KR20100110778A - 얼음-결합 활성을 포함하는 폴리펩티드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 얼음 결정 형성 및/또는 성장 감소 또는 억제 활성을 가져오는 얼음 결합 능력을 포함하는 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규 폴리펩티드를 포함하는 식용품 및 고체 지지체에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 신규 폴리펩티드의 제조 방법과 신규 폴리펩티드의 상이한 용도들에 관한 것이다.

Description

얼음-결합 활성을 포함하는 폴리펩티드{POLYPEPTIDES COMPRISING AN ICE-BINDING ACTIVITY}
본 출원은 2007년 11월 12일 제출된 미국 가 출원 제61/003,979호의 정식 출원으로서, 상기 출원은 전문이 참고자료로 본원에 포함된다. 상기 언급된 가 출원에서, 또는 본 출원에서 인용된 모든 특허와 비특허 참고문헌들은 전문이 참고자료로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 얼음 결정 형성 및/또는 성장 감소 또는 억제 활성을 가져오는 얼음-결합 능력을 포함하는 신규 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 이러한 폴리펩티드의 제조 및 사용 방법이 개시된다.
극지의 수중에서 살고 있는 해양 경골어류(teleost)의 체온은 주변의 바다와 평형인 온도이며, 따라서 예를 들어 남극의 바다 속에서는 겨울이나 연중 내내 대략 -1.8℃의 온도를 유지한다. 해양 경골어류의 혈액은 바닷물에 대해 저삼투성이며, 그 용융점은 대략 -0.7℃로 예상된다. 따라서, 극지의 해양 경골어류는 과냉각되며, 이러한 가혹한 환경 조건에 적응하지 못한다면 치명적인 결빙이 일어날 것이다.
절지동물, 식물, 진균 및 세균을 포함하여 다양한 저온-적응된 육지 생물들에 대해서도 유사한 관찰이 적용될 수 있으며, 이들 생물의 대부분은 해양 어류보다 훨씬 더 저온에 노출된다. 호냉성(저온성) 생물들은 지구상의 모든 영구 한랭지에 성공적으로 적응하였다. 이들은 -60℃ 정도의 저온을 나타내는 심해, 얼어붙은 산 정상 그리고 극지에서 발견될 수 있다. 치명적 조건에도 불구하고 이들 생물은 영구 저온 환경에만 고유한 중요한 장벽들을 극복해왔다. 이런 장벽은 효소 활성 감소, 막 유동성 감소, 영양물 및 노폐물 전달 변경, 전사, 번역 및 세포분열 속도 감소, 폴리펩티드 저온-변성, 부적절한 폴리펩티드 폴딩 및 세포내 얼음 형성을 포함한다.
어떤 생물이 영하의 온도에서 존재할 수 있도록 하는 기전에 대한 연구는 이들이 적어도 두 가지 전략에 의존한다는 것을 밝혔는데, 얼음 성장을 억제하거나, 또는 얼음 결정 형성을 제어하여 발생시킴에 의한 물의 결빙점의 저하이다(저 분자량 물질의 합성에 의해 속일적으로 그리고 독특한 폴리펩티드의 합성에 의해 비속일적으로). 결빙방지 폴리펩티드(AFP)와 폴리알코올, 자유 아미노산 및 당과 같은 저 분자량 물질이 전자의 과정을 초래하고, 얼음 핵형성 폴리펩티드(INP)가 후자의 과정을 초래한다고 생각된다.
결빙방지 폴리펩티드(AFP - 어떤 간행물에서는 열 이력 폴리펩티드, THP, 또는 얼음 구조화 폴리펩티드, ISP라고도 한다)는 용액의 결빙점을 실질적으로 낮추지만, 예상된 용융점은 아주 약간만 저하된다. 이것은 결빙점은 극적으로 저하되는 반면, 용액의 용융점은 속일적 용융점 저하에 의해 예상된다는 것을 의미한다. 이것은 얼음이 존재하는 용액에 대해서 사실이며, 결빙방지 폴리펩티드가 얼음 무함유 용액의 과냉각점을 저하시킬 수 있는지의 여부에 관한 문제는 대부분 해결되지 않고 있다.
결빙 온도의 변동은 제한적이며, 충분히 낮은 온도라면 빠른 얼음 성장이 일어날 것이다. 용융 온도와 결빙 온도의 분리는 일반적으로 열 이력(TH)이라고 하고(Knight et al. 1991, Raymond and DeVries 1977, Wilson 1993), 얼음 성장 온도는 이력 결빙점이라고 한다. 용융점과 이력 결빙점의 차이는 이력 또는 결빙방지 활성이라고 한다. AFP의 두 번째 기능은 결빙 상태에서 작용하며, 이때 이들은 얼음 재결정화 억제(RI)를 나타낸다. AFP는 재결정화 온도 이상의 온도에서 작은 결정들이 큰 결정을 형성하는 것을 억제한다(Knight et al. 1984, 1995, Knight and Duman 1986, Ramløv et al. 1996).
얼음 형성 억제 기전
결빙방지 폴리펩티드가 얼음 성장을 억제하는 기전은 아직 조사하고 있는 중이다. AFP는 모두 양쪽성인 것 같다. 이것은 이들이 분자의 나머지 부분보다 더 소수성인 한 부분을 가진다는 의미이다. 지금까지 이들의 활성에 관한 설명은 이들의 친수성 쪽이 얼음 결정에 결합한다는 것이었다. 그러나, 이런 관점은 얼음/물을 고찰할 때 정의대로 얼음 또는 물이 가장 친수성이라는 의문을 아주 당연하게 가질 수 있기 때문에 지난 10년 동안 도전받았다. AFP의 소수성 쪽/도메인을 통한 AFP와 얼음의 결합에 대한 여러 증거가 출현하고 있지만, 결합에 대한 정확한 기전은 아직 불명이기 때문에 지금까지의 모든 증거는 정황 증거였다.
그러나, 이 시점에서의 여론은 결빙방지 폴리펩티드가 결빙방지 폴리펩티드의 타입(및 동형)에 따라서 다양한 얼음 표면 평면을 인식하여 결합한다는 것이다. 결빙방지 폴리펩티드가 결합되면 얼음 성장이 중단되지만, 결빙방지 분자들 사이에서는 어느 정도까지는 계속된다(Raymond and DeVries 1977, DeLuca et al. 1998, Marshall et al. 2004). 결빙방지 폴리펩티드 분자들 사이에서 성장 중인 얼음의 곡률이 충분히 커졌을 때(또는 곡선이 되었을 때), 곡선 표면의 증가된 표면장력으로 인하여 얼음 성장이 중단된다(Kelvin 효과(Atkins and De Paula 2002, Wilson 1994, 2005, Kristiansen 2005)라고 알려져 있다). 이제는 물 분자가 곡선의 얼음 표면에 결합하는 것이 에너지적으로 유리하지 않다.
따라서, 이력 결빙점은 물 분자가 얼음에 결합하는 것이 다시 에너지적으로 유리하게 되는 온도이며, 여기서 얼음 성장이 폭발적으로 계속된다(Knight et al. 1991, Raymond and DeVries 1977, Wilson 1993). 대부분의 어류 결빙방지 용액에서는 이력 결빙점에서 침상형 얼음 성장이 보인다. 이것은 어류 결빙방지 폴리펩티드가 기저면이 아니라 얼음 결정상의 프리즘면에 결합한다는 사실 때문이라고 생각된다. 이력 결빙점에서의 성장이 물 분자와 기저면의 결합(부가) 때문인 경우에는 프리즘면에서의 성장이 계속 억제되어 얼음 결정이 기다란 창 모양(침상체)으로 성장하게 된다.
곤충에서 유래된 결빙방지 폴리펩티드를 함유하는 용액에서는 이력 결빙점에서의 성장 패턴이 더욱 불규칙한데, 이것은 곤충 결빙방지 폴리펩티드도 역시 기저면에 결합하고(또한 이들 동물에서 유래된 용액에서는 훨씬 높은 결빙방지 활성이 관찰된다), 이로써 일단 온도가 충분히 낮아지면(이력 결빙점) 얼음 결정상의 임의의 면의 점들에서 성장이 일어나기 때문이라고 추측된다.
곤충 결빙방지 폴리펩티드의 존재하에 이력 결빙점에서 얼음 성장이 일어날 때 얼음 성장 패턴은 침상형 대신에 콜리플라워 모양이다. 따라서, 열 이력은 적어도 두 가지 변수에 의존하는데, 1) 결빙방지 폴리펩티드 타입(생물, 동형에 따라서)과 2) 농도(농도 의존성이 포화를 나타내더라도)이다(DeVries 1983, Kao et al. 1985, Schrag et al. 1982).
분명히 결빙방지 폴리펩티드 분자의 크기와 관찰된 이력의 양 사이에는 양의 상관성이 또한 존재한다(Kao et al. 1985, Schrag et al. 1982, Wu et al. 2001). 결빙방지 효과를 결정하는 상기 언급된 변수와는 별도로, 결빙방지 활성과 얼음 결정 비율 사이에 역의 관계가 존재한다는 것도 또한 실증된다(얼음 결정이 이력 갭 내에 있을 경우). 이런 효과는 곤충 결빙방지 폴리펩티드의 경우에 가장 두드러진다(Zachariassen et al. 2002).
곤충-유래 결빙방지 폴리펩티드
몇 가지 AFP가 곤충에서 발견되었다. 이것은 어류가 직면할 수 있는 것보다 훨씬 더 저온에 곤충이 노출되기 때문인 것 같다(해수의 결빙점은 약 -1.8℃이다).
지금까지 쵸리스토뉴라 퓨미페라나(Choristoneura fumiferana), 덴드로이데스 카나덴시스(Dendroides canadensis) 및 테네브리오 몰리터(Tenebrio molitor)의 3종에 대해서 곤충 AFP의 구조가 밝혀졌다. 곤충으로부터의 3가지 특정된 AFP 중 2개(T. molitor와 D. canadensis)는 공통되는 많은 구조를 가지는데, 이것은 아마도 이들 둘은 갑충에서 유래하는 반면, C. fumiferana는 나방이기 때문인 것 같다.
매우 잘 특정된 곤충 AFP의 한 예는 갑충인 Tenebrio molitor에서 유래하는 AFP이다. 이 폴리펩티드는 적어도 9개의 동형이 발견되는데, 이들은 모두 아주 유사하며, 84, 96 내지 120개 아미노산의 길이를 가진다(Liou et al. 1999). 9개의 공지된 동형 모두에서 12개 아미노산의 반복 서열, T/A-C-T-X-S-X-X-C-X-X-A-X이 발견된다. 이 서열은 이들 AFP에서 6-9번 반복된다. TmAFP는 반복 아미노산 서열의 우선성 베타-헬릭스 구조이다. 편평한 베타 시트 상의 트레오닌 잔기들의 고도로 규칙적인 배열이 물/얼음과 상호작용한다고 생각되며, 트레오닌 잔기 간 거리는 얼음 격자 구조에서 물 분자의 산소 원자 위치와 정확하게 일치할 것으로 예상된다. 이 AFP는 다수의 시스테인-시스테인 황 다리에 의해 제공되는 극히 규칙적인 구조와 높은 구조적 안정성이 예상되며, 6개 아미노산마다 시스테인이 존재한다.
D. canadensis로부터는 다양한 길이와 중량(7.3-12.3 kDa)을 가진 13개의 동형이 분리되었다(Andorfer and Duman 2000, Duman et al. 2002). 이들 AFP의 반복 서열은 일부 반복 서열에 때로 13번째 아미노산이 존재하기는 하지만 T. molitor에서 발견된 것과 동일하다(Duman 1998, Li et al. 1998a, 1998b). T. molitor로부터의 AFP와 같은 위치에 시스테인이 정확하게 위치된다(Li et al. 1998a, 1998b).
C. fumiferana로부터의 AFP의 아미노산 서열은 곤충 유래의 다른 두 공지된 AFP 아미노산 서열과 상동성이 아니다. 15번째 아미노산마다 서열 T-X-T가 발견되지만, 오직 마지막 트레오닌만 보존되고, 첫 번째 트레오닌은 많은 경우 발린(V), 아르기닌(R) 또는 이소로이신(I)으로 치환된다. 또한, C. fumiferana로부터의 AFP는 나머지 두 곤충 AFP보다 적은 수의 시스테인을 함유한다(Doucet et al. 2000). 그러나, 모든 시스테인들이 이황화 결합에 참여한다(Gauthier et al. 1998). 분명히 C. fumiferana의 AFP는 소수성 코어를 함유하며, 이 폴리펩티드는 모두 함께 구조를 안정화하는 수소 결합과 이황화 다리의 망구조에 의해서 안정화된다(Graether et al. 2000, 2003, Leinala et al 2002).
한 양태에서 본 발명은 어떤 하늘소과(Cerambycid) 나무좀에 의해 생산된 다수의 얼음-결합 부위를 포함하는 결빙방지 폴리펩티드를 포함하는 결빙방지 폴리펩티드 및 그것의 단편에 관한 것이다. 또한, 하기 더 상세히 개시된 이러한 폴리펩티드의 제조 및 사용 방법도 본 발명의 범위 내이다.
하늘소과 나무좀인 라기움 인퀴시토르(Rhagium inquisitor)와 라기움 모르닥스(Rhagium mordax)는 둘 다 이들의 성체기 및 유충기에서 -30℃ 정도의 저온에 노출될 수 있으며, 북부 스칸디나비아에서 나무 그루터기의 껍질 밑에서 계속 겨울을 난다. 이들 종은 둘 다 결빙 회피자라고 불리는 내한성 동물군에 속하며, 이것은 이들의 조직에 얼음이 형성되지 않고 극저온에서도 생존한다는 것을 의미한다. 이들은 오랜 시간 동안 과냉각(불충분 냉각)된 상태를 채택하는 것이라고 간주될 수 있다.
원칙적으로는 불규칙한 핵형성으로 인해서, 또는 주변환경에서 얼음이 이식된 결과로서 과냉각된 준안정한 액체 중에서 얼음 형성이 발생할 수 있기 때문에, 과냉각된 상태는 하늘소과 나무좀에게 잠재적으로 치명적이다. 하늘소과 나무좀은 이렇게 얼음이 형성되면 생존할 수 없다.
따라서, R. inquisitor과 R. mordax는 둘 다 기후 조건에 적응해왔으며, 이들은 장기간 동안 저온에서 생존할 수 있다. 이것이 바로 하늘소과 나무좀이 결빙방지 폴리펩티드(AFP)의 출처로서 흥미로운 이유이다.
R. inquisitor에서 저온 적응은 혈림프 영역에 항냉동 글리세롤의 축적, 체액으로부터 잠재적 얼음 핵형성제의 제거(훨씬 더 높은 과냉각 가능성을 제공) 및 겨울이 시작되기 전에 다량의 결빙방지 폴리펩티드의 합성을 수반한다. 지금까지 R. inquisitor에서 발견된 결빙방지 폴리펩티드의 결빙방지 활성(7℃)이 공지된 것 중 가장 높다고 간주되고 있다.
R. mordax의 유충은 항냉동 화합물의 대단히 제한적인 축적을 나타내지만 R. inquisitor과 거의 마찬가지로 저온에서 생존할 수 있다. 현재의 바람직한 가설에 따르면, 저온을 견디는 Rhagium mordax의 능력에 대한 거의 유일한 이유는 겨울이 시작되기 전에 하나 이상의 결빙방지 폴리펩티드(AFP)를 합성하여 축적하기 때문이라고 생각될 수 있다.
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 예상외로 현재 알려진 다른 곤충 AFP보다 상당히 적은 수의 시스테인 잔기를 갖는 것으로 판명된다. 이 특징은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 많은 최신 곤충 결빙방지 폴리펩티드보다 더 적은 반복 서열을 가진다는 사실과 함께 본 발명의 폴리펩티드를 이종성 숙주 생물에서의 발현을 위한 더 좋은 후보로 만든다.
현재 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드 및 결빙방지 활성을 나타내는 그것의 기능적 단편은 바람직하게 4개 미만의 시스테인 잔기, 예를 들어 3개 미만의 시스테인 잔기, 예를 들어 2개의 시스테인 잔기를 가진다.
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 다양한 활용성 및 산업적 용도를 가지며, 이들은 하기 설명으로부터 분명해질 것이다. 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 다양한 방식으로 얼음 결정 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 직접 도입될 수도 있고, 아니면 적합한 발현 신호의 제어하에 숙주 세포에서 발현되는 유전자로서 도입되어 폴리펩티드(들)을 생산할 수도 있다.
결빙방지 폴리펩티드의 적합한 농도는 용도에 따라 변할 것이지만, 전형적으로는 약 1 ppb 내지 약 1 ppt(즉, 약 1 μg/L 내지 약 1 mg/L)의 범위일 것이다.
본 발명의 어떤 양태에서, 폴리펩티드는 식용품에 도입되거나, 또는 식용품과 접촉되며, 이로써 얼음 결정 성장 및/또는 형성을, 예를 들어 냉동 조건에서 식용품을 생산 및/또는 보관하는 동안 감소 또는 억제할 수 있다.
예상외로 본 발명에 따른 폴리펩티드는 다른 공지된 결빙방지 폴리펩티드의 존재하에 얻어진 결정과 현저히 차이 나는 얼음 결정화를 제공하는 것으로 판명되었다. 특히, 공지된 결빙방지 폴리펩티드, 예를 들어 US 6,914,043에 언급된 결빙방지 단백질 타입 III HPLC 12나 US 6,312,733에 언급된 얼음 결정 성장 억제제가 침상형 구조의 얼음 결정을 제공하는 것과는 대조적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재하에서는 작은 구형 구조의 결정이 얻어지는 것으로 판명되었다.
따라서, 본 발명의 한 중요한 이점은, 상기 타입 III의 공지된 결빙방지 폴리펩티드를 사용했을 때 얻어진 거친 침상형 결정과 비교하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드가, 예를 들어 아이스크림에 혼입된 경우, 생산 및 보관 동안 아이스크림에 형성된 결정이 본질적으로 작은 구형 구조를 가질 거라는 사실로 인해서 개선된 식감이 얻어진다는 것이다.
야채류를 포함하여 냉동 식용품의 질감, 맛, 및 유효 저장수명이 본 발명에 따른 폴리펩티드가 작용한 결과로서 상당히 개선될 것이다. 예를 들어, 셀러리, 감자, 아스파라거스, 완두콩, 당근, 콩, 브로콜리, 사탕옥수수, 시금치 등과 같은 냉동 야채류의 질감, 맛, 및 유효 저장수명이 개선될 것이다. 유사하게, 딸기, 블루베리, 라즈베리, 감귤류, 바나나, 포도, 키위, 복숭아, 파인애플, 서양자두, 체리, 토마토 및 망고를 포함하는 다양한 냉동 과일의 질감, 맛, 및 유효 저장수명이 증진될 것이다.
야채, 및 다른 식용품으로의 도입은, 예를 들어 표적 생물에 적합한 폴리뉴클레오티드를 유전자 도입함으로써 달성될 수 있다. 식품 가공이 시작되기 전에, 또는 수거와 가공이 시작된 후에, 구성성이든 유도성이든 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 식품을 포함하는 식용품을 효과적으로 보호할 만큼 충분히 높은 수준으로, 예를 들어 전체 식물 폴리펩티드의 최대 약 0.1질량% 수준으로 얻어진다. 또한, 발현은 조직 특이적으로 일어날 수도 있다. 예를 들어, 과일에 존재하는 성숙 유전자와의 결합에 의해서 산출 식물로부터 수거한 후에도 발현이 일어날 수 있다.
본 발명의 한 중요한 양태에서, 소비될 때까지, 또는 소비하는 중에도 냉동될 것으로 예상되는, 또는 냉동상태를 유지할 것으로 예상되는 식품, 특히 냉동된 상태나 냉각된 상태로 소비되는 식용품에 폴리펩티드가 첨가된다.
예를 들어, 아이스크림, 프로즌 요구르트, 아이스밀크, 샤베트, 아이스케이크, 냉동 휘핑크림, 냉동 크림파이, 냉동 푸딩 등, 많은 냉동 식품이 냉동된 상태나 냉각된 상태로 소비되도록 의도된다. 특히, 대부분의 가정용 자동성에제거 냉동고에서 일어나는 냉동-해동 사이클 동안이나, 또는 냉동상태로 지속적으로 보관할 때 형성되는 큰 얼음 결정은 질감이나 향미에 부정적인 영향을 미친다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 사용함으로써 이런 얼음 결정 성장 과정이 감소되거나, 또는 심지어 완전히 방지되거나, 또는 적어도 최소화될 수 있다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 식용품 전체에 혼입될 수도 있고, 및/또는 응축과 얼음 결정 형성이 아주 쉽게 발생할 것으로 예상되는 경우라면 식용품의 표면에 적용될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 중요한 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제빵용 효모를 비롯한 효모에 관한 것이다. 이 양태에 관련된 방법은 도우용 효모를 이들 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 방법을 포함한다. 효모에 폴리뉴클레오티드를 혼입하여 발현시키고 이들 효모를, 예를 들어 냉동 도우에 사용한 경우, 해동시 효모 생육성이 높이 유지될 것이므로 도우는 해동시 자연적으로 발효될 것이다. 이들 결빙방지 폴리펩티드의 존재하에서는 저장으로 인한 손상이 덜 축적되고, 해동된 샘플에서 효모 세포의 높은 생육성이 보존될 것이기 때문에, 냉동된 상태로 더 오랜 시간 보관하는 것이 가능할 것이며, 또는 더 작은 도우 샘플이 보관되면 될 것이다.
냉동 발효 식용품에 결빙방지 폴리펩티드를 혼입하는 다른 방식은 식품을 발효시키는 동안 발효 과정을 일으키는 생물로 하여금 결빙방지 폴리펩티드를 생산하도록 하는 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 냉동 발효 식품을 제조하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비할 수 있는 미생물과 식품을 접촉시키는 단계, 이때 미생물은 식품을 발효시켜서 발효된 식품을 생산할 수 있다; (b) 발효가 일어나는 조건에서 식품을 미생물과 함께 인큐베이션하여 식품 내부나 식품 표면에서 얼음 결정 성장 및/또는 형성을 억제하기 위한 유효량으로 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드가 존재하는 발효된 식품을 생산하는 단계; 및 (c) 바람직하게는 -5℃ 이하의 온도에서 발효된 식품을 냉동시켜 냉동 발효 식품을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 냉동 보관을 위해 생물학적 세포, 또는 그것의 추출물에 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 도입하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 포함하는 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포 및 동물 세포는 냉동-해동 과정으로 인한 고유 특성의 손실을 최소한으로 수반하거나 아니면 전혀 손실 없이 세포 또는 조직 생육성이 증가된다. 아세포 샘플 또는 세포 추출물도, 특히 장기 보관시 냉동에 대해 유사한 감수성을 가질 수 있다. 전형적인 예는 시험관내 폴리펩티드 번역 시스템, 효소 제조, 및 특히 민감성 막 성분, 예를 들어 엽록체 또는 미토콘드리아 막 제조물을 함유하는 샘플이다.
특히, 소기관을 함유하는 샘플이 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 첨가한 경우 냉동 손상에 대해 증가된 저항성을 나타낼 수 있다. 동물 연조직은 본 발명의 폴리펩티드의 존재하에 냉동될 때 더 적은 손상을 나타내며, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 첨가는 냉동과 이후의 해동시 세포 완전성이 중요하거나 바람직한 상황에서, 예를 들어 조직 배양물 기탁을 위해서 유용할 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 냉동 보관용 샘플, 예를 들어 세포 또는 조직 기탁용 샘플에 일반적으로 첨가될 수 있다. 생물학적 세포 중에서도 주로 보관되는 타입은 박테리아, 진균(효모를 포함해서), 특히 고등 진핵생물 세포(하이브리도마 균주 및 조직 배양 셀라인과 같은)의 유전자 변이체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 식품 분야에 특정되지 않는 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 비-식품 용도는 기후적인 결빙 조건으로부터 농작물과 식물을 보호하는 것이다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 도입된 유전자의 발현에 의해 세포질에 내부적으로 혼입될 수 있거나, 아니면 폴리펩티드는, 예를 들어 분무나 다른 방식에 의해 식물 외부에 도포될 수 있다. 이와 같은 외부 도포는 식물에 폴리펩티드를 직접 도포하거나, 또는 폴리펩티드를 분비하는 생물을 식물 위에 외부 침착시킴에 의해서 달성될 수 있다. 다른 용도에 대해서도 도입을 위해 이와 같은 대안들이 적용된다.
다른 구체예는 기관, 조직 또는 다른 생물학적 샘플을 둘러싼 액체에 결빙방지 폴리펩티드를 도입하는 것이다. 한 특정 용도는 이식 작업이나 보관 목적을 위해 병원으로 수송하는 동안에 있을 수 있다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 빙점하 온도에서 단기 또는 장기 보관을 허용하며, 이로써 고유의 대사작용이나 변성이 최소화되고, 얼음 결정 성장으로 인한 세포 손상이 실질적으로 감소된다. 다른 의료적으로 중요한 온도 민감성 생물학적 샘플은 혈액 및 혈액 제품, 치료제, 폴리펩티드 약물, 바이오어세이 시약 및 백신이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 화장품 또는 피부과용 제제를 제공한다. 화장품이나 국소 피부과용 제제에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사용은, 극명한 기후- 및 날씨-유도 온도 강하에 의해 세포 효소의 최적 온도가 손실됨으로써 세포 및 세포외 공간에서 세포 생리학에 변화가 야기되어 손상되는 추위로 인한 피부 구조 및 세포 손상, 예를 들어 추위, 바람 및/또는 UV 광에 의해 유도된 피부 손상, 피부 홍반 및 피부가 당기는 느낌 및 증가된 감각 감수성, 온도-민감성 피부, 환경 스트레스(온도 변화 및 UV 빛, 흡연, 스모그, 반응성 산소 종, 자유 라디칼로 인한)로 인한 피부, 입술 및 코와 구강 점막 그리고 피부 부속기관들의 부정적인 변화의 효과적인 치료와 예방을 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드와 당업자에게 잘 알려진 최신 안정제, 유화제 및 계면활성제와 다른 첨가제들의 혼합물에 기초한 조성물 및 그것의 사용을 포함한다. 이들 화합물은 부패 억제, 산화 억제, 변색 방지, 미생물 성장 억제, 에멀젼 안정화 등의 역할을 할 수 있다.
상기 언급한 바로부터 분명한 대로, 한 양태에서, 본 발명은 식용품을 포함하는 물체나 물질의 결빙 또는 과냉각과 관련된 얼음 결정 형성을 억제 및/또는 감소시킬 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 과냉각 상태는 보통은 상태 변화(즉, 물에서 얼음으로)가 일어나는 온도 이하에서 이러한 상태 변화의 발생 없이 물질이 냉각될 수 있는 상태이다. 따라서, 결빙이 일어나지 않는 결빙점 이하에서의 액체의 냉각이 과냉각이며, 그 결과 준안정 상태가 된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 결빙방지 폴리펩티드와 호환하여 표시되며, 본 명세서에서는 간단히 폴리펩티드라고 표시된다.
한 양태에서, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드가 제공된다. 주석 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8, 및 서열 식별 번호 범위의 시작 번호와 종료 번호를 나타내는 다른 유사한 주석들은, 본원에서 사용되었을 때, 상기 서열 식별 번호를 하나도 빼지 않고 모두 표시하는 것이며, 예를 들어 상기 인용된 예에서는 다른 언급이 없을 경우 서열 식별 번호 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8을 표시한다.
SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것으로 구성되거나 포함하는 폴리펩티드, 결빙방지 활성을 갖는 그것의 단편, 및 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것과 적어도 약 75% 동일한 그것의 변이체, 또는 그것의 단편이 본 발명의 범위에 또한 들어간다. 특히, 적어도 20개 아미노산과 얼음 결합 및 결빙방지 활성을 갖는 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것으로 구성되거나 포함하는 폴리펩티드의 단편이 또한 개시된다. 단편은 바람직하게 200개 아미노산 미만, 예를 들어 바람직하게 150개 아미노산 미만, 예를 들어 바람직하게 100개 아미노산 미만, 예를 들어 80개 아미노산, 예를 들어 60개 아미노산을 가진다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 "얼음 결합 부위"(IBS)를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO:9 내지 SEQ ID NO:72의 어느 것 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 도 3에 나타낸 대로 총 64개의 특이적 "얼음 결합 부위", IBS가 있다.
특히, 본 발명은 다음 폴리펩티드들에 관한 것이다:
SEQ ID NO:9 내지 SEQ ID NO:16으로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:17 내지 SEQ ID NO:24로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:25 내지 SEQ ID NO:32로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:33 내지 SEQ ID NO:40으로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:41 내지 SEQ ID NO:48로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:49 내지 SEQ ID NO:56으로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:57 내지 SEQ ID NO:64로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
SEQ ID NO:65 내지 SEQ ID NO:72로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드.
또한, 서열 SEQ ID NO:73 내지 80 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, "얼음 결합 도메인", IBD가 보존된 형태로, SEQ ID NO:73 내지 80의 서열 중, 예를 들어 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 이상 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
SEQ ID NO:81 내지 89는 더 보존된 도메인에 관한 것이며, 이들은 본 발명에 따른 폴리펩티드에서 단독으로, 또는 어떤 조합으로 존재할 수도 있다.
또한, 본 발명은 공통 얼음 결합 도메인, 공통 IBD의 형태인 SEQ ID NO:90에 관한 것이며, 이것은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 여러 번, 예를 들어 2번, 3번, 4번, 5번, 6번, 7번, 8번, 8번 초과, 그리고 바람직하게 30번 미만으로 나타날 수 있다. 동일한 서열이 여러 번 나타날 수도 있고, 아니면 SEQ ID NO:90의 변이체가 여러 번 나타날 수도 있는데, 이것은 하기 본 발명의 항목들을 기재하고 있는 절에서 개시된다.
얼음 결합 도메인의 페어-식 조합을 포함하는 폴리펩티드가 하기 표 1에 나열된다. SEQ ID NO:73 내지 SEQ ID NO:80로서 개시된 8개 얼음 결합 도메인(IBD) 중 어느 것의 각각의 모든 페어-식 조합과 독립적 조합의 형태로 총 64개의 상이한 조합이 나열된다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:73 내지 SEQ ID NO:80으로 구성되는 군으로부터 선택된 4개 이상의 서열, 예를 들어 5개 이상의 서열, 예를 들어 6개 이상의 서열, 예를 들어 7개 또는 서열 전부를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 서열 SEQ ID NO:90의 4개 이상의 카피, 예를 들어 5개 이상의 카피, 예를 들어 6개 이상의 카피, 예를 들어 7개 이상의 카피, 예를 들어 8개 이상의 카피, 그리고 바람직하게 20개 미만의 카피를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
상기 서술된 대로, 한 양태에서, 본 발명은 상이한 얼음 결합 도메인(IBD)들의 조합을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 조합은 바로 밑의 표 1에 제시된 64개의 페어-식 얼음 결합 도메인 서열 조합의 군으로부터 선택된 2개 IBD의 조합들 중 적어도 1개 조합, 예를 들어 적어도 2개 조합을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO:90에 의해 정의된 공통 얼음 결합 도메인을 20개 미만, 예를 들어 15개 미만, 예를 들어 12개 미만, 예를 들어 10개 미만 가진다.
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상기 표 1에 표시된 행렬에 제시된 개별 문자/숫자 조합들은 각각 서로 교차 조합되어 하기 표 2에 나열된 조합을 만든다. 예시하자면, 조합 A1A1은 2개의 IBD I 도메인과 또 다른 2개의 IBD I 도메인의 조합에서 생긴 것이고, 조합 B3A6은 1개의 IBD II 및 1개의 IBD III와 1개의 IBD I 및 1개의 IBD VI의 조합에서 생긴 것이다. 따라서, 결과의 폴리펩티드는 폴리펩티드 얼음 결합 도메인: IBD I, IBD II, IBD III 및 IBD VI를 포함한다.
따라서, 본 발명은 상이한 얼음 결합 도메인(IBD)들의 조합을 포함하는 폴리펩티드를 제공하며, 상기 조합은 바로 밑의 표 2에 제시된 4개의 얼음 결합 도메인 서열의 4096개 조합의 군으로부터 선택된 4개 IBD의 조합 중 적어도 1개 조합, 예를 들어 적어도 2개 조합, 예를 들어 3개 조합을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 SEQ ID NO:90에 의해 정의된 공통 얼음 결합 도메인을 20개 미만, 예를 들어 15개 미만, 예를 들어 12개 마만, 예를 들어 10개 미만 가진다.
표 2를 더 예시하자면, 조합들은 64x64 행렬로부터 기원하며, A1A1은 2개의 IBD I 도메인과 또 다른 2개의 IBD I 도메인의 조합이고, 조합 B3A6은 1개의 IBD II 및 1개의 IBD III 도메인과 1개의 IBD I 및 1개의 IBD VI 도메인의 조합에서 생긴 것이다. 따라서, 후자의 것은 폴리펩티드 도메인: IBD I, IBD II, IBD III 및 IBD VI로 구성된다.
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상술된 폴리펩티드들은 SEQ ID NO:81 내지 89로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 정의된 다수의 동일한 또는 상이한 폴리펩티드와 생리학상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 건조된 조성물일 수 있고, 건조된 조성물은 동결 건조 형태 또는 분무 건조 형태일 수 있다.
다른 추가의 양태에서, 본 발명은 얼음 결정의 성장 및/또는 형성을 감소 또는 억제할 수 있는 얼음 결합 활성을 가진 폴리펩티드에 관한 것이며, 이때 폴리펩티드는 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)를 포함하고, 여기서
X1은 S, A, G 및 D로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X2는 A, V, I, T 및 S로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X3은 비-벌크 아미노산 잔기들로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X4는 S, I, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X5는 S, A, I 및 T로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X6은 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X7은 비-벌크 아미노산 잔기들로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X8은 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X9는 S, A 및 G로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되며;
SEQ ID NO:1의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 하나는 T 또는 V이고;
이 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수는 250개 미만이다.
서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)는 공통 "얼음 결합 도메인"으로 본원에서 언급된다. 상기 도메인이 얼음 결합에 직접 연루되는지 아니면 얼음 결합에 간접적으로 연루되는지의 여부(즉, 폴리펩티드가 얼음 결합 활성을 가질 필요가 있는지)는 이 정의에서 중요하지 않다.
또한, 본 발명은 다수의 공통 "얼음 결합 도메인", 예를 들어 SEQ ID NO:90에 대해 실질적인 상동성/동일성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이와 관련하여, SEQ ID NO:90에 대한 실질적인 상동체는 SEQ ID NO:90의 서열과 위치 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 및 X9의 단지 1개 또는 최대 2개에만 서열에 차이가 있는 어떤 서열을 포함한다.
이와 관련하여 사용된 다수란 용어는 정수 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 9, 예를 들어 10 미만, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 예를 들어 25 미만을 포함하며, 상기 다수의 공통 "얼음 결합 도메인" 중 어느 것은 SEQ ID NO:90과 동일하거나, 또는 실질적으로 동일하거나, 또는 실질적으로 상동성일 수 있다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:90의 하나 이상의 카피를 포함하고, 선택적으로 SEQ ID NO:90, 또는 이것과 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상동성인 서열의 하나 이상의 카피를 더 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형체 및 유도체에 관한 것이다.
용어 "분리된 폴리펩티드"는 본 발명에 따른 폴리펩티드가 이 폴리펩티드와 본래 관련된 오염 세포 성분을 적어도 본질적으로 함유하지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 이러한 융합 폴리펩티드는 활성 형태 폴리펩티드의 정제 및/또는 제조에 도움이 되는 등, 많은 기능을 제공할 수 있다. 융합 폴리펩티드의 한 예는 친화성 택에 융합된 본 발명에 따른 폴리펩티드이다. 또한, 그 용어가 폴리펩티드에만 제한되는 것은 아니지만, 융합 폴리펩티드는 본원에 정의된 보체/항-보체 쌍의 일부를 형성할 수 있다. 또한, 폴리펩티드의 변형체, 예를 들어 본원에 정의된 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체, 오르토로그 및 파라로그도 본 발명의 범위에 들어간다. 융합 폴리펩티드의 예가 하기 더 상세히 개시된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 검출가능한 표지, 예를 들어 형광 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분리하거나 확인하는데 있어서 당업자에게 도움이 될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구성물, 예를 들어 선형 또는 원형 형태의 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 숙주 세포를 포함하는 트랜스젠 생물이 제공된다.
다른 말이 없으면 폴리뉴클레오티드는 "핵산" 및 "핵산 분자"와 호환하여 사용된다. 원칙적으로 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 보체, 예를 들어 cDNA 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 형태의 보체를 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 그것이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 한, 개별 뉴클레오티드의 축퇴 서열일 수도 있다.
폴리뉴클레오티드가 천연 숙주 생물로부터 분리된 자생 유전자의 개별 뉴클레오티드를 전부 포함할 필요는 없다. 자생 유전자와 적어도 75% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 80% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 85% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 90% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 91% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 92% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 93% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 94% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 95% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 96% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 97% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 98% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 99% 상동성이거나 동일한, 예를 들어 적어도 99.5% 상동성이거나 동일한 서열들을 포함해서, 이러한 자생 유전자의 어떤 말단 절단형이 본 발명에 포함된다. 자생 유전자의 어떤 이러한 기능적 말단 절단형은, 적합한 숙주 생물에서 발현될 수 있는 그것의 유도체나 변형체를 포함하여 "구조적 유전자"로 표시된다.
예를 들어, 클로닝 벡터나 발현 벡터에서 클로닝된 폴리뉴클레오티드 서열이 숙주 생물에 도입되어 발현되었을 때 발현이 얻어질 수 있다. 발현은 전형적으로 프로모터를 포함하는 조절 서열에 의해 적합하게 지시되며, 프로모터는 코어 프로모터 등의 요소와 발현 인핸서를 비롯한 하나 이상의 조절 요소를 포함할 수 있다.
숙주 생물은 전형적으로 재조합 숙주로서, 즉 발현될 폴리뉴클레오티드 서열을 본래 숨기고 있지 않거나, 또는 자생 발현 신호에 작동 가능하게 연결된 발현될 폴리뉴클레오티드 서열을 본래 포함하지 않는 숙주이다. 분비 신호 서열이 선행하여 있을 때, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 이러한 분비가 발생하든 아니든 무관하게 분비되도록 정해진다.
명확히 하기 위해서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 "분리된" 폴리뉴클레오티드로서 언급되며, 이로써 이 폴리뉴클레오티드가 자생 환경에 존재하는 동일한 또는 관련된 서열과 구별될 것이다. 마찬가지로, 본원에서 정의된 "이종성 폴리뉴클레오티드"는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 자생 형태와 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구성물을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 염색체에 통합되거나 에피솜에 존재한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체, 또는 그것의 결합 단편을 제공한다. 항체는 최신 방법에 의해 생산될 수 있고, 예를 들어 네이키드 항체, 항체의 결합 단편, 항체 성분, 항-이디오타입 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체일 수 있다.
또한, 본 발명의 범위에서는 a) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, b) 본 발명에 따른 폴리펩티드, 및 c) 상기 폴리펩티드에 특이적인 본 발명에 따른 항체의 제조 및 사용 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 항체는 폴리펩티드 집단으로부터 본원에 정의된 "표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"를 확인하거나 분리하기 위해 사용될 수 있다. "표적 펩티드"는 본원에서 정의된 "항원성 펩티드"일 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 항체를 포함하는 고체 지지체 및 이러한 고체 지지체의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
도 1은 R. inquisitor AFP의 단편의 아미노산 서열을 도시한다. 잠정적 얼음 결합 모티프가 검은색 상자로 표시된다. 순방향(F) 프라이머와 역방향(R) 프라이머가 서열로 주어지며, 이들이 유래하는 폴리펩티드의 일부분이 또한 표시된다. 아미노산 서열은 1-8개 아미노산 잔기에 의해 분리되어 X번 반복된 얼음 결합(IB) 모티프(컨센서스 A/G-Q/R-G-T-A-T-T-T-A-T-G-X-A/G)를 나타내거나 숨기고 있는 도메인을 가진다.
도 2는 R. mordax로부터의 AFP 1-8의 전-길이 cDNA 서열을 도시한다. 잠정적 신호 펩티드의 코딩 서열에 밑줄이 쳐있다. 이들 cDNA에 상응하는 AFP(AFP 1-8)은 주로 이들의 N-말단 부분에 차이가 있으며, 여기서 AFP4는 신호 서열이 없는 것으로 드러난다. AFP는 각각 코어 컨센서스 서열 T-A-T-T-T-A-T를 가진 아미노산 서열의 8개 반복부를 함유했다. 이것은 R. inquisitor(도 1)에서 역시 관찰된 잠정적 IB 모티프의 부분과 일치하며, 이것은 R. mordax의 IB 모티프 또는 그것의 적어도 일부분을 나타낸다고 생각된다.
도 3은 Rhagium mordax로부터의 AFP 1-8의 전-길이 아미노산 서열이다. 이들 서열은 각각 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8로 표시된다. 잠정적 신호 서열은 밑줄로 표시되고, 잠정적 얼음 결합 모티프는 상자로 표시된다.
도 4는 발현 벡터 pET26B(+)에서 클로닝된 전-길이 cDNA를 숨긴 E. coli 세포를 도시한다. IPTG는 관련된 AFP의 합성을 유도하는데 사용될 수 있다. 처음에 우리는 E. coli에서 AFP1의 합성을 유도했다. 그 결과는 E. coli에서 생산된 AFP1이 결빙에 견딜 수 있는 능력을 E. coli 세포에 부여한다는 것을 증명한다.
도 5는 야생형(wt) 동형 RmAFP1 및 결실 변이체(Δ2-9, WC(Trp-Cys))의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. RmAFP 변이체는 RmAFP1의 C-말단으로부터 한번에 하나 얼음 결합 도메인의 결실(Δ2-Δ9)(예를 들어, Δ4는 잠정적 얼음 결합 도메인 4-9(도 2 참조)의 결실을 나타낸다)과 C-말단(WC)에 Trp와 Cys 잔기를 함유하는 변이로서 구성되었다. 이들이 pGEX 벡터 시스템(GE Healthcare)에서 클로닝되고, E. coli(균주: Origami, BL21)에서 형질전환되었다. 이 단백질은 GST와 RmAFP 사이에 트롬빈 절단 부위를 함유하는 글루타티온-S-트랜스페라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현되었다.
도 6은 1) RmAFP1의 용액 및 2) 등가시치인 조아르세스 비비파루스(Zoarces viviparus)(타입 3 AFP를 가진 덴마크 어류)의 혈청에서 이력 결빙점에서 일어나는 "얼음 성장 폭발"의 진행을 나타낸다. 두 경우 모두 온도가 저하되기 전에 용액에서 작은 얼음 결정이 단련되었다. 온도가 낮아지면 RmAFP 용액에서는 이력 결빙점에 도달하기 전에는 최초 얼음 결정(1A에서 화살표)이 성장하거나 모양이 변하지 않았다. 이력 결빙점(1B)에서 얼음 결정이 갑자기 쏟아지고, 과냉각된 주변 환경으로 인하여 용액이 결빙된다. 이 경우, 이력 결빙점에서의 얼음 성장 패턴이 콜리플라워 모양(1B, 1C)인 것이 주목된다. 이것은 2)(Z. viviparus 혈청)에서 보이는 사건과는 대조적인데, 이 경우에는 냉각시 얼음 결정의 모양이 서서히 변하여 6각형 기저면을 가진 바이피라미드 모양(2A)이 된다. 이력 결빙점에서는 얼음 성장이 침상형(2B)이고, 용액 중의 모든 얼음은 침상체(2C)로서 성장한다.
도 7은 클로닝되고 정제된 Rhagium mordax AFP1의 분자량 결정을 나타낸다.
도 8은 rRmAFP1의 다이머화를 나타낸다. A: 자생 조건에서 rRmAFP는 다이머로서 거동하는데, 이는 크기 배제 칼럼(Superdex 75, 10/30, GE Healthcare)을 지나 통과될 때, 그것이 같은 Mw 범위에 있는 다른 단백질보다 짧은 체류 시간을 가지는 것으로 알 수 있다. rRmAFP1의 SEC로부터의 Mw 추정값은 Superdex 75가 소 혈청 알부민(68 KDa, BSA), 트립신(25 KDa), 및 인간 시스타틴 C(13 KDa)로 캘리브레이션되었을 때 28 KDa였다. B: 마찬가지로, SDS PAGE에서 전개되었을 때 RmAFP는 다이머로서 거동하며, Mw 추정값은 28 KDa이다. 레인 1: 소 혈청 알부민(BSA); 2: 트립신; 3: RNAse A; 4 시스타틴 C; 5: 리소자임; 6 RmAFPI; 7: 글루타티온-S-트랜스페라제(GST).
도 9는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 원편광 이색성 분광도(CD)를 나타낸다.
도 10은 온도 범위 6-100℃에서 RmAFP1의 온도 안정성을 나타내며, 온도 범위 6-70℃에서 연속 11회 스캔이 수행되었다.
도 11은 RmAFP1의 활성 및 안정성에 대한 pH의 영향을 나타낸다.
정의
결빙방지 단백질은 얼음 결정과의 결합 및 결정 성장의 억제에 의해 비속일적으로 용액의 결빙 온도를 저하시키지만, 용액의 용융점은 속일적 효과에 의해 약간만 변경된다. 이런 열 이력(결빙 온도와 용융 온도의 차이)은 단일 얼음 결정의 성장에 대한 온도의 효과를 관찰함으로써 결정된다. 용융은 얼음 결정면들이 둥글게 될 때 일어나고, 결빙은 얼음 결정이 c-축을 따라 연장될 때 일어난다.
그러므로, 용어 "결빙방지 활성"은 용융 온도와 결빙 온도의 분리를 말한다. 또한, 그것은 용융점과 결빙점의 차이를 말한다. 더 나아가, 그것은 재결정화 온도 이상에서 작은 결정들이 큰 결정을 형성하는 것의 억제를 말한다. 용어 결빙방지 활성은 열 이력과 호환하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 생성된 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 어느 것에 의해 생성된 단편을 말하며, 폴리뉴클레오티드 분자는 자연발생 뉴클레오티드(예를 들어, DNA 및 RNA), 자연발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 자연발생 뉴클레오티드의 알파-거울상이성질체), 또는 이 둘의 조합인 모노머들로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 부분이 변경될 수 있다. 당 변형은, 예를 들어 하나 이상의 히드록실기의 할로겐, 알킬기, 아민, 및 아지도기로의 치환을 포함하거나, 또는 당이 에테르 또는 에스테르로서 작용기화될 수 있다. 또한, 전체 당 부분이 입체적으로 그리고 전자적으로 유사한 구조로, 예를 들어 아자-당 및 탄소고리 당 유사체로 치환될 수 있다. 염기 부분의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 잘 공지된 헤테로고리 치환기를 포함하며, 폴리뉴클레오티드 모노머가 포스포디에스테르 결합이나 이러한 연결의 유사체에 의해서 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 또한, 용어 "핵산 분자"는 소위 "펩티드 폴리뉴클레오티드"라고 하는 것을 포함하며, 이들은 폴리아미드 백본에 부착된 자연발생 또는 변형된 폴리뉴클레오티드 염기를 포함하고, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드 분자의 보체"는 기준 뉴클레오티드 서열과 비교하여 역 방향의 상보성 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5' CCCGTGCAT 3'의 보체이다.
