasmid를 함유한 대장균이라고 하더라도 그 발현 조건(배양 시간, IPTG 농도, 발현 시간, 진탕 조건, 배양 총량 등)에 따라 불용성으로 발현되는 양상이 많이 변하였다. 하기 실시예 7에서 제시된 조건에서 재조합 결빙방지 단백질은 대부분 수용성이었으며, 일부 불용성 발현의 양상을 나타내었다. 형질전환체로부터 목적하는 단백질의 생산량을 늘리기 위한 조건은 공지 기술에 따라 당업자가 개량, 변경하여 사용할 수 있으며, 이 때 당업자에게 자명한 개량, 변경, 수정 등은 본 발명의 권리범위에 포함된다.

상기 형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pCI12mAFP를 2009년 6월 1일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KFCC11447P).

따라서, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 결빙방지 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 AFP 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 그의 형질전환체를 당업계의 공지기술로 목적에 맞게 변형하여 제조가능하다.

또한 본 발명에 따른 재조합 AFP의 결빙방지 활성을 확인하기 위하여, 상기 수용성 분획(soluble fraction)을 이용하여 나노리터 오스모미터로 결빙방지 단백질의 활성에 의한 ice crystal 모양을 관찰하였다(도 4). 결빙방지 단백질에 의하여 형성된 ice crystal은 3개의 a 축과 한 개의 c 축을 형성한다. 본 발명의 결빙방지 단백질의 경우, ice crystal 형태는 c 축 방향 양 끝 쪽이 뾰족하게 나온 기둥 모양이었다. 결빙방지 단백질은 녹는점은 변화시키지 않으면서 어는점을 낮추어 녹는점과 어는점의 차이(Thermal Hysteresis Gap)를 만든다. ice crystal은 이 차이에서는 그 성장이 억제되는데, 이 차이의 크기가 결빙방지 단백질의 활성의 크기가 된다. 온도를 더 낮추어 어는점 이하가 되면 ice crystal은 급격히 성장(Burst) 하게 된다. 본 발명의 결빙방지 단백질의 경우, 급격한 성장의 방향이 c 축 방향으로 나타났다. c 축 방향으로 성장하는 형태는 주로 결빙방지능이 우수한(hyperactive) 것들에게서 나타나는 현상이다(Scotter et al. (2006) Cryobiology 53, 229-239). 도 4에서 얻은 어는점과 녹는점의 차이는 대략 0.3℃ 였다.

따라서, 본 발명에 따른 AFP를 포함하는 결빙방지제용 조성물은 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는데 유용하게 이용할 수 있다.

이 때 상기 일정 온도는 시료 혹은 시료를 보관하기 위한 용액의 어는점보다 0 내지 -10℃ 낮은 온도를 말하며, 0 내지 -4℃ 낮은 온도에서는 시료의 결빙이 효과적으로 저해된다. 이러한 온도에서는 본 발명의 AFP가 얼음이 재결정화되는 것을 저해하여 시료 및 시료 보관액의 결빙을 저해한다.

상기 시료는 냉동식품, 약품, 농화학제, 색소 및 생물학적 재료 등을 포함한다. 이 때 냉동식품으로는 아이스크림, 냉동 과일, 정육 등 낮은 온도에서 보관하는 것이 바람직한 모든 냉동 혹은 저온 보관 식품을 포함한다.

구체적으로 아이스크림, 얼려먹는 요거트, 아이스블랜드, 슬러리 등의 냉동 디저트류에서 AFPs는 시료의 어는 점 이하의 온도에서 얼음 재결정에 의하여 큰 결정이 생성되는 것을 방지함으로써 냉동식품의 얼음 결정 구조를 미세하게 유지하여 냉동식품의 맛과 질을 향상시킨다.

또한 냉동 과일, 냉동 야채 및 정육 등의 냉동 혹은 저온보관 식품에서 AFP는 얼음 재결정 활성을 통하여 식품의 냉동시 큰 결정이 형성되어 식품의 원상태가 파괴됨으로써 냉동 상태로 혹은 해동 후 섭취하는 경우 식품의 맛과 질이 현저히 손상되는 것을 방지한다.

