KR101300177B1

KR101300177B1 - 극지 효모 유래 결빙방지단백질의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR101300177B1
Application number: KR1020110044852A
Authority: KR
Inventors: 김학준; 강성호; 이준혁; 이성구; 한세종; 박종찬; 박경선
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2013-08-26
Also published as: US9012179B2; JP2014513980A; JP5824139B2; KR20120126794A; US20140193854A1; WO2012157794A1

Abstract

본 발명은 극지 효모 유래 결빙방지단백질의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 루코스포리듐 속 (Leucosporidium sp.) 극지 효모 유래 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 효모발현 시스템에 최적화하여 변형시킨 재조합 폴리뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 효모발현 시스템을 이용하여 발현시키는 결빙방지단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

Description

극지 효모 유래 결빙방지단백질의 대량 생산방법{Mass producing method of anti-freezing protein derived from arctic yeast}

본 발명은 북극효모 유래 결빙방지 단백질의 대량 생산방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 루코스포리듐 속 (Leucosporidium sp.) 극지 효모 유래 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 효모발현 시스템에 최적화하여 변형시킨 재조합 폴리뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 효모발현 시스템을 이용하여 발현시키는 결빙방지 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

극지 생물체는 낮은 온도인 극지의 환경에서 살아가기 위해서 줄어든 효소 활성, 줄어든 생체막 유동성, 단백질의 불활성화 및 잘못된 접힘, 세포내에서의 얼음결정 형성 등과 같은 문제점들을 극복해야만 한다. 이중에서도 얼음결정의 생성은 얼음결정의 성장에 의한 물리적인 손상과 조직의 탈수현상을 유발하여 극지 생물체에 심각한 손상을 입힌다. 극지 생물체들은 낮은 온도에서 살아가기 위해 다양한 결빙방지 단백질(Antifreeze protein: 이하 ‘AFP’라고 함) 을 생산한다. AFP는 생체 내에서의 얼음 결정의 성장 및 재결정을 억제하는 기능을 통해 영하의 온도에서도 극지의 생물체들을 보호하고 살아 갈 수 있게 해준다 (Davies, P. L. and Sykes, B. D., Curr . Opin . Struct . Biol .7, 1997, 828-834; Davies, P. L. et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.357, 2002, 927-935; D'Amico, S. et al., EMBO Rep.7, 2006, 385-389).

AFP는 일반적으로 편편한 얼음 결합부위를 가지고 얼음 결정의 특정 면에 결합하여 얼음 결정의 성장과 재결정화를 억제 하는 특징을 가지는 단백질로써, 얼음에 결합하여 녹는점과 어는점의 차이를 만든다. 이를 열적 이력현상(thermal hysteresis: TH) 라고 하며, 나노리터 삼투압계(nanoliter osmometer)를 사용해서 측정할 수 있고 AFP의 활성을 측정하는 지표로 사용된다. AFP의 또 다른 특징은 자동차에 사용되는 일반 부동액과는 달리 농도에 비례하여 어는점을 낮추지 않는다. 즉 AFP는 얼음과의 직접적인 상호작용을 통해 아주 낮은 농도에서도 효과적으로 어는점을 낮출 수 있고 이로 인해 생체 내에서 동결 과정 중에 발생하는 삼투압에 의한 손상을 최소화 할 수 있다 (Jia, Z. and Davies P.L., Trends Biochem. Sci. 27, 2002,101-106).

