JP2002541846A - 脂肪細胞補体関連タンパク質同族体ｚａｃｒｐ２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを支持するタンパク質ファミリーの新規なメンバーであるzacrp2のためのポリヌクレオチドおよびポリペプチド分子に関する。ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドは二量化およびオリゴマー化に関係づけられ、そしてそれらの研究に使用することができる。本発明は、また、zacrp2ポリペプチドに対する抗体を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 エネルギー収支（エネルギー代謝、栄養状態、脂肪貯蔵およびその他を包含す
る）は健康の重要な基準である。このエネルギーホメオスタシスは、食物摂取お
よび随意および非随意機能に必要なエネルギーを発生させるための炭水化物およ
び脂肪の代謝を包含する。タンパク質の代謝はエネルギー発生に導くが、好まし
くは筋肉の形態または修復に導く。他の結果の中で、エネルギーのホメオスタシ
スの欠如は脂肪組織の過度または過小の形成に導く。

【０００２】 脂肪の形成および貯蔵はインスリンでモジュレートされる。例えば、インスリ
ンは細胞の中へのグルコースの輸送を刺激し、細胞においてグルコースはα−グ
リセロホスフェートに代謝され、これは脂肪酸のエステル化に使用されて、それ
はトリグリセリドとして貯蔵される。さらに、脂肪細胞は特異的輸送タンパク質
を発現し、このタンパク質は遊離脂肪の脂肪細胞への転移を増強する。

【０００３】 脂肪細胞は、また、グルコースおよび脂肪代謝のホメオスタシス制御をモジュ
レートすると考えられる、いくつかのタンパク質を分泌する。これらの追加の脂
肪細胞分泌タンパク質は、アジプシン、補体因子C3およびB、腫瘍壊死因子α、o
b遺伝子産物およびAcrp30を包含する。また、脂肪細胞におけるインスリン調節
分泌経路の存在を示唆する証拠が存在する。Scherer他、J. Biol. Chem. 270
（45）：26746−9、1995。これらの成分の過度または過小の分泌は、一部分脂肪
の過度または過小の形成により衝撃され、肥満症または拒食症に直接的または間
接的に関係づけられる病理学的状態に導くことがある。

【０００４】 Acrp30は、脂肪細胞により独占的に発現される247アミノ酸のポリペプチドで
ある。Acrp30ポリペプチドは、アミノ末端のシグナル配列、既知の相同性をもた
ない27アミノ酸ストレッチ、22の完全なGly−Xaa−Proまたは不完全なGly−Xaa
−Xaaコラーゲン反復およびカルボキシ末端の球状ドメインから構成されている
。Scherer他、前掲、および国際特許出願No．WO 96／39429参照。Acrp30、イン
スリンにより調節される豊富なヒト血清タンパク質は、相補的因子C1qおよび冬
眠シベリアシマリス（Hib27）の夏血清タンパク質に対して、特にカルボキシ末
端の球状ドメインにおいて、構造的類似性を共有する。Acrp30の発現は、脂肪細
胞の分化の間に100倍以上誘導される。Acrp30は、エネルギー収支のモジュレー
ションおよび被験試料中の脂肪細胞の同定において使用することが示唆される。

【０００５】 脂肪細胞においてもっぱら産生されるように思われる、他の分泌されるタンパ
ク質はapM1であり、例えば、Maeda他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 22
1：286−9、1996に記載されている。4517bpのクローンは、244アミノ酸のオープ
ンリーディングフレームおよび長い3'非翻訳領域を有した。このタンパク質は、
シグナル配列、アミノ末端の非コラーゲン配列、22コラーゲン反復（Gly−Xaa−
ProまたはGly−Xaa−Xaa）、およびコラーゲンX、コラーゲンVIIIおよび相補的
タンパク質C1qに対して相同性を有するカルボキシ末端の領域を含んでいた。

【０００６】 相補的因子C1qは6コピーの3つの関係するポリペプチド（A、BおよびC鎖）から
成り、各ポリペプチドは近いアミノ末端のコラーゲンドメインおよびカルボキシ
末端の球状領域をもつ約225アミノ酸長さである。6つの三重らせん領域は、6つ
のA、6つのBおよび6つのC鎖のコラーゲンドメインにより形成され、中央領域お
よび6つのストークを形成する。球状ヘッド部分は、A、BおよびC鎖の球状カルボ
キシ末端のドメインのアソシエーションにより形成される。したがって、C1qは6
つのコラーゲン様ストークを介して中央フィブリル領域に結合された、6つの球
状ヘッドから構成されている。Sellar他、Biochem. J. 274：481−90、1991。
この立体配置はしばしば花束と呼ばれる。Acrp30は、単一型のポリペプチド鎖か
ら形成された、同様な花束構造を有する。

【０００７】 C1qは防御メカニズムを刺激し、ならびに組織の損傷を引き起こす毒性酸素種
の発生を誘発することが見出された（Tenner、Behring Inst. Mitt. 93：241
−53、1993）。C1q結合性部位は血小板上に見出された。追加の補体およびC1qは
炎症においてある役割を演ずる。C1qを免疫グロブリンに結合させることによっ
て、補体の活性化が開始される。 C1qおよび補体経路のインヒビターは、抗炎症的用途、補体活性化および血栓
活性化の阻害のための有効であろう。 本発明は、これらの使用および本明細書における教示から当業者にとって明ら
かである他の使用のための、このようなポリペプチドを提供する。

【０００８】 発明の要約 1つの面において、本発明は、配列番号2の残基40〜285に対して少なくとも75
％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなる単離された
ポリペプチドを提供し、ここで前記配列は、コラーゲンドメインを形成するGly
−Xaa−Xaa反復またはGly−Xaa−Pro反復（ここでXaaは任意のアミノ酸である）
；および10のベータ鎖を含んでなるカルボキシル末端のC1qドメイン；を含んで
なる。1つの態様において、ポリペプチドは配列番号2の残基16〜285に対して少
なくとも90％のアミノ酸配列の同一性を有する。

【０００９】 他の態様において、コラーゲンドメインは24のGly−Xaa−Xaa反復と10のGly−
Xaa−Pro反復とを含んでなる。他の態様において、カルボキシル末端のC1qドメ
インは配列番号5の配列を含んでなる。他の態様において、カルボキシル末端のC
1qドメインは配列番号2のアミノ酸残基151〜155、172〜174、180〜183、187〜19
0、193〜205、208〜214、220〜227、229〜241、246〜251および269〜274を含ん
でなる。他の態様において、ポリペプチドと配列番号2との間の差は保存的アミ
ノ酸置換のためである。

【００１０】 他の態様において、ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列から成るポリペ
プチドに特異的に結合する抗体に特異的に結合する。それ以上の態様において、
ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸残基16〜285を含んでなる。他の態様におい
て、ポリペプチドは、親和標識、トキシン、ラジオヌクレオチド、酵素および蛍
光体から成る群から選択される部分にアミノ末端またはカルボキシル末端におい
て共有結合されている。なお他の態様において、カルボキシ末端のC1qは配列番
号2のアミノ酸残基142〜285から成る。

【００１１】 本発明は、また、下記のポリペプチドから成る群から選択される単離されたポ
リペプチドを提供する： a）配列番号2のアミノ酸残基40〜アミノ酸残基141に対して少なくとも75％の
アミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； b）配列番号2のアミノ酸残基142〜アミノ酸残基285に対して少なくとも75％の
アミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド；およ
び c）配列番号2のアミノ酸残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ酸配列
の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド。

【００１２】 他の態様において、本発明は、ペプチド結合により結合された第1部分と第2部
分とを含んでなる融合タンパク質を提供し、ここで第1部分は、 a）配列番号2のアミノ酸残基16〜アミノ酸残基285に対して少なくとも75％の
アミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド； b）配列番号2に示すアミノ酸残基1〜アミノ酸残基281のアミノ酸残基の配列を
含んでなるポリペプチド；

【００１３】 c）配列番号2に示すアミノ酸残基16〜アミノ酸残基285のアミノ酸残基の配列
を含んでなるポリペプチド； d）コラーゲン様ドメインまたは二量化またはオリゴマー化することができる
コラーゲン様ドメインの部分を含んでなる、配列番号2に示すzacrp2ポリペプチ
ドの部分； e）C1qドメインまたはC1qドメインの活性部分を含んでなる、配列番号2に示す
zacrp2ポリペプチドの部分；または f）コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを含んでなる、配列番号2に示すz
acrp2ポリペプチドの部分； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして第2部分は他の
ポリペプチドを含んでなる。

【００１４】 1つの態様において、第1部分は、 a）配列番号2のアミノ酸残基40〜アミノ酸残基141の配列から成るポリペプチ
ド； b）配列番号2のアミノ酸残基142〜アミノ酸残基285の配列から成るポリペプチ
ド；および c）配列番号2のアミノ酸残基40〜アミノ酸残基285の配列から成るポリペプチ
ド； から成る群から選択される。

【００１５】 他の態様において、本発明は、薬学上許容されるビヒクルと組み合わせた、前
述のポリペプチドを提供する。 他の面において、前述のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラ
グメントが提供される。1つの態様において、抗体は、a）ポリクローナル抗体；
b）ネズミモノクローナル抗体；c）b）に由来するヒト型化抗体；およびd）ヒト
モノクローナル抗体；から成る群から選択される。他の態様において、抗体フラ
グメントはF（ab'）、F（ab）、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小認識単位から
成る群から選択される。他の態様において、前述の抗体に特異的に結合する抗イ
ディオタイプ抗体が提供される。

【００１６】 他の面において、本発明は、下記成分から成る群から選択される単離されたポ
リペプチドを提供する： a）配列番号2の残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性
を有するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド、ここで配列は、コラーゲンドメインを形成するGly−Xaa−XaaまたはGly
−Xaa−Pro反復（ここでXaaは任意のアミノ酸である）；および 10のベータ鎖を含んでなるカルボキシル末端のC1qドメイン； を含んでなる。

【００１７】 1つの態様において、ポリペプチドは配列番号2の残基16〜285に対して少なく
とも90％のアミノ酸配列の同一性を有する。他の態様において、コラーゲンドメ
インは24のGly−Xaa−Xaa反復と10のGly−Xaa−Pro反復とを含んでなる。なお他
の態様において、カルボキシル末端のC1qドメインは配列番号5の配列を含んでな
る。

【００１８】 他の態様において、カルボキシル末端のC1qドメインは、配列番号2のアミノ酸
残基151〜155、172〜174、180〜183、187〜190、193〜205、208〜214、220〜227
、229〜241、246〜251および269〜274を含んでなる。他の態様において、ポリペ
プチドと配列番号2との間の差は保存的アミノ酸置換のためである。他の態様に
おいて、ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異
的に結合する抗体に特異的に結合する。なお他の態様において、ポリヌクレオチ
ドは配列番号2の残基16〜285を含んでなるポリペプチドをコードする。なお他の
態様において、カルボキシル末端のC1qドメインは配列番号2のアミノ酸残基142
〜285から成る。

【００１９】 また、下記から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチドが提供され
る： a）配列番号1のヌクレオチド1〜ヌクレオチド1161のヌクレオチド配列； b）配列番号1のヌクレオチド133〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； c）配列番号1のヌクレオチド178〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； d）配列番号1のヌクレオチド250〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； e）配列番号1のヌクレオチド556〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； f）配列番号1のヌクレオチド133〜ヌクレオチド555のヌクレオチド配列； g）配列番号1のヌクレオチド178〜ヌクレオチド555のヌクレオチド配列； h）配列番号1のヌクレオチド250〜ヌクレオチド555のヌクレオチド配列；

【００２０】 i）配列番号2の残基40〜141のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して少
なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド； j）配列番号2の残基142〜285のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して少
なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド； k）配列番号2の残基40〜285のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して少
なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド；

【００２１】 l）配列番号2の残基16〜141のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して少
なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド； m）ストリンジェント洗浄条件に従い配列番号1のヌクレオチド配列、または配
列番号1の相補体から成るポリヌクレオチドに対してハイブリダイズして保持さ
れるポリヌクレオチド； 上記n）a）、b）、c）、d）、e）、f）、g）、h）、i）、j）、k）、l）また
はm）に対して相補的なヌクレオチド配列；および 上記i）、j）、k）またはl）の縮重ヌクレオチド配列。

【００２２】 さらに、本発明は、ペプチド結合により結合された第1部分と第2部分とを含ん
でなる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し：ここ
で第1部分は、 a）配列番号2のアミノ酸残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ酸配列
の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド； b）配列番号2のアミノ酸残基1〜285のアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペ
プチド； c）配列番号2のアミノ酸残基16〜285のアミノ酸残基の配列を含んでなるポリ
ペプチド；

【００２３】 d）コラーゲン様ドメインまたは二量化またはオリゴマー化することはできる
、コラーゲン様ドメインの部分を含んでなる配列番号2のポリペプチドの部分； e）C1qドメインを含有する配列番号2のポリペプチドの部分；または f）コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを含んでなる、配列番号2のポリ
ペプチドの部分； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして第2部分は他の
ポリペプチドを含んでなる。 また、配列番号10のヌクレオチド1〜ヌクレオチド855から成る単離されたポリ
ヌクレオチドが提供される。

【００２４】 他の面において、本発明は、下記の作用可能に連鎖された因子を含んでなる発
現ベクターを提供する： 転写プロモーター； 前述のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および 転写ターミネーター。 1つの態様において、DNAセグメントは配列番号2の残基16〜285に対して少なく
とも90％のアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドをコードする。他の態様
において、コラーゲンドメインは24のGly−Xaa−Xaa反復と10のGly−Xaa−Pro反
復とを含んでなる。他の態様において、カルボキシル末端のC1qドメインは配列
番号5の配列を含んでなる。

【００２５】 他の態様において、カルボキシル末端のC1qドメインは、配列番号2のアミノ酸
残基151〜155、172〜174、180〜183、187〜190、193〜205、208〜214、220〜227
、229〜241、246〜251および269〜274を含んでなる。他の態様において、ポリペ
プチドと配列番号2との間の差は保存的アミノ酸置換のためである。他の態様に
おいて、カルボキシル末端のC1qドメインは配列番号2のアミノ酸残基142〜285か
ら成る。なお他の態様において、ポリペプチドは配列番号2のアミノ酸配列から
成るポリペプチドに特異的に結合する抗体に特異的に結合する。

【００２６】 なお他の態様において、DNAセグメントは配列番号2のアミノ酸残基16〜285を
含んでなるポリペプチドをコードする。それ以上の態様において、DNAセグメン
トは親和標識にアミノ末端またはカルボキシル末端において共有結合されたポリ
ペプチドをコードする。他の態様において、DNAセグメントはポリペプチドに作
用可能に連鎖された分泌シグナル配列をさらにコードする。関係する態様におい
て、分泌シグナル配列は配列番号2の残基1〜15を含んでなる。

【００２７】 他の面において、本発明は、前述の発現ベクターが導入されており、DNAセグ
メントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞を提供する。 なお他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなるポリペプチドを製造
する方法を提供する：前述の発現ベクターが導入された細胞を培養し；これによ
り細胞はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し；そして発現
されたポリペプチドを回収する。

【００２８】 発明の詳細な説明 本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することはその理解の助けと
なるであろう： 用語「親和標識」は、本明細書において、ポリペプチドの精製または検出を提
供するか、あるいは基質へのポリペプチドの結合部位を提供するために、ペプチ
ドに結合させることができるポリペプチドのセグメントを表すために使用される
。原理的には、抗体または他の特異的な結合因子が利用可能な任意のペプチドま
たはタンパク質を親和標識として使用することができる。

【００２９】 親和標識は下記のものを包含する：ポリヒスチジントラクト、プロテインA（N
ilsson他、EMBO J. 4：1075、1985；Nilsson他、Methods Enzymol. 198：3
、1991）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（SmithおよびJohnson、Gene 67
：31、1988）、サブスタンスP、Flag^TMペプチド（Hopp他、Biotechnology 6：1
204−10、1988、Eastman Kodak Co.、コネチカット州ニューヘブン、から入手
可能である）、ストレプチアビジン結合ペプチド、または他の抗原エピトープま
たは結合ドメイン。一般に、Ford他、Protein Expression and Purification
2：95−107、1991、参照。親和標識をコードするDNAは、商業的供給会社から
入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech、ニュージャージイ州ピスカタウ
ェイ）。

【００３０】 用語「対立遺伝子変異型」は、本明細書において、同一染色体遺伝子座を占有
する遺伝子の2またはそれ以上のオールタネイト形態の任意のものを表すために
使用される。対立遺伝子の変動は突然変異により天然に起こり、そして集団内に
表現型の多形性を生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサイレント（コー
ドされたポリペプチドの非変化）であるか、あるいは変更されたアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードすることができる。対立遺伝子変異型という用語は
、また、本明細書において遺伝子の対立遺伝子変異型によりコードされるタンパ
ク質を表すために使用される。

【００３１】 用語「アミノ末端」または「カルボキシル末端」は、本明細書において、ポリ
ペプチド内の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語
は近接性または相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を
参照して使用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端
に位置するある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置
するが、完全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。

【００３２】 用語「相補体／抗相補体の対」は、適当な条件下に非共有結合的にアソシエー
トした安定な対を形成する、非同一部分を表す。例えば、ビオチンおよびアビジ
ン（またはストレプトアビジン）は、相補体／抗相補体の対のプロトタイプのメ
ンバーである。他の典型的な相補体／抗相補体の対は、レセプター／リガンドの
対、抗体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）の対、センス／アンチセン
スポリヌクレオチドの対、およびその他を包含する。相補体／抗相補体の対の引
き続く解離を望む場合、補体／抗補体の対は好ましくは＜10⁹／Mの結合アフィニ
ティーを有する。

【００３３】 用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、相補的塩基配列を有しかつ参照配
列に比較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列5'
ATGCACGGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。 用語「contig」は、他のポリヌクレオチドに対して同一であるか、あるいは相
補的な配列の隣接するストレッチを有するポリヌクレオチドを表す。隣接する配
列は、それらの全体においてあるいはポリヌクレオチドの部分的ストレッチに沿
って、ポリヌクレオチド配列の所定のストレッチを「オーバーラップ」させると
言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列5'−ATGGCTTAGCTT−3'に対する代表的
なcontigは5'−TAGCTTgagtct−3'および3'−gtcgacTACCGA−3'である。

【００３４】 用語「縮重ヌクレオチド配列」は、1またはそれ以上の縮重コドンを含むヌク
レオチド配列（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して
）を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一
アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACのトリプレットの各々はAs
pをコードする）。

【００３５】 用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に
連鎖された、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または
円形のDNA分子を表すために使用される。このような追加のセグメントは、プロ
モーターおよびターミネーターの配列を包含し、そして、また、1またはそれ以
上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリア
デニル化シグナル、およびその他を包含することができる。発現ベクターは、一
般に、プラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、あるいは双方の因子を
含有することができる。

【００３６】 用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに適用されるとき、ポリヌクレオチ
ドがその自然の遺伝的環境から取出され、こうして他の余分または望ましくない
コーディング配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で使
用するために適当な形態であることを表す。このような単離された分子はそれら
の自然の環境から分離されたものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクローンを
包含する。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常アソシエートされる他
の遺伝子を含まないが、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域、例えば、プロ
モーターおよびターミネーターを包むことができる。アソシエートされた領域の
同定は当業者にとって明らかであろう（例えば、DynanおよびTijan、Nature 31
6：774−78、1985、参照）。

【００３７】 「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その自然環境、例えば、血
液および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパ
ク質である。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチ
ド、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形
態、すなわち、95％より大きい純度、より好ましくは99％より大きい純度のポリ
ペプチドを提供することが好ましい。この関係において使用するとき、用語「単
離された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または誘
導化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。

【００３８】 用語「作用可能に連鎖された」は、DNAセグメントについて言及するとき、セ
グメントがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転
写がプロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネー
ターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。 用語「オーソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能
的対応物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。
オーソログ間の配列の差は種形成の結果である。 「パラログ」は、生物により作られた、明確な、構造的に関係するタンパク質
である。パラログは遺伝子の重複を通して生ずると考えられる。例えば、α−グ
ロビン、β−グロビン、およびミオグロビンは互いにパラログである。

【００３９】 「ポリヌクレオチド」は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。ポリ
ヌクレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離され、in vitroで合成
されるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造することがで
きる。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略号「bp」）、ヌクレオチド（「
nt」）、またはキロ塩基（「kb」）として表される。

【００４０】 この関係が許す場合、後者の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌク
レオチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、そ
れは全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解さ
れるであろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は
わずかに長さが異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違う
ことがある；こうして、二本鎖ポリヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドは対
合していなことがある。このような不対末端は一般に20ヌクレオチド長さを越え
ない。

【００４１】 「ポリペプチド」は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により
結合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基より小さいポリペ
プチドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。

【００４２】 「プローブおよび／またはプライマー」は、本明細書において使用するとき、
RNAまたはDNAであることができる。DNAはcDNAまたはゲノムDNAであることができ
る。ポリヌクレオチドのプローブおよびプライマーは一本鎖または二本鎖のDNA
またはRNAであり、一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クローニングされ
たcDNAまたはゲノム配列またはその補体から発生させることができる。分析用プ
ローブは一般に少なくとも20ヌクレオチド長さであるが、多少これより短いプロ
ーブ（14〜17ヌクレオチド）を使用することができる。PCRプライマーは少なく
とも5ヌクレオチド長さ、好ましくは15ntまたはそれより長い、より好ましくは2
0〜30ntである。

【００４３】 遺伝子の小さい領域を分析のためにターゲットするとき、短いポリヌクレオチ
ドを使用することができる。遺伝子の全体の分析のために、ポリヌクレオチドプ
ローブは全体のエクソンまたはそれ以上を含んでなることができる。プローブを
、この分野においてよく知られている技術に従い、例えば、酵素、ビオチン、放
射性核種、発蛍光団、化学発光因子、常磁性粒子およびその他（これらは多数の
源、例えば、モレキュラー・プローブス・インコーポレーテッド（Molecular P
robes,Inc.）、オレゴン州エウジーン、およびアマーシャム・コーポレーション
（Amersham Corporation）、イリノイ州アーリントン・ハイツ、から商業的に
入手可能である）で標識化して検出可能なシグナルを提供することができる。

【００４４】 用語「プロモーター」は、本明細書において、RNAポリメラーゼの結合を提供
しかつ転写を開始させるDNA配列を含有する遺伝子の部分を表す、この分野にお
いて認識されている意味において使用される。プロモーター配列は普通に、しか
し常にではないが、遺伝子の5'非コーディング領域の中に見出される。

【００４５】 用語「レセプター」は、生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞
上のリガンドの作用を伝達する、細胞関連タンパク質を表す。膜に結合したレセ
プターは、細胞外リガンド結合性ドメインと、典型的にはシグナルトランスダク
ションに関係する細胞内エフェクタードメインとからなる、多ペプチド構造によ
り特徴づけられる。レセプターへのリガンドの結合は、エフェクタードメインと
、細胞中の1またはそれ以上の他の分子との間の相互作用を引き起こす、レセプ
ターにおけるコンフォメーションの変化を生ずる。この相互作用は、引き続いて
、細胞の代謝の変更に導く。

【００４６】 レセプター−リガンドの相互作用に関係する代謝の事象は、遺伝子の転写、リ
ン酸化、脱リン酸化、サイクル的AMP産生の増加、細胞のカルシウムの移動化、
膜脂質の移動化、細胞の接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の
加水分解を包含する。大部分の核レセプターは、また、アミノ末端のトランス作
用性ドメイン、DNA結合性ドメインおよびリガンド結合性ドメインを包含する、
多ドメイン構造を示す。一般に、レセプターは、膜結合、細胞質ゾルまたは核レ
セプター；モノマーのレセプター（例えば、甲状腺刺激ホルモンのレセプター、
ベータ−アドレナリン作動性レセプター）またはマルチマーのレセプター（例え
ば、PDGFレセプター、成長ホルモンレセプター、IL−3レセプター、GM−CSFレセ
プター、G−CSFレセプター、エリトロポイエチンレセプターおよびIL−6レセプ
ター）であることができる。

【００４７】 用語「分泌シグナル配列」は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードす
るDNA配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大きい
ポリペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。
通常、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌
ペプチドを除去する。

