JP2004524825A - 脂肪細胞補体関連タンパク質ｚａｃｒｐ３ｘ２ - Google Patents

Abstract

新規ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法が開示される。ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントもまた開示される。

Description

【０００１】
発明の背景：
細胞−細胞及び細胞−細胞外マトリックス相互作用は、多細胞生物の種々の細胞間での情報の交換、及びそれらの細胞間での協調を可能にし、そしてほとんどの生物学的工程のための基礎である。それらの相互作用は、受精から死まであらゆることにおいて役割を演じる。そのような相互作用は、成長及び分化の間、必須であり、そして生物の機能及び保護のために決定的である。例えば、細胞とその環境との間の相互作用は、組織再造形を開始し、そして介入するために必要である。それらの再造形は、多くの因子、例えば物理的損傷、細胞毒性損傷、代謝ストレス又は成長刺激に応答して開始され得る。病理学と治療（又は代謝最適化）との間の調整は、細胞マトリックス及び局部溶媒と刺激された細胞との間の相互作用により一部、行われ得る。
【０００２】
脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーは、細胞とそれらの環境との相互作用において役割を演じ、そして細胞外マトリックス及び細胞の界面で作用すると思われる。それらのタンパク質は、Ａｃｒｐ３０（Ｓｃｈｅｒｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２６７４６−４９， １９９５）、ａｐＭ１ （Ｍｅａｄａなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２２１： ２８６−９， １９９６）， ＧＢＰ２８ （Ｎａｋａｎｏなど．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２０： ８０３−１２， １９９６）， ｚｓｉｇ３９ （Ｓｈｅｐｐａｒｄ ａｎｄ Ｈｕｍｅｓ， ＷＩＰＯ 公開特許番号：ＷＯ９９／１０４９２号）、ｚｓｉｇ３７ （Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ＷＩＰＯ公開）特許番号ＷＯ９９／０４０００号）、ＺＣＲＰ３０Ｒ１（Ｓｍｉｔｈなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号ＷＯ９９／５６６１９号）、ＡＣＲＰ３０Ｒ１Ｌ（Ｈｅｎｓｌｅｙなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号ＷＯ９９／５９６１８号）、ＡＣＲＰ３０Ｒ２（Ｈｅｎｓｌｅｙなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号９９／６４６２９号）、ＰＲＯ３５３及びＰＲＯ３４４（Ｗｏｏｄなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号ＷＯ９９／２８４６２号）、ｚａｃｒｐ２ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／６３３７６号）、ｚａｃｒｐ３ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／６３３７７号）、ｚａｃｒｐ４ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ０１／１２５６５号）、ｚａｃｒｐ５ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／７３４４４号）、ｚａｃｒｐ６ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／７３４６６号）、ｚａｃｒｐ１１ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／＊＊＊＊）、及びｚａｃｒｐ１２ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／＊＊＊＊） を包含する。
【０００３】
それらのタンパク質はすべて、完全Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｒｏ及び不完全Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａコラーゲン反復体を含んで成るコラーゲン−様ドメイン、及びＣ１ｑドメインを共有する。補体因子Ｃ１ｑは、３種の関連するポリペプチド（Ａ、Ｂ及びＣ鎖）の６個のコピーから成り、そして個々のポリペプチドは、近くのアミノ末端コラーゲンドメイン及びカルボキシ末端球状領域を有する、約２２５個の長さのアミノ酸である。６種の３ヘリカル領域は、中心領域及び６個の軸を形成する、６個のＡ鎖、６個のＢ鎖の及び６個のＣ鎖のコラーゲンドメインにより形成される。
【０００４】
球状の頭部部分は、Ａ，Ｂ及びＣ鎖の球状カルボキシ末端ドメインの会合により形成される。Ｃ１ｑは、中心細繊維領域に対して、６個のコラーゲン−株軸を通して結合される６個の球状頭部から構成される。Ｓｅｌｌａｒなど．， Ｂｉｃｈｅｍ． Ｊ． ２７４： ４８１−９０， １９９１。この形状は、“花束（ｂｏｕｑｕｅｔ ｏｆ ｆｌｏｗｅｒｓ）”として、しばしば言及される。Ａｃｒｐ３０は、１つの型のポリペプチド鎖から形成される類似する花束構造を有する。ＡＣＲＰ３０のＣ１ｑ球状ドメインは、１０β鎖“ジェリーロール”を有することが決定されている（Ｓｈａｐｉｒｏ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ８： ３３５−８， １９９８）。その構造要素、例えば折りたたみトポロジー、保存された残基及び類似するトリマー界面、及びイントロン位置は、腫瘍壊死因子と相同であり、このことは、ＴＮＦとＣ１ｑファミリーとの間での結合を示す。
【０００５】
さらに、血管への損傷は、その損傷を修復し、そして血管からの血液の放出を制御するために一連の現象を推進する。この工程は、止血として知られている。血小板は、血管損傷を一時的に修復するために血栓又は栓を形成することによって止血において初期役割を演じる。血小板は通常、血管壁を被覆する内皮とは相互作用しないが、しかし偶然の事故を通しての又は手術工程に間、血管への損傷が、内皮細胞を破壊する。損傷の程度に依存して、種々の内皮下層要素、例えばコラーゲン、弾性板又は結合される筋原線維コラーゲンを有する平滑筋が流動血液に暴露されるであろう。
【０００６】
内皮下層が血管損傷に従って暴露される場合、局部血液流において移動する血小板は、コラーゲンを含む暴露された内皮下層マトリックスと相互作用し、そして減速される。血小板表面上の受容体と暴露されるコラーゲン層との間のさらなる相互作用が、血小板結合及び活性化を誘発し、局部血流の阻止をもたらす。結合された血小板は、活性化され、そしてフィブリノーゲン−血小板間橋の形成を通して、通過する血流における血小板との凝集体を形成する（Ｍｏｒｉｏ ａｎｄ Ｊｕｎｇ， Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ ３： ７１９−２８， １９９８； Ｂａｒｎｅｓなど．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ＸＩ， Ｊａｃｏｔｏｔ など．， ｅｄｓ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｐｐ．２９９−３０６， １９９８及びＢａｒｎｅｓなど．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ５： ３１４−２０， １９９８）。
【０００７】
止血応答は、徐々に変化し、そして血管への損傷の程度、暴露される特定の血管構成成分、及び損傷された領域における血流状態に依存する（Ｒａｎｄなど．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７８： ４４５−５０， １９９７）。例えば軽い血管損傷の間の内皮下層マトリックス（タイプＶＩコラーゲン及びｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の暴露は、遅い血流状態を有する領域において低い程度の付着及び凝集を促進する。高い程度の血管外傷をもたらす損傷及び追加の血管構成成分、例えば内部弾性板及びエラスチン結合された筋原線維の暴露は、より強い血小板凝集体の形成を刺激するであろう。筋原線維コラーゲンを暴露する重度の血管外傷は、血液の過度の損失から犠牲者を保護する血栓血小板応答を刺激する（Ｒａｎｄｎａｄｏ．， 前記）。
【０００８】
補体因子Ｃｌｑは、３種の関連するポリペプチド（Ａ， Ｂ及びＣ鎖）の６個のコピーから成り、そして個々のポリペプチドは、類似アミノ−末端コラーゲンドメイン及びカルボキシ−末端球状ドメインを有する約２２５個の長さのアミノ酸である。６個の三本鎖ヘリックス領域は、中心領域及び６個の柄を形成する、６個のＡ， ６個のＢ及び６個のＣ鎖のコラーゲンドメインにより形成される。球状ヘッド部分は、Ａ， Ｂ及びＣ鎖の球状カルボキシ末端ドメインの会合により形成される。従って、Ｃｌｑは、６個のコラーゲン様柄を通して、中心細繊維領域に結合される６個の球状ヘッドから構成される。Ｓｅｌｌａｒなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７４： ４８１−９０， １９９１を参照のこと。この配置はしばしば、花のブーケとして言及される。ａｃｒｐ３０は単一型のポリペプチド鎖から形成される類似するブーケット構造を有する。
【０００９】
Ｃｌｑは、防御機構を刺激し、そして組織損傷を引き起こすことができる毒性酵素種の生成を誘発する（Ｔｅｎｎｅｒ， Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９３： ２４１−５３， １９９３）。Ｃｌｑ結合部位は、血小板上に見出される。さらに、補体及びＣｌｑは、炎症において役割を演じる。補体活性化は、免疫グルブリンへのＣｌｑの結合により開始される。
【００１０】
細胞相互作用において役割を演じるタンパク質、例えば転写因子及びホルモンは、有用な診断及び治療剤である。特定の相互作用、例えば再造形を介在するタンパク質は、特に有用である。さらに、止血のインヒビターは、血管損傷に続いて血流を早め、そしてコラーゲン性表面を静めるために有用である。インヒビター及び補体経路のＣ１ｑは、抗−炎症用途、補体活性化の阻害及び血栓活性のために有用である。
本発明は、当業者に明らかであるそれらの及び他の使用のためのそのようなポリペプチドを提供する。
【００１１】
発明の記載：
本発明は、“ｚａｃｒｐ３ｘ２”と称する新規の脂肪細胞補体関連タンパク質を提供する。本発明はまた、“ｚａｃｒｐ３ｘ２”変異体ポリペプチド及び“ｚａｃｒｐ３ｘ２”融合タンパク質、及びそのようなポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子、並びに、それらのポリペプチド及びタンパク質をコードする核酸分子、及びそれらの核酸分子及びアミノ酸配列の使用方法を提供する。
【００１２】
１つの観点においては、本発明は、配列番号２を含んで成る単離されたポリペプチドを提供する。１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリペプチドは、親和性標識、毒素、放射性核種、酵素及びフルオロフォアーから成る群から選択された成分に、アミノ又はカルボキシル末端で共有結合される。もう１つの態様においては、上記に開示される単離されたポリペプチドは、医薬的に許容できるビークルと組合される。
【００１３】
第２の観点においては、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３−１８６から成るポリペプチド；及び（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２３−３１９から選択されたポリペプチドから成る第１部分、及びペプチド結合により結合される、もう１つのポリペプチドを含んで成る第２部分を含んで成る融合タンパク質を提供する。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるようなポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを提供する。１つの態様においては、前記抗体は、（ａ）ポリクローナル抗体；（ｂ）ネズミモノクローナル抗体；（ｃ）上記（ｂ）由来のヒト型化抗体；（ｄ）抗体フラグメント；及び（ｅ）ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択される。１つの態様においては、前記抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）， Ｆ（ａｂ）， Ｆａｂ’， Ｆａｂ， Ｆｖ， ｓｃＦｖ及び最小の認識単位から成る群から選択される。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような抗体に対して特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、ａ）配列番号１の核酸分子；及びｂ）配列番号７の核酸分子から成る群から選択された、単離された核酸分子を提供する。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３−１８６から成るポリペプチド；及びｂ）配列番号２のアミノ酸残基２３−３１９から成るポリペプチドから成る群から選択された第１部分、及びペプチド結合により結合される、もう１つのポリペプチドを含んで成る第２部分を含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；上記に開示されるようなポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供する。
【００１７】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示される発現ベクターが導入されている、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞を提供する。
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターが導入されている細胞を培養し；それにより前記細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現し；そして前記発現されたポリペプチドを回収することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法を提供する。
【００１８】
本発明は、“ｚａｃｒｐ３ｘ２”と称する新規脂肪細胞補体関連タンパク質をコードする核酸分子を提供する。ｚａｃｒｐ３ｘ２をコードする例示的ヌクレオチド配列は、配列番号１により提供される。コードされるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。従って、本明細書に記載されるｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、配列番号２に示されるような、４５９個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。
例示的ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドである。
【００１９】
本発明は、そのようなポリペプチドと特異的に結合する抗体及び抗体フラグメントをさらに提供する。典型的な抗体は、ポリクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体、ネズミモノクローナル抗体由来のヒト型化抗体、及びヒトモノクローナル抗体を包含する。例示的な抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２， Ｆ（ａｂ）_２， Ｆａｂ’， Ｆａｂ， Ｆｖ， ｓｃＦｖ及び最小認識単位を包含する。本発明はさらに、キャリヤー、及び本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド又は抗体を含んで成る組成物を包含する。
【００２０】
本発明はまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し、ここで前記核酸分子は、配列番号４のヌクレオチド配列を有する核酸分子；配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸分子；及び（ａ）配列番号４のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列の補体であるヌクレオチド配列から成る群から選択されたヌクレオチド配列から成る核酸分子に対して、緊縮洗浄条件下でハイブリダイズ核する酸分子から成る群から選択される。
本発明はさらに、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子も企画する。
【００２１】
本発明はまた、そのような核酸分子を含んで成るベクターを包含する。そのような発現ベクターは、転写プロモーター及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記プロモーターは核酸分子と作用可能に連結され、そして前記核酸分子は転写ターミネーターと作用可能に連結される。本発明はさらに、それらのベクター及び発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞を包含する。例示的宿主細胞は、細菌、酵母、菌類、昆虫、哺乳類及び植物細胞を包含する。発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞は、ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質を生成する、発現ベクターを含んで成るそのような組換え宿主細胞を培養し、そして任意には、前記培養された組換え宿主細胞からｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質を単離することによって、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドを生成するために使用され得る。
【００２２】
本発明はまた、（ａ）ｚａｃｒｐ３ｘ２核酸プローブと、（ｉ）生物学的サンプルから単離された試験ＲＮＡ分子又は（ｉｉ）前記単離されたＲＮＡ分子から合成される核酸分子のいずれかとを、ハイブリダイゼーション条件下で接触せしめ、ここで前記プローブは、配列番号１のヌクレオチド配列の一部、又はその補体を含んで成るヌクレオチド配列を有し、そして（ｂ）前記核酸プローブ、及び前記試験ＲＮＡ分子又は前記合成された核酸分子のいずれかのハイブリッドの形成を検出する段階を含んで成る、生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２ ＲＮＡの存在を検出するための方法を企画し、ここで前記ハイブリッドの存在が生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２ ＲＮＡの存在を示す。生物学的サンプルの例は、ヒト生物学的サンプル、例えば生検又は剖検である。
【００２３】
本発明はさらに、（ａ）生物学的サンプルと、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントとを接触せしめ、ここで前記接触は、生物学的サンプルへの抗体又は抗体フラグメントの結合を可能にする条件下で行われ、そして（ｂ）前記結合された抗体又は抗体フラグメントのいずれかを検出する段階を含んで成る、生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。そのような抗体又は抗体フラグメントはさらに、放射性同位体、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素ラベル、生物発光ラベル、及びコロイド状金から成る群から選択された検出できるラベルを含んで成る。典型的な生物学的サンプルは、ヒト生物学的サンプルである。
【００２４】
本発明はまた、それらの検出方法を行うためのキットも提供する。例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現の検出のためのキットは、核酸分子を含んで成る容器を含んで成り、ここで前記核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列の補体を含んで成る核酸分子、（ｃ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ａ）のフラグメントである核酸分子、及び（ｄ）少なくとも８個のヌクレオチドから成る（ｂ）のフラグメントである核酸分子から成る群から選択される。
【００２５】
例示的な核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド５６−１３６、１７９−４４８又は５６−４４８、又は５６−４４８、又はその補体を含んで成る核酸分子を包含する。そのようなキットはまた、核酸分子の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器も包含する。他方では、ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質の検出のためのキットは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントを含んで成る容器を含んで成ることができる。
【００２６】
本発明のそれらの及び他の観点は、次の特定の記載に基づいて明らかに成るであろう。さらに、種々の文献が下記において同定され、そして引用により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
定義：
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。
【００２８】
核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び／又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。
【００２９】
塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００３０】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。例えば、配列５’ ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ ３’ は、５’ ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ ３’に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。
【００３１】
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＣ）に転写される核酸分子を言及する。
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された成長因子をコードするＤＮＡ分子が、単離されたＤＮＡ分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なＤＮＡ分子よりも小さい。
【００３２】
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
“相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）”とは、逆転写酵素によりｍＲＮＡ鋳型から形成される一本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖ＤＮＡ分子及びその相補的ＤＮＡ鎖から成る二本鎖ＤＮＡ分子を言及するために用語“ｃＤＮＡ”を用いる。用語“ｃＤＮＡ”はまた、ＲＮＡ鋳型から生成されたｃＤＮＡ分子のクローンも言及する。
【００３３】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の５’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。
【００３４】
それらのプロモーター要素は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、ＴＡＴＡ配列、ＣＡＡＴ配列、分化−特異的要素（ＤＳＥ：ＭｃＧｅｈｅｅなど．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７： ５１１ （１９９３））、サイクリックのＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ：Ｔｒｅｉｓｍａｎ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １： ４７ （１９９０））、グルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）及び他の転写因子のための結合部位、例えばＣＲＥ／ＡＴＦ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： １９９３８ （１９９２））、ＡＰ２ （Ｙｅなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２５７２８ （１９９４））， ＳＰ１， ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質（ＣＲＥＢ；Ｌｏｅｋｅｎ， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ． ３： ２５３ （１９９３））、及びオクタマー因子（一般的には、Ｗａｔｓｏｎなど．， ｅｄｓ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４^ｔｈ ｅｄ． （Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｋｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ． １９８７）， ａｎｄ Ｌｅｍａｉｇｒｅ ａｎｄ Ｒｏｕｓｓｅａｕ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０３： １ （１９９４））を包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００３５】
“コアプロモーター”は、ＴＡＴＡボックス及び転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００３６】
“異種ＤＮＡ”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、ＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち、外来性ＤＮＡ）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性ＤＮＡ）に由来するＤＮＡを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主ＤＮＡセグメントに作用可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子であると思われる。逆に言えば、異種ＤＮＡ分子は、外来プロモーターと作用可能に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種ＤＮＡであると思われる。
【００３７】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約１０個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、１又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００３８】
非宿主ＤＮＡ分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００３９】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“作用可能に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
