KR101492434B1 - 플라보박테리움 프리고리스 유래 결빙방지 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래의 결빙방지 단백질에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 호냉성 남극 박테리아인 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래의 결빙방지 단백질(FfIBP), 이를 코딩하는 유전자, 재조합 결빙방지 단백질의 제조방법 및 재조합 결빙방지 단백질의 결정에 관한 것이다.
본 발명에 따른 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래 결빙방지 단백질(FfIBP)은 시료의 결빙을 방지하는 효과가 뛰어나므로, 산업 전반에 걸쳐 유용하게 사용될 수 있다.

Description

플라보박테리움 프리고리스 유래 결빙방지 단백질{Antifreeze Protein from Flavobacterium frigoris PS1}

본 발명은 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래의 결빙방지 단백질에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 호냉성 남극 박테리아인 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래의 결빙방지 단백질(FfIBP), 이를 코딩하는 유전자, 재조합 결빙방지 단백질의 제조방법 및 재조합 결빙방지 단백질의 결정에 관한 것이다.

생체 내에서의 얼음결정의 생성은 얼음결정의 성장에 의한 세포막과 세포소기관의 물리적인 손상뿐만 아니라 조직의 탈수현상을 유발하여 생물체에 심각한 손상을 입힌다. 극지에 서식하는 생물체는 영하의 온도에서 얼지 않고 살아가기 위해서 결빙방지 단백질(AFP: Antifreeze protein) 을 발현하고 있다. 얼음에 직접적으로 결합하는 능력을 가지는 단백질들을 얼음 결합 단백질(IBP:ice-binding protein)이라고 부르는데 여기에는 결빙방지 단백질뿐만 아니라, 얼음 재결정화 억제 단백질(IRIP:ice recrystallization inhibition protein) 및 빙핵활성 단백질(INP:ice nucleation protein)을 모두 포함한다. 지금까지 연구된 바에 의하면, 결빙방지 단백질은 일반적으로 편편한 얼음 결합부위를 가지고 수소 결합 또는 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)을 통해 작은 얼음 결정의 특정 면에 결합하여 얼음 결정의 성장과 재결정화를 억제하며 녹는점과 어는점의 차이를 만든다. 이 현상을 열적이력현상(TH:thermal hysteresis)이라고 하며, 결빙방지 단백질의 활성을 측정하는 하나의 지표로 사용하고 있다 (Davies and Sykes, Curr . Opin . Struct . Biol., 7:828, 1997; Davies et al ., Philos . Trans . R Soc . Lond . B Biol . Sci ., 357:927, 2002; D'Amico et al ., EMBO Rep., 7:385, 2006).

결빙방지 단백질이 얼음 결정의 성장을 방지하고 재결정화를 억제한다는 독특한 특성은 다양한 상업적인 분야에 이용되고 있다. 예를 들면 농업분야에서는 작물의 냉해를 방지하는 목적으로 결빙방지 단백질을 작물 내에서의 발현을 시도하고 있고, 어업분야에서는 물고기에 결빙방지 단백질을 발현시킨 형질전환 물고기를 만들어서 추운 지역에서도 양식을 가능하게 하고자 하는 시도가 진행되고 있다. 뿐만 아니라, 의학 분야에서는 냉동 외과수술(Cryosurgery)과 혈액, 줄기세포, 제대혈, 장기 및 생식세포의 냉동보존액의 첨가물로써 결빙방지 단백질의 사용에 대한 연구가 진행되고 있다. 그리고 식품분야에서도 아이스크림에 결빙방지 단백질을 첨가하여 아이스크림이 녹았다가 다시 얼 때 생기는 작은 얼음 결정의 성장을 막아서 부드러운 질감을 유지하는 용도로 사용하고 있다. 화장품 분야에서는 결빙방지 단백질이 첨가된 동상예방용 기능성 화장품이 이미 판매되고 있다.

결빙방지 단백질의 또 다른 특징은 자동차에 사용되는 일반 부동액과는 달리 농도에 비례하여 어는점을 낮추지는 않는다는 것이다. 따라서 결빙방지 단백질은 아주 낮은 농도에서 효과적으로 어는점을 낮출 수 있고 이로 인해 생체 내에서 동결 과정 중에 발생하는 삼투압에 의한 손상을 최소화할 수 있다 (Jia and Davies, Trends Biochem . Sci., 27:101, 2002).