용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드를 암호화하는 기준 폴리뉴클레오티드 분자와 비교하여 하나 이상의 축퇴성 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 표시한다. 축퇴성 코돈은 상이한 뉴클레오티드 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 암호화한다(즉, GAU와 GAC 트리플렛은 각각 Asp를 암호화한다).
용어 "구조적 유전자"는 메신저 RNA(mRNA)로 전사되는 폴리뉴클레오티드 분자를 말하며, 이것은 차례로 특정 폴리펩티드에 특징적인 아미노산의 서열로 번역된다.
"분리된 폴리뉴클레오티드 분자"는 생물의 게놈 DNA에 통합되지 않은 폴리뉴클레오티드 분자이다. 예를 들어, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장인자를 암호화하는 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 폴리뉴클레오티드 분자의 또 다른 예는 생물의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 분자이다. 특정 종으로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 분자는 그 종으로부터의 염색체의 완전한 DNA 분자보다 작다.
"핵산 분자 구성물"은 인간이 개입하여 천연에는 존재하지 않는 배열로 조합되어 병치된 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 함유하도록 변형된, 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자이다.
"선형 DNA"는 자유로운 5' 단부와 3' 단부를 가진 비-원형 DNA 분자를 표시한다. 선형 DNA는 폐쇄된 원형 DNA 분자, 예를 들어 플라스미드로부터 효소 분해나 물리적 파괴에 의해 제조될 수 있다.
"상보성 DNA(cDNA)"는 역전사효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일 가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 일부분에 상보하는 프라이머가 역전사의 개시에 사용된다. 또한, 당업자는 이러한 단일 가닥 DNA 분자와 그것의 상보성 DNA 가닥으로 구성된 이중 가닥 DNA 분자를 언급할 때도 용어 "cDNA"를 사용한다. 또한, 용어 "cDNA"는 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 말한다.
"프로모터"는 구조적 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조적 유전자의 전사 시작 부위 근처의, 유전자의 5' 비-코딩 영역에 위치된다. 전사의 개시에서 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 주로 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소는 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소(DSE; McGehee et al. Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), 고리형 AMP 반응 요소(CREs), 혈청 반응 요소(SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), 글루코코르티코이드 반응 요소(GREs), 및 다른 전사 인자들을 위한 결합 부위, 예를 들어 CRE/ATF(O'Reilly et al. J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2(Ye et al. J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, cAMP 반응 요소 결합 폴리펩티드(CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) 및 옥타머 인자(일반적으로 Watson et al. eds. Molecular Biology of the Gene, 4th ed(The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) 및 Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994) 참조)를 포함한다. 만일 프로모터가 유도성 프로모터라면 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 반대로, 만일 프로모터가 구성성 프로모터라면 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제성 프로모터가 또한 알려져 있다.
"코어 프로모터"는 TATA 상자 및 전사 시작부를 포함해서, 프로모터 기능에 필수적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이 정의에 따르면, 코어 프로모터는 활성을 증진시키거나 조직 특이적 활성을 부여할 수 있는 특이적 서열의 부재하에 검출가능한 활성을 가질 수도 있고 아닐 수도 있다.
"조절 요소"는 코어 프로모터의 활성을 조정하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 조절 요소는 특정 세포, 조직 또는 소기관에서의 전사를 배타적으로 또는 우선적으로 가능하게 하는 세포 인자에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이런 타입의 조절 요소는 통상 "세포-특이적", "조직-특이적", 또는 "소기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 관련된다.
"인핸서"는 전사 시작 부위에 대한 인핸서의 거리나 방향과는 무관하게 전사 효율을 증가시킬 수 있는 조절 요소의 일종이다.
"이종성 DNA"는 주어진 숙주 세포 내에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 분자, 또는 DNA 분자의 집단을 말한다. 특정 숙주 세포에 이종성인 DNA 분자는, 이 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 숙주 세포 종으로부터 유래하는 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들어, 전사 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 세그먼트에 작동 가능하게 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 비-숙주 DNA 세그먼트를 함유하는 DNA 분자는 이종성 DNA 분자로 간주된다. 이와는 반대로, 이종성 DNA 분자는 외인성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 야생형 세포로부터 유래하는 유전자를 포함하는 DNA 분자는 만일 그 DNA 분자가 야생형 유전자를 결여한 돌연변이 세포에 도입된다면 이종성 DNA로 간주된다.
"폴리펩티드"는 자연적으로 생산되든 합성에 의해 생산되든 바람직하게는 펩티드 결합에 의해서만 이어진 아미노산 잔기들의 중합체이다. 비-숙주 DNA 분자의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드는 "이종성" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"아미노산 잔기"는 펩티드 결합 또는 펩티드 결합과는 다른 결합에 의해 연결되는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있다. 아미노산 잔기는 D-입체구조 또는 L-입체구조일 수 있다.
"동종중합체"는 모 폴리펩티드에 몇 가지 유사한 폴리펩티드를 첨가함으로써 구축된 폴리펩티드이며, 이로써 하나의 더 큰 폴리펩티드로서 동일한 폴리펩티드의 다수의 카피가 만들어진다.
"이종중합체"는 모 폴리펩티드에 몇 가지 상이한 폴리펩티드를 첨가함으로써 구축된 폴리펩티드이며, 이로써 하나의 더 큰 폴리펩티드로서 상이한 폴리펩티드의 다수의 카피가 만들어진다.
"비-벌크 아미노산 잔기"는 바람직하게는 고리형(지방족 또는 방향족) 측쇄, 예를 들어 Pro, Phe, Trp, Tyr 및 His, 또는 더 길거나 분지형인 지방족 측쇄, 예를 들어 Arg, Lys, Leu, Ile, Met 및 Val을 가진 아미노산을 제외한 천연 아미노산이며, 또는 더 일반적으로 벌크 아미노산은 적어도 3개의 탄소가 연결되어 분지형 또는 비-분지형 측쇄를 형성한 측쇄를 가진다. "비-벌크 아미노산"의 바람직한 예는 Gly, Ala 및 Ser을 포함한다.
"본 발명에 따른 폴리펩티드"는 본 특허출원, 또는 본 특허출원의 청구항에 기초하여 등록된 특허의 청구항에 인용된 어떤 폴리펩티드이다.
"본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드" 또는 "본 발명에 따른 핵산"은 본 특허출원, 또는 본 특허출원의 청구항에 기초하여 등록된 특허의 청구항에 인용된 어떤 폴리펩티드를 포함해서 "본 발명에 따른 폴리펩티드"를 암호화하는 어떤 폴리뉴클레오티드이다.
"통합된 유전자 요소"는 그 요소가 인간의 조작을 통해 세포에 도입된 후 숙주 세포의 염색체에 편입된 DNA의 세그먼트이다. 본 발명의 범위에서, 통합된 유전자 요소는 전기천공이나 다른 기술에 의해 세포에 도입된 선형화된 플라스미드로부터 가장 일반적으로 유래된다. 통합된 유전자 요소는 모 숙주 세포에서 그것의 자손까지 전달된다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자발적으로 복제하는 능력을 가진 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지이다. 클로닝 벡터는 전형적으로, 벡터의 필수 생물학적 기능의 손실 없이 확정적인 방식으로 폴리뉴클레오티드 분자가 삽입될 수 있는 하나 또는 적은 수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위와 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인 및 선별에서 사용하기에 적합한 마커 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라시클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자, 및 전사 터미네이터를 포함한다. 유전자 발현은 일반적으로 프로모터의 제어하에 있고, 이러한 유전자는 프로모터에 "작동 가능하게 연결"된다고 한다. 유사하게, 조절 요소와 코어 프로모터는 만일 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조정한다면 작동 가능하게 연결된 것이다.
"재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터와 같은 이종성 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 세포이다.
"통합성 형질전환체"는 재조합 숙주 세포이며, 여기서 이종성 DNA가 세포의 게놈 DNA에 통합된다.
"융합 폴리펩티드"는 적어도 2개 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 발현된 하이브리드 폴리펩티드이다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 친화성 매트릭스와 결합한 폴리펩티드와 융합된 본 발명에 따른 폴리펩티드의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 융합 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 본 발명에 따른 다량의 폴리펩티드를 분리하기 위한 수단을 제공한다.
용어 "분비 신호 서열"은 더 큰 폴리펩티드의 성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통해서 더 큰 폴리펩티드를 관장하는 펩티드("분비 펩티드")를 암호화하는 DNA 서열을 표시한다. 더 큰 폴리펩티드는 통상 분비 경로를 통과하는 동안 절단되어 분비 펩티드가 제거된다.
"분리된 폴리펩티드"는 천연 폴리펩티드와 관련된 탄수화물, 지질 또는 다른 폴리펩티드성 불순물과 같은 오염 세포 성분들을 본질적으로 함유하지 않는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 분리된 폴리펩티드의 제조물은 고도 정제된 형태, 즉 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 95% 초과 순도, 또는 99% 초과 순도로 폴리펩티드를 함유한다. 특정 폴리펩티드 제조물이 분리된 폴리펩티드를 함유하는지 알 수 있는 한 방식은 폴리펩티드 제조물의 나트륨도데실술페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후의 단일 밴드의 모양과 그 겔의 코마시 브릴리언트 블루 염색에 의해서다. 그러나, 용어 "분리된"은 다이머 또는 글리코실화된 형태나 유도체화된 형태 등, 물리적 형태가 다른 동일한 폴리펩티드의 존재를 배제하지는 않는다.
용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내에서 위치를 표시하기 위해 본원에서 사용된다. 문맥상 허용된다면, 이들 용어는 폴리펩티드의 특정 서열이나 부분을 언급하면서 함께 사용되어 근접성이나 상대 위치를 표시한다. 예를 들어, 폴리펩티드 내에서 기준 서열에 대해 카르복실-말단에 위치된 어떤 서열은 기준 서열의 카르복실 말단에 가까이 위치되지만, 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단일 필요는 없다.
용어 "발현"은 유전자 산물의 생합성을 말한다. 예를 들어, 구조적 유전자의 경우, 발현은 구조적 유전자의 mRNA로의 전사와 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 수반한다.
용어 "스플라이스 변이체"는 유전자로부터 전사된 RNA의 다른 형태들을 표시하기 위해 본원에서 사용된다. 스플라이스 변이는 전사된 RNA 분자 내에서 선택적 스플라이싱 부위의 사용을 통해서 자연적으로 일어나거나, 아니면 덜 일반적이지만 개별적으로 전사된 RNA 분자들 사이에서 일어나고, 그 결과로서 같은 유전자로부터 전사된 몇 개의 mRNA가 생길 수 있다. 스플라이스 변이체는 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 또한, 용어 스플라이스 변이체는 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드를 표시하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "보체/항-보체 쌍"은 적합한 조건에서 비-공유 회합된 안정한 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분들을 표시한다. 예를 들어, 바이오틴과 아비딘(또는 스트렙타비딘)이 본보기적인 보체/항-보체 쌍의 구성원이다. 다른 전형적인 보체/항-보체 쌍은 리셉터/리간드 쌍, 항체/항원(또는 합텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등을 포함한다. 보체/항-보체 쌍의 해리가 이어지는 것을 바람직한 경우, 보체/항-보체 쌍의 결합 친화성은 109 M-1 미만인 것이 바람직하다.
"항-이디오타입 항체"는 면역글로불린의 가변영역 도메인과 결합하는 항체이다. 본 문맥에서, 항-이디오타입 항체는 항-항체의 가변영역과 결합하며, 이와 같은 항-이디오타입 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프를 의태한다.
"항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등과 같은 항체의 일부분들이다. 구조와 상관없이 항체 단편은 완전한 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합한다. 예를 들어, 항-(본 발명에 따른 폴리펩티드) 단클론성 항체 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프와 결합한다.
또한, 용어 "항체 단편"은 경쇄 가변영역으로 구성된 폴리펩티드, 중쇄와 경쇄의 가변영역으로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄와 중쇄 가변영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자("scFv 폴리펩티드"), 및 초가변영역을 의태하는 아미노산 잔기들로 구성된 최소 인식 단위와 같은, 특이적 항원에 결합하는 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩티드를 포함한다.
"키메라 항체"는 설치류 항체로부터 유래하는 가변 도메인과 상보성 결정 영역을 함유하고, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래하는 재조합 폴리펩티드이다.
"인간화된 항체"는 단클론성 항체의 뮤린 상보성 결정 영역이 뮤린 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 가변 도메인으로 전달된 재조합 폴리펩티드이다.
"검출가능한 표지"는 항체 부분에 콘쥬게이트되어 진단에 유용한 분자를 만들 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 예는 킬레이터, 광활성제, 방사선 동위원소, 형광제, 상자성 이온, 또는 다른 마커 부분들을 포함한다.
용어 "친화성 택"은 제 2 폴리펩티드에 부착되어 제 2 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하거나, 또는 제 2 폴리펩티드가 기질에 부착되기 위한 부위를 제공할 수 있는 폴리펩티드 세그먼트를 표시하기 위해 본원에서 사용된다. 원칙적으로는 항체나 다른 특이적 결합제에 의해 이용될 수 있는 모든 펩티드 또는 폴리펩티드가 친화성 택으로서 사용될 수 있다. 친화성 택은 폴리-히스티딘 트랙, 폴리펩티드 A(Nilsson et al. EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al. Methods Enzymol. 198:3(1991)), 글루타티온-S-트랜스페라제(Smith and Johnson, Gene 67:31(1988)), Glu-Glu 친화성 택(Grussenmeyer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), 섭스턴스 P, FLAG 펩티드(Hopp et al. Biotechnology 6:1204 (1988)), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프나 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로 Ford et al. Polypeptide Expression and Purification 2:95(1991)를 참조한다. 친화성 택을 암호화하는 DNA는 상업적 공급자로부터 이용할 수 있다(예를 들어, Pharmacia Biotech, Piscataway, N. J.).
"네이키드 항체"는 항체 단편과 대비되는 전 항체이며, 이것은 치료제와 콘쥬게이트되지 않는다. 네이키드 항체는 다클론성 항체와 단클론성 항체를 모두 포함할 뿐만 아니라, 키메라 항체 및 인간화된 항체와 같은 어떤 재조합 항체들도 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "항체 성분"은 전 항체와 항체 단편을 모두 포함한다.
"표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"는 적어도 하나의 에피토프를 포함하고, 종양 세포나 감염원 항원을 지닌 세포 등의 표적 세포에서 발현되는 아미노산 서열이다. T 세포는 표적 폴리펩티드나 표적 펩티드에 대해 주 조직적합성 복합체 분자에 의해 제시된 펩티드 에피토프를 인식하고, 전형적으로는 표적 세포를 용해시키거나, 아니면 표적 세포의 부위로 다른 면역 세포들을 모집하여 표적 세포를 죽인다.
"항원성 펩티드"는 주 조직적합성 복합체 분자에 결합하여 T 세포에 의해 인식되는 MHC-펩티드 복합체를 형성함으로써 T 세포에 대해 제시되었을 때 세포독성 림프구 반응을 유도하는 펩티드이다. 따라서, 항원성 펩티드는 적합한 주 조직적합성 복합체 분자에 결합하여, 항원에 결합하거나 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 세포 용해 또는 특이적 사이토카인 방출과 같은 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 항원성 펩티드는 I형 또는 II형 주 조직적합성 복합체 분자의 환경에서 항원 제시 세포 또는 표적 세포 상에 결합될 수 있다.
진핵세포에서는 RNA 중합효소 II가 구조적 유전자의 전사를 촉매하여 mRNA를 만든다. RNA 중합효소 II 주형을 함유하도록 폴리뉴클레오티드 분자가 설계될 수 있으며, 여기서 RNA 전사체는 특이적 mRNA의 서열에 상보하는 서열을 가진다. RNA 전사체는 "안티센스 RNA"라고 명명되고, 안티센스 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 "안티센스 유전자"라고 명명된다. 안티센스 RNA 분자는 mRNA 분자에 결합하여 mRNA 번역을 억제할 수 있다.
"본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드"는 (a) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 일부분과 안정한 트리플렉스를 형성할 수 있는 서열, 또는 (b) 이러한 유전자의 mRNA 전사체의 일부분과 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴클레오티드이다.
용어 "변이체 유전자"는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형체인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 이러한 변이체는 본 발명에 따른 유전자의 자연발생 다형체들뿐만 아니라 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열의 보존성 아미노산 치환을 함유하는 합성 유전자를 포함한다. 유전자의 추가 변이체 형태는 본원에 설명된 뉴클레오티드 서열의 삽입이나 결실을 함유하는 폴리뉴클레오티드 분자이다. 본 발명에 따른 변이체 유전자는 유전자가 본 발명에 따른 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 그것의 보체와 긴축 조건에서 혼성화하는지의 여부를 결정함으로써 확인될 수 있다.
또는 달리, 변이체 유전자는 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 만일 두 아미노산 서열의 아미노산 잔기들이 최대 일치 정렬되었을 때 동일하다면 두 아미노산 서열은 "100% 아미노산 서열 동일성"을 가진다. 유사하게, 만일 두 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기들이 최대 일치 정렬되었을 때 동일하다면 두 뉴클레오티드 서열은 "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 가진다. 서열 비교는 표준 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 DNASTAR(Madison, Wis.)에서 제조된 LASERGENE 바이오인포메틱스 컴퓨팅 스위트에 포함된 것들을 사용하여 수행될 수 있다. 최적 정렬을 결정함으로써 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법들도 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of polynucleotides and polypeptides," Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151(CRC Press, Inc. 1997), and Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998) 참조). 서열 동일성을 결정하는 특정한 방법들이 아래 설명된다.
변이체 유전자를 확인하기 위해 사용된 특정 방법에 상관없이, 변이체 유전자는 항-(본 발명에 따른 폴리펩티드) 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 할 수 있는 폴리펩티드를 암호화한다.
용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 점유하는 유전자의 둘 이상의 다른 형태들 중 어느 것을 표시하기 위해 본원에서 사용된다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해서 자연적으로 발생하며, 그 결과로서 집단 내에 표현형적 다형성이 생길 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵성(암호화된 폴리펩티드에 변화 없음)일 수도 있고, 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 또한, 용어 대립형질 변이체는 유전자의 대립형질 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드를 표시하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "오르토로그"는 한 종으로부터 얻어진, 상이한 종으로부터의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 카운터파트인 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 표시한다. 오르토로그들의 서열 차이는 종분화의 결과이다.
"파라로그"는 생물에 의해 만들어진 별개이지만 구조적으로는 관련된 폴리펩티드들이다. 파라로그는 유전자 중복을 통해서 발생하는 것으로 생각된다. 예를 들어, 알파-글로빈, 베타-글로빈, 및 미오글로빈은 서로의 파라로그이다.
표준 분석법의 부정확성으로 인하여 중합체의 분자량과 길이는 대략적인 값으로서 이해된다. 이러한 값이 "약" X 또는 "대략" X로서 표시된 경우, 기술된 X 값은 +/-20%, 예를 들어 +/-10%, 예를 들어 +/-5%까지 정확한 것으로 이해된다.
발명의 상세한 설명
한 구체예에서, 본 발명은 얼음 결정의 형성 및/또는 성장을 감소 또는 억제할 수 있는, SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열로 구성되거나 포함하는 분리된 폴리펩티드, 또는 얼음 결정의 형성 및/또는 성장을 감소 또는 억제할 수 있는 그것의 단편, 또는 상기 서열 중 어느 것과 적어도 75% 동일한 서열을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주 세포에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 발현 신호를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 분리된 재조합 세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 식용품이 제공되며, 상기 식용품은 냉동될 수 있거나, 또는 아이스크림 제품이나 빵과 같은 냉동 당과 제품의 형태일 수 있다.
비-식품 용도의 예로서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체 물질이 제공된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 또는 사용 방법에 관한 것이며, 여기에는, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 방법이 포함되고, 상기 방법은
i) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 벡터를 제공하는 단계,
ii) 단계 i)에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 재조합 발현에 의해 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는데 적합한 숙주 세포를 제공하는 단계,
iii) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는 단계, 및 선택적으로
iv) 상기 폴리펩티드를 정제 및/또는 분리하는 단계
를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 인시튜 제조에 관한 것일 경우,
i) 발효가능한 출발 물질을 제공하는 단계,
ii) 상기 발효가능한 식품 출발 물질을 발효시킬 수 있고, 상기 발효가능한 식품 출발 물질을 발효시킬 때 적합한 조건에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 단계,
iii) 상기 미생물의 존재하에 상기 식품 출발 물질을 발효시켜서 발효된 식용품을 제조하는 단계
를 포함하며, 상기 발효된 식용품이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 방법이 제공된다.
다른 구체예에서, 하기 방법들이 제공된다:
냉동 식용품에서 얼음 결정 형성을 감소 또는 억제하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 냉동 식용품, 또는 그것의 제조를 위해 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
ii) 경우에 따라, 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에 상기 제품 및/또는 상기 원료와 본 발명에 따른 폴리펩티드를 접촉시키는 단계
를 포함하며, 이로써 냉동 식용품에서 얼음 결정 형성이 감소 또는 억제되는 방법.
냉동 식용품에서 얼음 결정 성장을 감소 또는 억제하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 냉동 식용품, 또는 그것의 제조를 위해 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
ii) 경우에 따라, 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에 상기 제품 및/또는 상기 원료와 본 발명에 따른 폴리펩티드를 접촉시키는 단계
를 포함하며, 이로써 냉동 식용품에서 얼음 결정 성장이 감소 또는 억제되는 방법.
냉동 식용품에서 얼음 결정을 구조화하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 냉동 식용품, 또는 그것의 제조를 위해 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
ii) 경우에 따라, 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에 상기 제품 및/또는 상기 원료와 본 발명에 따른 폴리펩티드를 접촉시키는 단계
를 포함하며, 이로써 냉동 식용품에서 얼음 결정이 구조화되는 방법.
냉동 식용품의 질감 또는 관능 품질을 조정하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 냉동 식용품, 또는 그것의 제조를 위해 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
ii) 경우에 따라, 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에 상기 제품 및/또는 상기 원료와 본 발명에 따른 폴리펩티드를 접촉시키는 단계
를 포함하며, 이로써 냉동 식용품의 질감 또는 관능 품질이 조정되는 방법.
냉동 식용품의 제조 또는 보관 동안 얼음 결정 형성을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 냉동 식용품, 또는 그것의 제조를 위해 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
ii) 경우에 따라, 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에 상기 제품 및/또는 상기 원료와 본 발명에 따른 폴리펩티드를 접촉시키는 단계, 및
iii) 냉동 식용 식품의 제조 또는 보관 동안 상이한 시점들에서 얼음 결정 형성을 모니터링하는 단계
를 포함하는 방법.
여성 개체에서 시험관 수정(IVF) 치료를 수행하는 방법으로서, 상기 방법은 선택적으로 난포액을 포함하는 생물학적 샘플과 함께 여성 개체로부터 하나 이상의 난모세포(들)를 제거하는 단계; 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재하에, 선택적으로 생물학적 샘플과 함께, 하나 이상의 난모세포(들)를 냉동하는 단계; 제거된 난모세포들 중 하나 이상을 시험관 수정시키는 단계; 및 여성 개체에 수정된 난모세포들 중 하나 이상을 이식하는 단계를 포함한다.
여성 개체에서 임신 가능성 또는 확률을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 선택적으로 난포액을 포함하는 생물학적 샘플과 함께 여성 개체로부터 하나 이상의 난모세포(들)를 제거하는 단계; 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재하에, 선택적으로 생물학적 샘플과 함께, 하나 이상의 난모세포(들)를 냉동하는 단계; 제거된 난모세포들 중 하나 이상을 시험관 수정시키는 단계; 및 여성 개체에 수정된 난모세포들 중 하나 이상을 이식하는 단계를 포함하며, 이때 본 발명에 따른 폴리펩티드의 존재하에 하나 이상의 난모세포(들)를 냉동하는 단계가 난모세포(들) 상에서, 또는 난모세포(들)이 존재하는 주변환경에서 얼음 결정 성장 및/또는 형성을 감소시키고, 이로써 임신 가능성 또는 확률이 증가하는 방법.
샘플은 과립층-황체 세포 또는 난포 세포와 선택적으로 여성 개체의 난소 난포에서 회수된 다른 난소 세포를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 샘플은 난모세포 주변환경에서 유래하는 냉동된 세포를 더 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 얼음 결합 활성을 가지고, 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)의 하나 이상의 카피, 예를 들어 공통 얼음 결합 도메인 SEQ ID NO:90의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 개별적으로 선택된 카피를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서
X1은 S, A, G 및 D로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X2는 A, V, I, T 및 S로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X3은 비-벌크 아미노산 잔기들로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X4는 S, I, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X5는 S, A, I 및 T로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X6은 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X7은 비-벌크 아미노산 잔기들로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X8은 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X9는 S, A 및 G로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되며;
SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 하나는 T 또는 V이고;
이 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 최대 수는 1000개 미만이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 최대 수는 500개 미만, 예를 들어 400개 미만, 예를 들어 300개 미만, 예를 들어 250개 미만, 예를 들어 240개 미만, 예를 들어 230개 미만, 예를 들어 220개 미만, 예를 들어 210개 미만, 예를 들어 200개 미만, 예를 들어 190개 미만, 예를 들어 180개 미만, 예를 들어 150개 미만, 예를 들어 140개 미만, 예를 들어 130개 미만, 예를 들어 120개 미만, 예를 들어 110개 미만, 예를 들어 100개 미만, 예를 들어 95개 미만, 예를 들어 90개 미만, 예를 들어 85개 미만, 예를 들어 80개 미만, 예를 들어 75개 미만, 예를 들어 70개 미만, 예를 들어 65개 미만, 예를 들어 60개 미만, 예를 들어 55개 미만, 예를 들어 50개 미만, 예를 들어 45개 미만, 예를 들어 40개 미만, 예를 들어 30개 미만, 예를 들어 20개 미만, 예를 들어 15개 미만인 것이 바람직하다.
폴리펩티드의 수에 대한 상술된 제한과 기능적 관계로서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 최소 수는 10개 이상, 예를 들어 12개 이상, 예를 들어 14개 이상, 예를 들어 16개 이상, 예를 들어 18개 이상, 예를 들어 20개 이상, 예를 들어 22개 이상, 예를 들어 24개 이상, 예를 들어 26개 이상, 예를 들어 28개 이상, 예를 들어 30개 이상, 예를 들어 32개 이상, 예를 들어 34개 이상, 예를 들어 36개 이상, 예를 들어 38개 이상, 예를 들어 40개 이상, 예를 들어 42개 이상, 예를 들어 44개 이상, 예를 들어 46개 이상, 예를 들어 48개 이상, 예를 들어 50개 이상, 예를 들어 55개 이상, 예를 들어 60개 이상, 예를 들어 65개 이상, 예를 들어 70개 이상, 예를 들어 75개 이상, 예를 들어 80개 이상, 예를 들어 85개 이상, 예를 들어 90개 이상, 예를 들어 95개 이상, 예를 들어 100개 이상일 수 있고, 임의의 최대 수와 최소 수가 짝을 이룰 때, 최대 수는 최소 수보다 크다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 다수의 공통 얼음 결합 도메인을 포함하며, 각각의 공통 얼음 결합 도메인은, 본원에 설명된 대로, SEQ ID NO:90의 서열, 또는 그것의 변이체 또는 유도체 또는 변형체를 포함하고, 바람직하게는 최대 250개의 아미노산 잔기를 가진다.
한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:90의 추가로 독립적으로 선택된 카피의 형태로, 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열에 관한 것이며, 이때 SEQ ID NO:90의 추가의 카피는 SEQ ID NO:90의 최초 카피와 중첩되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:90의 제 3 카피를 더 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다(즉, 폴리펩티드가 SEQ ID NO:90의 3개의 독립적으로 선택된 카피를 포함한다). 또 다른 추가의 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:90의 제 4 카피를 더 포함한다(즉, 폴리펩티드가 SEQ ID NO:90의 3개의 독립적으로 선택된 카피를 포함한다). 본원에 개시된 대로, SEQ ID NO:90의 독립적으로 선택된 카피는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.
SEQ ID NO:90의 카피는 서로에 대하여 임의의 순서로 존재할 수 있으며, 임의의 두 서열은 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해서 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 고체 지지체나 반-고체 지지체와 같은 담체에 연결될 수 있다. 어떤 이러한 담체, 예를 들어 바람직하게 본 발명에 따른 폴리펩티드를 나타내는 물질의 표면에 폴리펩티드가 공유 또는 비-공유 연결될 수 있다.
또한, 본 발명은 친화성 택에 융합된 본 발명에 따른 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 친화성 택의 예는 문헌에 공지되어 있으며, 예를 들어 His-tag, 폴리펩티드 A 택, 아비딘/스트렙타비딘, 폴리펩티드 G, 글루타티온-S-트랜스페라제, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR), 녹색 형광 폴리펩티드(GFP), 폴리아르기닌, 폴리시스테인, c-myc, 칼모듈린 결합 폴리펩티드, 인플루엔자바이러스 헤마글루티닌, 말토스 결합 단백질(MBP)(HA)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 폴리펩티드를 포함하며, 상기 하나 이상의 변형(들)은 바람직하게 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화, 예를 들어 아세틸화 또는 카르복실화, 글리코실화, 예를 들어 글리코실화에 영향을 미치는 효소, 예를 들어 포유류 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 폴리펩티드가 노출된 결과로 인한 글리코실화, 인산화, 예를 들어 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포티로신, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 생성하는 아미노산 잔기의 변형으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 자연발생 L-아미노산, 자연발생 L-아미노산 및 비-자연발생 합성 아미노산으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 바람직하지 않은 변성으로부터 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단을 보호하고 및/또는 안정화하기 위한 봉쇄기가 도입된 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 봉쇄기는 분지형 또는 비-분지형 알킬기 및 아실기, 예를 들어 포르밀기 및 아세틸기, 또한 이들의 치환된 형태, 예를 들어 아세트아미도메틸을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 변형체 및 유도체, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드, 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 상기 세포를 포함하는 트랜스젠 생물에 관한 것이다.
부다페스트 조약하의 특허 기탁
다음의 박테리아 균주들이 부다페스트 조약의 규정에 따라 DSMZ에 2007년 6월 4일자로 기탁되었습니다.
Escherichia coli ALO3231
DSM 19401: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP1를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3232
DSM 19402: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP2를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3233
DSM 19403: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP3를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3234
DSM 19404: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP4를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3235
DSM 19405: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP5를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3236
DSM 19406: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP6를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3237
DSM 19407: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP7를 함유하는 E. coli 균주 JM109
Escherichia coli ALO3238
DSM 19408: 플라스미드 pGEM-T-Easy-RmAFP8를 함유하는 E. coli 균주 JM109
다음의 진술은 상기 인용된 DSMZ 기탁번호와 관련하여 아래 인용된 지역 및 국가를 위해 작성된다.
EPO: 출원인이 요청하는바, 출원이 거절되거나 철회되거나 철회로 간주되지 않는 경우, 유럽특허의 등록이 공표될 때까지, 또는 출원일로부터 20년 동안은 생물학적 물질을 신청(Rule EPC 28(4))에 의해 샘플을 전문가에게 제공할 때만 Rule EPC 28(3)의 규정에 따라 이용할 수 있어야 한다.
호주: 출원인이 통지하는바, 미생물 샘플은 특허등록 전, 또는 출원의 포기, 거절 또는 철회 전에만 본 발명에 이해관계가 없는 전문가에게 제공되어야 한다(호주 특허 규정의 Regulation 3.25(3)).
캐나다: 출원인이 요청하는바, 본 출원에 기초한 캐나다 특허가 발행될 때까지, 또는 본 출원이 거절되거나 포기되어서 더 이상 복구될 수 없게 되거나 철회될 때까지, 특허청장만이 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플을 특허청장이 지명한 독자적 전문가에게 제공할 권한을 가진다.
크로아티아: 출원인이 요청하는바, 출원공개와 특허등록 사이에 독자적 전문가만이 신청에 의해 샘플을 이용할 수 있다.
덴마크: 출원인이 요청하는바, 본 출원이 공적조사기관(덴마크 특허청에 의한)에 공개되거나, 또는 공적조사기관에 공개되지 않아도 된다고 덴마크 특허청에 의해 최종적으로 결정될 때까지, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 본 분야의 전문가에게만 제공되어야 한다.
핀란드: 출원인이 요청하는바, 본 출원이 공적조사기관(국가 특허규정위원회에 의한)에 공개되거나, 또는 공적조사기관에 공개되지 않아도 된다고 국가 특허규정위원회에 의해 최종적으로 결정될 때까지, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 본 분야의 전문가에게만 제공되어야 한다.
독일: 출원인이 요청하는바, 출원이 거절되거나 철회되지 않는 경우, 특허등록 때까지, 또는 출원일로부터 20년 동안은 샘플이 출원인이 지명한 독자적 전문가에게만 제공되어야 한다.
아이슬란드: 출원인이 요청하는바, 특허가 등록될 때까지, 또는 아이슬란드 특허청에 의해 본 출원에 관한 특허결정이 아닌 최종 결정이 취해질 때까지, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 본 분야의 전문가에게만 제공되어야 한다.
노르웨이: 출원인이 요청하는바, 본 출원이 공적조사기관(노르웨이 특허청에 의한)에 공개되거나, 또는 공적조사기관에 공개되지 않아도 된다고 노르웨이 특허청에 의해 최종적으로 결정될 때까지, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 본 분야의 전문가에게만 제공되어야 한다.
싱가폴: 출원인이 요청하는바, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 전문가에게만 제공되어야 한다.
스페인: 출원인이 요청하는바, 출원이 거절되거나 철회되지 않는 경우, 스페인 특허의 등록이 공표될 때까지, 또는 출원일로부터 20년 동안은 생물학적 물질을 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플을 독자적 전문가에게 제공할 때만 Article 45 SPL의 규정에 따라 이용할 수 있어야 한다.
스웨덴: 출원인이 요청하는바, 본 출원이 공적조사기관(스웨덴 특허청에 의한)에 공개되거나, 또는 공적조사기관에 공개되지 않아도 된다고 스웨덴 특허청에 의해 최종적으로 결정될 때까지, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 본 분야의 전문가에게만 제공되어야 한다.
영국: 출원인이 요청하는바, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플은 전문가에게만 제공되어야 한다.
서열 상동성 및 동일성의 결정
한 양태에서, 본 발명은 또한 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것과 같은, 본 발명에 따른 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가진 분리된 폴리펩티드, 또는 이들의 오르토로그를 제공한다.
용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것에 대해서 적어도 70%, 예를 들어 적어도 72%, 예를 들어 적어도 74%, 예를 들어 적어도 76%, 예를 들어 적어도 78%, 예를 들어 적어도 80%, 예를 들어 적어도 82%, 예를 들어 적어도 84%, 예를 들어 적어도 86%, 예를 들어 적어도 88%, 예를 들어 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 예를 들어 적어도 92%, 예를 들어 적어도 93%, 예를 들어 적어도 94%, 예를 들어 적어도 95%, 예를 들어 적어도 96%, 예를 들어 적어도 97%, 예를 들어 적어도 98%, 예를 들어 적어도 99%, 또는 99%를 초과하는 서열 동일성을 가진 폴리펩티드, 또는 이들의 오르토로그를 표시하기 위해 본원에서 사용된다.
또한, 본 발명은 두 가지 기준을 사용하여 확인될 수 있는 변이체 폴리뉴클레오티드 분자를 고찰하며, 두 가지 기준은 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 간의 동일성 또는 유사성의 결정(상기 참조), 및 b) 긴축 조건에서 수행되는 혼성화 분석이다. 예를 들어, 어떤 유전자 변이체는 세정 긴축도가 55-65℃에서 0.1% SDS를 가진 0.5x 내지 2x SSC와 등가인 긴축 세정 조건에서 세정한 후, 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것과 같은, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 보체와 혼성화되어 유지되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또는 달리, 변이체 유전자는 세정 긴축도가 55-65℃에서 0.1% SDS를 가진 0.1x 내지 0.2x SSC와 등가인 긴축 세정 조건에서 세정한 후, 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것과 같은, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 보체와 혼성화되어 유지되는 폴리뉴클레오티드 분자로서 특정될 수 있다.
서열 동일성 퍼센트는 종래의 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, Altschul et al. Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)를 참조한다. 간단히 말해서, 갭 오픈 패널티 10, 캡 익스텐젼 패널티 1, Henikoff and Henikoff(상동)의 "BLOSUM62" 스코어링 매트릭스를 사용하여 정렬 스코어가 최적화되도록 두 아미노산 서열을 정렬한다. 다음에, ([동일한 매치의 총 수/긴 서열의 길이 + 두 서열을 정렬하기 위해 긴 서열에 도입된 갭의 수]) x (100)에 따라 동일성 퍼센트를 계산한다.
당업자는 두 아미노산 서열의 정렬에 이용할 수 있는 많은 알고리즘이 확립되어 있다는 것을 알고 있다. Pearson과 Lipman의 "FASTA" 유사성 서치 알고리즘이 본원에 개시된 아미노산 서열과 잠정적 변이체의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성의 수준을 시험하는데 적합한 폴리펩티드 정렬 방법이다. FASTA 알고리즘은 Pearson과 Lipman에 의해 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)에서, 그리고 Pearson에 의해 Meth. Enzymol. 183:63 (1990)에서 설명된다.
간단히 말해서, FASTA는 먼저 보존성 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 고려하지 않고 쿼리 서열(예를 들어, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것)과 최고 동일성 밀도(ktup 변수가 1인 경우)나 동일성 쌍들(ktup=2인 경우) 중 어느 하나를 가진 테스트 서열에 의해 공유된 영역을 확인함으로써 서열 유사성을 특정한다. 다음에, 아미노산 치환 행렬을 사용하여 모든 쌍을 이룬 아미노산의 유사성을 비교함으로써 최고 동일성 밀도를 나타낸 10개 영역을 기록하고, 영역의 끝을 트리밍하여 최고 스코어에 기여하는 잔기들만 포함시킨다. 만일 몇 개의 영역이 "컷오프" 값(서열의 길이와 ktup 값에 기초한 정해진 식에 의해 계산된)을 초과하는 스코어를 나타낸다면, 트리밍된 초기 영역을 시험하여 그 영역들이 이어져서 갭을 가진 대략적 정렬을 형성할 수 있는지의 여부를 결정한다. 마지막으로, 아미노산 삽입 및 결실이 가능한 변형된 Needleman-Wunsch-Sellers 알고리즘을 사용하여 두 아미노산 서열의 최고 스코어 영역을 정렬한다(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)). FASTA 분석의 바람직한 파라미터는 ktup=1, 갭 오프닝 패널티=10, 갭 익스텐젼 패널티=1 그리고 치환 행렬=BLOSUM62이다. Pearson, Meth. Enzymol. 183:63(1990)의 Appendix 2에 설명된 대로, 스코어링 행렬 파일("SMATRIX")을 변형시켜서 FASTA 프로그램에 이들 파라미터를 도입할 수 있다.
또한, FASTA를 사용하여 상기 개시된 비를 이용하여 폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성을 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교에서 ktup 값은 1 내지 6의 범위, 바람직하게는 3 내지 6의 범위, 가장 바람직하게는 3일 수 있다. 다른 파라미터들은 갭 오프닝 패널티=10, 갭 익스텍젼 패널티=1로서 설정될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 치환
또한, 본 발명은 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 보존성 아미노산 치환(들)을 가진 폴리펩티드 및 하나 이상의 보존성 아미노산 치환(들)을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 즉, 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체가 얻어질 수 있다. 변이체는 알킬 아미노산이 알킬 아미노산으로 치환된 서열, 방향족 아미노산이 방향족 아미노산으로 치환된 서열, 황-함유 아미노산이 황-함유 아미노산으로 치환된 서열, 히드록시-함유 아미노산이 히드록시-함유 아미노산으로 치환된 서열, 산성 아미노산이 산성 아미노산으로 치환된 서열, 염기성 아미노산이 염기성 아미노산으로 치환된 서열, 또는 이염기성 모노카르복실 아미노산이 이염기성 모노카르복실 아미노산으로 치환된 서열을 포함한다.
통상의 아미노산 중에서, 예를 들어 "보존성 아미노산 치환"은 또한 다음의 각 그룹 범위 내에서의 아미노산의 치환에 의해 예시될 수 있다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 및 이소로이신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
BLOSUM62 테이블은 폴리펩티드 서열 세그먼트의 약 2,000개의 국소 다중 정렬로부터 유래된 아미노산 치환 행렬이며, 관련 폴리펩티드의 500개를 넘는 그룹의 고도로 보존된 영역을 표시한다(Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). 따라서, BLOSUM62 치환 빈도를 사용하여 본 발명의 아미노산 서열에 도입될 수 있는 보존성 아미노산 치환을 규정할 수 있다. 화학적 특성에만 기초하여 아미노산 치환을 설계하는 것도 가능하지만(상기 논의된 대로), "보존성 아미노산 치환"이란 말은 바람직하게는 -1을 초과하는 BLOSUM62 값으로 표시된 치환을 말한다. 예를 들어, 만일 치환이 0, 1, 2 또는 3의 BLOSUM62 값으로 특정된다면 아미노산 치환은 보존성이다. 이 시스템에 따르면, 바람직한 보존성 아미노산 치환은 최소 1(예를 들어, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값으로 특정되고, 더욱 바람직한 보존성 아미노산 치환은 최소 2(예를 들어, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값으로 특정된다.
폴리펩티드의 특정 변이체는 본원에 개시된 상응하는 아미노산 서열(즉, 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것)에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 초과의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 하며, 예를 들어 이때 아미노산 서열의 변화는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환으로 인한 것이다.
아미노산 서열의 변이체, 예를 들어 "보존성 아미노산" 변이체는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발, 링커-스캐닝 돌연변이유발, 중합효소 연쇄반응을 이용한 돌연변이유발 등에 의해 얻어질 수 있다(Ausubel (1995) pages 810-822; 및 McPherson (ed.) Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991) 참조).
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 비-자연발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비-자연발생 아미노산 잔기는, 제한은 없지만, 예를 들어 트랜스-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, 시스-4-히드록시프롤린, 트랜스-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸모노시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 데히드로폴린, 3- 및 4-메틸프롤릴, 3,3-디메틸프롤린, tert-로이신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다.
비-자연발생 아미노산 잔기를 폴리펩티드에 편입시키기 위한 몇 가지 방법이 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 화학적으로 아미노아실화된 억제인자 tRNA를 사용하여 논센스 돌연변이를 억제하는 시험관내 시스템이 채용될 수 있다. 아미노산 및 아미노아실화 tRNA를 합성하는 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 논센스 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 전형적으로 E. coli S30 추출물과 상업적으로 입수가능한 효소와 다른 시약들을 포함하는 세포 무함유 시스템에서 수행되고, 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드가 정제된다. 예를 들어, Robertson et al. J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et al. Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al. Science 259:806 (1993), 및 Chung et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:10145 (1993)를 참조한다.
Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53 (1988))나 Bowie and Sauer(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))에 의해 개시된 것들과 같은, 공지된 돌연변이유발 및 스크리닝 방법을 이용하여 다중 아미노산 치환을 만들고 시험할 수 있다. 간단히 말해서, 이들 저자는 폴리펩티드 내의 둘 이상의 위치를 동시에 무작위화하고, 기능적 폴리펩티드를 선택한 다음, 돌연변이된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각 위치에서 허용될 수 있는 치환의 범위를 결정하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 파지 디스플레이(예를 들어, Lowman et al. Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al. U.S. Pat. No.5,223,409, Huse, International Publication No. WO 92/06204), 영역-지정 돌연변이유발(Derbyshire et al. Gene 46:145 (1986) 및 Ner et al. DNA 7:127 (1988))을 포함한다.
본 발명에 따른 개시된 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 변이체는 또한, Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:10747 (1994), 및 국제공개 No. WO 97/20078에 개시된 DNA 셔플링을 통해서 생성될 수 있다. 간단히 말해서, 모 DNA의 무작위 단편화 후 PCR을 이용해 재조립함으로써 무작위로 도입된 점 돌연변이들을 만드는 시험관내 상동성 재조합에 의해 변이체 DNA 분자가 생성된다. 이 기술은 상이한 종들로부터의 대립형질 변이체나 DNA 분자와 같은 일단의 모 DNA 분자를 사용하여 과정에 추가적 다양성을 도입함으로써 변형될 수 있다. 원하는 활성의 선택이나 스크리닝 후, 돌연변이유발과 분석의 추가적 반복은 바람직한 돌연변이를 선택하는 동시에 불리한 변화에 대해서도 선택함으로써 서열의 신속한 "전개"를 제공한다.
본원에 개시된 돌연변이유발 방법은 고-처리량 자동화 스크리닝 방법과 조합될 수 있으며, 이로써 숙주 세포에서 클로닝된 돌연변이 폴리펩티드의 활성을 검출할 수 있다. 생물학적으로 활성인 폴리펩티드, 또는 특이적 항체와 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이된 DNA 분자가 숙주 세포로부터 회수되어 현대적 장비를 이용하여 빠르게 시퀀싱될 수 있다. 이들 방법은 관심의 폴리펩티드에서 각 아미노산 잔기의 중요도에 대한 빠른 결정을 가능하게 하며, 구조가 불명인 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편
또한, 본 발명은 폴리펩티드의 "기능적 단편" 및 이러한 기능적 단편을 암호화하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자에 대한 일반적인 결실 분석을 수행하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자의 기능적 단편을 얻을 수 있다. 예시로서, 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것을 암호화하는 DNA 분자가 Bal31로 효소분해되어 일련의 중첩된 결실을 제공할 수 있다. 다음에, 단편이 적합한 리딩 프레임 내에서 발현 벡터에 삽입되고, 발현된 폴리펩티드가 분리되고 항-항체에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 시험된다. 외인성 효소분해에 대한 한 가지 대안은 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발을 이용하여 결실이나 중단 코돈을 도입하여 원하는 단편의 생성을 지정하는 것이다. 또는 달리, 본 발명에 따른 유전자의 특정 단편들은 중합효소 연쇄반응을 이용하여 합성될 수 있다.
SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8의 단편은 바람직하게 본원에 설명된 대로 SEQ ID NO:9 내지 SEQ ID NO:72로 표시된 얼음 결합 부위 중 하나 이상을 포함한다. 또한, 키메라 폴리펩티드 및 폴리펩티드 단편도 제공된다.
다음 단편: GSYSCRAVGVDASTVTDVQGTCHAKATGPGAVASGTSVDGSTSTATATGSC는 전-길이 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ NO:7 및 SEQ ID NO:8로부터 기원하며, C-말단부에 대체 잔기 C와 N-말단부에 GS를 함유한다.