얼음 결정의 성장을 방지하고 재결정화를 억제한다는 AFP의 독특한 특성은 다양한 상업적인 분야에 이용되고 있다. 예를 들면 농업분야에서는 작물의 냉해를 방지하는 목적으로 작물 내에서의 AFP 발현을 시도하고 있고, 어업분야에서는 상업적으로 유용한 북대서양 연어(Atlantic salmon: Salmo salar) 혹은 금붕어(goldfish: Carassius auratus) 같은 물고기에 AFP를 발현시킨 형질전환 물고기를 만들어서 추운 지역에서도 양식을 가능하게 하는 시도가 진행되고 있다. 뿐만 아니라, 의학 분야에서는 저온수술(cryosurgery)과 혈액, 줄기세포, 제대혈, 장기, 생식세포의 냉동보존액의 첨가물로써 AFP 사용에 대한 연구가 진행되고 있다. 그리고 식품분야에서도 더욱 부드러운 질감의 아이스크림 냉동 보관을 위한 제품생산에 사용되고 있다. 화장품 분야에서는 동상예방을 위해 AFP가 첨가된 기능성 화장품이 이미 판매 되고 있다. 위와 같이 상업적인 활용 용도가 많고 유용한 AFP 이지만 낮은 발현 수준과 폴딩 문제 때문에 지금까지는 재조합 AFP을 대량으로 생산하는 데에는 한계가 있었다. 그 주된 이유는 대부분의 AFP이 이황화 결합(disulfide bond)을 가지고, 이황화 결합에 의해 안정화 되어지기 때문에 재조합 단백질의 발현이 어렵고, 또한 발현된 단백질의 제대로된 폴딩을 찾기가 어렵기 때문이다.

처음으로 차가운 바다에 서식하는 물고기로부터 AFP가 발견된 이후로 곤충, 식물, 곰팡이류, 미생물에서 다양한 종류의 새로운 AFP들이 발견되고 있다. 최근에 루코스포리듐 속 극지 효모 유래의 새로운 AY30 AFP가 발견되었고, AY30 AFP는 단 하나의 시스테인(cysteine) 아미노산 잔기도 가지고 있지 않기 때문에 재조합 단백질을 제작하였을 때, 단백질의 발현양이 많고 잘못 형성된 이황화 결합에 의한 폴딩 문제가 발생하지 않는 장점이 있어서 재조합 AFP의 대량 생산에 적합하다.

이에, 본 발명자들은 극지 효모에서 유래한 AFP를 활성형의 단백질 형태로 과발현시켜서 대량으로 생산하기 위하여, 효모 발현 시스템에 최적화된 코돈(codon)으로 발현되도록 AFP 유전자를 변형시킨 재조합 뉴클레오타이드를 합성하고 이를 효모 유래 발현벡터에 삽입하여 배양한 결과, 과량의 재조합 AFP를 수득하였으며, 이러한 AFP는 글리코실화(glycosylation)되어져 있다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 명세서에 기재된 참고 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 산업적으로 유용한 활성형의 AFP를 대량으로 수득할 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 루코스포리듐 속 극지 효모 유래 AFP를 코딩하는 유전자를 효모발현 시스템에 최적화하여 변형시킨 재조합 폴리뉴클레오타이드를 합성하고, 이를 효모발현 시스템을 이용하여 발현시키는 AFP의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 AY30 AFP의 생산 방법에 의하면, 자연형 AFP와 유사한 활성을 가지는 AFP를 대량으로 수득할 수 있으며 이러한 재조합 AY30 AFP 또는 이를 함유하는 배양액은 의료, 군수, 냉동식품산업 및 냉해방지 농작물 저장법 등의 산업에서 매우 다양하게 결빙방지용 첨가제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 극지 효모 유래 결빙방지단백질을 발현하는 재조합 벡터의 제한 효소 지도이다.
도 2는 루코스포리듐 속 (Leucosporidium sp.) AY30 결빙방지단백질의 DNA 서열과 본 발명에 따른 코돈 최적화 작업의 결과로 얻어진 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열(Syn_AY30) 과의 대응(alignment) 서열을 나타낸다.
도 3 및 도 4는 본 발명에 따른 형질전환체를 배양한 결과 배양된 세포의 양을 나타낸 그래프로서, 도 3은 배양 시간의 경과에 따른 광학 밀도(OD)를, 도 4는 세포 건조 중량(DCW)을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 형질전환체를 배양한 결과 얻어진 배양액의 총단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 내지 도 8은 배양 온도에 따른 재조합 AY30 결빙방지단백질의 발현 양상을 비교한 사진으로서, 도 6은 30℃에서의 발현 양상을, 도 7은 25℃에서의 발현 양상을, 도 8은 20℃에서의 발현 양상을 각각 나타낸다.
도 9 및 도 10은 재조합 AY30 결빙방지단백질이 쿠마시 염색(coomassie staining)과 파스 염색(PAS staining)을 통해 글리코실화되었는지 여부를 확인한 사진이다.
1: 자연형(native) AY30 결빙방지단백질;
2 및 3: 박테리아 발현시스템으로 생산된(Bacterial expressed) 재조합 AY30 결빙방지단백질;
4: 피키아 파스토리 ( Pichia pastoris) 발현시스템으로 생산된 재조합 AY30 결빙방지단백질
도 11은 AFP의 antibody를 이용한 western blot 실험 결과를 나타낸 것이며,
1: 자연형 AY30 결빙방지단백질;
2 및 3: 박테리아 발현시스템으로 생산된 재조합 AY30 결빙방지단백질;
4: 피키아 파스토리 ( Pichia pastoris) 발현시스템으로 생산된 재조합 AY30 결빙방지단백질
도 12 및 도 13은 본 발명에 따른 재조합 AY30 결빙방지단백질이 얼음결정의 성장을 억제하고 있는 형태를 오스모미터 나노미터 기기로 관찰한 사진이며, 도 12는 30℃에서 도 13은 25℃에서 배양하여 수득한 재조합 AY30 결빙방지단백질이다.
도 14는 배양 온도 조건별로 결빙방지 활성을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 루코스포리듐 속 극지 효모 유래 AY30 AFP 또는 이를 함유하는 배양액을 대량으로 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (ⅰ) 루코스포리듐 속 극지 효모 유래 AY30 AFP를 코딩하는 유전자를 효모 발현시스템에 최적화하여 변형시킨 재조합 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 단계; (ⅱ) (i)의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 효모 유래 발현벡터에 도입하는 단계, (ⅲ) 상기 재조합 발현벡터를 포함하는 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (ⅳ)상기 (ⅲ)단계로부터 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.