【００４０】
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。本明細書においては、組換え宿主の例は、発現ベクターからｚａｃｒｐ３ｘ２を生成する細胞である。対照的に、ｚａｃｒｐ３ｘ２は、ｚａｃｒｐ３ｘ２の“天然源”であり、そして発現ベクターを欠いている細胞により生成さえ得る。
【００４１】
“融合タンパク質”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子により発現されるハイブリッドタンパク質である。例えば、融合タンパク質は、親和性マトリックスを結合するポリペプチドにより融合されるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの少なくとも一部を含むことができる。そのような融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーを用いて、多量のｚａｃｒｐ３ｘ２を単離するための手段を提供する。
【００４２】
用語“受容体”とは、“リガンド”と称する生物活性分子に結合する、細胞結合されたタンパク質を示す。この相互作用は、細胞に対するリガンドの効果を介在する。受容体は、膜結合されたシトソール又は核；モノマー（例えば、胸腺刺激性ホルモン受容体、β−アドレナリン作用受容体）又はマルチマー（例えば、ＰＤＧＦ受容体、成長ホルモン受容体ＩＬ−３受容体、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、Ｇ−ＣＳＦ受容体、エリトロポエチン受容体及びＩＬ−６受容体）であり得る。膜結合された受容体は、細胞外リガンド−結合ドメイン、及び典型的には、シグナルトランスダクションに関与する細胞内エフェクタードメインを含んで成る多−ドメイン構造により特徴づけられる。一定の膜結合された受容体においては、細胞外リガンド−結合ドメイン及び細胞内エフェクタードメインは、完全な機能的受容体を含んで成る別々のポリペプチドに位置する。
【００４３】
一般的に、受容体へのリガンドの結合は、細胞の代謝における変更を導く、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体のコンホメーション変化をもたらす。受容体−リガンド相互作用にしばしば連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、サイクリックＡＭＰを生成の上昇、細胞カルシウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解を包含する。
【００４４】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするヌクレオチド配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００４５】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、９５％以上の純度、又は９９％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための１つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００４６】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
【００４７】
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はｍＲＮＡへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を包含する。
【００４８】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるＲＮＡの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたＲＮＡ分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのｍＲＮＡをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのスプライス変異体によりコードされるポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００４９】
本明細書において使用される場合、用語“イムノモジュレータ−”とは、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンフォトキシン、同時−刺激分子、造血因子及びそれらの分子の合成類似体を包含する。
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン（又はストレプタビジン）は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハプテン又はエピトープ）対、センス／アンチセンス ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０^９Ｍ^−１の結合親和性を有する。
【００５０】
“抗−イディオタイプ抗体”とは、免疫グロブリンの可変領域ドメインと結合する抗体である。本明細書においては、抗−イディオタイプの抗体は、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体の可変領域と結合し、そして従って、抗−イディオタイプ抗体はｚａｃｒｐ３ｘ２のエピトープを模倣する。
“抗体フラグメント”は、抗体の一部、例えばＦ（ａｂ’）_２， Ｆ（ａｂ）_２， Ｆａｂ’， Ａａｂ及び同様のものである。構造に関係なく、抗体フラグメントは、損なわれていない抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２モノクローナル抗体フラグメントは、ｚａｃｒｐ３ｘ２のエピトープと結合する。
【００５１】
用語“抗体フラグメント”はまた、特定の抗原に結合する、合成の又は遺伝的に構築されたポリペプチド、例えばＬ鎖可変領域から成るポリペプチド、Ｈ及びＬ鎖の可変領域から成る“Ｆｖ”フラグメント、Ｌ及びＨ鎖可変領域がペプチドリンガーにより連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（“ｓｖＦｖタンパク質”）、及び超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最少認識単位を包含する。
“キメラ抗体”は、囓歯動物抗体に由来する種々のドメイン及び相補的決定領域を含む組換えタンパク質であるが、ところが抗体分子の残りはヒト抗体に由来する。
【００５２】
“ヒト型化抗体”は、モノクローナル抗体のネズミ相補的決定領域がネズミ免疫グロブリンのＨ及びＬ可変鎖からヒト可変ドメインに移行されている組換えタンパク質である。
本明細書において使用される場合、“治療剤”は、治療のために有用である接合体を生成するために抗体成分に接合される分子又は原子である。治療剤の例は、薬剤、毒素、イムノモジュレーター、キレート化剤、硼素化合物、光活性剤又は染料、及び放射生同位体を包含する。
“検出できるラベル”は、診断のために有用な分子を生成するために抗体成分に接合され得る分子又は原子である。検出できるラベルの例は、キレート化剤、光活性剤、放射性同位体、蛍光剤、常磁性イオン又は他のマーカー成分を包含する。
【００５３】
“親和性標識”とは、第２ポリペプチドの精製又は検出を提供し、又は基質への第２ポリペプチドの結合のための部位を供給するために、第２ポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明細書において使用される。主に、抗体又は、他の特異的結合剤が利用できるいずれかのペプチド又はタンパク質が親和性標識として使用され得る。
【００５４】
親和性標識は、ポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインＡ （Ｎｉｌｓｓｏｎ など．， ＥＭＢＯ Ｊ． ４： １０７５， １９８５； Ｎｉｌｓｓｏｎ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９８： ３， １９９１）， グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Ｓｍｉｔｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７； ３１， １９８８）， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識 （Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ７９５２−４， １９８５）， 物質Ｐ、すなわちＦｌａｇ^ＴＭ ペプチド（Ｈｏｐｐなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： １２０４−１２１０， １９８８）、ストレプタビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ｆｏｒｄ など．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５−１０７， １９９１を参照のこと。親和性標識をコードする核酸分子は、商品供給者（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ； Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈｅｖｅｎ， ＣＴ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）から入手できる。
【００５５】
“裸の抗体”は、抗体フラグメントに対立するものとして、治療剤により接合されない完全な抗体である。裸の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、並びに一定の組換え抗体、例えばキメラ性及びヒト型化抗体を包含する。
本明細書において使用される場合、用語“抗体成分”は、完全な抗体及び抗体フラグメントの両者を包含する。
【００５６】
“免疫接合体”は、治療剤又は検出できるラベルと抗体成分との接合体である。
本発明において使用される場合、用語“抗体融合タンパク質”とは、抗体成分及び治療剤を含んで成る組換え分子を言及する。そのような融合タンパク質のために適切な治療剤の例は、イミノモデュレーター（“抗体−イミノモデュレーター融合タンパク質”）、及びトキシン（“抗体−トキシン融合タンパク質”）を包含する。
【００５７】
“標的ポリペプチド”又は“標的ペプチド”は、少なくとも１つのエピトープを含み、そして標的細胞、例えば腫瘍細胞、又は感染剤抗原を担持する細胞上で発現されるアミノ酸配列である。Ｔ細胞は、標的ポリペプチド又は標的ペプチドに、主要組織適合性複合体分子により提供されるペプチドエピトープを認識し、そして典型的には、標的細胞を溶解し、又は標的細胞の例に他の免疫細胞を補充し、それにより標的細胞を殺害する。
【００５８】
“抗原性ペプチド”は、Ｔ細胞により認識されるＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するために、主要組織適合複合体分子を結合し、それにより、Ｔ細胞への提供に基づいて細胞毒性リンパ球応答を誘発するペプチドである。従って、抗原性ペプチドは、適切な主要組織適合性複合体分子に結合し、そして細胞毒性Ｔ細胞応答、例えば抗原を結合するか又は発現する標的細胞に対する細胞溶解又は特異的サイトカイン開放を誘発することができる。抗原性ペプチドは、抗原提供細胞又は標的細胞上に、クラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子に関して結合され得る。
【００５９】
真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、ｍＲＮＡを生成するために構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子はＲＮＡポリメラーゼＩＩ鋳型を含むより企画され、ここでＲＮＡ転写体は特定のｍＲＮＡの配列に対して相補的である配列を有する。ＲＮＡ転写体は、“アンチセンスＲＮＡ”と呼ばれ、そしてアンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は“アンチセンス遺伝子”と呼ばれる。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子に結合することができ、ｍＲＮＡ翻訳の阻害をもたらす。
【００６０】
“ｚａｃｒｐ３ｘ２に対して特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド”又は“ｚａｃｒｐ３ｘ２アンチセンスオリゴヌクレオチド”は、（ａ）ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の一部と共に安定した三量体を形成できるか、又は（ｂ）ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子のｍＲＮＡ転写体の一部と共に安定した二量体を形成できる配列を有するオリゴヌクレオチドである。
“リボザイム”は、触媒中心を含む核酸分子である。この用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ、自己分解性ＲＮＡ及びそれらの触媒機能を行う核酸分子を包含する。
“外部案内配列”は、細胞内ｍＲＮＡの特定種に内因性リボザイム、すなわちＲＮアーゼＰを方向づけ、ＲＮアーゼＰによるｍＲＮＡの分解をもたらす核酸分子である。外部案内配列をコードする核酸分子は、“外部案内配列遺伝子”と呼ばれる。
【００６１】
用語“変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子”は、配列番号２の修飾であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子を言及する。そのような変異体は、天然に存在する多型現象のｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子、及び配列番号２のアミノ酸配列の保存性アミノ酸置換を含む合成遺伝子を包含する。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の追加の変異体形は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の挿入又は欠失を含む核酸分子である。変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、その遺伝子が配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又はその補体と、緊縮条件下でハイブリダイズするかどうかを決定することによって同定され得る。
【００６２】
他方では、変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、配列−比較により同定さえ得る。２つのアミノ酸配列は、その２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が、最大の応答により整列される場合、同じである場合、“１００％のアミノ酸配列同一性”を有する。配列比較は、標準のソフトウェアプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により製造されるＬＡＳＥＲＧＥＮＥ生物情報コンピューターサイトに包含されるそれらのプログラムを用いて行われ得る。
【００６３】
最適な整列を決定することによって、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するための他の方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｐｅｒｕｓｋｉ ａｎｄ Ｐｅｒｕｓｋｉ， Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎｅｔ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７）， Ｗｕ など． （ｅｄｓ．）， “Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｇｅｓ １２３−１５１ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９７）， 及びＢｉｓｈｏｐ （ｅｄ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）。配列同一性を決定するための特定の方法は下記に記載される。
【００６４】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおける変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００６５】
用語“オルト体（ｏｒｔｈｏｌｏｇｙ）”とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質を示す。オルト体間の配列の差異は、特定化の結果である。
“パラ体（ｐａｒａｌｏｇｓ）”とは、生物によって製造される、異なっているが，しかし構造的に関連するタンパク質である。パラ体は、遺伝子重複を通して生じると思われる。例えば、α−グロビン、β−グロビン及びミオグロビンは、お互いパラ体である。
【００６６】
本発明は、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の機能的フラグメントを包含する。本発明においては、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の“機能的フラグメント”は、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体と特異的に結合するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの一部をコードする核酸分子を言及する。例えば、本明細書に記載されるｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の機能的フラグメントは、配列番号１のヌクレオチド配列の一部を含んで成り、そして抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体と特異的に結合するポリペプチドをコードする。
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”Ｘ又は“およそ”Ｘとして表される場合、Ｘの言及された値は、±１０％で正確であると理解されるであろう。
【００６７】
本発明は、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリーに対する相同性を有するポリペプチドをコードする新規ＤＮＡ配列の発見に一部、基づかれる。前記ポリペプチドは、ｚａｃｒｐ３ｘ２と命名されている。ｚａｃｒｐ３ｘ２のヌクレオチド配列は配列番号１に記載され、そしてその推定されるアミノ酸配列は配列番号２に示される。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜アミノ酸残基２２（Ｃｙｓ）、すなわち配列番号１のヌクレオチド１−６６を含んで成るシグナル配列を包含する。成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２３（Ｇｌｎ）〜アミノ酸３１９（Ｌｙｓ）、すなわち配列番号１のヌクレオチド６７−９５７の範囲にわたる。
【００６８】
成熟ポリペプチド内に、配列番号２のアミノ酸２３（Ｇｌｎ）〜１２３（Ａｒｇ）、すなわち配列番号１のヌクレオチド６７〜３６９の既知相同性を有さないＮ−末端領域が見出される。さらに、配列番号２のアミノ酸１２４（Ｇｌｙ）〜１８６（Ｐｒｏ）、すなわち配列番号１のヌクレオチド３７０〜５５８のコラーゲン−様ドメインが見出される。前記コラーゲン−様ドメインにおいては、２１個のコラーゲン反復体、すなわち６個の完全Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｐｒｏ反復体及び１５個の不完全Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ反復体が存在する。鎖内ジスルフィド結合は、配列番号２のアミノ酸残基３９、４２及び４３でシステインを包含する。配列番号２のアミノ酸残基１２８， １２９， １３１， １３２， １３４， １３５， １３８， １６７， １７６， １８３及び１８６でこのドメインにおいて見出されるプロリン残基が加水分解され得る。
【００６９】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドはまた、配列番号２のアミノ酸１８７（Ｐｒｏ）〜３１９（Ｌｙｓ）、すなわち配列番号１のヌクレオチド５５９−９５７の範囲のカルボキシ−末端Ｃ１ｑ／ＴＮＦドメインを包含する。芳香族モチーフＦ−Ｘ（５）−［ＮＤ］−Ｘ（４）−［ＦＹＷＬ］−Ｘ（６）−Ｆ−Ｘ（５）−Ｇ−Ｘ−Ｙ−Ｘ（４） （配列番号８）はまた、配列番号２の残基２１０（Ｐｈｅ）〜２４０（Ｐｈｅ）、すなわち配列番号１のヌクレオチド６２８−７２０内に見出される。Ｘはいずれかのアミノ酸残基を表し、そして括弧（ ）内の数字は残基のアミノ酸番号を示す。括弧［ ］内に含まれるアミノ酸残基は、特定の位置でのアミノ酸残基の選択を制限する。正しい折りたたみを可能にするためにＣ１ｑドメイン内に相当量の保存された構造体が存在する。
【００７０】
ｚａｃｒｐ３ｘ２は、脂肪細胞補体関連タンパク質ｚａｃｒｐ３のスプライシング変異体であると思われる（Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ＷＩＰＯ国際公開番号ＷＯ００／６３３７７号、１０月２６日、２０００年）。ｚａｃｒｐ３ｘ２（配列番号２）及びｚａｃｒｐ３（配列番号３）のアミノ酸配列を比較すると、ｚａｃｒｐ３ｘ２は、配列番号３のアミノ酸残基２８〜２９間に７３個のアミノ酸残基挿入体（配列番号４）を含む。ｚａｃｒｐ３ｘ２（配列番号５）は、クローン化され、そして５’配列の残りを含むコンチグ（Ｃｏｎｔｉｇ）を生成するために使用された。配列番号２の十分な長さのｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが、配列番号１として提供される。
【００７１】
コラーゲンドメインの先に存在する、ｚａｃｒｐ３に対するｚａｃｒｐ３ｘ２の７３個のアミノ酸の挿入体は、他のタンパク質ファミリーメンバー、例えばＥＤＡ（外胚葉形成異常タンパク質）（配列番号６）を暗示する。ＥＤＡは、延長されたＮ−末端領域、続いてコラーゲンドメイン及びＴＮＦ−葉球状ドメインを有する。ＥＤＡは、汗腺及び髪の発育に関連する。ＥＤＡは、増殖組織において特異的に発現されるプロ領域スプライス変異体を有する。ｚａｃｒｐ３ｘ２の特異的発現及び他方では、スプライスされたプロ−領域は、成熟及び増殖する組織において異なった役割を示す。
【００７２】
ｚａｃｒｐ３ｘ２は、例えば肝臓、乳房、脳、リンパ組織、及び／又は下部構造の成長を調節することができる。ｚａｃｒｐ３ｘ２はまた、組織修復及び成長の増強において有用である。ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質は、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３ｘ２の多量体化状態または受容体結合特性を変更することによってｚａｃｒｐ３−様活性を調節することができる。従って、本発明のもう１つの観点は、配列番号２の１（Ｍｅｔ）又は２３（Ｇｌｎ）〜１２３（Ａｒｇ）の範囲のｚａｃｒｐ３ｘ２のＮ−末端フラグメントを包含する。
【００７３】
本発明のもう１つの観点は、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドフラグメントを包含する。好ましいフラグメントは、配列番号２のアミノ酸１（Ｍｅｔ）、２３（Ｇｌｎ）又は１２４（Ｇｌｙ）〜アミノ酸１８６（Ｐｒｏ）の範囲のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドのコラーゲン−様ドメイン、前記コラーゲン−様ドメインを含むｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの一部、又は二量体化又はオリゴマー化できるコラーゲン−様ドメインの一部を含むそれらを包含する。本明細書において使用される場合、用語“コラーゲン”又は“コラーゲン−様ドメイン”とは、一連の反復トリプレットアミノ酸配列、すなわちモチーフＧｌｙ−Ｘａａ−Ｐｒｏ又はＧｌｙ−Ｘａａ−Ｘａａ（ここで、Ｘａａはいずれかのアミノ酸残基である）により表される“反復体”又は“コラーゲン反復体”を言及する。
【００７４】
コラーゲン−様ドメイン内のコラーゲン反復体の数は、脂肪細胞補体関連タンパク質ファミリー内で変化する。そのようなコラーゲン−様ドメインを含むフラグメント又はタンパク質は、ホモマー構造体（同じフラグメント又はタンパク質のダイマー又はオリゴマー）を形成することができる。さらに、そのようなコラーゲン−様ドメインを含むそのようなフラグメント又はタンパク質は、ヘテロマー構造体（異なったフラグメント又はタンパク質のダイマー、トリマー又はオリゴマー）を形成することができる。
【００７５】
それらのフラグメントは、コラーゲン二量体化又はオリゴマー化の研究、又は下記により十分に記載されるような融合タンパク質の形成において特に有用である。（ａ）ヌクレオチド１， ６７又は３７０〜ヌクレオチド５５８の配列番号１に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；（ｂ）アミノ酸残基１２４（Ｇｌｙ）〜アミノ酸残基１８６（Ｐｒｏ）の配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％又は９５％同一であるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して相補的な分子；及び（ｄ）ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドコラーゲン−様ドメインフラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列から成る群を包含する、そのようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、本発明により包含される。
【００７６】
他の好ましいフラグメントは、配列番号２のアミノ酸１８７（Ｐｒｏ）〜３１９（Ｌｙｓ）の範囲のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの球状Ｃ１ｑドメイン、Ｃ１ｑドメインを含むｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの一部、又はＣ１ｑドメインの活性部分を含む。他のＣ１ｑドメイン含有タンパク質は、Ｃ１ｑＡ， Ｂ及びＣ（Ｓｅｌｌａｒなど．， 前記、Ｒｅｉｄ、前記、及びＲｅｉｄなど．， １９８２， 前記）、シマリス冬眠関連血漿タンパク質ＨＰ−２０、ＨＰ−２５及びＨＰ−２７（Ｔａｋａｍａｔｓｕなど．， 前記及びＫｏｎｄｏ ＆ Ｋｏｎｄｏ， 前記）、ヒトプレセレベリン（Ｕｒａｄａなど．， 前記）、ヒト内皮細胞マルチメリン（Ｈａｙｗａｒｄなど， 前記）、脊椎動物コラーゲンＶＩＩＩ型及びＸ型（Ｍｕｒａｇａｋｉなど．， 前記）、脂肪細胞補体関連タンパク質Ａｃｒｐ３０（Ｓｃｈｅｒｅｒなど．， 前記）、ａｐＭ１ （Ｍｅａｄａなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２２１： ２８６−９， １９９６）， ＧＢＰ２８ （Ｎａｋａｎｏなど．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １２０： ８０３−１２， １９９６）， ｚｓｉｇ３９ （Ｓｈｅｐｐａｒｄ ａｎｄ Ｈｕｍｅｓ， ＷＩＰＯ 公開特許番号：ＷＯ９９／１０４９２号）、
【００７７】