【００４８】 「可溶性レセプター」は、細胞膜に結合しないレセプターポリペプチド。最も
普通には、可溶性のレセプターはトランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠
如するリガンド結合性レセプターのポリペプチドである。可溶性レセプターは、
追加のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するまたは基質へのポ
リペプチドの結合部位を提供する親和標識を含んでなることができる。多数の細
胞表面のレセプターは、タンパク質分解により産生されるか、あるいは選択的に
スプライスされたmRNAから翻訳される、天然に存在する、可溶性対応物を有する
。レセプターのポリペプチドは、それぞれ、膜の定着またはシグナルトランスダ
クションを提供する、これらのセグメントの十分な部分を欠如するとき、トラン
スメンブランおよび細胞内ポリペプチドのセグメントを実質的に含まないと言わ
れる。

【００４９】 用語「スプライス変異型」は、本明細書において、遺伝子から転写されたRNA
の別の形態を表すために使用される。スプライス変異型は転写されたRNA分子内
の、あるいはそれ程普通ではないが別々に転写されたRNA分子の間の、オールタ
ネイトスプライス部位の使用により自然に発生し、そして同一遺伝子から転写さ
れたいくつかのmRNAを生ずることがある。スプライス変異型は、変更されたアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。また、スプライス変
異型という用語は、本明細書において、ある遺伝子から転写されたmRNAのスプラ
イス変異型によりコードされるタンパク質を表すために使用される。

【００５０】 不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xま
たは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10％の正確さであると理解さ
れるであろう。

【００５１】 本発明は、一部分、脂肪細胞補体関係タンパク質（Acrp30）に対する相同性を
有するポリペプチドをコードする、新規なDNA配列の発見に基づく。新規なDNA配
列は、アミノ末端のシグナル配列、非相同性の隣接するN末端領域、34のGly−Xa
a−XaaまたはGly−Xaa−Pro反復から構成されたコラーゲンドメインおよびカル
ボキシ末端の球状様C1qドメインを有するポリペプチドをコードする。前述の一
般的ポリペプチド構造はAcrp30およびC1q Cにより共有されるが、ただしzacrp2
のコラーゲン様ドメインは他のポリペプチドのそれよりも長い。

【００５２】 そのうえ、図面において整列された配列はzacrp2ポリペプチドの位置189にお
ける保存されたシステイン残基を共有する（配列番号2）。整列されたカルボキ
シ末端の球状C1qドメインの中に見出される、相同性の他の領域は、本発明にお
いて、他のファミリーメンバーを検索する有用なプライマーとして同定された。
例えば、Acrp30およびC1q Cは、プライマーを使用する検索において同定される
であろう。また、本発明のzacrp2ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸181（As
n）における推定上のN−結合グルコシル化部位を含み、そして鎖内ジサルファイ
ド結合は配列番号2の残基36においてシステインを含むことができる。

【００５３】 全長のプローブを使用するこの新規なDNAに対応するmRNAの組織分布の分析は
、zacrp2が心臓、小腸および結腸において強く発現されることを示した。zacrp2
は、また、前立腺、精巣、肝臓、胃、甲状腺、脊髄、子宮および気管において発
現される。このポリペプチドはzacrp2ポリペプチドと表示された。

【００５４】 本発明の新規なzacrp2ポリペプチドは、ESTデータベースをACRP30配列の相同
体について質問することによって最初に同定され、シグナル配列、コラーゲン様
ドメインおよびC1qドメインにより特徴づけられた。それらの検索基準を満足す
るESTに対応するポリペプチドを既知の配列と比較して、ACRP30に対する相同性
を有するタンパク質を同定した。組立てられたESTクラスターが発見され、分泌
されたタンパク質であると予測された。対応するcDNAを同定するために、全体の
コーディング配列を含有すると考えられるクローンを配列決定に使用した。生ず
る1161bpの配列を配列番号1に開示する。本来誘導されたEST配列を配列番号1に
表される配列と比較すると、2つのフレームシフトおよびコラーゲン様ドメイン
を通した203bpの挿入が存在することが示された。

【００５５】 全長のcDNAによりコードされる新規なポリペプチドは、図面に示すように、脂
肪細胞補体関係タンパク質Acrp30（配列番号3）および相補的成分C1q C（配列
番号4）との相同的関係の同定を可能とした。zacrp2はアミノ酸レベルにおいて
ヒトC1q CおよびACRP30と、それぞれ、35.5および36.5％の同一性を共有する。
C1q CおよびACRP30は32％の同一性を共有する。C1qドメイン内で、ヒトC1q C
およびACRP30と比較したとき、zacrp2はアミノ酸レベルにおいて、それぞれ、33
.6および40％の同一性を共有する。C1q Cはこの領域にわたって38.2％の同一性
を共有する。

【００５６】 zacrp2ポリペプチドの完全な配列は、それを含有すると考えられる単一クロー
ンから得られ、ここでクローンは膵臓腫瘍組織のライブラリーから得られた。こ
のようなクローンについてまた検索することができる他のライブラリーは、心臓
、小腸お、結腸、前立腺、精巣、肝臓、胃、甲状腺、脊髄、子宮、気管、脂肪組
織およびその他を包含する。

【００５７】 zacrp2のヌクレオチド配列を配列番号1に記載し、そしてその推定されたアミ
ノ酸配列を配列番号2に記載する。一般に前述したように、zacrp2ポリペプチド
はアミノ酸1（Met）〜アミノ酸残基15（Ala）の範囲のシグナル配列を含む。し
たがって、成熟ポリペプチドはアミノ酸16（Asp）〜アミノ酸285（Val）の範囲
である。成熟ポリペプチド内で、既知の相同性をもたないアミノ酸残基16（Asp
）〜39（Pro）の間の範囲のN末端領域が見出された。さらに、コラーゲン様ドメ
インがアミノ酸40（Gly）と141（Cys）との間に見出された。コラーゲン様ドメ
インにおいて、10の完全なGly−Xaa−Pro反復および24の不完全なGly−Xaa−Xaa
反復が観測された。

【００５８】 対照的に、Acrp30は22の完全なまたは不完全な反復を含有する。このドメイン
において配列番号2のアミノ酸残基45、48、51、63、84、93、117、123、135およ
び138に見出されるプロリンをヒドロキシル化することができる。zacrp2ポリペ
プチドは、また、約アミノ酸142（Ser）〜285（Val）の範囲のカルボキシル末端
のC1qドメインを含む。配列番号2の残基181（Asn）をグルコシル化することがで
きる。C1qドメイン内にかなりな量の保存された構造が存在して、適切なフォル
ディングを可能とする。

【００５９】 芳香族モチーフ（F−X（5）−［ND］−X（4）−［FYWL］−X（6）−F−X（5）
−G−X−Y−X−F−X−［FY］（配列番号5）が、また、配列番号2の残基169〜199
の間に見出された。Xはアミノ酸残基を表し、そして括弧（）中の数字は残基の
アミノ酸の数を表す。正方形に括弧［］内に含有されるアミノ酸残基は、その特
定の位置におけるアミノ酸残基の選択を制限する。zacrp2ポリペプチド、ヒトC1
q CおよびAcrp30はコラーゲンドメイン内およびC1qドメインにおいて相同的で
あるように思われるが、成熟ポリペプチドのN末端部分において相同的であるよ
うに思われない。

【００６０】 本発明の他の面は、zacrp2ポリペプチドフラグメントを包含する。好ましいフ
ラグメントは、配列番号2のアミノ酸1（Met）、16（Asp）または40（Gly）〜ア
ミノ酸141（Cys）の範囲のzacrp2ポリペプチドのコラーゲン様ドメインを含有す
るフラグメント、コラーゲン様ドメインを含有するzacrp2ポリペプチドの部分ま
たは二量化またはオリゴマー化することができるコラーゲン様ドメインの部分を
含む。本明細書において使用するとき、「コラーゲン」または「コラーゲン様ド
メイン」は1系列の反復するトリプレットアミノ酸配列を意味し、「反復」また
は「コラーゲン反復」はモチーフGly−Xaa−ProまたはGly−Xaa−Xaaにより表さ
れ、ここでXaaは任意のアミノ酸残基である。

【００６１】 このようなドメインは34程度に多いまたはそれより多いコラーゲン反復を含有
することができる。このようなコラーゲン様ドメインを含有するフラグメントま
たはタンパク質は、ホモマー構築物（同一フラグメントまたはタンパク質の二量
体またはオリゴマー）を形成することができる。そのうえ、このようなコラーゲ
ン様ドメインを含有するフラグメントまたはタンパク質は、ヘテロマー構築物（
異なるフラグメントまたはタンパク質の二量体またはオリゴマー）を形成するこ
とができる。

【００６２】 これらのフラグメントは、いっそう詳しく後述するように、コラーゲンの二量
化またはオリゴマー化の研究においてまたは融合タンパク質の形成において特に
有用である。このようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、また、
本発明に包含され、（a）配列番号1に示すヌクレオチド1、133、178または250〜
ヌクレオチド555のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド分子；（b）
配列番号2のアミノ酸残基40（Gly）〜アミノ酸残基141（Cys）のアミノ酸配列に
対して少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するzacrp2ポリペプチドフラ
グメントをコードするポリヌクレオチド分子；（c）上記（a）または（b）に対
して相補的な分子；および（d）zacrp2ポリペプチドのコラーゲン様ドメインの
フラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列；から成るグループを含む。

【００６３】 他の好ましいフラグメントは、配列番号2のアミノ酸142（Ser）〜285（Val）
の範囲のzacrp2ポリペプチドの球状C1qドメイン、C1qドメインを含有するzacrp2
ポリペプチドの部分またはC1qドメインの活性部分を含む。他のC1qドメインを含
有するタンパク質は、C1q A、BおよびC（Sellar他、前掲、Reid、前掲、および
Reid他、Biochem. J. 203：559−69、1982）、シマリス冬眠関連血漿タンパク
質HP−20、HP−25およびHP−27（Takamatsu他、Mol. Cell. Biol. 13：1516
−21、1993およびKondoおよびKondo、J. Biol. Chem. 267：473−8、1992）
、ヒトプレセレベリン（Urade他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：1069
−73、1991）、ヒト内皮細胞マルチメリン（Hayward他、J. Biol. Chem. 270
：18246−51、1995）および脊椎動物コラーゲンVIIIおよびX型（Muragaki他、Eu
r. J. Biochem. 197：615−22、1991）を包含する。

【００６４】 ACRP30の球状C1qドメインは、TNFファミリーに対する有意な相同性を示す10ベ
ータ鎖「ジェリーロール」トポロジー（ShapiroおよびScherer、Curr. Biol.
8：335−8、1998）を有することが決定され、そして配列番号2により表されるza
crp2配列はこの構造のすべての10のベータ鎖（配列番号2のアミノ酸残基151〜15
5、172〜174、180〜183、187〜190、193〜205、208〜214、220〜227、229〜241
、246〜251および269〜274）を含有する。これらの鎖は、それぞれ、「A」、「A
'」、「B」、「B'」、「C」、「D」、「E」、「F」、「G」および「H」と表示し
た。

【００６５】 zacrp2は、配列番号2のアミノ酸残基156〜182および214〜227に、2つのレセプ
ター結合性ループを有する。当業者は認識するように、これらの境界は近似であ
り、既知のタンパク質の整列およびタンパク質フォルディングの予測に基づく。
アミノ酸残基193（Gly）、195（Tyr）、241（Leu）および270（Phe）は、CD40、
TNFα、ACRP30およびzacrp2を包含するスーパーファミリーを通して保存される
ように思われる。

【００６６】 これらのフラグメントは、エネルギー収支または神経伝達、特に食事またはス
トレスに関係する神経伝達の研究およびモジュレーションにおいて特に有用であ
る。抗菌活性は、また、このようなフラグメントの中に存在することがある。TN
Fタンパク質に対する相同性は、このようなフラグメントが肥満症に関係するイ
ンスリン耐性、免疫調節、炎症応答、アポトーシスおよび溶骨細胞の成熟におい
て有用であろう。

【００６７】 このようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、また、本発明に包
含され、 （a）配列番号1に示すヌクレオチド556〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチド分子； （b）配列番号2のアミノ酸残基142（Ser）〜アミノ酸残基285（Val）のアミノ
酸配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列の同一性を有するzacrp2ポリペプ
チドフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子； （c）上記（a）または（b）に対して相補的な分子；および （d）zacrp2ポリペプチドのC1qドメインのフラグメントをコードする縮重ヌク
レオチド配列； から成るグループを含む。

【００６８】 本発明の他のzacrp2ポリペプチドフラグメントは、コラーゲン様ドメインおよ
び配列番号2のアミノ酸残基40（Gly）〜285（Val）の範囲のC1qドメインの両方
を含む。このようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、また、本発
明に包含され、 （a）配列番号1に示すヌクレオチド250〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列
を含んでなるポリヌクレオチド分子；

【００６９】 （b）配列番号2のアミノ酸残基40（Gly）〜アミノ酸残基285（Val）のアミノ
酸配列に対して少なくとも80％のアミノ酸配列の同一性を有するzacrp2ポリペプ
チドフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子； （c）上記（a）または（b）に対して相補的な分子；および （d）zacrp2ポリペプチドのコラーゲン様ドメイン−C1qドメインのフラグメン
トをコードする縮重ヌクレオチド配列； から成るグループを含む。

【００７０】 高度に保存されたアミノ酸、特にzacrp2ポリペプチドのカルボキシ末端のC1q
ドメインにおける高度に保存されたアミノ酸は、新しいファミリーメンバーを同
定するツールとして使用することができる。例えば、逆方向転写−ポリメラーゼ
連鎖反応（RT−PCR）を使用して、種々の組織源から得られたRNAからの保存され
たモチーフをコードする配列を増幅することができる。特に、保存された配列か
ら設計された、高度に縮重のプライマーはこの目的に有用である。特に、下記の
プライマーおよびそれらの補体はこの目的に有用である：

【００７１】 配列番号2のアミノ酸残基244〜260 GGN GAN SAR GTN TGG YT（配列番号6） 配列番号2のアミノ酸残基192〜197 SN GNN NTN TAY TWY TTY R（配列番号7） 配列番号2のアミノ酸残基270〜275 TTY DSN GGN TTY YTN HT（配列番号8） 配列番号2のアミノ酸残基179〜185 Y TWY RAY RBN WBN WSN GG（配列番号9） 前述のポリヌクレオチドの相補体に対応するプローブがまた包含される。

【００７２】 本発明は、また、本明細書に開示するzacrp2ポリペプチドをコードする、DNA
およびRNA分子を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は容易に
認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーにかんがみて、かなりの配列変動は
これらのポリヌクレオチド分子の間で可能である。配列番号10は、配列番号2のz
acrp2ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列である。

【００７３】 当業者は認識するように、配列番号10の縮重配列は、また、UをTと置換するこ
とによって配列番号4をコードするすべてをRNA配列を提供する。こうして、zacr
p2ポリペプチドをコードする配列番号10のヌクレオチド1〜ヌクレオチド855およ
びそれらのRNA同等物は本発明に包含される。縮重ヌクレオチド位置を表すため
に配列番号10内で使用した1文字コードを表1に記載する。「分解能」はコード文
字により表されるヌクレオチドである。「補体」は1またはそれ以上の相補的ヌ
クレオチドのコードである。例えば、コードYはCまたはTを表し、そしてその補
体RはAまたはGを表し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的
である。

【００７４】

【表１】 所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号10におい
て使用する縮重コドンを表2に記載する。

【００７５】

【表２】

【００７６】 当業者は認識するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代
表する縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セリ
ンの縮重コドン（WSN）は、ある環境において、アルギニン（AGR）をコードする
ことができ、そしてアルギニンの縮重コドン（MGN）は、ある環境において、セ
リン（AGY）をコードすることができる。

【００７７】 同様な関係はフェニルアラニンおよびロイシンをコードするコドンの間に存在
する。したがって、縮重配列に包含される、いくつかのポリヌクレオチドは変異
型アミノ酸配列をコードすることができるが、当業者は、配列番号2のアミノ酸
配列を参照することによって、このような変異型配列を容易に同定することがで
きる。変異型配列は、本明細書において記載するように、機能性について容易に
試験することができる。

【００７８】 また、当業者は認識するように、異なる種は「優先的コドンの使用」を示すこ
とができる。一般に、下記の文献を参照のこと：Grantham他、Nucl. Acids Re
s. 8：1893−912、1980；Haas他、Curr. Biol. 6：315−24、1996；Wain−Ho
bson他、Gene 13：355−64、1981；GrosjeanおよびFiers、Gene 18：199−209
、1982；Holm、Nucl. Acids Res. 14：3075−87、1986；Ikemura、J. Mol.
Biol. 158：573−97、1982。本発明において使用するとき、用語「優先的コ
ドンの使用」または「優先的コドン」は、ある種の細胞において最も頻繁に使用
され、こうして各アミノ酸をコードする可能なコドンの1つまたはわずかの代表
的なものに好んで使用される、タンパク質翻訳コドンを言及する、この分野の用
語である（表2参照）。

【００７９】 例えば、アミノ酸のスレオニン（Thr）はACA、ACC、ACG、またはACTによりコ
ードされることができるが、哺乳動物細胞において、ACCは最も普通に使用され
るコドンである；他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌におい
て、異なるThrコドンは優先的であることができる。特定の種の優先的コドンを
、この分野において知られている種々の技術により、本発明のポリヌクレオチド
の中に導入することができる。組換えDNAの中への優先的コドンの導入は、例え
ば、特定の細胞の型または種内のタンパク質の翻訳を効率よくすることによって
、タンパク質の産生を増強することができる。

【００８０】 したがって、配列番号10に開示されている縮重コドンの配列は、この分野にお
いて普通に使用されかつ本明細書において開示する、種々の細胞の型および種に
おけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として働く。優先的コド
ンを、本明細書において開示するように、種々の種における発現について試験し
、発現のために最適化し、そして機能性について試験することができる。

【００８１】 本発明は、さらに、他の種からの対応物を表すポリペプチドおよびポリヌクレ
オチド（オーソログ）を提供する。これらの種は下記のものを包含するが、これ
らに限定されない：哺乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊
椎動物および無脊椎動物。特に興味あるものは、他の哺乳動物種、例えば、ネズ
ミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、および他の霊長類のポリペプチド
からのzacrp2ポリペプチドである。部分的ネズミzacrp2相同体（配列番号12）が
同定された。

【００８２】 このネズミzacrp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号
11に開示されている。ヒトzacrp2のオーソログは、本発明により提供される情報
および組成物を慣用のクローニング技術と組み合わせて使用して、クローニング
することができる。例えば、本明細書において開示するように、zacrp2を発現す
る組織および細胞型から得られるmRNAを使用して、cDNAをクローニングすること
ができる。本明細書において開示する配列から設計されたプローブでノザンブロ
ットをプロービングすることによって、mRNAの適当な源を同定することができる
。次いで、陽性の組織または細胞系統のmRNAからライブラリーを調製することが
できる。

【００８３】 次いで、種々の方法、例えば、完全なまたは部分的ヒトcDNAで、または開示し
た配列をベースとする1またはそれ以上の組の縮重プローブでプロービングする
ことによって、zacrp2をコードするcDNAを単離することができる。追加の方法に
おいて、cDNAライブラリーを使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
トすることができ、そしてzacrp2ポリペプチドに対する抗体で問題のcDNAの発現
を検出することができる。また、ゲノムのクローンの単離に同様な技術を適用す
ることができる。

【００８４】 当業者は認識するように、配列番号1に記載する配列はヒトzacrp2の単一の対
立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変異型およびオールタネイトスプライシング
が起こることが期待される。この配列の対立遺伝子変異型は、標準的手順に従い
、異なる個体からのcDNAまたはゲノムのライブラリーをプロービングすることに
よって、クローニングすることができる。配列番号1に示すDNA配列の対立遺伝子
変異型は、サイレント突然変異体を含有するものおよび突然変異がアミノ酸配列
を変化させるものを包含し、配列番号2の対立遺伝子変異型であるタンパク質と
同様に、本発明の範囲内に入る。

【００８５】 交互にスプライスされたmRNAから発生するcDNAは、zacrp2ポリペプチドの性質
を保持し、このようなcDNAおよびmRNAをコードするポリペプチドと同様に、本発
明の範囲内に入る。これらの配列の対立遺伝子変異型およびスプライス変異型は
、この分野において知られている標準的手順に従い、異なる個体または組織から
のcDNAまたはゲノムのライブラリーをプロービングすることによって、クローニ
ングすることができる。

【００８６】 本発明の好ましい態様において、単離された核酸分子は、ストリンジェント条
件下に、配列番号1のヌクレオチド配列を有する核酸分子または配列番号1に対し
て相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子に対してハイブリダイゼーション
するであろう。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度および
pHにおいて、特定の配列の熱的融点（Tm）よりも約5℃低いように選択される。T
mはターゲット配列の50％が完全に合致するプローブにハイブリダイゼーション
する温度（規定されたイオン強度およびpHにおいて）である。

【００８７】 1対の核酸分子、例えば、DNA−DNA、RNA−RNAおよびDNA−RNAは、ヌクレオチ
ド配列がある程度の相補性を有する場合、ハイブリダイゼーションすることがで
きる。ハイブリッドは二重らせん中のミスマッチ塩基対を許容できるが、ハイブ
リッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチのハイブリッ
ドのTmは1〜1. 5％の塩基対ミスマッチ毎に1℃だけ低下する。ハイブリダイゼー
ション条件のストリンジェンシイを変化させると、ハイブリッドの中に存在する
ミスマッチの程度をコントロールすることができる。

【００８８】 ハイブリダイゼーション温度が増加しかつハイブリダイゼーション緩衝液のイ
オン強度が減少するにつれて、ストリンジェンシイの程度は増加する。ストリン
ジェントハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドのTmよりも約5〜25℃低
い温度および1MまでのNa⁺を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。
より低い温度におけるより高い程度のストリンジェンシイはホルムアミドの添加
により達成することができる。ホルムアミドは、緩衝液中の1％のホルムアミド
につきハイブリッドのTmを約1℃だけ低下させる。

【００８９】 一般に、このようなストリンジェント条件は20〜70℃の温度および6×までのS
SCおよび0〜50％のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝液を包
含する。より高い程度のストリンジェンシイは、40〜70℃の温度において、4×
までのSSCおよび0〜50％のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝
液を使用して達成可能である。

【００９０】 高度にストリンジェントの条件は、典型的には、42〜70℃の温度、および1×
までのSSCおよび0〜50％のホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション緩衝
液を包含する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間に異なる程度のストリン
ジェンシイを使用して、配列への最大の特異的結合を達成することができる。典
型的には、増加する程度のストリンジェンシイにおいてハイブリダイゼーション
後の洗浄を実施して、ハイブリダイゼーションした複合体からハイブリダイゼー
ションしなかったポリヌクレオチドプローブを除去することができる。

【００９１】 上記条件は指針として働くこと意味し、そして当業者は特定のポリペプチドの
ハイブリッドとともに使用するためにこれらの条件を適合させることができる。
特定のターゲット配列のTmは、ターゲット配列の50％が完全に合致したプローブ
配列にハイブリダイゼーションする温度（規定された条件下に）である。Tmに影
響を及ぼす条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズおよび塩基対含量、ハイ
ブリダイゼーション溶液のイオン強度、およびハイブリダイゼーション溶液中の
脱安定化因子の存在を包含する。

【００９２】 Tmを計算する多数の方程式はこの分野において知られており、そして変化する
長さのDNA、RNAおよびDNA−RNAハイブリッドおよびポリヌクレオチドプローブ配
列について特異的である（例えば、下記の文献を参照のこと：Molecular Cloni
ng：A Laboratory Manual、第2版（Cold Spring Harbor Press 1989）；A
usubel他（編者）、Current Protocols in Molecular Biology（John Wile
y & Sons，Inc. 1987）；BergerおよびKimmel（編者）、Guide to Molecula
r Cloning Techniques（Academic Press，Inc. 1987）；およびWetmur、Cri
t. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26：227（1990））。