이 때 상기 (ⅰ) 단계의 루코스포리듐 속 극지 효모 유래 AY30 AFP을 코딩하는 DNA 서열에 대한 정보는 Swiss-Prot/TrEMBL (accession number: C7F6X3)에 나타나 있으며, 이를 이용하여 효모 발현 시스템에 맞는 코돈으로 최적화시킨 서열 번호 1의 염기 서열을 합성한다.

서열 번호 1의 염기 서열은 진핵 세포, 특히 효모에서 발현되는 경우 클리코실화된 단백질을 생산하는 특징이 있어, 활성형의 AY30 AFP를 수득할 수 있다.

또한, 상기 (ⅱ) 단계의 효모 유래 발현벡터는 본 기술 분야에서 공지인 효모 유래 발현벡터를 모두 이용 가능하나, 본 발명에서는 피키아 파스토리(Pichia pastoris) 유래의 옥시다제 프로모터를 이용하는 발현벡터를 이용하는 것이 바람직하고 가장 바람직하게는 pPICZαA를 이용한다.

구체적으로, pPICZαA는 알콜 옥시다제 프로모터(alcohol oxidase promoter: AOX)를 이용하여 발현을 유도하며, 배양액으로 분비를 유도하는 신호서열인 α-인자 메이팅 신호 서열(α-factor mating signal sequence)을 가지고 있어 재조합 폴리뉴클레오타이드의 발현시에 N-말단에 신호서열이 연결되도록 하여 재조합 AFP가 배양액으로 분비되는 효과가 있다(도 1 참조).

본 발명에서는 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 pPICZαA에 삽입하여 재조합 발현벡터 pPICZαA-AY30를 제작하고 이를 다음과 같이 기탁하였다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC11917BP

수탁일자 : 20110415

이후, 재조합 발현벡터 pPICZαA-AY30로 효모 균주를 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 재조합 AY30 AFP를 수득한다. 이 때 숙주 효모로는 피키아 파스토리를 이용하는 것이 바람직하고, 구체적으로 pPICZαA-AY30로 피키아 파스토리 X33을 형질전환시킨 형질전환체 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 을 제공한다. 숙주세포를 형질전환시키는 방법은 본 발명이 속하는 분야에서 공지의 방법으로 모두 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 전기천공법을 이용한다.

형질전환체의 배양 방법은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게 공지인 효모 배양 방법을 모두 이용 가능하다.

본 발명에서는 우선 형질전환체를 대량으로 증식시킨 다음 재조합 AY30 AFP의 발현을 유도한다.