기능적 도메인을 확인하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 인터페론의 한쪽 말단이나 양쪽 말단에서의 말단 절단에 대한 연구가 Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995)에 요약되었다. 또한, 폴리펩티드의 기능적 분석을 위한 표준 기술들이, 예를 들어 Treuter et al. Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content et al. "Expression and preliminary deletion analysis of the 42kDa 25A synthetase induced by human interferon," Biological Inter-feron Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.) pages 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor," Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al.(eds.) pages 169-99(Academic Press 1985), Coumailleau et al. J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al. J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al. Biochem. Pharmacol. 50: 1295 (1995), 및 Meisel et al. Plant Molec. Biol. 30:1 (1996)에서 설명된다.
또한, 본 발명은 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것의 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 변화를 가진 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기능적 단편을 고찰한다. 변이체 폴리펩티드는 본원에 개시된 특정 아미노산 서열과의 동일성 수준을 결정함으로써 구조에 기초해 확인될 수 있다. 구조에 기초해 변이체 폴리펩티드를 확인하는 다른 접근법은 잠재적 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 논의된 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것의 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드 분자와 혼성화할 수 있는지의 여부를 결정하는 것이다.
또한, 본 발명은 본원에 설명된 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드를 제공한다. 이러한 단편이나 펩티드는 전체 폴리펩티드가 면역원으로서 사용될 때 항체 반응을 도출하는 폴리펩티드의 일부분인 "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프-보유 펩티드는 표준 방법에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, Geysen et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:3998 (1983) 참조).
반대로, 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 분자의 영역인 "항원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 어떤 에피토프는 아미노산의 선형 또는 연속 스트레치로 구성되며, 이러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의해서 파괴되지 않는다. 폴리펩티드의 에피토프를 의태할 수 있는 비교적 짧은 합성 펩티드를 사용하여 폴리펩티드에 대한 항체의 생산을 자극할 수 있다는 것이 본 분야에 알려져 있다(예를 들어, Sutcliffe et al. Science 219:660 (1983) 참조). 따라서, 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 설명된 폴리펩티드와 결합하는 항체를 생성하는데 유용하다.
항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 서열 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것의 적어도 4개 내지 10개 아미노산, 예를 들어 적어도 10개 내지 15개 아미노산, 예를 들어 약 15개 내지 약 30개 아미노산을 함유할 수 있다. 이러한 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 설명된 대로 본 발명에 따른 폴리펩티드의 단편화나 화학적 펩티드 합성에 의해서 제조될 수 있다. 또한, 에피토프는 무작위 펩티드 라이브러리의 파지 디스플레이에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993), 및 Cortese et al. Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996) 참조). 에피토프를 확인하고, 에피토프를 포함하는 작은 펩티드로부터 항체를 생산하기 위한 표준 방법은, 예를 들어 Mole, "Epitope Mapping," Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.) pages 105-116(The Humana Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.) pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), 및 Coligan et al. (eds.) Current Protocols in Immunology, pages 9.3.1-9.3.5, 및 pages 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997)에 설명된다.
본 발명에 따른 변이체 유전자의 특정 뉴클레오티드 서열과 상관없이, 유전자는 SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:8 중 어느 것에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 할 수 있는 폴리펩티드를 암호화한다.
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드, 또는 얼음 결합 부위, 또는 얼음 결합 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드
또한, 본 발명은 결빙방지 융합 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 결빙방지 융합 폴리펩티드는 특정 세포 구획이나 세포외 공간에, 특정 세포에, 또는 특정 세포 타입에 표적화될 수 있다. 세포 구획에 대한 표적화를 지정하거나 결정하는 폴리펩티드 세그먼트의 부착에 의해서 결빙방지 세그먼트가 특정 세포 소기관에 표적화될 수 있다. 이 펩티드는 소기관에 대해 지정될 뿐만 아니라, 다른 폴리펩티드 세그먼트로 둘러싸여 있을 때도 결빙방지 기능을 유지할 수 있다. 결합시 세포 특이성을 갖는 항체나 다른 분자와의 융합에 의해서 결빙에 따른 세포 손상에 대한 저항성이 이들 세포 타입에 부여될 수 있다. 이 기술은 또한 장기에도 사용될 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드가 결합될 수 있는 폴리펩티드의 예가 아래에 나열된다:
Figure pct00015
따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용하여 재조합 숙주에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현시키고, 발현된 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 융합 폴리펩티드의 한 가지 타입은 재조합 숙주 세포로부터 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인도하는 펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포의 분비 경로로 이끌기 위해서 적합한 발현 벡터에 분비 신호 서열(신호 펩티드, 리더 서열, 프레프로 서열 또는 프레 서열이라고도 한다)이 제공된다. 분비 신호 서열은 본 발명에 따른 폴리펩티드로부터 유래될 수도 있고, 적합한 신호 서열은 다른 분비된 폴리펩티드나 새로 합성된 폴리펩티드로부터 유래될 수도 있다. 분비 신호 서열은 두 서열이 정확한 리딩 프레임 내에서 이어져 위치됨으로써 새로 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 이끌도록 본 발명에 따른 서열을 암호화하는 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 분비 신호 서열은 일반적으로 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치되지만, 어떤 분비 신호 서열은 관심의 뉴클레오티드 서열 내의 다른 곳에 위치될 수도 있다(예를 들어, Welch et al. U. S. Pat. No. 5,037,743; Holland et al. U. S. Pat. No. 5,143,830 참조).
본 발명에 따른 유전자의 분비 신호 서열, 또는 포유류 세포에 의해 생산된 다른 폴리펩티드(예를 들어, 조직-타입 플라스미노겐 활성인자 신호 서열, 예를 들어 U. S. Pat. No. 5,641,655에 설명됨)는 재조합 포유류 숙주에서 본 발명에 따른 유전자의 발현을 위해 유용하고, 효모 신호 서열은 효모 세포에서의 발현을 위해 바람직하다. 적합한 효모 신호 서열의 예는 효모 메이팅 페르몬 알파-인자(MF-알파1 유전자에 의해 암호화됨), 인베르타제(SUC2 유전자에 의해서 암호화됨), 또는 산 포스파타제(PHO5 유전자에 의해서 암호화됨)로부터 유래된 것들이다. 예를 들어, Romanos et al. "Expression of Cloned Genes in Yeast," DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2.sup.nd Edition, Glover and Hames (eds.) pages 123-167 (Oxford University Press 1995)를 참조한다.
박테리아 세포에서는 주로 독성을 감소시키고, 안정성을 증가시키고, 발현된 폴리펩티드의 회수율을 증진시키기 위해 융합 폴리펩티드로서 이종성 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명에 따른 유전자는 글루타티온-S-트랜스페라제 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 글루타티온-S-트랜스페라제 융합 폴리펩티드는 전형적으로 가용성이며, 고정된 글루타티온 칼럼에서 E. coli 세포용해물로부터 쉽게 정제될 수 있다. 유사한 접근법으로, 말토스 결합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드는 아밀로오스 수지 칼럼에서 분리될 수 있고, 말단 절단형 폴리펩티드 A 유전자의 C-말단부를 포함하는 융합 폴리펩티드는 IgG-Sepharose를 이용하여 정제될 수 있다. 박테리아 세포에서 융합 폴리펩티드로서 이종성 폴리펩티드를 발현시키기 위한 확립된 기술이, 예를 들어 Williams et al. "Expression of Foreign polypeptides in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Anti-bodies," DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2.sup.nd Edition, Glover and Hames (Eds.) pages 15-58 (Oxford University Press 1995)에 설명된다. 또한, 상업적으로 입수가능한 발현 시스템도 이용할 수 있다. 예를 들어, PINPOINT Xa 폴리펩티드 정제 시스템(Promega Corporation; Madison, Wis.)은 아비딘을 포함하는 수지와 함께 발현되는 동안 바이오틴화된 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다.
원핵 세포나 진핵 세포에 의해 발현된 이종성 폴리펩티드를 분리하는데 유용한 펩티드 택은 폴리히스티딘 택(이것은 니켈-킬레이트화 수지에 대해 친화성을 가진다), c-myc 택, 칼모듈린 결합 폴리펩티드(칼모듈린 친화성 크로마토그래피에 의해 분리된다), 섭스턴스 P, RYIRS 택(이것은 항-RYIRS 항체와 결합한다), Glu-Glu 택, 및 FLAG 택(이것은 항-FLAG 항체와 결합한다)을 포함한다. 예를 들어, Luo et al. Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996), 및 Zheng et al. Gene 186:55 (1997)를 참조한다. 이러한 펩티드 택을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 Sigma-Aldrich Corporation(St. Louis, Mo.) 등에서 입수할 수 있다.
융합 폴리펩티드의 또 다른 형태는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 2개의 불변영역 도메인과 힌지 영역을 함유하고 가변영역은 결여된 면역글로불린 중쇄 불변영역, 전형적으로는 Fc 영역을 포함한다. 예를 들어, Chang et al. U. S. Pat. No. 5,723,125는 인간 인터페론과 인간 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 설명한다. 인터페론의 C-말단은 펩티드 링커 부분에 의해 Fc 단편의 N-말단에 연결된다. 펩티드 링커의 예는 면역학적으로 불활성인 T 세포 불활성 서열을 주로 포함하는 펩티드이다. 전형적인 펩티드 링커는 아미노산 서열 GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ ID NO:91)를 가진다. 이 융합 폴리펩티드에서 바람직한 Fc 부분은 인간 감마4 사슬인데, 이것은 용액 중에서 안정하며, 보체 활성화 활성을 거의 아니면 전혀 갖지 않는다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 또는 그것의 단편과 인간 Fc 단편을 포함하며, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 또는 그것의 단편의 C-말단이 펩티드 링커를 통해 Fc 단편의 N-말단에 부착된 융합 폴리펩티드를 고찰한다.
또 다른 변형에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드는 IgG 서열을 더 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 부분이 IgG 서열의 아미노 말단에 공유 결합되고, 단일 펩티드가 본 발명에 따른 폴리펩티드 부분의 아미노 말단에 공유 결합되며, 이때 IgG 서열은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인의 순서로 이들 요소들로 구성되거나 포함한다. 따라서, IgG 서열은 CH1 도메인이 결여된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 부분은 얼음 결합 활성을 나타낸다. 항체와 비-항체 부분을 모두 포함하는 융합 폴리펩티드를 생산하기 위한 상기 일반적인 접근법은 LaRochelle et al. EP 742830(WO 95/21258)에서 설명되었다.
융합 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드의 각 성분을 제조하고 이들을 화학적으로 콘쥬케이션하는 당업자에게 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 또는 달리, 적합한 프레임 내에서 융합 폴리펩티드의 양 성분을 모두 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 공지된 기술을 이용하여 발생되고 본원에 설명된 방법에 의해 발현될 수 있다. 융합 폴리펩티드를 효소적 및 화학적 절단하는 일반적인 방법은, 예를 들어 Ausubel (1995) pages 1619-1625에 설명된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 및 그것의 단편의 제조를 위한 일반적인 방법
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드의 합성은 생물학적 형태 또는 합성 형태의 두 가지로 추구될 수 있다. 생물학적 방법은 폴리펩티드 코딩 서열 또는 유전자의 발현에 의한 것이고, 합성 방법은 폴리펩티드의 화학적 합성에 의한 것이다.
바람직한 합성 방법은 Merrifield(J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:2149-2156)에 의해서 개발된 것과 같은 고체상 펩티드 합성을 이용한다. 이 방법은 결빙방지 활성을 위한 특정 조성이나 배합을 시험하는데 특히 유용하다.
대규모 생산을 위해서는 생물학적 발현이 전형적으로 바람직하다. 코딩 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 재조합 변형을 가진 천연 유전자거나, 또는 적합한 발현 시스템에서 발현되는 총 합성 서열일 수 있다. 적합한 벡터에 천연 서열 세그먼트를 삽입하는데 이용되는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, Maniatis 또는 Wu et al. (1987) Methods in Enzymology, Vol. 153 Academic Press, New York, N. Y.을 참조한다.
합성 서열은 서열의 특정 마디를 제조하는 포스포라미다이트 화학을 사용하여 합성될 수 있다(Beaucage and Carruthers (1981) Tet. Letters, 22:1859-1862). 중첩 세그먼트가 합성된 다음, 함께 라이게이션되어 더 큰 유전자가 만들어질 수 있다.
마지막으로, 결빙방지 세그먼트의 특정 서열을 선택함으로써, 효소 절단 부위가 삽입될 수 있고, 이것은 함께 쉽게 연결되거나 삽입되어 탠덤 반복을 생성할 수 있는 편리한 세그먼트를 제공할 것이며, 이것은 당업자에게 자명할 것이다.
결빙방지 폴리펩티드의 정제는 당업자에게 공지된 폴리펩티드의 정제 방법에 의해 이루어진다. 표준 정제 기술은 세포 용해물 또는 폴리펩티드가 분비된 경우에는 배양 배지에서 시작할 수 있다. 전형적인 방법은 칼럼 크로마토그래피, 황산암모늄 염 침전, 항체 친화성 칼럼 크로마토그래피 등이다. 자연발생 폴리펩티드(예를 들어, 어류에서 생산된)에 대한 바람직한 정제 방법은 Vries et al. (1977) Biochem Biophys. Acta 495:388-392에 설명된 것이다.
바람직하게, 결빙방지 폴리펩티드는 실질적인 상동성까지 정제되며, 일반적으로 적어도 약 70% 내지 80% 순도, 바람직하게는 약 90-95% 순도, 가장 바람직하게는 99% 이상의 순도이다. 전형적으로, 폴리펩티드는 자연적으로 관련된 오염 어류 화합물을 실질적으로 함유하지 않는다.
전-길이 폴리펩티드, 기능적 단편 및 융합 폴리펩티드를 포함해서 본 발명의 폴리펩티드가 종래 기술에 따라서 재조합 숙주 세포에서 유리하게 생산될 수 있다는 것이 상기 내용으로부터 분명하다.
본 발명에 따른 유전자의 발현을 위해, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자는 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 다음, 숙주 세포에 도입되어야 한다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열에 더하여, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 지닌 세포의 선택을 위해 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
진핵 세포에서 외래 폴리펩티드를 생산하는데 적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하기 위한 박테리아 복제 기원과 항생제 내성 마커를 코딩하는 원핵 DNA 요소; (2) 프로모터와 같은 전사의 개시를 제어하는 진핵 DNA 요소; 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사체의 가공을 제어하는 DNA 요소를 함유한다.
상기 논의된 대로, 발현 벡터는 또한 이종성 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 이끄는 분비 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 본 발명에 따른 유전자와 상기 유전자 또는 다른 분비된 유전자로부터 유래된 분비 서열을 포함할 수 있다.
박테리아와 함께 통상 사용되는 벡터의 예는 pET 시리즈(Novagen), pGEX 시리즈(Ge Healthcare), pBAD 시리즈(Invitrogen)를 포함한다. 효모에서 벡터의 예는 Pichia용 pPic 시리즈(Invitrogen), Kluyveromyces lactis로부터의 pKlac 시스템(New England biolabs), S. cereviseae 벡터(Patel O., Fearnley R., Macreadie I., 3002. 트롬빈-절단 N- 및 C-말단 6x(His) 택을 가진 Saccharomyces cerevisiae 발현 벡터. Biotechnol Lett. 2003 25(4):331-334) 및 S. cereviseae용 pYes 시스템(Invitrogen)이다.
진균에서 사용되는 벡터의 예는 pBAR 시리즈(Pall M. L. and J. Brunelli, 1993. 독특한 제한 부위를 가진 폴리링커를 함유하는 일련의 6개의 압축된 진균 형질전환 벡터. Fungal Genetics Newsletter 40:59-61에서 설명됨)이다. pIEx 플라스미드 기반 시스템(Merck) 또는 바큘로바이러스 기반 시스템(Merck)이 곤충 세포에서 유용한 시스템의 두 가지 예이다. 다른 회사들로부터도 유사한 제품을 이용할 수 있다.
곤충 세포에서 사용되는 벡터의 예는 아데노바이러스-기반 시스템 Adeno-X, 테트라시클린-조절 시스템 pTet과 pTre, 레트로바이러스-기반 시스템 Rethro-X(모두 Clontech) 및 pcDNA 벡터(Invitrogen)를 포함한다. 역시, 더 많은 예들이 존재하며, 시중에서 입수가능하다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 예는 아프리카 녹색원숭이 신장 세포(Vero; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장 세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개 신장 세포(MDCK; ATCC CCL 34), 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44[Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986]), 래트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 래트 간암종 세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-형질전환 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 뮤린 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다.
포유류 숙주에서, 전사 및 번역 조절 신호는 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 유인원 바이러스 등과 같은 바이러스 출처로부터 유래될 수 있으며, 조절 서열은 발현 수준이 높은 특정 유전자에 결합된다. 적합한 전사 및 번역 조절 서열도 액틴, 콜라겐, 미오신 및 메탈로티오네인 유전자와 같은 포유류 유전자로부터 얻어질 수 있다.
전사 조절 서열은 RNA 합성을 개시하도록 지시하는데 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(Hamer et al. J. Mol. Appl. Genet. 1:273 (1982)), 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31:355(1982)), SV40 조기 프로모터(Benoist et al. Nature 290:304 (1981)), Rous 육종 바이러스 프로모터(Gorman et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 79:6777(1982)), 시토메갈로바이러스 프로모터(Foecking et al. Gene 45: 101 (1980)) 및 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터를 포함한다(통상 Etcheverry, "Expression of Engineered polypeptides in Mammalian Cell Culture" polypeptide Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.) pages 163-81(John Wiley & Sons, Inc. 1996) 참조).
또는 달리, 원핵 프로모터가 진핵 프로모터에 의해 조절되는 경우, 박테리오파지 T3 RNA 중합효소 프로모터와 같은 원핵 프로모터를 사용하여 포유류 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있다(Zhou et al. Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990), and Kaufman et al. Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).
발현 벡터는 인산칼슘 트랜스펙션, 리포솜-매개 트랜스펙션, 마이크로프로젝타일-매개 송달, 전기천공 등을 포함하는 다양한 표준 기술에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 트랜스펙션된 세포가 선택되고 증식되어 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합된 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공할 수 있다.
진핵 세포에 벡터를 도입하는 기술과 우성 선택성 마커를 이용해 이러한 안정한 형질전환체를 선택하는 기술은, 예를 들어 Ausubel (1995) 및 Murray((ed.) Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991))에 의해 설명된다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자는 고등 진핵 세포, 예를 들어 조류, 진균, 곤충, 효모, 및 식물 세포에서 발현될 수 있다.
예를 들어, 한 적합한 선택성 마커는 항생제 네오마이신에 대한 내성을 제공하는 유전자이다. 이 경우, 네오마이신-타입 약물, 예를 들어 G-418 등의 존재하에 선택이 수행된다. 또한, 선택 시스템을 사용하여 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있는데, 이 과정을 "증폭"이라고 한다. 증폭은 낮은 수준의 선택제의 존재하에 트랜스펙션체를 배양한 다음, 선택제 양을 증가시켜 도입된 유전자의 산물을 높은 수준으로 생산하는 세포를 선택함으로써 수행된다.
적합한 증폭 선택성 마커는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 디히드로폴레이트 환원효소이다. 다른 약물 내성 유전자(예를 들어, 히그로마이신 내성, 다중-약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제)들도 또한 사용될 수 있다. 또는 달리, 변경된 표현형을 도입하는 마커, 예를 들어 녹색 형광 폴리펩티드, 또는 세포 표면 폴리펩티드, 예를 들어 CD4, CD8, I형 MHC, 태반 알칼리성 포스파타제를 사용하여 FACS 소팅이나 자기 비드 분리 기술과 같은 수단에 의해 트랜스펙션되지 않은 세포로부터 트랜스펙션된 세포를 가려낼 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 바이러스 송달 시스템을 사용하여 배양된 포유류 세포에 의해 생산될 수 있다. 이 목적을 위한 전형적인 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시나 바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다. 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 현재 이종성 폴리펩티드의 송달을 위한 가장 잘 연구된 유전자 전달 벡터이다(Becker et al. Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), 및 Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997) 참조). 아데노바이러스 시스템의 이점은 상대적으로 큰 DNA 삽입체의 수용, 높은 역가까지 성장하는 능력, 광범한 포유류 세포 타입을 감염시키는 능력, 및 상이한 프로모터를 함유하는 다수의 이용가능한 벡터와 함께 사용될 수 있는 유연성을 포함한다.
아데노바이러스 게놈의 일부를 결실시키면 이종성 DNA의 더 큰 삽입체(최대 7 kb)가 수용될 수 있다. 이들 삽입체는 직접 라이게이션이나 공-트랜스펙션 플라스미드와의 상동성 재조합에 의해 편입될 수 있다. 한 선택사항은 바이러스 벡터로부터 필수 E1 유전자를 결실시키는 것인데, 이로써 숙주 세포에 의해서 E1 유전자가 제공되지 않는다면 복제가 불가능하게 된다. 아데노바이러스 벡터-감염 인간 293 세포(ATCC Nos. CRL-1573, 45504, 45505)는, 예를 들어 유착성 세포로서 또는 현탁 배양물 중에서 비교적 높은 세포 밀도로 성장되어 상당량의 폴리펩티드를 생산할 수 있다(Gamier et al. Cytotechnol. 15:145 (1994) 참조).
트랜스젠 생물을 생성하는 방법들이 본 분야에 알려져 있으며, 표 3을 참조한다:
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바쿨로바이러스 시스템은 곤충 세포에 본 발명에 따른 클로닝된 유전자를 도입하는 효과적인 수단을 제공한다. 적합한 발현 벡터는 오토그래파 캘리포니아 다중 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV)에 기초한 것이며, 초파리 열충격 폴리펩티드(hsp) 70 프로모터, 오토그래파 캘리포니아 핵 폴리헤드로시스 바이러스 즉각-조기 유전자 프로모터(ie-1) 및 지연 조기 39K 프로모터, 바쿨로바이러스 p10 프로모터, 및 초파리 메탈로티오네인 프로모터를 함유한다.
재조합 바쿨로바이러스를 제조하는 두 번째 방법은 Luckow(Luckow et al. J. Virol. 67:4566 (1993))에 의해 설명된 트랜스포존-기반 시스템을 이용한다. 전달 벡터를 이용한 이 시스템은 BAC-to-BAC 키트(Life Technologies, Rockville, Md.)로 판매된다. 이 시스템은 Tn7 트랜스포존을 함유하는 전달 벡터 PFASTBAC(Life Technologies)를 이용하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 "바크미드"라고 하는 더 큰 플라스미드로서 E. coli에 유지된 바쿨로바이러스로 이동시킨다. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning et al. J. Gen. Virol. 75:1551(1994) 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995) 참조.
이에 더하여, 전달 벡터는 본 발명에 따른 발현된 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에 있는 에피토프 택, 예를 들어 Glu-Glu 에피토프 택을 암호화하는 DNA와의 인-프레임 융합체를 포함할 수 있다(Grussenmeyer et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. 82:7952 (1985)). 본 분야에 공지된 기술을 사용하여 본 발명에 따른 유전자를 함유하는 전달 벡터가 E. coli에서 형질전환되고, 재조합 바쿨로바이러스의 징표인 단절된 lacZ 유전자를 함유하는 바크미드에 대해 스크리닝된다. 다음에, 재조합 바쿨로바이러스 게놈을 함유하는 바크미드 DNA가 통상의 기술을 사용하여 분리된다.
예시적인 PFASTBAC 벡터는 상당한 정도로 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리헤드린 프로모터가 제거되고, 바쿨로바이러스 감염시 조기 발현되는 바쿨로바이러스 염기성 폴리펩티드 프로모터(Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터라고도 한다)로 치환되는데, 이것은 분비된 폴리펩티드의 발현에 유리한 것으로 나타났다(예를 들어, Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning et al. J. Gen. Virol. 75:1551(1994) 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995) 참조). 이러한 전달 벡터 구성물에는 짧은 버전이나 긴 버전의 염기성 폴리펩티드 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 자생 분비 신호 서열을 곤충 폴리펩티드로부터 유래된 분비 신호 서열로 치환한 전달 벡터가 구성될 수 있다. 예를 들어, 엑디스테로이드 글루코실트랜스페라제(EGT), 꿀벌 멜리틴(Invitrogen Corporation; Carlsbad, Calif.) 또는 바쿨로바이러스 gp67 (PharMingen: San Diego, Calif.)로부터의 분비 신호 서열을 구성물에 사용하여 자생 분비 신호 서열을 치환할 수 있다.
재조합 바이러스나 바크미드는 숙주 세포의 트랜스펙션에 사용된다. 적합한 곤충 숙주 세포는 IPLB-Sf-21 유래 셀라인, Spodoptera frugiperda 번데기 난소 셀라인, 예를 들어 Sf9(ATCC CRL 1711), Sf21 AE, 및 Sf21(Invitrogen Corporation; San Diego, Calif.), 그리고 초파리 Schneider-2 세포, 및 Trichoplusia ni로부터 유래된 HIGH FIVEO 셀라인(U. S. Pat. No. 5,300,435)을 포함한다. 상업적으로 입수가능한 혈청 무함유 배지를 사용하여 세포를 성장시키고 유지할 수 있다. 적합한 배지는 Sf9 세포는 Sf900 II™(Life Technologies) 또는 ESF 921™(Expression Systems)이고, T. ni 세포는 Ex-cellO405™(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.) 또는 Express FiveO™(Life Technologies)이다. 재조합 바이러스가 사용될 때, 세포는 전형적으로 약 2-5x105 세포의 접종 밀도에서 1-2x106 세포의 밀도까지 성장되고, 이 시점에서 재조합 바이러스 스톡이 0.1-10, 더 전형적으로는 거의 3의 감염 다중도(MOI)로 첨가된다.
바큘로바이러스 시스템에서 재조합 폴리펩티드를 생산하는 확립된 기술이 Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors," in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), pages 147-168(The Humana Press, Inc 1991), Patel et al. "The baculovirus expression system," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 205-244 (Oxford University Press 1995), Ausubel (1995), pages 16-37 to 16 57, Richardson (ed.) Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), 및 Lucknow "Insect Cell Expression Technology" Polypeptide Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.) pages 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)에 의해 제공된다.
또한, 효모 세포를 비롯한 진균 세포를 사용하여 본원에 설명된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여 흥미로운 효모 종들은 Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, 및 Pichia methanolica를 포함한다. 효모에서의 발현을 위한 적합한 프로모터는 GAL1(갈락토오스), PGK(포스포글리세라이트 키나제), ADH(알코올 탈수소효소), AOX1(알코올 옥시다제), HIS4(히스티디놀 탈수소효소) 등으로부터의 프로모터를 포함한다. 많은 효모 클로닝 벡터가 설계되어 있으며, 쉽게 입수할 수 있다. 이들 벡터는 Y1p-기반 벡터, 예를 들어 Y1p5, YRp 벡터, 예를 들어 YRp17, YEp 벡터, 예를 들어 YEp13 그리고 YCp 벡터, 예를 들어 YCp19를 포함한다. 외인성 DNA로 S. cerevisiae 세포를 형질전환하여 그로부터 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법이, 예를 들어 Kawasaki, U. S. Pat. No. 4,599,311, Kawasaki et al., U. S. Pat. 4,931,373, Brake, U. S. Pat. No. 4,870,008, Welch et al., U. S. Pat. No. 5,037,743, 및 Murray et al., U. S. Pat. No. 4,845,075에 개시된다. 형질전환된 세포는 선택성 마커에 의해 결정된 표현형에 따라서, 일반적으로 약물 내성 또는 특정 영양물(예를 들어, 로이신)의 부재하에 성장하는 능력에 따라서 선택된다. Saccharomyces cerevisiae에서 사용되는 적합한 벡터 시스템은 Kawasaki et al.(U. S. Pat. 4,931,373)에 의해서 개시된 POT1 벡터 시스템이며, 글루코오스-함유 배지에서의 성장되어 형질전환된 세포가 선택될 수 있다. 효모에서 사용되는 적합한 추가 프로모터와 터미네이터는 해당 효소 유전자(예를 들어, Kawasaki, U. S. Pat. No. 4,599,311, Kingsman et al., U.S. Pat. No. 4,615,974, 및 Bitter, U. S. Pat. No. 4,977,092) 및 알코올 탈수소효소 유전자로부터의 것들을 포함한다. U. S. Pat. No. 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936, 및 4,661,454를 또한 참조한다. 효모에서 사용하기 적합한 일반적으로 사용되고 및/또는 상업적으로 입수가능한 벡터의 다른 예는 pPic 시리즈(Invitrogen), Kluyveromyces lactis로부터의 pKlac 시스템(New England Biolabs) 그리고 S. cerevisae 벡터(Patel et al. Biotechnology letters, 2003, vol. 25(4):331-334)와 S. cerevisae용 pYes 시스템(Invitrogen)이다. 진균에서는 pBAR 시리즈가 유용하다(Pall et al. 1993, vol. 40:59-61, Functional Genetics Newsletter).
Hansenula polymorpha , Schizosaccharomyces pombe , Kluyveromyces lactis , Kluyveromyces fragilis , Ustilago maydis , Pichia pastoris , Pichia methanolica , Pichia guillermondii 및 Candida maltosa를 포함해서 다른 효모들의 형질전환 시스템도 본 분야에 알려져 있다. 예를 들어, Gleeson et al. J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) 및 Cregg, U.S. Pat. No. 4,882,279를 참조한다. Aspergillus 세포는 McKnight et al., U.S. Pat. No. 4,935,349의 방법에 따라서 이용될 수 있다. Acremonium chrysogenum 형질전환 방법은 Sumino et al., U.S. Pat. No. 5,162,228에 개시된다. Neurospora 형질전환 방법은 Lambowitz, U.S. Pat. No. 4,486,533에 개시된다.
예를 들어, 재조합 폴리펩티드의 생산을 위한 숙주로서 Pichia methanolica의 사용이 Raymond, U.S. Pat. No. 5,716,808, Raymond, U.S. Pat. No. 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14:11-23(1998), 국제공개 No. WO 97/17450, WO 97/17451 , WO 98/02536, 및 WO 98/02565에 개시된다. P. methanolica를 형질전환하는데 사용되는 DNA 분자는 통상 이중 가닥의 원형 플라스미드로 제조되며, 이것은 형질전환 전에 선형화될 수 있다. P. methanolica에서 폴리펩티드 생산을 위한 플라스미드 내의 프로모터와 터미네이터는 P. methanolica 유전자, 예를 들어 P. methanolica 알코올 이용 유전자((AUG1 또는 AUG2)의 것일 수 있다. 다른 유용한 프로모터들은 디히드록시아세톤 신타제(DHAS), 포르메이트 탈수소효소(FMD) 및 카탈라제(CAT) 유전자의 것들을 포함한다. 숙주 염색체로 DNA의 통합을 촉진하기 위해 플라스미드의 전체 발현 세그먼트의 양 말단 측면에 숙주 DNA 서열이 존재하는 것이 바람직하다. Pichia methanolica에서 사용되는 적합한 선택성 마커는 P. methanolica ADE2 유전자이며, 이것은 아데닌의 부재하에 ade2 숙주 세포를 성장시키는 포스포리보실-5-아미노아미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.21)를 암호화한다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모 산업 공정에서는 메탄올 이용 유전자(AUG1 및 AUG2)가 둘 모두 결실된 숙주 세포를 사용하는 것이 가능하다. 분비된 폴리펩티드의 생산을 위해서는 액포 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1)에 결함이 있는 숙주 세포가 사용될 수 있다. 전기천공을 사용하면 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드가 P. methanolica 세포에 도입되는 것이 촉진된다. P. methanolica 세포는 2.5 내지 4.5 kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm의 장 강도와 1-40 밀리세컨드, 가장 바람직하게는 약 20 밀리세컨드의 시간 상수(t)를 가진 지수 붕괴형 펄스식 전기장을 사용하는 전기천공에 의해 형질전환될 수 있다.
발현 벡터는 또한 식물 원형질체, 무손상 식물 조직 또는 분리된 식물 조직에 도입될 수 있다. 식물 조직에 발현 벡터를 도입하는 방법은 직접 감염 또는 식물 조직과 Agrobacterium tumefaciens의 동시-배양, 마이크로프로젝타일-매개 송달, DNA 주사, 전기천공 등을 포함한다. 예를 들어, Horsch et al., Science 227: 1229(1985), Klein et al. Biotechnology 10:268(1992), Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993)를 참조한다.
또는 달리, 본 발명에 따른 유전자는 원핵 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 원핵 숙주에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, T4, T3, Sp6 및 T7 중합효소를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, E. coli의 trp, recA, 열 충격, lacUV5, tac, Ipp-lacSpr, phoA, 및 lacZ 프로모터, B. subtilis의 프로모터, Bacillus의 박테리오파지의 프로모터, Streptomyces 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터는 Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), 및 Ausubel et al. (1995)에 의해 검토되었다.
적합한 원핵 숙주는 E. coli 및 Bacillus subtilus를 포함한다. 적합한 E. coli 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, 및 ER1647를 포함한다(예를 들어, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) 참조). 적합한 Bacillus subtilis 균주는 BR151, YB886, MM19, MM20, 및 B170를 포함한다(예를 들어, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985) 참조).
E. coli와 같은 박테리아에서 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현시킨 경우, 폴리펩티드는 세포질에 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유되거나, 또는 박테리아 분비 서열에 의해 원형질 주변 공간으로 보내질 수 있다. 전자의 경우, 세포를 용해하여 과립을 재회수한 다음, 예를 들어 구아니딘 이소티오시오네이트 또는 유레아를 사용하여 변성시킨다. 다음에, 변성제를 희석시켜서, 예를 들어 유레아 용액과 환원 산화 글루타티온의 조합에 대해 투석하여 변성된 폴리펩티드를 리폴딩하여 다이머화한 다음, 완충된 식염수 용액에 대해 투석한다. 후자의 경우, 세포를 파괴함으로써(예를 들어, 초음파 처리 또는 삼투 충격에 의해) 원형질 주변 공간의 내용물을 방출시키고, 폴리펩티드를 회수함으로써 가용성 기능적 형태로 원형질 주변 공간으로부터 폴리펩티드가 회수될 수 있으며, 이때는 변성과 리폴딩의 필요성이 생략된다.
원핵 숙주에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Williams et al., "Expression of foreign polypeptides in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 및 Georgiou, "Expression of polypeptides in Bacteria," Polypeptide Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) 참조).
박테리아, 효모, 곤충, 및 식물 세포에 발현 벡터를 도입하는 표준 방법은, 예를 들어 Ausubel (1995)에 의해 제공된다.
포유류 세포 시스템에 의해 생산된 외래 폴리펩티드의 발현 및 회수를 위한 일반적인 방법은, 예를 들어 Etcheverry, "Expression of Engineered polypeptides in Mammalian Cell Culture," Polypeptide Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)에 의해 제공된다. 박테리아 시스템에 의해 생산된 폴리펩티드를 회수하기 위한 표준 기술은, 예를 들어 Grisshammer et al., "Purification of over-produced polypeptides from E. coli cells," DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 59-92 (Oxford University Press 1995)에 제공된다. 바큘로바이러스 시스템으로부터 재조합 폴리펩티드를 분리하는 방법은 Richardson, (ed), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995)에 의해 설명된다.
대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드는 배타적 고체상 합성, 부분적 고체상 방법, 단편 축합 또는 고전적 용액 합성에 의해서 합성될 수 있다. 이들 합성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al. "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997) 및 Lloyd-Williams et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and polypeptides (CRC Press, Inc. 1997) 참조). 또한, "자생 화학적 라이게이션" 및 "발현된 폴리펩티드 라이게이션"과 같은 총 화학적 합성 전략의 변형들도 표준이다(예를 들어, Dawson et al. Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997), Muir et al, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95: 6705 (1998), 및 Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998) 참조).
본 발명은 본원에 설명된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 고찰한다. 이러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예는 물, 완충액, 알코올, 프로필렌글리콜, 마크로골, 참깨오일, 옥수수오일 등일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 분리
본 발명의 폴리펩티드는 오염 거대분자, 특히 다른 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 심지어 95% 초과 순도까지 정제될 수 있으며, 감염원과 발열원을 함유하지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 제약학적으로 순수한 상태, 즉 99.9%를 초과하는 순도까지 정제될 수 있다. 어떤 제제에서, 정제된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드를 실질적으로 함유하지 않는다.
단편화 및/또는 종래의 정제 방법을 사용하여 천연 출처에서 정제된 본 발명에 따른 폴리펩티드, 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드 및 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 제제를 얻을 수 있다. 일반적으로, 황산암모늄 침전 및 산 또는 챠오트로프 추출이 샘플을 분별하는데 사용될 수 있다. 전형적인 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기 배재, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적합한 크로마토그래피 매질은 유도체화된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 특제 실리카 등을 포함할 수 있다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하다. 전형적인 크로마토그래피 매질은 페닐기, 부틸기 또는 옥틸기에 의해 유도체화된 매질, 예를 들어 페닐-Sepharose FF(Pharmacia), Toyopearl 부틸 650(Toso Haas, Montgomeryville, Pa.), 옥토-Sepharose(Pharmacia) 등, 또는 폴리아크릴 수지, 예를 들어 Amberchrom CG 71(Toso Haas) 등을 포함한다. 적합한 고체 지지체는 유리 비드, 실리카-기재 수지, 셀룰로오스 수지, 아가로스 비드, 가교형 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 가교형 폴리아크릴아미드 수지 등을 포함하며, 이들은 사용 조건에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의해 폴리펩티드의 부착을 허용하는 반응기로 변형될 수 있다.
커플링 화학의 예는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체를 포함한다. 이들 및 다른 고체 매체들이 잘 공지되어 있으며, 본 분야에서 광범하게 사용되고, 상업적 공급자로부터 입수가능하다. 폴리펩티드 분리 및 정제를 위한 특정 방법의 선택은 루틴 설계의 문제이며, 선택된 지지체의 특성에 따라서 부분적으로 결정된다. 예를 들어, Affinity Chromatography: Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988), 및 Doonan, polypeptide Purification Protocols(The Humana Press 1996)를 참조한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 분리 및 정제에 있어서 추가의 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있다. 예를 들어, 아래 설명된 대로 얻어진 본 발명에 따른 폴리펩티드를 인식하는 특이적 항체 및 그것의 단편을 사용하여 면역친화성 정제에 의해 다량의 폴리펩티드를 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 특정한 특성을 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, 고정 금속 이온 흡착(IMAC) 크로마토그래피를 사용하여 폴리히스티딘 택을 포함하는 것들을 포함하여 히스티딘-부화 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 간단히 말해, 먼저 2가 금속 이온으로 겔을 하전시켜 킬레이트를 형성한다(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). 히스티딘-부화 폴리펩티드는 사용된 금속 이온에 따라서 상이한 친화성으로 이 바탕질에 흡착되고, 경쟁 용출, pH 저하, 또는 강한 킬레이트제의 사용에 의해 용출된다. 다른 정제 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 폴리펩티드의 정제를 포함한다(M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). 본 발명의 추가의 구체예에서, 관심의 폴리펩티드와 친화성 택(예를 들어, 말토스-결합 폴리펩티드, 면역글로불린 도메인)의 융합체를 구성하여 정제를 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 그것의 단편은 상기 설명된 대로 화학적 합성을 통해 제조될 수도 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 모노머 또는 멀티머; 글리코실화 또는 비-글리코실화; Peg화 또는 비 Peg화될 수 있고, 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체의 생산
본 발명에 따른 얼음 결합 폴리펩티드에 대한 항체, 또는 그것의 단편은, 예를 들어 적합한 숙주 생물에서 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 발현 벡터로부터 생산된 산물을 항원으로서 사용하거나, 또는 천연 출처로부터 분리되거나 어떤 종래의 고체상 합성 전략을 이용하여 합성된 본 발명에 따른 폴리펩티드를 사용하여 얻어질 수 있다. 특히 유용한 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 "특이적으로 결합한다". 항체는 항체가 다음의 두 가지 특성 중 적어도 하나를 나타낸다면 특이적으로 결합하는 것으로 고려되며, 두 가지 특성은 (1) 항체가 역치 수준의 결합 활성으로 본 발명에 따른 폴리펩티드와 결합하는 것과 (2) 항체가 하기 정의된 본 발명에 따른 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드와 유의하게 상호-반응하지 않는 것이다.
첫 번째 특성과 관련하여, 만일 항체가 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프와 106 M-1 이상, 바람직하게는 107 M-1 이상, 더 바람직하게는 108 M-1 이상, 가장 바람직하게는 109 M-1 이상의 결합 친화성(Ka)으로 결합한다면 항체는 특이적으로 결합한다. 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949))에 따라서 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 두 번째 특성과 관련하여, 예를 들어 만일 항체가 본 발명에 따른 폴리펩티드는 검출하지만 표준 웨스턴 블롯 분석에서 유사하거나 동일한 양으로 적용된 기지의 폴리펩티드는 검출하지 못한다면 항체는 관련된 폴리펩티드 분자와 유의하게 상호 반응하지 않는다.
항체는 본 발명에 따른 항원성 에피토프-보유 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용하여 생산될 수 있다. 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO:5 내지 12 중 어느 것에 함유된 아미노산을 적어도 4개, 또는 15개 내지 약 30개 함유한다. 그러나, 30개 내지 50개 아미노산을 함유하거나, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열을 포함해서 전체 아미노산 서열 이하의 어떤 길이를 함유하는, 본 발명의 아미노산 서열의 더 큰 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드도 역시 본 발명에 따른 폴리펩티드와 결합하는 항체를 유도하는데 유용하다. 에피토프-보유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매 중에서 실질적인 용해성을 제공하도록 선택되는 것이 바람직하다(즉, 서열이 상대적으로 친수성 잔기를 포함하고, 소수성 잔기는 피하는 것이 바람직하다). 또한, 프롤린 잔기를 함유하는 아미노산 서열도 항체 생산에 바람직할 수 있다.
예시로서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 내의 잠재 항원 부위는 Jameson-Wolf 방법을 이용하여 확인될 수 있으며, 이 방법은 LASERGENE(DNASTAR; Madison, Wis.)의 PROTEAN 프로그램(버전 3.14)에 의해 실행된다. 이 분석에서는 디폴트 파라미터가 사용된다.
Jameson-Wolf 방법은 6개의 메이저 서브루틴을 조합하여 폴리펩티드 구조를 예측함으로써 잠재적 항원 결정소를 예측한다. 간단히 말해, 먼저 Hopp-Woods 방법(Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981)을 사용하여 최대 국소 친수성을 가진 영역을 나타내는 아미노산 서열을 확인했다(파라미터: 평균 7개 잔기). 두 번째 단계에서, Emini 방법(Emini et al., J. Virology 55:836 (1985))을 사용하여 표면 확률을 계산했다(파라미터: 표면 결정 역치(0.6)=1). 세 번째, Karplus-Schultz 방법(Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985))을 사용하여 백본 사슬 유연성을 예측했다(파라미터: 유연성 역치(0.2)=1). 네 번째와 다섯 번째 분석 단계로, Chou-Fasman 방법(Chou, "Prediction of polypeptide Structural Classes from Amino Acid Composition," in Prediction of polypeptide Structure and the Principles of polypeptide Conformation, Fasman (ed.), pages 549-586 (Plenum Press 1990))과 Garnier-Robson 방법(Gamier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978)을 사용하여 데이터에 2차 구조 예측을 적용했다(Chou-Fasman 파라미터: 좌위표 = 64 폴리펩티드; .알파. 영역 역치 = 103; .베타. 영역 역치 = 105; Garnier-Robson 파라미터: .알파. 및 .베타. 결정 상수 = 0). 여섯 번째 서브루틴에서, 유연성 파라미터와 수치요법/용매 접근성 인자를 조합하여 표면 윤곽 값을 결정하고, 이것을 "항원 지수"로서 지정했다. 마지막으로, 피크 브로드닝 함수를 항원 지수에 적용하여, 내부 영역에 상대적인 표면 영역의 이동도로부터 유도된 추가 자유 에너지를 고려하여 각 피크 값의 20, 40, 60 또는 80%를 가중하여 주 표면 피크를 브로드화했다. 그러나, 이 계산은 나선 영역에 존재하는 어떤 주 피크에는 적용하지 않았는데, 나선 영역은 덜 유연한 경향이 있기 때문이다.
재조합 폴리펩티드 또는 천연 출처로부터 분리된 폴리펩티드에 대한 다클론성 항체가 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al. "Production of Polyclonal Antisera," Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992) 및 Williams et al. "Expression of foreign polypeptides in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)를 참조한다. 폴리펩티드의 면역원성은 알럼(수산화알루미늄) 또는 Freund 완전 또는 불완전 애쥬번트와 같은 애쥬번트의 사용을 통해 증가될 수 있다. 또한, 면역화에 유용한 폴리펩티드는 폴리펩티드의 일부분과 면역글로불린 폴리펩티드나 말토스 결합 폴리펩티드의 융합체와 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전-길이 분자 또는 그것의 일부분일 수 있다. 만일 폴리펩티드 일부분이 "헵텐-형"이라면, 이러한 부분은 거대분자 담체(예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍균 톡소이드)와 결합되거나 연결되는 것이 면역화를 위해 유리할 수 있다.
다클론성 항체는 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 토끼, 기니어피그, 염소 또는 양과 같은 동물에서 발생되지만, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체는 인간에 가까운 영장류의 항체로부터 유래할 수도 있다. 개코원숭이에서 진단상 및 치료상 유용한 항체를 발생시키기 위한 일반적인 기술을, 예를 들어 Goldenberg et al., 국제특허공개 No. WO 91/1 1465, 및 Losman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990)에서 찾을 수 있다.
또는 달리, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체가 생성될 수 있다. 특이적 항원에 대한 설치류 항체가 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해서 얻어질 수 있다(예를 들어, Kohler et al. Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (eds.) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)["Coligan"], Picksley et al. "Production of monoclonal antibodies against polypeptides expressed in E. coli" DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds) page 93 (Oxford University Press 1995) 참조).
간단히 말해서, 마우스에 유전자 산물을 포함하는 조성물을 주사하고, 혈청 샘플을 취하여 항체 생산의 존재를 검증하고, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻고, B-림프구와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 얻고, 이 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리함으로써 단클론성 항체가 얻어질 수 있다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체는 인간 단클론성 항체로부터 유래될 수 있다. 인간 단클론성 항체는 항원 시험감염에 반응하여 특이적 인간 항체를 생산하도록 조작된 트랜스젠 마우스로부터 얻어진다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소가 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 표적화하여 파괴한 배아줄기 셀라인으로부터 유래된 마우스의 균주에 도입된다. 이 트랜스젠 마우스는 인간 항원에 대해 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 이 마우스를 사용하여 인간 항체-분비 하이브리도마를 생산할 수 있다. 트랜스젠 마우스로부터 인간 항체를 획득하는 방법은, 예를 들어 Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), 및 Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)에 설명된다.
단클론성 항체는 다양한 잘 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술은 폴리펩티드 A-Sepharose 친화성 크로마토그래피, 크기-배재 크로마토그래피, 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다(예를 들어, Coligan, pages 2.7.1 2.7.12 및 pages 2.9.1 2.9.3; Baines et al. "Purification of Immunoglobulin G(IgG)," Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조).