본 발명자들은 극지 효모 루코스포리디움 속 (Leucosporidium sp.) 유래 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 확보하여, 재조합 결빙방지 단백질의 생산 시스템을 구축한바 있으며(한국공개특허 제2010-0137056호), 위와 같이 결빙방지 단백질을 상업적으로 활용하기 위해서는 고활성의 결빙방지단백질을 찾아서 이를 대량 생산하는 하는 것이 중요하다.

이에 본 발명자들은 기존에 알려진 결빙방지 단백질보다 활성이 향상된 결빙방지 단백질을 확보하기 위하여 예의 노력한 결과, 호냉성 남극 박테리아 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래의 새로운 결빙방지 단백질의 유전자를 확보하고, 이 유전자에 의해서 코딩되는 재조합 단백질이 루코스포리디움 속 미생물 유래의 결빙방지 단백질에 비해 약 10배 이상의 높은 열적이력(TH) 활성을 갖는다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래의 결빙방지 단백질(FfIBP) 및 상기 결빙방지 단백질을 함유하는 결빙방지용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 재조합 결빙방지 단백질을 제조하는 방법 및 상기 재조합 결빙방지 단백질의 결정을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 결빙방지 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 재조합 결빙방지 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 결빙방지 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 결빙방지 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, P4 ₁ 22 스페이스 그룹을 가지며 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a = b = 69.4 Å 및 c = 178.2 Å인 것을 특징으로 하는 재조합 FfIBF 결빙방지 단백질의 결정을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 결빙방지 단백질을 함유하는 결빙방지용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래 결빙방지 단백질(FfIBP)은 시료의 결빙을 방지하는 효과가 뛰어나므로, 산업 전반에 걸쳐 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래 결빙방지 단백질(FfIBP)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 그림이다 (시그널 펩타이드 시퀀스 부위(아미노산 1-23)는 붉은색으로 표시하였다).
도 2는 재조합된 pCold I-FfIBP에 대한 모식도이다.
도 3은 정제된 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 SDS-PAGE 분석 결과 그림이다.
도 4은 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 얼음결합에 의한 독특한 얼음결정 형성 사진이다.
도 5은 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)과 루코스포리디움 속 유래 결빙단백질(LelIBP)의 TH 활성 비교 데이터이다.
도 6은 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 농도별 얼음 재결정화 억제 활성을 측정 결과그림이다.
도 7은 far-UV CD 스펙트럼(A) 및 near-UV CD 스펙트럼(B)을 이용한 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 이차구조 분석를 나타난 그래프이다.
도 8은 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 결정모양(A) 및 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 결정을 이용한 X-선 회절데이타 이미지(B)를 나타낸 그림이다.
도 9은 재조합 결빙방지 단백질의 삼차구조를 나타낸 모식도(A) 및 재조합 결빙방지 단백질과 다른 얼음결합 단백질들의 아미노산 서열을 비교한 데이터(B)를 나타낸 그림이다.
도 10은 재조합 결빙방지 단백질들의 삼차구조 형태 비교 분석 데이터이다 (A: FfIBP 와 LeIBP의 삼차구조 비교, B: LeIBP의 이량체(dimer) 구조, C: FfIBP의 얼음결합부위 구조 D: LeIBP의 얼음결합 부위 구조).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 남극의 맥머도만(McMurdo Sound) 근처 해변의 얼음(sea ice)에서 그람 음성균인 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1를 분리하여 플라보박테리움 프리고리스 PS1 유래의 결빙방지 단백질(FfIBP; EMBL No. EIA07191.1)의 염기서열을 분석하였다. 또한, 시그널 펩타이드(signal peptide) 시퀀스(sequence) 부위(아미노산 1-23, 서열번호 4; 염기서열, 서열번호 3)를 제외한 아미노산(29-276) 지역에 해당하는 아미노산 서열(서열번호 2) 및 상기 아미노산 지역을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 규명하였다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 결빙방지 단백질에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 결빙방지 단백질은 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 결빙방지 단백질은 서열번호 4의 아미노산으로 표시되는 시그널 펩타이드를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기의 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법 (electroporation) [Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982] 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 (pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션 (연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용한다.