치료 약물, 혈장 및 조직 배양을 위한 포유동물 세포 등과 같은 생물학적 재료에는 냉동과 해동 과정이 세포의 생존능을 크게 감소시키게 되며, 장기 이식시에는 조직을 냉동시키는 것은 살아있는 세포의 기능에 심각한 손상을 초래하게 되며, 식물의 냉해는 농업에 심각한 문제를 발생시킬 뿐 아니라, 약물은 엄격한 온도 조건에서 보존되지 않으면 약효가 파괴되거나 오히려 위험해질 수 있다. 이러한 경우 AFPs는 얼음 재결정 저해 활성을 통하여 생물학적 시료가 급격한 온도 변화에 저항할 수 있게 해 준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 루코스포리디움 속 AY30 (Leucosporidium sp. AY30) 효모 배양

본 발명에 사용된 루코스포리디움 속 AY30 배양에는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% D-glucose)를 사용하였다. 배양 온도는 1-4℃에서 1주일 혹은 2주일간 진탕 배양하였다.

<실시예 2> 루코스포리디움 속 AY30의 genomic DNA 분리 및 지놈서열 분석

실시예 1의 방법에 따라 배양된 루코스포리디움 속 AY30 의 genomic DNA를 분리하기 위하여 MasterPure Yeast DNA Purification Kit(EPICENTRE사, 미국)를 사용하였다.

구체적으로, 2 ml 배양된 균주를 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 효모세포 파쇄액(Yeast Cell Lysis Solution) 300 ul를 첨가하여 잘 섞어 준 후, 65℃에서 15분간 배양하였다. 얼음에 5분간 정치한 후 MPC Protein Precipitation Reagent(EPICENTRE, 미국) 150 ul를 첨가하고 10초간 섞어 주었다. 원심분리하여 침전물을 버리고 상등액을 취하여 이소프로파놀 500 ul를 넣고 혼합하였다. 다시 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물을 70% 에탄올 500 ul로 씻어준 후 TE 완충용액 35 ul로 녹여서 보관하였다. 얻어진 genomic DNA는 pyrosequencing 을 실시하여 총 10888개의 Contigs 서열(총 16296399 base, 93% accuracy)을 확보하였다. GenBank에 등록 되어있는 Typhula ishikariensis의 결빙방지 단백질의 아미노산 서열(BAD02891)을 확보된 contig 서열에 대하여 tBlastN을 실시하여 결빙방지 단백질 서열을 암호화하는 contig를 확보하였다.

<실시예 3> Genomic DNA PCR

보다 정확한 지놈 서열을 분석하기 위해서 결빙방지 단백질을 암호화하는 서열 단편을 PCR 증폭하였다. 실시예 1에서 분리된 genomic DNA 100 ng, forward primer gF (10 pmol) 1 ul, reverse primer gR (표 1 참조) (10 pmol) 1 ul, HiPi PCR PreMix (엘피스바이오텍, 한국) 을 혼합하고 전체 50 ul가 되도록 멸균된 증류수를 보충하여 혼합하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분간, (94℃ 30 초, 55℃ 30초, 72℃ 2분 30초) 30 cycles, 72℃ 10분으로 설정하였으며, Thermal cycler Dice(TaKara, 일본) PCR 장비를 사용하였다. 얻어진 PCR 산물은 PCR purification kit (바이오니아, 한국)의 매뉴얼에 따라 정제하였고, full sequencing 하여 서열번호 1에 나타내었다.

<실시예 4> 루코스포리디움 속 AY30 결빙방지 단백질 3’-RACE PCR

(4-1) Total RNA 분리

실시예 1에서 배양된 루코스포리디움 속 AY30 1ml을 원심분리 하여 모은 뒤 TRIzol reagent(Invitrogen사, 미국) 1ml을 첨가하여 섞어 준 후, 상온에서 15분간 정치하였다. 클로로포름 200 ul를 첨가하고 잘 섞은 다음 4℃에서 12000 rpm으로 원심분리하고 상등액을 새 튜브로 옮겨서 이소프로필알콜 500 ul를 넣고 잘 섞은 후, 4℃에서 12000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고 침전물을 75% 에탄올 1 ml로 씻어 낸 후 DEPC-DW 50 ul로 녹였다.