특정 용도를 위해서, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체의 단편을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체 단편은, 예를 들어 항체의 단백질 가수분해에 의해 얻어질 수 있다. 항체 단편은 종래의 방법에 의한 전 항체의 펩신 또는 파파인 효소분해에 의해 얻어질 수 있다. 예시로서, 항체 단편은 항체를 펩신으로 효소 절단하여 5S 단편을 산출함으로써 생산될 수 있고, 이것은 F(ab')2로 표시된다. 이 단편을 티올 환원제를 사용하여 더 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 산출할 수 있다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단으로 인해 생긴 술프히드릴기에 대한 봉쇄기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로서, 펩신을 이용한 효소 절단은 2개의 1가 Fab 단편과 Fc 단편을 직접 산출한다. 이들 방법은, 예를 들어 Goldenberg, U.S. Pat. No. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al. 및 Coligan, 모두 Methods in Enzymology Vol. 1, (Academic Press 1967)에 설명된다.
단편이 완전한 항체에 의해 인식되는 항원과 결합하는 한, 중쇄를 분리하여 1가 경쇄 단편을 형성한 다음, 단편을 절단하는 것과 같은 다른 항체 절단 방법이나, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술이 또한 사용될 수 있다.
예를 들어, Fv 단편은 VH와 VL 사슬의 결합을 포함한다. 이 결합은 Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972)에 설명된 대로 비-공유일 수 있다. 또는 달리, 가변 사슬이 분자간 이황화 결합에 의해 연결되거나, 또는 글루타르알데히드와 같은 화학물질에 의해서 가교될 수 있다(예를 들어, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992) 참조).
Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함할 수 있다. 이들 단일 사슬 항원 결합 폴리펩티드(scFv)는 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH와 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조적 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조적 유전자가 발현 벡터에 삽입되고, 이것이 계속해서 E. coli와 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 V 도메인을 가교로 잇는 링커 펩티드를 가진 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. scFv를 생산하는 방법은, 예를 들어 Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991)에서 설명된다(또, Bird et al. Science 242:423 (1988), Ladner et al. U.S. Pat. No. 4,946,778, Pack et al. Bio/Technology 11:1271 (1993), 및 Sandhu(상동)을 참조한다).
예시로서, scFV는 시험관내에서 림프구를 폴리펩티드에 노출시키고, 파지 내 항체 디스플레이 라이브러리 또는 유사한 벡터를 선택함으로써 얻어질 수 있다(예를 들어, 고정된 또는 표지된 폴리펩티드 또는 펩티드의 사용을 통한). 잠재적 폴리펩티드 결합 도메인을 가진 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 파지(파지 디스플레이) 또는 박테리아, 예를 들어 E. coli 상에 출현된 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 무작위 돌연변이유발 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성에 의한 것과 같은 여러 가지 방식으로 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 리간드 또는 리셉터, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질과 같은, 폴리펩티드나 폴리펩티드일 수 있는 기지의 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 만들고 스크리닝하는 기술은 알려져 있고(Ladner et al. U.S. Pat. No. 5,223,409, Ladner et al. U.S. Pat. No. 4,946,778, Ladner et al. U.S. Pat. No. 5,403,484, Ladner et al. U.S. Pat. No. 5,571 ,698, 및 Kay et al., Phage Display of Peptides and polypeptides (Academic Press, Inc. 1996)), 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리와 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 키트는 상업적으로, 예를 들어 CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc.(San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc.(Beverly, Mass.), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway, N. J.)로부터 입수할 수 있다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 본원에 개시된 서열을 사용하여 스크리닝하여 결합된 폴리펩티드를 확인할 수 있다.
다른 형태의 항체 단편은 단일 상보성 결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드("최소 인식 단위")는 관심의 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는, 예를 들어 중합효소 연쇄반응을 사용하여 항체-생산 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성함으로써 제조된다(예를 들어, Larrick et al. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 및 Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-?ss, Inc. 1995) 참조).
또는 달리, 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체는 "인간화된" 단클론성 항체로부터 유래할 수 있다. 인간화된 단클론성 항체는 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터의 마우스 상보성 결정 영역을 인간 가변 도메인으로 전달함으로써 생산된다. 다음에, 인간 항체의 전형적인 잔기를 뮤린 카운터파트의 프레임워크 영역 내에서 치환한다. 인간화된 단클론성 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용으로 인해 뮤린 불변영역의 면역원성과 관련된 잠재적 문제가 제거된다. 뮤린 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하는 일반적인 기술은, 예를 들어 Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)에 설명된다. 인간화된 단클론성 항체를 생산하는 기술은, 예를 들어 Jones et al., Nature 321:522 (1986), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer et al. J. Immun. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.) Antibody Engineering Protocols(Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in polypeptide Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 및 Queen et al., U.S. Pat. No. 5,693,762 (1997)에 설명된다.
다클론성 항-이디오타입 항체는 표준 기술을 사용하여 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992)를 참조한다. 또, Coligan, pages 241-247를 참조한다. 또는 달리, 단클론성 항-이디오타입 항체는 상기 설명된 기술에 의해 면역원으로서 본 발명에 따른 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 항체 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 대안으로서, 인간화된 항-이디오타입 항체 또는 인간과 가까운 영장류의 항-이디오타입 항체가 상기 설명된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 항-이디오타입 항체를 생산하는 방법은, 예를 들어 Irie, U. S. Pat. No. 5,208,146, Greene, et. al., U. S. Pat. No. 5,637,677, 및 Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996)에 설명된다.
숙주 세포 및 관련 용도
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함할 수 있는 숙주 세포는, 예를 들어 동물 세포, 포유류 숙주 세포, 곤충 세포, 어류 세포, 진균 세포, 효모 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포에 의해 예시될 수 있다.
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 코딩하는 천연 또는 합성 핵산 단편이 궁극적인 표적 발현 세포에의 도입 및/또는 발현이 가능한 폴리뉴클레오티드 구성물에 편입된다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 구성물은 효모나 박테리아와 같은 단세포 또는 다세포 숙주에서의 복제에 적합하지만, 배양된 포유류나 다른 진핵 셀라인, 특히 식물의 게놈 내로의 도입 및 통합이 의도될 수도 있으며, 박테리아나 효모에 도입하기 위해 제조된 폴리뉴클레오티드 구성물은 숙주에 의해 인식되는 복제 시스템, 바람직한 결빙방지 폴리펩티드 산물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편, 결빙방지 폴리펩티드 암호화 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 단부에 결합된 전사 및 번역 개시 조절 서열, 및 이 서열의 3 단부에 결합된 전사 및 번역 종결 조절 서열을 포함할 것이다. 전사 조절 서열은 숙주에 의해 인식되는 이종성 프로모터를 포함할 것이다. 편의상, 결빙방지 폴리펩티드 암호화 서열의 삽입 부위와 함께 복제 시스템과 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 이용가능한 발현 벡터가 사용될 수 있다.
유전자는 결빙방지 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 어떤 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포함할 것이다. 일반적으로, 유전자는 코딩 서열에 더하여 상류 및 하류 결합 서열, 특히 어떤 인핸서, 프로모터, 리보솜 결합 부위 또는 번역 개시 마커를 포함할 것이다. 또한, 하류 세그먼트가 메시지 폴리아데닐화와 프로세싱에서 중요할 수 있으며, 이로써 또한 일반적 예에서 고찰된다.
발현을 위한 세포 또는 세포군에 유전자를 도입하는 것은 관심의 샘플에 폴리펩티드를 일반적으로 도입하기 위한 또 다른 방법이다. 또한, 최종 형질전환 산물도 본 발명의 산물로서 포함되며, 용어 "형질전환된 세포"는 형질전환된 실제 세포와 그 세포의 모든 자손을 포함할 것이다. 전형적인 경우, 최종 생물이 세포를 함유할 것이며, 각 세포는 유전자를 함유할 것이다. 표준 형질전환 과정이 박테리아(Maniatis), 진균(Sherman et al. (1986) Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics CSH), 식물(van den Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5:149-154) 및 동물(Hanahan, (1988) Ann. Rev. Genetics, 22:479-519)에 대해 존재한다.
효모 및 진균 숙주 세포
본 발명에서 사용되는 적합한 효모 숙주세포의 비제한적 예는 Saccharomyces 및 Candida 속의 구성원을 포함해서 Saccharomycetaceae 과로부터의 효모를 포함한다. 바람직한 예는, 제한되지는 않지만, Saccharomyces fragilis , Saccharomyces cervisae, Saccharomyces lactis , Candida pseudotropicalis를 포함한다.
박테리아
박테리아 세포가 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생산을 위한 본 발명에 따른 숙주 세포로서 유용하다. 박테리아, 예를 들어 유산균뿐만 아니라 많은 효모와 곰팡이들이 치즈, 피클, 간장, 소금 절임 양배추, 식초, 와인 및 요구르트와 같은 발효 식품의 제조에 수 천년 동안 사용되어 왔다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 이러한 식품을 제조하는데 사용되는 미생물의 생육성을 유지하는데 뿐만 아니라, 동물의 사료 조성물 및 인간 소비용 식품을 포함해서 프레바이오 및 프로바이오 식용 조성물을 제조하는데 유용하다. 본 발명과 관련하여, 본 발명에 따른 숙주 세포로서 적합한 바람직한 박테리아의 예는, 예를 들어 Escherichia coli , Streptococcus cremoris , Streptococcus lactis , Streptococcus thermophilus , Leuconostoc citrovorum , Leuconostoc mesenteroides , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus lactis , Lactobacillus bulgaricus , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium breve , Lactobacillus delbrueckii ssp . bulgaricus , Streptococcus thermophilus , Lactobacillus acidophilus , Bifidobacteria , Lactobacillus casei , Lactobacillus rhamnosus , Lactobacillus , casei , 및Bifidobacterium Iongum이다.
또한, 생물학적 해충 통제 프로그램에서 구충제의 대용으로서 박테리아가 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 이러한 용도를 위해 특히 적합하며, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 숨긴 재조합 미생물을 제공하며, 이것은 환경 친화적 생물학적 구충제로서 사용될 수 있다. 한 예는 흙에서 사는 그람 양성 박테리아인 Bacillus thurmgiensis이다. 본 발명에 따라서 사용하기에 적합한 박테리아 숙주 세포의 추가의 비제한적 예는 그람 양성 박테리아 및 그람 음성 박테리아를 포함한다. 또한, 바람직한 박테리아 세포는 그람 양성 구균, 그람 양성 간상균, 그람 음성 구균 및 그람 음성 간상균으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따라서 사용하기에 적합한 박테리아 숙주 세포의 예는, 제한되지는 않지만, 다음 속에서 선택된 박테리아를 포함한다: 아카리코메스, 아세티토마쿨럼, 아세티비브리오, 아세토박터, 아세토박테리움, 아세토박테리오데스, 아세토할로비움, 아세토미크로비움, 아세토모나스, 아세토네마, 아크로모박터, 아시다미노박터, 아시다미노코쿠스, 아시디칼두스, 아시디미크로비움, 아시디필리움, 아시디티오바실루스, 아시도박테리움, 아시도칼두스, 아시도셀라, 아시도모나스, 아시도보락스, 아시네토박터, 아크로카르포스포라, 악티나시디필루스, 악티노아시디필루스, 악티노알로테이쿠스, 악티노바실루스, 악티노바쿨럼, 악티노비피다, 악티노비스포라, 악티노카네니스포라, 악티노코랄리아, 악티노키네오스포라, 악티노마두라, 악티노미세스, 악티노플라네스, 악티노폴리스포라, 악티노피크니디움, 악티노스피카, 악티노스포랑기움, 악티노스트렙토스포라, 악티노신네마, 악티노텔레아, 악티노텔루리아, 아드하에리박터, 아에쿠오리비타, 에어로박터, 에어로코쿠스, 에어로코쿠스-형 유기체, 에어로미크로비움, 에어로모나스, 아에스투아리박터, 아피피아, 아가박테리움, 아그레가티박터, 아지토코쿠스, 아그레이아, 아그로박테리움, 아그로코쿠스, 아그로모나스, 아그로미세스, 아렌시아, 알비도불럼, 알칼리지네스, 알카니보락스, 알기박터, 알기콜라, 알고리파구스, 알리시클리필루스, 알리시클로바실러스, 알리슈와넬라, 알리스티페스, 알칼리바실루스, 알칼리박터, 알칼리박테리움, 알칼리임니콜라, 알칼리스피릴럼, 알칸인디제스, 알리소넬라, 알로바쿨럼, 알로크로마티움, 알로푸스티스, 알테로모나스, 알리시엘라, 아미노박터, 아미노박테리움, 아미노모나스, 암모니펙스, 암모니필루스, 아모에보박터, 아모르포스포랑기움, 암필바실루스, 암풀라리엘라, 아미콜라타, 아미콜라톱시스, 언에어로아르쿠스, 언에어로박터, 언에어로바쿨럼, 언에어로비오스피릴럼, 언에어로브란카, 언에어로셀럼, 언에어로코쿠스, 언에어로필럼, 언에어로푸스티스, 언에어로리니아, 언에어로무사, 언에어로파가, 언에어로플라스마, 언에어로시너스, 언에어로스티페스, 언에어로트룬쿠스, 언에어로비브리오, 언에어로비르굴라, 언에어로보락스, 안칼로미크로비움, 안시클로박터, 안에우리니바실루스, 안지오코쿠스, 안굴로미크로비움, 안옥시바실루스, 안타르크토박터, 아쿠아박터, 아쿠아박테리움, 아쿠아미크로비움, 아쿠아스피릴럼, 아퀴셀라, 아퀴펙스, 아퀴플렉숨, 아퀴마리나, 아퀴모나스, 아르카노박테리움, 아르찬기움, 아르시셀라, 아르코박터, 아레니박터, 아르호도모나스, 아리조나, 아르세니시코쿠스, 아르세노포누스, 아르트로박터, 아사노아, 아시오스포랑기움, 아스티카카울리스, 아스트로스포랑기움, 아토포비움, 아토포코쿠스, 아토포스티페스, 아우란티모나스, 아우레오박테리움, 아비박테리움, 악소노포리스, 아조아르쿠스, 아조히드로모나스, 아조모나스, 아조르히조비움, 아조르히조필루스, 아조스피라, 아조스피릴럼, 아조토박터 바실루스, 박테리오보락스, 박테리움, 박테로이데스, 발네아리움, 발네아트릭스, 바르네시엘라, 바르토넬라, 브델로비브리오, 베기아토아, 베이제린키아, 벨리엘라, 벨나피아, 베넥케아, 베르게리엘라, 베타박테리움, 베우텐베르기아, 비피도박테리움, 빌로필라, 블라스토박터, 블라스토클로리스, 블라스토코쿠스, 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미크로모노스포라, 미크로폴리스포라, 미크로프루이나, 미크로실라, 미크로스트렙토스포라, 미크로테트라스포라, 미크로비르굴라, 밀리시아, 미마, 미츠오켈라, 모빌룬쿠스, 모데스토박터, 모엘레렐라, 모기박테리움, 모오렐라, 모락셀라, 모락셀라(브란하멜라), 모락셀라(모락셀라), 모르가넬라, 모리텔라, 뮤리카우다, 뮤리코쿠스, 미셀리제네란스, 미세토콜라, 미코박테리움, 미코플라나, 미로이데스, 믹소박터, 믹소코쿠스, 나카뮤렐라, 난노시스티스, 나트로니엘라, 나트로닌콜라, 나우틸리아, 낙시박터, 네이세리아, 네레이다. 네스테렌코니아, 네브스키아, 니콜레텔라, Nih Group 12, 니트라티프랙토르, 니트라티레덕토르, 니트라티럽토르, 니트로박터, 노카르디아, 노카르디오이데스, 노카르디옵시스, 노노무라에아, 노보스핑고비움, 오베숨박테리움, 오세아니불부스, 오세아니카울리스, 오세아니콜라, 오세아니모나스, 오세아니서무스, 오세아노바실루스, 오세아노박터, 오세아노모나스, 오세아노스피릴럼, 오크로박트럼, 옥타데카박터, 오돈토미세스, 오에노코쿠스, 오에르스코비아, 올레이필루스, 올레이스피라, 올리겔라, 올리고트로파, 올세넬라, 오피투투스, 오레니아, 오리박테리움, 오르니티니코쿠스, 오르니티니미크로비움, 오르니소박테리움, 오리지휴무스, 오토위아, 옥살리시박테리움, 옥살로박터, 옥살로파구스, 옥소박터, 파에니바실루스, 팔루디박터, 판도라에아, 판노니박터, 판토에아, 파필리박터, 파라박테로이데스, 파라코쿠스, 파라콜로박트럼, 파라락토바실루스, 파라리오바실루스, 파라스카르도비아, 파라스포로박테리움, 파르비바쿨럼, 파르비모나스, 파르보폴리스포라, 파스테우렐라, 파스테우리아, 파툴리박터, 파우시박터, 파우시모나스, 파우시살리바실루스, 펙티나투스, 펙토박테리움, 페디오코쿠스, 페도박터, 펠크자리아, 펠로박터, 펠로딕티온, 펠로모나스, 펠로시누스, 펠로스포라, 펠로토마쿨럼, 펩토코쿠스, 펩토니필루스, 펩토스트렙토코쿠스, 페레디박터, 페르세포넬라, 페르시시비르가, 페르시코박터, 페트리모나스, 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로세오바리우스, 로티아, 루브리테피다, 루브리비박스, 루브로박터, 루에게리아, 루미노박터, 루미노코쿠스, 루넬라, 사카리박터, 사카로코쿠스, 사카로모나스포라, 사카로파구스, 사카로폴리스포라, 사카로스릭스, 사기툴라, 살라나, 살레젠티박터, 살리니박터, 살리니박테리움, 살리니코쿠스, 살리니모나스, 살리니스포라, 살리니비브리오, 살리노스포라, 살리피거, 살모넬라, 스카르도비아, 슈레겔렐라, 슈와르트지아, 세베키아, 세디멘티박터, 세디멘티콜라, 세그닐리파루스, 세이노넬라, 세존기아, 셀레노모나스, 셀리베리아, 세리니코쿠스, 세라티아, 세와넬라, 시겔라, 시넬라, 슈트레워티아, 실라니모나스, 실비모나스, 시몬시엘라, 심플리시스피라, 심소니엘라, 시노코쿠스, 시노리조비움, 스케르마니아, 슬락키아, 스마라그디코쿠스, 스미셀라, 소달리스, 소엔게니아, 소랑기움, 스파에로박터, 스파에로포루스, 스파에로스포랑기움, 스파에로틸루스, 스핑고박테리움, 스핑고비움, 스핑고모나스, 스핑고픽시스, 스핑고시니셀라, 시피릴리플라네스, 스피릴로스포라, 스피릴럼, 스피로카에타, 스피로소마, 스포라세티게니움, 스포라나에로박터, 스포리크스야, 스포로박터, 스포로박테리움, 스포로시토파가, 스포로할로박터, 스포로락토바실루스, 스포로무사, 스포로사르시나, 스포로탈레아, 스포로토마쿨럼, 스탁게브란드티아, 스탈레야, 스타필로코쿠스, 스타피아, 스타르케야, 스텔라, 스테노트로포모나스, 스테롤리박테리움, 스티그마텔라, 스트렙타시디필루스, 스트렙티모노스포라, 스트렙토알로모르파, 스트렙토알로테이쿠스, 스트렙토바실루스, 스트렙토박테리움, 스트렙토코쿠스, 스트렙토모노스포라, 스트렙토미세스, 스트렙토미세토이데스, 스트렙토미코이데스, 스트렙토스포랑기움, 스트렙토베르티실리움, 서브돌리그라눌럼, 서브테르콜라, 숙시니클라스티쿰, 숙시니모나스, 숙시니스피라, 숙시니비브리오, 술피토박터, 술포바실루스, 술푸리쿠르붐, 술푸리히드로게니비움, 술푸리모나스, 술푸로스피릴럼, 수테렐라, 수토넬라, 신트로포박터, 신트로포보툴루스, 신트로포코쿠스, 신트로포모나스, 신트로포서무스, 신트로푸스, 타틀록키아, 타투멜라, 탁세오박터, 타일로렐라, 테이코코쿠스, 텔루리아, 테나시바쿨럼, 테피드언에어로박터, 테피디박터, 테피디미크로비움, 테피디모나스, 테피디필루스, 테라사키엘라, 테라박터, 테라코쿠스, 테리바실루스, 테리모나스, 테사라코쿠스, 테트라게노코쿠스, 테트라스파에라, 테트라티오박터, 탈라소바실루스, 탈라소박터, 탈라소비우스, 탈라소리투우스, 탈라소모나스, 탈라소스피라, 타우에라, 탁스테라, 서마세토게니움, 섬에어로박터, 섬언에어로모나스, 섬언에어로비브리오, 서미카누스, 서민콜라, 서미티오바실루스, 서모악티노미세스, 서모언에어로박터, 서모언에어로박테리움, 서모언에어로비움, 서모언에어롤리니아, 서모박테리움, 서모박테리오데스, 서모비피다, 서모비스포라, 서모브라키움, 서모크로마티움, 서모크리니스, 서모크리스퓸, 서모데술파타토르, 서모데술포박테리움, 서모데술포비움, 서모데술포르햅두스, 서모데술포비브리오, 서모플라비미크로비움, 서모히드로게니움, 서모리토박터, 서모미크로비움, 서모모나스, 서모모노스포라, 서모네마, 서모노스포라, 서모폴리스포라, 서모세디미니박터, 서모시쿨럼, 서모시누스, 서모시포, 서모신트로파, 서모토가, 서모베나불럼, 서모비브리오, 서모비르가, 서무스, 테티시아, 티알칼리미크로비움, 티알칼리비브리오, 티오알칼리미크로비움, 티오알칼리비브리오, 티오바카, 티오바실루스, 티오박터, 티오캡사, 티오코쿠스, 티오시스티스, 티오딕티온, 티오할로캡사, 티오람프로붐, 티오미크로스피라, 티오모나스, 티오페디아, 티오레덕토르, 티오로도코쿠스, 티오로도코쿠스, 티오로도비브리오, 티오스파에라, 티오스릭스, 토르셀리아, 틴달리아, 티시에렐라, 톨루모나스, 트라불시엘라, 트레포네마, 트리코코쿠스, 트리코토모스포라, 트루에페라, 츠카무렐라, 투베리바실루스, 투리셀라, 투리시박터, 미분류, 우레이바실루스, 우루부루엘라, 바고코쿠스, 바리바쿨럼, 바리오보락스, 베이로넬라, 베루코미크로비움, 베루코시스포라, 비브리오, 빅티발리스, 비르기바실루스, 비르기스포랑기움, 비트레오실라, 보게셀라, 볼카니엘라, 볼루크리박터, 불카니바실루스, 불카니서무스, 와크스마니아, 와우테르시아, 위크셀라, 웨이셀라, 윌리암시아, 월리넬라, 우드숄리레아, 크산토박터, 크산토모나스, 크세노필루스, 크세노랍두스, 크실라니박터, 크실라니박테리움, 크실라니미크로비움, 크실라니모나스, 크실렐라, 크실로필루스, 야니아, 예르시니아, 요케넬라, 자바르지니아, 지메르만넬라, 조벨리아, 주글로에아, 주시켈라, 지모박터, 지모박테리움, 지모모나스 및 지모필루스.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 식물
식물 숙주 세포 및 다른 트랜스젠 생물에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 사용은 기후 조건이 농작물의 생산에 최적조건이 아닐 때 귀중한 농작물의 손실을 방지할 수 있다. 특히, 본 발명은 현재의 식물과 농작물이 견딜 수 없는 기후 조건을 견딜 수 있는 새롭고 혁신적인 트랜스젠 식물과 농작을 제공한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고 폴리펩티드를 생산하는 본 발명에 따른 식물 숙주 세포 형태의 농작물의 예는 포도, 피마자와 같은 지방종자 식물, 곡물(귀리, 보리, 밀 등), 감귤류, 및 사탕수수이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 트랜스젠 과일과 야채류에 관한 것이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 트랜스젠 과일과 야채류는, 예를 들어 저장 및/또는 수송 도중에 저하된 온도를 견딜 수 있다. 예는 딸기, 블루베리, 라즈베리, 감귤류, 바나나, 포도, 키위, 파인애플, 서양자두, 체리, 토마토 및 망고를 포함한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 화초
본 발명에 따라서 고찰된 냉동 화초는, 예를 들어 튤립, 장미, 백합을 포함한다.
어류
본 발명에서 적합한 어류의 예들은 흰날개다랑어(Thunnus alalunga), 참치가자미(Atheresthes stomias), 대서양 대구(Gadus morhua), 대서양 갈치(Trichiurus lepturus), 대서양 연어(Salmo salar), 대서양 이리치(Anarhichas lupus), 블랙드럼(Pogonias cromis), 병치매가리(Parastromateus niger), 검은등 도다리(혀넙치, Pleuronectes americanus), 검정지느러미 상어(Carcharhinus limbatus), 메기 (lctalurus furcatus), 바다게(Callinectes sapidus), 청새치(Makaira nigricans), 볼락(Sebastes auriculatus), 복어(Sphoeroides annulatus), 쏨뱅이(Scorpaena guttata), 쉽헤드(Semicossyphus pulcher), 볼락(Sebastes pinniger), 스나이퍼 (Lutjanus purpureus), 메기(lctalurus punctatus), 볼락(Sebastes goodei , Sebastes nebulosus), 시누크(Oncorhynchus tshawytscha), 고등어(Scomber japonicus), 은연어(실버, 미디움 레드)(Oncorhynchus kisutch), 환도상어(Alopias vulpinus), 그루퍼(Epinephelus fulva), 쿠스크(BrosmeBrosme), 만새기(Coryphaena hippurus), 혀넙치(Microstomus pacificus), 혀넙치(Pleuronectes vetulus), 에스콜라(Lepidocybium flavobrunneum), 도리(Zeus faber), 망상어(Sebastes norvegicus), 스나이퍼(Lutjanus griseus), 혀넙치(가자미목)(Glyptocephalus cynoglossus), 바라쿠다(Sphyraena barracuda), 해덕(Melanogrammus aeglefinus), 참치(Euthynnus affinis), 스나이퍼(Lutjanus synagris), 링코드(Ophiodon elongatus), 밀크피쉬(Chanos chanos), 틸라피아(Tilapia mossambica), 나일 틸라피아(Tilapia nilotica), 퓨퍼(Sphoeroides maculatus), 타일피쉬(Caulolatilus princeps), 오일피쉬(Ruvettus pretiosus), 오렌지러피(Hoplostethus atlanticus), 바라쿠다(Sphyraena argentea), 가다랭이(Sarda chiliensis), 대구(알래스카 대구, Gadus macrocephalus), 잭(Caranx caninus), 잭(Selene peruviana), 망상어 (Sebastes alutus), 고등어(Scomber scombrus), 스패니쉬(Scomberomorus sierra), 스나이퍼(Lutjanus peru), 메로(Dissostichus eleginoides), 혀넙치(가자미목, Eopsettajordani), 곱사송어(Humpback)(Oncorhynchus gorbuscha), 대구(Pollachius virens), 볼락(Sebastes maliger), 무지개 송어(스틸헤드)(Oncorhynchus mykiss), 드럼(연어)(Sciaenops ocellatus), 포기(Chrysophrys auratus), 스나이퍼(Lutjanus campechanus), 볼락(Sebastes proriger), 혀넙치(가자미목, Errex zachirus), 볼락 (Sebastes aleutianus), 스쿨마스터(Lutjanus apodus), 쉽헤드(Archosargus probatocephalus), 마코상어(Isurus oxyrinchus), 스나이퍼(Lutjanus vivanus), 버터피쉬(Pampus argenteus), 볼락(Sebastes brevispinis), 가다랭이(Katsuwonus pelamis), 스파인풋(Siganus javus), 크로아커 또는 코비나(Roncador stearnsi), 가자미(Platichthys stellatus), 청새치(TetrapturusAudax), 바스(Morone chrysops x saxatilis), 황새치(Xiphias gladius), 잉어(Barbodes schwanefeldi), 대구(알래스카 대구, Theragra chalcogramma), 메를루사(Urophycis tenuis), 볼락(Sebastes entomelas), 가자미(Scophthalmus aquosus), 크로아커(옐로우피쉬, Pseudosciaena manchurica), 볼락(Sebastes ruberrimus), 참치(Thunnus albacares), 옐로우스트라이프 스카드(Selaroides leptolepis), 옐로우테일(Seriola lalandei), 가자미 (Limanda ferruginea), 볼락(Sebastes flavidus) 및 스나이퍼(Ocyurus chrysurus), 북극민물송어(Salvelinus alpinus), 넙치(Hippoglossus hippoglossus), 그린란드넙치 튜봇(Reinhartdius hippoglossoides)이다.
냉동 식품 및 식용품
냉동 야채를 포함하여 냉동 식품의 재결정화는 이러한 음식들의 맛과 질감을 나쁘게 한다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 사용하여 냉동 식품이나 냉동될 식품을 처리함으로써 재결정화를 방지할 수 있다. 본 발명으로 처리되는 식품의 예는, 제한되지는 않지만, 아이스크림, 냉동 요구르트, 수프, 푸딩, 셔벗, 아이스크림바, 냉동 디저트, 예를 들어 커스터드, 푸딩 등과 냉동되는 기타 액체 또는 반액체를 포함한다. 셀러리, 감자, 아스파라거스, 완두콩, 당근, 콩, 브로콜리, 사탕옥수수, 시금치, 강낭콩 등과 같은 냉동 야채도 본 발명에 포함된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 락토스 결정의 형성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 특정 이론에 결부되지는 않지만, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 락토스 결정의 결정화 및/또는 성장을 억제한다고 생각된다. 아이스크림을 얼리는 동안 모든 원료(락토스를 포함해서)의 함량은 감소하는 액체 물의 함량을 제외하고는 점진적으로 농축된다는 것이 잘 알려져 있다. 락토스의 함량이 어떤 수준에 도달하면 락토스 결정이 결정화되기 시작한다. 이 결정화는 느린 과정이며, -20℃에서 발생한다. 전형적으로 아이스크림은 약 -20℃에 보관된다. 그러나, 많은 경우 아이스크림은 안정한 일정 온도에서 저장되지 못하고, 온도가 -20℃ 근처에서 변동된다. 따라서, 온도가 -20℃보다 높은 시기 동안에 락토스의 결정은 성장하여 새로운 결정이 형성될 것이다. 결국, 아이스크림의 식감이 더 거칠게 되고, 많은 사람은 이런 식감을 불쾌하게 느낄 것이다. 이제 놀랍게도 본 발명에 따른 폴리펩티드가 아이스크림을 얼리기 전에 아이스크림에 첨가된 경우, 약 -20℃에 보관된 동안 락토스 결정의 형성을 현저하게 줄이고 새로운 결정의 형성을 현저히 방지한다는 것이 판명되었다. 결국, 저장된 아이스크림의 품질이 현저히 개선된다.
본 발명에 따른 냉동 식용품의 예는 아래 더 상세히 개시된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 냉동 발효 제품
냉동 또는 냉장 식품은 이제 현대 국가에서 인간의 식사의 중요한 부분이다. 따라서, 소비자를 위한 고품질의 제품을 확보하기 위해 광범한 연구가 식품 과학자들에 의해 수행되고 있다. 이것은 특히 냉동 야채와 아이스크림 및 요구르트와 같은 냉동 디저트에 관해 사실이다.
아이스크림이나 요구르트와 같은 냉동 디저트는 일반적으로 냉동 상태로 먹게 된다. 따라서, 냉동 제품의 질감뿐만 아니라 향미가 소비자에게 중요하다. 질감은 얼음 결정의 크기에 의해 크게 좌우된다. 이들 냉동 디저트의 생산자는 부드러운 질감의 제품을 확보하기 위해서 상당한 노력과 비용을 들이고 있다. 그러나, 냉동 보관하는 동안 얼음 결정이 성장하여 질감을 거칠게 하고 망칠 수 있다. 냉동 보관 동안의 얼음 결정의 성장은 재결정화로 알려져 있다. 이 문제는 특히 냉동 보관 조건이 덜 이상적일 경우, 예를 들어 수송 도중이나 현대적인 성에가 끼지 않는 가정용 냉동고에서 보관되는 동안에 특히 일반적이다. 0도 이상의 온도(즉, 0℃ 이상)에서 비교적 짧은 기간 후, 또는 냉동 온도가 지속된 후에도, 냉동 식품은 얼음 재결정화 과정으로 인해 인간 소비에 덜 바람직하거나 또는 심지어 부적합하게 될 수 있다.
냉동 발효 식품에 결빙방지 폴리펩티드를 혼입하는 이상적인 방법은 식품을 발효시키는 동안 발효 과정에서 결빙방지 폴리펩티드를 생산할 수 있는 생물을 사용하는 것이다.
따라서, 본 발명은 냉동 발효 식품을 제조하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비할 수 있는 미생물과 식품을 접촉시키는 단계, 이때 미생물은 식품을 발효시켜서 발효된 식품을 생산할 수 있다; (b) 발효가 일어나는 조건에서 미생물과 함께 식품을 인큐베이션함으로써 식품의 재결정화를 억제하기에 효과적인 양으로 결빙방지 폴리펩티드가 나타난 발효 식품을 생산하는 단계; 및 (c) -5℃ 이하의 온도에서 발효 식품을 냉동시켜서 냉동 발효 식품을 제조하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 식품은 발효되어 요구르트, 버터밀크 또는 치즈를 생산할 수 있는 유제품(예를 들어, 밀크)일 수 있다.
본 발명에서 미생물은 대개 박테리아(예를 들어, Lactobacillus bulgaricus ; Streptococcus cremoris , Streptococcus lactis ; Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium longum)이지만, 진균, 예를 들어 효모(예를 들어, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces lactis, 및 기타)일 수도 있다. 본 발명에 따라서, 이들 미생물이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비할 수 있도록 유전자 조작된다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 밀크를 발효시켜서 요구르트를 생산할 수 있고 결빙방지 폴리펩티드를 분비할 수 있는 박테리아 종들인 Lactobacillus balgaricus 및 Streptococcus lactis와 함께 밀크를 인큐베이션하는 단계; 요구르트가 생산되는 조건에서 박테리아와 밀크를 인큐베이션하는 단계; 및 -5℃ 이하의 온도에서 요구르트를 냉동시켜 냉동 요구르트를 제조하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 요구르트와 미생물을 포함하는 조성물을 제공하며, 이때 미생물은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 "발효"는 미생물의 사용을 통한 식품 중 탄수화물 또는 폴리펩티드의 화학적 전환을 말한다. 이 과정에서 탄수화물은 주로 락트산으로 전환된다.
본원에서 사용된 "발효 식품"은 미생물에 의한 발효를 포함하는 과정에 의해서 제조된 식용품을 말한다.
본원에서 사용된 "요구르트"는 미생물의 작용에 의한 밀크의 락트산 발효에 의해 생산된 유제품을 말한다.
본원에서 사용된 "재조합 생산된 폴리펩티드"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산된 폴리펩티드를 말한다. 재조합 DNA 기술은 잘 공지되어 있으며, 천연에서는 자연적으로 결합되지 않는 DNA의 적어도 두 세그먼트(예를 들어, 박테리아 프로모터와 폴리펩티드 코딩 서열)의 결합을 특징으로 한다.
기준 서열은 전-길이 자연발생 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열보다 더 짧을 수 있지만, 폴리펩티드의 경우 적어도 12개 잔기 길이이고 폴리뉴클레오티드의 경우 적어도 36개 염기 길이일 것이다.
또한, 본 발명은 식품을 발효시켜서 발효 식품을 생산할 수 있고, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비할 수 있는 미생물을 첨가함으로써 냉동 발효 식품을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비하고 식품을 발효시키는 미생물의 사용은 얼음 결정 형성과 냉동 온도에 영향을 미치기 위한 다른 방법들을 능가하는 몇 가지 장점을 가진다. 예를 들어, 청구된 방법은 식품에 첨가하기 전에 본 발명에 따른 폴리펩티드를 정제하는 비용의 필요성이 회피된다. 이에 더하여, 이것은 정제 프로토콜로 인한 어떤 가능한 오염 및 외래 미생물과 관련된 발열성을 제거할 것이다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드가 청구된 발명의 미생물을 발효시킴으로써 분비되므로, 이 과정은 다른 방법들에 비해 더 적은 단계를 필요로 한다.
본 발명의 식품은 일반적으로 밀크이지만, 발효되어 식용 발효 식품을 생산하는 다른 식품들도 사용될 수 있다. 예는 양배추(이것은 발효되어 소금 절임 양배추를 생산할 수 있다), 오이(이것은 발효되어 피클을 생산할 수 있다) 및 대두(이것은 발효되어 된장 및 기타 제품을 만들 수 있다)를 포함한다.
본 방법의 한 단계에서, 식품은 식품을 발효시킬 수 있는 미생물과 접촉되거나 혼합된다. 식품 발효에 유용한 미생물의 예는 잘 알려져 있다(예를 들어, van de Guchte, 1992, FEMS Microbiology Reviews, 88:73-92 참조).
바람직한 구체예에서, 식품은 밀크이다(예를 들어, 암소[즉, 소], 암양, 암말, 염소로부터). 밀크에 대한 발효 미생물, 전형적으로 박테리아의 작용은 선택된 박테리아 및 인큐베이션 조건에 따라서 요구르트, 버터밀크, 또는 어떤 치즈를 생산한다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 밀크로부터 요구르트를 생산할 수 있다. 요구르트는 전세계에서 여러 이름으로 칭해진다. 일반적인 다양한 요구르트에 대한 이름과 기원 국가가 아래 나열된다.
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요구르트 생산 방법은 Elsevier Applied Science, London-New York에서 출판된 1992년에 Nakazawa와 Hosono에 의해 편집된 Functions of Fermented Milk 32페이지에서 찾을 수 있으며, 이 책은 본원에 참고자료로 포함된다. 미국에서 요구르트는 암소로부터의 전유 또는 스킴 밀크로부터 생산된다. 밀크는 10.5-11.5% 고형분으로 표준화되고, 90℃ 이상으로 가열되어(30-60분) 어떤 오염 미생물을 파괴한 다음 냉각된다. 다음에, 이 재료에 Streptococcus thermophilus과 Lactobacillus bulgaricus의 1:1 비율의 혼합 배양물을 접종한다. 이들 두 유기물의 조합 작용은 제품에서 일반적으로 바람직한 향미와 산을 얻기 위해서 필요하다. 다른 예에서는 bulgarian bacteria , L. jugarti , L. acidophilus , Bifido bacterium, spp., 효모 및 락트산 진균을 포함하는 다른 고 발효 박테리아가 사용된다. 요구르트 제조를 위한 밀크의 발효에 사용되는 박테리아 및 다른 유기물의 예가 아래 나열된다.
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미생물은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비할 수 있도록 유전자 조작될 수 있다(즉, 재조합 DNA 기술을 사용하여).
이종성 폴리펩티드의 발현 및 분비를 위해 박테리아 및 진균을 조작하는 방법은 잘 확립되어 있다(예를 들어, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 (Academic Press, Inc., San Diego, Calif.); Simon et al., 1986, Appl. Environ. Microbiol. 52:394-395; 및 von Wright et a., 1985, Appl. Environ. Microbiol. 50:1 100-1 102 참조, 모두 본원에 참고자료로 포함된다).
AFP를 발현하고 분비할 수 있는 미생물의 생산은 다양한 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 당업자에게 자명할 것이다. AFP를 암호화하는 DNA 서열이 바람직하게는 미생물에서 DNA의 폴리펩티드로의 전사(RNA 전사체로)와 번역을 허용하는 오페론에 작동가능하게 연결된다(즉, 오페론의 기능을 확보하도록 위치된다). 박테리아와 진균에 대한 프로모터는 본 분야에 잘 알려져 있다. 락트산 박테리아에서 발현을 위한 바람직한 오페론은 S. thermophilus의 락토스 오페론 또는 L. lactic의 lac ABCDFEGX 오페론을 포함하며, 이들은 숙주에서 외래 유전자 발현을 유도하는데 성공적으로 사용되었다(예를 들어, Simons et al., 1993, J. Bact. 175:5186-5175; Mollet et al., 1993, J. Bact. 175:4315-4324 참조).
본 발명에 따른 폴리펩티드는 증가된 안정성 또는 다른 유리한 특성을 위해 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 변형에 의해 변형될 수 있다. 일반적으로, 유전자의 변형은 부위-지정 돌연변이유발과 같은 다양한 잘 공지된 기술에 의해 쉽게 달성될 수 있다(예를 들어, Gillman and Smith, 1979, Gene 8:81-97 및 Roberts et al., 1987, Nature 328:731-734 참조).
본 발명의 미생물은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 분비할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 바람직하게 신호 펩티드 서열에 연결될 것이다. 적합한 신호 펩티드 서열의 예는 L. lactis ssp lactis MG 1363의 usp45 유전자 및 L. lactis ssp cremoris SK11 세포 외피 관련 프로테아제 유전자로부터의 것들을 포함한다(van Asseldonk et al., 1990, Gene 95:155-160; De vos et al., 1989, J. Dairy Sci. 72:3398-3405). L. lactis와 같은 박테리아에 대해서는 동일한 숙주로부터 유래하는 usp45 신호 펩티드가 바람직하다. 한 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 유전자는 전사 종결 서열에 연결되며, 이로써 숙주 시스템에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 정확한 전사 종결이 보장된다.
상기 설명된 요소들을 포함하는 유전자 구성물은 벡터로서 pUC19, pNZ18 및 pDBN183와 같은 플라스미드를 사용하여 구성된다(Solaiman et al., 1992, Plasmid, 28:25-36). 유전자 구성물은 상동성 재조합 기술을 사용하여 락트산 박테리아 종들의 게놈에 편입된다(Mollet et al., 1993, J. Bact., 175:4315-4324). 락트산 박테리아 및 E. coli 균주는 Maniatis et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, supra; 및 Chagnand et al., 1992, Can. J. Microbiol. 38:67-74에서 추천된 대로 유지될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 미생물은 어떤 종래의 방식으로 식품에 적용될 수 있다. 밀크와 같은 제품의 경우, 박테리아 또는 진균이 발효되어 냉동되는 식품에 잘 혼합될 수 있다. 원하는 제품을 생산하기 위해서는 때로 상이한 미생물의 혼합물이 사용된다는 것이 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 요구르트의 제조에서는 S. thermophilus와 L. bulgaricus가 주로 함께 사용된다.
식품에 첨가되는 FAE 미생물의 수는 미생물 및 식품의 특성에 따를 것이다. 일반적으로, 락트산 FAE 출발물질 박테리아(1010-1011/mL)가 저온살균되고 냉각된 밀크 안에서 1-5%로 인큐베이션되고, 이로써 본 발명에 따른 폴리펩티드가 제품 내에서 적합한 양으로 증식된다. 제품 중 AFP 양은 얼음 재결정화를 방지하거나 억제하는데 효과적인 양이어야 한다(1-100 mg/L 밀크). 이것은 Knight et al. (1988) Cryobiology, vol. 25, pp. 55-60에 의한 판-냉각 분석에 의해 결정될 수 있다.
본 방법의 다른 단계에서, 발효된 식품이 송풍식 냉동고(-20 내지 40℃) 또는 접촉판식 냉동고(-300 내지 40℃) 또는 진공 냉동 건조기와 같은 종래의 냉동고 작업을 이용하여 냉동된다. 전술된 구체예의 많은 변형이 가능하다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 아이스크림
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 아이스크림 제품을 제공한다. 또한, 아이스크림 제품은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 함께 유화제 시스템을 포함할 수 있다. 이 유화제 시스템은 당업자에게 공지된 어떤 시스템일 수 있다. 그러나, US 2005/0163902 또는 WO 2008/064675에 설명된 것과 같은 프로판-1,2-디올의 모노 에스테르와 지방산을 포함하는 시스템이 특히 바람직하다.
하기 설명된 대로 제조된 아이스크림에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 아이스크림 제조 도중에 다른 원료들과 혼합되어, 정제된 폴리펩티드로서 첨가될 수 있거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드는 밀크 발효에 사용된 미생물로부터 분비된 결과물로서 존재할 수 있다.
본 발명에 따라서 아이스크림을 제조하는 한 방식은 다음과 같다.
제 1 단계로서, 식품 중간체가 상기 언급된 유화제 시스템과 접촉된다.
본원에서 사용된 용어 "식품 중간체"는 아이스크림을 제조하기 위한 적합한 원료들의 혼합물을 의미한다. 아이스크림 제조에 적합한 원료들은 물, 유지방 또는 식물지방과 같은 지방, 무지 유고형분(MSNF), 감미료, 안정제, 향료 및 색소를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 유고형분에 이미 존재하거나, 또는 별도의 원료로서 혼합물에 첨가될 수 있다.
바람직하게, 식품 중간체는 지방을 포함한다. 바람직하게, 지방은 고급 라우르산 지방이나 유지방이다. 용어 "고급 라우르산 지방"은 대부분의 지방산이 라우르산인 지방을 의미한다. 경화 야자오일 및 경화 코코넛오일과 같은 고급 라우르산 지방은 β' 안정하다. 따라서, 바람직하게 식품 중간체는 β' 안정한 지방을 포함한다.
제 1 접촉 단계 후, 선택된 원료들이 함께 혼합된다. 전형적으로, 액체 원료들이 먼저 함께 혼합되고, 건조 원료들이 이어서 첨가된다. 액체 원료들은 냉각되거나 약 60℃로 가열될 수 있다. 블렌딩에는 분말을 혼입시키기 위해 빠른 교반이 필요하며, 주로 고속 블렌더가 사용된다.
버터/버터오일이나 식물성 지방이 사용된 경우, 이상적으로는 개별적으로 녹여서 40℃에서 혼합물에 첨가되거나, 또는 도징 펌프를 사용하여 균질화기의 입구에서 고정 믹서에 의해 첨가되어야 한다.
이어서 혼합물이 저온살균되다. 저온살균은 저온세균과 같은 병원성 박테리아와 부패 유기물을 파괴하기 위해 수행된다. 저온살균에는 저온살균, 균질화 및 냉각의 3 가지 분리된 단계가 있다.
혼합물의 균질화는 발견된 지방구의 크기를 1μm 미만까지 파괴하거나 줄임으로써 지방 에멀젼을 형성하기 위해 수행된다.
저온살균은 연속 저온살균 또는 뱃치 저온살균에 의해 수행될 수 있다.
요즘 적용되는 가장 일반적인 저온살균 원리는 연속 저온살균인데, 이 경우 아이스크림 혼합물이 전형적으로 평판 열 교환기에서 80-90℃ 범위의 온도에서 최소 16초간 가열된다. 연속 저온살균은 일반적으로 대형 절연 공급 탱크에서 원료들을 블렌딩한 후 고온 단시간(HTST) 열 교환기에서 수행된다. 성분의 용해를 위해 30-40℃까지의 예열이 필요할 수도 있다. HTST 시스템은 가열 구간, 냉각 구간 및 재생 구간을 구비한다.