ｚｓｉｇ３７ （Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ＷＩＰＯ公開）特許番号ＷＯ９９／０４０００号）、ＺＣＲＰ３０Ｒ１（Ｓｍｉｔｈなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号ＷＯ９９／５６６１９号）、ＡＣＲＰ３０Ｒ１Ｌ（Ｈｅｎｓｌｅｙなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号ＷＯ９９／５９６１８号）、ＡＣＲＰ３０Ｒ２（Ｈｅｎｓｌｅｙなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号９９／６４６２９号）、ＰＲＯ３５３及びＰＲＯ３４４（Ｗｏｏｄなど．， ＷＩＰＯ公開特許番号ＷＯ９９／２８４６２号）、ｚａｃｒｐ２ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／６３３７６号）、ｚａｃｒｐ３ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／６３３７７号）、ｚａｃｒｐ４ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ０１／１２５６５号）、ｚａｃｒｐ５ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／７３４４４号）、ｚａｃｒｐ６ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／７３４６６号）、ｚａｃｒｐ１１ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／＊＊＊＊）、及びｚａｃｒｐ１２ （Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／＊＊＊＊） を包含する。
【００７８】
ｚａｃｒｐ３ｘ２のＣ１ｑドメインは、１０β鎖“ジェリーロール”トポロジー（配列番号２のアミノ酸残基１９２−１９６， ２１３−２１５， ２２１−２２４， ２２８−２３１， ２３４−２４６， ２４８−２５５， ２６３−２７０， ２７３−２８５， ２９０−２９５及び３０１−３１４）を含む。それらの鎖は、それぞれ”Ａ”， “Ａ’”， “Ｂ”， “Ｂ’”， “Ｃ”， “Ｄ”， “Ｅ”， “Ｆ”， “Ｇ”及び”Ｈ”と称する（Ｓｈａｐｉｒｏ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ８： ３３５−８， １９９８）。
【００７９】
ｚａｃｒｐ３ｘ２は、配列番号２のアミノ酸残基１８４（Ｇｌｙ）〜２１２（Ｓｅｒ）及び２４３（Ｍｅｔ）〜２５５（Ｌｅｕ）で２個の受容体結合ループを有する。当業者は、それらの境界がおおよそであり、そして既知のタンパク質とのアラインメント及びタンパク質折りたたみの予測に基づかれていることを認識するであろう。コアー受容体結合領域は、配列番号２のアミノ酸残基１９７（Ｌｅｕ）〜２２３（Ｖａｌ）及び２５４（Ｔｙｒ）〜２７０（Ｍｅｔ）を含むことが予測される。アミノ酸残基２３４（Ｇｌｙ）、２３６（Ｔｙｒ）、２８５（Ｌｅｕ）及び３０７（Ｐｈｅ）は、そのスーパーファミリーを通して保存されると思われる。
【００８０】
それらのフラグメントは、エネルギーバランス又は神経伝達、特にダイエット−又はストレス−関連神経伝達、コラーゲン阻害及び補体阻害の研究又は調整において特に有用である。抗微生物活性がまた、そのようなフラグメントに存在することができる。ＴＮＦタンパク質（Ｓｈａｐｉｒｏ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒｅｒ， 前記）に対する脂肪細胞補体関連タンパク質Ｃ１ｑドメインの相同性は、そのようなフラグメントが肥満−関連インスリン耐性、免疫調節、炎症応答、血小板付着調整、アポプトシス、及び破骨細胞成熟において有用である。
【００８１】
（ａ）ヌクレオチド５５９〜ヌクレオチド９５７の配列番号１に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；（ｂ）アミノ酸残基１８７（Ｐｒｏ）〜アミノ酸残基３１９（Ｌｙｓ）の配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％又は９５％同一であるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に対して相補的な分子；及び（ｄ）ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドＣ１ｑドメインフラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列から成る群を包含する、そのようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、本発明により包含される。
【００８２】
本発明のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドフラグメントは、コラーゲン−様ドメイン、及び配列番号２のアミノ酸残基２３（Ｇｌｎ）、又は１２４（Ｇｌｙ）〜３１９（Ｌｙｓ）の範囲のＣ１ｑドメインの両者を包含する。（ａ）ヌクレオチド６７又は３７０〜ヌクレオチド９５７の配列番号１に示されるようなヌクレオチドの配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；（ｂ）アミノ酸残基２３（Ｇｌｎ）又は１２４（Ｇｌｙ）〜アミノ酸残基３１９（Ｌｙｓ）の配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、９０％又は９５％同一であるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド分子；（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に対して相補的な分子；及び（ｄ）ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドコラーゲン−様ドメイン−Ｃ１ｑドメインフラグメントをコードする縮重ヌクレオチド配列から成る群を包含する、そのようなフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、本発明により包含される。
【００８３】
ヒトｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の生成：
ヒトｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードする核酸分子は、配列番号１に基づいてのポリヌクレオチドプローブを用いて、ヒトｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。それらの技法は、標準であり、そして十分に確立されている。例示されるように、ヒトｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。この場合、第１段階は、当業者に良く知られている方法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを調製することである。一般的に、ＲＮＡ単離技法は、細胞を分解するための方法、ＲＮＡのＲＮアーゼ指図された分解を阻害するための手段、及びＤＮＡ、タンパク質及び多糖類汚染物からＲＮＡを分離する方法を提供すべきである。
【００８４】
例えば、全ＲＮＡは、液体窒素において組織を凍結し、その凍結された組織を乳針及び乳棒により粉砕し、細胞を溶解し、フェノール／クロロホルムの溶液により前記粉砕された組織を抽出し、タンパク質を除き、そして塩化リチウムによる選択的沈殿によりＲＮＡを残る不純物から分離することによって単離され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐａｇｅｓ４−１〜４−６ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ １９９５ ）［“Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５）”］； Ｗｕなど．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ３３−４１ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７ ） ［“Ｗｕ（１９９７）”］を参照のこと）。他方では、全ＲＮＡは、粉砕された組織をグアニジニウムイソチオシアネートにより抽出し、有機溶媒により抽出し、そしてＲＮＡを汚染物から示差遠心分離により分離することによって単離され得る（例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８： ５２ （１９７９）； Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） Ｐ．４−１〜４−６； Ｗｕ （１９９７） Ｐ．３３−４１ を参照のこと）。
【００８５】
ｃＤＮＡライブラリーを構成するために、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡが全ＲＮＡ調製物から単離されるべきである。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィーの標準技法を用いて、全ＲＮＡから単離され得る（例えば、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ６９： １４０８ （１９７２）； Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） Ｐ． ４−１１〜４−１２を参照のこと）。
【００８６】
二本鎖ｃＤＮＡ分子は、当業者に良く知られている技法を用いて、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから合成される（例えば、Ｗｕ （１９９７） Ｐ．４１−４６を参照のこと）。さらに、市販のキットが、二本鎖ｃＤＮＡ分子を合成するために使用され得る。例えば、そのようなキットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）， ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ） 及びＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） から入手できる。
【００８７】
種々のクローニングベクターが、ｃＤＮＡライブラリーの構成のために適切である。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、バクテリオファージに由来するベクター、例えばλｇｔ１０バクターにおいて調製され得る。例えば、Ｈｕｙｎｈなど．， “Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｎ λｇｔ１０ ａｎｄ λ１１” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ． Ｉ， Ｇｌｏｖａｒ （ｅｄ．）， ｐａｇｅ ４９ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５）； Ｗｕ （１９９７） ａｔ ｐａｇｅｓ ４７−５２ を参照のこと。
【００８８】
他方では、二本鎖ｃＤＮＡ分子は、プラスミドベクター、例えばＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ；Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）， ＬＡＭＤＡＧＥＭ−４ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．） 又は他の市販のベクター中に挿入され得る。適切なクローニングベクターはまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ． ＶＡ） から入手できる。
クローン化されたｃＤＮＡ分子を増幅するために、ｃＤＮＡライブラリーが、標準技法を用いて、原核宿主中に挿入される。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ） から得られるコンピテントＥ．コリＤＨ５細胞中に導入され得る。
【００８９】
ヒトゲノムライブラリーは、当業界において良く知られている手段により調製され得る（例えばＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ． ５−１〜５−６； Ｗｕ （１９９７） ｐ． ３０７−３２７を参照のこと）。ゲノムＤＮＡは、界面活性剤Ｓａｒｋｏｓｙｌにより組織を溶解し、その溶解物をプロテイナーゼＫにより消化し、不溶性残骸を溶解物から遠心分離により清浄し、イソプロパノールを用いて溶解物から核酸を沈殿し、そして塩化セシウム密度グラジエント上で再懸濁されたＤＮＡを精製することによって単離され得る。
【００９０】
ゲノムライブラリーの生成のために適切であるＤＮＡフラグメントは、ゲノムＤＮＡのランダム剪断により、又は制限エンドヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの部分消化により得られる。ゲノムＤＮＡフラグメントは、従来の技法、例えば適切な末端を供給するために制限酵素消化の使用、ＤＮＡ分子の所望しない連結を回避するためにアルカリホスファターゼ処理の使用、及び適切がリガーゼによる連結に従って、ベクター、例えばバクテリオファージ又はコスミドベクター中に挿入され得る。そのような操作のための技法は当業界において良く知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ． ５−１〜５−６； Ｗｕ （１９９７） ｐ． ３０７−３２７ を参照のこと）。
【００９１】
ヒトｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードする核酸分子はまた、本明細書に記載されるように、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子のヌクレオチド配列に基づくヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーによるポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて得られる。ＰＣＲによるライブラリーのスクリーニングの一般的方法は、例えば、Ｙｕなど．， “Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｈａｇｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”． Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， ｐ．２１１−２１５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９３）により提供される。
【００９２】
さらに、関連する遺伝子を単離するためへのＰＣＲの使用の技法は、例えばＰｒｅｓｔｏｎ， “Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｆａｍｉｌｙ Ｍｅｍｂｅｒｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， ｐａｇｅｓ ３１７−３３７ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９３） により記載される。
【００９３】
他方では、ヒトゲノムライブラリーは、市販源、例えばＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ （Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ） 及びＡＴＣＣ （Ｍａｒａｓｓａｓ， ＶＡ） から得られる。
ｃＤＮＡ又はゲノムクローンを含むライブラリーは、標準方法を用いて、配列番号１に基づかれる１又は複数のポリヌクレオチドプローブによりスクリーンされ得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ． ６−１〜６−１１を参照のこと）。
【００９４】
下記のようにして生成された抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体はまた、ｃＤＮＡライブラリーからのｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードするＤＮＡ配列を単離するためにも使用され得る。例えば、抗体はλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーンするために使用され、又は抗体はハイブリッド選択及び翻訳に続くイムノスクリーニングのために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）ｐ．６−１２〜６−１６； Ｍａｒｇｏｌｉｓ など．， “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ λ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｕｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｂｅｓ” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など （ｅｄｓ．） ｐ． １−１４ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） を参照のこと）。
【００９５】
他に、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、お互いプライムする長いオリゴヌクレオチド、及び本明細書に記載されるヌクレオチド配列を用いて、核酸分子を合成することによって得られる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ．８−８〜８−９を参照のこと）。ポリメラーゼ鎖反応を用いての確立された技法は、少なくとも２ｋｂの長さのＤＮＡ分子を合成する能力を提供する（Ａｄａｎｇ など．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２１： １１３１ （１９９３）． Ｂａｍｂｏｔ など．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２６６ （１９９３）， Ｄｉｌｆｏｎ など．， “Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｎｓｔｒａｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５： ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ２６３−２６８． （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９３）， 及びＨｏｌｏｗａｃｈｕｋなど．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． ４： ２９９ （１９９５））。
【００９６】
本発明の核酸分子はまた、ホスホラミジット方法のようなプロトコールを用いて、“遺伝子機会”により合成され得る。化学的に合成される二本鎖ＤＮＡが遺伝子又は遺伝子フラグメントの合成のような用途のために必要とされる場合、個々の相補的鎖は別々に製造される。短い遺伝子（６０〜８０の塩基対）の生成は技術的に簡単であり、そして相補的鎖を合成し、そして次にそれらをアニーリングすることによって達成され得る。しかしながら、長い遺伝子（３００以上の塩基対）の生成に関しては、化学的ＤＮＡ合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに１００％ではないので、特殊な手段が必要とされる。この問題を克服するために、合成遺伝子（二本鎖）が、２０〜１００個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュラー形でアセンブルされる。
【００９７】
合成遺伝子を構築するための１つの方法は、それぞれ２０〜６０個の長さのヌクレオチドである、１組のオーバーラップする相補的オリゴヌクレオチドの初期生成を必要とする。鎖の配列は、アニーリングの後、遺伝子の２つの末端セグメントがブラント末端を得るために一列整列されるよう設計される。遺伝子の個々の部分は、隣接する部分と共に正確に塩基対のために企画される相補的３’及び５’末端延長部を有する。従って、遺伝子がアセンブルされた後、工程を完結する唯一の残る必要条件は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより、２本の鎖の主鎖にそってニックを密封することである。タンパク質コード配列のほかに、合成遺伝子は、クローニングベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位中への挿入を促進する末端配列により企画され得、そして転写及び翻訳の正しい開始及び終結のためのシグナルを含む他の配列が付加されるべきである。
【００９８】
十分な長さの遺伝子を調製するための他の手段は、特定組みのオーバーラップするオリゴヌクレオチド（４０〜１００個のヌクレオチド）を合成することである。３’及び５’の延長領域（６〜１０個のヌクレオチド）がアニーリングされた後、大きなギャップが残存するが、しかし塩基対合された領域は、その構造体を一緒に維持するのに十分に長く且つ十分に安定性である。ギャップが満たされ、そしてＤＮＡ複合体がＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩによる酵素ＤＮＡ合成により完結される。この酵素は、複製開始点として３’−ヒドロキシル基、及び鋳型として一本鎖領域を使用する。
【００９９】
酵素合成の完結の後、ニックがＴ４ ＤＮＡリガーゼにより密閉される。より大きな遺伝子に関しては、完全な遺伝子配列は通常、４〜６種のオーバーラップするオリゴヌクレオチド（それぞれ２０〜６０個の塩基対）を連結することによって一緒に配置される二本鎖フラグメントから集成される。個々の合成及びアニーリング段階の後、十分な量の二本鎖フラグメントが存在する場合、それらはお互い単純に連結される。一方では個々のフラグメントは、利用できるＤＮＡの量を増幅するためにベクター中にクローン化される。両者の場合、二本鎖構造体は完全な遺伝子配列を形成するためにお互いに連続して連結される。
【０１００】
個々の二本鎖フラグメント及び完全な配列は、化学的に合成された遺伝子が正しいヌクレオチド配列を有することを確かめるために、ＤＮＡ配列分析により特徴づけられるべきである。ポリヌクレオチド合成の再考のためには、例えば、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ １９９４）， Ｉｔａｋｕｒａ など．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３： ３２３ （１９８４）， などＣｌｉｍｉｅ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ６３３ （１９９０） を参照のこと。
【０１０１】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ ｃＤＮＡ又はｚａｃｒｐ３ｘ２ゲノムフラグメントの配列は、標準の方法を用いて決定され得る。本明細書に開示されるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリヌクレオチド配列はまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の５’側の非−コード領域をクローン化するためのプローブ又はプライマーとして使用され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝からのプロモーター要素は、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子治療を受けている患者において異種遺伝子の発現を方向づけるために使用され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２プロモーター又は調節要素を含むゲノムフラグメントの同定は、十分に確立された技法、例えば欠失分析を用いて達成され得る（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） を参照のこと）。
【０１０２】
５’側フランギング配列のクローニングはまた、アメリカ特許第５，６４１，６７０号に開示される方法に従って、“遺伝子活性化”によるｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質の生成を促進する。手短くに言及すれば、細胞における内因性ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の発現は、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、及び対になっていないスプライスドナー部位を含んで成るＤＮＡ構造体を、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子座中に導入することによって変更される。標的配列は、内因性ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子座を有する構造体の相同組換えを可能にするｚａｃｒｐ３ｘ２ ５’側非コード配列であり、それにより、前記構造体内の配列は内因性ｚａｃｒｐ３ｘ２コード配列により作用可能に連結されるようになる。この場合、内因性ｚａｃｒｐ３ｘ２プロモーターが、他の調節は列により置換されるか又はそれにより補充され、増強された組織特異的、又は他方では、調節された発現が提供される。
【０１０３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子変異体の生成：
本発明は、本明細書に開示されるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードする種々の核酸分子、例えばＤＮＡ及びＲＮＡ分子を提供する。当業者は、遺伝子コードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可能であることを容易に認識するであろう。配列番号６は、それぞれ配列番号２のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードするすべての核酸分子を包含する縮重ヌクレオチド配列である。当業者は、配列番号７の縮重配列がまた、Ｔに代わってＵを置換することによって、それぞれ配列番号２をコードするすべてのＲＮＡ配列を提供することを認識するであろう。従って、本発明は、配列番号１のヌクレオチド１−９５７、及びそれらのＲＮＡ同等物を含んで成るｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド−コード核酸分子を企画する。
【０１０４】
表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号７内に使用される１文字コードを示す。“決定”は、コード文字により示されるヌクレオチドである。“補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。例えば、コードＹはＣ又はＴのいずれかを示し、そしてその補体ＲはＡ又はＧを示し、ＡはＴに対して相補的であり、そしてＧはＣに対して相補的である。
【０１０５】
【表１】

所定のアミノ酸についてのすべての可能なコドンを包含する、配列番号７に使用される縮重コドンが表２に示される。
【０１０６】
【表２】

【０１０７】
当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するであろう。例えば、セリン（ＷＳＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アルギニン（ＡＧＲ）をコードすることができ、そしてアルギニン（ＭＧＮ）のための縮重コドンは、ある環境下で、セリン（ＡＧＹ）をコードすることができる。類似する関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号２のアミノ酸配列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。