본 발명의 일 실시예에서, 재조합 결빙방지 단백질의 발현을 위해 시그널 펩타이드 시퀀스 부위(아미노산 1-23)를 제외한 아미노산(29-276) 지역을 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 pCold I에 삽입하여 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 포함하는 재조합 벡터 pCold I-FfIBP를 제작하였다 (도 2).

본 발명의 pCold I 벡터는 대장균 유래 cold-shock gene의 프로모터(promoter)를 사용하며, 외래 유전자가 발현되었을 때, N-ternimal 쪽에 발현율을 높이는 TEE(translation enhancing element) 서열 및 발현된 단백질을 쉽게 정제할 수 있도록 His-Tag 서열을 포함한다

본 발명은 또 다른 관점에서, 결빙방지 단백질을 코팅하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 KCTC 12227BP인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으며, 대장균(Escherichia coli)인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pCold I-FfIBP)의 DNA염기 서열을 확인한 다음, 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)에 형질전환시켜 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제작하였다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 재조합 결빙방지 단백질을 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 결빙방지 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 결빙방지 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기의 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 재조합 결빙방지 단백질을 생성하였으며, 생성된 재조합 결빙방지 단백질을 Factor Xa 효소를 이용하여 His-tag 부위를 절단한 후, 사이즈 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 이용하여 재조합 결빙방지 단백질을 정제하였다. 정제된 재조합 결빙방지 단백질을 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석하였다 (도 3).

본 발명의 재조합 결빙방지 단백질의 결빙방지 활성 측정을 위하여, 열적이력현상(TH) 활성을 측정한 결과, 재조합 결빙방지 단백질의 얼음 결합에 의한 독특한 얼음 결정이 형성되는 것을 확인하였다 (도 4). 또한, 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)과 루코스포리디움 속(Leucosporidium sp.) 유래 결빙방지 단백질(LeIBP)의 TH(열적이력현상) 활성을 비교한 결과, 재조합 결빙방지 단백질 및 LeIBP는 50μM 농도에서 각각 2.5℃ 및 0.17℃의 TH 값을 보여, 재조합 결빙방지 단백질이 LeIBP에 비해 약 10배 이상 높은 TH 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 5). 이는 지금까지 알려진 결합방지 단백질 중에서 가장 높은 결합방지 활성을 보이는 것이다.

또한, 본 발명의 재조합 결빙방지 단백질의 결빙방지 활성 측정을 위하여, 얼음 재결정 저해(ystallization inhibition) 활성을 측정한 결과, 대조군에 비해 재조합 결빙방지 단백질을 처리한 군에서 얼음 재결정이 저해되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

본 발명은 또 다른 관점에서, P4 ₁ 22 스페이스 그룹을 가지며 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a = b = 69.4 Å 및 c = 178.2 Å인 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질의 결정에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 결빙방지 단백질은 α-헬릭스(helix) 및 β-스트랜드(strand)의 비율이 각각 8.02% 및 22.14%으로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 결빙방지 단백질은 용액 상에서 단량체로 존재하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 결빙방지 단백질은 전체적으로 삼각기둥 모양의 오른나선(right handed) 구조의 β-나선형(helical) 형태를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기의 삼각기둥의 A면은 긴 α-헬릭스(helix)와 상호작용을 하고 있고, 삼각기둥의 B면이 얼음에 직접적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 재조합 결빙방지 단백질의 이자 구조 분석을 위하여, 서큘러 다이크로이즘(Circular dichroism)을 이용하여 측정을 한 결과, far-UV CD의 스펙트럼으로부터 재조합 FfIBP의 α-헬릭스(helix) 및 β-스트랜드(strand)의 비율이 각각 8.02% 및 22.14% 인 것을 확인하였으며, 주로 β-스트랜드(strand)로 이루어진 단백질임을 예측할 수 있었다 (도 7).