뱃치 저온살균은 오래된 방법인데, 이 경우 모든 혼합 원료들이 고온수 재킷이 장착된 큰 통에서 서서히 가열된다. 큰 통의 바닥과 측면의 오염을 피하기 위해 가열 과정은 혼합물과 가열 매체의 온도 차이(델타 T)를 작게 하여 느리게 진행되어야 한다. 델타 T가 작아야 하고, 혼합물 부피/통 표면의 비가 전형적으로 높기 때문에, 60℃의 온도로 혼합물을 가열하는데 몇 분 정도 걸리는 것은 불가피할 것이다. 통 표면으로부터 혼합물로의 열 전달을 개선하기 위해서 혼합물의 효과적인 교반이 필요하다. 뱃치 저온살균의 에너지 소비는 매우 높고, 연속 저온살균과는 달리 열 회수가 되지 않는다.
저온살균 후, 혼합물이 고압에 의해 균질화된다. 균질화는 전형적으로 약 80℃의 온도에서 일어나며, 균질화 압력은 65-75℃의 온도에서 90 bar(1300 psi) 내지 250 bar(3600 psi)의 범위일 수 있다. 뱃치 탱크는 일반적으로 직렬로 작동되고, 이로써 한 탱크가 홀딩되는 동안 다른 탱크에서는 제조가 이루어진다. 자동 타이머와 밸브를 사용하여 적합한 홀딩 시간이 충족될 수 있다.
균질화는 저온살균 전이나 후에 수행될 수 있다.
이어서 혼합물을 열 교환기(평판 또는 이중 또는 삼중 튜브)를 통과시킴으로써 혼합물이 냉장 온도(4℃)까지 냉각된다.
혼합물은 약 4℃인 숙성 온도까지 냉각된다. 다음에, 혼합물은 최소 4시간, 바람직하게는 하룻밤 동안 숙성된다. 이것은 지방의 결정화 및 폴리펩티드와 다당류의 완전한 수화를 허용하는 시간이다.
숙성 후, 혼합물은 향료 탱크로 보내질 수 있고, 여기서 어떤 액체 향료, 과일 퓨레, 또는 색소가 첨가된다. 다음에, 혼합물은 동적 냉동 과정으로 진입되어, 여기서 물의 일부가 냉동되고, 냉동된 혼합물에 공기가 휘핑된다. 냉동은 연속 냉동 과정 또는 뱃치 냉동/휘핑에 의해 수행될 수 있다.
연속 냉동은 배럴형 냉동고에서 수행될 수 있다. 배럴형 냉동고는 매끄러운 표면의 관형 열교환기이며, 암모니아나 프레온 같은 비등 냉각제의 재킷을 가진다. 약 30초 내지 3분 내에 혼합물이 배럴형 냉동고를 통과해 펌핑되어 다른 쪽 끝으로 보내진다. 뱃치 냉동고의 경우에는 이 과정에 10-15분이 걸린다. 혼합물이 다른 쪽 끝으로 보내졌을 때 그것의 물의 약 50%가 냉동된다. 배럴형 냉동고의 내부에는 회전 블레이드가 있어서 얼음을 냉동고의 표면으로부터 계속해서 긁어 모은다. 또한, 기계 내부에서 혼합물을 휘핑하여 공기를 혼입시키는 것을 돕는 교반기가 있다.
아이스크림은 상당량의 공기, 전형적으로는 최대 부피의 반의 공기를 함유한다. 이것은 제품에 특징적인 부드러움을 제공한다. 공기 함량은 오버런이라고 한다.
아이스크림이 물의 약 절반이 냉동된 상태로 되었을 때, 과일 조각, 견과 또는 쿠기와 같은 미립자 물질이 반-냉동 슬러리에 첨가될 수 있다. 다음에, 아이스크림이 포장되고, -30℃ 내지 -40℃에서 송풍식 냉동고에 보관되며, 여기서 나머지 물이 냉동된다.
경화는 송풍식 냉동고에서의 포장된 제품의 정적(정지, 정류) 냉동을 포함한다. 냉동 속도는 빠른 것이 이상적이며, 그래서 냉동 기술은 저온(-40℃)이 적용되는 증진된 대류(강제 공기 팬을 가진 냉동 터널) 또는 증진된 전도(평판 냉동고)를 포함한다.
종래의 경화 과정 대신에, 아이스크림은 아이스크림 냉동고로부터 저온 압출기(단일 또는 이중 스크류 압출기)로 펌핑될 수 있으며, 여기서 아이스크림의 온도가 -12 내지 -18℃까지 낮아진다. 충전 또는 압출 후, 아이스크림은 직접 저온 저장소로 옮겨질 수 있다.
경화된 아이스크림은 -25℃ 이하에서 보관되어야 한다. 약 -25℃ 이하에서는 아이스크림이 빠른 얼음 결정 성장의 위험 없이 장기간 동안 아주 안정하다.
이미 언급된 대로, 본 발명의 과정은 식품 중간체와 유화제 시스템을 접촉시키는 단계를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 이 과정은 물에 유화제 시스템을 용해시키는 단계를 포함한다. 이 구체예에서, 유화제 시스템이 물에 용해된 다음, 식품 중간체가 물과 접촉될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 이 과정은 지방에 유화제 시스템을 용해시키는 단계를 포함한다. 이 구체예에서, 유화제 시스템이 지방에 용해된 다음, 식품 중간체가 지방과 접촉될 수 있다.
한 바람직한 구체예에서, 이 과정은 동적 냉동 단계를 포함한다.
본원에서 정의된 용어 "동적 냉동 단계"는 식품 중간체를 교반하면서 냉동 조건에 노출하는 것을 의미한다. 이것은 식품 중간체가 고정된 채로 냉동 조건에 노출되는 정지 냉동 단계와 대조된다.
한 바람직한 구체예에서, 이 과정은 냉동 단계를 포함한다.
한 바람직한 구체예에서, 이 과정은 -4℃ 이하의 냉동고로부터 출하 온도에서의 냉동 단계를 포함한다. 바람직하게, 냉동고로부터의 출하 온도는 약 -4℃ 내지 -7℃, 바람직하게 약 -5℃ 내지 -7℃, 더 바람직하게는 약 -5℃ 내지 -6℃, 더 바람직하게는 약 -6℃이다. 출하 온도는 아이스크림을 아이스크림 냉동고에서 꺼낼 때의 아이스크림의 온도이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 기체주입 식품
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 기체주입 식품을 제공한다. 아이스크림, 셔벗, 및 냉동 요구르트가 기체주입 제품으로서 특정될 수 있는 식품의 예로서 언급될 수 있다.
용어 "기체주입"은, 예를 들어 기계적 수단에 의해 혼합물에 기체가 집중적으로 혼입된 것을 의미한다. 기체는 어떤 기체라도 가능하며, 바람직하게 식품과 관련해서는 식품 등급 기체, 예를 들어 공기, 질소, 산화질소 또는 이산화탄소일 수 있다. 본 발명의 기체주입 식품은 기포 집단을 포함하며, 적어도 65%의 기포는 20μm 미만의 직경을 가진다. 바람직하게 적어도 75%, 더 바람직하게 적어도 80%의 기포가 20μm 미만의 직경을 가진다. 바람직하게 적어도 50%, 더 바람직하게 적어도 60%, 가장 바람직하게 적어도 75%의 기포가 10μm의 직경을 가진다.
기체주입도는 전형적으로 "오버런"으로서 정의된다. 본 발명과 관련하여, 오버런 %는 기체주입 제품의 부피와 제품이 형성되는 기체주입되지 않은 혼합물의 부피의 항으로서 정의된다.
오버런 = (최종 기체주입 제품의 부피 - 기체주입되지 않은 혼합물의 부피) x 100/기체주입되지 않은 혼합물의 부피
오버런은 대기압에서 측정된다. 제품에 존재하는 오버런의 양은 원하는 제품 특성에 따라 변할 것이다.
바람직하게, 식품은 적어도 20%, 더 바람직하게 적어도 50%, 가장 바람직하게 적어도 80%의 오버런을 가진다. 바람직하게, 식품은 최대 400%, 가장 바람직하게 최대 200%, 가장 바람직하게 최대 120%의 오버런을 가진다.
기체주입 제품은 본 분야에 공지된 어떤 과정을 사용하여, 예를 들어 기체주입되지 않은 혼합물에서 출발하여 작은 기포를 높은 비율로 포함하는 기체주입 식품을 제조하는 과정인 예비-기체주입 경로를 사용하여 제조될 수 있다.
예비-기체주입 경로에서는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 선택적으로 다른 원료들을 포함하는 혼합물(즉, 수성 용액 및/또는 현탁액)에 기체주입 단계가 행해진다. 기체주입 단계는 매우 작은 기포(직경 20μm 미만)들이 매우 많이 생길 수 있도록 충분히 높은 "강도"를 가져야 한다. 기체주입 과정의 강도는 많은 요인들에 좌우되는데, 이중 가장 중요한 것은 기체주입 단계에서의 에너지 소산 속도, 기체주입 단계에서 혼합물과 기포가 경험한 흐름성, 및 혼합물의 점도와 온도이다. 이에 더하여, 기체주입 단계는 바람직한 기체주입도(즉, 오버런)를 달성할 수 있을 만큼 충분히 길어야 한다.
기계적 기체주입 장치는 주로 혼합물을 전단하는 로터에 기반한다. 에너지 소산 속도는 장치의 회전 속도의 함수이다. 일반적으로 말해서, 작은 기포들을 생성하려면 높은 속도의 에너지 소산(및 이에 따른 높은 회전 속도)이 필요하다(예를 들어, "Chemical Engineering for the Food Industry", Fryer, Pyle and Rielly, Blackie, London, 1997 참조).
또한, 기체주입 단계의 효율은 기체주입 장치로의 흐름성에 좌우된다. 기체주입은 정상적으로는 비교적 큰 기포를 처음에 혼입시킨 다음, 이것을 작은 것으로 깨트림으로써 달성된다. 신장 흐름 또는 연장 흐름이 단순한 전단 흐름과 비교하여 큰 기포를 깨트리는데 특히 효과적인 것으로 알려졌다(예를 들어, Rallinson, J.M. Ann. Rev. Fluid Mech. 16, pp 45-66, 1984 참조). 적어도 신장 흐름 성분을 제공할 수 있는 적합한 고 전단 기체주입 과정 및 장치는 로터-스테이터 장치에서의 연속 휘핑, 예를 들어 Oakes 믹서(ET. Oakes Corp), Megatron 믹서(Kinematica AG), Mondo 믹서(Haas-Mondomix BV) 또는 Silverson 믹서(Silverson Machines Inc.); 기체 주사 후 매끄러운 표면의 열 교환기와 같은 연속 흐름 장치에서의 혼합 및 분산; 및 기체의 표면 비말을 수반하는 뱃치 휘핑, 예를 들어 Hobart 휘스크 믹서(Hobart UK), Kenwood Chef 믹서(Kenwood Ltd), Ultra-Turrax 믹서(IKA Werke GmbH & Co. KG) 또는 전기 핸드-헬드 믹서, 예를 들어 Breville 부엌용 핸드 블렌더를 포함한다.
또한, 기체주입 단계의 효율은 혼합물의 점도 및/또는 온도에 좌우된다. 혼합물의 점도를 증가시키고 및/또는 온도를 저하시킴으로써 기포에 대한 기체주입 장치의 크기 감소 효과가 증가된다. 또한, 기체주입 단계의 효율은 혼합물의 배합에도 좌우된다.
기체주입 단계의 효율은 사용된 과정 및 장치와 기체주입될 혼합물의 특정한 세부사항에 좌우되지만, 상기 설명된 요인들을 고려하여 어떤 특정 상황에 적합한 과정 조건을 결정할 수 있다는 것은 당업자의 이해 범위에 들어간다. 특히, 소산 에너지를 증가시키고 및/또는 신장 흐름 성분을 증가시키고 및/또는 혼합물의 점도를 증가시키고 및/또는 혼합물의 온도를 낮춤으로써 매우 작은 기포의 비율이 증가될 수 있다.
예를 들어 만일 최종 제품이 아이스크림이나 셔벗과 같은 기체주입된 냉동 제품이라면, 기체주입 혼합물이 선택적으로 기체주입 도중에 및/또는 후에 냉동될 수 있다. 냉동은 기체주입과 동시에, 예를 들어 매끈한 표면의 열 교환기 내에서 일어날 수 있다. 동시적 냉동 및 기체주입은 얼음 형태로서 혼합물 점도가 증가하기 때문에 작은 기포의 형성에 도움이 될 수 있다. 냉동이 기체주입 후에 일어나는 경우, 추가 기체가 거의 또는 전혀 혼합되지 않도록 수행되는 것이 바람직하다.
후속 냉동 작업, 예를 들어 저온 압출, 간수나 글리콜 같은 차가운 액체조에 잠긴 몰드에 기체주입된 혼합물 배치, 액체 질소와 같은 극저온 액체조에 직접 기체주입된 혼합물 일부씩 적하, 또는 냉동고, 송풍식 냉동고 또는 냉동 창고와 같은 저온 환경에 기체주입 혼합물을 포함하는 용기 배치에 의해 얼음 함량이 더 증가될 수 있다. 후속 냉동 단계는 바람직하게 추가 기체가 거의 또는 전혀 혼입되지 않도록 낮은 전단 또는 제로 전단에서 수행된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여, 본 발명의 기체주입 식품(및 이들이 제조되는 혼합물)은 종래부터 식품에서 발견되는 다른 원료들, 예를 들어 지방, 밀크 또는 크림; 오일 또는 지방, 특히 유화된 상의 형태; 설탕, 소금, 과일 및/또는 야채 재료, 추출물, 주스, 증점제, 예를 들어 다당류, 안정제, 색소, 향료, 화학 유화제, 예를 들어 모노글리세리드; 산 및 보존제를 포함할 수 있다. 바람직한 식품은 아이스크림, 셔벗, 무스, 휘핑크림, 기체주입 음료수, 예를 들어 밀크 쉐이크 및 스무디, 저지방 스프레드(예를 들어, 지방 함량 0-60wt%), 드레싱 및 소스를 포함한다. 바람직하게, 식품은 냉동되거나 차게 한 기체주입된 당과, 예를 들어 아이스크림, 셔벗 또는 무스이다.
본 발명의 기체주입된 냉동 당과는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 선택적으로 본 발명 따른 폴리펩티드 이외의 다른 결빙방지 폴리펩티드를 하나 이상 포함한다. 기체주입 제품에서 결빙방지 폴리펩티드의 총량은 전형적으로 적어도 약 0.0001 wt%, 더 바람직하게는 적어도 0.0005 wt%, 가장 바람직하게는 적어도 0.001 wt%이다. 결빙방지 폴리펩티드는 매우 낮은 농도로 사용될 수 있으며, 따라서 당과는 0.05 wt% 미만의 결빙방지 폴리펩티드를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 범위는 약 0.001 내지 0.01 wt%이다. 결빙방지 폴리펩티드는 단독으로 또는 본 분야에 알려진 다른 결빙방지 폴리펩티드와 조합하여 사용될 수 있다.
냉동 기체주입 제품은 선택적으로 코팅, 예를 들어 초콜릿 또는 커버쳐의 층 및/또는 함유물, 예를 들어 견과, 과일, 태피 또는 초콜릿 조각을 포함할 수 있다. 이 경우, 냉동 기체주입 당과의 지방 함량은 코팅이나 함유물에 존재하는 지방은 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 냉동 기체주입 당과는 3 wt% 이하, 바람직하게 2 wt% 이하, 더 바람직하게는 1 wt% 이하의 지방을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 당과는 지방 무함유이며, 이것은 당과가 실질적으로 지방을 포함하지 않는다는 의미이다(즉, 0.1 wt% 미만).
하이드로포빈 및 계면활성제와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 기체주입 식품
또한, 본 발명은 하이드로포빈 및 계면활성제와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 당과와 같은 냉동 기체주입 식품을 제공한다. 바람직하게, 기체주입 식품은 기포의 집단을 포함하며, 이때 적어도 65%의 기포는 20μm 미만의 직경을 가진다.
냉동 기체주입 당과에 존재하는 하이드로포빈의 양은 일반적으로 당과 배합과 공기상의 부피에 따라 변할 것이다. 전형적으로, 당과는 적어도 0.001 wt%, 더 바람직하게는 적어도 0.005 내지 0.01 wt%의 하이드로포빈을 포함할 것이다. 전형적으로, 당과는 1 wt% 미만의 하이드로포빈을 포함할 것이다. 하이드로포빈은 단일 출처 또는 복수의 출처로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어 하이드로포빈은 둘 이상의 상이한 하이드로포빈 폴리펩티드의 혼합물일 수 있다.
하이드로포빈은 공기상을 안정화하는데 이용될 수 있는 형태 및 양으로 첨가된다. 용어 "첨가된"은 그것의 포말 안정화 특성을 이용하고자 하이드로포빈을 당과에 일부러 도입한 것을 의미한다. 결국, 하이드로포빈 폴리펩티드를 포함할 수 있는, 진균 오염물을 포함하는 원료들이 존재하거나 첨가된 경우는 본 발명과 관련된 하이드로포빈의 첨가를 구성하지 않는다.
전형적으로, 하이드로포빈은 기액 표면에서 자가-조립될 수 있는 형태로 당과에 첨가된다.
전형적으로, 하이드로포빈은 분리된 형태로, 전형적으로 적어도 부분적으로 정제된 형태로, 예를 들어 고형분 중량에 기초하여 적어도 10% 순도로 본 발명의 당과에 첨가된다. "분리된 형태로 첨가된"은 하이드로포빈이 하이드로포빈을 자연적으로 발현하는 버섯과 같은 자연발생 생물의 일부로서 첨가되지 않는다는 의미이다. 대신에, 하이드로포빈은 전형적으로 자연발생 출처로부터 추출되거나, 또는 숙주 생물에서 재조합 발현에 의해 얻어질 것이다.
한 구체예에서, 하이드로포빈은 모노머, 다이머 및/또는 올리고머(즉, 10 모노머 단위 이하로 구성된) 형태로 당과에 첨가된다. 바람직하게, 첨가된 하이드로포빈 중 적어도 50 wt%, 더 바람직하게는 적어도 75, 80, 85 또는 90 wt%는 적어도 이들 형태 중 하나로 존재한다. 일단 첨가되면, 하이드로포빈이 전형적으로 공기, 액체 계면에서 조립되고, 따라서 모노머, 다이머 및 올리고머의 양은 감소될 것으로 예상된다.
본원에서 사용된 용어 "계면활성제"(또는 "표면 활성제")는 그것이 용해되는 매질의 표면장력을 저하시키고, 따라서 액체/증기 계면에서 분명히 흡착하는 물질을 의미한다.
이 용어는 표면 위에 자발적으로 분산됨으로써 액체의 표면 장력을 저하시키는 약간 가용성인 물질을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "계면활성제"는 하이드로포빈을 포함하지 않는다.
용어 "계면활성제"는 다른 (비-표면 활성) 원료 안에 매우 소량으로 존재할 수 있는 미량의 표면 활성 성분, 예를 들어 펙틴, 로커스트빈 검 및 구아 검과 같은 안정제는 포함하지 않는다. 이러한 경우, 계면활성제의 양은 일반적으로 식품의 0.05 wt% 미만일 것이다.
계면활성제는 전형적으로 맛 및/또는 질감에 대한 유리한 효과 때문에 기체주입 식품에서 사용되는 원료이다. 이러한 계면활성제는 (제한되지는 않지만) 다음을 포함한다:
■ 밀크 폴리펩티드, 예를 들어 카제인, 유장(및 이들의 폴리펩티드 단편), 나트륨 카제이네이트, 칼슘 카제이네이트, 및 가수분해된 유장 폴리펩티드;
■ 기타 폴리펩티드, 예를 들어 젤라틴, 난 폴리펩티드, 및 대두 폴리펩티드;
■ 포화 또는 불포화 지방산의 모노- 및 디-글리세리드, 예를 들어 모노글리세릴 팔미테이트;
■ 6가 알코올(일반적으로 소르비톨)의 폴리옥시에틸렌 유도체, 글리콜, 글리콜 에스테르, 폴리글리세롤 에스테르, 소르비탄 에스테르, 스테아로일 락틸레이트, 아세트산 에스테르, 락트산 에스테르, 시트르산 에스테르, 아세틸화 모노글리세리드, 디아세틸 타르타르산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(예를 들어, 폴리소르베이트 80);
■ 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 알킬폴리(에틸렌 옥시드), 지방 알코올, 및 수크로오스 에스테르;
■ 인지질 및 인지질 혼합물(예를 들어, 레시틴); 그리고 상기 어느 것의 혼합물.
바람직하게, 계면활성제는 제품의 적어도 0.05 wt%, 더 바람직하게는 적어도 0.1 wt%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 계면활성제는 폴리펩티드, 더 바람직하게는 밀크 폴리펩티드이고, 식품의 적어도 0.5 wt%, 더 바람직하게는 적어도 1 wt%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 계면활성제는 식품의 최대 20 wt%, 더 바람직하게는 최대 10 wt%, 가장 바람직하게는 최대 5 wt%의 양으로 존재한다.
본 발명에 따른 기체주입 식품은 "예비-기체주입" 경로(상기 더 상세히 개시됨)를 사용하여 제조될 수 있는데, 이것은 하이드로포빈과 계면활성제를 포함하는 기체주입되지 않은 혼합물에서 출발하여 작은 기포를 큰 비율로 포함하는 기체주입된 식품을 제조하는 과정이다. 또 다른 경로는 "후-첨가"라고 하는데 계면활성제가 기체주입 후 첨가되는 과정이다.
후-첨가 경로는 기체주입이 일어난 후 계면활성제를 첨가함으로써 기포가 형성되는 지점에서는 계면활성제의 양과 관련하여 하이드로포빈의 양이 증가될 수 있지만 최종 제품에서는 그 양이 변함없이 유지되는 방식을 제공한다. 따라서, 하이드로포빈을 포함하지만 계면활성제는 포함하지 않는 혼합물이 기체주입되고, 이어서 계면활성제를 포함하는 제 2 혼합물이 기체주입된 혼합물과 조합된다. 제 2 혼합물은 조합된 혼합물이 바람직한 최종 배합을 제공하도록 배합된다. 혼합 단계를 사용하여 조합된 혼합물의 균질성을 개선할 수 있다. 혼합 단계는 바람직하게 비교적 낮은 전단에서 짧은 시간 동안 수행되며, 이로써 추가의 기체는 거의 또는 전혀 혼입되지 않도록 하다(즉, 혼합 단계 동안 10% 이상으로 오버런이 증가하지 않는다). 적합한 혼합 장치는 정적 믹서; 인라인 동적 믹서, 예를 들어 오거, 블렌더 또는 프루트-피더; 및 뱃치 혼합 장치, 예를 들어 교반 용기를 포함한다. 뱃치 과정에서, 제 2 (계면활성제-포함) 혼합물은 전형적으로 공정 기간이 끝날 무렵에 주사된다. 또한, 혼합 단계는, 예를 들어 제 2 혼합물을 제품이 나오는 지점 근처의 매끄러운 표면의 열 교환기 또는 스크류 압출기의 배럴에 주사함으로써 매끈한 표면의 열 교환기 또는 스크류 압출기 안에서 연속 과정으로 일어날 수도 있다.
예를 들어 만일 최종 제품이 냉동 기체주입 제품, 예를 들어 아이스크림이나 셔벗이라면, 기체주입 혼합물은 선택적으로 기체주입 도중에 및/또는 이후에 냉동될 수 있다. 냉동은 기체주입과 동시에, 예를 들어 매끄러운 표면의 열 교환기 안에서 일어날 수 있다. 동시적 냉동 및 기체주입은 얼음 형태로서 혼합물 점도가 증가하기 때문에 작은 기포의 형성에 도움이 될 수 있다. 냉동이 기체주입 후 일어나는 경우, 추가의 기체가 전혀 또는 거의 혼입되지 않도록 수행되는 것이 바람직하다. 계면활성제가 기체주입 후 첨가되는 경우(즉, 후-첨가 경로), 냉동은 혼합 단계 전에 및/또는 도중에 일어날 수 있다. 계면활성제 스트림은 혼합 전에 차게 되거나 또는 부분적으로 냉동될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 얼린 물 당과
전형적으로, 얼린 물 당과는 비교적 작은, 예를 들어 1mL 미만, 더 바람직하게는 0.5mL 미만의 평균 부피를 가진다. 예로서, 5mm 내지 10mm의 직경을 가진 비드는 약 0.065mL 내지 약 0.5mL의 부피를 가질 것이다. 전형적으로, 분리된 얼린 당과들은 각 당과가 소비자에 의해 쉽게 구별될 수 있도록 하는 최소 평균 부피를 가진다. 예를 들어, 분리된 냉동 당과는 바람직하게 적어도 약 0.02mL의 최소 평균 부피를 가진다.
분리된 얼린 물 당과는 정육면체나 구체의 형태 등, 어떤 모양으로도 제조될 수 있다. 바람직하게, 냉동 당과는 실질적으로 구형이다.
얼린 물 당과는 코어나 층 등, 제품의 적어도 한 부분이나 영역은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하지 않는 복합 제품의 형태를 가질 수 있다. 이것의 예는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 빙수층으로 코팅된, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 결여한 아이스크림 코어를 함유하는 제품이다. 바람직하게, 실질적으로 이 조성의 당과의 외부층, 즉 다른 분리된 얼린 당과와 접촉하게 되는 영역이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함한다. 복합 제품의 경우, 당과에 첨가되는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 wt% 양은 복합 제품과는 관련 없이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 당과 성분들에만 관련하여 계산된다는 것이 인정될 것이다.
얼린 물 당과는 기체주입되거나 그렇지 않거나 할 수 있다. 기체주입되지 않았다는 것은 냉동 당과가 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만의 오버런을 가진다는 의미이다. 기체주입되지 않은 냉동 당과는 기체 함량을 증가시키기 위한 휘핑과 같은 단계를 고려하지 않아도 된다. 그렇지만, 기체주입되지 않은 냉동 당과를 제조하는 동안 공기와 같은 기체가 낮은 수준으로 제품에 혼입될 수 있다는 것은 인정될 것이다.
빙수 당과는 전형적으로 설탕, 물, 색소, 과일산이나 다른 산성화제, 과일이나 과일향 및 안정제를 함유한다. 바람직하게 총 고형분 함량은 적어도 6 wt%, 더 바람직하게 적어도 8 wt% 또는 적어도 10, 12, 15 또는 20 wt%이고, 약 35 wt%만큼 높을 수 있다. 바람직하게 총 고형분 함량은 35 wt% 미만, 더 바람직하게 25 wt% 미만이다. 빙수는 기체주입되거나 그렇지 않거나 할 수 있다. 기체주입되는 경우, 오버런은 전형적으로 약 50% 미만, 예를 들어 약 25-30%이다. 한 구체예에서, 본 발명의 빙수 당과는 기체주입되지 않는다.
바람직하게, 빙수 당과는 2 wt% 미만, 더 바람직하게 1 wt% 미만의 인공 감미료를 포함한다. 제일 바람직한 구체예는 아스파르탐이나 아세술팜과 같은 인공 감미료가 빙수 당과에 존재하지 않는 것이다.
본 발명의 얼린 물 당과는 전형적으로 하나 이상의 안정제, 예를 들어 검, 아가, 알기네이트 및 유도체, 젤라틴, 펙틴, 레시틴, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 카라게난 및 푸르셀레란으로부터 선택된 하나 이상의 안정제를 포함한다. 바람직하게, 검과 카라게난의 블렌드 같은 안정제의 블렌드가 사용된다. 바람직한 구체예에서, 냉동 당과는 0.1 내지 1 wt%의 안정제를 포함한다.
본 발명의 얼린 물 당과는 전형적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 적어도 약 0.0005wt%를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 매우 낮은 농도로 사용될 수 있으며, 따라서 당과는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 0.05wt% 미만을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 범위는 약 0.001 내지 0.01wt%이다.
본 발명의 얼린 물 당과는 본 분야에 공지된 많은 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 액체 혼합물의 드롭을 액체 질소의 냉동 챔버로 분배함으로써 자유-유동 비드가 제조될 수 있다(WO 96/29896 참조). 다른 모양은 몰딩 기술에 의해, 예를 들어 냉각된 몰드에 액체 프리믹스를 도입함으로써 제조될 수 있다. 몰딩된 제품은 복합적인 모양을 함유할 수 있으며, 고도의 표면 한정성을 가진다.
아이스크림-함유 제품 등은 -20℃ 내지 -25℃ 이하의 냉각 경화 단계를 시행할 필요는 없지만, 특히 제품이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하지 않는 층이나 코어를 가진 복합 제품이라면 바람직할 경우 이 단계가 사용될 수 있다.
본 발명의 얼린 물 당과 제품은 개별 단위로서 소비자 판매용 용기에 포장될 수 있다. 이러한 용기의 부피는 전형적으로 100mL 내지 1000mL, 예를 들어 200mL 내지 500mL이다.
그러나, 제품은 또한 소매용 대형 용기에 포장될 수도 있으며, 이 경우 제품은, 예를 들어 패스트푸드 아울렛에서 또는 픽 '앤' 믹스 형태로서 소매를 전제로 하는 더 작은 용기에 분배되고, 소비자는 상이한 모양, 향 및/또는 색소를 가진 본 발명의 냉동 당과들로부터 선택할 수 있다. 이런 대형 용기는, 예를 들어 약 1000mL 이상, 예를 들어 적어도 2000mL 또는 5000mL의 부피를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분리된 냉동 유제품 당과
본 발명은 또한 제품 내에서 다른 분리된 얼린 당과와 직접 접촉하게 되는 분리된 기체주입되지 않은 냉동 유제품 당과를 포함하는 냉동 당과 제품을 제공한다.
얼음 당과는 냉동된 상태에서 소비되는 단맛이 나도록 제조된 식료품이다(즉, 식료품의 온도가 0℃ 미만인 조건에서, 바람직하게는 식료품이 상당량의 얼음을 포함하는 조건에서). 본 발명의 얼음 당과는 1 내지 8 wt%의 지방을 포함하고, 10 내지 25 wt%의 총 고형분 함량을 가진다. 지방과 총 고형분의 이러한 양은 수용성 기체주입 기체 및 본 발명에 따른 폴리펩티드와 조합하여 제품에 바람직한 질감 및 외형을 제공한다. 전형적인 빙수 제법(지방을 함유하지 않는)과 표준 아이스크림 제법(적어도 약 30 wt%의 총 고형분 함량을 가지는)은 분리된 냉동 유제품 당과의 정의에 들어가지 않는다.
본 발명의 얼음 당과는 바람직하게 2 내지 6 wt%, 더 바람직하게 2.5 내지 5 wt%의 지방을 포함한다. 지방은 어떤 적합한 출처, 예를 들어 버터지방, 코코넛오일, 야자오일, 코코아버터, 해바라기오일, 올리브오일 또는 평지씨오일, 및 이들의 혼합물이나 분획들로부터 유래할 수 있다.
얼음 당과의 총 고형분 함량은 당과의 건조 중량, 즉 물 이외의 다른 모든 원료들의 중량의 합계이며, 총 중량의 퍼센트로서 표시된다. 이것은 Ice Cream, 6th Edition, p 296에 설명된 대로 측정된다. 본 발명의 얼음 당과는 얼음 당과의 10 내지 25wt%의 총 고형분 함량을 가진다. 바람직하게 총 고형분 함량은 적어도 12%, 더 바람직하게 적어도 15%, 가장 바람직하게 적어도 18%이다. 바람직하게 총 고형분 함량은 최대 24%, 더 바람직하게 최대 22%이다.
본 발명에 따른 얼음 당과는 얼음을 함유한다. 총 고형분 함량이 10 내지 25 wt%이므로, 물 함량은 상응하여 90 내지 75 wt%이다. -18℃의 온도에서 전부는 아니지만 대부분의 물은 결빙된다.
본 발명의 얼음 당과는 전형적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 적어도 약 0.0001wt%, 더 바람직하게 적어도 0.0005wt%를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 매우 낮은 농도로 사용될 수 있으며, 따라서 당과는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 0.05wt% 미만을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 범위는 약 0.001 내지 0.01wt%, 더 바람직하게 0.005 내지 0.01wt%이다.
기체주입제는 그것의 표면 활성 및/또는 점도로 인하여 작은 기포들을 제공하고, 작은 기포들의 형성을 돕고, 이들의 응집이나 분리를 제지하는 어떤 성분을 말한다. 기체주입제는 기체주입 기체는 포함하지 않는다고 이해되어야 한다. 바람직하게, 기체주입제는 폴리펩티드-기재 기체주입제, 예를 들어 가수분해된 밀크 폴리펩티드, 예를 들어 Hygel™ 및 Hyfoama™(Kerry Biosciences로부터 입수가능); 또는 가수분해된 대두 폴리펩티드, 예를 들어 Versawhip(Kerry Biosciences로부터 입수가능) 및 D-100TM(Gunter Industries로부터 입수가능)이다. 또는, 기체주입제는 단백질 기재가 아닐 수 있으며, 예를 들어 모노글리세리드, 예를 들어 Myverol 18-04K(식물성 오일로부터 제조된 증류 95% 모노글리세리드, Quest International로부터 입수가능), 또는 폴리글리세롤 에스테르, 예를 들어 PGE 55(지방산의 폴리글리세롤 에스테르, Danisco로부터 입수가능)가 있다. 당과에서 기체주입제의 양은 적어도 0.1wt%, 바람직하게 적어도 0.15wt%이다.
바람직하게 기체주입제의 양은 0.5wt% 미만, 바람직하게 0.4wt% 미만, 가장 바람직하게 0.25wt% 미만이다.
본 발명의 얼음 당과는 안정제를 포함할 수 있다. 안정제로는 폴리펩티드, 예를 들어 젤라틴; 식물 추출물, 예를 들어 아라비아 검, 가티 검, 카라야 검, 트래거캔스 검; 종자 검, 예를 들어 로커스트빈 검, 구아 검, 타라 검, 피실리움씨 검, 모과씨 검 또는 타마린드씨 검; 곤약 만난; 해초 추출물, 예를 들어 아가, 알가네이트, 카라게난 또는 푸르셀레란; 펙틴, 예를 들어 저급 메톡실 또는 고급 메톡실-타입 펙틴; 셀룰로오스 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 메틸 및 메틸에틸 셀룰로오스, 또는 히드록실프로필 및 히드록시프로필메틸 셀룰로오스; 및 미생물 검, 예를 들어 덱스트란, 크산탄 또는 β-1,3-글루칸이 있다. 안정제는 단일 안정제, 또는 둘 이상의 안정제의 혼합물일 수 있다. 바람직하게, 안정제는 로커스트빈 검이다. 안정제의 양은 바람직하게 최대 0.3 wt%, 더 바람직하게 최대 0.25 wt%이다. 예를 들어, 안정제의 양은 전형적으로 0 내지 0.2 wt%이다.
본 발명의 얼음 당과는 폴리펩티드(어떤 폴리펩티드 기재 기체주입제에 더하여)를, 바람직하게 적어도 1 wt%, 더 바람직하게 적어도 1.5 wt%의 양으로 함유할 수 있다. 적어도 이러한 양의 폴리펩티드를 함유하는 얼음 당과는 밀크 아이스-타입 제품으로서 인식되며, 많은 소비자가 실질적으로 폴리펩티드가 없는 얼음 당과보다 더욱 매력을 느낀다. 바람직하게 폴리펩티드 함량은 8 wt% 미만, 더 바람직하게 6 wt% 미만, 가장 바람직하게 3 wt% 미만이다. 본 발명에서 사용되는 적합한 폴리펩티드는 밀크 폴리펩티드, 난 폴리펩티드 및 젤라틴뿐만 아니라 식물 폴리펩티드, 예를 들어 대두 폴리펩티드를 포함한다. 우수한 향과 열 안정성 때문에 밀크 폴리펩티드가 특히 바람직하다. 밀크 폴리펩티드의 적합한 출처는 밀크, 농축유, 밀크 분말, 유장, 유장 분말 및 유장 폴리펩티드 농축 분리물을 포함한다.
본 발명의 얼음 당과는 전형적으로 당분, 예를 들어 수크로오스, 프럭토스, 덱스트로스, 락토스, 옥수수시럽, 당 알코올을 포함하며, 이들은 또한 다른 원료들, 예를 들어 색소와 향료를 함유할 수 있다.
얼음 당과는 바람직하게 적어도 20%, 더 바람직하게는 적어도 40%, 가장 바람직하게는 적어도 60%의 오버런을 가진다. 바람직하게 오버런은 최대 150%, 더 바람직하게는 최대 120%, 가장 바람직하게는 최대 120%이다.
"혼합물"은 기체주입 전 기체주입되지 않은 혼합물을 말한다(또는 녹은 얼음 당과에서 기체가 빠져나간 후). 오버런은 대기압에서 측정된다.
본 발명의 얼음 당과는 전체 제품을 구성할 수도 있고, 복합 제품의 성분일 수도 있다. 복합 제품에서, 본 발명의 얼음 당과는 제품의 다른 성분(들)과 대조적인 질감 및 외형을 제공한다. 바람직하게, 이러한 복합 제품은 이들의 구조 내에 분리된 요소로서 얼음 당과를 함유한다. 예를 들어, 비교적 부드러운 아이스크림 코어가 얼음 당과 층으로 코팅되어 아이스크림 코어를 둘러싼 단단하고 바삭한 층을 제공할 수 있다. 다른 예는 함유물로서 얼음 당과가 포함되는 것이다. 또는, 얼음 당과는, 예를 들어 적어도 한 표면에 물 글레이즈, 기체주입되지 않은 빙수 또는 초콜릿의 연속 또는 부분 코팅으로 제공될 수 있다. 복합 제품에서, 총 고형분 및 지방, 기체주입제, 얼음 구조화 폴리펩티드, 안정제, 및 폴리펩티드 함량은 복합 제품의 다른 성분들은 고려치 않고 얼음 당과만을 고려하여 결정한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분리된 냉동 유제품 당과는 본 분야에 공지된 어떤 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 분리된 냉동 유제품 당과는 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다:
(a) 원료들의 혼합물을 제조하는 단계; 그 다음
(b) 혼합물을 저온살균하고 균질화하는 단계; 그 다음
(c) 본 발명에 따른 폴리펩티드를 첨가하는 단계;
(d) 혼합물을 냉동시키면서 동시에 이산화탄소, 산화질소 또는 이들의 혼합물을 적어도 50 부피%를 함유하는 기체주입 기체로 혼합물에 기체를 주입하여 얼음 당과를 제조하는 단계(예를 들어, 아이스크림 냉동고에서);
(e) 얼음 당과를 냉각 경화하는 단계, 여기서 단계 (c)는 단계 (b) 전에, 도중에 또는 이후에 일어날 수 있다.
혼합물은 이산화탄소, 산화질소 또는 이들의 혼합물을 적어도 약 50 부피%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 100%를 함유하는 기체로 기체주입된다. 기체주입 기체의 나머지는 전형적으로 공기와 같은 질소-함유 기체이다. 가장 바람직하게, 기체주입 기체는 100% 이산화탄소이다.
냉동 후, 얻어진 얼음 당과는, 예를 들어 압출 후 컷팅, 또는 몰딩에 의해 냉각 경화하는 단계 전에 모양이 만들어질 수 있다. 바람직하게, 얼음 당과는 4℃ 내지 -1.5℃, 더 바람직하게 -2.5℃ 내지 -1.5℃의 온도에서 압출된다. 비교적 높은 압출 온도가 특히 우수한 폼-형태 외형을 가져온다.
바람직하게, 냉각 경화 단계는 약 -25℃ 이하의 온도에서, 예를 들어 송풍식 냉동에 의해 일어난다. 냉각 경화 후, 얼음 당과는 바람직하게 -25℃ 내지 -10℃, 전형적으로 약 -18℃의 온도에서 보관된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 저지방 유제품
또, 본 발명은 냉동 저지방 유제품을 제공한다. 냉동 유제품 당과는 전형적으로 밀크 또는 밀크 고형분을 함유하는 당과, 예를 들어 아이스크림, 밀크 아이스, 냉동 요구르트 및 셔벗이다. 포유류의 젖이 바람직하지만 용어 "밀크"는 밀크 대용물, 예를 들어 대두 밀크를 포함한다. 바람직하게, 냉동 유제품 당과는 아이스크림 또는 밀크 아이스이다.
본 발명의 저지방 제품은 바람직하게 3wt% 이하, 바람직하게 2wt% 이하, 더 바람직하게 2wt% 미만, 또는 1wt% 이하의 지방을 포함한다. 한 구체예에서, 이 제품은 지방 무함유이며, 이것은 제품이 실질적으로 지방을 포함하지 않는다는 의미이다(즉, 0.1wt% 미만). 제품이 초콜릿 또는 커버쳐 층과 같은 비-유제품 조성물로 코팅되는 경우, 제품의 지방 함량은 코팅을 무시하고 결정되어야 한다.
밀크를 함유하는 냉동 당과는 바람직하게는 적어도 약 3wt%의 무지 유고형분 (MSNF), 더 바람직하게 약 5wt% 내지 약 25wt%의 MSNF를 함유한다.
안정제가 본 발명의 냉동 제품에 존재할 수 있지만, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 안정화 효과가 어떤 경우에 안정제를 대체할 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 그러나, 지방이 1wt% 미만인 저지방 제품과 같은, 일부 제품의 제법의 경우, 원하는 제품 안정성을 유도하기 위해서는 유의한 수준의 안정제가 본 발명에 따른 폴리펩티드에 더하여 여전히 필요할 수 있다. 그렇지만, 얻어진 제품은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 질감 및 맛에 대한 안정제의 좋지 않은 효과를 감소시키거나 완화하기 때문에 이전의 제품들에 비해 개선된다.
적합한 안정제는 알기네이트, 젤라틴, 아카시아 검, 구아 검, 카라야 검, 로커스트빈 검, 카라게난 및 염, 잔탄 검, 미세결정 셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 안정제 양은 바람직하게 1.5wt% 이하, 더 바람직하게 1wt% 이하, 예를 들어 0.1 내지 0.8wt%이다.
한 구체예에서, 제품은 적어도 0.5wt% 안정제, 예를 들어 적어도 0.7wt% 안정제를 포함한다. 바람직하게, 이러한 제품에서 지방의 수준은 2 또는 1wt% 미만이다. 다른 구체예에서, 제품은 0.5wt% 미만의 안정제를 포함한다. 바람직하게, 이러한 제품에서 지방의 수준은 적어도 1wt% 이상, 더 바람직하게는 적어도 2wt%이다.
본 발명의 냉동 당과는 전형적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 적어도 약 0.0001wt%, 더 바람직하게는 적어도 0.0005wt%를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 매우 낮은 농도로 사용될 수 있으며, 따라서 당과는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 0.05wt% 미만을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 범위는 약 0.001 내지 0.01wt%, 더 바람직하게는 0.005 내지 0.01wt%이다.
냉동 당과는 기체주입되거나 그렇지 않거나 할 수 있으며, 기체주입되는 것이 바람직하다. 기체주입되지 않았다는 것은 냉동 당과가 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만의 오버런을 가진다는 의미이다. 기체주입되지 않은 냉동 당과는 기체 함량을 증가시키기 위한 휘핑과 같은 단계를 고려하지 않아도 된다. 그렇지만, 기체주입되지 않은 냉동 당과를 제조하는 도중에 공기와 같은 기체가 낮은 수준으로 제품에 혼입될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 기체주입된 제품에 존재하는 오버런의 양은 원하는 제품 특성에 따라 변할 것이다. 예를 들어, 아이스크림에서 오버런의 수준은 전형적으로 약 70 내지 100%이고, 무스와 같은 당과에서 오버런은 200 내지 250wt%만큼 높을 수 있지만, 밀크 아이스에서 오버런은 25 내지 30%이다. 기체주입된 냉동 당과는 바람직하게 30% 내지 200%, 더 바람직하게는 50% 내지 150%의 오버런을 가진다.
본 발명의 냉동 당과는 본 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 제품은 전형적으로 정지 상태에서 또는 교반을 이용하여, 예를 들어 매끄러운 표면의 열 교환기에서 냉동된다. 제품은 몰딩될 수 있다. 제품은 복잡한 모양을 함유할 수 있으며, 고도의 표면 한정성을 가질 수 있는데, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 첨가가 이러한 모양과 구조의 안정성을 보존하기 때문이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 제품을 냉동하기 전에, 도중에 또는 이후에 첨가될 수 있다. 냉동 후 첨가되는 경우, 이것은 제품이 소성인 상태에서 일어날 것이며, 이로써 본 발명에 따른 폴리펩티드는, 예를 들어 매끄러운 표면의 열 교환기로부터 압출된 후 굳어지기 전에 혼합될 수 있다.
아이스크림 제품 등은 -20℃ 내지 -25℃ 이하에서 냉동 경화하는 단계가 선택적으로 실행될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 저지방 냉동 당과 제품을 제조하기 위한 조성물을 포함하며, 이 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드를, 바람직하게는 적어도 0.005wt%를 포함한다. 이러한 조성물은 액체 프리믹스 및 건조 믹스, 예를 들어 분말을 포함하며, 여기에 수성 액체, 예를 들어 밀크나 물이 첨가된다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 마이크로파에서 해동되도록 디자인된 냉동 식품
냉동은 식품을 보존하기 위한 매우 일반적인 기술이다. 어떤 주목되는 예외는 있지만, 냉동 식품은 일반적으로 사용 전에 해동되거나 더 가공된다(예를 들어, 요리). 해동은 냉동 식품을 주변 온도에 방치함으로써 충분히 달성된다. 그러나, 가정 규모에서도 충분한 해동을 달성하는데 걸리는 시간이 상당하다. 또한, 해동은 냉동 식품에 전도성 또는 대류성 열을 적용함으로써 산업적 규모에서도 달성된다. 그러나, 이러한 해동을 달성하는데 필요한 장치는 소비자가 쉽게 입수할 수 없다.
마이크로파 오븐은 산업적인 면과 가정적인 면 모두에서 점점 널리 전파되고 있다. 이들의 용도 중 하나는 냉동 식품의 해동이다. 마이크로파 해동은 주변 온도에서 해동하는 것보다 더 빠르다. 많은 단점이 여전히 존재한다:
■ 냉동 식품의 낮은 열 확산성은 온도 평형의 확립에 펄스방식 마이크로파의 사용을 필요로 한다;
■ 액체 물은 얼음보다 훨씬 더 쉽게 마이크로파 에너지를 흡수하고, 그 결과 "핫스폿"을 만들어져 불균일한 해동의 경향이 나타난다;
■ 크기 및 모양과 관련된 식품 아이템의 기하구조가 적합해야 한다;
■ 단지 간헐적인 마이크로파 펄스를 사용하는 것이 필요하기 때문에, 식품 아이템을 완전히 해동하는데 걸리는 시간이 상당하다.
만일 메조 상의 물, 유화제 및 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물이 식품에 혼입되고, 적어도 물의 양이 냉동 식품에서 얼지 않은 물로서 존재한다면, 개선된 제품이 얻어진다는 것이 판명되었다.