【０１０８】
異なった種は“選択的コドン使用法”を示すことができる。一般的には、Ｇｒａｎｔｈａｍ，など．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８： １８９３−９１２， １９８０； Ｈａａｓ， など．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ６： ３１５−２４， １９９６； Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、など．，Ｇｅｎｅ １３：３５５−６４，１９８１；Ｇｒｏｓｊｅａｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒａ，Ｇｅｎｅ １８：１９９−２０９、１９８２；Ｈｏｌｍ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３０７５−８７、１９８６；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：５７３−９７，１９８２、Ｓｈａｒｙｐ ａｎｄ Ｍａｔａｓｓｉ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ４： ８５１ （１９９４）， Ｋａｎｅ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６： ４９４（１９９５）， 及びＭａｋｒｉｄｅｓ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６０： ５１２（１９９６） を参照のこと。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用法”又は“選択的コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸をコードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを言及する技術的用語である（表２を参照のこと）。例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しかし哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種においては、例えば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なったＴｈｒコドンが好ましい。
【０１１０】
特定の種のための選択的コドンは、当業界において知られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。例えば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生成を増強する。従って、配列番号７に開示される縮重コドン配列は、当業界において通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種においてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示される官能性について試験され得る。
【０１１１】
本発明はさらに、他の種（オルト体）からの相対物を表すポリペプチド及び核酸分子を供給する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドである。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドのそのようなオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃＤＮＡは、本明細書に開示されるようにｚａｃｒｐ３ｘ２を発現する組織又は細胞型から得られるｍＲＮＡを用いてクローン化され得る。ｍＲＮＡの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍＲＮＡから調製される。
【０１１２】
次に、ｚａｃｒｐ３ｘ２コードのｃＤＮＡが種々の方法、例えば完全な又は部分的なｃＤＮＡにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃＤＮＡはまた、本明細書に開示される代表的なｚａｃｒｐ３ｘ２配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、、ｃＤＮＡライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃＤＮＡの発現がｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離のために適用され得る。
【０１１３】
当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトｚａｃｒｐ３ｘ２の単一の対立遺伝子を表し、そして対立遺伝子変動及び交互のスプライシングが生じることが予測されることを認識するであろう。本明細書に開示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。配列番号１に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体、例えばサイレント突然変異を含むそれらの変異体及び突然変異がアミノ酸配列変更をもたらすそれらの変異体は、配列番号２の対立遺伝子変異体であるタンパク質のように、本発明の範囲内である。
【０１１４】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの性質を保持する、もう１つのスプライスされたｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡ分子は、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドと同じように、本発明の範囲内に包含される。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【０１１５】
本発明の好ましい態様においては、単離された核酸分子は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。例えば、そのような核酸分子は、緊縮条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子、配列番号１のヌクレオチドから成る核酸分子、又は配列番号１に対して相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号１又は５に対して相補的なヌクレオチド配列からなる核酸分子にハイブリダイズすることができる。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるよう選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。
【０１１６】
１対の核酸分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ， ＲＮＡ−ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡは、ヌクレオチド配列がいくらかの程度の相補性を有する場合、ハイブリダイズすることができる。ハイブリッド二重ヘリックスにおけるミスマッチ塩基対を許容できるが、しかしハイブリッドの安定性はミスマッチの程度により影響される。ミスマッチハイブリッドのＴｍは、１〜１．５％の塩基対ミスマッチごとに１℃低下する。ハイブリダイゼーション条件の緊縮性の変更は、ハイブリッドに存在するであろうミスマッチの程度に対する制御を可能にする。緊縮性の程度は、ハイブリダイゼーション温度が上昇し、そしてハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度が低下するにつれて、上昇する。
【０１１７】
緊縮ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリッドの熱溶融点（Ｔ_ｍ）よりも約５〜２５℃低い温度、及び１ＭまでのＮａ^＋を有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。より低い温度でのより高い温度の緊縮性は、緩衝溶液における個々の１％ホルムアミドについて約１℃、ハイブリッドのＴｍを低めるホルムアミドの添加により達成され得る。一般的に、そのような緊縮条件は、２０〜７０℃の温度、及び６×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを含むハイブリッド緩衝液を包含する。高い程度の緊縮性は、４０〜７０℃の温度で及び４×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液により達成され得る。
【０１１８】
高い緊縮条件は典型的には、４２〜７０℃の温度、及び１×ＳＳＣ及び０〜５０％のホルムアミドを有するハイブリダイゼーション緩衝液を包含する。異なった程度の緊縮液が、標的配列への最大の特異的結合を達成するために、ハイブリダイゼーション、及び洗浄の間、使用され得る。典型的には、ハイブリダイゼーションに続く洗浄は、ハイブリダイズされた複合体からハイブリダイズされていないポリヌクレオチドプローブを除去するために、上昇する程度の緊縮性で行われる。
【０１１９】
上記条件は、ガイドとして作用することを意味し、そしてそれは特定のポリペプチドハイブリッドとの使用のためのそれらの条件を適合するために、十分に当業者の能力の範囲内である。特定の標的配列についてのＴ_ｍは、標的配列の５０％が完全に適合されたプローブ配列にハイブリダイズするであろう温度（定義された条件下での）である。Ｔ_ｍに影響を及ぼすそれらの条件は、ポリヌクレオチドプローブのサイズ及び塩基対含有率、ハイブリダイゼーション溶液のイオン温度、及びハイブリダイゼーション溶液における不安定化剤の存在を包含する。
【０１２０】
Ｔｍを計算するための多くの等式は当業界において知られており、そして種々の長さのＤＮＡ、ＲＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド及びポリヌクレオチドプローブ配列に対して特異的である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ など．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ １９８８）； Ａｕｓｕｂｅｌ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ （ｅｄｓ．）， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）； 及びＷｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：２２７ （１９９０）を参照のこと）。
【０１２１】
配列分析ソフトウェア、並びにインターネット上のサイトが所定の配列を分析し、そして使用者の定義された基準に基づいてＴｍを計算するための手段を入手できる。そのようなプログラムはまた、定義された条件下で所定の配置を分析し、そして適切なプローブ配列を同定することができる。典型的には、５０以上の塩基対の長いポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、計算されたＴｍよりも約２０〜２５℃低い温度で行われる。５０以下の塩基対の小さなプローブに関しては、ハイブリダイゼーションは典型的には、Ｔｍ又はそれよりも５〜１０℃以下で行われる。これは、ＤＮＡ−ＤＮＡ及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに関して、最大速度のハイブリダイゼーションを可能にする。
【０１２２】
ヌクレオチド配列の長さは、ハイブリッド形成の速度及び安定性に影響を及ぼす。小さなプローブ配列、すなわち５０個以下の塩基対は、相補的配列との平衡化にすばやく達するが、しかし安定したハイブリッドは形成されない。インキュベーション時間（およそ分〜時）が、ハイブリッド形成を達成するために使用され得る。より長いプローブ配列はよりゆっくりと平衡化するが、しかし低い温度でさえ、より安定した複合体を形成する。インキュベーションは、一晩又はそれ以上の間、進行せしめられる。一般的に、インキュベーションは、計算されたコット時間の３倍に等しい期間、行われ得る。コット時間、すなわちポリヌクレオチド配列が再会合するのにかかる時間は、当業界において知られている方法により、特定の配列について計算され得る。
【０１２３】
ポリヌクレオチド配列の塩基対組成が、ハイブリッド複合体の熱安定性をもたらし、それにより、ハイブリダイゼーション温度の選択及びハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度に影響を及ぼす。Ａ−Ｔ対は、塩化ナトリウムを含む水溶液においてＧ−Ｃ対よりも低い安定性である。従って、Ｇ−Ｃ含有率が高いほど、ハイブリッドはより安定する。配列内のＧ及びＣ残基の平等な分布がまた、ハイブリッド安定性に正に寄与する。さらに、塩基対組成は、所定の配列のＴｍを変えるために操作され得る。例えば５−メチルデオキシシヂンは、デオキシシスチジンより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンは、デオキシシチジンにより置換され得、そして５−ブロモデオキシウリジンはＴｍを高めるためにチミジンにより置換され、そして７−デアズ−２’−デオキシグアノシンは、Ｔｍに対する依存性を低めるためにグアノシンにより置換され得る。
【０１２４】
ハイブリダイゼーション緩衝液のイオン濃度はまた、ハイブッリドの安定性に影響お及ぼす。ハイブリダイゼーション緩衝液は一般的にブロッキング剤、例えばＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）、変性されたサケ精子ＤＮＡ、粉乳（ＢＬＯＴＴＯ）、ヘパリン又はＳＤＳ、及びＮａ^＋源、例えばＳＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５：ＮのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）又はＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：１．８ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）を含む。緩衝液のイオン濃度を低めることによって、ハイブリッドの安定性は高められる。
【０１２５】
典型的には、ハイブリダイゼーション緩衝液は、１０ｍＭ〜１ＭのＮａ^＋を含む。不安定剤又は変性剤、例えば、ホルムアミド、テトラアルキルアンモニウム塩、グアニジウムカチオン又はチオシアネートカチオンのハイブリダイゼーション溶液への添加が、ハイブリッドのＴ_ｍを変更するであろう。典型的には、ホルムアミドが、より便利で且つ低い温度でのインキュベーションの実施を可能にするために、５０％までの濃度で使用される。ホルムアミドはまた、ＲＮＡプローブを用いる場合、非特異的バッググラウンドを低めるためにも作用する。
【０１２６】
例示のように、変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードする核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子により、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ 溶液：２％（ｗ／ｖ）のＦｉｃｏｌｌ ４００， ２％ （ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン及び２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン）、１０％の硫酸デキストラン及び２０μｇ／ｍｌの変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液において、４２℃で一晩ハイブリダイズされ得る。
【０１２７】
当業者は、それらのハイブリダイゼーション条件の変動性を考慮することができる。例えば、ハイブリダイゼーション混合物は、ホルムアミドを含まない溶液において、高度で、例えば約６５℃でインキュベートされ得る。さらに、予備混合されたハイブリダイゼーション溶液が入手でき（例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． からのＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ），そしてハイブリダイゼーションは製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションに続いて、核酸分子は、緊縮条件下で、又は高い緊縮条件下で、ハイブリダイズされなかった核酸分子を除去するために洗浄され得る。典型的な緊縮洗浄条件は、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液による５５〜６５％での洗浄を包含する。すなわち、変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードする核酸分子は、緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５５〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液、例えば５５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ溶液に等しい。当業者は、例えば洗浄溶液におけるＳＳＣをＳＳＰＥにより置換することによって同等の条件を容易に製造することができる。
【０１２９】
典型的な高い緊縮洗浄条件は、５０〜６５℃での０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．１×〜０．２×ＳＳＣの溶液による洗浄を包含する。言いかえれば、変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードする核酸分子は、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、ここで前記洗浄緊縮性は、５０〜６５℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液、例えば５０℃での、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ溶液、又は６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ溶液に等しい。
【０１３０】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチド又はそれらのオルト体に対して実質的に類似する配列同一性を有する単離されたｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドも提供する。用語“実質的に類似する配列同一性”とは、配列番号２で示される配列又はそれらのオルト体に対して７０％８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【０１３１】
本発明はまた、２種の次の基準を用いて同定され得るｚａｃｒｐ３ｘ２変異体核酸分子を企画する：配列番号２のアミノ酸配列とコードされたポリペプチドとの間の類似性の決定、及びハイブリダイゼーションアッセイ。そのようなｚａｃｒｐ３ｘ２変異体は、（１）５５〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣ溶液に等しい緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸残基４２〜１１０のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。
【０１３２】
他方では、ｚａｃｒｐ３ｘ２変異体は、（１）５０〜６５℃での０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣ溶液に等しい、高い緊縮洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列（又はその補体）を有する核酸分子とハイブリダイズし、そして（２）配列番号２のアミノ酸残基４２〜２５０のアミノ酸配列、又は配列番号６の対応する領域を含んで成るポリペプチドをコードする核酸分子として特徴づけられ得る。
本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列又はその補体から成る核酸分子のフラグメントである対照核酸分子とのハイブリダイゼーション分析を用いて特徴づけられる特定のｚａｃｒｐ３ｘ２変異体も包含する。例えば、そのような対照核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列又はその補体、配列番号１のヌクレオチド１６９−７９５から成る核酸分子を包含する。
【０１３３】
％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど．， Ｂｕｌｌ． Ｍａｔｈ． Ｂｉｏ． ４８ ： ６０３−６１６， １９８６及びｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｕｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９ ：１０９１５−１０９１９， １９９２を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （前記）の“ＢＬＯＳＵＭ６２”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：（［同一の適合するものの合計数］／［より長い配列の長さ＋ ２種の配列を整合するためにそのより長い配列中に導入されるギャップの数］）（１００）。
【０１３４】
【表３】

【０１３５】
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの“ＦＡＳＴＡ”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示される１つのアミノ酸配列及び推定上のｚａｃｒｐ３ｘ２変異体のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）， 及びＰｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３： ６３ （１９９０） により記載される。
【０１３６】
手短には、ＦＡＳＴＡがまず、問題の配列（例えば、配列番号２又は６）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１である場合）又は対の同一性（ｋｔｕｐ＝２である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【０１３７】
“カットオフ”値（配列の長さ及びｋｔｕｐ値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ ｗｉｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４４， １９７０； Ｓｅｌｌｅｒｓ， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２６： ７８７， １９７４）の変法を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ 分析のための好ましいパラメーターは次のものである：ｋｔｕｐ＝１、ギャップ開始ペナルティー＝１０、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。それらのパラメーターは、Ａｐｐｅｎｄｉｘ ２ ｏｆ Ｐｅａｒｓｏｎ， １９９０ （前記）に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってＦＡＳＴＡプログラム中に導入され得る。
【０１３８】
ＦＡＳＴＡはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ｋｔｕｐ値は、上記に設定される他のパラメーターを伴なって、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【０１３９】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列に比較して、保存性アミノ酸変更を有するポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。すなわち、配列番号２の１又は複数のアミノ酸置換を含む変異体が得られ、ここでアルキルアミノ酸がｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸配列におけるアルキルアミノ酸に代わって置換され、芳香族アミノ酸がｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸における芳香族アミノ酸に代わって置換され、硫黄含有アミノ酸がｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸配列における硫黄含有アミノ酸に代わって置換され、ヒドロキシ含有アミノ酸ｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸配列におけるヒドロキシ含有アミノ酸に代わって置換され、酸性アミノ酸がｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸配列における酸性アミノ酸に代わって置換され、塩基性アミノ酸がｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸配列における塩基性アミノ酸に代わって置換され、又は二塩基性モノカルボン酸アミノ酸ｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸配列における二塩基性モノカルボン酸アミノ酸に代わって置換される。
【０１４０】
通常のアミノ酸の中で、“保存性アミノ酸置換”は、次のグループの個々内のアミノ酸間の置換により示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（３）セリン及びトレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、及び（６）リシン、アルギニン及びヒスチジン。 ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連するタンパク質の５００以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９９２） ］。
【０１４１】
従って、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。単に化学的性質に基づいてのアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記で論じられたように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなＢＬＯＳＵＭ６２値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のＢＬＯＳＵＭ６２値により特徴づけられる。
【０１４２】
ｚａｃｒｐ３ｘ２の特定の変異体が、その対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号２）に対して、９６％以上、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％以上の配列同一性を有することによって特徴づけられ、ここでアミノ酸配列の変動は、１又は複数のアミノ酸置換による。
【０１４３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子における保存性アミノ酸変化が、配列番号１に列挙されるヌクレオチドに代わってヌクレオチドを置換することによって導入され得る。そのような“保存性アミノ酸”変異体は、例えばオリゴヌクレオチド指図された突然変異誘発、リンカー走査突然変異誘発、ポリメラーゼ鎖反応を用いての突然変異誘発及び同様の方法により得られる（Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）ｐａｇｅｓ８−１０〜８−２２； 及びＭｃＰｈｒｓｏｎ（ｅｄ．）， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９１） を参照のこと）。