【００９３】 配列解析ソフトウェア、例えば、OLIGO 6.0（LSR；ミネソタ州ロングレイク
）およびPrimer Premier 4.0（Premier Biosoft International；カリフォ
ルニア州パロアルト）、ならびにインターネット上のサイトは、所定の配列を解
析しかつユーザー規定基準に基づいてTmを計算するための入手可能な道具である
。また、このようなプログラムにより、規定された条件下に所定の配列を解析し
、適当なプローブ配列を同定することができる。

【００９４】 典型的には、＞50塩基対の、より長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼ
ーションを計算したTmよりも約20〜25℃だけ低い温度において実施する。＜50塩
基対の、より小さいプローブについて、ハイブリダイゼーションは典型的にはTm
または5〜10℃だけ低い温度において実施される。これにより、DNA−DNAおよびD
NA−RNAハイブリッドについてハイブリダイゼーション速度を最大にすることが
できる。

【００９５】 ポリヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度および安定性に影響
を及ぼす。＜50塩基対の、より小さいプローブ配列は、相補的配列との平衡化に
急速に到達するが、低い安定性のハイブリッドを形成することがある。数分から
数時間のいずれかのインキュベート時間を使用して、ハイブリッドを形成するこ
とができる。より長いプローブ配列はいっそうゆっくり平衡化するようになるが
、より低い温度においてさえいっそう安定な複合体を形成する。インキュベーシ
ョンは一夜またはそれより長い時間進行させることができる。一般に、インキュ
ベーションは計算したCot時間の3倍に等しい期間の間実施される。Cot時間は、
ポリヌクレオチド配列が再アソシエーションするために要する時間であり、この
分野において知られている方法により特定の配列について計算することができる
。

【００９６】 ポリヌクレオチド配列の塩基対組成はハイブリッド複合体の熱安定性に影響を
与え、これによりハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩
衝液のイオン強度に影響を及ぼすであろう。A−T対は塩化ナトリウムを含有する
水溶液中でG−C対よりも安定性が低い。したがって、G−C含量が高くなるほど、
ハイブリッドはより安定になる。配列内のGおよびC残基の均一な分布もまたハイ
ブリッドの安定性に積極的に寄与する。さらに、塩基対組成を操作して所定の配
列のTmを変更することができる。例えば、5−メチルデオキシシチジンをデオキ
シシチジンと置換し、5−ブロモデオキシウリジンをチミジンと置換してTmを増
加することができ、これに対して7−デアズ−2'−デオキシグアノシンをグアノ
シンと置換してTmに対する依存性を減少することができる。

【００９７】 ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度は、また、ハイブリッドの安定性
に影響を与える。ハイブリダイゼーション緩衝液は、一般に、ブロッキング剤、
例えば、デンハルト溶液（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）、
変性サケ精子DNA、tRNA、ミルク粉末（BLOTTO）、ヘパリンまたはSDS、およびNa ⁺ 源、例えば、SSC（1×SSC：0.15Mの塩化ナトリウム、15mMのクエン酸ナトリウ
ム）またはSSPE（1×SSPE：1. 8MのNaCl、10mMのNaH₂PO₄、1mMのEDTA、pH7. 7）
を含有する。緩衝液のイオン濃度を減少させることによって、ハイブリッドの安
定性を増加させる。

【００９８】 典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は10mM〜1MのNa⁺を含有する。脱
安定化剤または変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩
、グアニジニウムカチオンまたはチオシアネートカチオンをハイブリダイゼーシ
ョン溶液に添加して、ハイブリッドのTmを変更させる。典型的には、ホルムアミ
ドを50％までの濃度において使用して、より好都合な、より低い温度においてイ
ンキュベーションを実施することができる。また、RNAプローブ使用するとき、
ホルムアミドは非特異的バックグラウンドを減少する作用をする。

【００９９】 例示として、42℃において50％のホルムアミド、5×SSC（1×SSC：0.15Mの塩
化ナトリウムおよび15mMのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム（pH
7. 6）、5×デンハルト溶液（100×デンハルト溶液：2％（w/v）のフィコール40
0、2％（w/v）のポリビニルピロリドン、および2％（w/v）のウシ血清アルブミ
ン）、10％のデキストラン硫酸、および20μg/mlの変性、剪断サケ精子DNAを含
んでなる溶液中で、変異型ZTMPO−1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を、配列番号1のヌクレオチド配列（またはその補体）を有するポリヌクレオチ
ドと一夜ハイブリダイゼーションさせることができる。

【０１００】 当業者はこれらのハイブリダイゼーション条件の変更を案出することができる
。例えば、より高いまたはより低い温度、例えば、約65℃において、ホルムアミ
ドを含有しない溶液中で、ハイブリダイゼーション混合物をインキュベートする
ことができる。そのうえ、プレミックスハイブリダイゼーション溶液は入手可能
であり（例えば、EXPRESSHYBハイブリダイゼーション溶液、CLONTECH Laborato
ries，Inc.）そしてハイブリダイゼーションを製造業者の使用説明書に従い実施
することができる。

【０１０１】 ハイブリダイゼーション後、核酸分子をストリンジェント条件下に、または高
度にストリンジェントな条件下に洗浄して非ハイブリダイゼーション核酸分子を
除去する。典型的なストリンジェント洗浄条件は、0.5×〜2×SSCおよび0.1％の
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液中の55〜65℃における洗浄を包含する。
すなわち、変異型ZTMPO−1ポリペプチドをコードする核酸分子は配列番号1のヌ
クレオチド配列（またはその補体）を有する核酸分子とストリンジェント洗浄条
件下にハイブリダイゼーションし、ここで洗浄ストリンジェントは55〜65℃にお
ける0.5×〜2×SSCおよび0.1％のSDSに等しく、例えば55℃における0.5×SSCお
よび0.1％のSDS、または65℃における2×SSCおよび0.1％のSDSを包含する。当業
者は、例えば、洗浄溶液中のSSCをSSPEと置換することによって、同等条件を容
易に案出することができる。

【０１０２】 典型的な高度にストリンジェントな洗浄条件は、50〜65℃における0.1×〜0.2
×SSCおよび0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液中の洗浄を包含する
。換言すると、変異型ZTMPO−1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは配
列番号1のヌクレオチド配列（またはその補体）を有する核酸分子と高度にスト
リンジェントな洗浄条件下にハイブリダイゼーションし、ここで洗浄ストリンジ
ェントは55〜65℃における0.1×〜0.2×SSCおよび0.1％のSDSに等しく、例えば5
0℃における0.1×SSCおよび0.1％のSDS、または65℃における0.2×SSCおよび0.1
％のSDSを包含する。

【０１０３】 本発明は、また、配列番号2および4のポリペプチドおよびそれらのオーソログ
に対して実質的に類似する、単離されたzacrp2ポリペプチドを提供する。用語「
実質的に類似する」は、本明細書において、配列番号2および4に示す配列または
それらのオーソログに対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％
、少なくとも85％のまたは95％より大きい配列の同一性を有するポリペプチドを
表すために使用される。本発明は、また、配列番号2のアミノ酸残基40〜285の配
列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも85％
のまたは95％より大きい配列の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペ
プチドを包含する。本発明は、さらに、このようなポリペプチドをコードする核
酸分子を包含する。同一性百分率を決定する方法を後述する。

【０１０４】 本発明は、また、2つの基準を使用して同定できる、zacrp2の種々の核酸分子
を包含する：前述したような、配列番号2のアミノ酸配列をもつコードされたポ
リペプチドの間の類似性の決定、およびハイブリダイゼーションアッセイ。この
ようなzacrp2変異型は下記の核酸分子を包含する：（1）スリンジェント洗浄条
件下に配列番号1のヌクレオチド配列（またはその相補体）を有する核酸分子と
ハイブリダイゼーションする核酸分子、ここで洗浄ストリンジェンシイは55〜65
℃における0.5×〜2×SSC、0.1％のSDSに等しい、および（2）配列番号2のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくと
も95％のまたは95％より大きい配列の同一性を有するポリペプチドをコードする
核酸分子。

【０１０５】 あるいは、zacrp2変異型は、（1）高度にストリンジェントの洗浄条件下に配
列番号1のヌクレオチド配列（またはその補体）を有する核酸分子とハイブリダ
イゼーションする核酸分子、ここで洗浄ストリンジェンシイは50〜65℃における
0.1×〜0.2×SSC、0.1％のSDSに等しい、および（2）配列番号2のアミノ酸配列
に対して少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％の
または95％より大きい配列の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
、として特徴づけることができる。

【０１０６】 配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参照
のこと：Altschul他、Bull. Math. Bio. 48：603、1986およびHenikoffおよ
びHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915、1992。簡単に述べ
ると、表3（アミノ酸は標準的1文字コードにより示されている）に示すように10
のギャップオープニングペナルティー、1のギャップエクステンションペナルテ
ィー、およびHenikoffおよびHenikoff（前掲）の「ブロサム（BLOSUM）62」スコ
アリングマトリックスを使用して、2つのアミノ酸配列を整列させて整列スコア
を最適化する。次いで同一性百分率を次のように計算する：（同一の整合（matc
hes）の総数）/（より長い配列の長さ＋2つの配列を整列させるために、より長
い配列の中に導入されたギャップの数）×100。

【０１０７】

【表３】

【０１０８】 当業者は認識するように、2つのアミノ酸配列を整列するために有効な多数の
アルゴリズムが存在する。PearsonおよびLipmanの「FASTA」類似性の検索アルゴ
リズムは、本明細書に開示するアミノ酸配列および推定上の変異型zacrp2のアミ
ノ酸配列が共有する同一性のレベルを検査する、適当なタンパク質整列法である
。FASTAアルゴリズムは下記の文献に記載されている：PearsonおよびLipman、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444、1988、およびPearson、Meth. Enzy
mol. 183：63、1990。

【０１０９】 簡単に述べると、まず、保存的アミノ酸の置換、挿入、または欠失を考慮しな
いで、問題の配列（例えば、配列番号2）、および同一性の最高密度（ktup変数
が1である場合）または同一性の対（ktup＝2である場合）を有する試験配列が共
有する領域を同定することによって、FASTAは配列の類似性を特性決定する。次
いで、アミノ酸置換マトリックスを使用してすべての対合アミノ酸の類似性を比
較することによって、同一性の最高密度をもつ10領域を再スコアリングし、そし
て最高スコアに寄与する残基のみを含むように、領域の末端を「トリミング」す
る。

【０１１０】 「カットオフ」値（配列の長さおよびktup値に基づいて前もって決定した式に
より計算される）より大きいスコアをもつ、いくつかの領域が存在する場合、ト
リミングした最初の領域を検査して、領域を結合してギャップをもつ近似整列を
形成できるかどうかを決定する。最後に、アミノ酸配列の挿入または欠失を可能
とする、Needleman−Sellersアルゴリズムの変法（NeedlemanおよびWunsch、J.
Mol. Biol. 48：444、1970；Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26：787、
1974）を使用して、2つのアミノ酸配列の最高のスコアリング領域を整列させる
。

【０１１１】 FASTA分析のためのパラメーターの例は次の通りである：ktup＝1，ギャップオ
ープニングペナルティー＝10、ギャップエクステンションペナルティー＝1、お
よび置換マトリックス＝BLOSUM62。Pearson、Meth. Enzymol. 183：63、1990
の付録2に説明されているように、スコアリングマトリックスファイル（「SMATR
IX」）を変更することによって、これらのパラメーターをFASTAプログラムの中
に導入することができる。 また、上に開示した比を使用して核酸分子の配列の同一性を決定するために、
FASTAを使用することができる。ヌクレオチド配列を比較するために、ktup値は1
〜6、好ましくは4〜6の範囲であることができる。

【０１１２】 本発明は、配列番号2のアミノ酸配列と比較して、1またはそれ以上の保存的ア
ミノ酸変化を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。保存的アミ
ノ酸置換はアミノ酸の化学的特性に基づくことができる。すなわち、配列番号2
の1またはそれ以上のアミノ酸置換を含有する変異型を得ることができ、ここで
アルキルアミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中のアルキルアミノ酸と置換されており
、芳香族アミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中の芳香族アミノ酸と置換されており、

【０１１３】 硫黄含有アミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中の硫黄含有アミノ酸と置換されてお
り、ヒドロキシ含有アミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中のヒドロキシ含有アミノ酸
と置換されており、酸性アミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中の酸性アミノ酸と置換
されており、塩基性アミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中の塩基性アミノ酸と置換さ
れているか、あるいは二塩基性モノカルボン酸アミノ酸はzacrp2アミノ酸配列中
の二塩基性モノカルボン酸アミノ酸と置換されている。

【０１１４】 例えば、普通のアミノ酸の間で、「保存的アミノ酸置換」は、下記の基の各々
内のアミノ酸間の置換により例示される：（1）グリシン、アラニン、バリン、
ロイシン、およびイソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、およびト
リプトファン、（3）セリンおよびトレオニン、（4）アスパラギン酸塩およびグ
ルタミン酸塩、（5）グルタミンおよびアスパラギン、および（6）リシン、アル
ギニンおよびヒスチジン。

【０１１５】 BLOSUM62表は、関係するタンパク質の500より多いグループの高度に保存され
た領域を表す、タンパク質配列のセグメントの約2,000の局所的多重整列から誘
導されたアミノ酸置換マトリックスである（HenikoffおよびHenikoff、Proc. N
atl'l. Acad. Sci. USA、89：10915、1992）。したがって、本発明のアミノ
酸配列の中に導入することができる保存的アミノ酸置換を定めるために、BLOSUM
62置換頻度を使用することができる。

【０１１６】 化学的特性にのみ基づくアミノ酸置換を設計することができる（前述したよう
に）が、「保存的アミノ酸置換」は好ましくは−1より大きいBLOSUM62値により
表される置換を意味する。例えば、置換が0、1、2、または3により特徴づけられ
る場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムに従うと、好ましい保存的
アミノ酸置換は少なくとも1（例えば、1、2または3）のBLOSUM62値により特徴づ
けられるが、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも2（例えば、2または
3）のBLOSUM62値により特徴づけられる。

【０１１７】 配列番号1に記載するヌクレオチドをヌクレオチドで置換することによって、z
acrp2遺伝子における保存的アミノ酸変化を導入することができる。このような
「保存的アミノ酸」の変異型は、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘
発、リンカー−走査突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する突然変異誘
発、およびその他により得ることができる（下記の文献を参照のこと：Ausubel
（1995）pp. 8−10〜8−22；およびMcPherson（編者）、Directed Mutagenesi
s：A Practical Approach（IRL Press 1991））。エネルギー収支を促進す
るこのような変異型の能力ならびに野生型タンパク質の他の性質は、標準的方法
、例えば、本明細書に記載するアッセイを使用して決定することができる。ある
いは、抗zacrp2抗体に特異的に結合する能力により、変異型zacrp2ポリペプチド
を同定することができる。

【０１１８】 本発明のタンパク質は、また、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことがで
きる。天然に存在しないアミノ酸は、限定されずに、下記のものを包含する：ト
ランス−3−メチルプロリン、2，4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシプロ
リン、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−スレオニ
ン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシ
ステイン、ニトロ−グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジン
カルボン酸、デヒドロプロリン、3−および4−メチルプロリン、3，3−ジメチル
プロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフ
ェニルアラニン、4−アザフェニルアラニン、および4−フルオロフェニルアラニ
ン。

【０１１９】 天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に組込む、いくつかの方法は
この分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレ
ッサーｔRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する、in vitro系を使用する
ことができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法はこの分野に
おいて知られている。大腸菌（E. coli）S30抽出物および商業的に入手可能な
酵素および他の試薬を含んでなる、無細胞系において、ナンセンス突然変異を含
有するプラスミドの転写および翻訳は実施される。

【０１２０】 タンパク質をクロマトグラフィーにより精製する。例えば、下記の文献を参照
のこと：Robertson他、J. Am. Chem. Soc. 113：2722、1991；Ellman他、Me
thods Enzymol. 202：301、1991；Chung他、Science 259：806−809、1993；
およびChung他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10145−9、1993。

【０１２１】 第2の方法において、突然変異されたmRNAおよび化学的にアミノアシル化され
たサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより、キセノプス・オオサイ
ト（Xenopus oocytes）中で翻訳を実施する（Turcatti他、J. Biol. Chem.
271：19991、1996）。第3の方法において、置換すべき天然のアミノ酸（例えば
、フェニルアラニン）の非存在においてかつ所望の天然に存在しない1またはそ
れ以上のアミノ酸（例えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニ
ン、4−アザフェニルアラニンまたは4−フルオロフェニルアラニン）の存在下に
、大腸菌（E. coli）細胞を培養する。

【０１２２】 天然に存在しないアミノ酸をその天然の対応物の代わりにタンパク質の中に組
込む。Koide他、Biochem. 33：7470、1994、参照。in vitro化学的修飾により
、天然に存在するアミノ酸残基を天然に存在しない種に変換することができる。
化学的修飾を部位特異的突然変異誘発と組合わせて、置換の範囲をさらに拡張す
ることができる（WynnおよびRichards、Protein Sci. 2：395、1993）。 制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、
天然に存在しないアミノ酸、および非天然のアミノ酸をzacrp2アミノ酸残基と置
換することができる。

【０１２３】 既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載
されている方法を使用して、多重アミノ酸置換を行い、試験することができる：
Reidhaar−OlsonおよびSauer、Science 241：53、1988またはBowieおよびSauer
、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 86：2152、1989。簡単に述べると、これ
らの著者らはポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にランダム化し、
機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異化ポリペプチドを配列決定
して、各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示してい
る。使用できる他の方法は下記の方法を包含する：ファージディスプレイ（例え
ば、Lowman他、Biochem. 30：10832、1991；Ladner他、米国特許第5,223,409号
；Huse、WIPO公開WO 92／06204）および領域特異的突然変異誘発（Derbyshire
他、Gene 46：145、1986；Ner他、DNA 7：127、1988）。

【０１２４】 また、開示したzacrp2ヌクレオチドおよびポリペプチド配列の変異型を、下記
の文献に開示されているように、DNAシャフリングにより発生させることができ
る：Stemmer、Nature 370：389、1994、Stemmer、Proc. Natl'l. Acad. Sci
. USA 91：10747、1994およびWIPO公開WO 90／20078。簡単に述べると、親DN
Aをランダムフラグメント化し、次いでPCRによりリアセンブリーして、ランダム
に導入された点突然変異を生じさせることによって、in vitro相同的組換えに
より変異型DNA分子を発生させる。

【０１２５】 親DNA分子のファミリー、例えば、対立遺伝子変異型または異なる種からのDNA
分子を使用して、追加の可変性をプロセスの中に導入することによって、この技
術を修飾することができる。所望の活性について選択またはスクリーニングし、
次いで突然変異誘発およびアッセイをさらに反復して、所望の突然変異を選択す
ると同時に有害な変化に対して選択することによって、配列を急速に「進化」さ
せる。

【０１２６】 本明細書に開示する突然変異誘発法を大きい処理量の自動化スクリーニング法
と組合わせて、宿主細胞においてクローニングされ、突然変異化されたポリペプ
チドの活性を検出することができる。生物学的に活性なポリペプチド、または抗
zacrp2抗体に結合するポリペプチドをコードする突然変異化DNA分子を宿主細胞
から回収し、現代的装置を使用して急速に配列決定することができる。これらの
方法は、問題のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定
を可能とし、未知構造のポリペプチドに適用することができる。

【０１２７】 本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野において知られてい
る手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発に従
い同定することができる（CunninghamおよびWells、Science 244：1081、1989
；Bass他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：4498、1991；CoombsおよびCo
rey、″Site−Directed Mutagenesis and Protein Engineering″、Protein
s：Analysis and Design、Angeletti（編者）、pp. 259−311（Academic Pr
ess，Inc． 1998）。

【０１２８】 後者の技術において、単一のアラニンの突然変異を分子中のすべての残基にお
いて導入し、そして、後述するように、生ずる突然変異体分子を生物学的活性に
ついて試験して、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定する。ま
た、Hilton他、J. Biol. Chem. 271：4699、1996参照。必須アミノ酸の同定
は、また、関係するポリペプチドとの相同性から推定することができる。

【０１２９】 zacrp2レセプター結合性ドメインの位置は、核磁気共鳴、結晶学、電子回折ま
たはフォトアフィニティー標識化のような技術により、推定上の接触部位のアミ
ノ酸の突然変異と組み合わせて、決定して、構造の物理的解析により同定するこ
とができる。例えば、下記の文献を参照のこと：de Vos他、Science 255：306
、1992、Smith他、J. Mol. Biol. 224：899、1992、およびWlodaver他、FEBS
Lett. 309：59、1992。そのうえ、ビオチンまたはFITCで標識化されたzacrp2
はzacrp2レセプターの発現クローニングのための使用することができる。

【０１３０】 本発明は、また、本明細書に記載するzacrp2ポリペプチドのエピトープを支持
する部分を含んでなるポリペプチドフラグメントまたはペプチドを提供する。こ
のようなフラグメントまたはペプチドは「免疫原性エピトープ」を含むことがで
きる。免疫原性エピトープは、全体のタンパク質を免疫原として使用するとき、
抗体の応答を誘発するタンパク質の部分である。免疫原性エピトープを支持する
ペプチドは標準的方法により同定することができる（例えば、Geysen他、Proc. Natl . Acad. Sci. USA 81：3998、1983、参照）。

【０１３１】 対照的に、ポリペプチドのフラグメントまたはペプチドは、抗体が特異的に結
合するタンパク質分子の領域である、「抗原エピトープ」を含むことができる。
ある種のエピトープはアミノ酸の線状または隣接ストレッチから成り、そしてこ
のようなエピトープの抗原性は変性因子により崩壊されない。タンパク質のエピ
トープを模擬できる、比較的短い合成ペプチドを使用して、タンパク質に対する
抗体の産生を刺激することができることはこの分野において知られている（例え
ば、Sutcliffe他、Science 219：660、1983参照）。したがって、本発明の抗原
性エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、本明細書に記載するポ
リペプチドに結合する抗体を発生させるために有用である。

【０１３２】 エピトープを支持するペプチドおよびポリペプチドは、配列番号2の少なくと
も4〜10アミノ酸、少なくとも10〜15アミノ酸、または約15〜約30アミノ酸を含
有することが好ましい。このようなエピトープを支持するペプチドおよびポリペ
プチドは、本明細書に記載するように、zacrp2ポリペプチドをフラグメント化す
るか、あるいは化学的ペプチド合成により製造することができる。そのうえ、エ
ピトープはランダムペプチドライブラリーのファージディスプレイにより選択で
きる（例えば、下記の文献を参照のこと：LaneおよびStephen、Curr. Opin. Imm
unol. 5：268、1993、およびCortese他、Curr. Opin. Biotechnol. 7：616、1
996）。

【０１３３】 エピトープを同定し、そしてエピトープを含んでなる小さいペプチドから抗体
を産生する標準的方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Mole、"Epito
pe Mapping"、 Methods in Molecular Biology、Vol. 10、Manson（編）
、pp. 105−16（The Humana Press，Inc. 1992）、Price、"Production and
Characterization of Synthetic Peptide−Derived Antibodies"、Monocl
onal Antibodies：Production，Engineering，and Clinical Application、R
itterおよびLadyman（編者）、pp. 60−84（Cambridge University Press 19
95）、およびColigan他（編者）、Current Protocols in Imunology、pp. 9.
3. 1−9. 3. 5およびpp. 9. 4. 1−9. 4. 11（John Wiley & Sons 1997）
。

【０１３４】 変異型zacrp2遺伝子の特定のヌクレオチド配列を無視して、この遺伝子はその
エネルギー収支モジュレート活性または野生型タンパク質の他の活性により、ま
たは抗zacrp2抗体に特異的に結合する能力により特徴づけられるポリペプチドを
コードする。さらに詳しくは、変異型zacrp2遺伝子は、本明細書に記載するヒト
zacrp2遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の少なくとも50％の、好ま
しくは70、80、または90％より大きい活性を示すポリペプチドをコードする。

【０１３５】 変異型および融合タンパク質を包含する、任意のzacrp2ポリペプチドについて
、当業者は上記表1および2に記載される情報を使用して、その変異型をコードす
る、完全に縮重のポリヌクレオチド配列を容易に発生させることができる。その
うえ、当業者は標準的ソフトウェアを使用して、本明細書に記載するヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列をベースとするzacrp2変異型を案出することができる。し
たがって、本発明は、下記の配列の少なくとも1つを提供するデータ構造でコー
ドされたコンピューターで読取り可能な媒体を包含する：配列番号1、配列番号2
または配列番号10。