(4-2) Full-length cDNA syntheis

Full-length cDNA 합성은 CapFishing full-length cDNA Premix Kit (SeeGene사, 미국)를 사용하였다. 우선 상기 과정으로 분리된 total RNA 3 ug에 5 mM dNTP, 10 uM dT-adaptor를 첨가하고 75℃에서 3분 간 배양하였다. 얼음에서 식힌 다음, 5X RT buffer, 0.1 M DTT, CapFishing solution, BSA, RNase inhibitor, SuperScript III (Invitrogen사, 미국) 200 Unit를 첨가하고 42℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 CapFishing adaptor를 첨가하고 42℃에서 30분간 더 배양하였다. 94℃에서 5분간 배양하고 얼음에 식힌 후 사용 될 때 까지 냉동 보관 하였다.

(4-3) 결빙방지 단백질 full-length cDNA 증폭 및 cloning

상기 과정에서 얻어진 total full-length cDNA를 주형으로 사용하여 효모의 결빙방지 단백질을 증폭하기 위하여 forward primer 12F(표 1 참조)을 제작하였다. full-length cDNA 1 ul, forward primer 12F (10 pmol) 1 ul, 3’-RACE primer (SeeGene사, 미국) (10 pmol) 1 ul, Pfu PreMix (엘피스바이오텍사, 한국) 10 ul, 멸균 증류수 37 ul를 혼합하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간, (94℃ 30 초, 55℃ 30초, 72℃ 1분) 30 cycles, 72℃ 10분으로 설정하였으며, Thermal cycler Dice(TaKara, 일본) PCR 장비를 사용하였다. 얻어진 PCR 산물에 Taq polymerase 1 Unit을 첨가하여 72℃에서 10분간 반응한 후 PCR purification Kit (바이오니아사, 한국)로 정제하였다. 정제된 산물은 TA cloning vector(Invitrogen사, 미국) 로 cloning 하였다(서열번호 2).

<실시예 5> 성숙 결빙방지 단백질 유전자를 포함한 대장균 발현 재조합 plasmid

성숙 결빙방지 단백질 유전자를 발현 벡터에 넣기 위해 forward primer 12F와 reverse primer 12R(표 1 참조)를 제작하였다. full-length cDNA 1ul, forward primer 12F (10 pmol) 1ul, reverse primer 12R (10 pmol) 1ul, Pfu PreMix (엘피스바이오텍사, 한국) 4 ul, 멸균된 증류수, 13 ul를 혼합하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분간, (94℃ 30 초, 55℃ 30초, 72℃ 1분) 30 cycles, 72℃ 10분으로 설정하였으며, Thermal cycler Dice(TaKara, 일본) PCR 장비를 사용하였다. 얻어진 PCR 산물에 Taq polymerase 1 Unit을 첨가하여 72℃에서 10분간 반응한 후 PCR purification Kit (바이오니아사, 한국)로 정제하였다. 정제된 산물은 TA cloning vector(Invitrogen사, 미국) 로 cloning 하였다. 이 plasmid를 함유한 대장균을 배양 한 후 plasmid를 정제 하였다. 정제된 plasmid 1 ug, Nde I (10 unit/ul) 1 ul, Xba I (30 units/ul) 1ul, 10X reaction buffer 5 ul를 혼합하고 멸균된 증류수로 전체 50 ul가 되게 첨가한 후, 37℃에서 3 시간 배양하였다. 1.5 % 아가로즈 젤에 전기 영동 한 후 절단된 결빙방지 단백질 유전자 단편(삽입 유전자)을 정제하였다.

pCold I plasmid (TaKaRa사, 일본) 1 ug, Nde I (10 unit/ul) 1 ul, Xba I (30 units/ul) 1ul, 10X reaction buffer 5 ul를 혼합하고 멸균된 증류수로 전체 50 ul가 되게 첨가한 후, 37℃에서 3 시간 배양하였다. 제한 효소 처리된 plasmid는 0.7% 아가로즈에서 전기 영동 한 후, 정제하였다.