【０１４４】
本発明のタンパク質はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで成る。天然に存在しないアミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、３，３−ジメチルプロリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界において知られている。
【０１４５】
例えばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてｔＲＮＡをアミノアシル化するための方法は、当業者において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ３０抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。例えば、Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎなど．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１３：２７２２， １９９１； Ｅｌｌｍａｎ など．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０２： ３０１，１９９１； Ｃｈｕｎｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ８０６−０９， １９９３； 及びＣｈｕｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０１４５−４９， １９９３を参照のこと。
【０１４６】
第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたｍＲＮＡ及び化学的にアミノアミル化されたサプレッサ−ｔＲＮＡのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行われる（ Ｔｕｒｃａｔｔｉ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： １９９１−９８， １９９６ ）。 第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する天然に存在しないアミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。
【０１４７】
天然に存在しないアミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Ｋｏｉｄｅ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３３： ７４７０−４６， １９９４を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的に修飾により天然に存在しない種に転換され得る。化学的修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わされ得る（Ｗｙｎｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２： ３９５−４０３， １９９３）。
【０１４８】
限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、ｚａｃｒｐ３ｘ２アミノ酸により置換され得る。
【０１４９】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５， １９８９； Ｂａｓｓなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ｓｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４４９８−５０２， １９９１）， Ｃｏｏｍｂｓ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ， “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ” ，ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ（ｅｄ．） Ｐｐａｇｅｓ ２５９−３１１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８））。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。また、Ｈｉｌｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−５７０８， １９９６を参照のこと。
【０１５０】
ｚａｃｒｐ３ｘ２受容体結合ドメインの位置はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造体の物理的分析によっても決定され得る。例えば、ｄｅ Ｖｅｓ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６ （１９９２）， Ｓｍｉｔｈ など．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９ （１９９２）， 及びＷｌｏｄａｖｅｒ など．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９：５９ （１９９２） を参照のこと。さらに、ビオチン又はＦＩＴＣによりラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２は、ｚａｃｒｐ３ｘ２基質及びインヒビターの発現クローニングのために使用され得る。
【０１５１】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ （ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７， １９８８）又はＢｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６，１９８９ ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Ｌｏｗｍａｎ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０ ： １０８３２−１０８３７，１９９１； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９号； Ｈｕｓｅ， ＷＩＰＯ公開ＷＯ ９２／０６２０４号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ など．， Ｇｅｎｅ ４６ ： １４５， １９８６； Ｎｅｒ など．， ＤＮＡ ７ ： １２７， １９８８ ）を包含する。
【０１５２】
開示されるｚａｃｒｐ３ｘ２ヌクレオチド及びポリペプチド配列の変異体は、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０ ： ３８９−９１， １９９４， Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １０７４７−５１， １９９４及びＷＩＰＯ公開ＷＩ９７／２００７８により開示されるように、ＤＮＡ シャフリングを通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体ＤＮＡ分子が、ランダムに導入された点突然変異をもたらす、親ＤＮＡのランダム断片化、続く、ＰＣＲを用いてのアセンブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中に追加の変動性を導入するために、親ＤＮＡのファミリー、例えば異なった種からの対立遺伝子変異体又はＤＮＡを用いて改良され得る。所望する活性の選択又はスクリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変化に対して同時に選択しながら、所望する突然変異について選択することによって、配列の急速な“進化”を提供する。
【０１５３】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。生物学的に活性のポリペプチド又は抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体と結合するポリペプチドをコードする突然変異誘発されたＤＮＡ分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【０１５４】
本発明はまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの“機能的フラグメント”及びそのような機能的フラグメントをコードする分子を包含する。核酸分子の通常の欠失分析は、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードする核酸分子の機能的フラグメントを得るために行われ得る。例示されるように、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子は、一連の欠失を得るためにＢａｌ３ Ｔヌクレアーゼにより消化され得る。エキソヌクレアーゼ消化のための１つの方法は、欠失を導入するためにオリゴヌクレオチド−指図された突然変異誘発を使用し、又は所望するフラグメントの生成を特定するために停止コドンを使用することである。他方ではｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の特定のフラグメントは、ポリメラーゼ鎖反応を用いて合成され得る。
【０１５５】
例示のように、インターフェロンのいずれかの又は両末端での切断に基づいての研究が、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｄｉ Ｍａｒｃｏ， ｐｈａｒｍａｃ． Ｔｈｅｒ． ６６： ５０７ （１９９５） により要約されることにより例示される。さらに、タンパク質の機能的分析のための標準技法は、例えばＴｒｅｕｌｔｅｒなど．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４０： １１３ （１９９３）， Ｃｏｎｔｅｎｔ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓｉ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｋＤａ ２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ”， ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳＩＲ−ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｎｔｅｌｌ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ ６５−７２ （Ｎｉｊｈｏｆｆ １９８７）， Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ， “Ｔｈｅ ＥＧＦ Ｅｎｚｙｍｅ”， ｉｎ Ｃｏｒｔｒｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ， Ｖｏｌ． １， Ｂｏｙｎｔｏｎ など．， （ｅｄｓ．） ｐａｇｅｓ １６９−１９９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）， Ｃｏｕｎａｉｌｌｅａｕ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２９２７０ （１９９５）； Ｆｕｋｕｎａｇａ など．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ２５２９１ （１９９５）； Ｙａｍａｇｕｃｈｉ など．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５０： １２９５ （１９９５）； 及びＭｅｉｓｅｌなど．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ３０： １ （１９９６）により記載される。
【０１５６】
本発明はまた、配列番号２のアミノ配列に比較して、アミノ配列変化を有するｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の機能的フラグメントも企画する。変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、上記のように、配列番号１及び２のヌクレオチド及びアミノ酸配列との同一性のレベルを決定することにより、構造体に基づいて同定され得る。構造体に基づいて変異体遺伝子を同定するもう１つのアプローチは、可能性ある変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードする核酸分子が、上記のように、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズすることができるかどうかを決定することである。
【０１５７】
本発明はまた、本明細書に記載されるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドのエピトープ−担持の部分を含んで成るポリペプチドフラグメント又はペプチドも提供する。そのようなフラグメント又はペプチドは、完全なタンパク質が免疫原として使用される場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部である“免疫原性エピトープを含んで成る。免疫原性エピトープ−担持のペプチドは、標準方法を用いて同定され得る。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ８１： ３９８８， １９８３を参照のこと）。
【０１５８】
対照的に、ポリペプチドフラグメント又はペプチドは、抗体が特異的に結合することができるタンパク質分子の領域である“抗原性エピトープ”を含んで成る。一定のエピトープは、線状又は連続した範囲のアミノ酸から成り、そしてそのようなエピトープの抗原性は、変性剤により破壊されない。タンパク質のエピトープを模倣する比較的短い合成ペプチドがタンパク質に対する抗体の生成を刺激するために使用され得ることは、当業界において知られている（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９： ６６０， １９８３を参照のこと）。従って、本発明の抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドと結合する抗体を生ぜしめるために有用である。
【０１５９】
抗原性エピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも４〜１０個のアミノ酸、少なくとも１０〜１５個のアミノ酸、又は約１５〜約３０個のアミノ酸を含む。そのようなエピトープ−担持のペプチド及びポリペプチドは、本明細書に記載されるように、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドのフラグメント化又は化学的ペプチド合成により生成され得る。さらに、エピトープは、ランダムペプチドライブラリーのファージ表示により選択され得る（例えば、Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５： ２６８， １９９３， 及びＣｏｒｔｅｓｅ など．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７： ６１６， １９９６を参照のこと）。
【０１６０】
エピトープを含んで成る小さなペプチドからエピトープを同定し、そして抗体を生成するための標準の方法は、例えばＭｏｌｅ， “Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １０， Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １０５−１６ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９２）， Ｐｒｉｃｅ， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｄｙｍａｎ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ ６０−８４ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， 及びＣｏｌｉｇａｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ９．３．１−９．３．５ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ９．４．１−９．４．１１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９７）により記載される。
【０１６１】
変異体及び融合タンパク質を包含するいずれかのｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドに関しては、当業者は、上記表１及び２に示される情報を用いて、その変異体をコードする十分な縮重ポリヌクレオチド配列を容易に生成することができる。さらに、当業者は、本明細書に記載されるヌクレオチド及びアミノ酸配列に基づいて、種々のｚａｃｒｐ３ｘ２変異体に標準のソフトウェアを使用することができる。従って、本発明は、次の配列、すなわち配列番号１、２、３、４又は６の少なくとも１つの配列を提供するデータ構造によりコードされるコンピューターに読み取り可能媒体を包含する。
【０１６２】
適切な形のコンピューター読み取り可能媒体は、磁気媒体及び光学的読み取り可能な媒体包含する。磁気媒体の例は、ハード又は固定されたドライブ、ランダムアクセス記憶（ＲＡＭ）チップ、フロッピーディスク、デジタルリニアーテープ（ＤＬＴ）、ディスクカーシ及びＺＩＰディスクを包含する。光学的読み取り可能な媒体は、コンパクトディスク（例えば、ＣＤ−読み取りのみ記憶（ＲＯＭ）、ＣＤ−再書き込みできる（ＲＷ）及びＣＤ−再記録できる）、及びデジタル可転性／ビデオディスク（ＤＶＤ）（例えば、ＤＶＤ−ＲＯＭ， ＤＶＤ−ＲＡＭ及びＤＶＤ＋ＲＷ）により例示される。
【０１６３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質の生成：
ｚａｃｒｐ３ｘ２の融合タンパク質は、組換え宿主においてｚａｃｒｐ３ｘ２を発現するために、そして発現されたｚａｃｒｐ３ｘ２を単離するために使用され得る。下記に記載されるように、特定のｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質はまた、診断及び治療にも使用される。
【０１６４】
１つのタイプの融合タンパク質は、組換え宿主細胞からのｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドを案内するペプチドを含んで成る。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドを、真核細胞の分泌経路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（また、シグナルペプチド、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、ｚａｃｒｐ３ｘ２発現ベクターに供給される。
【０１６５】
分泌シグナル配列はｚａｃｒｐ３ｘ２に由来するが、適切なシグナル配列はまた、もう１つの分泌されたタンパク質から誘導されるか、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、ｚａｃｒｐ３ｘ２−コード配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しく読み取り枠を整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路中に新しく合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるヌクレオチド配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Ｗｅｌｃｈなど．，アメリカ特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄなど．， アメリカ特許第５，１４３，８３０号を参照のこと）。
【０１６６】
ｚａｃｒｐ３ｘ２の分泌シグナル配列又は哺乳類細胞により生成されるもう１つのタンパク質（例えば、アメリカ特許第５，６４１，６５５号に記載されるような組織タイプのプラスミノーゲン活性化因子シグナル配列）は、組換え哺乳類宿主におけるｚａｃｒｐ３ｘ２の発現のために有用であるが、酵母シグナル配列は、酵母細胞における発現のために有用である。適切な酵母シグナル配列の例は、酵母対合現象α−因子（ＭＦα１遺伝子によりコードされる）、インバーターゼ（ＳＵＣ２遺伝子によりコードされる）又は酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ遺伝子によりコードされる）に由来するそれらのものである。例えば，Ｒｏｍａｎｏｓ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ （ｅｄｓ．）， ｐ．１２３−１６７ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） を参照のこと。
【０１６７】
細菌細胞においては、毒性を低め、安定性を高め、そして発現されたタンパク質の回収性を高めるために、異種タンパク質を融合タンパク質として発現することが、しばしば所望される。例えばｚａｃｒｐ３ｘ２は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドを含んで成る融合タンパク質として発現され得る。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、典型的には、可溶性であり、そして固定されたグルタチオンカラム上でＥ． コリ融解物から容易に精製できる。類似するアプローチにおいては、マルトース結合タンパク質ポリペプチドを含んで成るｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質は、アミロース樹脂カラムにより単離され得、そして切断されたタンパク質Ａ遺伝子のＣ−末端を含んで成る融合タンパク質は、ＩｇＧ−セファロースを用いて精製され得る。
【０１６８】
細菌細胞において異種ポリペプチドを、融合タンパク質として発現するために確立された技法は、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ Ｕｓｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ （Ｅｄｓ．）， ｐ．１５−５８ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） により記載される。さらに、市販の発現システムが利用できる。例えば、ＰＩＮＰＯＩＮＴ Ｘａタンパク質精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）は、アビジンを含んで成る樹脂により、発現の間、ビオチニル化されるポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を単離するための方法を提供する。
【０１６９】
原核又は真核細胞により発現される異種ポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、ポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、ｃ−ｍｙｃ標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質Ｐ， ＲＹＩＲＳ 標識（抗−ＲＹＩＲＳ抗体と結合する）、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ標識及びＦＬＡＧ標識（抗−ＦＬＧ抗体と結合する）を包含する。例えば、Ｌｕｏなど．， Ｓｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３２９： ２１５ （１９９６）， Ｍｏｒｇａｎｔｉ など．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３： ６７ （１９９６）， 及びＺｈｅｎｇなど．， Ｇｅｎｅ １８６： ５５ （１９９７） を参照のこと。そのようなペプチド標識コードする核酸分子は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ） から入手できる。
【０１７０】
もう１つの形の融合タンパク質は、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、及び２又は３個の複領域ドメイン及びヒンジ領域を含むが、しかし可変領域を欠いている免疫グロブリンＨ鎖不変領域、典型的なＦｃフラグメントを含んで成る。例示のように、Ｃｈａｎｇ など．， （アメリカ特許第５，７２３，１２５号） は、ヒトインターフェロン及びヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントを含んで成る融合タンパク質を記載する。インターフェロンのＣ−末端は、ペプチドリンカー成分によりＦｃフラグメントのＮ−末端に連結される。
【０１７１】
ペプチドリンカーの例は、免疫学的に不活性であるＴ細胞不活性配列を主に含んで成るペプチドである。そのような融合タンパク質においては、例示的なＦｃ成分は、溶液において安定性であり、そして活性を活性化する補体をほとんど有さないか又は完全に有さないヒトγ４鎖である。従って、本発明はｚａｃｒｐ３ｘ２成分及びヒトＦｃフラグメントを含んで成るｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質を企画し、ここで前記ｚａｃｒｐ３ｘ２成分のＣ−末端は、ペプチドリンカー、例えば配列番号４のアミノ酸配列から成るペプチドを通してＦｃフラグメントのＮ−末端に結合される。ｚａｃｒｐ３ｘ２成分は、ｚａｃｒｐ３ｘ２分子又はそのフラグメントであり得る。
【０１７２】
もう１つの態様においては、ｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質は、ＩｇＧ配列、ＩｇＧ 配列のアミノ酸末端に共有結合されるｚａｃｒｐ３ｘ２成分、及びｚａｃｒｐ３ｘ２のアミノ酸末端に共有結合されるシグナルペプチドを含んで成り、ここで前記ＩｇＧ配列は、次の順序での次の要素から成る：ＣＨ_２ドメイン及びＣＨ_３ドメイン。従って、ＩｇＧ配列はＣＨ_１ドメインを欠いている。ｚａｃｒｐ３ｘ２成分は、本明細書に記載されるように、ｚａｃｒｐ３ｘ２活性、例えばｚａｃｒｐ３ｘ２抗体と結合する能力を示す。抗体及び非抗体部分の両者を含んで成る融合タンパク質を生成するこの一般的なアプローチは、ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅなど．， ヨーロッパ特許第７４２８３０号（ＷＯ９５／２１２５８号）により記載されている。
【０１７３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２成分及びＦｃ成分を含んで成る融合タンパク質は、インビトロアッセイ手段として使用され得る。例えば、生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２インヒビターの存在は、ｚａｃｒｐ３ｘ２−抗体融合タンパク質を用いて検出され得、ここでｚａｃｒｐ３ｘ２成分は、基質又はインヒビターを標的化するために使用され、そして高分子、例えばタンパク質Ａ又は抗−Ｆｃ抗体は、結合されたタンパク質−受容体複合体を検出するために使用される。さらに、そのような融合タンパク質は、ｚａｃｒｐ３ｘ２及び基質の結合を妨害する分子を同定するために使用され得る。