【０１３６】 コンピューターで読取り可能な媒体の適当な形態は、磁気媒体および光学的に
読取り可能な媒体を包含する。磁気媒体の例は、ハードまたは固定ドライブ、ラ
ンダムアクセスメモリー（RAM）チップ、フロッピーディスク、ディジタル線状
テープ（DLT）、ディスクカシェ、およびZIPディスクを包含する。光学的に読取
り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、CD−読出し専用メモリー（ROM
）、CD−再書込み可能な（RW）、およびCD−再記録可能な）、およびディジタル
多角的／ビデオディスク（DVD）（例えば、DVD−ROM、DVD−RAM、およびDVD+RW
）により例示される。

【０１３７】 本発明は、また、zacrp2融合タンパク質を提供する。例えば、本発明の融合タ
ンパク質は下記の成分からなる： （1）（a）配列番号2に示され、アミノ酸残基1（Met）、16（Asp）または40（
Gly）〜アミノ酸残基285（Val）のアミノ酸残基の配列からなるポリペプチド分
子； （b）配列番号2のアミノ酸40（Gly）〜アミノ酸141（Cys）の範囲のポリペプ
チド分子、コラーゲン様ドメインを含有するzacrp2ポリペプチドの部分、または
二量体化またはオリゴマー化することができるコラーゲン様ドメインの部分；

【０１３８】 （c）配列番号2のアミノ酸142（Ser）〜アミノ酸285（Val）の範囲のポリペプ
チド分子、C1qドメインを含有するzacrp2ポリペプチドの部分、またはC1qドメイ
ンの活性部分；または （d）アミノ酸40（Gly）〜285（Val）の範囲のポリペプチド分子、コラーゲン
様ドメインおよびC1qドメインを含むzacrp2ポリペプチドの部分から成る群より
選択されるポリペプチド；および （2）他のポリペプチド。

【０１３９】 他のポリペプチドはオールタネイティブまたは追加のC1qドメイン、オールタ
ネイティブまたは追加のコラーゲン様ドメイン、融合タンパク質の分泌を促進す
るシグナルペプチドまたはその他であることができる。補体の球状ドメインはＩ
ｇＧに結合し、こうして、zacrp2ポリペプチド、フラグメントまたは融合物の球
状ドメインは同様な役割を有することができる。

【０１４０】 アミノ酸1（Met）〜アミノ酸285（Val）の範囲のzacrp2ポリペプチド；アミノ
酸16（Asp）〜アミノ酸285（Val）の範囲の成熟zacrp2ポリペプチド；またはア
ミノ酸1（Met）〜アミノ酸15（Ala）の範囲の、前記ポリペプチドのオールタネ
イティブ分泌リーダーフラグメントを、細胞のタンパク質の分泌の研究において
使用することができる。本発明のこの面の好ましい態様において、成熟ポリペプ
チドを推定上の分泌シグナル配列として形成する；融合タンパク質の発現を指令
することができる調節領域を支持するプラスミドを被験細胞の中に導入する；そ
して成熟タンパク質の分泌をモニターする。モニターはこの分野において知られ
ている技術、例えば、HPLCおよびその他により実施することができる。

【０１４１】 全長のタンパク質、それらのフラグメントおよび融合ポリペプチドを包含する
、本発明のポリペプチドを、慣用技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞におい
て製造することができる。適当な宿主細胞は、外因的DNAで形質転換またはトラ
ンスフェクトし、培養において増殖させることができる細胞の型であり、そして
細菌、真菌細胞、および培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多
細胞微生物の培養された細胞は好ましい。クローニングされたDNA分子を操作し
、外因的DNAを種々の宿主細胞の中に導入する技術は下記の文献に記載されてい
る：Sambrook他、前掲、およびAusubel他、前掲。

【０１４２】 一般に、zacrp2ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内に一般
に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現に必要な他の遺伝因
子に作用可能に連鎖される。ベクターは、また、1またはそれ以上の選択可能な
マーカーおよび1またはそれ以上の複製起点を普通に含有するが、当業者は認識
するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々のベクター上に提供し、
そして宿主細胞のゲノムの中への組込みにより外因的DNAの複製を得ることがで
きる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他
の因子の選択は、当業者のレベル内の日常的設計事項である。多数のこのような
因子は文献に記載されており、そして商業的供給会社から入手可能である。

【０１４３】 zacrp2ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグナル
配列（また、リーダー配列、シグナル配列、プレプロ配列または前配列として知
られている）を発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はzacrp2ポリペ
プチドのそれであることができるか、あるいは他の分泌されたタンパク質（例え
ば、t−PA）から誘導するか、あるいは新規に合成することができる。分泌シグ
ナル配列をzacrp2ポリペプチドDNA配列に正しいリーディングフレームで結合さ
せる。分泌シグナル配列は普通に問題のポリペプチドをコードするDNA配列に対
して5'に配置されるが、ある種の分泌シグナル配列は問題のDNA配列の中のどこ
かに位置決定することができる（例えば、Welch他、米国特許第5,037,743号；Ho
lland他、米国特許第5,143,830号、参照）。逆に、類似する方法により、オール
タネイティブタンパク質の分泌を指令することができる。

【０１４４】 本発明のポリペプチドの中に含有される分泌シグナル配列を使用して、他のポ
リペプチドを分泌経路の中に向けることができる。本発明はこのような融合ポリ
ペプチドを提供する。配列番号2のアミノ酸残基1〜15から誘導された分泌シグナ
ル配列が他のポリペプチドに作用可能に連鎖されたシグナル融合ポリペプチドを
、この分野において知られておりかつ本明細書に開示されている方法により、作
ることができる。

【０１４５】 好ましくは、本発明の融合ポリペプチドの中に含有される分泌シグナル配列を
追加のペプチドに対してアミノ末端的に融合させて、追加のペプチドを分泌経路
の中に向ける。このような構築物はこの分野において知られている多数の用途を
有する。例えば、これらの新規な分泌シグナル配列の融合構築物は、例えば、常
態で分泌されないタンパク質の活性成分、例えば、レセプターの分泌を指令する
ことができる。このような融合物をin vivoまたはin vitroにおいて使用して
、ペプチドを分泌経路を通して向けることができる。

【０１４６】 培養された哺乳動物細胞は本発明において適当な宿主である。外因的DNAを哺
乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する：リン酸カルシウ
ム仲介トランスフェクション（Wigler他、Cell 14：725、1978；Corsaroおよび
Pearson、Somatic Cell Genetics 7：603、1981；GrahamおよびVan der Eb
、Virology 52：456、1973）、エレクトロポレーション（Neumann他、EMBO J.
1：841−5、1982）、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクション（Ausubel
他、前掲）、およびリポソーム仲介トランスフェクション（Hawley−Nelson他、
Focus 15：73、1993；Ciccarone他、Focus 15：80、1993）、およびウイルス
ベクター（MillerおよびRosman、BioTechniques 7：980−90、1989；Wangおよ
びFiner、Nature Med. 2：714−6、1996）。

【０１４７】 培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記
の特許文献に記載されている：Levinson他、米国特許第4,713,339号；Hagen他、
米国特許第4,784,950号；Palmiter他、米国特許第4,579,821号；およびRingold
、米国特許第4,656,134号。適当な培養された哺乳動物細胞は下記のものを包含
する：COS−1（ATCC No. CRL 1650）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BH
K（ATCC No. CRL 1632）、BHK570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATCC N
o. CRL 1573；Graham他、J. Gen. Virol. 36：59−72、1977）；およびチ
ャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO−K1；ATCC No. CRL 61）細胞系統
。

【０１４８】 追加の適当な細胞系統はこの分野において知られており、そして公衆の寄託機
関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）バージニア州マンナッサス、から入手可能である。一
般に、強い転写プロモーター、例えば、SV−40またはサイトメガロウイルスから
のプロモーターは好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号参照。他の適当な
プロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（米国特許第4,57
9,821号および米国特許第4,601,978号）およびアデノウイルスの主要な後期プロ
モーターを包含する。

【０１４９】 薬剤選択を一般に使用して、外来DNAが挿入された、培養された哺乳動物細胞
について選択する。このような細胞は普通に「トランスフェクタント」と呼ばれ
る。例えば、選択因子の存在において培養され、問題の遺伝子をそれらの子孫に
移行させることができる細胞は、「安定なトランスフェクタント」と呼ばれる。
好ましい選択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコード
する遺伝子である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G−418またはその他の
存在において実施される。また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベル
を増加することができる、「増幅」と呼ぶ方法。

【０１５０】 低いレベルの選択因子の存在においてトランスフェクタントを培養し、次いで
選択因子の量を増加して、導入された遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞
について選択することによって、増幅は実施される。好ましい増幅可能な選択可
能なマーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与する、ジヒドロフォレー
トリダクターゼである。他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多
薬剤耐性、プロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる
。

【０１５１】 因子によるトランスフェクションのセットに加えて、変更された表現型を導入
するオールタネイティブマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表
面のタンパク質、例えば、CD4、CD8、クラスIのMHC、胎盤アルカリ性ホスファタ
ーゼを使用して、FACSソーティングまたは磁気ビーズ分離技術により、トランス
フェクトされない細胞からトランスフェクトされた細胞をソーティングすること
ができる。

【０１５２】 植物細胞、昆虫細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細
胞として使用することもできる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクタ
ーとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使
用することは、Sinkar他、J. Biosci.（Bangalore）11：47−58、1987、におい
て概観されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産生
は、Guarino他、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO 94/06463に開示され
ている。オートグラファト・カリフォルニカ（Autographa californica）核多
角体病ウイルス（AcNPV）から普通に誘導される、組換えバキュロウイルスで、
昆虫細胞を感染させることができる。

【０１５３】 下記の文献を参照のこと：KingおよびPossee、The Baculovirus Expression
System：A Laboratory Guide、London、Chapman & Hall、O'Reilly他、Ba
culovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual、New York、Oxford
University Press、1994；およびRichardson、C. D. 編者、Baculovirus
Expression Protocols、 Methods in Molecular Biology、Totowa、NJ、Hu
mana Press、1995。組換えzacrp2バキュロウイルスを作る第2の方法は、Luckow
が記載するトランスポゾンをベースとする系を利用する（Luckow他、J. Virol.
67：4566−79、1993）。この系はBac−to−Bac^TMキット（Life Technologies
、マリイランド州ロックビレ）で販売されている。

【０１５４】 この系は転移ベクター、pFastBac1^TM（Life Technologies）を利用し、ここ
でpFastBac1^TMは「バクミド（bacmid）」と呼ばれる大きいプラスミドとして大
腸菌（E. coli）の中に維持されたバキュロウイルスのゲノムの中にzacrp2ポリ
ペプチドをコードするDNAを動かすために、Tn7トランスポゾンを含有する。pFas
tBac1^TM転移ベクターは、問題の遺伝子、この場合においてzacrp2の発現を推進
するためにAcNPVポリヘドリンプロモーターを利用する。しかしながら、pFastBa
c1^TMをかなりの程度に修飾することができる。

【０１５５】 ポリヘドリンプロモーターを除去し、バキュロウイルスの基本的タンパク質プ
ロモーター（また、Pcor、p6.9またはMPプロモーターとして知られている）で置
換することができ、このプロモーターはバキュロウイルス感染において初期に発
現され、分泌されたタンパク質を発現させるために好都合であることが示された
。下記の文献を参照のこと：Hill−PerkinsおよびPossee、J. Gen. Virol. 7
1：971−6、1990；Bonning他、J. Gen. Virol. 75：1551−6、1994；および
、ChazenbalkおよびRapoport、J. Biol. Chem. 270：1543−9、1995。このよ
うな転移ベクター構築物において、基本的タンパク質プロモーターの短いおよび
長いバージョンを使用することができる。

【０１５６】 そのうえ、自然zacrp2分泌シグナル配列を昆虫タンパク質に由来する分泌シグ
ナル配列で置換された、転移ベクターを構築することができる。例えば、エクチ
ステロイドグルコシルトランスフェラーゼ（RGT）、ミツバチメリチン（Invitro
gen、カリフォルニア州カールスバッド）、またはバキュロウイルスgp67（PharM
ingen、カリフォルニア州サンディエゴ）からの分泌シグナル配列を構築物にお
いて使用して、自然zacrp2分泌シグナル配列を置換することができる。さらに、
転移ベクターは、発現されたzacrp2ポリペプチドのC末端またはN末端におけるエ
ピトープ標識、例えば、Glu−Gluエピトープ標識をコードするDNAとのインフレ
ーム融合物を含むことができる（Grussenmeyer、他、Proc. Natl. Acad. Sci
. 82：7952−4、1985）。

【０１５７】 この分野において知られている技術を使用して、zacrp2を含有する転移ベクタ
ーを大腸菌（E.coli）の中に形質転換し、そして組換えバキュロウイルスを示す
中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミドについてスクリーニングする。組換え
バキュロウイルスのゲノムを含有するバクミドDNAを普通の技術に従い単離し、
そしてスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、例えば、
Sf9細胞をトランスフェクトする。zacrp2を発現する組換えベクターを引き続い
て生成させる。この分野において普通に使用されている方法により、組換えウイ
ルスの系統を作る。

【０１５８】 宿主細胞、典型的にはヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）に由来する細胞系統を感染させるために、組換えウイルスを使用す
る。一般に、下記の文献を参照のこと：GlickおよびPasternak、Molecular Bio
technology：Principle and Applications of Recombinant DNA、ASM Pre
ss、Washington、D. C.、1994。他の適当な細胞系統は、トリコデルマ・ニ（Tr
ichoderma ni）に由来するHigh FiveO^TM細胞系統（Invitrogen）である（米国
特許第5,300,435号）。商業的に入手可能な無血清培地を使用して、細胞を増殖
させかつ維持する。

【０１５９】 適当な培地はSf9細胞についてSf900 II^TM（Life Technologies）またはESF
921^TM（Expression System）；およびトリコデルマ・ニ（T.ni）細胞につい
てEx−cellO450^TM（JRH Bioscience、カンサス州レネクサ）またはExpress Fi
veO^TM（Life Technologies）である。細胞をほぼ2〜5×10⁵細胞の接種密度から
1〜2×10⁶細胞の密度に増殖させ、この時組換えウイルスの系統を0.1〜10、より
典型的には3付近の感染の多重度で添加する。使用する手順は一般に入手可能な
実験室のマニュアルに記載されている（KingおよびPossee、前掲；O'Reilly他、
前掲；Richardson、前掲）。本明細書に記載する方法に従い、上清からのzacrp2
ポリペプチドの引き続く精製を実施することができる。

【０１６０】 酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに
関して特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces c
erevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタ
ノリカ（Pichia metanolica）を包含する。外因的DNAでサッカロミセス・セレ
ビシエ（S. cerevisiae）を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産す
る方法は、例えば、下記の特許文献に記載されている：Kawasaki、米国特許第4,
599,311号；Kawasaki他、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008
号；Welch他、米国特許第5,037,743号；およびMurry他、米国特許第4,845,075号
。

【０１６１】 選択可能なマーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄
養（例えば、ロイシン）の非存在において増殖する能力により、形質転換された
細胞を選択する。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
において使用するために好ましいベクター系は、Kawasaki他（米国特許第4,931,
373号）により開示されているPOT1ベクター系であり、これによりグルコースを
含有する培地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。酵母におい
て使用するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子
（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Ingsman他、米国特許第4,615,97
4号；およびBitter、米国特許第4,977,092号、参照）およびアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。

【０１６２】 また、米国特許第4,990,446号；米国特許第5,063,154号；米国特許第5,139,93
6号および米国特許第4,661,454号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenul
a polymorpha）、シゾサッカラロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマ
イセス・フラギリス（Kluyveromyces frgilis）、ウスチラゴ・マイディス（Us
tilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノ
リカ（Pichia metanolica）、ピキア・グイレルモンディイ（Pichia guillerm
ondii）およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を包含する、他の酵母
のための形質転換系はこの分野において知られている。

【０１６３】 例えば、Gleeson他、J. Gen. Microbiol. 132：3459−65、1986およびCreg
g、米国特許第4,882,279号、参照。McKnight他、米国特許第4,935,349号の方法
に従い、アスペルギルス（Aspergillus）細胞を利用することができる。アクレ
モニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）は、Sumino他、米国特許
第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換す
る方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。

【０１６４】 組換えタンパク質の生産のための宿主としてピキア・メタノリカ（Pichia me
tanolica）を使用することは、WIPO公開WO 97／17450、WO 97／17451、WO 98
／02536、およびWO 98／02565に開示されている。ピキア・メタノリカ（P. me
tanolica）の形質転換において使用するDNA分子は二本鎖、円形のプラスミドと
して普通に製造され、これらは好ましくは形質転換の前に線状化される。ピキア
・メタノリカ（P. metanolica）におけるタンパク質の産生のために、プラスミ
ド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ（P. metanoli
ca）の遺伝子、例えば、ピキア・メタノリカ（P. metanolica）のアルコール利
用遺伝子（AUG1またはAUG2）のそれであることが好ましい。

【０１６５】 他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ホル
メートデヒドロゲナーゼ（FMD）、およびカタラーゼ（CAT）遺伝子のプロモータ
ーを包含する。宿主染色体の中へのDNAの組込みを促進するために、宿主DNA配列
により双方の末端においてフランクされたプラスミドの全体の発現セグメントを
有することが好ましい。ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）において使
用するために好ましい選択可能なマーカーはピキア・メタノリカ（P. metanoli
ca）のADE2遺伝子であり、これはホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカル
ボキシラーゼ（AIRC；EC4.1.1.21）をコードし、これはアデニンの非存在におい
てade2宿主細胞を増殖させる。

【０１６６】 メタノールの使用を最小としようとする、大規模の工業的方法のために、双方
のメタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠失されている、宿主細胞を使用
することが好ましい。分泌されたタンパク質の生産のために、液胞プロテアーゼ
遺伝子（PEP4およびPRB1）を欠如する宿主細胞は好ましい。問題のポリペプチド
をコードするDNAを含有するプラスミドをピキア・メタノリカ（P. metanolica
）細胞の中に導入することを促進するために、エレクトロポレーションを使用す
る。2.5〜4.5kV／cm、好ましくは約3.75kV／cmの電界強度を有する、指数的に減
衰する、パルス電界、および1〜40ミリセカント、最も好ましくは約20ミリセカ
ントの時間定数（τ）を使用する、エレクトロポレーションにより、ピキア・メ
タノリカ（P. metanolica）細胞を形質転換することが好ましい。

【０１６７】 細菌大腸菌（Escherichia coli）、バシラス（Bacillus）および他の属の株
を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有用である。これらの宿主
を発現させ、その中でクローニングされた外来DNA配列を発現する技術はこの分
野においてよく知られている（例えば、Sambrook他、前掲参照）。大腸菌（E.
coli）のような細菌においてzacrp2ポリペプチドを発現させるとき、ポリペプチ
ドを、典型的には不溶性粒子として、細胞質の中に保持させることができるか、
あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスミック空間の中に向けることができる
。

【０１６８】 前者の場合において、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば、グアニジンイソ
チオシアネートまたは尿素を使用して、変性する。次いで変性されたポリペプチ
ドをリフォルディングさせ、変性物の希釈により、例えば、尿素の溶液および還
元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンとの組合わせに対する透析
、および引き続く緩衝化生理食塩水に対する透析により、二量体化させることが
できる。後者の場合において、細胞を崩壊させて（例えば、超音波処理または浸
透圧ショックにより）ペリプラスミック空間の内容物を解放し、これにより変性
およびリフォルディングの必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリ
プラスミック空間から可溶性の、機能的形態で回収することができる。

【０１６９】 形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素
および選択した宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培地中で培養する。
規定された培地および複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野にお
いて知られており、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよ
び無機質を含む。培地は、また、必要に応じて、成長因子または血清のような成
分を含有することができる。一般に、外因的に添加されたDNAを含有する細胞に
ついて成長培地を選択する。この選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の
欠如により実施され、必須栄養素は発現ベクター上に担体されるか、あるいは宿
主細胞の中に共トランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補足される。

【０１７０】 分画および／または慣用の精製方法および培地を使用して、発現された組換え
zacrp2ポリペプチド（またはキメラzacrp2ポリペプチド）を精製することができ
る。試料の分画のために、硫酸アンモニウム沈降および酸またはカオトロープ抽
出を使用することができる。典型的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイ
ズ排除、FPLCおよび逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含することができる
。適当なアニオン交換媒質は、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、
ポリアクリルアミド、特製シリカ、およびその他を包含する。PEI、DEAE、QAEお
よびQ誘導体は好ましく、DEAE高速流れセファローズ（Pharmacia、ニュージャー
ジイ州ピスカタウェイ）は特に好ましい。

【０１７１】 典型的なクロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基で
誘導化された媒質、例えば、フェニル−セファローズFF（Pharmacia）、トヨパ
ールブチル650（Toso Haas、ペンシルベニア州モントゴメリヴィレ）、オクチ
ル−セファローズ（Pharmacia）およびその他；またはポリアクリル樹脂、例え
ば、Amberchrom CG 71（Toso Haas）およびその他を包含する。適当な固体支
持体は、ガラスビーズ、シリカをベースとする樹脂、セルロース樹脂、アガロー
スビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミ
ド樹脂、およびその他を包含し、これらはこれらを使用する条件下に不溶性であ
る。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロ
キシル基および／または炭水化物部分によるタンパク質の結合を可能とする反応
性基で修飾することができる。

【０１７２】 化学的カップリングの例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミ
ド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、およ
びカーボジイミドの化学的カップリングのためのカルボキシルおよびアミノ誘導
体を包含する。これらおよび他の固体の媒質はこの分野においてよく知られてお
り、かつ広く使用されており、そして商業的供給会社から入手可能である。レセ
プターのポリペプチドを固体の媒質に結合する方法は、この分野においてよく知
られている。特定の方法の選択は日常的設計事項であり、そして一部分選択した
支持体の性質により決定される。例えば、下記の文献を参照のこと：Affinity
Chromatography：Principle & Methods、Pharmacia LKB Biotechnology、ス
イス国ウップサラ、1988。

【０１７３】 本発明のポリペプチドは、それらの構造的および結合的性質を利用することに
よって、単離することができる。例えば、固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマ
トグラフィーを使用して、ポリヒスチジン標識からなるものを包含する、ヒスチ
ジンに富んだタンパク質を精製することができる。簡単に述べると、ゲルにまず
2価の金属イオンを負荷してキレート化剤を形成する（Sulkowski、Trends in
Biochem. 3：1−7、1985）。ヒスチジンに富んだタンパク質は、使用する金属
イオンに依存して、異なるアフィニティーでこのマトリックスに吸着され、競合
的溶離、pHの低下、または強いキレート剤の使用により溶離されるであろう。

【０１７４】 他の精製法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換
クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を包含する（Methods
in Enzymol.、Vol. 182、″Guide to Protein Purification″、M. Deu
tscher（編）、Academic Press、サンディエゴ、1990、pp. 529−39）。本発
明の追加の態様の範囲内において、下記の実施例の節に詳細に論じられているよ
うに、問題のポリペプチドと親和標識（例えば、マルトース結合性タンパク質、
FLAG、Glu−Gluタグ、免疫グロブリンドメイン）との融合物を構築して、精製を
促進することができる。

【０１７５】 タンパク質の再フォルディング（および必要に応じて再酸化）手法を好都合に
使用することができる。汚染する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関し
て＞80％の純度、より好ましくは＞90％、なおより好ましくは＞95％の純度にタ
ンパク質を精製することが好ましく、製剤学的に純粋な状態、すなわち、99.9％
より大きい純度にタンパク質を精製すること、そしてタンパク質は感染因子およ
び発熱因子を含有しないことが特に好ましい。好ましくは、精製されたタンパク
質は他のタンパク質、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。

【０１７６】 zacrp2ポリペプチドまたはそのフラグメントは、また、化学的合成により製造
することができる。このようなzacrp2ポリペプチドはモノマーまたはマルチマー
であることができ、グリコシル化されているか、あるいはされていないことがで
き、ペギル化されているか、あるいはされていないことができ、そして初期のメ
チオニンアミノ酸残基を含むか、あるいは含まないことができる。