삽입 유전자 200 ng, 벡터 100 ng, 10X ligation buffer 2 ul, T4 DNA ligase 1ul를 혼합하고 멸균된 증류수를 전체 20 ul가 되게 첨가하였다. 이 혼합액을 4℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 배양액 20 ul를 competent E. coli DH5alpha (엔지노믹스사, 한국) 100 ul에 첨가하고, 얼음에서 30분간 정체 하였다. 42℃에서 45초간 배양하고 얼음에서 2분간 둔 다음, LB 배지 400 ul를 첨가한다. 37℃에서 1시간 배양 한 후, 암피실린(50 ug/ml)이 첨가된 LB 평판 배지에 100 ul, 300 ul 씩 각 각 도말하고, 37℃에서 14시간 배양 하였다. 얻어진 colony의 삽입 유무를 확인 하기 위하여 colony PCR을 실시하였다. 확인된 colony를 암피실린(50 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 5 ml에 접종한 뒤 37℃에서 14 시간 배양한 후 plasmid를 분리하였다. 분리된 plasmid는 염기서열 분석을 통하여 다시 확인 하였다. 이렇게 확인된 재조합 plasmid pCI12mAFP는 형질전환체 제작에 사용되었다.

<실시예 6> 결빙방지 단백질 유전자를 발현하는 대장균 형질전환체의 제작

pCI12mAFP 재조합 plamid를 이용하여 실시예 5에서와 같은 방법으로 Competent E. coli BL21(DE3)에 형질 전환 하였다. 상기 형질전환체 E. coli BL21(DE3)/pColdI12mAFP를 2009년 6월 1일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KFCC11447P).

<실시예 7> 결빙방지 단백질의 발현 및 수용성 분획 분리

형질전환된 E. coli BL21(DE3)/pColdI12mAFP을 암피실린(50 ug/ml)이 첨가된 LB 배지 5ml에 접종하고 37℃에서 200 rpm으로 밤새 진탕 배양하였다. 배양된 1ml을 암피실린(50 ug/ml) LB 배지 1 liter에 옮긴 후 37℃에서 진탕 배양하였다. OD₆₀₀이 0.5 정도로 자랐을 때, 15℃에서 30분간 정치하였다. 이어서, 최종 농도가 1 mM이 되게 IPTG를 첨가하고 15℃에서 20 시간 진탕 배양하였다.

발현된 결빙방지 단백질을 분석하기 위하여, 세포 배양액을 원심분리하여 상등액을 모은 세포 1g 당 B-PER solution(Thermo사, 미국) 4 ml첨가하여 잘 섞어 주고 10 ul를 취하여 두었다(Total extract).

12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 새 tube로 옮기고 10 ul를 취하여 두었다(soluble fraction). 침전물을 다시 B-PER solution 4 ml을 넣고 잘 섞은 뒤 10 ul를 취하였다(Insoluble fraction).

상기 과정으로 얻은 추출 분획 10 ul에 2X SDS loading buffer 10 ul를 섞고 잘 섞은 후 95℃에서 5분간 배양하였다. 준비된 15% SDS-polyacrylamide gel에 15 ul 씩 넣고 전기 영동한 후, Coomassie brilliant Blue로 염색하였다.

<실시예 8> 결빙방지 단백질 활성 측정 및 얼음 결정 형태 관찰

결빙방지 단백질에 의한 얼음결정 형태의 변화를 관찰하기 위하여 나노리터 삼투압계(nanoliter osmometer)(Otago osmometers, New Zealand)를 사용하였다. 구체적으로, 샘플 챔버 내에 immersion oil을 채운 후 상기 실시예 7의 수용성 분획을 오일 위에 올려 두었다. 샘플 챔버를 스테이지에 올려놓고 -20℃로 급속 냉동시키고 온도를 천천히 상승시켜 얼음 결정은 대부분 녹고 관찰 대상 결정만을 남겼다. 다시 스테이지의 온도를 천천히 내리면서 얼음 결정이 형성되는 것을 관찰하였다. 온도가 하강해도 얼음 결정이 커지지 않고 유지하다가 급격히 결정이 성장하는 모양도 관찰하였다(도 4).

도 1은 본 발명에 따른 AFP와 다른 결빙방지 단백질의 아미노산 서열 상동성을 비교한 그림이고,

도 2는 본 발명에 사용된 pCold I expression 벡터 지도이고,

도 3은 본 발명에 따라 대장균에서 발현된 성숙 AFP를 SDS-PAGE로 확인한 사진이고;

M: 분자량마커(Molecular marker);

N: 발현 유도전 총 파쇄액(Total lysate before induction);

T: 발현 유도후 총 파쇄액(Total lysate after Induction);

S: 수용성 분획(Soluble fraction);

I: 불용성 분획(Insoluble fraction),

도 4는 본 발명의 수용성 성숙 AFP의 활성에 의해 ice crystal의 모양 과 어는점 이하에서 급격히 커질 때의 형태를 오스모미터 나노미터로 관찰한 사진이다.