본 발명의 재조합 결빙방지 단백질의 삼자 구조 분석을 위하여, 단백질 결정화 방법 중에 하나인 hanging drop vapor diffusion 방법을 이용하여 20℃에서 결정화 실험을 수행한 결과, 2일이 지난 후에 단일 결정의 가장 긴축이 0.5mm 정도까지 자란 것을 확인하였다(도 8)

또한, 본 발명의 재조합 결빙방지 단백질의 삼자 구조 분석을 위하여, 상기의 결정을 X선 회절법을 이용하여 분석을 한 결과, 재조합 결빙방지 단백질의 결정은 P4 ₁ 22 스페이스 그룹을 가지며 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a = b = 69.4 Å 및 c = 178.2 Å인 것으로 확인되었다. X선 결정학 방법으로 해석된 재조합 결빙방지 단백질의 삼차구조는 전체적으로 삼각기둥 모양의 오른나선(right handed) 구조의 β-나선형(helical) 형태를 가지며, 삼각기둥의 A면은 긴 α-헬릭스(helix)와 상호작용을 하고 있고, 삼각기둥의 B면이 얼음에 직접적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다 (도 9).

또한, 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)과 루코스포리디움 속(Leucosporidium sp.) 유래 결빙방지 단백질(LeIBP)의 삼차구조 비교한 결과, 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 경우 LeIBP에서 dimerization에 중요하다고 알려진 C-말단의 소수성 부위가 짧아 용액 상에서 단량체(mononer) 형태로 존재하며, 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 Thr, Ala 및 Asn 등의 얼음결합 잔기들이 LeIBP 보다 넓게 위치해 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).

상기에서, 본 발명의 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)이 LeIBP보다 높은 결빙방지 활성을 가지는 이유는 용액 상에서 단량체(monomer)로 존재하는 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)이 이량체(diner)로 존재하는 LeIBP보다 같은 농도일 때 얼음에 결합하는 단백질의 수가 많으며, 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 Thr, Ala 및 Asn 등의 얼음결합 잔기들이 LeIBP 보다 넓게 위치해 있어 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)의 얼음결합부위 면적이 넓기 때문이라고 불 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기의 결빙방지 단백질을 함유하는 결빙방지용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 결빙방지용 조성물은 시료의 결빙을 방지하는데 유용하게 이용될 수 있다.

상기 시료는 냉동식품, 약품, 농화학제, 색소 및 생물학적 재료 등을 포함하며, 이때 냉동식품으로는 아이스크림, 냉동 과일, 정육 등 낮은 온도에서 보관하는 것이 바람직한 모든 냉동 혹은 저온 보관 식품을 포함할 수 있다.

구체적으로 아이스크림, 얼려 먹는 요거트, 아이스블랜드, 슬러리 등의 냉동 디저트류에서 결빙방지 단백질들은 시료의 어는점 이하의 온도에서 얼음 재결정에 의하여 큰 결정이 생성되는 것을 방지함으로써 냉동식품의 얼음 결정 구조를 미세하게 유지하여 냉동식품의 맛과 질을 향상시킬 수 있다.

또한 냉동 과일, 냉동 야채 및 정육 등의 냉동 혹은 저온보관 식품에서 결빙방지 단백질은 얼음 재결정 활성을 통하여 식품의 냉동 시 큰 결정이 형성되어 식품의 원상태가 파괴됨으로써 냉동 상태로 혹은 해동 후 섭취하는 경우 식품의 맛과 질이 현저히 손상되는 것을 방지할 수 있다.

일반적으로 치료 약물, 혈장 및 조직 배양을 위한 포유동물 세포 등과 같은 생물학적 재료에는 냉동과 해동 과정이 세포의 생존능을 많이 감소시키게 되는데, 본 결빙방지 단백질 조성물은 얼음 재결정 저해 활성을 통하여 생물학적 시료가 급격한 온도 변화에 저항할 수 있게 해 준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작 및 미생물 변이체 제작

1-1 : 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작

본 연구에 사용된 남극 박테리인 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1는 그람 음성균으로 남극의 McMurdo Sound 근처 해변의 얼음(sea ice)에서 분리한 것이다. 플라보박테리움 프리고리스 PS1 유래의 결빙방지 단백질(FfIBP; EMBL No. EIA07191.1)의 염기서열을 규명하였으며, 시그널 펩타이드 시퀀스 부위(아미노산 1-23, 서열번호 4; 시그널 펩타이드 시퀀스 염기서열, 서열번호 3)를 제외한 아미노산(29-276) 지역에 해당하는 아미노산 서열(서열번호 2)에 해당하는 지역을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 pCold I(Takara Bio Inc., Japan)에 삽입하여 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pCold I-FfIBP를 제작하였다 (도 2).

pCold I 벡터는 대장균 유래 cold-shock gene의 프로모터(promoter)를 사용하며, 외래 유전자가 발현되었을 때, N-ternimal 쪽에 발현율을 높이는 TEE(translation enhancing element) 서열 및 발현된 단백질을 쉽게 정제할 수 있도록 His-Tag 서열을 포함한다.