【０１７７】 リガンド結合性ポリペプチド、例えば、zacrp2結合性ポリペプチドをリガンド
の精製に使用することもできる。ポリペプチドを固体支持体、例えば、アガロー
ス、架橋したアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベースとする樹脂
、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、または使用条件下に安定である同様
な物質のビーズ上に固定化する。

【０１７８】 固体支持体にポリペプチドを結合する方法はこの分野において知られており、
そしてアミン化学、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、
エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、およびヒドラジド活性化を包含する
。生ずる媒質は一般にカラムの形態に形造り、そしてリガンドを含有する流体を
カラムに1またはそれ以上の回数通過させて、リガンドをリガンド結合性ポリペ
プチドに結合させる。次いで塩濃度、カオトロープ因子（グアニジンHCl）、ま
たはリガンド−レセプターの結合を崩壊するpHの変化により、リガンドを溶離す
る。

【０１７９】 リガンド結合性レセプター（または抗体、補体／抗補体の対の一方のメンバー
）またはそれらの結合性フラグメント、および商業的に入手可能なバイオセンサ
ー計器（BIAcore^TM、Pharmacia Biosensor、ニュージャージイ州ピスカタウェ
イ）を使用してアッセイシステムを好都合に使用することができる。このような
レセプター、抗体、補体／抗補体の対のメンバーまたはフラグメントをレセプタ
ーチップの表面上に固定化する。この計器の使用は下記の文献に開示されている
：Karlsson、J. Immunol. Methods 145：229−40、1991およびCunninghamお
よびWells、J. Mol. Biol. 234：554−63、1993。

【０１８０】 アミンまたはスルフヒドリル化学を使用して、レセプター、抗体、補体／抗補
体の対のメンバーまたはフラグメントを流れセル内の金薄膜に結合したデキスト
ラン繊維に共有結合させる。被験試料をセルに通過させる。リガンド、エピトー
プ、または補体／抗補体の対のメンバーが試料の中に存在する場合、それはそれ
ぞれ固定化されたレセプター、抗体またはメンバーに結合し、媒質の屈折率を変
化させ、これは金薄膜表面のプラスモン共鳴の変化として検出される。このシス
テムは、結合アフィニティーをそれから計算することができるオンおよびオフの
速度、および結合の化学量論の評価を可能とする。

【０１８１】 また、この分野において知られている他のアッセイシステムにおいて、リガン
ド結合性ポリペプチドを使用することができる。このようなシステムは結合アフ
ィニティーを測定するスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sc
i. 51：660−72、1949）および比色アッセイ（Cunningham他、Science 253：5
45−48、1991およびCunningham他、Science 245：821−25、1991参照）。

【０１８２】 本発明は、また、抗zacrp2抗体を提供する。例えば、zacrp2発現ベクターの産
物、または天然源から単離されたzacrp2を抗原として使用して、zacrp2に対する
抗体を得ることができる。特に有効な抗zacrp2抗体は、zacrp2に「特異的に結合
する」。抗体が10⁶／Mまたはそれより大きい、好ましくは10⁷／Mまたはそれより
大きい、より好ましくは10⁸／Mまたはそれより大きい、最も好ましくは10⁹／Mま
たはそれより大きい結合アフィニティー（Ka）でzacrp2ポリペプチド、ペプチド
またはエピトープに結合する場合、抗体は「特異的に結合する」と考える。抗体
の結合アフィニティーは、例えば、スキャッチャード分析（Scatchard、Ann. N
Y Acad. Sci. 51：660、1949）により、容易に決定することができる。適当
な抗体は、特定のドメインにおいてzacrp2に結合する抗体を包含する。

【０１８３】 抗原zacrp2エピトープ支持ペプチドおよびポリペプチドを使用して、抗zacrp2
抗体を製造することができる。本発明の抗原エピトープ支持ペプチドおよびポリ
ペプチドは、配列番号2内に含有される少なくとも9、好ましくは15〜約30アミノ
酸の配列を含有する。しかしながら、本発明のアミノ酸配列のより大きい部分を
含んでなり、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全
体までの任意の長さのアミノ酸を含有し、かつ本発明のポリペプチドのアミノ酸
配列の全体を包含する、ペプチドまたはポリペプチドは、また、zacrp2に結合す
る抗体を誘導するために有効である。

【０１８４】 水性溶媒中の実質的な溶解度を提供するようにエピトープ支持ペプチドのアミ
ノ酸配列を選択することが望ましい（すなわち、配列は比較的親水性の残基を含
むが、疎水性残基を回避することが好ましい）。親水性ペプチドは疎水性プロッ
トから予測することができる、例えば、下記の文献を参照のこと：HoppおよびWo
ods、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78：3824−8、1981およびKyteおよびDoo
little、J. Mol. Biol. 157：105−142、1982。そのうえ、プロリン残基を含
有するアミノ酸配列は、また、抗体産生に望ましいことがある。

【０１８５】 組換えzacrp2タンパク質または天然源から単離されたzacrp2に対するポリクロ
ーナル抗体は、この分野においてよく知られている方法を使用して製造すること
ができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Green他、“Production of Pol
yclonal Antsera，”in Immunochemical Protocols（Manson、編）、pp. 1
−5（Humana Press 1992）、およびWilliams他、“Expression of foreign
proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of
specific polyclonal antibodies，”in DNA Cloning 2：Expression S
ystems、第2版、Glover他（編者）、p. 15（Oxford University Press 1995
）。アジュバント、例えば、明礬（水酸化アルミニウム）またはフロインド完全
アジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用して、zacrp2ポリペプ
チドの免疫原性を増加することができる。

【０１８６】 免疫化に有効なポリペプチドは、また、融合ポリペプチド、例えば、zacrp2ま
たはその一部分と免疫グロブリンまたはマルトース結合性タンパク質との融合物
を包含する。ポリペプチド免疫原は全長の分子またはその一部分であることがで
きる。ポリペプチドの一部分が「ハプテン様」である場合、このような一部分は
免疫化のために好都合には高分子担体（例えば、キーホールリンペットヘモシア
ニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）または破傷風トキソイド）に結合また
は連鎖することができる。

【０１８７】 ポリクローナル抗体は典型的には動物、例えば、ウマ、雌牛、イヌ、ニワトリ
、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、ヤギまたはヒツジにおい
て発生させるが、本発明の抗zacrp2抗体は類人猿の抗体に由来することができる
。ヒヒにおいて診断的、療法的に有効な抗体を発生させる一般的技術は、例えば
、下記の文献に記載されている：Goldenberg、国際特許公開No.WO 91／11465、
およびLosman他、Int. J. Cancer 46：310、1990。また、抗体はトランスジ
ェニック動物、例えば、トランスジェニックヒツジ、雌牛、ヤギまたはブタにお
いて発生させることができ、そして酵母および真菌中の修飾された形態でならび
に哺乳動物細胞および昆虫細胞中で発現させることができる。

【０１８８】 あるいは、モノクローナル抗zacrp2抗体を発生させることができる。特異的抗
原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、この分野において知られている方法に
より得ることができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Kohler他、Nature
256：495、1975；Coligan他（編者）、Current Protocols in Imunology、Vo
l. 1、pp. 2.5.1−2.6.7（John Wiley & Sons 1991）；Picksley他、“Pr
oduction of monoclonal antibodies against proteins expressed in
E. coli，”in DNA Cloning：Expression Systems、第2版、Glover他（編者
）、p. 63（Oxford University Press 1995））。

【０１８９】 簡単に述べると、モノクローナル抗体は次のようにして得ることができる。za
crp2遺伝子産物を含んでなる組成物をマウスに注射し、血清試料を取出すことに
よって抗体産生を確認し、脾臓を取出してBリンパ球を獲得し、Bリンパ球を骨髄
腫細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、
抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生す
るクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離する。

【０１９０】 さらに、本発明の抗zacrp2抗体はヒトモノクローナル抗体に由来することがで
きる。抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたト
ランスジェニックマウスから、ヒトモノクローナル抗体は得られる。この技術に
おいて、内因的重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲッテッド崩壊を含有する胚幹細
胞系統に由来したマウスの中に、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の因子を導入する
。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成するこ
とができ、そしてこのマウスを使用してヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生する
ことができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、
下記の文献に記載されている：Green他、Nat. Genet. 7：13、1994；Lonberg
他、Nature 368：856、1994；およびTaylor他、Int. Immun. 6：579、1994。

【０１９１】 種々のよく確立された技術により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養
物から単離し、精製することができる。このような単離技術は、プロテインAセ
ファローズを使用するアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマト
グラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、下記の
文献を参照のこと：Coligen、pp. 2.7.1−2.7.12およびpp. 2.9.1−2.9.3；Ba
ines他、“Purification of Immunoglobulin G（IgG），”in Methods in
Molecular Biology、Vol. 10、pp. 79−104（The Humana Press，Inc.
1992））。

【０１９２】 特定の用途のために、抗zacrp2抗体のフラグメントを製造することが望ましい
。このような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解に
より、得ることができる。抗体フラグメントは、慣用法に従い全抗体のペプシン
またはパパイン消化により得ることができる。例示として、抗体をペプシンで酵
素的に消化してF（ab）'₂と表示する5Sフラグメントを形成することによって、
抗体フラグメントを製造することができる。チオール還元剤を使用して、このフ
ラグメントをさらに切断して、3.5SFab'1価フラグメントを産生することができ
る。

【０１９３】 必要に応じて、ジサルファイド結合の切断から生ずるスルフヒドリル基のブロ
ッキング基を使用して、切断反応を実施することができる。別法として、ペプシ
ンを使用する酵素的切断は2つの1価FabフラグメントおよびFcフラグメントを直
接的に産生する。これらの方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Gold
enberg、米国特許第4,331,647号；Nisonoff他、Arch. Biochem. Biophys. 89
：230、1960；Porter、Biochem. J. 73：119、1959；Edelman他、in Methods
in Enzymology、Vol. 1、p. 422（Academic Press 1967）；およびColig
an、前掲。

【０１９４】 フラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合するかぎり、抗体を切
断する他の方法、例えば、重鎖を分離して1価の軽−重鎖フラグメントを形成す
る方法、フラグメントをさらに切断する方法、または他の酵素的、化学的または
遺伝学的技術を使用することもできる。 例えば、FvフラグメントはV_HおよびV_L鎖のアソシエーションを含んでなる。下
記の文献に記載されているように、このアソシエーションは非共有結合であるこ
とができる：Inbar他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69：2659、1972。ある
いは、可変鎖は細胞間ジサルファイド結合により結合するか、あるいは化学物質
、例えば、グルタルアルデヒドにより架橋することができる（例えば、下記の文
献を参照のこと：Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12：437、1992）。

【０１９５】 Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより接続されたV_HおよびV_L鎖を含んで
なることができる。オリゴヌクレオチドにより接続されたV_HおよびV_Lドメインを
コードするDNA配列を含んでなる構造的遺伝子を構築することによって、これら
の一本鎖抗原結合性タンパク質（scFv）は製造される。構造遺伝子を発現ベクタ
ーの中に挿入し、次いで発現ベクターを宿主細胞、例えば、大腸菌（E. coli）
の中に導入する。これらの組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリンカ
ーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを産生する方法は、
例えば、下記の文献に記載されている：Whitlow他、Methods：A Companion to
Methods in Enzymology 2：97、1991；また、Bird他、Science 242：423
、1988；Ladner他、米国特許第4,946,778号；Pack他、Bio／Technology 11：12
71、1993；およびSandhu、前掲。

【０１９６】 例示として、リンパ球をin vitroにおいてzacrp2ポリペプチドに暴露し、フ
ァージまたは同様なベクター中の抗体表示ライブラリーを選択することによって
、scFvを得ることができる（例えば、固定化または標識化zacrp2タンパク質また
はペプチドを使用する）。潜在的zacrp2ポリペプチド結合性ドメインを有するペ
プチドをコードする遺伝子は、ファージ上で（ファージ表示）または細菌、例え
ば、大腸菌（E. coli）上で表示されたランダムペプチドライブラリーをスクリ
ーニングすることによって得ることができる。

【０１９７】 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダ
ム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成により得ることができる。
これらのランダムペプチド表示ライブラリーを使用して、既知のターゲットと相
互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。このターゲット
はタンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学
的または合成的高分子、または有機または無機の物質であることができる。

【０１９８】 このようなランダムペプチド表示ライブラリーをつくりかつスクリーニングす
る技術はこの分野において知られている（Ladner他、米国特許第5,223,409号、L
adner他、米国特許第4,946,778号、Ladner他、米国特許第5,403,484号、Ladner
他、米国特許第5,571,698号、およびKay他、Phage Display of Peptides an
d Poteins（Academic Press，Inc. 1996）そしてランダムペプチド表示ライ
ブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば
、Clontech（カリフォルニア州パロアルト）、Invitrogen Inc.（カリフォルニ
ア州サンディエゴ）、New England Biolabs，Inc.（マサチュセッツ州ベバー
リイ）、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.（ニュージャージイ州ピ
スカタウェイ）から商業的に入手可能である。本明細書に開示するzacrp2配列を
使用して、ランダムペプチド表示ライブラリーをスクリーニングして、zacrp2に
結合するタンパク質を同定することができる。

【０１９９】 抗体フラグメントの他の形態は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードする
ペプチドである。問題の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって
、CDRペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。このような遺伝子は
、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するPCRにより製造される（例
えば、下記の文献を参照のこと：Larrick他、Methods：A Companion to Meth
ods in Enzymology 2：106、1991）；Courtenay−Luck、“Genetic Manipul
ation of Monoclonal Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Product
ion，Engineering and Clinical Application、Ritter他、（編者）、p. 16
6（Cambridge University Press 1995）；およびWard他、“Genetic Manipu
lation and Expression of Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：P
rinciples and Applications、Birch他、（編者）、p. 137（Wiley−Liss，I
nc. 1995））。

【０２００】 あるいは、抗zacrp2抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体から誘導することが
できる。マウス相補的決定領域をマウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖から
ヒト可変ドメインの中に転移することによって、ヒト化モノクローナル抗体を産
生する。次いでヒト抗体の典型的な残基を、ネズミ対応物のフレームワーク領域
において置換する。ヒトモノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズ
ミ定常領域の免疫原性に関連する潜在的問題を排除する。ネズミ免疫グロブリン
可変領域をクローニングする一般的技術は、例えば、下記の文献に記載されてい
る：Orlandi他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86：3833、1989。

【０２０１】 ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は、例えば、下記の文献に記載され
ている：Jones他、Nature 321：522、1986；Carter他、Proc. Nat. Acad. S
ci. USA 89：4285、1992；Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12：437、1992；S
inger他、J. Immun. 150：2844、1993；Sudhir（編者）、Antibody Engineeri
ng Protocols（Humana Press，Inc. 1995）；Kelley、“Engineering Thera
peutic Antibodies，”in Protein Engineering：Principles and Practic
e、Cleland他（編者）、pp. 399−434（John Wiley & Sons，Inc. 1996）
；およびQueen他、米国特許第5,693,762号（1997）。

【０２０２】 ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、動物を抗zacrp2抗体または抗体フラ
グメントで標準的技術に従い免疫化することによって製造することができる。例
えば、下記の文献を参照のこと：Green他、“Production of Polyclonal Ant
isera，”in Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols
、Manson（編者）、pp. 1−12（Humana Press 1992）。

【０２０３】 また、Coligan、前掲、pp. 2.4.1−2.4.7参照。あるいは、モノクローナル抗
イディオタイプ抗体は、前述の技術に従い、免疫原として抗zacrp2抗体または抗
体フラグメントを使用して製造することができる。別法として、ヒト化抗イディ
オタイプ抗体または類人猿抗イディオタイプ抗体は前述の技術に従い製造するこ
とができる。抗イディオタイプ抗体を製造する方法は、例えば、下記の文献に記
載されている：Irie、米国特許第5,208,146号、Greene他、米国特許第5,637,677
号、およびVarthakaviおよびMinocha、J. Gen. Virol. 77：1875、1996。

【０２０４】 ファージ（ファージディスプレイ）上にまたは細菌、例えば、大腸菌（E. co
li）上にディスプレイされたランダムまたは方向づけられたライブラリーをスク
リーニングすることによって、潜在的zacrp2ポリペプチド結合性ドメインを有す
るポリペプチド、「結合性タンパク質」をコードする遺伝子を得ることができる
。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダ
ム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成において得ることができる
。あるいは、拘束ファージディスプレイライブラリーを製造することもできる。
これらのペプチドディスプレイライブラリーを使用して、既知のターゲットと相
互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。

【０２０５】 ここでターゲットはタンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたは
レセプター、生物学的または合成的高分子、または有機または無機の物質である
ことができる。このようなペプチドディスプレイをつくりかつスクリーニングす
る技術はこの分野において知られており（Ladner他、米国特許第5,223,409号；L
adner他、米国特許第4,946,778号；Ladner他、米国特許第5,403,484号およびLad
ner他、米国特許第5,571,698号）そしてペプチドディスプレイライブラリーおよ
びこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、

【０２０６】 例えば、クロンテク（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）、インビトロ
ゲン（Invitrogen、カリフォルニア州サンディエゴ）、ニュー・イングランド・
バイオラブス・インコーポレーテッド（New England Biolabs，Inc.、マサチ
ュセッツ州ベバーリイ）およびファーマシアLKBバイオテクノロジー・インコー
ポレーテッド（Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.、ニュージャージイ州ピ
スカタウェイ）から商業的に入手可能である。本明細書に開示するzacrp2配列を
使用してペプチドディスプレイライブラリーをスクリーニングして、zacrp2に結
合するタンパク質を同定することができる。zacrp2ポリペプチドと相互作用する
、これらの「結合性タンパク質」を本質的に抗体と同様に使用することができる
。

【０２０７】 この分野において知られている種々のアッセイを利用して、zacrp2タンパク質
またはペプチドに特異的に結合する抗体および／または結合性タンパク質を検出
することができる。典型的なアッセイは下記の文献に詳細に記載されている：An
tibodies：A Laboratory Manual、HarlowおよびLane（編者）、Cold Spring
Harbor Laboratory Press、1988。このようなアッセイの代表的例は下記の
ものを包含する：並流免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射線免疫沈降、
酵素結合イムノアッセイ（ELISA）、ドットブロットまたはウェスタンブロット
アッセイ、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。さらに、野
生型vs突然変異体zacrp2タンパク質またはポリペプチドに対する結合について、
抗体をスクリーニングすることができる。

【０２０８】 zacrp2に対する抗体および結合性タンパク質は下記の用途に使用することがで
きる：zacrp2を発現する細胞の標識化；アフィニティー精製によるzacrp2の単離
；zacrp2ポリペプチドの循環レベルを測定する診断アッセイ；根元的病理または
疾患のマーカーとして可溶性zacrp2の検出または定量；FACSを使用する方法にお
いて；発現ライブラリーのスクリーニング；抗イディオタイプ抗体を発生させる
ため；およびin vitroおよびin vivoにおける精子形成または同様な活性のzac
rp2ポリペプチドのモジュレーションをブロックする中和性抗体またはアンタゴ
ニストとして。

【０２０９】 適当な直接的タグまたは標識は、放射性核種、酵素、基質、コファクター、イ
ンヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子およびその他を包含す
る；間接的タグまたは標識は、ビオチン−アビジンまたは他の補体／抗補体の対
を中間体として使用することを特徴とする。そのうえ、アッセイ、例えば、ウェ
スタンブロットアッセイまたはこの分野において知られている他のアッセイにお
いて、zacrp2またはそのフラグメントに対する抗体をin vitroにおいて使用し
て、変性されたzacrp2またはそのフラグメントを検出することができる。

【０２１０】 本発明における抗体またはポリペプチドは、また、薬剤、トキシン、放射性核
種およびその他と直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの
複合体はin vivoの診断または療法の応用において使用することができる。例え
ば、対応する抗相補的分子（例えば、それぞれ、レセプターまたは抗原）を発現
する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは
抗体を使用することができる。さらに詳しくは、zacrp2ポリペプチドまたは抗za
crp2抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは
細胞障害性分子にカップリングさせ、そして抗相補的分子を発現する細胞、組織
または器官を有する哺乳動物に送達することができる。

【０２１１】 本発明の追加の面は、前述のzacrp2ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴ
ニストを同定する方法を提供し、前記アゴニストまたはアンタゴニストは本明細
書においてさらに論ずるように価値のある特性を有することができる。1つの態
様において、zacrp2ポリペプチドアゴニストを同定する方法が提供され、この方
法はアゴニストに対して応答性の細胞を準備し、被検化合物の存在下に細胞を培
養し、細胞の応答をzacrp2ポリペプチドの存在下に培養した細胞と比較し、そし
て細胞の応答が同一型である被検化合物を選択することを含む。

【０２１２】 他の態様において、zacrp2ポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法が提
供され、この方法はzacrp2ポリペプチドに対して応答性の細胞を準備し、zacrp2
ポリペプチドの存在下に細胞の第1部分を培養し、zacrp2ポリペプチドおよび被
検化合物の存在下に細胞の第2部分を培養し、そして細胞の第1部分に比較して細
胞の第2部分の細胞の応答の減少を検出することを含む。本明細書に開示するア
ッセイに加えて、レセプターの結合またはzacrp2依存的細胞応答の刺激／阻害を
測定するように設計された、種々のアッセイにおいて、試料をzacrp2活性の阻害
について試験することができる。

【０２１３】 例えば、zacrp2刺激細胞経路に対して応答性であるリポーター遺伝子構築物で
zacrp2応答性細胞系統をトランスフェクトすることができる。この型のリポータ
ー遺伝子構築物はこの分野において知られており、そして一般にアッセイ可能な
タンパク質、例えば、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に作用可能に連鎖され
た、zacrp2−DNA応答因子を含んでなるであろう。DNA応答因子は下記のものを包
含するが、これらに限定されない：環状AMP応答因子（CRE）、ホルモン応答因子
（HRE）、インスリン応答因子（IRE）（Nasrin他、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87：5273−7、1990）および血清応答因子（SRE）（Shaw他、Cell 56：5
63−72、1989）。

【０２１４】 環状AMP応答因子は下記の文献において概観されている：Roestler他、J. Bio
l. Chem. 263（19）：9063−6、1988およびHabener、Molec. Endocrinol. 4
（8）：1087−94、1990。ホルモン応答因子は、Beato、Cell 56：335−44。198
9において概観されている。リポーター遺伝子発現のzacrp2刺激の減少により証
明されるように、ターゲット細胞に対するzacrp2の活性を阻害する能力について
、候補の化合物、溶液、混合物または抽出物を試験する。この型のアッセイは、
細胞表面レセプターに対するzacrp2の結合を直接的にブロックする化合物、なら
びにレセプター−リガンド結合に引き続いて細胞経路のプロセスをブロックする
化合物を検出するであろう。

【０２１５】 別法において、検出可能な標識（例えば、¹²⁵I、ビオチン、セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ、FITC、およびその他）で標識化したzacrp2を使用して、化合物
または試料をレセプターに対するzacrp2の結合の直接的ブロックについて試験す
ることができる。このアッセイにおいて、レセプターに対する標識化zacrp2の結
合を阻害する被験試料の能力は阻害活性を示し、これは二次的アッセイにより確
証することができる。結合アッセイにおいて使用するレセプターは細胞のレセプ
ターまたは単離し、固定化されたレセプターであることができる。

【０２１６】 zacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニストまたはアンタゴニス
トを使用して哺乳動物におけるエネルギー収支をモジュレートするか、あるいは
損傷から内皮細胞を保護することができる。エネルギー収支のモジュレーション
に関すると、zacrp2ポリペプチドは細胞の代謝反応をモジュレートする。このよ
うな代謝反応は、脂肪生成、グルコース新生、グリコーゲン分解、脂質生成、グ
ルコース吸収、タンパク質合成、熱発生、酸素の利用およびその他を包含する。
zacrp2ポリペプチドの発現パターンは、内皮細胞組織における発現を示す。