<110> KOREA OCEAN RESEARCH AND DEVELOPMENT INSTITUTE <120> Antifreeze protein gene derived from Leucosporidium sp., the recombinant vector harboring the gene, and recombinant ice binding protein produced by the plasmid <130> PD09109 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2007 <212> DNA <213> Leucosporidium sp. AY30 <400> 1 agaagcagga cgtctggact ctgaggaggc gggcggcgtg cgattggcgg cttggcgccg 60 tctcctcaat ctttgctcgc ctccgtgcgt cgtctattct ctgttgcaga ggctctttca 120 ggactactga cacggttcgg tgtctcgcag acggtcgagc tcaacggagc aggaggacac 180 tcgttatcgc gcagcccatc ccactgctct ccctacgccg tttcgattta ggcaagccct 240 tcctgctcct ctcgtcaccg cgtcaacctc tcaccttgtc ctcccgacgc agctggacgc 300 cgtttcctgc tccttcctct ccatcgcaac cgacgactga tgaccaattt ttgcaaccct 360 gccaaacgtg tccatgtggg ttagtcgcac ccaaggcagg tccttctagc tcgaaaactt 420 taactgcttt tatataactt ctccttcgca atatcctcgc gaatctcgct accgtgtgtt 480 cacggccacg aagacccccc gtgtttccgc gttggctgcg tagcctcaac ccaatcctgc 540 tcggtcgcat agttctagtt tgctcgctgc ctctgtgtca ttcgtgggtc cgcgggacct 600 tctcggaata attcactcag cagaagcgtt cgttcgttcc tcctctcttc ttccttcacc 660 actcctctca acgccctact cctctcaacc aacaccttca cctctctcca aatgtctctc 720 ctctcgatta tcaccatcgg actcgccggt ctcggaggcc ttgtcaacgg acagcgcgac 780 ctctccgtcg agctcggagt cgcttccaac tttgccatcc tcgctaaggc aggcatctca 840 agcgtccctg actcagcgat ccttggcgac attggagtgt cgcccgccgc cgccacctgt 900 acgtcgagct tcgccatcga ctttacaacg ctgatttatc tcgtgcagac atcactggct 960 tcggtctcac ccagggtacg ttccagcatc gcagttggtc tgactactcg tcgctaactc 1020 tcctcacaga ctccagcacc acgtacgcga cctctcccca ggtcaccggt ttgatctacg 1080 ctgcagacta ctcgactccg tgcgtccctt cctctgggac tcagttctct cgctaatcca 1140 aaccgtgaca gtactcccaa ctacctcgcc gccgccgttg ccaacgccga gactgcctgt 1200 acgtctctcg ctccatactc cctaccgaag ctcacccttc tcttctccgc agacaaccag 1260 gccgccggat tcgtcgaccc cgacttcctc gagcttggag ctggtgaact tagggaccag 1320 acccttgttc ctggtacgtc gcatgctctt gagtttgagt tttggtttgg cgcggcagct 1380 aacagcgaga tcaccaaata ggactctaca agtggacgtc ctcggtctcg gttcctaccg 1440 acctcacctt tgagggaaag tgcgtcgttg tgccagtttc ctgcatctgc gacggtagct 1500 gactgtgctt cgcagcggcg acgccacctg ggttttccag atcgctggag gcctcagcct 1560 tgccgacggt gttgccttcg taggttaaat cttccttcgc gtgtgagcgc gtgcgcgtcg 1620 ctgactcgtt cttcatcgca gaccctcgct ggcggagcga actcgaccaa catcgcgttc 1680 caggtcggtg acgacgtcac gtacgtccgt tcccactgcc tttcgcactc agtccttata 1740 cgttcgttca cagcgtcgga aagggagctc acttcgaggg tgtcctcctc gccaagcgct 1800 tcgtcaccct ccagaccggc tcgtccctca acggtcgcgt cttgagtcag accgaggtcg 1860 ctctccagaa ggccaccgtc aactctccct tcgtccctgc ccccgaggtc gtccagaagc 1920 gctcgaacgc ccgccagtgg ctttaagcgt ctccctcttg tccaatacac ctccttttcc 1980 tctcttaact ctctttcgat acgcggt 2007 <210> 2 <211> 967 <212> DNA <213> Leucosporidium sp. AY30 <400> 2 cgggaccttc tcggaataat tcactcagca gaagcgttcg ttcgttcctc ctctcttctt 60 ccttcaccac tcctctcaac gccctactcc tctcaaccaa