결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작에 사용된 올리고 뉴클레오타이드 서열

프라이머	Oligonucleotide Sequences (5'- 3')
Forward(서열번호 5)	CGA TAA CAT ATG TCT CTA TCA GTT GCA AAT
Reverse(서열번호 6)	CGA TAA CTC GAG TCA TTG TGG TAT GGT AAC GGT

1-2: 재조합 결빙방지 단백질( FfIBP ) 생산능을 가지는 재조합 미생물 제작 및 재조합 결빙방지 단백질의 생산

재조합 결빙방지 단백질의 생산을 위해 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 재조합 미생물을 제작하였다.

결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터(pCold I-FfIBP)의 DNA염기 서열을 확인하였고 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균을 37℃에서 앰피실린(Ampicillin) 100㎎/㎖이 첨가된 LB 배지에서 OD값이 0.6이 될 때까지 배양하다가 1mM IPTG(isopropyl-d-1-thiogalactopyranoside) 조건에서 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 유도하였다. 이후에 16℃에서 24시간 동안 배양하여 재조합 결빙방지 단백질을 생산하였다.

생산된 재조합 결빙방지 단백질은 N-말단 부위에 hexa-histidine tag을 가지며 Factor Xa 효소를 이용해서 histidine tag을 제거할 수 있다.

실시예 2 : 재조합 미생물에서 생산된 재조합 결빙방지 단백질( FfIBP )의 정제

발현된 재조합 결빙방지 단백질을 포함하는 재조합 미생물의 cell pellet을 수확 후 차가운 라이시스 버퍼(lysis buffer; 50mM sodium phosphate(pH 8.5), 300 mM NaCl, 5mM imidazole, 0.5㎎/㎖ lysozyme, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride)에 현탁시킨다. 4℃에서 30분 동안 배양한 후 ultra-sonication (Vibra-Cell VCX400, USA)으로 세포를 파쇄시킨 후에 4℃, 16,000rpm 조건에서 40분 동안 원심분리하였다.

원심분리 후 상층액을 His-tag 흡착 컬럼(affinity column)에 통과시켜 His-tag bead에 결합한 FfIBP를 컬럼의 10배 부피의 라이시스 버퍼(lysis buffer)로 세척한 후에 용출 버퍼(elution buffer; 50 mM sodium phosphate(pH 8.5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazole)로 용출(elution) 하였다. Factor Xa 효소를 4℃에서 하룻밤 동안 처리하여 His-tag 부위를 절단 한 후, Superdex 200 HiLoad 16/60 column을 사용해서 사이즈 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 20mM Tris-HCl(pH 8.5) 및 150mM NaCl 버퍼 조건에서 수행하여 재조합 미생물에서 생산된 재조합 결빙방지 단백질을 정제하였으며, 정제된 재조합 결빙방지 단백질을 SDS-PAGE 방법을 이용하여 분석하였다 (도 3).

실시예 3 : 재조합 결빙방지 단백질( FfIBP )의 결빙방지 활성 측정

3-1 : 재조합 결빙방지 단백질의 열적이력현상 ( TH ) 활성 측정

재조합 결빙방지 단백질의 열적이력현상(TH) 활성을 측정하기 위하여 nanoliter osmometer(Otago Osmometers Ltd, NewZealand)를 사용하였다.

샘플 챔버에 이멀젼 오일(immersion oil)을 채운 후 시료를 오일 위에 올려둔 후에 스테이지 위에 샘플 챔버를 올려놓고 -20℃로 급속냉동시켰다. 그 후에 온도를 천천히 상승시키면서 관찰 대상 얼음 결정만을 남긴 다음에 다시 스테이지의 온도를 천천히 내리면서 얼음 결정이 형성되는 것과 온도(녹는점, melting temperature)를 측정하였다.