먼저 형질전환체를 대량으로 증식시키기 위하여 종배양 후 얻은 배양액을 발효배양의 시드(seed)로 사용하는 단계로 나누어 세포배양을 진행한다.

구체적으로, 종배양은 YPD 배지에서 진탕배양하는 것이 바람직하고, 발효배양은 형질전환체의 대량증식을 위하여 글리세롤, PTM1 Trace Salts 등의 영양분을 포함한 배지를 사용하는 것이 바람직하다.

배양 온도는 15℃ 내지 35℃ 범위를 유지하는 것이 바람직하며, 20℃ 이상의 온도를 유지할 때 배양이 최대로 진행된다.

다음으로 본 발명에 따른 형질전환체 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 는 메탄올에 의하여 재조합 AY30 AFP의 발현을 시작하므로 메탄올 유가식 배양으로 AFP의 발현을 유도한다.

즉, 발효배양에서 이용된 영양성분인 글리세롤의 공급을 종료하고 글리세롤이 모두 소모되어 용존산소량의 수준이 증가하는 시점에 메탄올을 공급하여 재조합 AY30 AFP의 발현유도를 시작한다. 용존산소량의 수준이 20%를 유지하지 못할 때는 메탄올의 공급을 중단하고, 용존산소량의 수준이 증가하는 시점에서 메탄올을 다시 공급하는 방식으로 발현 유도를 진행한다.

본 발명에 따른 재조합 AY30 AFP는 N-말단의 신호 서열에 의하여 세포외로 분비되기 때문에, 특히 형질전환체를 파쇄하지 않고 연속 배양하면서 재조합 AY30 AFP가 함유된 배양액을 계속적으로 수득할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 형질전환체 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 배양액 또는 이로부터 분리한 재조합 AY30 AFP를 첨가하여 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는 방법을 제공한다.

이 때 상기 일정 온도는 시료 혹은 시료를 보관하기 위한 용액의 어는점보다 0 ~ 10°낮은 온도를 말하며, 0 ~ 4°낮은 온도에서는 시료의 결빙이 효과적으로 저해된다. 이러한 온도에서는 재조합 AY30 AFP에 의하여 얼음이 재결정화되는 것을 저해하여 시료 및 시료 보관액의 결빙을 저해한다.

상기 시료는 냉동 식품, 약품, 농화학제, 색소 및 생물학적 재료 등을 포함한다.

이 때 냉동 식품으로는 아이스크림, 냉동 과일, 정육 등 낮은 온도에서 보관하는 것이 바람직한 모든 냉동 혹은 저온 보관 식품을 포함한다.

구체적으로 아이스크림, 얼려먹는 요거트, 아이스블랜드, 슬러리 등의 냉동 디저트류에서 AFPs는 시료의 어는 점 이하의 온도에서 얼음 재결정에 의하여 큰 결정이 생성되는 것을 방지함으로써 냉동 식품의 얼음 결정 구조를 미세하게 유지하여 냉동 식품의 맛과 질을 향상시킨다.

또한 냉동 과일, 냉동 야채 및 정육 등의 냉동 혹은 저온보관 식품에서 AFPs는 얼음 재결정 활성을 통하여 식품의 냉동시 큰 결정이 형성되어 식품의 원상태가 파괴됨으로써 냉동 상태로 혹은 해동 후 섭취하는 경우 식품의 맛과 질이 현저히 손상되는 것을 방지한다.

치료 약물, 혈장 및 조직 배양을 위한 포유동물 세포 등과 같은 생물학적 재로에는 냉동과 해동 과정이 세포의 생존능을 크게 감소시키게 되며, 장기 이식시에는 조직을 냉동시키는 것은 살아있는 세포의 기능에 심각한 손상을 초래하게 되며, 식물의 냉해는 농업에 심각한 문제를 발생시킬 뿐 아니라, 약물은 엄격한 온도 조건에서 보존되지 않으면 약효가 파괴되거나 오히려 위험해질 수 있다. 이러한 경우 AFPs는 얼음 재결정 저해 활성을 통하여 생물학적 시료가 급격한 온도 변화에 저항할 수 있게 해 준다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않음은 자명하다.