【０２１７】 内皮細胞の保護に関すると、zacrp2ポリペプチドは、器官の保存において、凍
結保存のため、虚血および／または炎症のための損傷を防止する外科的前処理の
ために、または同様な手順において使用することができる。心臓におけるzacrp2
ポリペプチドの発現は、タンパク質がアセチルコリンおよび／またはノルエピネ
フリンの放出をモジュレートできることを示唆する。zacrp2ポリペプチドは、ま
た、交感神経系または副交感神経系に関連する組織中のポリペプチドの発現によ
り示されるように、神経伝達物質として、または神経伝達のモジュレーターとし
ての使用を見出することができる。これに関して、zacrp2ポリペプチドは、例え
ば、脳またはその他における2−デオキシ−グルコースの吸収により証明される
ように、栄養分の吸収における実用性を見出すことができる。

【０２１８】 大動脈における発現は、タンパク質が止血作用に関係しうることを示唆する。
血小板は損傷した血管壁と相互作用して血栓を形成する。暴露された内皮下組織
および損傷した領域における血流のために、応答の程度は等級づけられる。これ
に関して、zacrp2ポリペプチドは止血作用のモジュレーション、血管損傷部を流
れる血液の増加およびコラーゲン質表面の沈静において実用性を見出すことがで
きる。

【０２１９】 この分野において知られているか、あるいは本明細書において記載されている
他の方法の中で、哺乳動物のエネルギー収支を下記の代謝機能の1または2以上を
モニターすることによって評価することができる：脂肪生成、グルコース新生、
グリコーゲン分解、脂質生成、グルコース吸収、タンパク質合成、熱発生、酸素
の利用およびその他。これらの代謝機能は、いっそう詳細に後述するように、当
業者に知られている技術（アッセイまたは動物モデル）によりモニターされる。

【０２２０】 例えば、インスリンのグルコース調節作用は、肝臓、骨格筋および脂肪組織に
おいて主として発揮される。インスリンはこれらの組織中のその細胞のレセプタ
ーに結合し、組織特異的作用を開始し、これは、例えば、グルコース産生の阻害
およびグルコース利用の刺激を生ずる。肝臓において、インスリンはグルコース
吸収を刺激し、グルコース新生およびグリコーゲン分解を阻害する。骨格筋およ
び脂肪組織において、インスリンはグルコースの吸収、貯蔵および利用を刺激す
る作用をする。

【０２２１】 前述の代謝機能のすべてをモニターする、この分野において認識されている方
法が存在する。こうして、当業者は、zacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合
タンパク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを代謝のモジュレート機能
のために評価することができる。典型的なモジュレーション技術は後述される。

【０２２２】 脂肪生成、グルコース新生およびグリコーゲン分解は、哺乳動物のエネルギー
収支の相互に関係する成分であり、既知の技術、例えば、ob／obマウスまたはdb
／dbマウスにより評価することができる。ob／obマウスは、ob（肥満）位置にお
ける不活性化突然変異に対してホモ結合的である同系繁殖マウスである。このよ
うなob／obマウスは過食性および代謝低下性であり、循環OBタンパク質の産生を
欠如すると考えられる。db／dbマウスはdb（糖尿病）位置における不活性化突然
変異に対してホモ結合的である同系繁殖マウスである。db／dbマウスは、また、
糖尿病の表現型を表示する以外、ob／obmuのそれに類似する表現型を表示する。
このようなdb／dbマウスは循環OBタンパク質の作用に対して耐性であると考えら
れる。また、これらのパラメーターを評価する種々のin vitro法がこの分野に
おいて知られている。

【０２２３】 インスリン刺激脂質生成は、例えば、トリグリセリド中の¹⁴C−アセテートの
取込み（Mackall他、J. Biol. Chem. 251：6462−6464、1976）またはトリグ
リセリドの蓄積（Kletzien他、Mol. Pharmacol. 41：393−398、1992）の測定
によりモニターすることができる。

【０２２４】 グルコースの吸収は、例えば、インスリン刺激グルコース輸送についてのアッ
セイにおいて評価することができる。非トランスフェクト、分化L6筋管（G418の
非存在下に維持される）を、1g／lのグルコース、0.5または1.0％のBSA、20mMの
Hepes、および2mMのグルタミンを含有するDMEMの中に入れる。2〜5時間培養した
後、培地を0.5または1.0％のBSA、20mMのHepes、および2mMのグルタミンを含有
する、新鮮な、無グルコースDMEMと置換する。適当な濃度のインスリンまたはIG
F−1、または希釈系列の被験物質を添加し、細胞を20〜30分間インキュベートす
る。

【０２２５】 ³Hまたは¹⁴C標識化デオキシグルコースを約50mMの最終濃度に添加し、細胞を
ほぼ10〜30分間インキュベートする。次いで細胞を冷緩衝液（例えば、PBS）で
急速にすぎ、適当な溶解剤（例えば、1％のSDSまたは1NのNaOH）で溶解する。次
いでシンチレーションカウンターで計数することによって、細胞ライゼートを評
価する。グルコース輸送のインヒビターであるサイトカラシンbの存在下に細胞
をインキュベートすることによって測定して、細胞に関連する放射能を非特異的
結合を減じた後のグルコース輸送の測度として採る。他の方法は、例えば、Manc
hester他、Am. J. Physiol. 266（Endocrinol. Metab. 29）：E326−E333
、1994（インスリン刺激グルコース輸送）に記載されている方法を包含する。

【０２２６】 タンパク質合成は、例えば、被験細胞と³⁵S−メチオニンとインキュベートし
た後、³⁵S−メチオニン標識化タンパク質の沈澱を³⁵S−メチオニンおよびタンパ
ク質合成の推定上のモジュレーターと比較することによって評価することができ
る。

【０２２７】 熱発生は下記の文献に記載されているようにして評価することができる：B.
Stanley、The Biology of Neutropeptide Y and Related Peptides、W.
ColmersおよびC. Wahlestedt（編者）、Humana Press、Ottawa、1993、pp.
457−509；C. Billington他、Am. J. Physiol. 260：R321、1991；N. Za
rjevski他、Endocrinology 133：1753、1993；C. Billington他、Am. J. Ph
ysiol. 266：1753、1993；Heller他、Am. J. Physiol. 252（4Pt2）：R661
−7、1987；およびHeller他、Am. J. Physiol. 245（3）：R321−8、1993。
また、代謝速度は、種々の技術により測定することができ、熱発生の間接的測度
である。

【０２２８】 酸素の利用は、Heller他、Pflugers Atch 369：55−9、1977に記載するよう
にして評価することができる。この方法は、また、視床下部温度および代謝熱産
生の分析を含んだ。酸素の利用および熱調節は、また、ヒトにおいてHaskell他
、J. Appl. Physiol. 51：948−54、1981に記載されているように評価された
。

【０２２９】 この分野において知られているか、あるいは本明細書において記載されている
他の方法の中で、哺乳動物の内皮細胞組織の保護は、内皮組織の機能をモニター
することによって評価することができる。例えば、心臓（大動脈）の機能は、ア
セチルコリンの放出、ノルエピネフリンの放出または同様なパラメーターをモニ
ターすることによって評価することができる。これらのパラメーターは、いっそ
う詳細に後述するように、この分野において知られている技術（アッセイまたは
動物モデル）によりモニターされる。

【０２３０】 アセチルコリンおよびノルエピネフリンの放出はHPLCによりモニターすること
ができる。Levy、Electrophysiology of the Sinoatrial and Atrioventri
cular Nodes、Alan T. Liss，Inc.、187−197、1998には、冠状動脈洞の流出
流中のノルエピネフリンの測定が記載されている。さらに、下記の文献に記載さ
れているように、電気的に動物の歩調を調整し、結果をモニターすることができ
る：Elsner、European Heart Journal 16（Supplement N）、52−8、1995、
およびReiffelおよびKuehnert、PACE 17（Part 1）：349−65、1994。

【０２３１】 この分野において知られているか、あるいは本明細書において記載されている
他の方法の中で、神経伝達物質の機能を脳における2−デオキシ−グルコースの
吸収をモニターすることによって評価することができる。このパラメーターはこ
の分野において知られている技術（アッセイまたは動物モデル）、例えば、オー
トラジオグラフィーによりモニターされる。有効なモニター技術は、例えば、Ki
lduff他、J. Neurosci. 10：2463−75、1990に記載されており、下記の文献に
記載されているように、関係する技術を使用して「冬眠心臓」を評価する：Gerb
er他、Circulation 94（4）：651−8、1996、およびFallavollita他、Circulat
ion 95（7）：1900−9、1997。

【０２３２】 さらに、zacrp2ポリペプチド、そのフラグメント、融合物、アゴニストまたは
アンタゴニストは、抗微生物の用途に有用である。例えば、補体成分C1qは、感
染因子、例えば、細菌およびウイルスに対する宿主の防御においてある役割を演
ずる。C1qはいくつかの特殊化された機能を示すことが知られている。例えば、C
1qは結合した抗体またはC反応性タンパク質（CRP）との相互作用を介して補体の
カスケードを誘発する。

【０２３３】 また、C1qはある種の細菌、RNAウイルス、マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌の
エンドトキシンの脂質A成分およびある種の細胞内オルガネラの膜と直接的に相
互作用する。C1qレセプターに対するC1qの結合は、食作用を促進すると考えられ
る。C1qは、また、宿主の防御系の抗体形成の面を増強するように思われる。例
えば、下記の文献を参照のこと：Johnston、Pediatr. Infect. Dis. J. 12
（11）：933−41、1993。こうして、可溶性C1q様分子は、感染因子の溶解または
食作用を促進する抗菌剤として有用であろう。

【０２３４】 zacrp2フラグメントならびにzacrp2ポリペプチドは、この分野において知られ
ている手法に従い、それらの抗微生物特性に関して評価することができる。例え
ば、下記の文献を参照のこと：Barsum他、Eur. Respir. J. 8（5）：709−14
、1995；Sandovsky−Losica他、J. Med. Vet. Mycol.（England）28（4）：2
79−87、1990；Mehentee他、J. Gen. Microbiol.（England）135（Pt. 8）：
2181−8、1989；SegalおよびSavage、Journal of Medical and Veterinary
Mycology 24：477−9、1986およびその他。

【０２３５】 所望ならば、これに関するzacrp2の性能をこれに関して機能的であることが知
られているタンパク質、例えば、プロリンに富んだタンパク質、リゾチーム、ヒ
スタチン、ラクトペルオキシダーゼまたはその他と比較することができる。さら
に、zacrp2のフラグメント、ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アン
タゴニストまたは抗体を1またはそれ以上の抗微生物因子と組み合わせて評価し
て、相乗効果を同定することができる。当業者は認識するように、zacrp2のポリ
ペプチド、フラグメント、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニストおよび
抗体の抗微生物特性を同様に評価することができる。

【０２３６】 神経伝達物質または神経伝達モジュレーターとして、本発明のzacrp2ポリペプ
チドフラグメントならびにzacrp2ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、
アンタゴニストまたは抗体は、また、カルシウムイオン濃度、筋肉収縮、ホルモ
ン分泌、DNA合成または細胞成長、リン酸イノシトールの代謝回転、アラキドン
酸塩の放出、ホスホリパーゼ−Cの活性化、胃内容排出、ヒト好中球の活性化ま
たはＡDCC能力、スーパーオキシドアニオンの産生およびその他をモジュレート
することができる。これらの性質の評価は既知の方法、例えば、本明細書におい
て記載する方法により実施することができる。

【０２３７】 細胞内カルシウムレベルに対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物
、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られて
いる方法、例えば、Dobrzanski他、Regulatory Peptides 45：341−52、1993
、およびその他に記載されている方法により評価することができる。筋肉収縮に
対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニストまたはアンタゴ
ニストの衝撃は、この分野において知られている方法、例えば、SmitsおよびLev
evre、J. Auton. Pharmcol. 14：383−92、1994、Belloli他、J. Vet. Pha
rmacol. Therap. 17：379−83、1994、Maggi他、Regulatory Peptides 53：
259−74、1994、およびその他に記載されている方法により評価することができ
る。

【０２３８】 ホルモンの分泌に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニ
ストまたはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られている方法、例え
ば、プロラクチンの放出について、Henriksen他、J. Recep. Sig. Transd.
Res. 15（1−4）：529−41、1995、およびその他に記載されている方法により
評価することができる。

【０２３９】 DNA合成または細胞成長に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物
、アゴニストまたはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られている方
法、例えば、Dobrzanski他、Regulatory Peptides 45：341−52、1993、およ
びその他に記載されている方法により評価することができる。リン酸イノシトー
ルの代謝回転に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニスト
またはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られている方法、例えば、
Dobrzanski他、Regulatory Peptides 45：341−52、1993、およびその他に記
載されている方法により評価することができる。

【０２４０】 また、アラキドン酸塩の放出に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融
合物、アゴニストまたはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られてい
る方法、例えば、Dobrzanski他、Regulatory Peptides 45：341−52、1993、
およびその他に記載されている方法により評価することができる。ホスホリパー
ゼ−Cの活性化に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニス
トまたはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られている方法、例えば
、Dobrzanski他、Regulatory Peptides 45：341−52、1993、およびその他に
記載されている方法により評価することができる。

【０２４１】 胃内容排出に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニスト
またはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られている方法、例えば、
Varga他、Eur. J. Pharmacol. 286：109−112、1995、およびその他に記載さ
れている方法により評価することができる。

【０２４２】 ヒト好中球の活性化およびADCC能力に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメン
ト、融合物、アゴニストまたはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知ら
れている方法、例えば、Wozniak他、Immunology 78：629−34、1993、およびそ
の他に記載されている方法により評価することができる。スーパーオキシドのア
ニオンの産生に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニスト
またはアンタゴニストの衝撃は、この分野において知られている方法、例えば、
Wozniak他、Immunology 78：629−34、1993、およびその他に記載されている方
法により評価することができる。

【０２４３】 コラーゲンは血小板凝集の効力のあるインデューサーである。これは血管損傷
から回復する患者に危険を付与する。コラーゲン誘導血小板凝集のインヒビター
は、コラーゲン被覆した表面に対する血小板の結合をブロックし、そして関連す
るコラーゲン誘導血小板凝集を減少するために有用であろう。C1qは補体経路の1
成分であり、防御メカニズムを刺激し、ならびに組織の損傷を引き起こすことが
ある毒性酸素種の発生を誘発することが見出された（Tenner、Behring Inst.
Mitt. 93：241−53、1993）。

【０２４４】 C1q結合性部位が血小板上に見出された。C1qは、免疫結合性相手に対して独立
して、血小板凝集を阻害するが、血小板の付着または形状変化を阻害しないこと
が見出された。C1qのアミノ末端範囲はコラーゲンとの相同性を共有する（Peers
chkeおよびGhebrehiwet、J. Immunol. 145：2984−88、1990）。C1qおよび補
体経路の阻害は、本明細書に開示するか、あるいはこの分野において知られてい
る方法、例えば、SubaおよびCsako、J. Immunol. 117：304−9、1976に記載さ
れている方法により測定することができる。

【０２４５】 コラーゲン仲介血小板の接着、活性化および凝集に対するzacrp2ポリペプチド
、フラグメント、融合物、アゴニストまたはアンタゴニストの衝撃は、本明細書
に開示するか、あるいはこの分野において知られている方法、例えば、血小板凝
集アッセイ（Chiang他、Thrombosis Res. 37：605−12、1985）および血小板
接着アッセイ（PeerschkeおよびGhebrehiwet、J. Immunol. 144：221−5、199
0）により評価することができる。

【０２４６】 コラーゲンに対する血小板の接着およびコラーゲン誘導血小板凝集の阻害につ
いてのアッセイは、下記の文献に記載されている方法により測定することができ
る：Keller他、J. Biol. Chem. 268：5450−6、1993；WaxmanおよびConnolly
、J. Biol. Chem. 268：5445−9、1993；Noeske−Jungblut他、J. Biol. C
hem. 269：5050−3、1994またはDeckmyn他、Blood 85：712−9、1995。

【０２４７】 大動脈環の血管拡張に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、ア
ゴニストまたはアンタゴニストの衝撃は、Dainty他、J. Pharmacol. 100：767
、1990およびRhee他、Neurotox. 16：179、1995の方法に従い測定することがで
きる。

【０２４８】 虚血および再灌流の損傷に対するzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合タ
ンパク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストの作用をスクリーニングする
ために、種々のin vitroおよびin vivoモデルが入手可能である。例えば、下
記の文献を参照のこと：Shandelya他、Circulation 88：2812−26、1993；Weis
man他、Science 249：146−151、1991；Buerke他、Circulation 91：393−402
、1995；Horstick他、Circulation 95：701−5、1997およびBurke他、J. Phar
. Exp. Therap. 286：429−38、1998。ex vivoハムスター血小板凝集アッセ
イは、Deckmyn他、前掲に記載されている。

【０２４９】 Deckmyn他、前掲に記載されているモデルを使用して、zacrp2ポリペプチドの
注射後、ハムスターおよびヒヒにおける出血時間を測定することができる。Deck
myn他、前掲により提供されるハムスター大腿静脈血栓モデルを使用して、本発
明のタンパク質の投与に応答した血栓の形成を測定することができる。zacrp2投
与後における流れ条件下の血小板接着の変化は、Harsfalvi他、Blood 85：705
−11、1995に記載されている方法により測定することができる。

【０２５０】 補体の阻害および創傷の治癒について、zacrp2ポリペプチド、フラグメント、
融合タンパク質、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを単独で、あるいはコ
ラーゲン誘導血小板活性化および凝集の他の既知インヒビター、例えば、パルジ
ピン、モウバチンまたはカリンと組合わせて評価することができる。 本明細書に開示するか、あるいはこの分野において知られている方法、例えば
、ブタにおける皮膚層の治癒（Lynch他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84
：7696−700、1987）および遺伝的に糖尿病のマウスにおける全厚さの皮膚の創
傷（Greenhalgh他、Am. J. Pathol. 136：1235−46、1990）を使用して、zac
rp2ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニストまたはア
ンタゴニストを評価することができる。本発明のポリペプチドを単独で、あるい
は前述した他の既知の補体インヒビターと組合わせてアッセイすることができる
。

【０２５１】 放射性ハイブリッドマッピングは、哺乳動物の染色体の高い分解能の、隣接す
る地図を構築するために開発された、幹細胞の遺伝的技術である（Cox他、Scien
ce 250：245−50、1990）。遺伝子の配列の部分的または完全な知識は、染色体
の放射性ハイブリッドマッピングパネルとともに使用するために適当なPCRプラ
イマーの設計を可能とする。全体のヒトゲノムをカバーする、放射性ハイブリッ
ドマッピングパネル、例えば、Stanford G3 PanelおよびGeneBridge 4 RH
Panel（Research Genetics,Inc. 、アラバマ州ハンツヴィレ）は商業的に入手
可能である。これらのパネルは、急速な、PCRをベースとする染色体の局在化お
よび遺伝子、配列標識化部位（STSs）、および問題の領域内の他の非多形性およ
び多形性マーカーの順序決定を可能とする。

【０２５２】 これは、問題の新しく発見された遺伝子と前にマッピングされたマーカーとの
間の、直接的に比例する物理的距離の確立を包含する。遺伝子の位置の正確な知
識は、下記の目的を包含する、多数の目的に有用である：1）配列が存在するcon
tigの一部分であるかどうかを決定し、そして追加の取り囲む遺伝的配列を種々
の形態、例えば、YAC−、BAC−またはcDNAクローンで得ること；2）同一染色体
領域に対する連鎖を示す、遺伝性疾患の可能な候補の遺伝子を準備すること；お
よび3）特定の遺伝子がどんな機能を有することができるかの決定を促進するこ
とができる、交差参照モデルの生物、例えば、マウス。

【０２５３】 7.80のLODスコアを有しかつマーカーから20cR 10000の距離においてヒト染色
体5フレームワークマーカーSHGC−57747に対するzacrp2の結合を結果は示した。
取り囲むマーカーを使用すると、統合されたLDBヒト染色体5地図上の5q34領域に
おいてzacrp2が位置決定された。本発明は、また、診断的用途に使用される試薬
を提供する。例えば、zacrp2遺伝子、zacrp2のDNAまたはRNAを含んでなるプロー
ブ、またはそのサブ配列を使用して、zacrp2遺伝子が染色体5上に存在するかど
うか、または突然変異が起こったかどうかを決定することができる。

【０２５４】 zacrp2遺伝子の遺伝子座における検出可能な染色体異常は下記のものを包含す
るが、これらに限定されない：異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制
限部位の変化および再配列。これらの異常は、上流のプロモーターおよび調節領
域を包含する、コーディング配列内、イントロン内、またはフランキング配列内
で起こることがあり、そしてコーディング配列内の物理的変更または遺伝子発現
レベルの変化として発現されることがある。

【０２５５】 一般に、これらの診断法は下記の工程からなる：（a）患者から遺伝的試料を
を採取し、（b）遺伝的試料を前述のポリヌクレオチドのプローブまたはプロモ
ーターと、ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイゼー
ションする条件下に、インキュベートして、第1反応生成物を生成し、そして（i
ii）第1反応生成物を対照反応生成物と比較する。第1反応生成物と対照反応生成
物との間の差は、患者における遺伝的異常性を示す。本発明において使用する遺
伝的試料は、ゲノムDNA、cDNA、およびRNAを包含する。

【０２５６】 ポリヌクレオチドのプローブまたはプロモーターはRNAまたはDNAであることが
でき、そして配列番号1の一部分、配列番号1の補体、またはそれらのRNA同等物
を含むであろう。これに関して適当なアッセイ法は、この分野において知られて
いる分子遺伝的技術、例えば、制限フラグメントの長さ多形性（RFLP）の分析、
PCR技術を使用する短い直列反復（STR）の分析、結合鎖反応（Barany、PCR Met
hods and Applications 1：1−15、1991）、リボヌクレアーゼ保護アッセイ
、およびこの分野において知られている他の遺伝的結合分析技術を包含する（Sa
mbrook他、前掲；Ausubel他、前掲；Marian；Chest 108：255−65、1995）。

【０２５７】 リボヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、Ausubel他、前掲参照）は、RNAプロ
ーブを患者のRNA試料に対してハイブリダイゼーションさせ、次いで反応生成物
（RNA−RNAハイブリッド）をRNアーゼに暴露することからなる。RNAのハイブリ
ダイゼーションした領域を消化から保護する。PCRアッセイにおいて、患者の遺
伝的試料を1対のポリヌクレオチドのプライマーとインキュベートし、プロモー
ターの間の領域を増幅させ、回収する。回収された生成物の大きさおよび量の変
化は患者における突然変異を示す。使用することができる他のPCRをベースとす
る技術は、一本鎖コンフォメーション多形性（SSCP）そしてである（Hayashi、P
CR Methods and Applications 1：34−8、1991）。

【０２５８】 zacrp2ポリペプチドは、哺乳動物のエネルギー収支の分析において使用するこ
とができる。血清または組織の試料の中に見出されるzacrp2ポリペプチドは、食
物を貯蔵する哺乳動物の能力を示し、いっそう高度に効率よい哺乳動物は肥満に
向かう傾向がある。さらに詳しくは、本発明は下記の工程からなるzacrp2ポリペ
プチドを検出する方法を包含する：

【０２５９】 zacrp2ポリペプチドを含有する可能性がある試料を固体の支持体に結合させた
抗体に暴露し、ここで前記抗体はzacrp2ポリペプチドのエピトープに結合し； 前記固定化された抗体−ポリペプチドを洗浄して、非結合汚染物質を除去し； 前記固定化された抗体−ポリペプチドをzacrp2ポリペプチドの第2エピトープ
に対して向けられた第2抗体に暴露し；ここで第2抗体は検出可能な標識とアソシ
エートし；そして

【０２６０】 検出可能な標識を検出する。被験試料中のzacrp2ポリペプチドの濃度は哺乳動
物のエネルギー効率を示すように思われる。この情報は哺乳動物の栄養の分析を
促進する。潜在的に、この情報はエネルギー欠乏組織の同定および／またはター
ゲッティングにおいて有用であろう。 本発明のそれ以上の面は、インスリンを研究する方法を提供する。本発明のこ
のような方法は、zacrp2ポリペプチド、そのモノクローナル抗体、アゴニストま
たはアンタゴニスト±インスリンを含んでなる培地中で脂肪細胞インキュベート
し、そして脂肪細胞のタンパク質の分泌または分化の変化を観測することからな
る。