온도가 하강해도 얼음 결정이 커지지 않고 유지하다가 급격히 결정이 성장하는 온도를(어는점, freezing temperature) 측정하여 어는점과 녹는점의 온도 차이를 TH 값으로 결정하였다.

그 결과, 재조합 결빙방지 단백질의 얼음 결합에 의한 독특한 얼음 결정이 형성되는 것을 확인하였다 (도 4).

또한, 재조합 결빙방지 단백질와 루코스포리디움 속(Leucosporidium sp.) 유래 결빙방지 단백질(LeIBP)의 TH(열적이력현상) 활성을 비교한 결과, 재조합 결빙방지 단백질 및 LeIBP는 50μM 농도에서 각각 2.5℃ 및 0.17℃의 TH값을 보여, 재조합 결빙방지 단백질이 LeIBP에 비해 약 10배 이상 높은 TH 활성이 있음을 확인할 수 있었다 (도 5). 이는 지금까지 알려진 결합방지 단백질 중에서 가장 높은 결합방지 활성을 보이는 것이다.

3-2 : 얼음 재결정 저해( ystallization inhibition ) 활성을 측정

얼음 재결정 저해(ystallization inhibition) 활성을 측정하기 위해 재조합 결빙방지 단백질을 물에 녹인 후 같은 양의 60% 수크로오스(sucrose)용액과 혼합시킨 후에 4㎕의 샘플 용액을 16mm diameter cover slip 사이에 넣고 영하 1℃에서 1분 동안 배양하였다. 1분 후에 샘플을 circulating cooling stage(THMS600 stage, Linkam Scientific Instruments)에 위치시키고, 영하 6℃에서 60분 동안 배양하면서 얼음 재결정화(ice re-crystallization)를 유도하였다. 현미경 아래에서 DP71 CCD camera(Olympus)를 이용하여 얼음 재결정이 생성되는 것을 5분 마다 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비해 재조합 결빙방지 단백질을 처리한 군에서 얼음 재결정이 저해되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

실시예 4 : 재조합 결빙방지 단백질( FfIBP )의 이차 구조 분석

재조합 결빙방지 단백질의 이차 구조 분석을 위해 Circular dichroism(CD)을 측정하였다.

Circular dichroism(CD) 측정은 Peltier temperature controller 가 연결된 Chirascan CD spectrometer(Applied photophysics Co., UK) 기기를 사용하였으며, 재조합 결빙방지 단백질 샘플은 1mm 내지 10mm 두께의 quartz cuvettes (Hellma)에 넣고 측정하였다. 190 내지 260nm 파장에서 far-UV CD의 스펙트럼을 측정하였으며, near-UV CD의 스펙트럼은 250 내지 350nm 파장에서 20℃ 조건으로 1nm 밴드위스(bandwidth)를 이용해서 측정하였다. 열 번 반복된 스펙트럼의 평균값을 최종 결과로 사용하였고 버퍼에 의한 스펙트럼 값을 제거하여 분석을 하였다. CD 실험에 사용된 단백질의 농도는 40μM이고 물에 녹여서 측정하였으며, 단백질의 이차 구조 분석은 circular dichroism analysis software CDNN 프로그램을 사용하였다.

그 결과, far-UV CD의 스펙트럼으로부터 재조합 결빙방지 단백질의 α-헬릭스(helix) 및 β-스트랜드(strand)의 비율이 각각 8.02% 및 22.14% 인 것을 확인하였으며, 주로 β-스트랜드(strand)로 이루어진 단백질임을 예측할 수 있었다 (도 7).

실시예 5 : 재조합 결빙방지 단백질( FfIBP )의 삼차 구조 분석

재조합 결빙방지 단백질의 삼차 구조 분석을 위해 정제된 재조합 결빙방지 단백질을 농도가 16.4㎎/㎖이 될 때까지 농축한 후 단백질 결정화 방법 중에 하나인 haing drop vapor diffusion 방법을 이용하여 20℃에서 결정화 실험을 실시하였다.