재조합 폴리뉴클레오타이드의 합성 및 형질전환체 제작

1-1. 재조합 폴리뉴클레오타이드의 합성

본 발명에 사용된 극지 효모는 루코스포리디움 속 AY30 (Leucosporidium sp. AY30)으로 한국 해양 연구원 부설 극지 연구소 (Korea Ocean Polar Research Institute, KOPRI)에서 북극 스발바드군도의 Tvillingbenet 호수에서 분리한 것이다.

AY30 AFP의 전체 유전자 서열(Swiss-Prot/TrEMBL accession number: C7F6X3)을 이용하여 재조합 AY30 AFP의 파키아 파스토리(Picha pastoris) 에서의 원활한 발현을 위하여 AY30 유전자를 파키아의 codon으로 최적화 작업을 수행하였다. 인공 유전자 합성은 주형 DNA 없이 인공적으로 유전자를 합성하는 방법으로 화학적으로 합성이 가능한 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여 이들 간의 서열 상동성에 기초한 결합으로 원하는 크기의 double strand DNA를 제조하였다. 구체적으로 오버랩 연장 PCR(Overlap Extension PCR) 방법으로 인공 유전자를 합성하였으며 기본적인 합성 절차는 올리고뉴클레오타이드 디자인 및 합성, 그리고 오버랩 연장 PCR을 수행한 다음 클로닝과 시퀀싱 단계를 거쳤다.

그 결과, 서열목록 1의 염기 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열을 제작하였다.

AY30 AFP(Swiss-Prot/TrEMBL accession number: C7F6X3)의 DNA 서열과 재조합 단백질 발현을 위해 코돈 최적화 작업을 수행한 DNA 서열 (Syn_AY30) 과의 대응 서열을 도 2에 도시하였다.

1-2. 재조합 발현벡터의 제작

파키아 파스토리(Invitrogen, San Diego, CA)는 메탄올을 영양분으로 섭취하는 효모균주 X33이며, 재조합 P. pastoris X33/Mut+(methanol utilization plus)균주의 alcohol oxidase promoter (AOX1)를 이용하여 AFP AY30을 대량생산하였다.

상기 1-1에서 합성한 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열을 AOX1(alcohol oxidase promoter)를 이용하는 pPICZαA의 제한 효소 사이트에 삽입하여 재조합 발현벡터 pPICZαA-AY30를 제작하였다.

이러한 재조합 발현 벡터는 2011년 4월 15일 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11917BP)

1-3. 형질전환체의 제작

재조합 발현벡터 pPICZαA-AY30로 P. pastoris X33/Mut+를 형질전환시키기 위하여 전기천공법(electroporation)을 이용하였다.

pPICZαA에 AY30AFP가 삽입된 플라스미드 DNA는 제한효소 SacΙ을 처리하여, 균주의 genomic DNA에 삽입될 수 있는 linear한 형태로 준비하였다.

형질전환을 위한 균주 P. pastoris X33/Mut+는 YPD에 균주를 접종하여 30℃에서 200rpm으로 18시간 배양하고, 원심분리(5000rpm, 25℃, 2분)를 통해 세포만 분리했다. 분리된 균주는 ice-cold DW와 1M Sorbitol에 재현탁 후, 다시 원심 분리하는 과정을 각각 2번씩 수행해서 준비하였다.

준비된 셀에 플라스미드 DNA 3ug을 잘 섞고, ice에서 10분 동안 incubation했다. 이것을 미리 차갑게 준비한 0.1cm electroporation cuvette으로 옮겨서 pulse를(커패시턴스 25uF, 전압 900V) 진행한 후, 바로 ice로 옮겼다. ice-cold 1M Sorbitol을 넣어 배양튜브에 넣은 후 YPD와 함께 30℃에서 200rpm으로 1시간동안 배양하였다. 배양액을 분주한 YPD 고체 배지는 30℃에서 3일 동안 incubation했다.

상기 과정으로 형질전환체 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 을 수득하였다.

효모 균주의 배양

2-1. 종배양

루코스포리디움 sp. AY30의 배양은 NB배지(5g/l peptone, 3g/l beef extract)에서 2℃의 조건으로 7일 동안 진탕배양 하였다.

재조합 AY30 폴리뉴클레오사이트가 발현될 재조합 형질전환체 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 의 종배양은 YPD배지(10g/l yeast extract, 20g/l peptone, 20g/l dextrose)에서 30℃를 유지하는 진탕배양기에서 250rpm의 조건으로 하룻밤 동안 진탕 배양 하였다. 이를 발효배양의 seed 로 사용하였다.