caccttcacc tctctccaaa 120 tgtctctcct ctcgattatc accatcggac tcgccggtct cggaggcctt gtcaacggac 180 agcgcgacct ctccgtcgag ctcggagtcg cttccaactt tgccatcctc gctaaggcag 240 gcatctcaag cgtccctgac tcagcgatcc ttggcgacat tggagtgtcg cccgccgccg 300 ccacctacat cactggcttc ggtctcaccc aggactccag caccacgtac gcgacctctc 360 cccaggtcac cggtttgatc tacgctgcag actactcgac tcctactccc aactacctcg 420 ccgccgccgt tgccaacgcc gagactgcct acaaccaggc cgccggattc gtcgaccccg 480 acttcctcga gcttggagct ggtgaactta gggaccagac ccttgttcct ggactctaca 540 agtggacgtc ctcggtctcg gttcctaccg acctcacctt tgagggaaac ggcgacgcca 600 cctgggtttt ccagatcgct ggaggcctca gccttgccga cggtgttgcc ttcaccctcg 660 ctggcggagc gaactcgacc aacatcgcgt tccaggtcgg tgacgacgtc accgtcggaa 720 agggagctca cttcgagggt gtcctcctcg ccaagcgctt cgtcaccctc cagaccggct 780 cgtccctcaa cggtcgcgtc ttgagtcaga ccgaggtcgc tctccagaag gccaccgtca 840 actctccctt cgtccctgcc cccgaggtcg tccagaagcg ctcgaacgcc cgccagtggc 900 tttaagcgtc tccctcttgt ccaatacacc tccttttcct ctcttaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaa 967 <210> 3 <211> 261 <212> PRT <213> Leucosporidium sp. AY30 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <400> 3 Met Ser Leu Leu Ser Ile Ile Thr Ile Gly Leu Ala Gly Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Asn Gly Gln Arg Asp Leu Ser Val Glu Leu Gly Val Ala Ser 20 25 30 Asn Phe Ala Ile Leu Ala Lys Ala Gly Ile Ser Ser Val Pro Asp Ser 35 40 45 Ala Ile Leu Gly Asp Ile Gly Val Ser Pro Ala Ala Ala Thr Tyr Ile 50 55 60 Thr Gly Phe Gly Leu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Thr Ser 65 70 75 80 Pro Gln Val Thr Gly Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Ser Thr Pro Thr 85 90 95 Pro Asn Tyr Leu Ala Ala Ala Val Ala Asn Ala Glu Thr Ala Tyr Asn 100 105 110 Gln Ala Ala Gly Phe Val Asp Pro Asp Phe Leu Glu Leu Gly Ala Gly 115 120 125 Glu Leu Arg Asp Gln Thr Leu Val Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Thr Ser 130 135 140 Ser Val Ser Val Pro Thr Asp Leu Thr Phe Glu Gly Asn Gly Asp Ala 145 150 155 160 Thr Trp Val Phe Gln Ile Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ala Asp Gly Val 165 170 175 Ala Phe Thr Leu Ala Gly Gly Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ala Phe Gln 180 185 190 Val Gly Asp Asp Val Thr Val Gly Lys Gly Ala His Phe Glu Gly Val 195 200 205 Leu Leu Ala Lys Arg Phe Val Thr Leu Gln Thr Gly Ser Ser Leu Asn 210 215 220 Gly Arg Val Leu Ser Gln Thr Glu Val Ala Leu Gln Lys Ala Thr Val 225 230 235 240 Asn Ser Pro Phe Val Pro Ala Pro Glu Val Val Gln Lys Arg Ser Asn 245 250 255 Ala Arg Gln Trp Leu 260 <210> 4 <211> 886 <212> DNA <213> Leucosporidium sp. AY30 <400> 4 acgccatatc gccgaaaggc acacttaatt attaagaggt aatacaccat gaatcacaaa 60 gtgcatcatc atcatcatca tatcgaaggt aggcatatgc agcgcgacct ctccgtcgag 120 ctcggagtcg cttccaactt tgccatcctc gctaaggcag gcatctcaag cgtccctgac 180 tcagcgatcc ttggcgacat tggagtgtcg cccgccgccg ccacctacat cactggcttc 