【０１７４】
融合タンパク質は、その融合タンパク質の個々の成分を調製し、そしてそれらを化学的に接合することによって、当業者に知られている方法により調製され得る。他方では、正しく読み取り枠を整合して融合タンパク質の両成分をコードするポリヌクレオチドは、既知の技法を用いて生成され、そして本明細書に記載される方法により発現され得る。融合タンパク質の酵素的及び化学分解のための一般的な方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ（１９９５）、ｐ． １６−１９〜１６−２５により記載される。 ｚａｃｒｐ３ｘ２類似体及びｚａｃｒｐ３ｘ２インヒビター：
【０１７５】
１つの一般的な種類のｚａｃｒｐ３ｘ２類似体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列の突然変異であるアミノ酸配列を有する変異体である。もう１つの一般的種類のｚａｃｒｐ３ｘ２類似体は、下記のように、抗−イディオタイプ抗体及びそのフラグメントにより供給される。さらに、抗−イディオタイプの可変ドメインを含んで成る組換え抗体が、類似体として使用され得る（例えば、Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉなど．， ｐｒｏｃ． Ａｓｓｏｃ． Ａｍ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ １０８： ４２０ （１９９６） を参照のこと）。抗−イディオタイプｚａｃｒｐ３ｘ２抗体の可変ドメインはｚａｃｒｐ３ｘ２を模倣するので、それらのドメインは、ｚａｃｒｐ３ｘ２結合活性を提供することができる。、抗−イディオタイプ触媒性抗体を生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Ｊｏｒｏｎなど．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６７２：２１６（１９９２）， Ｆｒｉｂｏｕｌｅｔなど．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４７：２２９（１９９４），及びＡｖａｌｌｅなど．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．８６４：１１８（１９９８）を参照のこと）。
【０１７６】
ｚａｃｒｐ３ｘ２類似体を同定するもう１つのアプローチは、結合ライブラリーの使用により提供される。ファージ表示及び他の結合ライブラリーを構成し、そしてスクリーニングする方法は、例えばＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｖｅｒｄｉｎｅ， アメリカ特許第５，７８３，３８４号、Ｋａｙ， など．， アメリカ特許第５，７４７， ３３４号及びＫａｕｆｆｍａｎなど．， アメリカ特許第５，７２３，３２３号号により提供される。
【０１７７】
溶液インビトロアッセイはｚａｃｒｐ３ｘ２基質又はインヒビターを同定するために使用され得る。固相システムはまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの基質又はインヒビターを同定するために使用され得る。例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド又はｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質は、市販のバイオセンサー装置の受容体チップの表面上に固定され得る（ＢＬＡＣＯＲＥ， Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ； ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）。この装置の使用は、例えばｋａｒｌｓｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４５：２２９ （１９９１）、及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４：５５４ （１９９３） により開示される。
【０１７８】
手短には、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド又は融合タンパク質は、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、共有結合される。次ぎに、試験サンプルが、細胞を通して通される。ｚａｃｒｐ３ｘ２基質又はインヒビターがサンプルに存在する場合、それは固定されたポリペプチド又は融合タンパク質に結合し、培地の屈折率の変化を引き起こし、これが金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。このシステムは、結合親和性が計算され得るオン−及びオフ−速度の測定、及び結合の化学量論、及びｚａｃｒｐ３ｘ２突然変異の運動学的効果の評価を可能にする。このシステムはまた、抗体−抗原相互作用、及び他の補体／抗−補体対の相互作用を試験するためにも使用され得る。
【０１７９】
培養された細胞におけるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの生成：
十分な長さのポリペプチド、機能的フラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、組換え宿主細胞において生成され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を発現するためには、ポリペプチドをコードする核酸分子が、発現ペプチドにおいて転写発現を制御し、そして次に、宿主細胞中に導入される調節配列に作用可能に連結されるべきである。転写調節配列、例えばプロモーター及びエンハンサーの他に、発現ベクターは、翻訳調節配列、及び発現ベクターを担持する細胞の選択のために適切なマーカー遺伝子を包含することができる。
【０１８０】
真核細胞において外来性タンパク質の生成のために適切である発現ベクターは、典型的には、（１）細胞宿主における発現ベクターの増殖及び選択を提供するための細菌複製起点及び抗生物質耐性マーカーをコードする真核ＤＮＡ要素；（２）転写の開始を制御する真核ＤＮＡ要素、例えばプロモーター；及び（３）転写体のプロセッシングを制御するＤＮＡ要素、例えば転写終結／ポリアデニル化配列を含む。上記で論じられたように、発現ベクターはまた、異種ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路中に方向づける分泌配列コードするヌクレオチド配列を包含する。例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２発現ベクターは、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子、及びｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子及びもう１つの分泌された遺伝子に由来する分泌配列を含むことができる。
【０１８１】
本発明のｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質は、哺乳類細胞において発現され得る。適切な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８７）、ヒト胚腎細胞（２９３−ＨＥＫ； ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）、子供のハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１， ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ８５４４， ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０３１４）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１； ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１； ＣＨＯ ＤＧ４４ ［Ｃｈａｓｉｎなど．， Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １２： ５５５ （１９８６）］、ラット下垂体細胞（ＣＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５４８）、ＳＶ４０−形質転換されたモンキー腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）及びネズミ胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５８）を包含する。
【０１８２】
哺乳類宿主に関しては、転写及び翻訳シグナルは、ウィルス源、例えばアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サルウィルス又は同様のものに由来することができ、ここで調節するシグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子に関連している。適切な転写及び翻訳調節配列はまた、哺乳類遺伝子、例えばアクチン、コラーゲン、ミコシン及びメタロチオネイン遺伝子から得られる。
【０１８３】
転写調節配列は、ＲＮＡ合成の開始を方向づけるために十分なプロモーター領域を含む。適切な真核プロモーターは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒなど．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ２７３ （１９８２））、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ３１ ： ３５５ （１９８２））、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔなど．， Ｎａｔｕｒｅ ２９０： ３０４ （１９８１））、Ｒｏｕｓ肉腫ウィルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ６７７７ （１９８２））、サイトメガロウィルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇなど．， Ｇｅｎｅ ４５： １０１ （１９８０））及びマウス乳腫瘍ウィルスプロモーター（一般的には、Ｅｔｃｈｅｖｅｒｒｙ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｌｅｌａｎｄ など．， （ｅｄｓ．）， ｐ． １６３−１８１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６）を参照のこと）を包含する。
【０１８４】
他方では、原核プロモーター、例えばバクテリオファージＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、その原核プロモーターが真核プロモーターにより調節される場合、哺乳類細胞におけるｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現を制御するために使用され得る（Ｚｈｏｕなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０： ４５２９ （１９９０）， 及びＫａｕｋａｍａｎなど．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４４８５ （１９９１） を参照のこと）。
【０１８５】
発現ベクターは、種々の標準の技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクト−介在性供給、エレクトロポレーション及び同様のものを用いて、宿主細胞中に導入され得る。好ましくは、トランスフェクトされた細胞が選択され、そして増殖され、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞が供給される。真核細胞中にベクターを導入するための技法、及び優性選択マーカーを用いてのそのような安定した形質転換体を選択するための技法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ （１９９５） 及びＭｕｒｒａｙ （ｅｄ．）， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９１） により記載される。
【０１８６】
例えば、１つの適切な選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性を付与する遺伝子である。この場合、選択は、ネオマイシン型薬物、例えばＧ−４１８又は同様のもの存在下で実施される。“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
【０１８７】
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。変更された表現型を導入する他のマーカー、例えば緑色蛍光タンパク質、又は細胞表面タンパク質、例えばＣＤ４， ＣＤ８，クラスＩ ＭＨＣ、胎盤アルカリホスファターゼが、ＦＡＣＳ分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トランスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するために使用され得る。
【０１８８】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドはまた、ウィルス供給システムを用いて、培養された哺乳類細胞により生成され得る。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは現在、異種核酸の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（Ｂｅｃｋｅｒ など．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４３： １６１−８９， １９９４； 及びＪ． Ｔ． Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｄ．Ｔ． Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４： ４４−５３， １９９７ を参照のこと）。アデノウィルスシステムの利点は、比較的大きなＤＮＡ挿入体の収容、高い力価に増殖する能力、広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び異なったプロモーターを含む多数の入手できるベクターとの使用を可能にする柔軟性を包含する。
【０１８９】
アデノウィルスゲノムの一部を欠失することによって、異種ＤＮＡの大きな挿入体（７ｋｂまでの）が収容され得る。それらの挿入体は、直接的な連結により、又はトランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に導入され得る。ＥＩ遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製の無能性をもたらす、ウィルスベクターからの必須ＥＩ遺伝子を欠失することは任意である。例えば、アデノウィルスベクター−感染されたヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＲＬ−１５７３， ４５５０４， ４５５０５）は、有意な量のタンパク質を生成するために比較的高い細胞密度で、付着細胞として、又は懸濁培養物において増殖され得る（Ｇａｒｎｉｅｒなど．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５： １４５ （１９９４） を参照のこと）。
【０１９０】
ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子はまた、他の高等真核細胞、例えば鳥類、菌類、昆虫、酵母、又は植物細胞においても発現され得る。バキュロウィルスシステムは、昆虫細胞中に、クローン化されたｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を導入するための効果的な手段を提供する。適切な発現ベクターは、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ） 核多角体病ウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）に基づかれており、そして良く知られているプロモーター、例えばショウジョウバエ熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）７０プロモーター、オートグラファ・カルホルニカ核多角体病ウィルス即時−初期遺伝子プロモーター（ｉｅ−Ｉ）及び遅延された初期３９Ｋ プロモーター、バキュロウィルスｐ１０プロモーター及びジョウジョウバエメタロチオネインプロモーターを含む。組換えバキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Ｌｕｃｋｏｗ （ Ｌｕｃｋｏｗ， ＶＡ， など．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６７： ４５６６−７９， １９９３ ） により記載されるトランスポゾンに基づくシステムを利用する。
【０１９１】
トランスファーベクターを利用するこのシステムは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ^ＴＭキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）として市販されている。このシステムは、“ｂａｃｍｉｄ” と呼ばれる大きなプラスミドとして、Ｅ．コリに維持されるバキュロウィルスゲノム中に、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドをコードするＤＮＡを移動せしめるために、Ｔｎ７トランスポゾンを含むトランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃＩ ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）を利用する。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１９２】
さらに、トランスファーベクターは発現されたｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドのＣ−又はＮ−末端でエピトープ標識、例えばＧｌｕ−Ｇｌｕ エピトープ標識をコードするＤＮＡとのイン−フレーム融合体を含むことができる（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ， Ｔ． など．， Ｐｅｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ７９５２−６， １９８５）。当業界において知られている技法を用いて、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を含むトランスファーベクターにより、Ｅ．コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示である断続的ｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄａ についてスクリーンされる。組換えバキュロウィルスゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡ が、通常の技法を用いて単離される。
【０１９３】
例示的なＰＦＡＳＴＢＡＣベクターは、相当の程度まで修飾され得る。例えば、前記ポリヒドリンプロモーターは、除去され、そしてバキュロウィルス感染において早めに発現され、そして分泌されたタンパク質を発現するために好都合であることが知られているバキュロウィルス塩基性タンパク質プロモーター（また、Ｐｃｏｒ， ｐ６．９又はＭＰプロモーターとしても知られている）により置換され得る。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｒ．Ｄ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ９７１−６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ， Ｂ．Ｃ． など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５： １５５１−６， １９９４； 及びＣｈａｚｅｎｂａｌｋ， Ｇ． Ｄ．， ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｂ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７０： １５４３−９，１９９５ を参照のこと。
【０１９４】
そのようなトランスファーベクター構造体においては、塩基性タンパク質プロモーターの短いか又は長いバージョンが使用され得る。さらに、昆虫タンパク質に由来する分泌シグナル配列により天然のｚａｃｒｐ３ｘ２分泌シグナル配列を置換しているトランスファーベクターが構成さえ得る。例えば、エクジステロイド・グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＧＴ）、ミツバチＭｅｌｉｔｔｉｎ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ） 又はバキュロウィルスｇｐ６７（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）からのシグナル配列は、生来のｚａｃｒｐ３ｘ２分泌シグナル配列を置換するために、構造体に使用され得る。
【０１９５】
組換えウィルス又はｂａｃｍｉｄは、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される。適切な昆虫宿主細胞は、ＩＰＬＢ−Ｓｆ−２１に由来する細胞系、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）さなぎ卵巣細胞系、例えばＳｆ９ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）、Ｓｆ２１ＡＥ及びＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ； Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、及びショウジョウバエＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞、並びにトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）に由来するＨＩＧＨ ＦＩＶＥＯ 細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を包含する（アメリカ特許第５，３００，４３５号）。
【０１９６】
市販の血清フリー培地が、細胞の増殖及び維持のために使用され得る。適切な培地は、Ｓｆ９細胞に関しては、Ｓｆ９００ＩＩ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） 又はＥＳＦ９２１^ＴＭ （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；及びトリコプルシア・ニ細胞に関しては、Ｅｘ−ｃｅｌｌＯ４０５^ＴＭ （ＪＲＨ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ） 又はＥｘｐｒｅｓｓ ＦｉｖｅＯ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を包含する。組換えウィルスが使用される場合、細胞は典型的には、組換えウィルスストックが０．１〜１０、より典型的には、約３の感染の多重度（ＭＯＩ）で添加される地点で、約２〜５×１０^５個の細胞１〜２×１０^６個の細胞の接種密度で触媒される。
【０１９７】
バキュロウィルスでの組換えタンパク質を生成するための確立された技法は、Ｂａｉｌｅｙなど．， “Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ７： Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｕｒｒａｙ （ｅｄ．）， Ｐ． １４７−１６８ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， （ｎｃ． １９９１） により、Ｐａｔｅｌ など．， “Ｔｈｅ ｂｕｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ”， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｉｎｇ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など．， （ｅｄｓ．） ｐ．２０５−２４４ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） により、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ｐ．１６−３７〜１６−５７により、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５） により、及びＬｕｃｋｎｏｗ， “Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐ．１８３−２１８ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６） により提供される。
【０１９８】
菌類細胞、例えば酵母細胞はまた、本明細書に開示される遺伝子を発現するためにも使用され得る。これに関して、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピチア・メタノリカ（ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ） を包含する。酵母における発現のための適切なプロモーターは、ＧＡＬ１（ガラクトース）、ＰＧＫ（ホスホグリセリンキナーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）及び同様のものからのプロモーターを包含する。
【０１９９】
外因性ＤＮＡによりＳ． セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばＫａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ など．， アメリカ特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ， アメリカ特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈなど．， アメリカ特許第５，０３７，７４３号；及びＭｕｒｒａｙ など．， アメリカ特許第４，８４５，０７５号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【０２００】
サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Ｋａｗａｓａｋｉ など． （アメリカ特許第４，９３１，３７３号）により開示されるＰＯＴ１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ， アメリカ特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど．， アメリカ特許第４，６１５，９７４号；及びＢｉｔｔｅｒ， アメリカ特許第４，９７７，０９２ 号を参照のこと）及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第４，９９０，４４６ 号；第５，０６３，１５４号；第５，１３９，９３６ 号；及び第４，６６１，４５４号を参照のこと。