2-2. 발효배양

재조합 형질전환체 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 의 대량배양은 최대용량이 7L인 jar bottom magnetic drive fermentor (KoBioTech, Korea)와 최대용량 50L의 종균 발효기가 있는 최대용량 500L 발효기 (KF-500 KoBioTech, Korea)를 사용하였다. 온도의 측정 기록은 발효기 내부관 부위의 열전대를 이용하였다. 용존산소량의 측정은 멸균된, polarographic dissolved oxygen electrode InProO₂ Sensors (Mettler-ToledoGmbH,Switzerland)를 사용하였다.

발효배지는 Fermentation Basal Salts Medium (26.7ml/l phosphoric acid 85%, 0.93g/l calcium sulfate, 18.2g/l potassium sulfate, 14.9g/l magnesium sulfate-7H₂O, 4.13g/l potassium hydroxide, 40g/l glycerol)에 4.35ml/l PTM1 Trace Salts(6g/l cupric sulfate-5H₂O, 0.08g/l sodium iodide, 3g/l mangane sesulfate-H₂O, 0.2g/l sodium molybdate-2H₂O, 0.02g/l boric acid, 0.5g/l cobalt chloride, 20g/l zinc chloride, 65g/l ferrous sulfate-7H₂O, 0.2g/l biotin, 5ml/l sulfuric acid)를 첨가하여 사용하였으며, pH의 조절은 연동 펌프(peristaltic pump)를 이용하여 산과 염기를 첨가하였으며, InPropH sensor (Mettler-ToledoGmbH,Switzerland)를 사용하여 pH 측정하였다.

배양조건은 30℃에서 15L/min으로 공기를 공급하고, 600rpm으로 진탕 배양하며 포화 용존산소량은 20 ~ 30% 수준을 유지하게 하였다. pH조건은 암모니아수를 이용하여 pH5를 유지하게 하였다.

발효배지에 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30 를 접종하기 전에 소포제를 소량첨가하고, 배양 중 거품이 생기면 소포제를 이용하여 거품을 제거하였다.

2-3. 글리세롤 회분식 및 유가식 배양

지속적으로 정상적인 발효는 상기 2-2에서 초기에 첨가된 글리세롤을 소모하여 균체가 자라는 동안 진행되었으며, 갑자기 용존산소량의 수준이 증가하는 시점을 분석하여 초기 글리세롤이 모두 소모된 것을 확인하였다.

균체농도 및 AFP의 생산을 증대시키기 위하여 글리세롤 유가식 배양을 실시하였으며, 이 때 12ml/l PTM1 trace salts가 포함된 50% w/v 글리세롤을 사용하였고, 공급은 18.15ml/hr/liter 초기발효액의 비율로 설정하였다. 글리세롤 공급은 9시간 동안 진행하였으며, 세포의 양을 OD600으로 측정하였을 때 글리세롤 공급전 세포농도의 3~4배가 증가하는 시점까지 공급하였다.

2-4. 메탄올 유가식 배양

재조합 AFP의 발현 유도를 위하여, 글리세롤의 공급을 종료하고 글리세롤이 모두 소모되어 용존산소량의 수준이 증가하는 시점에 12ml/l PTM1 trace salts가 포함된 100% 메탄올을 3.6 ml/hr/liter 초기발효액의 비율로 공급하였다. 또한 온도 조건을 30℃, 25℃, 20℃, 15℃의 조건으로 진행하였다. 용존산소량의 수준이 20%를 유지하지 못할 때는 메탄올의 공급을 중단하였으며, 용존산소량이의 수준이 증가하는 시점에서는 상기의 비율로 메탄올을 공급하였다.

그 결과, 배양액으로 분비된 재조합 AFP가 함유된 세포 배양액을 수득하였다.