20mM Tris-HCl(pH 8.5) 및 150 mM NaCl에 16.4 ㎎/㎖ 재조합 결빙방지 단백질을 넣어 1μM의 재조합 결빙방지 단백질 용액을 제조하여, 1μM의 재조합 결빙방지 단백질 용액 및 1μM의 레저버 용액(reservoir solution; 0.1 M sodium acetate(pH 4.4), 3 M sodium chloride)의 조건에서 결정화 실험을 진행하였으며, 2일이 지난 후에 단일 결정의 가장 긴축이 0.5mm 정도까지 자란 것을 확인하였다(도 8A)

X-선에 의한 단백질 결정의 손실을 막기 위한 초저온 냉동(Cryo-cooling) 실험을 위해 상기의 재조합 결빙방지 단백질 결정을 파라톤 오일(paratone oil)에 담근 후 2분 후에 액체 질소에 담근 후에 분석을 하였다. X선 회절데이타는 한국기초과학지원 연구원에서 해상도 2.9Å의 조건으로 모았으며(도 8B), 회절데이타는 iMOSFLM 과 SCALA 프로그램을 이용하여 인덱싱하였다.

결정구조는 MOLREP 프로그램과 LeIBP structure(PDB code 3UYU)를 이용하여 molecular replacement 방법으로 해석하였으며, 구조의 리파인먼트는 REFMAC5 와 Coot프로그램을 이용하여 분석하였다. .

그 결과, 재조합 결빙방지 단백질의 결정은 P4 ₁ 22 스페이스 그룹을 가지며 Unit cell 크기는 a = b = 69.4 Å 및 c = 178.2 Å인 것으로 확인되었다. X선 결정학 방법으로 해석된 재조합 결빙방지 단백질의 삼차구조는 전체적으로 삼각기둥 모양의 오른나선(right handed) 구조의 β-helical 형태를 가지며, 삼각기중의 A면은 긴 α-helix와 상호작용을 하고 있고, 삼각기둥의 B면이 얼음에 직접적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다 (도 9).

또한, 재조합 결빙방지 단백질(FfIBP)과 루코스포리디움 속(Leucosporidium sp.) 유래의 결빙방지 단백질(LeIBP)의 삼차구조 비교한 결과, FfIBP의 경우 LeIBP에서 dimerization에 중요하다고 알려진 C-말단의 소수성 부위가 짧아 용액상에서 단량체(mononer) 형태로 존재하며, FfIBP의 Thr, Ala 및 Asn 등의 얼음결합 잔기들이 LeIBP 보다 넓게 위치해 있어 FfIBP의 얼음결합부위 면적이 넓은 것을 확인할 수 있었다 (도 10).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12227BP 20120625