【０２６１】 抗微生物保護因子は、直接的に作用性または間接的に作用性であることができ
る。このような因子は、膜のアソシエーションまたは孔の形成メカニズムを介し
て働き、攻撃性微生物に直接的に結合する。抗微生物因子は、また、酵素的メカ
ニズムを介して作用して、微生物保護物質または微生物の細胞壁／膜を破壊する
ことができる。微生物の増殖または作用を阻害するか、あるいは前述のいずれか
のメカニズムにより微生物の完全性を崩壊することができる、抗微生物因子は、
抗微生物活性に対して感受性である微生物による、細胞培養における汚染を防止
する方法において有用である。このような技術は、有効量の前記zacrp2ポリペプ
チドまたはそのアゴニストまたはアンタゴニストの存在下に、細胞を培養するこ
とを含む。

【０２６２】 また、zacrp2ポリペプチドまたはそのアゴニストを、外因的微生物の感染、例
えば、細菌、ウイルスまたは菌類の感染のin vitro研究において、細胞培養試
薬として使用することができる。このような成分は、また、感染のin vivo動物
モデルとして使用することができる。 本発明は、また、哺乳動物細胞の代謝を研究する方法を提供する。本発明のこ
のような方法は、研究すべき細胞、例えば、ヒト導管内皮細胞、±zacrp2ポリペ
プチド、そのモノクローナル抗体、アゴニストまたはアンタゴニストをインキュ
ベートし、そして脂肪生成、グルコース新生、グリコーゲン分解、脂質生成、グ
ルコース吸収、またはその他の変化を観測することからなる。

【０２６３】 本発明の追加の面は、二量体化またはオリゴマー化を研究する方法を提供する
。本発明のこのような方法は、zacrp2ポリペプチド、またはコラーゲン様ドメイ
ンを単独で、またはコラーゲン様ドメインを支持する他のポリペプチドを含有す
る、そのフラグメントまたは融合タンパク質をインキュベートし、そしてコラー
ゲン様ドメインの間で形成したアソシエーションを観測することからなる。この
ようなアソシエーションは、HPLC、細胞の二色性またはその他により示される。

【０２６４】 本発明のzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニ
ストまたはアンタゴニストは、接着し、活性化される血小板の数および血小板凝
集の大きさを減少することによって、哺乳動物の血管構造内の血流を促進する方
法において使用することができる。このような目的のために、zacrp2は哺乳動物
における血管の急性損傷の前、間または後に投与することができる。血管損傷は
、血管の再構築のためであることができ、このような再構築は下記のものを包含
するが、これらに限定されない：血管形成術、冠状動脈バイパス移植、微小血管
修復または血管移植片の吻口。

【０２６５】 また、外傷、卒中および動脈瘤のための血管損傷が考えられる。他の好ましい
方法において、血管損傷はプラーク破裂、血管構造の劣化、糖尿病に関連する合
併症およびアテローム性動脈硬化症のためである。冠状動脈におけるプラーク破
裂を誘導し、そして脳動脈におけるプラーク破裂は卒中を誘導する。このような
方法におけるzacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴ
ニストまたはアンタゴニストの使用は、また、免疫系に関連する血管構造の全系
統の疾患、例えば、内転移した血管内凝固（DIC）およびSIDを改善するために有
効である。さらに、補体阻害活性は、非血管構造の免疫疾患、例えば、アテロー
ム性動脈硬化症の治療に有効であろう。

【０２６６】 局在化虚血性心筋中のC1qの存在と冠状動脈閉塞および再灌流後の白血球の蓄
積との間の相関が見出された。組織損傷後の細胞成分の解放は補体の活性化を誘
発し、これにより心筋損傷の主要な原因であることがある、毒性酸素産物を生ず
る（Rossen他、Circ. Res. 62：572−84ね1998およびTenner、前掲）。補体経
路のブロッキングは、再灌流損傷から虚血性心筋を保護することが見出された（
Buerke他、J. Pharmacol. Exp. Ther. 286：429−38、1998）。補体阻害お
よびC1q結合活性を有するタンパク質は、このような目的に有用であろう。

【０２６７】 脂肪細胞補体関係タンパク質同族体、例えば、zacrp2のコラーゲンおよびC1q
結合能力は、損傷したコラーゲン組織を落ち着かせ、血小板の接着、活性化また
は凝集、および毒性酸素生成物の解放に導く炎症プロセスの活性化を防止するた
めに有効であろう。暴露された組織を補体活性、血栓活性および免疫活性化のよ
うなプロセスに対して不活性とすることによって、虚血および再灌流の損傷作用
を減少させる。特に、このような損傷は、外傷損傷虚血、腸窒息、および血流の
確立前および後に関連する損傷を包含するであろう。このようなポリペプチドは
、心肺バイパス虚血およびリセシテイション（recesitation）、心筋梗塞および
外傷後の血管痙攣、例えば、発作または経皮的経管血管形成ならびに偶発的また
は外科的に誘導された血管外傷の治療において有効であろう。

【０２６８】 さらに、このようなコラーゲンおよびC1q結合性ポリペプチドは、人工生物材
料および外科的装置を落ち着かせて、材料の表面を補体活性化、血栓活性または
免疫活性化に対して不活性とするために有効であろう。このような材料は下記の
ものを包含するが、これらに限定されない：コラーゲンまたはコラーゲンフラグ
メント被覆生物材料、ゼラチン被覆生物材料、フィブリン被覆生物材料、フィブ
ロネクチン被覆生物材料、ヘパリン被覆生物材料、コラーゲンおよびゲル被覆ス
テント、動脈移植片、合成心臓弁、人工的器官または1×10⁸より大においてzsug
37に結合する血液に暴露された人工材料の応用。このような材料の被覆はこの分
野において知られている方法を使用して実施することができる、例えば、Rubens
、米国特許第5,272,074号参照。

【０２６９】 補体およびC1qは炎症においてある役割を演ずる。補体活性化はC1qを免疫グロ
ブリンに結合することによって開始される（Johnston、Pediatr. Infect. Dis
. J. 12：933−41、1993；WardおよびGhetie、Therap. Immunol. 2：77−94
、1995）。C1qおよび補体のインヒビターは抗炎症剤として有効であろう。この
ような応用は感染を防止することができる。

【０２７０】 さらに、補体活性化およびC1qに対する免疫複合体の結合により仲介される炎
症を患う個体に、このようなインヒビターを投与することができる。C1qおよび
補体のインヒビターは、創傷修復を仲介し、障害された創傷治癒を克服すること
によって創傷治癒の進行を増強する方法において有用であろう。創傷治癒の進行
は、例えば、炎症の減少、繊維芽細胞のリクルートメント、創傷の退縮および感
染の減少のような要素を包含する。

【０２７１】 コラーゲンに結合する腫瘍細胞の能力は腫瘍の転移に寄与することがある。コ
ラーゲン結合のインヒビターは、また、腫瘍の接着性相互作用および転移拡大を
仲介するために有効である（Noeske−Jungbult他、米国特許第5,723,312号）。 さらに、zacrp2ポリペプチド、それらのフラグメント、融合物、アゴニストま
たはアンタゴニストは抗菌応用のために療法上有効であろう。例えば、補体成分
C1qは感染因子、例えば、細菌およびウイルスに対する宿主の防御においてある
役割を演ずる。C1qはいくつかの特殊化した機能を示すことが知られている。

【０２７２】 例えば、C1qは結合した抗体またはC反応性タンパク質（CRP）との相互作用を
介して補体のカスケードを誘発する。また、C1qはある種の細菌、RNAウイルス、
マイコプラズマ、尿酸結晶、細菌のエンドトキシンの脂肪A成分およびある種の
細胞内オルガネラの膜と直接的に相互作用する。C1qレセプターに対するC1qの結
合は、食作用を促進すると考えられる。また、C1qは宿主防御系の抗体形成の面
を増強ように思われる。例えば、下記の文献を参照のこと：Johnston，Pediatr.
Infect. Dis. J. 12（11）：933−41、1993。こうして、可溶性C1q様分子
は抗菌剤として感染因子の溶解または食作用を促進するために有効であろう。

【０２７３】 C1qおよびマクロファージ掃去剤レセプターの正に帯電した、細胞外、三重ら
せんの、コラーゲンドメインはリガンドの結合においてある役割を演ずることが
決定され、ポリアニオンに対して広い結合特異性を有することが示された（Acto
n他、J. Biol. Chem. 268：3530−37、1993）。リゾホスホリピッド成長因子
（リゾホスファチジン酸、LPA）および他のマイトジェンアニオンは損傷した組
織の部位に局在化し、創傷修復を促進する。LPAは血小板の活性化およびマトリ
ックスアセンブリーのアップレギュレーションを包含する、多数の生物学的作用
を発揮する。LPAｈａ他の血液凝固因子と相乗し、創傷治癒を仲介すると考えら
れる。

【０２７４】 タンパク質、例えば、C1qおよびマクロファージ掃去剤レセプターのコラーゲ
ンドメインは、酸性リン脂質、例えば、LPAに結合することが知られている。zac
rp2ポリペプチド、フラグメント、融合物、アゴニストまたはアンタゴニストと
マイトジェンアニオン、例えば、LPAとの相互作用は、この分野において知られ
ているアッセイを使用して測定することができる、、例えば、Acton他、前掲参
照。本発明のポリペプチドおよび抗体の炎症プロセスの阻害は、創傷部位におけ
る感染を予防するとき有効である。

【０２７５】 薬学的に使用するために、本発明のタンパク質は、慣用法に従い、非経口的、
経口的、経鼻的、経直腸的、局所的、経皮的投与またはその他のための薬学上許
容される担体を使用して処方することができる。本発明の好ましい態様において
、投与は脈管損傷部位にまたはその付近において実施される。一般に、医薬処方
物はzacrp2タンパク質と、薬学上許容されるビヒクル、例えば、生理食塩水、緩
衝化生理食塩水、水中の5％デキストロースまたはその他との組合わせを含むで
あろう。

【０２７６】 処方物は、さらに、1または2以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝化剤、バ
イアル表面上のタンパク質の損失を防止するためのアルブミン、およびその他を
含むことができる。処方法はこの分野においてよく知られており、そして、例え
ば、下記の文献に開示されている：The Science and Practice of Pharmac
y、Gennaro、編、Mack Publshing Company、ペンシルベニア州イーストン、第
19版、1995。治療的投与量は一般に承認された標準に従い、治療すべき症状の特
質および重症度、患者の体質、およびその他を考慮して、臨床医により決定され
る。投与量の決定は当業者のレベルの範囲内である。

【０２７７】 本明細書において使用するとき、zacrp2ポリペプチド、フラグメント、融合タ
ンパク質、アゴニストまたはアンタゴニストの「薬学的に有効量」は所望の生物
学的結果を誘導するために十分な量である。この結果は疾患の徴候、症候、また
は原因の軽減、あるいは生物学的系の任意の他の所望の変更であることができる
。例えば、zacrp2ポリペプチドの有効量は、臨床医または他の適格とされた観察
者により認められた症候の主観的軽減または客観的同定可能な改善を提供する量
である。

【０２７８】 このような有効量のzacrp2ポリペプチドは、例えば、C1qを包含する、コラー
ゲン活性化血小板活性化および補体経路の阻害、患者の脈管内の局在化血流の増
加および虚血および再灌流の損傷的作用の減少を提供するであろう。zacrp2ポリ
ペプチドの有効量は、治療すべき疾患または症候に依存して広く変化させること
ができる。投与すべきポリペプチドの量および処方物中のその濃度は、選択した
ベヒクル、投与経路、特定のポリペプチドの効力、患者の臨床的症状、処方物中
の化合物の副作用および安定性に依存する。したがって、臨床医は、問題の患者
または同様に患者を使用する臨床的経験に依存して、処方物の中に適当な濃度を
含有する適当な調製物、ならびに処方物の投与量を使用するであろう。

【０２７９】 このような量は、一部分、治療すべき特定の症状、患者の年齢、体重、および
一般的健康、および当業者にとって明らかな他の因子に依存するであろう。典型
的には、投与量は0.01〜100mg／被検体kgの範囲であろう。バルーンカテーテル
のような応用において、典型的な投与量範囲は0.05〜5mg／被検体kgであろう。
特定の化合物の投与量は、実験動物についての研究と組合わせたin vitroまた
はex vivo研究から決定することができる。in vitroまたはex vivoにおいて有
効であることが見出された化合物の濃度は動物の研究のために手引きを提供し、
ここで投与量は作用部位において同様な濃度を提供するように計算される。

【０２８０】 zacrp2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zacrp2活性を増加させ
るか、あるいは阻害する遺伝子治療において有用である。哺乳動物が突然変異し
たzacrp2遺伝子をもつか、あるいは前記遺伝子をもたない場合、zacrp2遺伝子を
哺乳動物の細胞の中に導入することができる。1つの態様において、zacrp2ポリ
ペプチドをコードする遺伝子をin vivoにおいてウイルスのベクターの中に導入
する。このようなベクターは、弱毒化または欠陥DNAウイルス、例えば、単純ヘ
ルペスウイルス（HSV）、肺炎ウイルス、EBウイルス（EBV）、アデノウイルス、
アデノ関連ウイルス（AAV）、およびその他を包含するが、これらに限定されな
い。

【０２８１】 欠陥ウイルスは、ウイルス遺伝子を完全にまたはほとんど完全に欠如し、この
ようなウイルスは好ましい。欠陥ウイルスは、細胞の中に導入された後、感染性
ではない。欠陥ウイルスのベクターを使用すると、ベクターが他の細胞を感染す
ることができるということを無視して、特定の局在化区域における細胞への投与
が可能となる。特定のベクターの例は下記のものを包含するが、これらに限定さ
れない：欠陥単純ヘルペスウイルス1（HSV1）のベクター（Kaplitt et al.、M
olec. Cell. Neurosci. 2：320−30、1991）；弱毒化アデノウイルス、例え
ば、Stratford−Perricaudet et al.、J. Clin. Invest. 90：626−30、19
92、に記載されているベクター；および欠陥アデノ関連ウイルスのベクター（Sa
mulski et al.、J. Virol. 61：3096−101、1987；Samulski et al.、J.
Virol. 63：3822−8、1989）。

【０２８２】 他の態様において、zacrp2遺伝子を、例えば、下記の文献に記載されているよ
うに、レトロウイルスのベクターの中に導入することができる：Anderson et
al.、米国特許第5,399,346号；Mann et al.、Cell 33：153、1983；Temin e
t al.、米国特許第4,650,764号；Temin et al.、米国特許第4,980,289号；Ma
rkwoitz et al.、J. Virol. 62：1120、1988；Temin et al.、米国特許第
5,124,263号；Dougherty et al.、国際特許公開No. WO95／07358号；およびK
uo et al.、Blood 82：845、1993。あるいは、ベクターはリポソームを使用
するin vivoにおけるリポフェクションにより導入することができる。

【０２８３】 合成カチオン性脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子バンクのin vi
voトランスフェクションのためのリポソームを調製する（Felgner et al.、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 84：7413−7、1987；Mackey et al.、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85：8027−31、1988）。外因的遺伝子を特定の器
官の中にin vivoにおいて導入するリポフェクションを使用すると、ある種の実
際的利点が得られる。特定の細胞に対するリポソームの分子のターゲッティング
は、1つの範囲の利益を表す。

【０２８４】 さらに詳しくは、トランスフェクションを特定の細胞に向けることは、1つの
範囲の利益を表す。例えば、特定の細胞の型にトランスフェクションを向けるこ
とは、細胞の異種性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳におい
て特に好都合である。脂質をターゲッティングの目的で他の分子に化学的にカッ
プリングさせることができる。ターゲッテッドペプチド（例えば、ホルモンまた
は神経伝達物質）、タンパク質、例えば、抗体、または非ペプチド分子をリポソ
ームの化学的にカップリングさせることができる。

【０２８５】 標的細胞を体から取出し、裸のDNAプラスミドとしてベクターを導入し、次い
で形質転換された細胞を体の中に再移植することができる。遺伝子治療のための
裸のDNAベクターを、この分野において知られている方法、例えば、トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダ
クション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈降法、遺伝子ガン
の使用またはDNAベクターのトランスポーターの使用により、所望の宿主細胞の
中に導入することができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Wu et al.、J
. Biol. Chem. 267：963−7、1992；Wu et al.、J. Biol. Chem. 263：
14621−4、1988。

【０２８６】 アンチセンスの方法を使用して、zacrp2遺伝子の転写を阻害すること、例えば
、in vivoにおいて細胞の増殖を阻害することができる。zacrp2をコードするポ
リヌクレオチド（例えば、配列番号1に記載するポリヌクレオチド）のセグメン
トに対して相補的であるポリヌクレオチドを設計して、zacrp2をコードするmRNA
に結合させ、かつこのようなmRNAの翻訳を阻害する。細胞培養において、または
被検者において、このようなアンチセンスのポリヌクレオチドを使用して、zacr
p2ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害する。

【０２８７】 zacrp2遺伝子を発現するように操作された、トランスジェニックマウス、およ
びzacrp2遺伝子機能の完全な非存在を示すマウス、「ノックアウトマウス」と呼
ぶ（Snouwaert et al.、Science、257：1083、1992）を発生させることもでき
る（Lowell et al.、Nature 366：740−42、1993）。これらのマウスを使用
して、in vivo系においてzacrp2遺伝子およびそれによりコードされるタンパク
質を研究することができる。 下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。

【０２８８】実施例1 ．組織分布 クロンテク（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）からのヒト多重組織ブ
ロット（MTN1、MTN2およびMTN3）を使用してノザンを実行して、ヒトzacrp2の組
織分布を決定するためにプロービングした。EcoRIおよびHindIII制限酵素を製造
業者のインストラクションに従い使用して制限消化により、前述のクローンから
全長のzacrp2に対応する1039bpのcDNAプローブを得た。制限フラグメントをゲル
電気泳動により単離し、製造業者のインストラクションに従いゲル抽出キット（
Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）を使用して精製した。

【０２８９】 製造業者の使用説明書に従いレジプライム（Rediprime）IIDNA標識化キット（
Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用して、プローブを放射能標識
化した。NUCTRAPプッシュカラム（Stratagene Cloning Systems、カリフォル
ニア州ラジョラ）を使用して、プローブを精製する。プレハイブリダイゼーショ
ンのためにかつノザンブロットのハイブリダイゼーション溶液として、EXPRESSH
YB（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）溶液を使用した。

【０２９０】 55℃において、1.5×10⁶cpm／mlの標識化プローブを使用して、ハイブリダイ
ゼーションを実施した。次いでブロットを2×SSCおよび0.1％のSDS中で室温にお
いて洗浄し、次いで2×SSCおよび0.1％のSDS中で65℃において洗浄し、次いで0.
1×SSCおよび0.1％のSDS中で65℃において洗浄した。ほぼ1.2kbの単一転写物が
前立腺、精巣、肝臓、心臓、胃、甲状腺、脊髄および気管において見られた。

【０２９１】 8つのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した種々の組織からのRNAを含有
するRNAマスター・ドット・ブロット（Clontech）を、また、前述したようにプ
ロービングし、ハイブリダイゼーションした。発現は低いレベルですべての組織
において見られ、心臓、大動脈、子宮、甲状腺および小腸において発現は高かっ
た。

【０２９２】実施例2 ．zacrp2の染色体割当ておよび配置 「スタンフォードG3放射線ハイブリッドマッピングパネル」（Research Gene
tics，Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ）の商業的に入手可能なバージョンを使用
して、zacrp2をヒト染色体5に対してマッピングした。スタンフォードG3RHパネ
ルは全ヒトゲノムの83の放射線ハイブリッドクローンの各々からのPCRable DNA
、＋2つの対照DNA（RMドナーおよびA3レシピエント）を含有する。公衆に利用可
能なWWWサーバー（http:／／shgc−www.stanford.edu）はマーカーの染色体局在
化を可能とする。

【０２９３】 スタンフォードG3RHパネルを使用するzacrp2のマッピングのために、20μlの
反応物を96ウェルのマイクロタイタープレート（Stratagene、カリフォルニア州
ラジョラ）中で構成し、RoboCycler勾配96サーマルサイクラー（Stratagene）に
おいて使用した。85PCR反応物の各々は、2μlの10KlenTaq PCR反応緩衝液（Clo
ntech）、1.6μlのdNTP混合物（2.5mMの各々、PERKIN−ELMER、フォスターシテ
ィー、カリフォルニア州）、1μlのセンスプライマー、ZC20,810（配列番号13）
、1μlのアンチセンスプライマー、ZC20,809（配列番号14）、2μlのRediLoad（
Research Genetics，Inc.）、0.4μlの50×Advantage KlenTaqポリメラーゼ混
合物（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）、個々のハイブリッドクローン
または対照からの25ngのDNAおよび全体積を20μlとするddH₂Oから成っていた。
反応物に等しい量の鉱油をオーバーレイし、密閉した。

【０２９４】 PCRサイクラー条件は次の通りであった：初期の1サイクルの5分の変性、94℃
；35サイクルの45秒の変性、94℃；45秒のアニーリング、62℃；および1分のAND
15秒のエクステンション、72℃。反応物を2％のアガロースゲル（Life Technol
ogies、マリイランド州ガイサースバーグ）上の電気泳動により分離した。 7.80のLODスコアを有しかつマーカーから20cR 10000の距離においてヒト染色
体5フレームワークマーカーSHGC−57747に対するzacrp2の結合を結果は示した。
取り囲むマーカーを使用すると、統合されたLDBヒト染色体5地図上の5q34領域に
おいてzacrp2が位置決定された（The Genetic Location Database、Universi
ty of Southhampton）。

【０２９５】実施例3 ．ヒトzacrp2のバキュロウイルスの発現 昆虫細胞において、C末端のGlu−Gluタグを有するヒトzacrp2ポリペプチドを
発現させるために、発現ベクター、pzacrp2ceeを調製した。 A. pzacrp2ceeの構築 プライマーZC23375（配列番号［15］）および23376（配列番号［16］）を使用
してzacrp2 cDNAを含有するプラスミドからPCR増幅により、zacrp2をコードす
る配列およびそれぞれ5'および3'末端上のBamHIおよびXbaI制限部位をコードす
るポリヌクレオチド配列を含有する887bpのフラグメントを発生させた。PCR条件
は次の通りであった：1サイクル、94℃、4分；25サイクル、94℃、45秒、50℃、
45秒、および72℃、2分；1サイクル、72℃、10分、次いで4℃のソーク。

【０２９６】 フラグメントをゲル電気泳動（1％SeaPlaque／1％NuSieve）により可視化した
。バンドを切除し、2mMのMgCl₂で0.5％のアガロースに希釈し、65℃において溶
融し、BamHI／XbaI消化バキュロウイルス発現ドナーベクター、pZBV32Lの中に結
合した。２ｌベクターはpFastBacl^TM（Life Technologies、ニューヨーク州グ
ランドアイランド）発現ベクターの修飾物であり、ここでポリヘドロンプロモー
ターが除去され、後期活性化基本的タンパク質プロモーターおよびGlu−Gluタグ
（配列番号17）のコーディング配列が置換されており、ならびに停止シグナルが
多重クローニング領域の3'末端に挿入されている）。約28ngの制限消化したzacr
p2インサートおよび約56ngの対応するベクターを16℃において一夜結合した。

【０２９７】 結合混合物をTE（10mMのTris−HCl、pH7.5および1mMのEDTA）中で3倍に希釈し
、そして4fmolの希釈した結合混合物を製造業者の指示に従い42℃の水浴中で45
秒間の熱ショックによりDH5αライブラリーエフィシャンシイコンピテント細胞
（Life Technologies）の中に形質転換した。形質転換されたDNAおよび細胞を4
50μlのSOC培地（2％のバクトトリプトン、0.5％のバクト酵母エキス、10mlの1M
NaCl、1.5mMのKCl、10mMのMgCl₂、10mMのMgSO₄および20mMのグルコース）中で
希釈し、100μg／mlのアンピシリンを含有するLBプレート上にプレートした。

【０２９８】 クローンを制限消化により分析し、1μlの陽性クローンを製造業者のインスト
ラクションに従い42℃の水浴中で45秒間の熱ショックによりDH10Bac Macエフィ
シャンシイコンピテント細胞（GIBCO−BRL、マリイランド州ガイサースバーグ）
の中に形質転換した。次いで形質転換された細胞を980μlのSOC培地（2％のバク
トトリプトン、0.5％のバクト酵母エキス、10mlの1MのNaCl、1.5mMのKCl、10mM
のMgCl₂、10mMのMgSO₄および20mMのグルコース）中で希釈し、震盪インキュベー
ター中で37℃において4時間アウトグロースさせ、50μg／mlのカナマイシン、7
μg／mlのゲンタマイシン、10μg／mlのテトラサイクリン、IPTGおよびBluo Ga
lを含有するLuria寒天プレート上にプレートした。