세포 함량 측정

세포함량의 측정은 UV spectrophotometer (Ultrospec 3300 pro, Amersham Biosciences, sweden)를 이용하여 600nm에서의 optical density (OD)를 측정하였다. 세포건조중량 (Dry cell weight, DCW)은 1ml의 배양액을 원심분리하여 0.9% NaCl용액을 이용하여 세척 후 80℃ 건조기에 48시간 동안 말린 후 측정하였다. 각각의 온도 별로 발효 배양한 OD값과 DCW값을 이용하여 발효조건의 온도에 따른 상관관계를 구하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 시간의 경과에 따른 OD₆₀₀값의 변화는 초기는 비슷하게 시작하여 7일이 경과한 후에는 20℃가 훨씬 배양이 잘되었으며, 30℃와 25℃는 7일 경과 후 비슷한 경향을 나타내었다. 그리고 4일 경과 시점부터 20℃에서 성장곡선이 25℃, 30℃를 추월하는 경향을 보였다. 또한 도 4에 나타낸 Cell의 DCW (Dry Cell Weight) 결과 또한 OD₆₀₀의 결과와 동일하게 나타났으며, 20℃에서의 세포양이 훨씬 많았다.

총단백질 함량 측정

배양액의 총단백질함량은 bovine serum albumin (BSA)을 표준함량으로 설정하여 Bradford protein assay법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로 시료는 배양 중 24시간 단위로 15ml의 배양액을 채취하고 그 중 1ml를 사용하여 4℃, 4500rpm의 조건으로 5분간 원심분리 후 세포와 상등액을 분리하였다. 단백질 표준함량의 설정은 BSA를 0ug, 50ug, 100ug, 500ug, 1000ug, 2000ug으로 희석한 BSA용액 20㎕를 Bradford reagent (SIGMA-ALDRICH, USA) 1ml를 첨가하여 섞은 후 5분간 반응시간을 주고 UV spectrophotometer를 이용하여 595nm에서의 파장값을 측정 한 후 단백질 표준함량의 관계식을 구하였다. 시료 또한 위의 방법과 동일한 방법으로 시료 20㎕를 사용하였으며, 측정값을 BSA를 이용한 단백질 표준함량식에 대입하여 전체단백질함량을 구하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 30℃에서 배양하였을 때 배양액의 총단백질함량이 높은 것으로 나타났다.

SDS-PAGE 분석

배양 중 24시간 단위로 배양액의 상등액을 채취하여 동량의 2x SDS gel loading buffer (126mM Tris-Cl pH6.8, 4% SDS, 0.02% Bromophenol Blue, 20% Glycerol, 5% β-mercaptoethanol)를 혼합하여 95℃에서 시료를 denaturing 후 Laemmli법에 따라 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)를 하였다. SDS-PAGE는 1x running buffer (25mM Tris base, 192mM Glycine, 1% SDS)와 12%의 separating gel (40% Acrylamide, 1.5M Tris pH8.8, 10% SDS, 10% APS, Temed), stacking gel (40% Acrylamide, 1.5M Tris pH6.8, 10% SDS, 10% APS, Temed)을 사용하였다.

SDS-PAGE를 상기와 같은 방법으로 수행한 후 gel을 fix solution (40% ethanol, 7% acetic acid)을 사용하여 고정하였고 oxidation solution (1% periodic acid, 3% acetic acid)을 사용하여 산화시킨 후, Schiff`s reagent (SIGMA-ALDRICH, USA)를 사용하여 염색하고 reduction solution (0.58% potassium metabissulfite, 3% acetic acid)을 사용하여 환원시킨 후 확인하였다.

그 결과 도 6 내지 8에 나타낸 바와 같이, 30℃ 온도 조건에서 배양한 시료에 재조합 AY30 AFP가 비교적 다량으로 함유되어 있음을 확인하였다.

재조합 AFP의 글리코실화를 확인하기 위하여, 재조합 AFP 발현의 확인은 Coomassie brilliant blue (CBB) staining solution (0.25% Coomassie brilliant blue R250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid)을 사용하여 염색하고 AFP의 glycosylation확인은 Periodic acid Schiff reagent (PAS)를 이용하여 확인하였다.

이 때, 박테리아 발현시스템으로 생산된 재조합 AY30 AFP는 pCold I 벡터를 이용하여 대장균(E. coli Bl21 (DE3)에서 발현한 것이다.

그 결과 도 9 내지 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30에서 발현된 재조합 AY30 AFP는 본래의 AFP(native AFP)와 같이 글리코실화된 활성형임이 확인되었다.