메조 상이라는 말은 본원에서 층 구조 및 전통적인 메조 상, 즉 층상, 정육면체, 육면체(1 및 2), L2 및 L1과 또한 분산된 메조 상, 즉 리포솜, 큐보솜 및 헥소좀을 모두 포함한다. 추가로, 그것은 역시 이러한 표면을 형성하는 미셸의 형태를 포함한다.
간헐적 또는 펄스방식 마이크로파를 사용할 필요 없이 직접 마이크로파 에너지를 적용함으로써 상기 설명된 냉동 식품이 균일하고 신속하게 해동될 수 있다는 것이 판명되었다.
냉동 식품에 존재할 때 얼지 않은 물의 비율을 유지하는 본 발명의 시스템의 능력은 메조 상을 형성하는 조성물의 능력 때문인 것으로 생각된다. 메조 상은 극성 유화제와 물이 그들의 극성에 따라서 잘 정의된 구조로 조직화된 구조이다. 유화제의 극성 말단 기가 물 상 또는 상들과 접촉된다. 다수의 상이한 메조 상 구조가 존재할 것으로 생각된다. 유화제의 극성 말단 기에 가까운 물은 냉동으로부터 보호되는 방식으로 조직화된다.
본 발명의 조성물에서 물 대 유화제의 비는 사용된 유화제, 및 조성물의 특정 용도에 의존할 것이다. 어떤 특정 유화제/물 시스템에서, 0℃ 이하에서 존재하는 액체 물("얼지 않은 물")의 양은 물의 비율에 따라 최대까지 증가하려는 경향이 있다. 이 최대 지점 이하에서는 실질적으로 시스템의 모든 물이 얼지 않는다고 생각된다. 이 지점을 넘으면 존재하는 물의 고정된 양은 얼지 않고, 나머지는 언다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 -15℃ 이하의 온도에서 냉동 식품에 존재할 때 적어도 일정량의 얼지 않은 물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 -20℃ 이하의 온도에서 냉동 식품에 존재할 때 적어도 일정량의 얼지 않은 물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 -25℃ 이하의 온도에서 냉동 식품에 존재할 때 적어도 일정량의 얼지 않은 물을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 -40℃ 이하의 온도에서 냉동 식품에 존재할 때 적어도 일정량의 얼지 않은 물을 포함한다.
냉동 식품에 존재할 때, 본 발명의 조성물은 바람직하게 0℃ 이하의 온도에서 열역학적으로 안정한 얼지 않은 물을 일정량 포함한다.
바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 0.1%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 1%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 2%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 3%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 5%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 10%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 99.9%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 50%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 40%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 30%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 25%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 99.9%의 양으로 존재한다. 더 바람직하게, 물 성분은 조성물의 총 중량을 기준으로 1 내지 25%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 0.1%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 50%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 60%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 70%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 80%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 99.0%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 99.9%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 99.9%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 99%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 97%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 95%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 90%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 99.9%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 유화제는 조성물의 총 중량을 기준으로 75 내지 90%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 0.001%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 0.01%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 0.1%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 1%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 5%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 적어도 10%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 90%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 50%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 25%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 15%의 양으로 존재한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 최대 10%의 양으로 존재한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.001 내지 90%의 양으로 존재한다. 더 바람직하게, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 10%의 양으로 존재한다.
바람직한 양태에서, 조성물은 25% w/w 미만의 오일을 포함한다. 더 바람직하게, 조성물은 10% w/w 미만의 오일을 포함한다. 더 바람직하게, 조성물은 5% w/w 미만의 오일을 포함한다. 더 바람직하게, 조성물은 1% w/w 미만의 오일을 포함한다. 더 바람직하게, 조성물은 0.1% w/w 미만의 오일을 포함한다. 가장 바람직하게, 조성물은 실질적으로 오일을 포함하지 않는다.
다른 성분들이 본 발명의 조성물에 존재할 수 있으며, 단 이들은 냉동 식품에 존재하는 적어도 일정량의 얼지 않은 물을 유지하는 능력에 영향을 미치지 않아야 한다.
회합시키는 기술의 예는 혼합이다. 물과 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 유화제의 혼합은 당업자에게 자명한 많은 수단 중 어느 하나에 의해 달성될 수 있다. 전기 믹서에서의 혼합이 한 예이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 추가되는 원료, 유화제 및 물이 조성물에 존재한다면, 이들은 어떤 적합한 단계에서 혼입될 수 있다.
바람직하게, 식품은 전체적으로 식품에 존재하는 얼지 않은 물의 양이 균일하고 빠른 마이크로파 해동을 가능하게 하는 충분한 양의 조성물을 포함한다. 실제로, 이것은 전제적으로 식품에 존재하는 얼지 않은 물이 적어도 0.1% w/w의 양과 동등한 것이다.
사용 수준은 특정 식품, 용도 및 냉동 후 음식 질감을 보존하는데 필요한 물의 정도에 의존할 것이다.
전체 제품의 약 0.1% 정도로 적은 얼지 않은 물의 양은 마이크로파 오븐에서 가열되었을 때 빠르고 균일하게 해동되는 제품을 제공한다. 이런 고른 해동은 식품에 개선된 질감을 제공한다. 본 발명에 따라서 0.1%의 얼지 않은 물을 얻기 위해서는 약 0.20%의 PGE가 필요하다. 정확한 유화제 양은 유화제의 성질에 의존할 것이며, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 0.14%의 Dimodan® MO90 또는 0.14%의 Grindsted® PGE O70(Danisco, 덴마크)가 동일한 효과를 야기할 것이다.
바람직하게, 식품은 적어도 0.1% w/w의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 적어도 0.2% w/w의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 적어도 0.3% w/w의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 적어도 0.4% w/w의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 적어도 0.5% w/w의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다.
바람직하게, 식품은 10% w/w 미만의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 5% w/w 미만의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 4% w/w 미만의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다. 바람직하게, 식품은 3% w/w 미만의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다.
바람직하게, 식품은 0.1 내지 5% w/w, 더 바람직하게 0.5 내지 3% w/w의 양으로 본 발명의 조성물을 포함한다.
식품에 본 발명의 조성물을 적용하는 방식은 해당 식품의 성질에 좌우될 것이다. 예를 들어, 식품이 주변 온도에서 액체 또는 반액체라면, 조성물은 그것과 식품을 혼합함으로써 간단히 혼입될 수 있다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 물, 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 유화제가 개별적으로 식품에 첨가될 수 있다. 물이 첨가되고, 이어서 본 발명에 따른 폴리펩티드와 유화제가 첨가되거나, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 유화제가 첨가되고, 이어서 물이 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 유화제 및 물은 식품에 첨가되기 전에 조합되는 것이 바람직하다.
또는 달리, 조성물은 식품 제조 공정 도중의 어떤 지점에서 혼입될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 식품의 표면에 분무될 수 있다. 조성물은 식품에 주사될 수 있다(예를 들어, 가금류, 육류 또는 어류의 경우).
당업자는 이런 혼입을 가장 잘 달성할 수 있는 경우를 판단할 수 있을 것이다.
바람직하게, 식품은 저지방 스프레드, 마요네즈, 요구르트, 제과소, 마가린, 재구성 과일, 잼, 과일 제조물, 과일소, 리플, 과일 소스, 과일 스튜, 커피 표백제, 인스턴트 과일 디저트, 당과(예를 들어, 마쉬멜로우), 감자 베이스 식품(예를 들어, 칩, 프렌치 프라이 및 크로켓), 준비된 음식(예를 들어, 캐서롤 및 스튜) 및 파인푸드(예를 들어, 샐러드 드레싱을 비롯한 드레싱; 케찹, 비네그레트 드레싱 및 수프)로부터 선택된다. 식품은 음료, 생고기, 요리된 고기, 생 가금류 제품, 요리된 가금류 제품, 생 해산물 제품, 요리된 해산물 제품을 포함하는 생, 가공된 또는 저온살균된 식품[생 또는 요리된 고기, 가금류 및 해산물 제품], 소시지, 프랑크프루트, 바로 먹을 수 있는 음식, 파스타 소스, 저온살균된 수프, 매리네이드, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 치즈 스프레드, 가공 치즈, 유제품 디저트, 향을 가한 밀크, 크림, 발효된 유제품, 치즈, 버터, 응축 밀크 제품, 치즈 스프레드, 저온살균된 액체 난, 아이스크림 믹스, 대두 제품, 저온살균된 액체 난, 당과 제품, 과일 제품, 및 지방 베이스 또는 물-함유 소를 채운 식품일 수 있다. 식품은 빵, 케이크, 파인 베이커리 및 도우와 같은 제과 제품일 수 있다.
본 발명에 따른 화장품 및 피부과 조성물
또한, 본 발명은 선택적으로 결빙방지 폴리펩티드 및 결빙방지 당단백질로부터 선택된 하나 이상의 추가 폴리펩티드와 조합하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 화장품 또는 피부과 제제를 제공한다.
상기 제제는 본 발명에 따른 폴리펩티드만을 포함할 수도 있고, 또는 적어도 하나의 추가 결빙방지 폴리펩티드를 포함할 수도 있다. 또한, 조성물은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 함께 적어도 하나의 결빙방지 당단백질을 포함할 수 있다.
상기 제제에서, 제제 중 본 발명에 따른 폴리펩티드는 제제의 총 중량에 기초하여 0.0001중량% 내지 50중량%의 농도, 예를 들어 0.001중량% 내지 50중량%의 농도, 0.1중량% 내지 10중량%의 농도, 또는 0.1중량% 내지 1중량%의 농도로 존재할 수 있다.
결빙방지 폴리펩티드 및 결빙방지 당단백질로부터 선택된 하나 이상의 추가 폴리펩티드가 본 발명에 따른 폴리펩티드와 함께 제제에 존재하는 경우, 폴리펩티드의 총량은 제제의 총 중량에 기초하여 0.0001중량% 내지 50중량%의 양일 수 있으며, 예를 들어 0.001중량% 내지 50중량%, 0.1중량% 내지 10중량%, 또는 0.1중량% 내지 1중량%의 농도일 수 있다.
바람직하게, 적어도 하나의 추가 결빙방지 폴리펩티드는 타입 AFP 1, AFP 2, AFP 3 및 AFP 4로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 예를 들어 슈도플루로넥테스 아메리카누스, 미옥소세팔루스 스코피우스, 미옥소세팔루스 아에나에우스 및/또는 미옥소세팔루스 스코피오데스에 의해 합성되는 타입 AFP 1의 적어도 하나의 폴리펩티드, 헤미트립테루스 아메리카누스, 오스메루스 모닥스 및/또는 클루피아 하렌구스 하렌구스에 의해 합성되는 타입 AFP 2의 적어도 하나의 폴리펩티드, 마크로조아세스 아메리카누스, 리고필라 디아보미, 리코데스 폴라리스 및/또는 "울프 피쉬" 아나리카스 루푸스에 의해 합성되는 타입 3의 적어도 하나의 폴리펩티드, 및/또는 미옥소세팔루스 옥토데심스피노시스에 의해 합성되는 타입 AFP 4의 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게, 적어도 하나의 결빙방지 당단백질은 트레마토마스 보르그레빈키, 디소스티쿠스 마우소니, 보레오가두스 사이다 및/또는 가두스 모후아에 의해 합성되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 제제 중 하나 이상의 폴리펩티드의 적어도 일부분은 캡슐화될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및 슈도플루로넥테스 아메리카누스, 미옥소세팔루스 스코피우스, 미옥소세팔루스 아에나에우스, 미옥소세팔루스 스코피오데스, 헤미트립테루스 아메리카누스, 오스메루스 모닥스, 클루피아 하렌구스 하렌구스, 마크로조아세스 아메리카누스, 리고필라 디아보니, 리코데스 폴라리스, 아나리카스 루푸스, 미옥소세팔루스 옥토데심스피노시스, 트레마토마스 보그레빈키, 디소스티쿠스 마우소니, 보레오가두스 사이다, 및 가두스 모후아 중 적어도 하나에 의해 합성되는 결빙방지 폴리펩티드 및 결빙방지 당단백질로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 화장품 또는 피부과 제제를 포함한다.
바람직하게, 화장품 또는 피부과 제제에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 총량은 제제의 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 50중량%, 예를 들어 0.1중량% 내지 10중량%의 농도에 이른다. 바람직하게, 화장품 또는 피부과 제제에서 폴리펩티드의 총량은 제제의 총 중량을 기준으로 0.001중량% 내지 50중량%, 예를 들어 0.1중량% 내지 10중량%의 농도에 이를 수 있다.
또한, 본 발명은 o/w 크림, w/o 크림, w/o/w 크림, o 크림, w/o 에멀젼, 수분산물, 젤 크림, w/o 스틱 또는 o 스틱이고, 다양한 양태를 포함해서, 본 발명의 제제를 포함하는 화장품 또는 피부과 제품을 제공한다.
또한, 본 발명은 바람직하지 않은 피부 상태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드와 선택적으로 하나 이상의 폴리펩티드를 피부의 적어도 일부분에 도포하는 단계를 포함하며, 폴리펩티드는 결빙방지 폴리펩티드 및 결빙방지 당단백질로부터 선택된다.
한 양태에서, 바람직하지 않은 피부 상태는 피부 염증, 색소형성 장애, 외부요인 및 내부요인에 의한 피부 노화의 증상 및/또는 UV 선에 의한 피부 손상을 포함할 수 있다.
화장품 및 피부과 제제의 기술 분야에서, 용어 "결빙방지 폴리펩티드"는 극한의 온도 조건에서도 생물이 중요한 세포 구조를 기능적으로 활성으로 유지할 수 있도록 하는 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용된다. 이들의 기능의 관점에서, 이런 의미에서 "결빙방지 폴리펩티드"는 또한 세포 수준에서는 "동상-보호 화합물"을 나타낸다.
본 발명에 따른 제제가 선행 기술의 제제보다 추위로 인한 피부의 구조 및 세포 손상에 대해 더 잘 보호하고, 피부의 장벽 특성을 더 잘 유지하거나 회복하고, 피부 건조에 더 잘 투쟁하고, 색체변색에 대해 더 잘 작용하고, 염증 피부 상태에 대해 더 잘 작용하고, 피부 노화에 대해 더 잘 작용하고, 환경적 영향에 대해 피부를 더 잘 보호한다는 것을 당업자는 예측할 수 없었다.
선택적인 추가 결빙방지 폴리펩티드(AFP) 및/또는 결빙방지 당단백질(AFGP)과 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 화장품 또는 국소 피부과 제제의 사용은, 선택적인 추가 AFP 및/또는 AFGP와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드의 유효 함량에서, 세포 효소의 최적 온도의 손실을 통하여 세포 및 세포외 공간의 세포 생리학에 변화를 야기하는 극명한 기후- 및 날씨-유래 온도 강하로 인해 손상되는, 추위로 인한 피부의 구조 및 세포 손상, 예를 들어 추위, 바람 및/또는 UV 광에 의해 유발된 피부 손상, 피부 홍반 및 피부가 당기는 느낌 및 증가된 감각 민감성, 온도-민감성 피부, 환경 스트레스(온도 변화 및 UV 광, 흡연, 스모그, 반응성 산소 종, 자유 라디칼로 인한)로 인한 피부, 입술 및 코와 구강 점막 그리고 피부 부속기관의 불리한 변화의 효과적인 치료와 예방을 가능하게 한다.
선택적인 추가 AFP 및/또는 AFGP와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사용 또는 화장품 또는 국소 피부과 제제의 사용은, 선택적인 추가 AFP 및/또는 AFGP와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드의 유효 함량에서, 피부 조기 노화의 징표인 결함성, 민감성 또는 저활성 피부 상태 또는 결함성, 민감성 또는 저활성 피부 부속기관의 상태(예를 들어, 주름, 노화에 따른 각질, 실핏줄확장증) 및/또는 환경 유발된(흡연, 스모그, 반응성 산소 종, 자유 라디칼), 특히 광-유발된 피부 및 피부 부속기관의 부정적인 변화, 광-유발된 피부 손상, 색소침착 장애, 민감성, 자극성 및 가려운 피부, 건조 피부 상태 및 각질층 장벽의 장애, 탈모 및 개선된 모발 성장, 피부 노화의 징후, 예를 들어 주름 및 감소된 피부 재생, 염증 피부 상태, 및 아토피성 습진, 지루성 습진, 다형성 광피부병, 건선, 백반증, 민감성 또는 자극성 피부의 진정, 콜라겐, 히알루론산 및 엘라스틴 합성의 자극, 건강한 피부의 정상 히알루론산 및 글리코사미노글리칸 함량의 변화, 피부의 세라마이드 합성의 자극, 세포내 DNA 합성의 자극, 특히 결함성 또는 저활성 피부 상태인 경우, 세포 재생 및 피부 재생 증가, 피부 자체의 보호 및 수선 기전 증가(예를 들어, 기능장애 효소, DNA, 지질, 폴리펩티드에 대해), 세포-세포 통신 결합 감소, 민감성 또는 저활성 피부 상태 또는 결함, 민감성 또는 저활성 피부 부속기관의 상태, 세라마이드, 건강한 피부의 지질 및 에너지 대사의 변화, 지질 및 폴리펩티드 퍼옥시드화의 변화, 생리학적 표피통과 물 손실의 변화, 피부 수화의 감소, 피부의 정상 삼투조절 및 수분 함량의 감소, 천연 보습인자 함량의 변화, DNA 손상 및 내인성 DNA 손상 기전의 감소, 메탈로프로테이나제 및/또는 다른 프로테아제의 활성화 또는 이들 효소의 상응하는 내인성 억제인자의 억제, 건강한 피부의 연결조직 구성물의 정상 번역-후 변형과의 편차, 모발 및 모발 영역에서 비듬 형성, 피부 취약성, 탄력 손실 및 피부 피로, 정상 각질세포 증식의 증가, 예를 들어 피부 주름 및 흉터를 감소시키는데 사용되는 레이저 및 마모성 치료의 국소 적용의 경우 치료-전 및 치료-후에 자연적 재생 및 피부 및 모발의 구조 감소, 결과의 피부 자극의 상쇄 및 손상된 피부에서 재생 과정의 촉진에 있어서 이들을 위한 치료 및 예방에 효과적이다.
따라서, 염증성 피부 상태 및 아토피성 습진의 예방 및 치료 및/또는 민감한 건성 피부의 소인이 있는 경우 피부 보호를 위해서 선택적으로 추가의 AFP 및/또는 AFGP와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사용은 또한 본 발명에 따른다.
따라서, 색소침착 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 화장품 또는 피부과 제제의 제조를 위한 화장품 또는 피부과 제제의 사용이 또한 본 발명에 따른다.
따라서, 고유 및/또는 외부 피부 노화 증상의 치료 및/또는 예방 및 피부에 대한 자외선의 유해한 효과의 치료 및 예방을 위한 화장품 또는 피부과 제제의 제조를 위한 제제의 사용이 또한 본 발명에 따른다.
따라서, 세라마이드 생체합성을 위한 화장품 또는 피부과 제제의 생산을 위한 선택적으로 추가의 AFP 및/또는 AFGP와 함께 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사용이 또한 본 발명의 양태이다.
또한, 피부의 장벽 기능을 강화하기 위한 화장품 또는 피부과 제제의 제조를 위한 AFP 및/또는 AFGP의 사용이 또한 본 발명의 다른 양태이다.
본 발명에 따른 화장품 또는 피부과 제제는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 선택적으로 추가의 AFP 및/또는 AFGP와 함께 또는 인용된 AFP 및/또는 AFGP의 둘 이상의 조합과 함께 제제의 총 중량을 기준으로 바람직하게 0.0001중량% 내지 50중량%, 특히 바람직하게 0.01중량% 내지 10중량%를 함유한다.
본 발명에 따라서, 통상의 항산화제가 본 발명에 따른 활성 물질 조합을 함유하는 제제에 사용될 수 있다.
유리하게 항산화제는 아미노산(예를 들어, 글리신, 히스티딘, 티로신, 트립토판, [베타]-알라닌) 및 유도체, 이미다졸(예를 들어, 우로칸산) 및 유도체(예를 들어, 안세린), 카로테노이드, 카로텐(예를 들어, [알파]-카로텐, [베타]-카로텐, 리코펜) 및 유도체, 리포산 및 유도체(예를 들어, 디히드로리포산), 아우로티오글루코오스, 프로필티오우라실 및 다른 티올(예를 들어, 티오레독신, 글루타티온, 시스테인, 시스틴, 시스타민 및 글리세롤, N-아세틸, 메틸, 에틸, 프로필, 아밀, 부틸 및 라우릴, 팔미토일, 올레일, [감마]-리놀레일, 콜레스테릴 및 이들의 글리세릴 에스테르), 디라우릴 티오디프로피오네이트, 디스테아릴 티오디프로피오네이트, 티오디프로피온산 및 유도체(에스테르, 에테르, 펩티드, 리피드, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 및 염) 및 술폭시민 화합물(예를 들어, 부티오닌, 술폭시민, 호모시스테인 술폭시민, 부티오닌 술폰, 펜타-, 헥사- 및 헵타티오닌 술폭시민)(매우 낮은 허용량, 예를 들어 pmol 내지 μmol/kg), 및 추가의 (금속) 킬레이트제(예를 들어, [알파]-히드록시 지방산, 팔미트산, 피트산, 락토페린), [알파]-히드록시산(예를 들어, 시트르산, 락트산, 말산), 흄산, 바일산, 바일 추출물, 빌리루빈, 빌리베르딘, EDTA, EGTA 및 유도체, 불포화 지방산 및 유도체(예를 들어, [감마]-리놀렌산, 리놀레산, 올레산), 엽산 및 유도체, 알라닌 디아세트산, 플라보노이드, 폴리페놀, 카테콜, 비타민 C 및 유도체(예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, Mg-아스코르빌 포스페이트, 아스코르빌 아세테이트), 토코페롤 및 유도체(예를 들어, 비타민 E 아세테이트), 및 벤조인 수지의 코니페릴 벤조에이트, 루틴산 및 유도체, 페룰산 및 유도체, 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸화 히드록시아니솔, 노르디히드로구아이악산, 노르디히드로구아이아레트산, 트리히드록시부티로페논, 우르산 및 유도체, 만노스 및 유도체, 아연 및 유도체(예를 들어, ZnO, ZnSO4), 셀레늄 및 유도체(예를 들어, 셀레노메티오닌), 스틸벤 및 유도체(예를 들어, 스틸벤 옥시드, 트랜스-스틸벤 옥시드) 및 본 발명에 따라서 적합한 언급된 활성 성분들의 유도체(염, 에스테르, 에테르, 당, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 펩티드 및 지질)의 군으로부터 선택된다.
제제 중 항산화제(하나 이상의 화합물)의 양은 제제의 총 중량을 기준으로 바람직하게 0.001중량% 내지 30중량%, 특히 바람직하게 0.05중량% 내지 20중량%, 특히 바람직하게 1중량% 내지 10중량%이다.
이에 더하여, 용융 왁스를 사용해서 소위 말하는 고체 지질 나노부분으로서 본 발명에 따른 활성 성분을 캡슐화하는 것이 유리할 수 있으며, 왁스는 제한되지는 않지만 특히 에스테르 왁스, 트리글리세리드 왁스 또는 탄화수소 왁스로부터 선택될 수 있다. 이에 더하여, 예를 들어, 특히 고도 가교 폴리메타크릴레이트 및/또는 셀룰로오스 트리아세테이트 및/또는 폴리(옥시메틸우레아), 나일론, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 젤라틴 및 폴리올레핀으로 제조된 외피를 가진 코어/외피 입자에 기초하여 중합체 내에 본 발명에 따른 활성 성분을 캡슐화하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명에 따라서 사용된 활성 성분 또는 본 발명에 따라서 사용된 활성 성분의 유효량을 가진 화장품 또는 국소 피부과 제제를 사용한 예방 또는 화장 또는 피부과 치료는 본 발명에 따라서 사용된 활성 성분 또는 본 발명에 따라서 사용된 활성 성분의 유효량을 가진 화장품 또는 국소 피부과 제제를 침범된 피부 영역에 도포함으로써 일반적인 방식으로 수행될 수 있다.
본 발명에 따라서 사용된 활성 성분은 다양한 형태를 취할 수 있는 통상의 화장품 및 피부과 제제에 혼입되는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 이들은, 예를 들어, 용액, 유중수(W/O) 에멀젼 타입 또는 수중유(O/W) 에멀젼 타입 또는 유-수-유(O/W/O) 에멀전 타입, 수분산물 또는 유분산물, 젤, Pickering 에멀젼, 고체 스틱 또는 에어로졸일 수 있다.
본 발명의 취지에 맞는 본 발명에 따른 에멀젼은, 예를 들어 크림, 로션, 화장용 밀크, 및 스틱의 형태인 것이 유리하며, 예를 들어 지방, 오일, 왁스 및/또는 다른 지방 물질과 물 및 이런 타입의 제제에 통상 사용되는 하나 이상의 유화제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 취지에 있어서, 본 발명에 따라서 사용되는 활성 성분을 피부 및 모발의 세정 및 치료용 수성 시스템 또는 계면활성제 제제에 혼입하는 것이 가능하며 유리하다.
물론 당업자는 통상의 보조제와 첨가제를 사용하지 않은 화장품 조성물을 요구하는 것은 거의 상상할 수 없다는 것을 알고 있다. 이들의 예는 빌더, 필러, 향수, 염료, 유화제, 추가 활성 성분, 예를 들어 비타민 또는 폴리펩티드, 광보호제, 안정제, 방충제, 알코올, 물, 염, 및 항균, 가수분해 또는 각질분해 활성 물질 등을 포함한다.
상응하는 요건은 약제의 조제에 필요한 변경을 가하여 적용한다.
본 발명의 취지에 따른 약제용 국소 조성물은 하나 이상의 의약을 유효 농도로 포함한다. 간단히 하기 위하여, 화장품 용도와 약제용 용도 및 상응하는 제품들 사이의 명확한 차이에 대해서는 독일연방공화국의 법률조항을 참조한다(예를 들어, Cosmetics Directive, Foods and Drugs Act).
이와 관련하여, 본 발명에 따라서 사용되는 활성 성분을 다른 취지를 위하여 다른 활성 성분을 이미 포함하고 있는 제제에 첨가제로서 첨가하는 것도 마찬가지로 유리하다.
따라서, 본 발명의 취지에 있어서, 화장품 또는 국소 피부과 조성물은 이들의 배합에 따라서, 예를 들어 피부보호 크림, 세정 밀크, 선스크린 로션, 영양 크림, 데이 크림이나 나이트 크림, 입술관리 스틱, 코 스프레이 등으로 사용될 수 있다. 어떤 예에서, 제약 제제의 베이스로서 본 발명에 따른 조성물을 사용하는 것이 가능하며 유리하다.
또한, 본 발명의 취지에 있어서, 주요 목적이 햇빛에 대해 보호하는 것은 아니지만 UV 보호 물질을 일정량 가진 화장품 및 피부과 제제를 제공하는 것이 유리하다. 따라서, 예를 들어, UVA 및/또는 UVB 필터 물질이 일반적으로 데이 크림 또는 메이크업 제품에 혼입된다. 또한, 항산화제와 마찬가지로 UV 보호 물질과 원한다면 보호제가 제제를 열화로부터 효과적으로 보호한다. 또한, 화장품 및 피부과 제제는 선스크린의 형태인 것이 유리하다.
따라서, 본 발명에 따른 제제는, 본 발명에 따른 하나 이상의 활성 성분 조합에 더하여, 바람직하게는 추가로 적어도 하나의 추가 UVA 필터 물질 및/또는 UVB 필터 물질을 포함한다. 반드시 그렇지는 않지만 제제는 또한 선택적으로 UV 필터 물질로서 하나 이상의 유기 및/또는 무기 안료를 포함하며, 이것은 수성상 및/또는 오일상으로 존재할 수 있다.
바람직한 무기 안료는 물에서 불용성이거나 약간 가용성인 금속 산화물 및/또는 다른 금속 화합물이며, 특히 티탄(TiO2), 아연(ZnO), 철(예를 들어, Fe2O3), 지르코늄(ZrO2), 규소(SiO2), 망간(예를 들어, MnO), 알루미늄(Al2O3), 세륨(예를 들어, Ce2O3)의 산화물, 상응하는 금속들의 혼성 산화물, 및 이러한 산화물의 혼합물이다.
본 발명에 따라서, 이러한 안료는 유리하게 표면-처리("코팅")될 수 있으며, 이로써 예를 들어 이러한 안료의 양쪽성 또는 소수성 특성이 형성되거나 보유되어야 한다. 이런 표면 처리는 공지된 방법에 의해서 안료에 얇은 소수성 층을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라서, 예를 들어 이산화티탄 안료는 옥틸실라놀로 코팅되는 것이 유리하다. 적합한 이산화티탄 입자는 Degussa에서 상표명 T805로 입수할 수 있다. 또한, 알루미늄 스테아레이트로 코팅된 TiO2 안료가 특히 유리하며, 예를 들어 이들은 TAYCA로부터 상표명 MT 100 T로 입수할 수 있다.
무기 안료의 더 유리한 코팅제는 트리메틸실록시 단위로 말단 봉쇄된 완전히 메틸화된 선형 실록산 중합체의 혼합물인 디메틸폴리실록산(또한: 디메티콘)을 포함한다. 본 발명의 취지에 있어서, 특히 유리한 안료는 이런 방식으로 코팅된 산화아연 안료이다.
또한, 시메티콘이라고도 하는 디메틸폴리실록산, 특히 200 내지 350개 디메틸실록산 단위의 평균 사슬 길이를 가진 디메틸폴리실록산과 실리카겔의 혼합물에 의한 무기 안료의 코팅이 유리하다. 무기 안료가 수산화 알루미늄 또는 수화된 산화 알루미늄(또한 알루미나, CAS No.: 1333-84-2)로 추가로 코팅된다면 특히 유리하다. 특히 유리한 것은 시메티콘과 알루미나로 코팅된 이산화티탄이며, 코팅제가 물을 포함하는 것도 가능하다. 이것의 한 예는 Merck에서 상표명 Eusolex T200으로 입수할 수 있는 이산화티탄이다.
본 발명의 취지에 따른 유리한 무기 안료는 2,2'-메틸렌비스-(6-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페놀)[INCI: 비스옥틸트리아졸]을 포함하며, 이것은 CIBA Chemikalien GmbH로부터 상표명 Tinosorb(R) M으로 입수할 수 있다.
유리하게, 본 발명에 따른 제제는 UVA 및/또는 UVB 범위에서 UV 선을 흡수하는 물질을 함유하며, 이로써 필러 물질의 총량은 제제의 총 중량을 기준으로, 예를 들어 0.1중량% 내지 30중량%, 바람직하게 0.5 내지 20중량%, 특히 1.0 내지 15중량%이며, 이로써 전 범위의 자외선에 대해 모발 또는 피부를 보호하는 화장품 제제가 제공된다. 이들은 또한 모발이나 피부용의 선스크린으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 취지를 위한 더 유리한 UVA 필러는 디벤조일메탄 유도체, 특히 4-(tert-부틸)-4'-메톡시디벤조일메탄(CAS No. 70356-09-1)을 포함하며, 이것은 상표명 Parsol® 1789로 Givaudan에서 그리고 상표명 Eusolex® 9020으로 Merck에서 판매된다.
더 유리한 UVA 필러 물질은 페닐렌-1,4-비스-(2-벤즈이미다질)-3,3',5,5'-테트라술폰산 및 염들, 특히 상응하는 나트륨, 칼륨 또는 트리에탄올암모늄 염, 특히 INCI 이름이 비스이미다질레이트인 페닐렌-1,4-비스-(2-벤즈이미다질)-3,3',5,5'-테트라술폰산 비스-나트륨염을 포함하며, 이것은 예를 들어 Haarmann & Reimer로부터 상표명 Neo Heliopan AP로 입수할 수 있다.
또한, 1,4-디(2-옥소-10-술포-3-보르닐리덴메틸)벤젠 및 염들(특히, 상응하는 나트륨, 칼륨 또는 트리에탄올암모늄 염)이 유리하며, 이것은 벤젠-1,4-디(2-옥소-3-보르닐리덴메틸-10-술폰산)이라고도 한다.
또한, 본 발명의 취지를 위한 유리한 UV 필러 물질은 소위 말하는 브로드밴드 필러로서, 즉 UVA와 UVB 선을 모두 흡수하는 필러 물질이다.
유리한 브로드밴드 필러 또는 UVB 필러 물질은, 예를 들어 비스-레조르시닐트리아진 유도체를 포함한다. 2,4-비스{[4-(2-에틸헥실옥시)-2-히드록시페닐}-6-(4-메톡시페닐)-1,3,5-트리아진(INCI: Aniso Triazine)이 특히 바람직하며, 이것은 CIBA-Chemikalien GmbH에서 상표명 Tinosorb® S로 입수할 수 있다.
높은 또는 매우 높은 UVA 보호를 특징으로 하는 본 발명의 취지를 위한 특히 유리한 제제는 바람직하게 몇 가지 UVA 및/또는 브로드밴드 필러, 특히 디벤조일메탄 유도체[예를 들어, 4-(tert-부틸)-4'-메톡시디벤조일메탄], 벤조트리아졸 유도체[예를 들어, 2,2'-메틸렌-비스-(6-(2H-벤조트리아졸-2-일)-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀], 페닐렌-1,4-비스-(2-벤즈이미다질)-3,3',5,5'-테트라술폰산 및/또는 염들, 1,4-디(2-옥소-10-술포-3-보르닐리덴메틸)-벤젠 및/또는 염들 및/또는 2,4-비스-{[4-(2-에틸헥실옥시)-2-히드록시]-페닐}-6-(4-메톡시페닐)-1,3,5-트리아진을 개별적으로 또는 서로 조합하여 함유한다.
본 발명에 따라서 유리하게 사용될 수 있는 다른 광 보호 필러 물질은 에틸헥실 2-시아노-3,3-디페닐아크릴레이트(옥토크릴렌)이며, 이것은 BASF로부터 상표명 Uvinul® N 539로 입수할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 제제에서 중합체-결합 또는 중합성 UV 필러 물질, 특히 WO-A-92/20690에 설명된 것들을 사용하는 것이 유리하게 고려될 수 있다.
이에 더하여, 선택적으로 본 발명에 따른 화장품 또는 피부과 제제에 추가의 UVA 및/또는 UVB 필러, 예를 들어 어떤 살리실란 유도체, 예를 들어 4-이소프로필벤질 살리실레이트, 2-에틸헥실 살리실레이트(-옥틸 살리실레이트) 및 호모멘틸 살리실레이트를 혼입하는 것이 유리할 수 있다.
물론 본 발명의 취지를 위해 사용될 수 있는 인용된 UV 필러의 리스트가 제한을 의도하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제제는 유리하게 UVA 및/또는 UVB 범위의 UV 선을 흡수하는 물질을 제제의 총 종량에 기초하여, 예를 들어 0.1중량% 내지 30중량%, 바람직하게 0.5중량% 내지 20중량%, 특히 1.0중량% 내지 15.0중량%의 총량으로 함유하며, 이로써 전 범위의 자외선으로부터 모발이나 피부를 보호하는데 이용할 수 있는 화장품 제제가 만들어진다. 또한, 이들은 모발이나 피부용의 선스크린 조성물로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화장품 및 피부과 제제는 화장품 활성제, 보조제 및 첨가제를 포함할 수 있으며, 이러한 제제에서 통상 사용되는 대로, 예를 들어 항산화제, 보존제, 살균제, 향수, 거품방지제, 염료, 착색 안료, 증점제, 계면활성제, 유화제, 연화제, 보습제, 및/또는 습윤제, 지방, 오일, 왁스 및 화장품 또는 피부과 제제의 다른 통상의 구성요소들, 예를 들어 알코올, 폴리올, 중합체, 거품안정제, 전해질, 유기용매 또는 실리콘 유도체를 포함할 수 있다.
만일 본 발명에 따른 화장품 또는 피부과 제제가 용액 또는 에멀젼 또는 분산물의 형태로 존재한다면, 다음의 용매가 사용될 수 있다: 물 또는 수성 용액; 오일, 예를 들어 카르프산 또는 카프릴산의 트리글리세리드, 바람직하게는 피마자유; 지방, 왁스 및 다른 천연 및 합성 지질, 바람직하게 저 탄소 알코올, 예를 들어 이소프로판올, 프로필렌글리콜 또는 글리세롤에 의한 지방산의 에스테르, 또는 저 탄소 알칸산 또는 지방산에 의한 지방 알코올의 에스테르; 저 탄소 알코올, 디올 또는 폴리올 및 이들의 에테르, 바람직하게 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜 모노에틸에테르 또는 모노부틸에테르, 프로필렌글리콜 모노메틸에테르, 모노에틸에테르 또는 모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜 모노메틸에테르 또는 모노에틸에테르, 및 유사한 산물들.
특히, 상기 언급된 용매들의 혼합물이 사용될 수 있다. 알코올 용매인 경우 물이 추가 구성요소일 수 있다.
본 발명에 따른 에멀젼, 올레오겔 또는 히드로- 또는 리포분산물의 오일상은 유리하게 3 내지 30개 C 원자의 사슬 길이를 가진 포화 및/또는 불포화, 분지 및/또는 비분지 알칸카르복실산 및 3 내지 30개 C 원자의 사슬 길이를 가진 포화 및/또는 불포화, 분지 및/또는 비분지 알코올의 에스테르, 3 내지 30개 C 원자의 사슬 길이를 가진 방향족 카르복실산 및 포화 및/또는 불포화, 분지 및/또는 비분지 알코올의 에스테르로부터 선택될 수 있다. 이 경우에, 이러한 에스테르 오일은 유리하게 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 스테아레이트, 이소프로필 올레에이트, n-부틸 스테아레이트, n-헥실 라우레이트, n-데실 올레에이트, 이소옥틸 스테아레이트, 이소노닐 스테아레이트, 이소노닐 이소노나노에이트, 2-에틸헥실 팔미테이트, 2-에틸헥실 라우레이트, 2-헥실데실 스테아레이트, 2-옥틸도데실 팔미테이트, 올레일 올레에이트, 올레일 에우카트, 에우실 올레에이트, 에루실 에우카트, 및 이러한 에스테르의 합성, 반합성 및 천연 혼합물, 예를 들어 호호바 오일로부터 선택될 수 있다.
또, 오일상은 유리하게 분지 및 비분지 탄화수소 및 탄화수소 왁스, 실리콘 오일, 디알킬 에테르, 포화 또는 불포화, 분지 또는 비분지 알코올 및 지방산 트리글리세리드, 즉 8 내지 24개, 특히 12 내지 18개 C 원자의 사슬 길이를 가진 포화 및/또는 불포화, 분지 및/또는 비분지 알칸카르복실산의 트리글리세롤 에스테르로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 지방산 트리글리세리드는 유리하게 합성, 반합성 및 천연 오일, 예를 들어 올리브오일, 해바라기오일, 대두오일, 땅콩오일, 평지씨오일, 아몬드오일, 야자오일, 코코넛오일, 야자인오일 등으로부터 선택될 수 있다.
또한, 이러한 오일 및 왁스 성분들의 어떤 혼합물이 본 발명에 따라서 유리하게 사용될 수 있다. 적합하다면, 오일상의 유일한 지질 성분으로서 왁스, 예를 들어 세틸 팔미테이트를 사용하는 것이 유리할 수 있다.
오일상은 유리하게 2-에틸헥실 이소스테아레이트, 옥틸도데칸올, 이소트리데실 이소노나노에이트, 이소에이코산, 2-에틸헥실 코코에이트, C12-15 알킬 벤조에이트, 카프릴/카프르산 트리글리세리드, 디카프릴릴 에테르로부터 선택될 수 있다.
특히 유리한 혼합물은 C12-15 알킬 벤조에이트와 2-에틸헥실 이소스테아레이트의 혼합물, C12-15 알킬 벤조에이트와 이소트리데실 이소노나노에이트의 혼합물 및 C12-15 알킬 벤조에이트, 2-에틸헥실 이소스테아레이트 및 이소트리데실 이소노나노에이트의 혼합물이다.
탄화수소 중에서도 액체 파라핀, 스쿠알란 및 스쿠알렌이 본 발명에 따라서 유리하게 사용될 수 있다.
오일상은 고리형 또는 선형 실리콘 오일을 포함하거나, 이러한 오일로 전체적으로 구성되는 것이 더 유리할 수 있지만, 실리콘 오일(들)과는 별도로 추가 양의 다른 오일상 성분을 사용하는 것도 바람직하다.
시클로메티콘(옥타메틸시클로테트라실록산)이 본 발명에 따라서 사용되는 실리콘 오일로서 유리하게 사용된다. 그러나, 다른 실리콘 오일도 본 발명에 따라서 유리하게 사용될 수 있으며, 예를 들어 헥사메틸시클로트리실록산, 폴리디메틸실록산 및 폴리(메틸페닐실록산)이 있다.
또한, 특히 유리한 혼합물은 시클로메티콘과 이소트리데실 이소노나노에이트의 혼합물 및 시클로메티콘과 2-에틸헥실 이소스테아레이트의 혼합물이다.
적합하다면, 본 발명에 따른 제제의 수성상은 유리하게 저 탄소 알코올, 디올 또는 폴리올, 및 이들의 에테르, 바람직하게는 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌글리콜, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜 모노에틸에테르 또는 모노부틸에테르, 프로필렌글리콜 모노메틸에테르, 모노에틸에테르 또는 모노부틸에테르, 디에틸렌글리콜 모노메틸에테르 또는 모노에틸에테르 및 유사한 산물들을 포함할 수 있으며, 또한 저 탄소 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, 1,2-프로판디올, 글리세롤, 및 특히 이산화규소, 알루미늄 실리케이트, 다당류 및 이들의 유도체, 예를 들어 히알루론산, 잔탄 검, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 특히 유리하게는 폴리아크릴레이트, 특히 소위 말하는 Carbopol, 예를 들어 타입 980, 981, 1382, 2984 및 5984 Carbopol의 군으로부터의 폴리아크릴레이트로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 증점제가 각 경우에 개별적으로 또는 조합하여 포함될 수 있다.
본 발명에 따라서 사용될 수 있는 겔은 일반적으로 저 탄소 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, 1,2-프로판디올, 글리세롤 및 물, 또는 증점제 존재하의 상기 언급된 오일을 포함하며, 이것은 바람직하게는 오일-알코올 겔의 경우 이산화규소 또는 알루미늄 실리케이트이고, 바람직하게는 수성-알코올 또는 알코올성 겔의 경우 폴리아크릴레이트이다.
고체 스틱은, 예를 들어 천연 또는 합성 왁스, 지방 알코올 또는 지방산 에스테르를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장용 스틱으로서 사용되는 적합한 통상의 기본 재료는 액체 오일(예를 들어, 액체 파라핀, 피마자유, 이소프로필 미리스테이트), 반고체 구성성분(예를 들어, 석유, 라놀린), 고체 구성성분(예를 들어, 밀랍, 세레신 및 미세결정 왁스, 또는 오조세라이트) 및 고 용융점 왁스(예를 들어, 카나우바 왁스 및 칸델릴라 왁스)를 포함한다.
에어로졸 용기로부터 분무될 수 있는 본 발명에 따른 화장품 및/또는 피부과 제제에 적합한 추진제는 통상의 공지된 휘발성 액화 추진제, 예를 들어 탄화수소(프로판, 부탄, 이소부탄)이며, 이들은 개별적으로 또는 서로의 혼합물로서 사용될 수 있다. 압축 공기도 유리하게 사용될 수 있다.
물론 당업자는 에어로졸 제제의 형태로 본 발명을 실시하는데 원칙적으로 적합한 비독성 추진제가 있다는 사실에 익숙할 것이다. 그러나, 자연환경이나 다른 수반되는 환경에 대한 허용되지 않는 효과로 인해 이들, 특히 플루오로카본 및 플루오로클로로히드로카본(FCHC)의 사용을 하지 않는 것이 권장된다.
또, 본 발명에 따른 화장품 제제는 겔의 형태를 취할 수 있으며, 이것은 본 발명에 따른 활성 성분의 유효량과 종래부터 사용된 적합한 용매, 바람직하게 물뿐만 아니라 유기 증점제, 예를 들어 아라비아 검, 잔탄 검, 나트륨 알기네이트, 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 또는 무기 증점제, 예를 들어 알루미늄 실리케이트, 예를 들어 벤토나이트, 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜 스테아레이트 또는 폴리에틸렌글리콜 디스테아레이트의 혼합물을 포함한다. 겔은 증점제를, 예를 들어 0.1 내지 30중량%, 바람직하게는 0.5 내지 15중량%의 양으로 포함한다.
본 발명의 취지에 있어서, 본 발명에 따른 화장품 또는 피부과 제제가 추가의 활성 물질, 특히 천연 활성 물질 및/또는 이들의 유도체, 예를 들어 알파-리포산, 피토엔, D-바이오틴, 코엔자임 Q10, 알파-글루코실 루틴, 카니틴, 카노신, 오스몰라이트, 클로버 추출물, 호프 추출물 또는 호프-맬트 추출물을 함유하는 것이 특히 유리하다.
활성 성분(하나 이상의 물질)의 농도는 제제의 총 중량을 기준으로 0.0001중량% 내지 30중량%가 유리하다. 본 발명에 따른 화장품 또는 피부과 제제는 본 분야에 공지된 어떤 방법에 의해서 제조될 수 있다.
장기 및 조직 샘플의 치료
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 포함하는 조성물로 장기나 조직 샘플을 관류시킴으로써 이러한 장기와 조직 샘플, 또는 다른 생물학적 물질을 저온에서 보관하는 것이 가능해지며, 이로써 상기 조직, 장기, 세포 또는 다른 생물학적 물질에 결빙이 발생할 위험 없이 샘플의 열화나 변성이 방지된다. 많은 예에서, 장기 및 생물학적 조직에 대한 손상은 해당 장기나 조직에 결빙 상태가 발생하는 것이 원인이라기보다 발생할 수 있는 재결정화가 원인이다.
생물학적 물질, 장기 및 조직 샘플의 예들은, 제한되지는 않지만, 예를 들어 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 샘플, 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 하나 이상의 마이크로솜 또는 미셸을 포함하는 샘플, 전혈을 포함하는 샘플, 혈장을 포함하는 샘플, 혈소판을 포함하는 샘플, 적혈구를 포함하는 샘플, 정액을 포함하는 샘플, 생식체를 포함하는 샘플을 포함한다.
조직 배양 샘플은 동물 세포 및 인간 세포와 같은 포유류 세포, 설치류 세포 및 곤충 세포를 포함해서 어떤 형태의 생물학적 세포를 포함할 수 있다. 처리되는 장기는, 예를 들어 신장, 폐, 심장, 비장 또는 간일 수 있다. 따라서, 장기 또는 생물학적 샘플의 재결정화를 억제하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 장기 또는 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 폴리펩티드와 폴리펩티드가 장기 또는 생물학적 샘플의 재결정화를 방지할 수 있는 조건에서 접촉시키는 단계를 포함한다.