【０２９９】 プレートした細胞を37℃において48時間インキュベートした。色選択を使用し
て、プラスミドの中に組込まれたpzacrp2ceeエンコーディングドナーインサート
を有する細胞を同定した（「バクミド」と呼ぶ）。白色のコロニーを分析のため
に取り上げた。製造業者の指示に従いQiaVac Miniprep8系（Qiagen）を使用し
て、バクミドDNAを陽性コロニーから単離した。プライマーZC447（配列番号18）
およびZC976（配列番号19）を使用するPCRにより、バクミド中の転位可能な因子
に対するプライマーを使用してDNAを増幅することによって、コロニーを正しい
インサートについてスクリーニングした。

【０３００】 PCR反応条件は次の通りであった：35サイクル、94℃、45秒間、50℃、45秒間
、および72℃、5分間；1サイクル、72℃、10分間；次いで4℃のソーク。PCR生成
物を1％のアガロースゲル上で展開してインサートのサイズをチェックした。正
しいインサートを有するものを使用して、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodop
tera frugiperda）（Sf9）細胞をトランスフェクトした。

【０３０１】 B. トランスフェクション Sf9細胞を5×10⁶細胞／35mmプレートで播種し、27℃において1時間結合させた
。5μlのバクミドDNAを100μlのSf−900 II SFM（Life Technologies）で希
釈した。6μlのCellFECTIN試薬（Life Technologies）を100μlのSf−900 II
SFMで希釈した。バクミドDNAおよび脂質溶液をおだやかに混合し、室温におい
て30〜45分間インキュベートした。細胞の1つのプレートからの培地を吸引し、
細胞を2mlの新鮮なSf−900 II SFM培地で1回洗浄した。800μlのSf−900 II
SFMを脂質−DNA混合物に添加した。洗浄培地を吸引し、DNA−脂質混合物を細
胞に添加した。細胞を27℃において4〜5時間インキュベートした。DNA−脂質混
合物を吸引し、2mlのSf−900 II SFMを各プレートに添加した。プレートを27
℃、90％の湿度において96時間インキュベートし、次いでウイルスを収集した。

【０３０２】 C. 一次増幅 Sf9細胞を125mlの震盪フラスコ内で50mlのSf−900 II SFM中で、0.41〜0.52
×10⁵細胞／mlの概算密度に成長させた。次いでそれらを150μlの前述からのウ
イルスストックで感染させ、27℃において3日間インキュベートし、次いでこの
分野において知られている標準方法に従いウイルスを収集した。

【０３０３】実施例4 ．Glu−Gluタッグドzacrp2ポリペプチドを発現したバキュロウイルスの 精製 特記しない限り、すべての操作は4℃において実施した。C末端のGlu−Glu（EE
）タッグドzacrp2バキュロウイルス感染Sf9細胞からのコンディショニングした
培地の2リットルの試料に、プロテアーゼインヒビターの混合物を2.5mMのエチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA、Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントルイス）、
0.001mMのロイペプチン（Boehringer−Mannheim、インジアナ州インジアナポリ
ス）、0.001mMのペプスタチン（Boehringer−Mannheim）および0.4mMのPefabloc
（Boehringer−Mannheim）の最終濃度に添加した。

【０３０４】 Beckman Avanti J25I遠心機（Beckman Instruments）のBeckman JLA−10.
5回転器（Beckman Instruments）中で、試料を10,000rpm、4℃において30分間
遠心して細胞破片を除去した。後述するように調製した抗EEセファローズの50.0
mlの試料を上清画分に添加し、この混合物をWheaton（Millville、ニュージャー
ジイ州）ローラー培養装置上で4℃において18.0時間おだやかに撹拌した。

【０３０５】 この混合物を5.0×20.0cmのEconoカラム（Bio−Rad Laboratories）の中に注
ぎ、ゲルを30カラム体積のリン酸塩緩衝液（PBS）で洗浄した。保持されない貫
流画分を廃棄した。いったん280nMにおける流出液の吸収が0.05より低くなった
とき、カラムを通る流れはゼロに減少し、抗EEセファローズゲルを2.0カラム体
積の0.2mg／mlのEEペプチド（AnaSpec、カリフォルニア州サンジョーズ）を含有
するPBSで洗浄した。使用したペプチドは配列Glu−Tyr−Met−Pro−Val−Asp（
配列番号20）を有する。4℃において1.0時間後、流れを回復させ、溶出したタン
パク質を収集した。この画分をペプチド溶出液と呼んだ。抗EEセファローズゲル
を2.0カラム体積の0.1Mのグリシン、pH2.5で洗浄し、グリシン洗浄液を別々に収
集した。グリシン溶出画分のpHを小さい体積の10×PBSの添加により隣接し、4℃
において貯蔵した。

【０３０６】 製造業者の使用説明書に従い5,000の分子量カットオフの膜濃厚装置（Millipo
re）を使用して、ペプチド溶出液を5.0mlに濃縮した。BioCad Sprint HPLC（P
erSeptive BioSystems）を使用してPBS中の平衡化した1.5×50cmのSephadex G
−50（Pharmacia）カラム上にクロマトグラフィーにより1.0ml／分の流速で、濃
縮したペプチド溶出液を遊離ペプチドから分離した。2mlの画分を収集し、280nM
における吸収をモニターした。280nMにおいて吸収しかつカラムのボイド体積付
近で溶出する物質の第1ピークを収集した。

【０３０７】 この物質は精製されたpzacrp2CEEを表した。これらのバンドは約等モル量で存
在した。両方のバンドは、精製した物質のウェスタンブロッティングにより、抗
EE抗体との交差反応性を示した。精製したタンパク質のタンパク質濃度（0.254m
g／ml）をBCA分析（Pierce）により測定し、この物質のアリコートを採り、−80
℃において貯蔵した。

【０３０８】抗EEセファローズの調製 500mlのNalgene 0.45ミクロンのフィルターユニットを使用して、0.02％のア
ジ化ナトリウムを含有する100mlのPBSで100mlのベッド体積のタンパク質G−セフ
ァローズ（Pharmacia）を3回洗浄した。ゲルを6.0体積の200mMのトリエタノール
アミン、pH8.2（TEA、Sigma）で洗浄し、900mgの抗体を含有する等しい体積のEE
抗体溶液を添加した。4℃において一夜インキュベートした後、樹脂を5体積の20
0mMのTEAで前述したように洗浄することによって非結合抗体を除去した。

【０３０９】 樹脂を2体積のTEAの中に再懸濁し、適当な容器に移し、TEA中に溶解したジメ
チルピミリミデート−2HCl（Pierce）を36mg／mlのゲルの最終濃度に添加した。
ゲルを室温において45分間ロックし、脂質を前述したようにフィルターユニット
により除去した。次いで室温において5体積の200mMのTEA中の20mMのエタノール
アミンと10分間インキュベートすることによって、ゲル上の非特異的部位をブロ
ックした。次いでゲルを5体積の0.02％のアジ化ナトリウムを含有するPBSで洗浄
し、この溶液中で4℃において貯蔵した。

【０３１０】実施例5 ．接着分子のアッセイ 炎症性サイトカイン、例えば、TFN（腫瘍壊死因子）で刺激すると、ヒト微小
血管骨髄細胞（TRBMEC）は、E−セレクチン（内皮白血球接着分子）、V−CAM（
血管細胞接着分子）、およびI−CAM（細胞内接着分子）を包含する、細胞の接着
分子を発現する。

【０３１１】 Ouchi他、（Circulation 100：2473−7、1999）に従う細胞ELISAにおいて微
小血管骨髄細胞（TRBMEC）を使用して、細胞表面の接着分子の発現に対するzacr
p2の作用を測定した。簡単に述べると、TRBMEC細胞を96ウェルの平底プレート（
Costar、カリフォルニア州プレザントン）中でコンフルエントまで成長させた。
製造業者のインストラクションに従う試験（Centricon Centrifugal Filterat
ion Unit 5,000Kカットオフ、Millipore Corp．、マサチュセッツ州ベッドフ
ォード）前に、野生型対照培地およびバキュロウイルス発現zacrp2培地の両方は
10×であった。各ウェルに、90μlのzacrp2を含有する培地または対照培地を添
加し、プレートを37℃、5％CO₂において一夜インキュベートした。次の日に、試
料の半分に10μlのTNFα（10ng／ml、R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス）
を添加し、他方の試料は未処理であり、基底発現を測定した。プレートを37℃、
5％CO₂において4時間インキュベートした。

【０３１２】 インキュベーション後、測定をプレートから除去し、次いで50μlの抗ヒトVCA
M抗体（1mg／mlのストックの1：1000希釈物、R&D Systems）、50μlの抗ヒトIC
AM−1モノクローナル抗体（1mg／mlのストックの1：1000希釈物、R&D Systems
）、または50μlの抗ヒトE−セレクチン抗体（1mg／mlのストックの1：1000希釈
物、R&D Systems）をトリプリケートのｗｌｅに添加し、プレートを37℃、5％C
O₂において1時間インキュベートした。

【０３１３】 抗体溶液を除去し、プレートを温かいRPMI＋5％FBS中で3回洗浄した。最後の
洗浄後、100μl／ウェルの0.05％のグルタルアルデヒド溶液（PBS中の50％のグ
ルタルアルデヒドの1：1000）をウェルに添加し、プレートを室温において10分
間インキュベートした。プレートをPBSで3回洗浄し、50μl／ウェルの二次抗体
（ヤギα−マウスIgG全軽鎖HRP接合体（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セン
トルイス）の1：1000希釈物）をすべてのウェルに添加した。プレートを37℃に
おいて1時間インキュベートした。

【０３１４】 次いでプレートを洗浄緩衝液（PBS＋0.05％のTween 20）で5回洗浄し、100μ
l／ウェルのTMB溶液（100μlのDMSO中の4mg／mlのテトラメチルベンジジン（Sig
ma）、10mlの60mMの酢酸ナトリウムpH5.0および100μlの1.2％のH₂O₂）を各ウェ
ルに添加した。プレートを室温において15〜20分間現像し、次いで100μl／ウェ
ルの1MのH₂SO₄の添加により反応をクエンチした。プレートを450nmにおいて655n
mの参照波長で読んだ。

【０３１５】 zacrp2はICAM−1発現に対して作用を示さなかった。zacrp2は事実VCAM−1発現
に対して作用を有した。最大のTNF応答と比較すると、zacrp2処理した細胞は約5
0％の阻害を示した。また、zacrp2はE−セレクチンの発現に対してある作用、す
なわち、少ない、約10％の阻害を示した。 TRBMEC細胞の直接的アデノウイルス感染後に、VCAM−1発現を測定した。簡単
に述べると、zacrp2を含有するアデノウイルスまたは親アデノウイルス株でTRBM
EC細胞を直接的に感染させた。ウイルスを種々の感染多重度（moi 500、1,000
および5,000）で添加した。細胞を37℃、5％CO₂において43時間インキュベート
した。感染後、アデノウイルス感染細胞をTNFα（1ng／ml）で4時間チャレンジ
した。VCAM発現を前述したように測定した。VCAM−1発現は投与量依存的であり
、5000の感染多重度において最大阻害は20％であった。 Ouchi他、（前掲）およびCybulskyおよびGimbrone、（Science 251：788−91
、1991）に従うTHP−1単球接着アッセイは、上記VCAM−1について見られたのと
同一の結果を示した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明のzacrp2ポリペプチドおよびヒトACRP30（ACR3）（配列番号3
、Maeda他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 221：286−9、1996）および
ヒトC1q C（配列番号4、Sellar他、Biochem. J. 274：481−90、1991およびR
eid、Biochem. J. 179：361−71、1979）の多重整列を図解する。デフォルト
設定を有するClustalx多重整列ツールを使用して、多重整列を実行した：ブロサ
ムエクステンションマトリックス、ギャップオープニングペナルティー：10.0、
ギャップエクステンションペナルティー：0.05。同一性百分率を計算する前に、
多重整列をさらに手で同調させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 31/04 ４Ｈ０４５ 29/00 31/12 31/04 43/00 １０７ 31/12 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０７ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｎ 21/08 45/00 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 45/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ビショップ，ポール ディー． アメリカ合衆国，ワシントン 98024，フ ォール シティ，サウスイースト エイス ストリート 28425 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA43 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 4C084 AA01 AA06 AA07 AA16 ZA38 ZA44 ZA45 ZA89 ZB11 ZB33 ZB35 4C085 AA13 AA14 BB11 CC03 CC05 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA76 DA86 EA22 FA74

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号2の残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ酸
   配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなり、この配列は、 コラーゲンドメインを形成するGly−Xaa−XaaまたはGly−Xaa−Pro反復、ここ
   でXaaは任意のアミノ酸である、および 10ベータ鎖を含んでなるカルボキシル末端のC1qドメイン、 を含んでなることを特徴とする、単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 配列番号2の残基16〜285に対して少なくとも90％のアミノ酸
   配列の同一性を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記コラーゲンドメインが24のGly−Xaa−Xaa反復と10のGly
   −Xaa−Pro反復とを含んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが配列番号5の配列を含
   んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
5. 【請求項５】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが配列番号2のアミノ酸
   残基151〜155、172〜174、180〜183、187〜190、193〜205、208〜214、220〜227
   、229〜241、246〜251および269〜274を含んでなる、請求項１に記載の単離され
   たポリペプチド。
6. 【請求項６】 前記ポリペプチドと配列番号2との間の差が保存的アミノ酸
   置換のためである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
7. 【請求項７】 配列番号2のアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異的に
   結合する抗体に前記ポリペプチドが特異的に結合する、請求項１に記載の単離さ
   れたポリペプチド。
8. 【請求項８】 前記コラーゲンドメインが配列番号2のアミノ酸残基41〜141
   を含んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
9. 【請求項９】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが配列番号2のアミノ酸
   残基142〜285を含んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸残基16〜285を含
    んでなる、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
11. 【請求項１１】 親和標識、トキシン、ラジオヌクレオチド、酵素および蛍
    光体から成る群から選択される部分にアミノ末端またはカルボキシル末端におい
    て共有結合された、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
12. 【請求項１２】 a） 配列番号2のアミノ酸残基40〜アミノ酸残基141に対
    して少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成
    るポリペプチド； b） 配列番号2のアミノ酸残基142〜アミノ酸残基285に対して少なくとも75％
    のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド；お
    よび c） 配列番号2のアミノ酸残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ酸配
    列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポリペプチド； から成る群から選択される単離されたポリペプチド。
13. 【請求項１３】 ペプチド結合により結合された第1部分と第2部分とを含ん
    でなる融合タンパク質において、前記第1部分が、 a） 配列番号2のアミノ酸残基16〜アミノ酸残基285に対して少なくとも75％
    のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド
    ； b） 配列番号2に示すアミノ酸残基1〜アミノ酸残基281のアミノ酸残基の配列
    を含んでなるポリペプチド； c） 配列番号2に示すアミノ酸残基16〜アミノ酸残基285のアミノ酸残基の配
    列を含んでなるポリペプチド； d） コラーゲン様ドメインまたは二量化もしくはオリゴマー化することがで
    きるコラーゲン様ドメインの部分を含んでなる、配列番号2に示すzacrp2ポリペ
    プチドの部分； e） C1qドメインまたはC1qドメインの活性部分を含んでなる、配列番号2に示
    すzacrp2ポリペプチドの部分；または f） コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを含んでなる、配列番号2に示
    すzacrp2ポリペプチドの部分； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして 前記第2部分は他のポリペプチドを含んでなる； 融合タンパク質。
14. 【請求項１４】 前記第1部分が、 a） 配列番号2のアミノ酸残基40〜アミノ酸残基141の配列から成るポリペプ
    チド； b） 配列番号2のアミノ酸残基142〜アミノ酸残基285の配列から成るポリペプ
    チド；および c） 配列番号2のアミノ酸残基40〜アミノ酸残基285の配列から成るポリペプ
    チド； から成る群から選択される、請求項13に記載の融合タンパク質。
15. 【請求項１５】 前記第2部分がACRPファミリーのタンパク質のコラーゲン
    またはC1qドメインを含んでなる、請求項１３に記載の融合タンパク質。
16. 【請求項１６】 薬学上許容されるビヒクルと組み合わせた、請求項１に記
    載の単離されたポリペプチド。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結合
    する抗体または抗体フラグメント。
18. 【請求項１８】 前記抗体が、 a） ポリクローナル抗体； b） ネズミモノクローナル抗体； c） 上記b）に由来するヒト型化抗体；および d） ヒトモノクローナル抗体； から成る群から選択される、請求項17に記載の抗体。
19. 【請求項１９】 前記抗体フラグメントがF（ab'）、F（ab）、Fab'、Fab、
    Fv、scFv、および最小認識単位から成る群から選択される、請求項１７に記載の
    抗体フラグメント。
20. 【請求項２０】 請求項１７に記載の前記抗体に特異的に結合する抗イディ
    オタイプ抗体。
21. 【請求項２１】 配列番号2の残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ
    酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチドをコード
    し、前記配列が、 コラーゲンドメインを形成するGly−Xaa−XaaまたはGly−Xaa−Pro反復、ここ
    でXaaは任意のアミノ酸である、および 10のベータ鎖を含んでなるカルボキシル末端のC1qドメイン、 を含んでなることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
22. 【請求項２２】 前記ポリペプチドが配列番号2の残基16〜285に対して少な
    くとも90％のアミノ酸配列の同一性を有する、請求項２１に記載の単離されたポ
    リヌクレオチド。
23. 【請求項２３】 前記コラーゲンドメインが、24のGly−Xaa−Xaa反復と10
    のGly−Xaa−Pro反復とを含んでなる、請求項２１に記載の単離されたポリペプ
    チド。
24. 【請求項２４】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが、配列番号5の配列
    を含んでなる、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
25. 【請求項２５】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが、配列番号2のアミ
    ノ酸残基151〜155、172〜174、180〜183、187〜190、193〜205、208〜214、220
    〜227、229〜241、246〜251および269〜274を含んでなる、請求項２１に記載の
    単離されたポリペプチド。
26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドと配列番号2との間の差が保存的アミノ
    酸置換のためである、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
27. 【請求項２７】 配列番号2のアミノ酸配列から成るポリペプチドに特異的
    に結合する抗体に前記ポリペプチドが特異的に結合する、請求項２１に記載の単
    離されたポリペプチド。
28. 【請求項２８】 前記コラーゲンドメインが配列番号2のアミノ酸残基41〜1
    41から成る、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
29. 【請求項２９】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが配列番号2のアミノ
    酸残基142〜285から成る、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
30. 【請求項３０】 前記ポリペプチドが配列番号2のアミノ酸残基16〜285を含
    んでなる、請求項２１に記載の単離されたポリペプチド。
31. 【請求項３１】 a） 配列番号1のヌクレオチド1〜ヌクレオチド1161のヌ
    クレオチド配列； b） 配列番号1のヌクレオチド133〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； c） 配列番号1のヌクレオチド178〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； d） 配列番号1のヌクレオチド250〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； e） 配列番号1のヌクレオチド556〜ヌクレオチド987のヌクレオチド配列； f） 配列番号1のヌクレオチド133〜ヌクレオチド555のヌクレオチド配列； g） 配列番号1のヌクレオチド178〜ヌクレオチド555のヌクレオチド配列； h） 配列番号1のヌクレオチド250〜ヌクレオチド555のヌクレオチド配列； i） 配列番号2の残基40〜141のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して
    少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド； j） 配列番号2の残基142〜285のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して
    少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド； k） 配列番号2の残基40〜285のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して
    少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド； l） 配列番号2の残基16〜141のアミノ酸配列から成るポリペプチドに対して
    少なくとも75％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸残基の配列から成るポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチド； m） ストリンジェント洗浄条件に従い配列番号1のヌクレオチド配列、または
    配列番号1の相補体から成るポリヌクレオチドに対してハイブリダイズして保持
    されるポリヌクレオチド； n） 上記a）、b）、c）、d）、e）、f）、g）、h）、i）、j）、k）、l）ま
    たはm）に対して相補的なヌクレオチド配列；並びに o） 上記i）、j）、k）またはl）の縮重ヌクレオチド配列； から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド。
32. 【請求項３２】 ペプチド結合により結合された第1部分と第2部分とを含ん
    でなる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記
    第1部分が、 a） 配列番号2のアミノ酸残基40〜285に対して少なくとも75％のアミノ酸配
    列の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んでなるポリペプチド； b） 配列番号2のアミノ酸残基1〜285のアミノ酸残基の配列を含んでなるポリ
    ペプチド； c） 配列番号2のアミノ酸残基16〜285のアミノ酸残基の配列を含んでなるポ
    リペプチド； d） コラーゲン様ドメインまたは二量化もしくはオリゴマー化することはで
    きるコラーゲン様ドメインの部分を含んでなる、配列番号2のポリペプチドの部
    分； e） C1qドメインを含有する、配列番号2のポリペプチドの部分；または f） コラーゲン様ドメインおよびC1qドメインを含んでなる、配列番号2のポ
    リペプチドの部分； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして 前記第2部分は他のポリペプチドを含んでなる、 ことを特徴とする融合タンパク質。
33. 【請求項３３】 配列番号10のヌクレオチド1〜ヌクレオチド855から成る単
    離されたポリヌクレオチド。
34. 【請求項３４】 作用可能に連鎖された下記の因子： 転写プロモーター； 請求項１に記載のポリペプチドをコードするDNAセグメント；および 転写ターミネーター； を含んでなる発現ベクター。
35. 【請求項３５】 前記DNAセグメントが配列番号2の残基16〜285に対して少
    なくとも90％のアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求
    項３４に記載の発現ベクター。
36. 【請求項３６】 前記コラーゲンドメインが24のGly−Xaa反復−Xaaと10のG
    ly−Xaa−Pro反復とを含んでなる、請求項３４に記載の発現ベクター。
37. 【請求項３７】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが、配列番号5の配列
    を含んでなる、請求項３４に記載の発現ベクター。
38. 【請求項３８】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが、配列番号2のアミ
    ノ酸残基151〜155、172〜174、180〜183、187〜190、193〜205、208〜214、220
    〜227、229〜241、246〜251および269〜274を含んでなる、請求項３４に記載の
    発現ベクター。
39. 【請求項３９】 前記ポリペプチドと配列番号2との間の差が保存的アミノ
    酸置換のためである、請求項３４に記載の発現ベクター。
40. 【請求項４０】 前記ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列から成る
    ポリペプチドに特異的に結合する抗体に特異的に結合する、請求項３４に記載の
    発現ベクター。
41. 【請求項４１】 前記コラーゲンドメインが、配列番号2のアミノ酸残基41
    〜141から成る、請求項３４に記載の発現ベクター。
42. 【請求項４２】 前記カルボキシル末端のC1qドメインが、配列番号2のアミ
    ノ酸残基142〜285から成る、請求項３４に記載の発現ベクター。
43. 【請求項４３】 前記DNAセグメントが、配列番号2のアミノ酸残基16〜285
    を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項３４に記載の発現ベクター。
44. 【請求項４４】 前記DNAセグメントが、アミノ末端またはカルボキシル末
    端において親和標識に共有結合されたポリペプチドをコードする、請求項３４に
    記載の発現ベクター。
45. 【請求項４５】 前記DNAセグメントが、前記ポリペプチドに作用可能に連
    鎖された分泌シグナル配列をさらにコードする、請求項３４に記載の発現ベクタ
    ー。
46. 【請求項４６】 前記分泌シグナル配列が配列番号2の残基1〜15を含んでな
    る、請求項３４に記載の発現ベクター。
47. 【請求項４７】 請求項３４に記載の発現ベクターが導入されており、前記
    DNAセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現する培養された細胞
    。
48. 【請求項４８】 請求項３４に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養
    し； これにより前記細胞は前記DNAセグメントによりコードされる前記ポリペプチ
    ドを発現し；そして 前記発現されたポリペプチドを回収する； を含んでなるポリペプチドを製造する方法。