240 ggtctcaccc aggactccag caccacgtac gcgacctctc cccaggtcac cggtttgatc 300 tacgctgcag actactcgac tcctactccc aactacctcg ccgccgccgt tgccaacgcc 360 gagactgcct acaaccaggc cgccggattc gtcgaccccg acttcctcga gcttggagct 420 ggtgaactta gggaccagac ccttgttcct ggactctaca agtggacgtc ctcggtctcg 480 gttcctaccg acctcacctt tgagggaaac ggcgacgcca cctgggtttt ccagatcgct 540 ggaggcctca gccttgccga cggtgttgcc ttcaccctcg ctggcggagc gaactcgacc 600 aacatcgcgt tccaggtcgg tgacgacgtc accgtcggaa agggagctca cttcgagggt 660 gtcctcctcg ccaagcgctt cgtcaccctc cagaccggct cgtccctcaa cggtcgcgtc 720 ttgagtcaga ccgaggtcgc tctccagaag gccaccgtca actctccctt cgtccctgcc 780 cccgaggtcg tccagaagcg ctcgaacgcc cgccagtggc tttaatctag ataggtaatc 840 tctgcttaaa agcacagaat ctaagatccc tgccatttgg cgggga 886 <210> 5 <211> 241 <212> PRT <213> Leucosporidium sp. AY30 <400> 5 Gln Arg Asp Leu Ser Val Glu Leu Gly Val Ala Ser Asn Phe Ala Ile 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Gly Ile Ser Ser Val Pro Asp Ser Ala Ile Leu Gly 20 25 30 Asp Ile Gly Val Ser Pro Ala Ala Ala Thr Tyr Ile Thr Gly Phe Gly 35 40 45 Leu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Thr Ser Pro Gln Val Thr 50 55 60 Gly Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Ser Thr Pro Thr Pro Asn Tyr Leu 65 70 75 80 Ala Ala Ala Val Ala Asn Ala Glu Thr Ala Tyr Asn Gln Ala Ala Gly 85 90 95 Phe Val Asp Pro Asp Phe Leu Glu Leu Gly Ala Gly Glu Leu Arg Asp 100 105 110 Gln Thr Leu Val Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Thr Ser Ser Val Ser Val 115 120 125 Pro Thr Asp Leu Thr Phe Glu Gly Asn Gly Asp Ala Thr Trp Val Phe 130 135 140 Gln Ile Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ala Asp Gly Val Ala Phe Thr Leu 145 150 155 160 Ala Gly Gly Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ala Phe Gln Val Gly Asp Asp 165 170 175 Val Thr Val Gly Lys Gly Ala His Phe Glu Gly Val Leu Leu Ala Lys 180 185 190 Arg Phe Val Thr Leu Gln Thr Gly Ser Ser Leu Asn Gly Arg Val Leu 195 200 205 Ser Gln Thr Glu Val Ala Leu Gln Lys Ala Thr Val Asn Ser Pro Phe 210 215 220 Val Pro Ala Pro Glu Val Val Gln Lys Arg Ser Asn Ala Arg Gln Trp 225 230 235 240 Leu

Claims (8)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 4의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 가지고, 결빙방지 단백질을 암호화하는 유전자.
2. 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 결빙방지 단백질.
3. 제1 항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제3 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 결빙방지 단백질을 암호화하는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는 pCI12mAFP인 재조합 벡터.
5. 제3 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
6. 제5 항에 있어서, 형질전환체가 E. coli BL21(DE3)/pCI12mAFP(수탁번호: KFCC11447P)인 형질전환체.
7. 제5 항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 제2 항의 결빙방지 단백질을 대량으로 생산하는 방법.
8. 제2 항의 결빙방지 단백질을 포함하는, 일정온도에서 시료의 결빙을 저해 또는 방지하는 결빙방지용 조성물.

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