<실시예 6> Western blot 분석

SDS-PAGE를 수행 후 gel상의 AFP를 PVDF membrane (MILLIPORE, USA)에 transfer하였다. Ttransfer buffer (5.1g/l bicine, 6.55g/l Bis-Tris, 0.375g/l EDTA, 10% methanol, pH7.2)를 사용하여 1000mM에서 1시간 30분간 transfer 하였다. 수행 후 membrane을 TBS buffer (20mM Tris, 140mM NaCl, pH7.5)로 2회 세척 후 blocking buffer (3% bovine serum albumin, 20mM Tris, 140mM NaCl, pH7.5)에 1시간 동안 incubation하고, TBSTT buffer (0.1% Tween20, 0.2% Triton X-100, 20mM Tris, 140mM NaCl, pH7.5)에 2회 세척 후 TBS buffer로 1회 세척하고 1/8000으로 희석된 1차 항체(Anti-rIAY30 poly. Ab. Rabbit, Cosmo gene Tech, korea)가 함유된 blocking buffer에 1시간 incubation하였다. 후에 TBSTT buffer로 2회, TBS buffer로 1회 세척 후 1/90000으로 희석된 2차 항체(Anti-rabbit Ig G, Sigma, USA)가 함유된 blocking buffer로 1시간 incubation 후 TBSTT buffer로 4회 세척하고, BCIP/NBT-purple Liquid Substrate System (Sigma, USA)으로 확인하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 western blot 실험을 통하여 본 발명의 P. pastoris X33/Mut⁺/pPICZaA-AY30에서 발현된 재조합 AFP와 박테리아에서 발현된 재조합 AFP가 native AFP와 아미노산 서열이 같은 단백질이라는 사실을 확인하였다.

<실시예 7> AFP AY30의 결빙방지 활성분석

AFP AY30에 의한 얼음결정 형태의 변화를 관찰하기 위하여 nanoliter osmometer (nanolitre osmometer, Otago Osmometers Ltd, NewZealand)를 사용하였다. 구체적으로, 샘플 챔버 내에 immersion oil을 채운 후 측정 시료를 오일 위에 올려두었다. 샘플 챔버를 스테이지에 올려놓고 -20℃로 급속냉동 시키고 온도를 천천히 상승시켜 얼음 결정이 대부분 녹고 관찰 대상 결정만을 남겼다. 다시 스테이지의 온도를 천천히 내리면서 얼음 결정이 형성되는 것과 온도(melting temperature)를 관찰 및 측정하였다. 온도가 하강해도 얼음 결정이 커지지 않고 유지하다가 급격히 결정이 성장하는 온도를(freezing temperature) 측정하여 결빙방지 활성 (thermal hysteresis)을 분석하였다.

그 결과, 하기 표 1 및 도 12 내지 14의 그래프에 나타난 바와 같이 두 가지 다른 배양온도에서 생산된 재조합 AY30 AFP는 결빙방지 활성을 가지는 활성형이라는 사실을 확인하였다.

	0	24	48	72	96	120	144	168
30℃	0.080	0.303	0.363	0.317	0.407	0.393	0.413	0.370
25℃	0.070	0.307	0.453	0.320	0.403	0.407	0.403	0.355

한국생명공학연구원

KCTC11917BP

20110415

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(i) 서열 번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 합성하는
단계;
(ii) (i)의 폴리뉴클레오타이드를 피키아 파스토리(Pichia pastoris) 유래의 알콜 옥시다제 프로모터를 이용하는 발현 벡터에 도입하는 단계,
(iii) 상기 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 피키아 파스토리(Pichia pastoris) 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(iv) 상기 (iii)단계로부터 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 극지 효모 유래 결빙방지 단백질 또는 이를 함유하는 배양액의 대량 생산방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (ii)에서 피키아 파스토리(Pichia pastoris) 유래의 알콜 옥시다제 프로모터를 이용하는 발현벡터는 pPICZαA인 대량 생산방법.
청구항 1 있어서, 상기 (ⅲ) 의 재조합 발현벡터는 pPICZαA-AY30(수탁번호:KCTC11917BP)인 대량 생산방법.
결빙방지 단백질을 발현하는 서열 번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.