【０２０１】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ）、クルイベリミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ）、ウスチラゴ・マイジス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ）、ピチア・パストリス（ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア・グイレルモンジ（ Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、及びカンジタ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【０２０２】
例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２： ３４５９−３４６５， １９８６ 及びＣｒｅｇｇ， アメリカ特許第４，８８２，２７９ 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Ｍｃｋｎｉｇｈｔ など．，アメリカ特許第４，９３５，３４９号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）を形質転換するための方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ．， アメリカ特許第５，１６２，２２８号により開示される。ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）を形質転換するための方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ， アメリカ特許第４，４８６，５３３号により開示される。
【０２０３】
例えば、組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、Ｒａｙｍｏｎｄ、アメリカ特許第５，７１６，８０８号、Ｒａｙｍｏｎｄ、アメリカ特許第５，７３６，３８３号、Ｒａｙｍｏｎｄなど．，Ｙｅａｓｔ １４： １１−２３ （１９９８）、及びＷＩＰＯ公開ＷＯ９７／１７４５０， ＷＯ９７／１７４５１、ＷＯ９８／０２５３６及びＷＯ９８／０２５６５に開示される。Ｐ．メタノリカの形質転換に使用するためのＤＮＡ分子は通常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろう。Ｐ．メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプロモーター及びターミネーターは、Ｐ．メタノリカ遺伝子、例えばＰ．メタノリカ アルコール利用遺伝子（ＡＵＧ１又はＡＵＧ２）のものであることが好ましい。
【０２０４】
他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（ＤＨＡＳ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＭＤ）、及びカタラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子のものを包含する。宿主染色体中へのＤＮＡの組み込みを促進するためには、宿主ＤＮＡ配列を両端に有するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア メタノリカへの使用のための例示的な選択マーカーは、アデニンの不在下でａｄｅ２宿主細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ＡＩＲＣ； ＥＣ． ４．１．１．２１）をコードするＰ．メタノリカＡＤＥ２遺伝子である。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メタノール利用遺伝子（ＡＵＧ１及びＡＵＧ２）が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。
【０２０５】
分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（ＰＥＰ４及びＰＲＢ１）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、Ｐ．メタノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするＤＮＡを含むプラスミドの導入を促進するために使用される。２．５〜４．５ｋＶ／ｃｍ，好ましくは約３．７５ｋＶ／ｃｍの電場の強さ、及び１〜４０ｍ秒、最も好ましくは約２０ｍ秒の時定数（ｔ）を有する、指数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりＰ．メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。
【０２０６】
発現ベクターはまた、植物プロトプラスト、損なわれていない植物組織又は単離された植物細胞中にも導入され得る。植物組織中に発現ベクターを導入するための方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、マイクロプロジェクティル−介在性供給、ＤＮＡ注射、エレクトロポレーション及び同様のものによる植物組織の直接的な感染又はそれらと共にｓ植物細胞の同時培養を包含する。例えば、Ｈｏｒｓｃｈなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９ （１９９５）、Ｋｌｅｉｎなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ２６８ （１９９２） 及びＭｉｋｉなど．， “Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｌｉｃｋ など． （ｅｄｓ．）， Ｐ．６７−８８ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３） を参照のこと。
【０２０７】
他方では、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、原核宿主細胞において発現され得る。原核細胞においてｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドを発現するために使用され得る適切なプロモーターは、当業者に良く知られており、そしてＴ４， Ｔ３， Ｓｐ６及びＴ７ポリメラーゼを認識できるプロモーター、バクテリオファージλのＰ_Ｒ及びＰ_Ｌプロモーター、Ｅ．コリのｔｒｐ， ｒｅｃＡ， 熱ショック、ｌａｃＵＶ５， ｔａｃ， ｌｐｐ−ｌａｃＳｐｒ， ｐｈｏＡ及びｌａｃＺプロモーター、Ｂ．スブチリスのプロモーター、バチルスのバクテリオファージのプロモーター、ストレプトミセスプロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のｂｌａプロモーター及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターを包含する。原核プロモーターは、Ｇｌｉｃｋ， Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １： ２７７ （１９８７）， Ｗａｔｓｏｎなど．， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， ４^ｔｈ Ｅｄ． （Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃｕｍｍｉｎｓ １９８７）， 及びＡｕｓｕｂｅｌなど． （１９９５） により再考されている。
【０２０８】
有用な原核宿主は、Ｅ．コリ及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を包含する。Ｅ．コリの適切な株は、ＢＬ２１ （ＤＥ３）， ＢＬ２１ （ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ， ＢＬ２１ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ， ＤＨ１， ＤＨ４， ＤＨ５， ＤＨ５１， ＤＨ５１Ｆ， ＤＨ５１ＭＣＲ， ＤＨ １０Ｂ， ＤＨ１０Ｂ／ｐ３， ＤＨ１１Ｓ， Ｃ６００， ＨＢ１０１， ＪＭ１０１， ＪＭ１０５， ＪＭ１０９， ＪＭ１１０， Ｋ３８， ＲＲ１， Ｙ１０８８， Ｙ１０８９， ＣＳＨ１８， ＥＲ１４５１及びＥＲ１６４７を包含する（例えば、Ｂｒｏｗｎ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９１） を参照のこと）。バチルス・スブチリスの適切な株は、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０及びＢＩ７０を包含する（例えば、Ｈａｒｄｙ， “Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ”， ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｃｌｏｖｅｒ （ｅｄ．） （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８５） を参照のこと。
【０２０９】
細菌、例えばＥ．コリにおいてｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収され、そして例えばグアニジンイソチオシアネート又はウレアを用いて変性される。次に、変性されたポリペプチドが再生され、そして例えばウレア、及び還元された及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶液に対する透析により、前記変成体を希釈することによってニ量体化され得る。後者の場合、ポリペプチドは、細胞周辺腔の内容物を開放するために細胞を破壊し（例えば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それにより、変性及び再生のための必要性を回避することができる。
【０２１０】
原核宿主においてタンパク質を発現するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓなど．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など． （ｅｄｓ．）， Ｐ．１５ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， Ｗａｒｄ など．， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐ． １３７ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）， 及びＧｅｏｒｇｉｏｕ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ； Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐ１０１ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６） を参照のこと）。
【０２１１】
細菌、酵母、昆虫及び植物細胞中に発現ベクターを導入するための標準方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） により提供される。哺乳類細胞系により生成される外来性タンパク質を発現し、そして回収するための一般的方法は、例えばＥｔｃｈｅｖｅｒｒｙ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ “ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｌｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐ１６３ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６） により提供される。
【０２１２】
細菌系により生成されるタンパク質を回収するための標準技法は、例えばＧｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ など．， “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｖｅｒ−Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ｃｅｌｌｓ “ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など． （ｅｄｓ．）， ｐ．５９−９２ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５） により提供される。バキュロウィルス系から組換えタンパク質を単離するための確立された方法は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５） により記載される。
【０２１３】
他方では、本発明のポリペプチドは、独占的固相合成、部分固相方法、フラグメント縮合又は従来の溶液合成により合成され得る。それらの合成方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５： ２１４９ （１９６３）， Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， （Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． １９８４）， Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｒａｐｐ， Ｃｈｅｍ． Ｐｅｐｔ． ３．３ （１９８６）． Ａｔｈｅｒｔｏｎ など．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９）． Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｗｉｃｋ， “Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）， 及び Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ など．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７）を参照のこと）。
【０２１４】
全体的な化学合成方法、例えば“生来の化学的連結”及び“発現されたタンパク質連結”における変動性もまた標準である（例えば、Ｄａｗｓｏｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６： ７７６ （１９９４）， Ｈａｃｋｅｎｇなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９４： ７８４５ （１９９７）， Ｄａｗｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８７： ３４ （１９９７）， Ｍｕｉｒ など．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９５： ６７０５ （１９９８），及び Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ ａｎｄ Ｍｕｉｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １６２０５ （１９９８）を参照のこと）。
【０２１５】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの単離：
本発明のポリペプチドは、汚染性高分子、特に他のタンパク質及び核酸に対して、少なくとも約８０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、又は９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして感染性及び発熱性剤を有さない。本発明のポリペプチドはまた、９９．９％以上の純度である医薬的に純粋な状態に精製され得る。特定の製剤においては、精製されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。
【０２１６】
分別及び／又は従来の精製方法は、天然源から精製されたｚａｃｒｐ３ｘ２、及び組換え宿主細胞から精製された組換えｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド及び融合ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの調製物を得るために使用され得る。一般的に、硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出は、サンプルの分別のために使用される。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、ＦＰＬＣ及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。
【０２１７】
ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ及びＱ誘導体が好ましい。典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基により誘導体化されたもの、例えばフェニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ブチル６５０（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＰＡ）、オクチル−Ｓｅｐｈａｒｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、例えばＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ７１ （Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基より変性され得る。
【０２１８】
カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化及びカルボジイミド カップリング化学物質のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。ポリペプチド単離及び精製の特定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８、及びＤｏｏｎａｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９６）を参照のこと。
【０２１９】
ｚａｃｒｐ３ｘ２単離及び精製における追加の変動は、当業者により調節され得る。例えば、下記のようにして得られる抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体は、免疫親和性精製により多量のタンパク質を単離するために使用され得る。
【０２２０】
本発明のポリペプチドは、アニオン及びカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除、及び親和性クロマトグラフィーを包含する方法の組み合わせより単離され得る。例えば、固定された金属イオン吸着（ＩＭＡＣ）クロマトグラフィーが、ヒスチジンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタンパク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金属イオンにより荷電され、キレートが形成される（ Ｓｕｌｋｏｗｓｋｉ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３： １−７， １９８５）。
【０２２１】
ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イオンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして競争溶出、ｐＨの低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう。他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Ｍ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２， ５２９（１９９０））。本発明のさらなる態様においては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（例えばマルトース−結合タンパク質、ＦＬＡＧ標識、Ｇｌｕ−Ｇｋｕ標識、免疫グロブリンドメイン）の融合体が、精製を促進するために構成され得る。
【０２２２】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド又はそのフラグメントはまた、下記のようにして、化学合成を通して調製され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり得；グリコシル化されても、又はグリコシル化されなくても良く；ＰＥＧ化されても、又はＰＥＧ化されなくても良く；そして初期メチオニンアミノ酸残基を含むことができるか、又は含まなくても良い。
【０２２３】
本発明はまたｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドがポリマーにより連結される、化学的に修飾されたｚａｃｒｐ３ｘ２組成物を企画する。典型的には、前記ポリマーは、ｚａｃｒｐ３ｘ２接合体が水性環境、例えば生理学的環境において沈殿しないよう水溶性である。適切なポリマーの例は、単一の反応基、例えばアシル化のための活性エステル、又はアルキル化のためのアルデヒドを有する修飾されている１つのポリマーである。この場合、重合化の程度は調節され得る。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノ−（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシ、又はそれらのアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓなど．， アメリカ特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。ポリマーは枝分かれ鎖であっても、又は枝分かれ鎖でなくても良い。さらに、ポリマーの混合物がｚａｃｒｐ３ｘ２接合体を生成するために使用され得る。
【０２２４】
治療のために使用され得るｚａｃｒｐ３ｘ２接合体は、好ましくは医薬的に許容できる水溶性ポリマー成分を含むべきである。適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、モノ−（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシ−ＰＥＧ、アリールオキシ−ＰＥＧ、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ＰＥＧ、トレシルモノメトキシＰＥＧ、ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ビス−スクシンイミジルカーボネートＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物基材のポリマーを包含する。適切なＰＥＧは、約６００〜約６０，０００、例えば５，０００、１２，０００及び２５，０００の分子量を有することができる。ｚａｃｒｐ３ｘ２接合体はまた、そのような水溶性ポリマーの混合物も含むことができる。抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体又は抗−イディオタイプ抗体はまた、水溶性ポリマーと接合され得る。
【０２２５】
本発明は、本明細書に記載されるペプチド又はポリペプチドを含んで成る組成物を企画する。そのような組成物はさらに、キャリヤーを含むことができる。前記キャリヤーは、従来の有機又は無機キャリヤーであり得る。キャリヤーの例は、水、緩衝液、アルコール、ポリエチレングリコール、マクロゲル、ゴマ油、トウモロコシ油及び同様のものを包含する。
【０２２６】
本発明のペプチド及びポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６個、少なくとも９個又は少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を含んで成る。本発明の１つの態様においては、ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列の２０個，３０個，４０個，５０個，１００個又はそれ以上の連続した残基を含んで成る。追加のポリペプチドは、配列番号２のそのような領域のアミノ酸配列の少なくとも１５個，少なくとも３０個，少なくとも４０個，又は少なくとも５０個の連続した残基を含んで成る。そのようなペプチド及びポリペプチドをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ鎖反応プライマー及びプローブとして有用である。
【０２２７】
ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質に対する抗体の生成：
ｚａｃｒｐ３ｘ２に対する抗体は、例えば抗原として、ｚａｃｒｐ３ｘ２発現ベクターの生成物又は天然源から単離されたｚａｃｒｐ３ｘ２を用いて得られる。特に有用な抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体は、ｚａｃｒｐ３ｘ２を、“特異的に結合する”。抗体は、その抗体が次の２つの性質の少なくとも１つを示す場合、特異的に結合すると思われる：（１）抗体が限界レベルの結合活性を伴って、ｚａｃｒｐ３ｘ２に結合し、そして（２）抗体がｚａｃｒｐ３ｘ２に関連するポリペプチドと有意に交差反応しない場合。
【０２２８】
第１の特徴に関しては、抗体は、それらが、１０^６Ｍ^−１又はそれ以上、好ましくは１０^７Ｍ^−１又はそれ以上、より好ましくは１０^８Ｍ^−１又はそれ以上、及び最も好ましくは１０^９Ｍ^−１又はそれ以上の結合親和性（Ｋａ）を伴なって、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合する場合、特異的に結合する。抗体の結合親和性は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ 分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１： ６６０ （１９４９））により、当業者により容易に決定され得る。第２の特徴に関しては、抗体は、それらが、標準のウェスターンブロット分析を用いて、ｚａｃｒｐ３ｘ２を検出するが、しかし現在知られているポリペプチドを検出しない場合、関連するポリペプチドと有意に交差反応しない。既知の関連するポリペプチドの例は、１つのタンパク質ファミリーのメンバーである同じ種からのオルト体及びタンパク質である。
【０２２９】
抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体は、抗原性ｚａｃｒｐ３ｘ２エピトープ−担持ペプチドを用いて生成され得る。本発明の抗原性エピトープ−担持ペプチド及びポリペプチドは、配列番号２内に含まれる、少なくとも９個、又は１５〜約３０個のアミノ酸の配列、又は本明細書に開示されるもう１つのアミノ酸配列を含む。しかしながら、３０〜５０個のアミノ酸、又は本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列までのいずれかの長さのアミノ酸を含む、本発明のアミノ酸配列の大きな部分を含んで成るペプチド又はポリペプチドはまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２と結合する抗体を誘発するためにも有用である。所望には、エピトープ担持ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒において実質的な溶解性を提供するよう選択される（すなわち、前記配列は、比較的親水性の残基を包含し、そして疎水性残基は好ましくは、回避される）。さらに、プロリン残基を含むアミノ酸配列がまた、抗体生成のために所望される。