또, 장기 또는 생물학적 샘플의 보존을 개선하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 장기 또는 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 폴리펩티드와 폴리펩티드가 해당 장기 또는 생물학적 샘플과 접촉할 수 있는 조건에서 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 장기 또는 생물학적 샘플이 처리되지 않은 장기 또는 생물학적 샘플의 저장 온도와 비교하여 빙점하 온도에서 저장될 수 있다.
유리화에 기초한 새로운 방법이 최근에 개발되었다. 그러나, 이 방법은 생식체, 배아 또는 줄기세포의 해빙 동안 이완이 발생한다는 사실이 문제가 되며, 이것은 얼음 결정이 형성된다는 것을 의미한다. 해빙 과정 동안에 이들 얼음 결정은 재결정화 때문에 성장한다. 이 유리화 과정 동안 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드가 생식체, 배아 또는 줄기 세포가 존재하는 용매에 존재한다면, 결정 형성뿐만 아니라 결정 성장이 현저히 감소되거나, 또는 심지어 방지될 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 동결-보호 용도가 다음에 더 상세히 개시된다.
다른 양태에서, 본 발명은 고온, 저온 및 빙점하 온도를 비롯한 온도 이상과 같은 비생리학적 조건에 노출되었을 때 받을 수 있는 손상으로부터 세포 및 세포막을 보호하기 위한 방법에 관한 것이다. 유리화 조건 내에서 결빙 범위 이상의 온도뿐만 아니라 결빙 범위 이하의 온도를 포함해서, 얼음 형성을 수반하지 않는 광범한 조건에 걸쳐서 개선된 비율의 세포 생육성이 관찰된다. 지금까지 이들 폴리펩티드의 유일한 알려진 특성은 얼음 결정과 상호작용하는 능력이었다. 얼음 결정이 형성되는 조건에서, 출처 생물에서 이들이 자연적으로 발생하는 농도에서는 인간 세포와 함께 폴리펩티드를 사용함으로써 세포 손상이 감소하는 것이 아니라 오히려 악화된다는 것이 또한 발견되었지만, 낮은 농도를 사용하면 손상이 저하되고 생존율이 개선된다. 따라서, 폴리펩티드는 세포 현탁액, 조직 및 전체 장기의 보존 및 생육성 개선에 있어서 이점을 제공한다. 또한, 폴리펩티드는 포유류 세포막의 이온 채널을 차단하는 능력을 가진다는 것이 발견되었으며, 이로써 질환 상태의 치료에서 추가의 활용성이 제공된다.
본 발명은 인식되고는 있었지만 활용되지는 않았던 품질의 결빙방지 폴리펩티드와 세포 및 세포막과 상호작용하는 그들의 능력을 활용한다. 상호작용은 세포 현탁액 중의 각 세포, 조직 및 장기의 연결된 세포 덩어리, 및 혈관계에 퍼져 있는 세포 구조물을 포함한 광범한 구조의 세포막에 대해 일어난다. 상호작용은 유리한 작용으로서, 세포 생육성 및 생존율의 개선, 기능성의 연장, 세포 및 세포 조직의 안정성 및 구조 완전성, 불리한 조건에서 막 및 세포에 대한 구조 손상의 발생 감소, 및 세포막을 가로지른 이온 수송의 제어를 포함하는 다양한 이점을 세포막 및 이들 막과 결합된 세포 구조에 부여한다.
이들 상호작용의 유리한 효과는 얼음 결정의 존재하에 이들이 발생되는 것에 더하여 얼음 결정이 전혀 형성되지 않는 조건에서도 관찰되기 때문에, 다양한 타입의 상호작용은 얼음 결정 증식에 대한 이들 폴리펩티드의 공지된 효과와는 무관하다. 예를 들어, 극저온 온도에서부터 생리학적 온도를 꽤 넘는 온도 범위에서 이점이 관찰된다. 따라서, 본 발명은 생리학적 조건뿐만 아니라 비생리학적 조건을 포함하는 상황까지, 그리고 얼음 결정의 존재를 포함하는 상황뿐만 아니라 얼음 결정이 완전히 없는 상황까지 확대된다. 따라서, 생육성 세포 및 세포막에 대한 유리한 효과가 관찰되는 비생리학적 조건은 (i) 얼음 형성 가능성이 없는 물의 정상 결빙점(0℃) 이상 및 세포의 생리학적 온도 이하의 온도로 정의되는 저온 조건; (ii) 150K에서부터 약 4K까지 내려가는 것과 같은 유리 형성(또는 유리 전이) 온도 또는 그 이하의 온도 및 유리화를 촉진하고 결정화를 억제하는 유리화제의 존재로 정의되는 유리화 조건; (iii) 얼음 결정의 형성을 허용하는 정상 결빙점에서부터 약 4K까지 내려가는 온도와 같은 결빙 조건; (iv) 생리학적 온도를 최대 약 10℃ 넘는 생리학적 온도 범위의 온도와 같은 세포의 생리학적 온도 이상의 온도로 정의되는 저온 조건; 및 (v) 비생리학적 pH 및 생리학적 화학적 조성으로부터의 다른 변화된 조건과 같은 세포의 생리학적 화학적 환경과는 상이한 화학적 환경으로 정의되는 조건뿐만 아니라, 비생리학적 온도의 조건과 조합된 이러한 조건을 포함한다.
본 발명의 활용성은 세포막의 불안정성과 관련된 질환 및 세포막을 가로지른 비정상적 이온 수송을 일으키는 세포내 공간과 세포외 공간 사이의 이온 불균형과 관련된 질환과 같은 비정상적인 생리학적 조건까지의 확장을 목표로 한다. 이러한 거동의 예상치 못한 성질은 상피 세포의 칼슘 및 칼륨 이온 채널과 같은 이온 채널의 차단이 ATP 이온 펌프 및 카르바콜과의 상호작용을 비롯한 세포의 다른 대사기능에 의한 방해 없이 달성된다는 발견으로 강화된다. 또한, 본 발명은, 예를 들어 표피 조직을 회복, 보존 또는 수선하도록 디자인된 화장품 또는 의약의 사용을 통해서 정상 생리학적 조건에서는 세포에 이점을 제공한다.
본 발명은 동물 세포와 식물 세포를 모두 포함하여 광범한 살아 있는 세포에서 활용된다. 그러나, 본 발명과 관련된 특히 유례없는 관심의 대상은 포유류 세포, 조직 및 장기의 치료 및 보존에서 결빙방지 폴리펩티드의 이용이다. 천연 형태에서 이들 폴리펩티드는 비-포유류 종에만 존재하며, 이들 종과 포유류 종 사이에서 세포 및 막 구조에서의 차이뿐만 아니라 혈액 및 세포질 조성물에서의 차이가 현재 발견된 이점을 놀라운 예상외의 것으로 만든다. 따라서, 본 발명은 특히 포유류의 정상 생리학적 상태와 상이한 조건에 노출된 포유류 세포, 조직, 장기 및 생물에 적용하는 것에 활용되며 관심의 대상이다. 본 발명이 적용될 수 있는 세포의 예는 포유류 난모세포, 간세포, 적혈구 및 백혈구, 그리고 다양한 타입의 식물 세포들이다. 조직 및 장기의 예는 간, 심장, 및 신장 조직, 그리고 이들 장기 자체이다. 생물의 예는 배아, 자기-지속 전 동물, 식물 종자 및 전 식물이다.
본 발명으로부터 생기는 추가의 이점은 많으며 다양하다. 이들 중에는 극저온 온도로 동결하는 동안에 빠른 냉각 속도를 유지할 필요의 제거, 공지된 동결보호제보다 상당히 낮은 농도에서도 용액의 점도를 높이는 폴리펩티드의 능력, 및 동결시 폴리펩티드가 식품을 보존하는 능력이 포함된다. 본 발명의 다른 장점, 이점 및 용도는 이후의 설명으로부터 명백해질 것이다.
동결보존의 기술 분야에서 다음 용어들은 다음의 정의로서 사용된다:
세포, 조직, 장기 또는 생물에 대한 "비정상적" 또는 "비-생리학적 조건"은 정상 생리학적 조건과 상이한 조건을 말한다. 비정상적 또는 비-생리학적 조건은, 제한되지는 않지만, 세포, 조직 또는 장기의 원천인 건강한 생물, 또는 생물 자체의 정상 생리학적 온도보다 상당히 높거나 낮은 온도; 과량의 또는 정상 수준 이하의 이산화탄소, 산소, 무기염, 또는 유기 화합물; 건강한 생물의 pH보다 상당히 높거나 낮은 pH 값; 및 이들 조건의 조합을 포함한다.
"결빙방지 폴리펩티드", "결빙 방지 폴리펩티드"("AFP"), "결빙방지 당단백질" 및 "결빙방지 글리코펩티드"("AFGP")는 어떤 동물의 체액에서 발견되는 거대분자를 말하며, 이들은 일반적으로 물의 결빙점을 비속일적으로 감소시킨다는 공지된 특성을 가진다. 또한, 결빙방지 폴리펩티드, 폴리펩티드, 당단백질 및 글리코펩티드는 "열 이력 폴리펩티드"라고도 알려져 있는데, 왜냐하면 결빙이 발생하는 온도가 폴리펩티드의 어떤 속일적 특성으로 인해 일어날 수 있는 것보다 더 많은 정도까지 저하되는 한편, 용융 동안 얼음이 녹는 온도는 오직 속일적 거동에만 따라서 상당히 적게 저하되기 때문이다.
"극저온 온도"는 0℃ 이하의 온도를 말한다.
"결빙"은 물의 액체상에서 물의 고체상으로의 전이를 말한다.
"고온"은 세포, 조직, 장기 또는 생물의 정상 생리학적 온도보다 높은 온도를 말하며, 예를 들어 생리학적 온도를 약간 넘는 것에서부터 생리학적 온도의 최대 약 20℃ 이상, 바람직하게는 약 10℃ 이상, 더 바람직하게는 약 5℃ 이상의 생리학적 온도를 말한다.
"저온"은 세포, 조직, 장기 또는 생물의 정상 생리학적 온도보다 낮지만 고체상으로의 상전이가 일어날 만큼 충분히 낮지는 않은 온도를 말한다.
"분리되고 정제된"은 천연에서 발생한 생물로부터 추출되어 크로마토그래피와 같은 종래의 실험실 기술에 의해 바람직하게는 적어도 약 85%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%까지 농축된 분자 종을 말한다. 또한, 본 발명은 자연발생한 형태의 분자와 동일한, 매우 유사한 또는 상동성인 분자 구조를 가지며, 화학적 수단이나 재조합 DNA 기술에 의해 합성될 수 있는 분자에까지 확장된다.
"포유류"는 생물학에서 일반적으로 사용되는 용어로서, 예를 들어 돼지, 소, 토끼, 말 및 인간을 포함하여 어떤 온혈 포유류를 말한다.
"극지 어류 종"은 북극 및 남극환 내의 지방을 포함해서 지구의 극지 지방의 물에서 사는 냉혈 수생 동물, 특히 척추동물을 말한다. 본 발명과 관련하여 특히 관심 있는 극지 어류 종은 얼음을 가지게 되거나 얼음을 가진 상태로 물에서 유지되는 것들이다.
"침상체" 및 "침상형"은 결정 증식의 지배적인 방향이 c-축을 따라 있어서, 즉 기저면과 수직이어서 바늘 모양을 가진 결정을 형성하는 얼음 결정 및 얼음 결정 성장을 말한다.
"생육성"은 살아 있을 수 있고 생존할 수 있고 발육될 수 있다는 의미, 또는 정상 생리학적 조건으로 회복되었을 때, 또는 생식에 본래 유리한 조건에서 생식할 수 있다는 의미이다.
"유리화"는 결정질 얼음과는 달리 유리상, 즉 비-결정질 고체가 형성되는 방식으로 극저온 온도에서 고화되는 것을 말한다. "겉보기 유리화"는 현미경으로 육안 관찰하여 결정되는 유리화를 말한다. 생물학적 물질의 유리화는 일반적으로 글리세롤 및 프로필렌글리콜과 같은 다가 알코올이나 디메틸술폭시드와 같은 다른 화합물을 포함하는 다양한 동결보호제 또는 "유리화"제 중 어느 것을 물질에 도입함으로써 달성된다. 유리화제의 도입은 주로 비교적 고속의 냉각에 의해 달성된다. 이 경우 최적 속도는 시스템의 조성 및 열역학에 따라 다양하다. 대부분의 경우, 난자, 정자 및 배아와 같은 작은 비조직화된 세포에 대해서, 그리고 장기에 대해서 전형적인 냉각 속도는 일반적으로 약 100℃/분 내지 약 2,000℃/분, 바람직하게는 약 200℃/분 내지 약 1,750℃/분, 더 바람직하게는 약 700℃/분 내지 약 1,750℃분의 범위이다. 1,500℃분 정도의 속도가 일반적으로 사용된다.
본 발명의 실시에서, 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 일반적으로 액체 용액, 바람직하게 수성 용액의 형태로 사용된다. 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드는 개별적으로 또는 다른 폴리펩티드와 조합하여 사용될 수 있다. 폴리펩티드가 조합하여 사용될 때, 그것은 주로 출처 종에서 자연발생하는 생리학적 조합 내의 폴리펩티드를 사용하는 것이 가장 편리한데, 즉 이들이 추출되는 어류, 곤충 또는 다른 생물의 유체에서 발견되는 폴리펩티드 종과 동일한 혼합물 및 비율로 사용되는 것이 편리하지만, 유체의 다른 성분들과는 분리되어 상이한 용매나 용액에 재용해되어 사용되며, 아마도 총 농도는 자연 환경에서 존재하는 혼합물과는 상이할 것이다. 그러나, 어떤 경우, 출처 혼합물 중의 폴리펩티드를 단편화하고 선택하여 최적 방식으로 단편을 재조합함으로써 활성 및 효율이 개선될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 액체 용액에서 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드의 농도는 광범하게 변할 수 있지만, 어떤 경우에는 어떤 농도 범위에서 개선된 결과가 얻어질 수 있고, 어떤 경우에는 폴리펩티드 자체로 인한 손상을 피하기 위해 농도가 어떤 범위로 제한될 수도 있다. 그러나, 일반적으로, 폴리펩티드는 약 0.01 mg/mL 내지 약 80 mg/mL, 바람직하게 약 0.1 mg/mL 내지 약 60 mg/mL, 더 바람직하게 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 가장 바람직하게 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL의 농도로 사용될 것이다. 인간 세포에 사용될 경우, 특히 세포의 생리학적 온도 이하의 온도에서는, 바람직한 농도가 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL이고, 더 바람직한 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 3 mg/mL이다. 폴리펩티드가 조직의 생리학적 온도 이하의 온도에서 조직을 보호하기 위해 사용되는 용도에서, 바람직한 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 범위이고, 조직이 인간 조직인 경우, 바람직한 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 3 mg/mL의 범위이다. 폴리펩티드가 세포의 생리학적 온도 이하이지만 세포의 결빙 온도 이상인 온도에서나, 또는 세포의 결빙 온도 이하이지만 유리화제나 비-펩티드 동결보호제가 존재하는 경우에 일반적으로 세포를 보호하기 위해 사용되는 용도에서, 바람직한 농도는 약 0.01 mg/mL 내지 약 60 mg/mL의 범위이고, 더 바람직한 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL의 범위이다. 폴리펩티드가 세포막을 가로지른 이온 채널을 차단하기 위해 사용되는 용도에서, 바람직한 농도는 적어도 약 0.01 mg/mL, 더 바람직하게 적어도 약 0.1 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL이다. 결빙방지 폴리펩티드의 모든 농도는 용액이 상이한 결빙방지 폴리펩티드들의 혼합물을 함유하는 경우 각 결빙방지 폴리펩티드의 농도의 합계로서 표시된다.
본 발명에서 사용되는 결빙방지 폴리펩티드의 수성 용액은 생물학적 제제를 보존하는데 유용하다고 본 분야에 공지된 전해질 용액에 포함되는 염, 당, 이온 및 다른 영양물의 광범한 혼합물 중 어느 것을 더 함유할 수 있다. 이들은 조직 배양 배지, 장기 관류액 등을 포함한다. 전해질 용액은 특히 폴리펩티드의 생물학적 적합성을 증진시키는데 유용하다. 본 분야에 공지된 많은 전해질 용액의 예는 NaCl 농도가 0.9% 또는 0.95%인 생리식염수, Facts and Comparisons, p. 50, Lippincott Publishing Co., St. Louis, Mo. (October 1981)에 등재된 링거주사액(U.S.), Best and Taylor, Basis of Medical Practice, 6th ed., Baltimore(1950)에 등재된 포유류 링거액(U.K., 캐나다), Facts and Comparisons, p. 50, Lippincott Publishing Co., St. Louis, Mo. (October 1981)에 등재된 락테이트 링거액(U.S.), Hartmann, A. F., J. Am. Med. Assoc. 103:1349-1354 (1934)의 락테이트 링거액(Hartmann), Fox, C. L, et al., J. Am. Med. Assoc. 148:825-833 (1952)에 등재된 아세테이트 링거액, Locke, F. S., Zbl. Physiol. 8:166 (1894); 14:670 (1900);15:490 (1901)에 등재된 Locke's 용액, Tyrode, M. J., Arch. Int. Pharmacodyn. 20:205 (1910)에 등재된 Tyrode's 용액, Krebs, H. A., et al, Hoppe-Seyle's Z. Physiol. Chem. 210:33-66 (1932)에 등재된 Krebs Henseleit 용액, Krebs, H. A., Hoppe-Seyle's Z. Physiol. Chem. 217:193 (1933)에 등재된 Krebs 링거 포스페이트 용액, Krebs, H. A., Biochem. Biophys. Acta 4:249-269 (1950)에 등재된 Krebs 혈청 치환물 용액, Krebs, H. A., Biochem. Biophys. Acta 4:249-269 (1950)에 등재된 Krebs 개선된 링거 II 용액, Krebs, H. A., Biochem. Biophys. Acta 4:249-269 (1950)에 등재된 Krebs 개선된 링거 III 용액, Hem, R., et al., Biochem. J. 101:284(1966)에 등재된 소 혈청 알부민과 적혈구를 함유한 Krebs 간관류액, Schimassek H., et al, Biochem. Z. 336,440 (1963)에 등재된 Schimassek 간관류액, Nishiitsutsuji-Uwo, J., et al., Biochem. J. 103:852-862 (1967)에 등재된 Krebs 신장관류액, Crow, K. E., et al., Biochem. J. 172:29-36 (1978)에 등재된 간세포 인큐베이션 용액, Bahlman, J., et al., Am. J. Physiol. 212:77 (1967)에 등재된 Bahlman 신장관류액, Fulgraff, et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 172:49 (1972)에 등재된 Fulgraff 신장관류액이다.
어떤 특정 용도를 위한 전해질 용액의 최적 선택은, 예를 들어 결빙방지 폴리펩티드에 의해서 치료되거나 보호될 세포의 형태(세포가 세포 현탁물, 조직 또는 장기로서 존재하는지의 여부), 세포가 유래된 동물, 및 세포가 노출되거나 노출될 것으로 예상되는 조건 등, 용도에 따라서 변할 것이다.
유리화 조건을 포함하는 본 발명의 구체예에서, 결빙방지 폴리펩티드는 빙점하 온도로 냉각할 때 세포내 및 세포외 유체의 고화 동안 얼음 결정 형성을 방지하거나 억제하는 유리화제와 조합하여 사용된다. 다양한 유리화제가 본 분야에 공지되어 있으며, 개별적으로 또는 다른 유리화제나 생물학적으로 적합한 용질과 조합하여 사용될 수 있다. 유리화제의 예는 글리세롤, 디메틸술폭시드, 에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 글루코오스, 수크로오스, 프로판디올, 부탄디올, 및 카르복시메틸셀룰로오스이다. 다가 알코올 부류도 유리화제로서 유용하다. 중요한 예는 글리세롤, 에틸렌글리콜, 프로판디올, 부탄디올, 및 부탄트리올이다. 유리화제의 농도는 시스템의 다른 성분들의 농도, 냉각 속도 및 도달된 최저 온도에 따라서 광범하게 변할 수 있다. 일반적으로, 최상의 결과는 약 5중량% 내지 약 35중량%의 농도에서 얻어질 것이다. 유리화는 일반적으로 빠른 냉각 속도, 예를 들어 100℃/분을 초과하는, 바람직하게는 1,000℃/분을 초과하는 속도에서 실시된다.
얼음 결정의 형성을 반드시 회피할 필요는 없는 비-펩티드 동결보호제의 사용을 포함하는 구체예에서도 같은 고려사항들이 대부분 적용된다. 유리화제의 예로서 상기 나열된 제제들이 유사한 농도 범위에서 동결보호제로서 사용된다.
세포 및/또는 세포막에 대한 결빙방지 폴리펩티드의 유리한 효과는 폴리펩티드를 세포와 접촉하여 배치하고, 이러한 접촉을 다른 손상 조건들에 노출하는 기간 동안 내내, 또는 노출 기간의 실질적인 부분 동안 유지함으로써 달성된다. 세포가 세포 현탁액 형태인 경우, 이런 타입의 접촉은 현탁액에 폴리펩티드를 간단히 첨가함으로써 달성된다. 세포가 조직이나 장기의 형태인 경우, 접촉은 조직이나 장기를 폴리펩티드 용액에 담금으로써 달성된다. 세포가 혈관계를 함유하는 조직이나 장기의 형태인 경우, 접촉은 폴리펩티드 용액으로 혈관계를 관류시키고, 한번 관류되면, 저장, 보존 또는 손상 조건 노출 기간 동안 내내 혈관계 내에 폴리펩티드 용액을 유지함으로써 달성된다. 관류 방법은 생리학 및 수술 과정의 전문가에게 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드에 의한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 세포는 광범한 타입의 세포들을 포함한다. 예는 난모세포, 배아, 백혈구, 적혈구, 혈소판, 췌장섬, 및 간세포이다. 본 발명으로부터 이익을 얻을 수 있는 장기도 광범하게 다양하다. 예는 간, 신장, 심장, 뇌, 폐, 췌장, 비장, 난소, 및 위를 포함한다. 본 발명으로부터 이익을 얻을 수 있는 조직은 이들 장기 중 어느 것의 조직뿐만 아니라, 피부 조직, 골수 조직, 각막 조직, 및 다른 광범한 조직을 포함한다. 본 발명은 일반적인 포유류에서 이용될 수 있으며, 인간 세포, 조직 및 장기와 관련하여 특히 관심 있게 이용될 것이다.
세포막을 가로지른 이온 수송을 억제하는데 있어서 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드의 효과는 다양한 이온까지 확장되며, 특히 관심 있는 것은 Ca++, K+ 및 Na+ 이온과 이들 이온의 둘 이상의 조합이다.
과도한 이온 수송은 체온저하를 수반하는 생리학적 효과이므로, 이온 수송을 억제하는 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드의 능력은 저온 조건에서 세포 생육성을 증진시키는 폴리펩티드의 능력과 관련될 수 있다. 따라서, 이온 수송의 억제 효과를 달성하기 위해 투여되는 폴리펩티드의 양 및 농도는 일반적으로 저온 노출시 생육성을 증진시키는데 사용되는 양과 동일하거나 유사하다.
또한, 세포막을 가로지른 이온 수송을 억제하는 폴리펩티드의 능력을 과도한 막통과 이온 수송이 존재하는 질환 및 비정상적 생리학적 상태를 치료하는데 폴리펩티드를 유용하게 한다. 이러한 질환 및 상태의 예는 낭성섬유증, Kartagener's 증후군, 요붕증, 당뇨병, 및 항이뇨 호르몬 이상이다. 이런 효과를 위한 폴리펩티드의 투여는 섭취, 혈관주사, 국소도포, 및 이들 질환 및 상태의 치료나 관리에 사용될 때 다른 약물이나 치료제를 투여하는 일반적인 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 유용한 결과를 위한 농도는 일반적으로 역시 상기 언급된 것들과 같고, 투여량 또는 투여빈도는 치료될 상태가 진행된 정도와 치료에 대한 관찰된 반응에 따라 결정될 것이다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 결빙방지 폴리펩티드의 용도는 세포 구조를 가진 식품의 보존에서 폴리펩티드를 사용하는 데까지 확장된다. 이 용도에서 특히 관심 있는 식품은 육류 및 육류 제품이지만, 다른 타입의 식품들에도 역시 이점이 있다. 본 발명의 취지에 있어서, 육류 및 육류 제품은 신선한 육류와 가금류뿐만 아니라, 냉동, 통조림 및 말린 육류 및 가금류를 포함한다. 수송이나 저장 동안 변질되는 것을 피하기 위해 냉각될 때 이러한 식품은 대부분 식품의 맛, 식감 및 일반적 외형에 기여하는 팽윤도, 신선도 및 다른 특질을 잃는 경향이 있다. 이런 품질이 본 발명에 따른 폴리펩티드 용액으로 식품으로 처리함으로써 보존될 수 있다. 처리 방식은 식품 타입별로 다양할 것이지만, 일반적으로 침지, 관류 또는 어떤 다른 종류의 흡수 또는 연장된 접촉을 달성하는 다른 수단에 의해 식품과 용액 중 폴리펩티드를 평형화하는 것을 수반한다. 본 발명의 다른 용도와 관련하여 상기 설명된 용액의 타입과 침지 및 관류 방법이 여기서도 또한 이용될 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 유체
예를 들어, 냉장제 및 많은 상이한 타입의 수성 용액과 같은 유체 및 액체에 첨가하는 첨가제로서 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드의 사용이 본 발명에 따라서 제공되며, 이로써 냉장제 또는 수성 용액의 결빙이 방지된다. 용액의 결빙을 방지하는 특징은 많은 상이한 기술 분야에서 유리하다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 연결된 담체 및 고체 지지체
본 발명에 따른 폴리펩티드는 고체 지지체 또는 반고체 지지체와 같은 담체에 연결될 수 있다. 폴리펩티드는 어떤 이러한 담체, 예를 들어 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 나타내는 물질의 표면에 공유 또는 비공유 연결될 수 있다. 본 발명에 따른 표면 및 고체 지지체는 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드, 또는 결빙방지 활성을 나타내는 이들의 기능적 단편을 포함할 수 있으며, 이들은 고체 또는 반고체 지지체와 같은 표면에 직접 또는 간접 부착된다.
부착은 원칙적으로 폴리펩티드를 표면에, 예를 들어 직접적으로, 링커 잔기를 통해, 표면과 반응성 접촉하여 폴리펩티드를 보유한 우리 구조에 폴리펩티드의 포착을 통해, 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 고체 지지체 또는 반고체 지지체에 부착하는 어떤 다른 방식을 통해 공유 또는 비공유 부착시키기 위한 모든 최신 기술을 포함한다.
폴리펩티드를 고체 또는 반고체 지지체에 부착시키기 위한 많은 기술이 이용될 수 있다. 폴리펩티드와 고체 표면의 부착은, 예를 들어 Cordek et al. 1999, Anal. Chem., 71:1529-1533; Blasi et al. 2005, Enzyme and Microbial Tech., 36: 818-823; Parrado et al. (1995), Proc. Chem., 30(8):735-741; Yakovleva et al. (2003), Biosensors and Bioelectronics, 19:21-34; Cao, L., Carrier-bound Immobilized Enzymes. Principles, Applications and Design, Wiley-VCH 2005; and Immobilization of Enzymes and Cells (Methods in Biotechnology), Birkerstaff, G. F., eds., Humana Press, 1997에 개시된다. 다른 기술들도 이용할 수 있으며, 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 코팅 조성물이 제공된다. 코팅 조성물은 안료와 수지를 포함해서 하나 이상의 추가 성분을 더 포함할 수 있으며, 이것은 하기 더 상세히 개시된다.
졸-겔 법에 의해 형성된 실리케이트 유리에 폴리펩티드를 비롯한 생체분자를 고정하는 것에 많은 관심이 집중되고 있다(Eggers et al., Protein Sci. 2001, 10, 250-261 ). 이 과정은 알콕시드를 가수분해하여 졸을 만들고, 이것을 중축합하여 겔을 형성하는 것을 수분한다. 졸-겔 전이 동안 겔에 생체분자가 포착되어 고정된다. 졸-겔 물질은 이들 물질이 기계적 강도, 화학적 안정성, 생체적합성 및 미생물 공격에 대한 내성을 증가시킨다는 점에서 생체분자 포착에 대하여 전이유기 중합체를 훨씬 능가하는 이점을 제공한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 졸-겔 캡슐화는 폴리올 실리케이트 및 폴리올 실록산, 특히 글리세롤로부터 유래된 것들에 기초한 전구체를 이용하여 수행될 수 있다. 폴리(글리세릴 실리케이트)(PGS)는 고도의 생체적합성과 중간 정도의 캡슐화 조건에 의해 구분된 접근법에서 폴리펩티드의 졸-겔 생체포착을 위해 제조되어 이용될 수 있으며, 이로써 실리카 내에 폴리펩티드를 재현가능하고 효과적으로 가둘 수 있다.
상기 개시된 방법은 메탈로실리케이트, 알킬실록산, 작용기화된 실록산, 및 다양한 복합 졸-겔까지 확장될 수 있으며, 이로써 본 발명에 따른 결빙방지 폴리펩티드를 포함하는 생리화학적으로 다양한 범위의 생체-도핑 중합체의 제작이 가능해진다.
본 발명에 따른 하이브리드 물질은 바람직하게 졸-겔 바이오세라믹스를 특징으로 하는 높은 안정성 및 견고성과 함께, 자유 결빙방지 폴리펩티드의 활성에 근접한 활성을 나타낸다.
본 발명의 한 양태에서, 당업자에게 잘 공지된 졸-겔 과정은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 고체 또는 반고체 지지체에 부착하는데 사용된다. 졸-겔 과정은 종래부터의 과정이며, 전형적으로 졸-겔 유리를 생성하는데, 이것은 유리 밀도의 약 절반 정도로 망구조가 완전히 단단하게 될 때까지 점도를 증가시키면서 콜로이드상 서브-마이크로미터 입자들의 망구조에 상호연결을 형성함으로써 생성된 광학적으로 투명한 비정질 실리카 또는 실리케이트 물질로부터 생긴다. 따라서, 본 발명에 따른 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 졸-겔 유리가 또한 청구된다. 특히, Gill and Ballesteros, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8587-8598를 참조한다. 가교 입자의 졸을 형성하기 위한 용액 중합이, 예를 들어 US 5,863,996에 개시되며, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따른 코팅 조성물은 바람직하게 본 발명에 따른 폴리펩티드(들)과 양립성인, 즉 코팅 조성물의 일부를 형성할 때 상기 폴리펩티드가 결빙방지 활성을 발휘하도록 허용하는 수지를 포함한다. 수지들은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 폴리펩티드 양립성 수지도 선행기술로서 개시된다. 예를 들어, WO 01/72911 및 US 5,998,200을 참조한다.
또한, 본 발명에 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 3-차원 나노구조를 가진 메조포러스 에어로겔을 포함하는 조성물이 제공된다. 3-차원 나노구조는 바람직하게 나노-부착되는 결빙방지 폴리펩티드 생체-복합체 수퍼구조를 캡슐화한 콜로이드 금속을 포함한다. 따라서, 또한, 나노-부착된 결빙방지 폴리펩티드 생체-복합체를 캡슐화한 콜로이드 금속과 함께 3-차원 나노구조를 가진 메조포러스 에어로겔의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 본 발명에 따른 하나 이상의 결빙방지 폴리펩티드와 상기 콜로이드상 금속을 함께 혼합함으로써 결빙방지 폴리펩티드 생체-복합체를 캡슐화한 금속을 형성하는 단계; 촉매와 규소 알콕시드와 같은 알콕시드를 함께 혼합함으로써 실리카 졸과 같은 졸을 형성하는 단계; 실리카 졸과 같은 상기 졸과 상기 생체-복합체를 혼합하고, 상기 졸을 겔로 되게 함으로써 겔을 형성하는 단계; 및 이산화탄소를 사용하여 상기 겔을 추출하고 초임계 건조시켜 나노-부착된 결빙방지 폴리펩티드 생체-복합체 수퍼구조를 캡슐화한 상기 금속을 가진 상기 에어로졸을 형성하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 메조포러스 에어로겔은 실리카 메조포러스 에어로겔이다. US 2004/0209338를 참고한다.
기체 수화물의 형성 억제에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 사용
또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 해양에서 기체 수화물의 형성을 억제하는데 사용될 수 있다. 기체 수화물은 물과 적합한 크기의 "게스트" 기체 분자의 혼합물로부터 형성된 얼음 모양 결정질 분자 복합체라고 잘 알려져 있다. 물(호스트) 분자는 수소 결합에 의해서 몇 개의 간극 공동을 가진 격자 구조를 형성한다. 게스트 기체 분자가 격자 공동을 점유할 수 있으며, 최소한의 공동이 채워지면, 빙수의 용융점을 꽤 넘는 온도에서도 결정질 구조가 안정하게 되어 고체 기체 수화물이 형성될 것이다. 기체 수화물이 해리(용융)되면, 결정 격자는 액체 물로 파괴되고(또는 조건이 물의 결빙점 이하라면 얼음으로 전환), 기체가 방출된다. 상업적으로 기체는 에너지 생산을 위해 이용될 수 있다. 그러나, 이 현상은 기체가 통제되지 않는 방식으로 배출되는 경우 환경적으로 위험하다. 이것은 때로 지구 균열이 나타난 지역에서 있을 수 있다.
기체 수화물 형성에 관련된 문제는 또한 해양 바닥의 파이프라인에서 발생한다고 잘 알려져 있다. 그러나, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 얼음 결정 형성 억제 성질로 인해, 상기 폴리펩티드의 존재는 이들 수화물의 구조가 얼음 결정의 구조와 매우 유사하다는 사실로 인해 기체 수화물의 형성을 방지할 수 있다고 생각된다.
본 발명의 선택된 항목들이 하기 개시된다.
1. 복수의 연속 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드는 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQ ID NO:90)을 포함하고, 여기서
X1은 S, A, G 및 D로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X2는 A, V, I, T 및 S로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X3은 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X4는 S, I, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X5는 S, A, I 및 T로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X6은 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X7은 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X8은 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
X9는 S, A 및 G로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되며;
SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 하나는 T 또는 V이고;
폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총 수는 250개 미만이고;
폴리펩티드는 얼음-결합 능력을 지닌다.
2. 항목 1에 있어서, X1이 S인 폴리펩티드.
3. 항목 1에 있어서, X1이 A인 폴리펩티드.
4. 항목 1에 있어서, X1이 G인 폴리펩티드.
5. 항목 1에 있어서, X1이 D인 폴리펩티드.
6. 항목 1에 있어서, X2가 A인 폴리펩티드.
7. 항목 1에 있어서, X2가 V인 폴리펩티드.
8. 항목 1에 있어서, X2가 I인 폴리펩티드.
9. 항목 1에 있어서, X2가 T인 폴리펩티드.
10. 항목 1에 있어서, X2가 S인 폴리펩티드.
11. 항목 1에 있어서, X3이 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않는 폴리펩티드.
12. 항목 1에 있어서, X4가 S인 폴리펩티드.
13. 항목 1에 있어서, X4가 I인 폴리펩티드.
14. 항목 1에 있어서, X4가 T인 폴리펩티드.
15. 항목 1에 있어서, X4가 V인 폴리펩티드.
16. 항목 1에 있어서, X5가 S인 폴리펩티드.
17. 항목 1에 있어서, X5가 A인 폴리펩티드.
18. 항목 1에 있어서, X5가 I인 폴리펩티드.
19. 항목 1에 있어서, X5가 T인 폴리펩티드.
20. 항목 1에 있어서, X6이 S인 폴리펩티드.
21. 항목 1에 있어서, X6이 T인 폴리펩티드.
22. 항목 1에 있어서, X6이 V인 폴리펩티드.
23. 항목 1에 있어서, X7이 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않는 폴리펩티드.
24. 항목 1에 있어서, X8이 S인 폴리펩티드.
25. 항목 1에 있어서, X8이 T인 폴리펩티드.
26. 항목 1에 있어서, X8이 V인 폴리펩티드.
27. 항목 1에 있어서, X9가 S인 폴리펩티드.
28. 항목 1에 있어서, X9가 A인 폴리펩티드.
29. 항목 1에 있어서, X9가 G인 폴리펩티드.
30. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 하나가 T인 폴리펩티드.
31. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 2개가 T인 폴리펩티드.
32. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 3개가 T인 폴리펩티드.
33. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 4개 전부가 T인 폴리펩티드.
34. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 하나가 V인 폴리펩티드.
35. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 2개가 V인 폴리펩티드.
36. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 중 적어도 3개가 V인 폴리펩티드.
37. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 X2, X4, X6 및 X8 4개 전부가 V인 폴리펩티드.
38. 항목 1에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 최대 수가 240개 미만, 예를 들어 230개 미만, 예를 들어 220개 미만, 예를 들어 210개 미만, 예를 들어 200개 미만, 예를 들어 190개 미만, 예를 들어 180개 미만, 예를 들어 150개 미만, 예를 들어 140개 미만, 예를 들어 130개 미만, 예를 들어 120개 미만, 예를 들어 110개 미만, 예를 들어 100개 미만, 예를 들어 95개 미만, 예를 들어 90개 미만, 예를 들어 85개 미만, 예를 들어 80개 미만, 예를 들어 75개 미만, 예를 들어 70개 미만, 예를 들어 65개 미만, 예를 들어 60개 미만, 예를 들어 55개 미만, 예를 들어 50개 미만, 예를 들어 45개 미만, 예를 들어 40개 미만, 예를 들어 30개 미만, 예를 들어 20개 미만, 예를 들어 15개 미만인 폴리펩티드.
39. 항목 1에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 최소 수가 10개 이상, 예를 들어 12개 이상, 예를 들어 14개 이상, 예를 들어 16개 이상, 예를 들어 18개 이상, 예를 들어 20개 이상, 예를 들어 22개 이상, 예를 들어 24개 이상, 예를 들어 26개 이상, 예를 들어 28개 이상, 예를 들어 30개 이상, 예를 들어 32개 이상, 예를 들어 34개 이상, 예를 들어 36개 이상, 예를 들어 38개 이상, 예를 들어 40개 이상, 예를 들어 42개 이상, 예를 들어 44개 이상, 예를 들어 46개 이상, 예를 들어 48개 이상, 예를 들어 50개 이상, 예를 들어 55개 이상, 예를 들어 60개 이상, 예를 들어 65개 이상, 예를 들어 70개 이상, 예를 들어 75개 이상, 예를 들어 80개 이상, 예를 들어 85개 이상, 예를 들어 90개 이상, 예를 들어 95개 이상, 예를 들어 100개 이상인 폴리펩티드.
40. 항목 1에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 중첩되지 않는 SEQ ID NO:90의 제 2 카피를 더 포함하는 폴리펩티드, 여기서 SEQ ID NO:90의 제 2 카피는 서열 Xa-Xb-Xc-Xd-Xe-Xf-Xg-Xh-Xi(SEQ ID NO:90)를 포함하고,
Xa는 S, A, G 및 D로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xb는 A, V, I, T 및 S로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xc는 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xd는 S, I, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xe는 S, A, I 및 T로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xf는 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xg는 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xh는 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xi는 S, A 및 G로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 하나는 T 또는 V이다.
41. 항목 40에 있어서, Xa는 S인 폴리펩티드.
42. 항목 40에 있어서, Xa는 A인 폴리펩티드.
43. 항목 40에 있어서, Xa는 G인 폴리펩티드.
44. 항목 40에 있어서, Xa는 D인 폴리펩티드.
45. 항목 40에 있어서, Xb는 A인 폴리펩티드.
46. 항목 40에 있어서, Xb는 V인 폴리펩티드.
47. 항목 40에 있어서, Xb는 I인 폴리펩티드.
48. 항목 40에 있어서, Xb는 T인 폴리펩티드.
49. 항목 40에 있어서, Xb는 S인 폴리펩티드.
50. 항목 40에 있어서, Xc는 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않는 폴리펩티드.
51. 항목 40에 있어서, Xd는 S인 폴리펩티드.
52. 항목 40에 있어서, Xd는 I인 폴리펩티드.
53. 항목 40에 있어서, Xd는 T인 폴리펩티드.
54. 항목 40에 있어서, Xd는 V인 폴리펩티드.
55. 항목 40에 있어서, Xe는 S인 폴리펩티드.
56. 항목 40에 있어서, Xe는 A인 폴리펩티드.
57. 항목 40에 있어서, Xe는 I인 폴리펩티드.
58. 항목 40에 있어서, Xe는 T인 폴리펩티드.
59. 항목 40에 있어서, Xf는 S인 폴리펩티드.
60. 항목 40에 있어서, Xf는 T인 폴리펩티드.
61. 항목 40에 있어서, Xf는 V인 폴리펩티드.
62. 항목 40에 있어서, Xg는 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않는 폴리펩티드.
63. 항목 40에 있어서, Xh는 S인 폴리펩티드.
64. 항목 40에 있어서, Xh는 T인 폴리펩티드.
65. 항목 40에 있어서, Xh는 V인 폴리펩티드.
66. 항목 40에 있어서, Xi는 S인 폴리펩티드.
67. 항목 40에 있어서, Xi는 A인 폴리펩티드.
68. 항목 40에 있어서, Xi는 G인 폴리펩티드.
69. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 하나는 T인 폴리펩티드.
70. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 2개는 T인 폴리펩티드.
71. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 3개는 T인 폴리펩티드.
72. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 4개 전부가 T인 폴리펩티드.
73. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 하나는 V인 폴리펩티드.
74. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 2개는 V인 폴리펩티드.
75. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 중 적어도 3개는 V인 폴리펩티드.
76. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xb, Xd, Xf 및 Xh 4개 전부가 V인 폴리펩티드.
77. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 및 제 2 카피가 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
78. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 및 제 2 카피가 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
79. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 및 제 2 카피가 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
80. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 및 제 2 카피가 100개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 95개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 40개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
81. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피가 SEQ ID NO:90의 제 2 카피의 N-말단에 위치된 폴리펩티드.
82. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피가 SEQ ID NO:90의 제 1 카피의 N-말단에 위치된 폴리펩티드.
83. 항목 40에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 및 제 2 카피와 중첩되지 않는 SEQ ID NO:90의 제 3 카피를 더 포함하는 폴리펩티드, 여기서 SEQ ID NO:90의 제 3 카피는 서열 Xaa-Xba-Xca-Xda-Xea-Xfa-Xga-Xha-Xia(SEQ ID NO:90)를 포함하고,
Xaa는 S, A, G 및 D로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xba는 A, V, I, T 및 S로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xca는 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xda는 S, I, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xea는 S, A, I 및 T로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xfa는 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xga는 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xha는 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xia는 S, A 및 G로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 하나는 T 또는 V이다.
84. 항목 83에 있어서, Xaa는 S인 폴리펩티드.
85. 항목 83에 있어서, Xaa는 A인 폴리펩티드.
86. 항목 83에 있어서, Xaa는 G인 폴리펩티드.
87. 항목 83에 있어서, Xaa는 D인 폴리펩티드.
88. 항목 83에 있어서, Xba는 A인 폴리펩티드.
89. 항목 83에 있어서, Xba는 V인 폴리펩티드.
90. 항목 83에 있어서, Xba는 I인 폴리펩티드.
91. 항목 83에 있어서, Xba는 T인 폴리펩티드.
92. 항목 83에 있어서, Xba는 S인 폴리펩티드.
93. 항목 83에 있어서, Xca는 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않은 폴리펩티드.
94. 항목 83에 있어서, Xda는 S인 폴리펩티드.
95. 항목 83에 있어서, Xda는 I인 폴리펩티드.
96. 항목 83에 있어서, Xda는 T인 폴리펩티드.
97. 항목 83에 있어서, Xda는 V인 폴리펩티드.
98. 항목 83에 있어서, Xea는 S인 폴리펩티드.
99. 항목 83에 있어서, Xea는 A인 폴리펩티드.
100. 항목 83에 있어서, Xea는 I인 폴리펩티드.
101. 항목 83에 있어서, Xea는 T인 폴리펩티드.
102. 항목 83에 있어서, Xfa는 S인 폴리펩티드.
103. 항목 83에 있어서, Xfa는 T인 폴리펩티드.
104. 항목 83에 있어서, Xfa는 V인 폴리펩티드.
105. 항목 83에 있어서, Xga는 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않은 폴리펩티드.
106. 항목 83에 있어서, Xha는 S인 폴리펩티드.
107. 항목 83에 있어서, Xha는 T인 폴리펩티드.
108. 항목 83에 있어서, Xha는 V인 폴리펩티드.
109. 항목 83에 있어서, Xia는 S인 폴리펩티드.
110. 항목 83에 있어서, Xia는 A인 폴리펩티드.
111. 항목 83에 있어서, Xia는 G인 폴리펩티드.
112. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 하나가 T인 폴리펩티드.
113. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 2개가 T인 폴리펩티드.
114. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 3개가 T인 폴리펩티드.
115. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 4개 전부가 T인 폴리펩티드.
116. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 하나가 V인 폴리펩티드.
117. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 2개가 V인 폴리펩티드.
118. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 중 적어도 3개가 V인 폴리펩티드.
119. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xba, Xda, Xfa 및 Xha 4개 전부가 V인 폴리펩티드.
120. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 상이한 카피들이 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
121. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 및 제 3 카피가 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
122. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 3 카피가 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
123. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 3 카피가 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
124. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 3 카피가 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
125. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 3 카피가 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
126. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 제 3 카피가 100개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 95개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 40개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
127. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 제 3 카피가 100개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 95개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 40개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
128. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피가 SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 제 2 카피 모두의 N-말단에 위치된 폴리펩티드.
129. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피가 SEQ ID NO:90의 제 1 카피의 N-말단에 위치되고 SEQ ID NO:90의 제 2 카피 C-말단에 위치된 폴리펩티드.
130. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피가 SEQ ID NO:90의 제 2 카피의 N-말단에 위치되고 SEQ ID NO:90의 제 1 카피 C-말단에 위치된 폴리펩티드.
131. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피가 SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 제 2 카피 모두의 C-말단에 위치된 폴리펩티드.
132. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1, 제 2 및 제 3 카피 중 어느 것과 중첩되지 않는 SEQ ID NO:90의 제 4 카피를 더 포함하는 폴리펩티드, 여기서 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 서열 Xab-Xbb-Xcb-Xdb-Xeb-Xfb-Xgb-Xhb-Xib(SEQ ID NO:90)를 포함하고,
Xab는 S, A, G 및 D로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xbb는 A, V, I, T 및 S로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xcb는 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xdb는 S, I, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xeb는 S, A, I 및 T로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xfb는 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xgb는 비-벌크 아미노산 잔기로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xhb는 S, T 및 V로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
Xib는 S, A 및 G로 구성되는 아미노산 잔기의 군으로부터 선택되고;
SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 하나는 T 또는 V이다.
133. 항목 83에 있어서, Xab는 S인 폴리펩티드.
134. 항목 83에 있어서, Xab는 A인 폴리펩티드.