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Antifreeze Protein from Flavobacterium frigoris PS1 <130> P12-B114 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 762 <212> DNA <213> Flavobacterium frigoris PS1 ice-binding protein <400> 1 gattcggatt caagctctct atcagttgca aattcaactt atgagacgac cgccttaaat 60 tcacaaaagt cttcaactga ccaacccaat tcaggctcga aaagcggcca aaccttggat 120 ctagtaaatc ttggtgttgc agctaacttt gctatacttt caaaaacagg aataaccgat 180 gtgtataaat cggcaattac aggtgatgtt ggtgcaagtc caattacagg agccgctatt 240 cttttaaaat gtgatgaagt aactggtacc atattttcag ttgatgctgc aggacctgct 300 tgcaaaataa ctgatgcttc acgtctaact acagctgtag gtgacatgca aattgcttat 360 gataatgctg caggacgact aaacccagac tttttaaatt taggggctgg aactatcggt 420 ggaaaaactc ttacaccagg tttatataaa tggacaagta cattaaacat ccctacagat 480 atcaccattt caggtagctc aactgatgtt tggattttcc aagttgcagg aaacctgaat 540 atgagttctg cagttagaat aactttagcc ggaggtgcac aagccaaaaa tattttctgg 600 caaacagctg gtgcagttac gctaggatca actagccatt ttgaaggaaa tatattaagt 660 caaactggta taaatatgaa aacagccgct tcaataaacg gaagaatgat ggcacaaaca 720 gcagttacac tacaaatgaa taccgttacc ataccacaat aa 762 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Flavobacterium frigoris PS1 ice-binding protein <400> 2 Asp Ser Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Asn Ser Thr Tyr Glu Thr 1 5 10 15 Thr Ala Leu Asn Ser Gln Lys Ser Ser Thr Asp Gln Pro Asn Ser Gly 20 25 30 Ser Lys Ser Gly Gln Thr Leu Asp Leu Val Asn Leu Gly Val Ala Ala 35 40 45 Asn Phe Ala Ile Leu Ser Lys Thr Gly Ile Thr Asp Val Tyr Lys Ser 50 55 60 Ala Ile Thr Gly Asp Val Gly Ala Ser Pro Ile Thr Gly Ala Ala Ile 65 70 75 80 Leu Leu Lys Cys Asp Glu Val Thr Gly Thr Ile Phe Ser Val Asp Ala 85 90 95 Ala Gly Pro Ala Cys Lys Ile Thr Asp Ala Ser Arg Leu Thr Thr Ala 100 105 110 Val Gly Asp Met Gln Ile Ala Tyr Asp Asn Ala Ala Gly Arg Leu Asn 115 120 125 Pro Asp Phe Leu Asn Leu Gly Ala Gly Thr Ile Gly Gly Lys Thr Leu 130 135 140 Thr Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Thr Ser Thr Leu Asn Ile Pro Thr Asp 145 150 155 160 Ile Thr Ile Ser Gly Ser Ser Thr Asp Val Trp Ile Phe Gln Val Ala 165 170 175 Gly Asn Leu Asn Met Ser Ser Ala Val Arg Ile Thr Leu Ala Gly Gly 180 185 190 Ala Gln Ala Lys Asn Ile Phe Trp Gln Thr Ala Gly Ala Val Thr Leu 195 200 205 Gly Ser Thr Ser His Phe Glu Gly Asn Ile Leu Ser Gln Thr Gly Ile 210 215 220 Asn Met Lys Thr Ala Ala Ser Ile Asn Gly Arg Met Met Ala Gln Thr 225 230 235 240 Ala Val Thr Leu Gln Met Asn Thr Val Thr Ile Pro Gln 245 250 <210> 3 <211> 69 <212> DNA <213> Flavobacterium frigoris PS1 ice-binding protein <400> 3 atgaagatat taaaaagaat tccggtctta gcagtgcttt tggtcggctt aatgacgaat 60 tgtagcaat 69 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Flavobacterium frigoris PS1 ice-binding protein <400> 4 Met Lys Ile Leu Lys Arg Ile Pro Val Leu Ala Val Leu Leu Val Gly 1 5 10 15 Leu Met Thr Asn Cys Ser Asn 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 cgataacata tgtctctatc agttgcaaat 30 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 cgataactcg agtcattgtg gtatggtaac ggt 33

Claims (18)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 결빙방지 단백질.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 결빙방지 단백질은 남극 박테리아인 플라보박테리움 프리고리스(Flavobacterium frigoris) PS1 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질.
   
3. 삭제
4. 제1항의 재조합 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자.
   
5. 제4항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
   
6. 삭제
7. 제4항 또는 제5항의 재조합 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
   
8. 제7항에 있어서, 재조합 벡터는 pCold I-FfIBP인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
   
9. 제4항의 재조합 결빙방지 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물.
   
10. 제9항에 있어서, KCTC 12227BP인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli )인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
    
12. 다음의 단계를 포함하는 재조합 결빙방지 단백질의 제조방법;
    (a) 제9항의 재조합 결빙방지 단백질 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 재조합 결빙방지 단백질을 생성하는 단계; 및
    (b) 생성된 재조합 결빙방지 단백질을 회수하는 단계.
    
13. P4₁22 스페이스 그룹을 가지고 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a = b = 69.4 Å 및 c = 178.2 Å인 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 재조합 결빙방지 단백질의 결정.
    
14. 제13항에 있어서, α-헬릭스(helix) 및 β-시트(sheet)의 비율이 각각 8.02% 및 22.14%으로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질의 결정.
    
15. 제13항에 있어서, 용액 상에서 단량체로 존재하는 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질의 결정.
    
16. 제13항에 있어서, 삼각기둥 모양의 오른나선(right handed) 구조의 β-나선형(helical) 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질의 결정.
    
17. 제16항에 있어서, 삼각기둥의 A면은 긴 α-헬릭스(helix)와 상호작용을 하고 있고, 삼각기둥의 B면이 얼음에 직접적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 결빙방지 단백질의 결정.
    
18. 제1항 또는 제2항의 재조합 결빙방지 단백질을 함유하는 결빙방지용 조성물.
    
    

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