135. 항목 83에 있어서, Xab는 G인 폴리펩티드.
136. 항목 83에 있어서, Xab는 D인 폴리펩티드.
137. 항목 83에 있어서, Xbb는 A인 폴리펩티드.
138. 항목 83에 있어서, Xbb는 V인 폴리펩티드.
139. 항목 83에 있어서, Xbb는 I인 폴리펩티드.
140. 항목 83에 있어서, Xbb는 T인 폴리펩티드.
141. 항목 83에 있어서, Xbb는 S인 폴리펩티드.
142. 항목 83에 있어서, Xcb는 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않는 폴리펩티드.
143. 항목 83에 있어서, Xdb는 S인 폴리펩티드.
144. 항목 83에 있어서, Xdb는 I인 폴리펩티드.
145. 항목 83에 있어서, Xdb는 T인 폴리펩티드.
146. 항목 83에 있어서, Xdb는 V인 폴리펩티드.
147. 항목 83에 있어서, Xeb는 S인 폴리펩티드.
148. 항목 83에 있어서, Xeb는 A인 폴리펩티드.
149. 항목 83에 있어서, Xeb는 I인 폴리펩티드.
150. 항목 83에 있어서, Xeb는 T인 폴리펩티드.
151. 항목 83에 있어서, Xfb는 S인 폴리펩티드.
152. 항목 83에 있어서, Xfb는 T인 폴리펩티드.
153. 항목 83에 있어서, Xfb는 V인 폴리펩티드.
154. 항목 83에 있어서, Xgb는 고리형 지방족 측쇄 또는 방향족 측쇄를 함유하지 않는 폴리펩티드.
155. 항목 83에 있어서, Xhb는 S인 폴리펩티드.
156. 항목 83에 있어서, Xhb는 T인 폴리펩티드.
157. 항목 83에 있어서, Xhb는 V인 폴리펩티드.
158. 항목 83에 있어서, Xib는 S인 폴리펩티드.
159. 항목 83에 있어서, Xib는 A인 폴리펩티드.
160. 항목 83에 있어서, Xib는 G인 폴리펩티드.
161. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 하나는 T인 폴리펩티드.
162. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 2개는 T인 폴리펩티드.
163. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 3개는 T인 폴리펩티드.
164. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 4개 전부가 T인 폴리펩티드.
165. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 하나는 V인 폴리펩티드.
166. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 2개는 V인 폴리펩티드.
167. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 중 적어도 3개는 V인 폴리펩티드.
168. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 잔기 Xbb, Xdb, Xfb 및 Xhb 4개 전부가 V인 폴리펩티드.
169. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
170. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
171. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
172. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
173. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
174. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피는 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
175. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 4 카피가 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
176. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 4 카피가 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
177. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피와 SEQ ID NO:90의 4 카피가 적어도 2개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 3개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 4개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 5개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 6개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 7개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 8개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 9개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 10개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 11개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 12개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 13개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 14개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 16개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 17개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 18개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 19개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 20개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 21개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 22개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 23개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 24개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 25개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 26개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 27개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 28개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 29개 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 30개 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
178. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 1 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 100개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 95개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 40개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
179. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 2 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 100개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 95개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 40개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
180. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 3 카피와 SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 100개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 95개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 90개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 85개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 80개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 75개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 70개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 65개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 60개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 55개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 50개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 45개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 40개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 35개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 30개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 25개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 24개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 23개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 22개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 21개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 20개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 19개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 18개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 17개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 16개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 15개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 14개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 13개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 12개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 11개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 10개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 9개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 8개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 7개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 6개 미만의 아미노산 잔기, 예를 들어 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 분리된 폴리펩티드.
181. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 SEQ ID NO:90의 제 1 카피의 N-말단에 위치된 폴리펩티드.
182. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 SEQ ID NO:90의 제 1 카피의 C-말단에 위치된 폴리펩티드.
183. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 SEQ ID NO:90의 제 2 카피의 N-말단에 위치된 폴리펩티드.
184. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 SEQ ID NO:90의 제 2 카피의 C-말단에 위치된 폴리펩티드.
185. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 SEQ ID NO:90의 제 3 카피의 N-말단에 위치된 폴리펩티드.
186. 항목 83에 있어서, SEQ ID NO:90의 제 4 카피가 SEQ ID NO:90의 제 3 카피의 C-말단에 위치된 폴리펩티드.
187. 담체에 부착된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드.
188. 항목 187에 있어서, 담체가 선택적으로 바이오틴화된 스트렙타비딘과 같은 아비딘 부분을 포함하는 폴리펩티드.
189. 고체 지지체 또는 반고체 지지체에 부착된, 예를 들어 공유 결합된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드.
190. His-택과 같은 친화성 택에 작동 가능하게 융합된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드.
191. N-말단 측면 서열에 작동 가능하게 융합된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
192. C-말단 측면 서열에 작동 가능하게 융합된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
193. 신호 펩티드에 작동 가능하게 연결된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드.
194. 프로 영역에 작동 가능하게 융합된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드.
195. 프레-프로 영역에 작동 가능하게 융합된 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드.
196. 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형되고, 상기 변형(들)은 바람직하게 생체내 또는 시험관내 화학 유도체화, 예를 들어 아세틸화 또는 카르복실화, 글리코실화, 예를 들어 글리코실화에 영향을 미치는 효소, 예를 들어 포유류 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 폴리펩티드를 노출시킴으로써 생기는 글리코실화, 인산화, 예를 들어 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포티로신, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 생성하는 아미노산 잔기의 변형으로 구성되는 군으로부터 선택된 폴리펩티드.
197. 항목 1 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 바람직하게는 단백질 가수분해 변성에 대한 내성과 안정성을 개선하거나, 또는 용해성을 최적화하거나, 또는 폴리펩티드를 치료제로서 더욱 적합하게 하도록 변형된 폴리펩티드.
198. 자연발생 L-아미노산 잔기 이외의 다른 아미노산 잔기를 포함하는 항목 197에 따른 폴리펩티드.
199. D-아미노산 잔기를 포함하는 항목 198에 따른 폴리펩티드.
200. 비-자연발생 합성 아미노산을 포함하는 항목 198에 따른 폴리펩티드.
201. 바람직하게는 바람직하지 않은 변성으로부터 폴리펩티드의 N- 및 C-말단을 보호하고 및/또는 안정화하는데 적합한 화학 치환체의 형태인 하나 이상의 봉쇄기를 포함하는 항목 197에 따른 폴리펩티드.
202. 항목 201에 있어서, 하나 이상의 봉쇄기는 폴리펩티드의 생체내 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 보호기를 포함하는 폴리펩티드.
203. 항목 201에 있어서, 하나 이상의 봉쇄기는 N-말단의 알킬화 또는 아실화에 의해 도입된 폴리펩티드.
204. 항목 201에 있어서, 하나 이상의 봉쇄기는 C1 내지 C5 분지 또는 비분지 알킬기 및 아실기, 예를 들어 포르밀 및 아세틸기, 및 이들의 치환된 형태, 예를 들어 아세타미도메틸(Acm) 기로부터 선택된 폴리펩티드.
205. 항목 201에 있어서, 하나 이상의 봉쇄기는 아미노산의 데스아미노 유사체를 포함하는 N-말단 봉쇄기로부터 선택되고, 이들이 펩티드의 N-말단에 연결되거나, 또는 N-말단 아미노산 잔기 대신에 사용되는 폴리펩티드.
206. 항목 201에 있어서, 하나 이상의 봉쇄기는 C-말단의 카르복실기가 편입되거나 되지 않은 C-말단 봉쇄기, 예를 들어 에스테르, 케톤, 및 아미드, 및 데스카르복실화 아미노산 유사체로부터 선택된 폴리펩티드.
207. 항목 201에 있어서, 하나 이상의 봉쇄기는 에스테르 또는 케톤-형성 알킬기를 포함하는 C-말단 봉쇄기, 예를 들어 저급(C1 내지 C6) 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸 및 프로필, 및 아미드-형성 아미노기, 예를 들어 1차 아민(-NH2), 및 모노- 및 디-알킬아미노기, 예를 들어 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸에틸아미노 등으로부터 선택된 폴리펩티드.
208. 항목 201에 있어서, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 유의한 영향을 미치지 않으면서 N-말단부의 자유 아미노기(들)과 말단의 자유 카르복실기(들)이 폴리펩티드로부터 모두 함께 제거되어 데스아미노 및 데스카르복실화 형태를 산출할 수 있는 폴리펩티드.
209. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 산 부가 염으로서, 상기 염은 폴리펩티드를 무기산, 예를 들어 염산, 수소화브롬산, 황산, 질산, 인산 등, 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 살리실산으로 처리함으로써 얻어지며, 이로써 폴리펩티드의 수용성 염을 제공하는 산 부가 염.
210. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하거나, 또는 시험관내에서, 또는 적합한 숙주 생물에서 생체내에서 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
211. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드의 폴리펩티드 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
212. 항목 211에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 선택적으로 적합한 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터.
213. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및/또는 항목 211에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 항목 212에 따른 발현 벡터를 포함하는 재조합 또는 트랜스젠 숙주 세포.
214. 재조합 또는 트랜스젠 숙주 세포의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 재조합 또는 트랜스젠 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 선택적으로 상기 폴리펩티드를 상기 재조합 또는 트랜스젠 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 이로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 재조합 또는 트랜스젠 숙주 세포를 생성하는 방법.
215. 항목 213에 따른 숙주 세포를 포함하는 트랜스젠 포유류 생물.
216. 항목 215에 있어서, 상기 포유류 숙주 세포가 주 계통 Deuterostomes , Ecdysozoa, Platyzoa 및 Lophotrochozoa의 4가지 중 어느 것에 속하는 포유류 세포를 포함해서, Bilateria 문으로부터 선택된 동물 세포인 트랜스젠 포유류 생물.
217. 항목 215에 있어서, 상기 포유류 숙주 세포가 할구세포, 난세포, 배아줄기세포, 적혈구, 섬유아세포, 간세포, 근육모세포, 근육대롱, 뉴런, 난모세포, 골모세포, 파골세포, 정자세포, T-세포 및 접합체로 구성되는 군으로부터 선택된 동물 세포인 트랜스젠 포유류 생물.
218. 트랜스젠 포유류 숙주 세포의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 항목 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리펩티드를 상기 재조합 또는 트랜스젠 숙주 세포에 도입하는 단계, 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 트랜스젠 포유류 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 이로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 트랜스젠 포유류 숙주 세포를 생성하는 방법.
219. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및/또는 항목 211에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 항목 212에 따른 발현 벡터를 포함하는 트랜스젠 어류.
220. 항목 219에 있어서, 상기 어류가 연어인 트랜스젠 어류.
221. 항목 219에 있어서, 상기 어류가 가자미목인 트랜스젠 어류.
222. 항목 219에 있어서, 상기 어류가 대구인 트랜스젠 어류.
223. 항목 219에 있어서, 상기 어류가 청어인 트랜스젠 어류.
224. 항목 213에 따른 숙주 세포를 포함하는 트랜스젠 식물.
225. 항목 224에 있어서, 상기 숙주 세포가 바람직하게는 호분 세포, 후각조직 세포, 내피 세포, 배유 세포, 표피 세포, 엽육 세포, 분열조직 세포, 울타리 세포, 연조직 세포, 체관 세포, 화분생성 세포, 화분성장 세포, 후막조직 세포, 헛물관 세포, 물관 세포 및 접합체 세포로 구성되는 군으로부터 선택된, 탁손 유배식물 또는 녹색식물 또는 녹조식물의 식물 세포인 트랜스젠 식물 숙주 세포.
226. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 감자 식물인 트랜스젠 식물.
227. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 토마토 식물인 트랜스젠 식물.
228. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 포도덩굴인 트랜스젠 식물.
229. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 오이 식물인 트랜스젠 식물.
230. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 밀인 트랜스젠 식물.
231. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 보리인 트랜스젠 식물.
232. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 호밀인 트랜스젠 식물.
233. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 귀리인 트랜스젠 식물.
234. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 담배 식물인 트랜스젠 식물.
235. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 감귤류 식물인 트랜스젠 식물.
236. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 사과 식물인 트랜스젠 식물.
237. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 딸기 식물인 트랜스젠 식물.
238. 항목 224에 있어서, 상기 식물이 라즈베리 식물인 트랜스젠 식물.
239. 트랜스젠 식물의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 식물에 도입하는 단계, 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 식물에서 발현시키는 단계를 포함하며, 이로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 트랜스젠 식물을 생성하는 방법.
240. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및/또는 항목 211에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 항목 212에 따른 벡터를 포함하는 재조합 박테리아 숙주 세포.
241. 항목 240에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가 그람 양성 박테리아 숙주 세포 및 그람 음성 박테리아 숙주 세포로부터 선택된 박테리아 숙주 세포.
242. 항목 240에 있어서, 상기 박테리아 세포가 유산균 균주인 박테리아 숙주 세포.
243. 항목 240에 있어서, 상기 박테리아 세포가 연쇄상구균 균주인 박테리아 숙주 세포.
244. 항목 240에 있어서, 상기 박테리아 세포가 비피도박테리움 균주인 박테리아 숙주 세포.
245. 재조합 박테리아 세포의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 박테리아 세포에 도입하는 단계, 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 박테리아 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 이로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 재조합 박테리아 세포를 생성하는 방법.
246. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및/또는 항목 211에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 항목 212에 따른 벡터를 포함하는 재조합 효모 세포.
247. 항목 246에서, 상기 효모 숙주세포가 Saccharomyces, Scizosacchomyces 또는 Pichia 속에 속하는 효모 숙주 세포.
248. 항목 246에 있어서, 상기 효모가 Saccharomyces cerevisiae인 효모 숙주 세포.
249. 항목 246에 있어서, 상기 효모가 Scizosacchomyces pompe인 효모 숙주 세포.
250. 항목 246에 있어서, 상기 효모가 Pichia pastoris인 효모 숙주 세포.
251. 재조합 효모 세포의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 효모 세포에 도입하는 단계, 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 효모 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 이로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 재조합 효모 세포를 생성하는 방법.
252. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 및/또는 항목 211에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 항목 212에 따른 벡터를 포함하는 재조합 진균 숙주 세포.
253. 항목 252에 있어서, 상기 진균 세포가 Aspergillus 속에 속하는 진균 숙주 세포.
254. 재조합 진균 세포의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 진균 세포에 도입하는 단계, 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 진균 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 이로써 상기 폴리펩티드를 생산하는 재조합 박테리아 세포를 생성하는 방법.
255. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 펩티드에 특이적인 항체, 또는 그것의 결합 단편.
256. 항목 255에 있어서, 상기 항체가 다클론성인 항체.
257. 항목 255에 있어서, 상기 항체가 단클론성인 항체.
258. 항목 255에 있어서, 상기 항체 단편이 F(ab')2, F(ab)2, Fab' 및 Fab로 구성되는 군으로부터 선택된 항체의 일부를 포함하는 항체 단편.
259. 항목 255에 있어서, 상기 항체 단편이 특이적 항원에 결합하는 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩티드인 항체 단편.
260. 항목 255에 있어서, 상기 항체 단편이 경쇄 가변 영역으로 구성되거나 포함하는 항체 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편으로 구성되거나 포함하는 항체 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자("scFv 폴리펩티드")로 구성되거나 포함하는 항체 단편, 및 초가변 영역을 의태하는 아미노산 잔기로 구성되는 최소 인식 단위로 구성되거나 포함하는 항체 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체 단편.
261. 항목 255에 있어서, 상기 항체가 설치류 항체로부터 유래하는 가변 도메인과 상보성 결정 영역을 함유하고, 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유래하는 재조합 폴리펩티드 형태의 키메라 항체인 항체.
262. 항목 255에 있어서, 상기 항체가 단클론성 항체의 뮤린 상보성 결정 영역이 뮤린 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 가변 도메인으로 전달된 재조합 폴리펩티드 형태의 인간화된 항체인 항체.
263. 항체 부분에 콘쥬게이트되어 더 쉽게 검출될 수 있는 부분을 생성할 수 있는 분자 또는 원자 형태의 검출가능한 표지와 결합되거나 더 포함하는 항목 255 내지 262 중 어느 하나에 따른 항체.
264. 항목 263에 있어서, 표지는 킬레이터, 광활성제, 방사선 동위원소, 형광제 및 상자성 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항체.
265. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 항체, 또는 그것의 결합 단편의 생성 방법으로서, 상기 방법은 항체 반응을 도출하는 조건에서 포유류 피험체를 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드로 면역화하는 단계, 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 확인하는 단계, 및 선택적으로 상기 포유류 피험체로부터 상기 항체 또는 그것의 결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는 방법.
266. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 항체 반응을 도출하는 조건에서 포유류 피험체를 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드로 면역화하는 단계, 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체를 생산하는 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 폴리펩티드에 특이적으로 결합한 항체를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
267. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 담체를 포함하는 조성물.
268. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 항목 267에 따른 조성물을 포함하는 얼음 방지 표면.
269. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 냉장고.
270. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 냉동고.
271. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 창문.
272. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 풍차 날개.
273. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 라디오 대역 검출 장치(레이더).
274. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 자동차.
275. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 히트 펌프.
276. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 선박.
277. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 도로 표면.
278. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 물과 같은 액체 공급원 전용 파이프.
279. 플라스틱으로 제조된 항목 278에 따른 파이프.
280. 금속으로 제조된 항목 278에 따른 파이프.
281. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 지붕 구조물.
282. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 병.
283. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 캔.
284. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 안테나 장치.
285. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 바람막이 유리 와이퍼.
286. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 고무 타이어.
287. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 에어-컨디셔닝 설비.
288. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 철도 트랙.
289. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 기차 바퀴.
290. 항목 268에 따른 얼음 방지 표면을 포함하는 전력 케이블.
291. 항목 1 내지 208 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 항목 267에 따른 조성물을 포함하는 얼음 핵형성 표면.
292. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 냉장고.
293. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 냉동고.
294. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 창문.
295. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 풍차 날개.
296. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 라디오 대역 검출 장치(레이더).
297. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 자동차.
298. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 히트 펌프.
299. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 선박.
300. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 도로 표면.
301. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 물과 같은 액체 공급원 전용 파이프.
302. 플라스틱으로 제조된 항목 301에 따른 파이프.
303. 금속으로 제조된 항목 301에 따른 파이프.
304. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 지붕 구조물.
305. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 병.
306. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 캔.
307. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 안테나 장치.
308. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 바람막이 유리 와이퍼.
309. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 고무 타이어.
310. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 에어-컨디셔너 설비.
311. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 철도 트랙.
312. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 기차 바퀴.
313. 항목 291에 따른 얼음 핵형성 표면을 포함하는 전력 케이블.
314. 수성 액체 조성물의 결빙점을 저하시키는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 상기 수성 액체 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 접촉에 의해 상기 수성 액체 조성물의 결빙점이 저하되는 방법.
315. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 도료 조성물을 포함하는 방법.
316. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 냉동고에 사용되는 결빙방지제를 포함하는 방법.
317. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 냉장고에 사용되는 결빙방지제를 포함하는 방법.
318. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 엔진에 사용되는 결빙방지제를 포함하는 방법.
319. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 바람막이 유리 워시를 포함하는 방법.
320. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 실리콘을 포함하는 방법.
321. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 도료, 래커 또는 니스와 같은 코팅 조성물을 포함하는 방법.
322. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 왁스를 포함하는 방법.
323. 항목 314에 있어서, 상기 조성물은 오일을 포함하는 방법.
324. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 시멘트를 포함하는 방법.
325. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 콘크리트를 포함하는 방법.
326. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 비누를 포함하는 방법.
327. 항목 314에 있어서, 상기 액체 조성물은 자물쇠에 사용되는 결빙방지 조성물을 포함하는 방법.
328. 수성 액체 조성물의 재결정화를 감소 또는 제거하는 방법으로서, 상기 방법은 결빙 전에 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 수성 액체 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 수성 액체 조성물의 재결정화가 감소 또는 제거되는 방법.
329. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 도료 조성물을 포함하는 방법.
330. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 냉동고에서 사용되는 결빙방지제를 포함하는 방법.
331. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 냉장고에 사용되는 결빙방지제를 포함하는 방법.
332. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 엔진에 사용되는 결빙방지제를 포함하는 방법.
333. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 바람막이 유리 워시를 포함하는 방법.
334. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 실리콘을 포함하는 방법.
335. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 래커를 포함하는 방법.
336. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 왁스를 포함하는 방법.
337. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 오일을 포함하는 방법.
338. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 시멘트를 포함하는 방법.
339. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 콘크리트를 포함하는 방법.
340. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 비누를 포함하는 방법.
341. 항목 328에 있어서, 상기 액체 조성물이 자물쇠에 사용되는 결빙방지 조성물을 포함하는 방법.
342. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드와 생물학적 샘플 또는 장기를 접촉시킴으로써 생물학적 샘플 또는 장기를 보존하고 및/또는 결빙점을 저하시킴으로써 과냉각 조건 또는 결빙 조건에서 생물학적 샘플 또는 장기의 저장을 가능하게 하는 방법.
343. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 폴리펩티드를 포함하는 방법.
344. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 마이크로솜 또는 미셸을 포함하는 방법.
345. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 전혈을 포함하는 방법.
346. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장을 포함하는 방법.
347. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 혈소판을 포함하는 방법.
348. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 적혈구를 포함하는 방법.
349. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 정액을 포함하는 방법.
350. 항목 342에 있어서, 생물학적 샘플이 생식체를 포함하는 방법.
351. 항목 342에 있어서, 상기 샘플이 곤충 세포의 세포 배양물을 포함하는 방법.
352. 항목 342에 있어서, 상기 샘플이 포유류 세포의 세포 배양물을 포함하는 방법.
353. 항목 352에 있어서, 포유류 세포가 설치류 세포인 방법.
354. 항목 352에 있어서, 포유류 세포가 인간 세포인 방법.
355. 항목 352에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 장기로 구성되거나 포함하는 방법.
356. 항목 355에 있어서, 장기는 신장, 폐, 심장, 비장, 및 간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
357. 생물학적 샘플 또는 장기의 저장 동안 이들의 재결정화를 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드와 상기 생물학적 샘플 또는 장기를 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 과냉각 조건 또는 결빙 조건에서 생물학적 샘플 또는 장기의 재결정화를 억제하고 저장을 가능하게 하는 방법.
358. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 폴리펩티드를 포함하는 방법.
359. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 마이크로솜 또는 미셸을 포함하는 방법.
360. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈을 포함하는 방법.
361. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 혈장을 포함하는 방법.
362. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 혈소판을 포함하는 방법.
363. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 적혈구를 포함하는 방법.
364. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 정액을 포함하는 방법.
365. 항목 357에 있어서, 생물학적 샘플은 생식체를 포함하는 방법.
366. 항목 357에 있어서, 상기 샘플은 곤충 세포의 세포 배양물을 포함하는 방법.
367. 항목 357에 있어서, 상기 샘플은 포유류 세포의 세포 배양물을 포함하는 방법.
368. 항목 367에 있어서, 포유류 세포는 설치류 세포인 방법.
369. 항목 367에 있어서, 포유류 세포는 인간 세포인 방법.
370. 항목 357에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 장기로 구성되거나 포함하는 방법.
371. 항목 370에 있어서, 장기는 신장, 폐, 심장, 비장, 및 간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
372. 식품과 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 접촉시킴으로써 식품이 냉동 상태로 되는 온도에서 냉동되지 않은 상태로 식용 또는 음용 조성물을 개선 또는 연장 저장할 수 있는 식품과 같은 식용 또는 음용 조성물을 보존하는 방법.
373. 항목 372에 있어서, 조성물은 밀크, 발효 밀크 제품, 치즈, 저민 육류, 저민 어류, 요구르트, 셔벗, 푸딩, 야채 퓨레, 과일 퓨레, 도우, 아이스 밀크, 커스터드, 빙수, 슬러시 얼음, 스무디, 아이스크림, 그라니타, 파스타 및 육류로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
374. 식품과 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 접촉시킴으로써 얼음 결정이 형성되는 온도에서 저장 동안 조성물 상에 형성된 얼음 결정의 재결정화를 감소 또는 억제하는 식품과 같은 식용 또는 음용 조성물 상의 얼음 결정의 재결정화를 감소 또는 억제하는 방법.
375. 항목 374에 있어서, 조성물은 밀크, 발효 밀크 제품, 치즈, 저민 육류, 저민 어류, 요구르트, 셔벗, 푸딩, 야채 퓨레, 과일 퓨레, 도우, 아이스 밀크, 커스터드, 빙수, 슬러시 얼음, 스무디, 아이스크림, 그라니타, 파스타 및 육류로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
376. 개체의 피부에 도포될 수 있는 화장품의 냉각 저항성을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 화장품을 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 피부에 도포되면서 화장품의 냉각 저항성이 증가되는 방법.
377. 물을 흡수할 수 있는 제품의 수분 함량을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 제품의 수분 함량이 증가되는 방법.
378. 수술에 의한 종양의 제거 방법으로서, 상기 방법은 상기 종양에 동결 단계를 행하기 전에 종양에 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 주사하는 단계를 포함하며, 이로써 종양의 사멸이 증가되는 방법.
379. 수술에 의해 지방 조직을 제어 방식으로 제거하는 방법으로서, 상기 방법은 지방 조직을 제거하기 전에 지방 조직에 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 주사하는 단계를 포함하는 방법.
380. 조 오일 제품에서 크러스레이트 형성을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 조 오일 제품에 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 첨가하는 단계를 포함하며, 이로써 크러스레이트 형성이 억제되는 방법.
381. 건조 동안 또는 고 삼투질이나 저 삼투질에 노출되는 동안에 생물학적 샘플을 안정화하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이로써 건조 동안 또는 고 삼투질이나 저 삼투질에 노출되는 동안 생물학적 샘플이 안정화되는 방법.
382. 항목 381에 있어서, 생물학적 샘플은 폴리펩티드, 마이크로솜, 미셸, 전혈, 혈장, 혈소판, 적혈구, 정액, 생식체 중 하나 이상을 포함하는 방법.
383. 항목 381에 있어서, 생물학적 샘플은 세포 배양물을 포함하는 방법.
384. 항목 383에 있어서, 세포 배양물은 곤충 세포, 포유류 세포, 설치류 세포 및 인간 세포 중 하나 이상을 포함하는 방법.
385. 상이한 분자를 포함하는 조성물로부터 하나 이상의 분자를 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 존재하에 상기 정제를 수행하는 단계를 포함하며, 이로써 상이한 분자를 포함하는 조성물의 결빙점 이하의 온도에서 정제하는 것이 가능하게 되는 방법.
386. 항목 385에 있어서, 상이한 분자를 포함하는 조성물의 분자는 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산, 당, 지방산, DNA 분자, RNA 분자, 인지질, 소기관, 예를 들어 미토콘드리아, 리보솜 등, 아데노신 트리포스페이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
387. 탈수될 조성물의 탈수를 개선하는 방법으로서, 상기 방법은 항목 1 내지 209 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드와 상기 조성물을 접촉시키는 단계, 및 상기 조성물을 탈수시키는 단계를 포함하는 방법.
388. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
389. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 표면적으로 균질하게 또는 불균질하게 분포된 조성물.
390. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 상기 조성물 전체에 균질하게 또는 불균질하게 분포된 조성물.
391. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 결빙용 조성물로서, 폴리펩티드가 결빙 전에 첨가된 조성물.
392. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 결빙용 조성물로서, 폴리펩티드가 결빙 후에 첨가된 조성물.
393. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물.
394. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 얼음 방지 표면.
395. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 얼음 결합 표면.
396. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 생물학적 샘플.
397. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 식용 조성물.
398. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 액체 조성물.
399. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 고체 조성물.
400. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 고체 조성물로서, 폴리펩티드가 표면적으로 분포된 고체 조성물.
401. 항목 1 내지 209에 따른 폴리펩티드를 포함하는 고체 조성물로서, 폴리펩티드가 샘플 전체에 균질하게 또는 불균질하게 분포된 고체 조성물.
Rhagium mordax로부터 결빙방지 단백질의 재조합 발현, 정제 및 특성화를 설명함으로써 본 발명은 이제 더 상세히 설명된다.
실시예
R. mordax로부터 결빙방지 폴리펩티드를 확인하고 정제하기 위해 두 가지 상이한 전략이 사용되었다.
1) Kristiansen et al. (2005)에 공개된 방법을 사용하여 결빙방지 폴리펩티드를 정제하였다.
2) R. Inquisitor AFP의 N-말단과 C-말단의 영역들이 일치되도록 2개의 축퇴된 프라이머를 설계하였다(도 1). 이들을 사용하여 종래의 RT-PCR 반응에서 겨울철 동물로부터 분리된 R. mordax RNA로부터 cDNA 영역을 증폭하였다. 이러한 cDNA는 R. mordax로부터의 잠정적 AFP의 중심 영역을 암호화한다. 이 접근법에 의해서 두 가지 타입(패밀리)의 폴리펩티드의 중심 부분(99-108aa)의 서열이 얻어졌다.
3) 이어서 9개 이소자임에 대한 전-길이 AFP 서열이 얻어졌다. 잠정적 AFP를 암호화하는 cDNA의 각 중심 부분에 특이적인 프라이머를 Clontech Smart RACE cDNA 증폭 키트를 사용한 적절한 5' 단부(5' RACE)의 증폭과 조합하여 사용하였다. 일단 각 cDNA의 5' 단부가 얻어지면 이 서열을 전-길이 클론을 얻는데 사용한다. 이것은 R. mordax RNA의 RT-PCR 반응에서 mRNA 폴리-A 테일과 일치하는 프라이머와 조합하여 각 cDNA의 맨 끝 5-단부와 일치하는 프라이머를 사용하여 행해진다. 전체적으로, 그룹 I AFP의 여러 동형을 암호화하는 9개의 전-길이 cDNA가 얻어졌고, 암호화된 폴리펩티드가 추론되었다.
발현 및 정제
Rhagium mordax RmAFP로부터 결빙방지 단백질(AFP)의 동형을 6개 클로닝하였다. 도 5는 야생형(wf) 동형 RmAFPI와 결실 변이체(Δ2-9, WC (Trp-Cys))의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. RmAFP 변이체는 RmAFPI의 C-말단으로부터 한번에 하나 얼음 결합 도메인의 결실(Δ2-Δ9)(예를 들어, Δ4는 잠정적 얼음 결합 도메인 4-9의 결실을 나타낸다)과 C-말단에 Trp와 Cys 잔기를 함유하는 변이(WC)로서 구성되었다. 이들을 pGEX 벡터 시스템(GE Healthcare)에서 클로닝하고, E. coli(균주: Origami, BL21)에서 형질전환시켰다. 단백질은 GST와 RmAFP 사이에 트롬빈 절단 부위를 함유하는 글루타티온-S-트랜스페라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현되었다. 프렌치 프레스에 의해 세포를 용해시키고, 세파로스 비드에 공유 부착된 환원된 글루타티온을 사용한 친화성 크로마토그래피와 크기 배제 크로마토그래피에 기초하여 정제하였다. 도 5에서 화살표는 AFP1의 결실 유도체의 위치를 나타낸다.
활성 측정
Rhagium mordax 결빙방지 단백질의 야생형 동형과 이들의 변이체들을 나노리터 오스모미터를 사용하여 활성에 대해 시험하였다. 그 결과를 아래 표 4에 나타낸다. RmAFP 변이체는 RmAFPI의 C-말단으로부터 한번에 하나 얼음 결합 도메인의 결실과 C-말단에 Trp와 Cys 잔기를 함유하는 변이로서 구성되었다. THapp는 AFP의 농도를 고려하지 않고 분석으로부터 직접 추정된 열 이력이며, AFP는 각 측정에서 정제된 AFP 또는 융합 단백질이나 얼음 분획으로서의 AFP이고, 예외적으로 별표 표시된 TH는 TH 대 얼음 분획의 플롯에 나타난 지점들을 이은 직선의 외삽에 의해 추정되었고, n은 측정 횟수이다. 측정되지는 않지만 진행중임(N.D). Δ5-9 및 Δ4-9에서 검출가능한 활성이 발견된다는 사실은 4 및 3개의 잠정적 얼음 결합 모티프를 함유하는 AFP1의 말단 절단된 버전이 각각 얼음 결정의 성장을 방지하는 능력을 보유한다는 것을 증명한다. 결실 유도체의 특이적 활성은 측정되지 않았으며, wt 단백질과 비교한 활성은 현재로서는 불명이다.
Figure pct00019
RmAFP 활성의 육안 조사
도 6은 1) RmAFPI의 용액 및 2) 등가시치 Zoarces viviparus(타입 3 AFP를 가진 덴마크 어류)의 혈청의 이력 결빙점에서 일어나는 "얼음 성장-폭발"의 진행을 예시한다. 두 경우 모두 온도가 저하되기 전에 작은 얼음 결정이 용액 중에서 단련되었다. RmAFP 용액에서는 온도가 감소했을 때 초기 얼음 결정(1A에서 화살표)은 이력 결빙점에 도달하기 전에는 성장하거나 모양이 변하지 않았다. 이력 결빙점(1B)에서 얼음 결정이 갑자기 쏟아지고, 과냉각된 주변환경으로 인해 용액이 결빙된다. 이 경우에는 이력 결빙점에서 얼음 성장 패턴이 콜리플라워 모양임이 주목된다(1B, 1C). 이와 달리, 2)의 경우(Z. viviparus 혈청)에는 냉각되면 얼음 결정의 모양이 서서히 변하여 육각형 기저면을 가진 바이피라미드가 된다(2A). 이력 결빙점에서는 얼음 성장이 침상형(2B)이고, 용액 중의 모든 얼음이 침상체(2C)로서 성장하고 있다. 결론적으로, RmAFP는 모든 얼음 성장 또는 얼음 결정 모양의 변화를 억제할 수 있다(1). 이것은 일반적으로 (2)에서 보이는 패턴을 따르는 어류 결빙방지 단백질 용액과는 상당히 다르다.
RmAFPI 의 물리화학적 특성화 - 질량분광기( MALDI - ToF )
클로닝되고 정제된 Rhagium mordax AFP1의 분자량 결정을 도 7에 나타낸다. 정제된 재조합 rRmAFPI의 질량분광기에 의한 분석을 Alphalyse(Odense, 덴마크)의 MALDI-ToF 분석에 의해 수행하였다. rRmAFPI의 분자량 측정에 의해 12555 Da의 평균값이 산출되었다. 이런 차이는 장치를 캘리브레이션할 때 사용한 외부 기준 때문일 수 있다.
크기-배제 크로마토그래피
또한, rRmAFPI의 다이머화를 조사하였고, 그 결과를 도 8에 나타낸다. 자생 조건에서는 rRmAFP가 다이머로서 거동하는데, 그것이 크기 배제 칼럼(Superdex 75, 10/30, GE Healthcare)을 지나 통과할 때 같은 Mw 범위의 다른 단백질보다 더 짧은 체류 시간을 나타내기 때문이다. Superdex 75를 소 혈청 알부민(68 KDa, BSA), 트립신(25 KDa), 및 인간 시스타틴 C(13 KDa)로 캘리브레이션했을 때, rRmAFPI의 SEC로부터의 Mw 추정값은 28 KDa였다. 이것을 도 8A에 나타낸다. 마찬가지로, RmAFP는 SDS PAGE에서 전개하였을 때 다이머로서 거동하며, Mw는 28 KDa로 추정되었다. 레인 1: 소 혈청 알부민(BSA); 2: 트립신; 3: RNAse A; 4 시스타틴 C; 5: 리소자임; 6: RmAFPI; 7: 글루타티온-S-트랜스페라제(GST). 이것을 도 8B에 나타낸다.
원편광 이색성 분광법
원평광 이색성 분광법(CD)을 코펜하겐 대학에서 수행하였다. 그 결과를 도 9에서 볼 수 있다. 도 9A에 따르면, 먼 UV CD 스펙트럼은 재조합 단백질이 정의된 구조를 가진다는 것을 나타낸다. 도 9B에 나타낸 가까운 UV CD 스펙트럼은 rRmAFP가 높은 함량의 베타-시트 구조를 가진다는 것을 시사한다.
차등 주사 열량법
차등 주사 열량법(DSC; Seal, Moscow, 러시아)에 의해 온도 안정성을 조사하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다. RmAFPI의 전이 온도 Tm은 47.7℃로 추정되었다. 1차 스캔은 온도 범위 6-100℃에서 수행하였고, 계속해서 11회의 스캔을 온도 범위 6-70℃에서 수행하였다. 곡선의 비대칭 모양은 단백질 다이머의 해리에 이어진 모노머의 언폴딩을 시사한다. 11회 스캔의 결과인 곡선들의 전체적인 유사성은 RmAFP가 물질의 어떤 손실 없이 연속되는 가열/냉각 사이클 시에 여러 번 변성되고 재생될 수 있다는 것을 나타낸다. 아래쪽 라인은 버퍼 대조군에 대해 수행된 유사한 가열 사이클의 결과이다. 계속해서, 가열-냉각 사이클을 12회 행한 샘플을 활성에 대해 분석하였고, 0.94℃에서 열 이력 THapp을 산출하였는데, 이것은 출발 물질의 활성과 차이가 없었다. 이들 연구는 단백질이 중간 정도로 안정하지만, 변성 후 생물학적 활성 분자로 재생되는 두드러진 특징을 가진다는 것을 시사한다.
활성 및 안정성에 대한 pH 의 영향
또한, 활성 및 안정성에 대한 pH의 영향을 조사하였다. 나타낸 pH 값에서 1시간 예비 인큐베이션하였을 때 pH 7.2에서 TH로서 나타낸 RmAFP의 안정성에 대한 pH의 효과를 도 11에 나타낸다.
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<400> 51 Ile Ala Thr Ser Thr Ser Ser 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 52 Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 53 Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 54 Thr Ser Thr Ile Ser Ala Ser 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 55 Thr Gln Thr Ser Thr Val Thr 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 56 Thr Ala Thr Thr Thr Val Thr 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 57 Thr Cys His Ala Lys Ala Thr 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 58 Thr Ser Thr Ala Thr Ala Thr 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 59 Thr Ala Thr Ser Thr Ser Thr 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 60 Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 61 Thr Ala Thr Ser Thr Ala Thr 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 62 Ser Ser Thr Thr Ser Ala Ser 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 63 Thr Gln Thr Lys Thr Val Ser 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 64 Thr Ala Thr Thr Thr Val Thr 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 65 Thr Cys His Ala Lys Ala Thr 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 66 Thr Ser Thr Ala Thr Ala Thr 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 67 Thr Ala Thr Ser Thr Ser Thr 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 68 Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 69 Thr Ala Thr Ser Thr Ala Thr 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 70 Ser Ser Thr Thr Ser Ala Ser 1 5 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 71 Thr Gln Thr Lys Thr Val Ser 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 72 Thr Ala Thr Thr Thr Val Thr 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X could be any of the amino acids H, N or T. <400> 73 Thr Cys Xaa Ala Lys Ala Thr 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X could be any of the amino acids R or T. <400> 74 Xaa Ser Thr Ala Thr Ala Thr 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X could be any of the amino acids I, S, T or V. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X could be any of the amino acids S or T. <400> 75 Xaa Ala Thr Ser Thr Ser Xaa 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 76 Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X could be any of the amino acids S or T. <400> 77 Thr Ala Thr Xaa Thr Ala Thr 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X could be any of the amino acids A, S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X could be any of the amino acids I or T. <400> 78 Xaa Ser Thr Xaa Ser Ala Ser 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X could be any of the amino acids K, R, Q or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X could be any of the amino acids I or V. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X could be any of the amino acids S or T. <400> 79 Thr Gln Thr Xaa Thr Xaa Xaa 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 80 Thr Ala Thr Thr Thr Val Thr 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X could be any of the amino acids A or G. <400> 81 Cys Arg Ala Val Gly Val Asp Xaa 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X could be any of the amino acids V, I or L. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X could be any of the amino acids H or Q. <400> 82 Val Thr Asp Xaa Xaa Gly Thr Cys 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Rhagium mordax <400> 83 Gly Ala Val Ala Ser Gly Thr Ser 1 5 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X could be any of the amino acids T, S, K, R or H. <400> 84 Asp Gly Ser Xaa Ser Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ser Gly Ala 1 5 10 <210> 85 <211> 11 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X could be any of the amino acids S or G. <400> 85 Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Xaa Asn Ala 1 5 10 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X could be any of the amino acids A, G, D or E. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X could be any of the amino acids N, Q, R, K or H. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X could be any of the amino acids S or T. <400> 86 Ala Thr Ser Asn Ala Ile Xaa Xaa Gly Thr Ala Thr Xaa Thr Ala Thr 1 5 10 15 Gly <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X could be any of the amino acids S or T. <400> 87 Ser Ala Ser Ala Xaa Glu Pro Thr Gln Thr 1 5 10 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X could be any of the amino acids S or T. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X could be any of the amino acids A or G. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X could be any of the amino acids I, V or F. <400> 88 Gly Xaa Gln Thr Xaa Thr Ala Xaa Ala 1 5 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X could be any of the amino acids A, G, S or T. <400> 89 Asp Thr Ala Thr Thr Thr Val Thr Xaa Ser 1 5 10 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Rhagium mordax <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X could be any of the amino acids A, D, G or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X could be any of the amino acids A, V, I, T or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X could be any of the amino acids A, G or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X could be any of the amino acids I, T, V or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X could be any of the amino acids I, T, A or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X could be any of the amino acids T, V or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X could be any of the amino acids A, G or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X could be any of the amino acids T, V or S. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X could be any of the amino acids A, G or S. <400> 90 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Synthetic peptide <400> 91 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (29)

  1. SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 잔기의 서열로 구성되거나 이들을 포함하는 분리된 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가 얼음 결정의 형성 및/또는 성장을 감소시키거나 억제할 수 있는 분리된 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:1인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:2인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:3인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:4인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:5인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:6인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:7인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 1 항에 있어서, 서열이 SEQ ID NO:8인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10 항에 있어서, 적합한 숙주 세포에서 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 발현 신호를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 10 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제 10 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제 12 항에 따른 벡터 또는 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 분리된 재조합 세포.
  14. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 식용품.
  15. 제 14 항에 있어서, 식용품이 냉동된 것을 특징으로 하는 식용품.
  16. 제 14 항에 있어서, 식용품이 냉동 당과 제품인 것을 특징으로 하는 식용품.
  17. 제 14 항에 있어서, 식용품이 아이스크림 제품 또는 빵인 것을 특징으로 하는 식용품.
  18. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 고체 지지체 물질.
  19. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법이
    i) 제 10 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제 12 항에 따른 벡터를 제공하는 단계,
    ii) 단계 i)에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 재조합 발현에 의해 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 생산하는데 적합한 숙주 세포를 제공하는 단계,
    iii) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 생산하는 단계, 및 선택적으로
    iv) 상기 폴리펩티드를 정제 및/또는 분리하는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 인시튜 제조 방법으로서, 상기 방법이
    i) 발효가능한 출발 물질을 제공하는 단계,
    ii) 상기 발효가능한 식품 출발 물질을 발효시킬 수 있고, 상기 발효가능한 식품 출발 물질이 발효될 때 적합한 조건에서 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 생산할 수 있는 미생물을 제공하는 단계,
    iii) 상기 미생물의 존재하에 상기 식품 출발 물질을 발효시킴으로써 발효된 식용품을 제조하는 단계
    를 포함하며, 상기 발효된 식용품이 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 방법.
  21. 냉동 식용품에서 얼음 결정 형성을 감소 또는 억제하는 방법으로서, 상기 방법이
    i) 냉동 식용품, 또는 그것을 제조하는데 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
    ii) 경우에 따라 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에, 상기 제품 및/또는 상기 원료를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계
    를 포함하며, 이로써 냉동 식용품에서 얼음 결정 형성이 감소 또는 억제되는 방법.
  22. 냉동 식용품에서 얼음 결정 성장을 감소 또는 억제하는 방법으로서, 상기 방법이
    i) 냉동 식용품, 또는 그것을 제조하는데 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
    ii) 경우에 따라 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에, 상기 제품 및/또는 상기 원료를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계
    를 포함하며, 이로써 냉동 식용품에서 얼음 결정 성장이 감소 또는 억제되는 방법.
  23. 냉동 식용품에서 얼음 결정을 구조화하는 방법으로서, 상기 방법이
    i) 냉동 식용품, 또는 그것을 제조하는데 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
    ii) 경우에 따라 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에, 상기 제품 및/또는 상기 원료를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계
    를 포함하며, 이로써 냉동 식용품에서 얼음 결정이 구조화되는 방법.
  24. 냉동 식용품의 질감 또는 관능 품질을 조정하는 방법으로서, 상기 방법이
    i) 냉동 식용품, 또는 그것을 제조하는데 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
    ii) 경우에 따라 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에, 상기 제품 및/또는 상기 원료를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계
    를 포함하며, 이로써 냉동 식용품의 질감 또는 관능 품질이 조정되는 방법.
  25. 냉동 식용품의 제조 또는 저장 동안 얼음 결정 형성을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법이
    i) 냉동 식용품, 또는 그것을 제조하는데 필요한 하나 이상의 원료를 제공하는 단계, 및
    ii) 경우에 따라 제품의 제조 전에, 도중에, 또는 이후에, 상기 제품 및/또는 상기 원료를 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및
    iii) 냉동 식용품의 제조 또는 저장 동안 상이한 시점들에서 얼음 결정 형성을 모니터링하는 단계
    를 포함하는 방법.
  26. 여성 개체에서 시험관 수정(IVF) 치료를 수행하는 방법으로서, 상기 방법이
    i) 여성 개체로부터 하나 이상의 난모세포(들)를, 선택적으로 난포액을 포함하는 생물학적 샘플과 함께 제거하는 단계,
    ii) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 존재하에, 하나 이상의 난모세포(들)를, 선택적으로 생물학적 샘플과 함께 냉동시키는 단계,
    iii) 제거된 난모세포 중 하나 이상을 시험관 수정시키는 단계, 및
    iv) 수정된 난모세포 중 하나 이상을 여성 개체에 이식하는 단계
    를 포함하는 방법.
  27. 여성 개체에서 임신의 가능성 또는 확률을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이
    ii) 여성 개체로부터 하나 이상의 난모세포(들)를, 선택적으로 난포액을 포함하는 생물학적 샘플과 함께 제거하는 단계,
    iii) 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 존재하에, 하나 이상의 난모세포(들)를, 선택적으로 생물학적 샘플과 함께 냉동시키는 단계,
    iv) 제거된 난모세포 중 하나 이상을 시험관 수정시키는 단계, 및
    v) 하나 이상의 수정된 난모세포를 여성 개체에 이식하는 단계
    를 포함하며, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 존재하에 하나 이상의 난모세포(들)를 냉동시키는 단계가 임신의 가능성 또는 확률을 증가시키는 것인 방법.
  28. 제 26 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 과립층-황체 세포 또는 난포 세포를 더 포함하고, 또한 선택적으로 여성 개체의 난소 난포로부터 회수된 다른 난소 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 샘플이 난모세포의 주위환경에서 유래하는 냉동된 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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