【０２３０】
例示のように、ｚａｃｒｐ３ｘ２における可能性ある抗原性部位が、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（ＤＮＡＳＴＡＲ；Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のＰＲＯＴＥＡＮプログラム（バージョン３．１４）により実効されるように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ ｍｅｔｈｏｄ， Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， ＣＡＢＩＯＳ ４： １８１， （１９８８） を用いて、同定された。デフォールトパラメーター（ｄｅｆａｕｌｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）が、この分析に使用された。
【０２３１】
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ方法は、タンパク質構造予測のために６種の主要サブルーチンを組合すことによって、可能性ある抗原決定基を予測する。手短には、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ方法、Ｈｏｐｐなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８： ３９２４ （１９８１） が最初に、最大の局部親水性の領域を表すアミノ酸配列を同定するために使用された（パラメーター：平均７個の残基）。第２段階においては、Ｅｍｉｎｉ方法、Ｅｍｉｎなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｇｙ ５５： ８３６ （１９８５） が、表面確立を計算するために使用された（パラメーター：表面決定限界値（０．６）＝１）。第３に、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ方法、Ｋａｒｐｌｕｓ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｔｚ， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ７２： ２１２ （１９８５） が、主鎖柔軟性を予測するために使用された（パラメーター：柔軟性限界値（０．２）＝１）。
【０２３２】
分析の第４及び第５段階においては、二次構造の予測が、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎの方法、Ｃｈｏｕ， “Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｌａｓｓｅｓ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ”， ｉｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｆａｓｍａｎ （ｅｄ．）， ｐ．５４９−５８６ （１９７８） を用いて、データに適用された（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ パラメーター：コンホメーション表＝６４タンパク質；β領域限界値＝１０５；Ｇｒｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎパラメーター：α及びβ決定パラメーター＝０）。
【０２３３】
第６のサブルーチンにおいては、柔軟性パラメーター及び水治療／溶媒接近性因子が、“抗原指数”として呼ばれる表面輪郭値を決定するために組合された。最終的に、ピーク拡大機能が、抗原指数に適用され、内部領域に対する表面領域の移動度に由来する追加の自由エネルギーを計算するために、それぞれのピーク値の２０， ４０， ６０又は８０％を付加することによって主用表面ピークを拡大する。しかしながら、この計算は、ヘリカル領域がほとんど柔軟性になる傾向がないので、ヘリカル領域に存在するいずれかの主用ピークにも適用されなかった。
【０２３４】
組換えｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質、又は天然源から単離されたｚａｃｒｐ３ｘ２に対するポリクローナル抗体は、当業者に良く知られている方法を用いて調製され得る。抗体はまた、Ｂｕｒｒｕｓ ａｎｄ ＭｃＭａｈｏｎ， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２２０： ３６３（１９９５）により記載される方法に類似する、ｚａｃｒｐ３ｘ２−グルタチオントランスフェラーゼ融合タンパク質を用いて生成され得る。ポリクローナル抗体を生成するための一般的な方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ など．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ，” ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｃｏｌｓ （Ｍａｎｓｏｎ， ｅｄ．）， ｐａｇｅｓ １−５ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）， 及びＷｉｌｌｉａｍｓ など．， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ １５ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ １９９５により記載される。
【０２３５】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えばみょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用を通して高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドはまた、融合ポリペプチド、例えばｚａｃｒｐ３ｘ２又はその一部と、免疫グロブリンポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は好都合には、免疫化のために高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は破傷風トキソイド）に結合されるか又は連結され得る。
【０２３６】
ポリクローナル抗体は典型的には、動物、例えば馬、牛、犬、鶏、ラット、マウス、ウサギ、テンジュクネズミ、ヤギ又は羊において生ぜしめられるが、本発明の抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体はまた、ヒトに近い霊長類抗体から誘導され得る。ヒヒにおいて診断的に及び治療的に有用な抗体を生ぜしめるための一般的な技法は、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇなど．， 国際特許出願番号ＷＯ９１／１１４６５号及びＬｏｓｍａｎなど．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６： ３１０， １９９０に見出され得る。
【０２３７】
他方では、モノクローナル抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体が生成され得る。特定抗原に対する囓歯動物モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法により得られる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ など．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５ （１９７５）， Ｃｏｌｉｇａ など．， （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １， ｐａｇｅ ２．５．１−２．６．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）， Ｐｉｃｋｓｌｅｙ など．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ，” ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２： Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｌｏｖｅｒ など． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ ９３ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５を参照のこと）。
【０２３８】
手短には、モノクローナル抗体は、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子生成物を含んで成る組成物をマウスに注射し、血清サンプルを除去することにより抗体生成の存在を確かめ、Ｂ−リンパ球を得るために脾臓を除去し、ハイブリドーマを生成するために前記リンパ球を骨髄腫細胞により融合し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を生成する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を生成するクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離することに得られる。
【０２３９】
さらに、本発明の抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体は、ヒトモノクローナル抗体から誘導され得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗原攻撃に応答して特定のヒト抗体を生成するよう構築されたトランスジェニックマウスから得られる。この技法においては、ヒトＨ鎖及びＬ鎖遺伝子座の要素が、内因性Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子座の標的化された破壊を含む胚幹細胞系に由来するマウス株中に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、そして前記マウスはヒト抗体−分泌性ハイブリドーマを生成するために使用され得る。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎなど．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ７： １３， １９９４， Ｌｏｎｂｅｒｇ など．， Ｎａｔｕｒｅ ３６８： ８５６， １９９４， 及びＴａｙｌｏｒなど．， Ｉｎｃ． Ｉｍｍｕｎ． ６： ５７６， １９９４により記載される。
【０２４０】
モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技法により、ハイブリドーマ培養物から単離され、そして精製され得る。そのような単離技法は、プロテイン−Ａセファロースによる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｐａｇｅ ２．７．１−２．７．１２及びｐａｇｅ ２．９．１＾２．９．３； Ｂａｉｎｅｓなど．，” Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ （ＩｇＧ）”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ， １０， ｐ． ７９−１０４ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９２） を参照のこと）。
【０２４１】
特定の用途に関しては、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体のフラグメントを調製することが所望される。そのような抗体フラグメントは、例えば抗体のタンパク質加水分解により得られる。抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン又はパパイン消化により得られる。例示のように、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２として示される５Ｓフラグメントを供給するためにペプシンによる抗体の酵素分解により生成され得る。このフラグメントはさらに、３．５Ｓ Ｆａｂ’ 単価フラグメントを生成するためにチオール還元剤を用いて分解され得る。
【０２４２】
任意には、その分解反応は、ジスルフィド結合の分解に起因するスルフヒドリル基に関するブロッキング基を用いて行われ得る。他の手段としては、ペプシンを用いての酸素分解が２種の単位Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを直接的に生成する。それらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ， アメリカ特許第４，３３１，６４７号、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ など．， Ａｒｃｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９： ２３０， １９６０， Ｐｏｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ７３： １１９， １９５９， Ｅｄｅｌｍａｎ など．， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １， ｐ． ４２２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）， 及びＣｏｌｉｇａｎ， ｐ． ２．８．１−２．８．１０及び２．１０−２．１０．４により記載される。
【０２４３】
抗体を分解する他の方法、例えば単価Ｌ−Ｈ鎖フラグメントを形成するためへのＨ鎖の分解、フラグメントの追加の分解、又は他の酵素的、化学的又は遺伝的技法がまた、そのフラグメントが損なわれていない抗体により認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
例えば、Ｆｖフラグメントは、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖の会合を含んで成る。この会合は、Ｉｎｂａｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９： ２６５９， １９７２により記載のように、非共有的であり得る。他方では、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合により連結され、又は化学物質、例えばグルテルアルデヒドにより交差結合され得る（例えば、Ｓａｎｄｈｕ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｗ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２： ４３７， １９９２を参照のこと）。
【０２４４】
Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーにより連結されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖を含んで成る。それらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドにより連結されるＶ_Ｈ及びＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含んで成る構造遺伝子を構成することによって調製される。構造遺伝子が、続いて、宿主細胞、例えばＥ．コリ中に導入される発現ベクター中に挿入される。組換え宿主細胞は、２種のＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ＳｃＦｖを生成するための方法は、例えばＷｈｉｔｌｏｗ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｅｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７， １９９１により記載される。Ｂｉｒｄ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３， １９８８， Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８号、Ｐａｃｋなど．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １２７１， １９９３及びＳａｎｄｈｕ， 前記も参照のこと。
【０２４５】
例示のように、ｓｃＦｖは、インビトロで、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質又はペプチドの作用を通して）によって得られる。可能性あるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【０２４６】
前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【０２４７】
そのようなランダム ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，２２３，４０９ 号； Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第４，９４６，７７８ 号；Ｌａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，４０３，４８４ 号及びＬａｄｎｅｒ など．， アメリカ特許第５，５７１，６９８ 号、及びＫａｙなど．， Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６））、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． （Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ） 及びＰｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． （Ｐｉｃｃａｔａｗａｙ， ＭＪ） から市販されている。ランダムペプチド表示ライブラリーは、ｚａｃｒｐ３ｘ２に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示されるｚａｃｒｐ３ｘ２配列を用いてスクリーンされ得る。
【０２４８】
抗体フラグメントのもう１つの形は、単一の相補性−決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（“最小認識単位”）は、興味ある抗体のＤＣＲをコードする遺伝子を構成することによって得られる。そのような遺伝子は、例えば抗体−生成細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためにポリメラーゼ鎖反応を用いることによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ など．， Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６， （１９９１）， Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ など．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ １６６ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， 及びＷａｒｄ など．， “Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｒｃｈ など．， （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅ １３７ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）を参照のこと）。
【０２４９】
他方では、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体は、“ヒト型化”モノクローナル抗体から誘導され得る。ヒト型化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンＨ及びＬ可変鎖からのマウス相補的決定領域を、ヒト可変ドメイン中に移行することにより生成される。次に、ヒト抗体の典型的な残基がネズミ相対物の骨格領域において置換される。ヒト型化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ不変領域の免疫原性に関連する可能性ある問題を回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローン化するための一般的な技法は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３８３３， １９８９により記載される。
【０２５０】
ヒト型化モノクローナル抗体を生成するための技法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ など．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２， １９８６， Ｃａｒｔｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ４２８５， １９９２， Ｓａｎｄｈｕ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｙ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １２： ４３７， １９９２， Ｓｉｎｇｅｒ など．， Ｊ． Ｔｍｍｕｎ． １５０： ２８４４， １９９３， Ｓｕｄｈｉｒ （ｅｄ．）， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）， Ｋｅｌｌｅｙ， “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｃｌｅｌａｎｄ など． （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ３９９−４３４ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， 及びＱｕｅｅｎ など．， アメリカ特許第５，６９３，７６２号（１９９７）により記載される。
【０２５１】
ポリクローナル抗−イディオタイプ抗体は、標準技法を用いて、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体又は抗体フラグメントにより動物を免疫化することにより調製され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎなど．， “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌｏｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｐ． １−２ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２） を参照のこと。また、Ｃｏｌｉｇａｎ， 前記、ｐ．２．４．１−２．４．７も参照のこと。他方では、モノクローナル抗−イディオタイプ抗体は、上記の技法により、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体又は抗体フラグメントを免疫原として用いて調製され得る。もう１つの方法として、ヒト型化抗−イディオタイプ抗体又は人間に近い霊長類抗−イディオタイプ抗体が、上記技法を用いて調製され得る。抗−イディオタイプ抗体を調製するための方法は、例えばＩｒｉｅ， アメリカ特許第５，２０８，１４６号， Ｇｒｅｅｎｅなど．， アメリカ特許第５，６３７，６７７号、及びＶａｒｔｈａｋｏｖｉ ａｎｄ Ｍｉｎｏｃｈａ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ ７７： １８７５， （１９９６）により記載される。
【０２５２】
抗−イディオタイプｚａｃｒｐ３ｘ２抗体及びｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、ｚａｃｒｐ３ｘ２基質及びインヒビターを同定し、そして単離するための使用され得る。例えば、本発明のタンパク質及びペプチドは、カラム上に固定され、そしてカラム上を流動する生物学的サンプルからの基質及びインヒビタータンパク質を結合するために使用され得る（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎなど． （ｅｄｓ．）， Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｐａｇｅｓ １９５−２０２ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９２））。
【０２５３】
放射性ラベルされた又は親和性ラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドはまた、生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２基質及びインヒビターを同定するか又は局部制限するために使用され得る（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ｖｏｌ． １８２， Ｐａｙｅｓ ７２１−３７ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）； Ｂｒｕｎｎｅｒなど．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２： ４８３ （１９９３）； Ｆｅｄａｎなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３３： １１６７ （１９８４） を参照のこと）。
【０２５４】
ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現を検出しそしてｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子構造を試験するためへのｚａｃｒｐ３ｘ２ヌクレオチド配列の使用：
核酸分子は、生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の発現を検出するために使用され得る。そのようなプローブ分子は、配列番号１のヌクレオチド配列、又はそのフラグメントを含んで成る二本鎖核酸分子、及び配列番号１のヌクレオチド配列の補体、又はそのフラグメントを有する１本鎖核酸分子を包含する。プローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。
【０２５５】
基本的アッセイにおいては、一本鎖プローブ分子が、プローブと標的ｚａｃｒｐ３ｘ２ ＲＮＡ種との間の塩基対合を促進する、温度及びイオン強度の条件下で、生物学的サンプルから単離されたＲＮＡと共にインキュベートされる。末結合のプローブをハイブリダイズされた分子から分離した後、ハイブリッドの量が検出される。
【０２５６】
ＲＮＡ検出の十分に確立されたハイブリダイゼーション方法は、ノザン分析及びドット／スロット ブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ 前記、ｐ４−１〜４−２７、及びＷｕなど． （ｅｄｓ．）、”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ＲＮＡ Ｌｅｖｅｌ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐ． ２２５−３９， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９７を参照のこと）。核酸プローブは、放射性同位体、例えば^３２Ｐ又は^３５Ｓにより検出できるようラベルされ得る。
【０２５７】
他方では、ｚａｃｒｐ３ｘ２ ＲＮＡは、非放射性ハイブリダイゼーション方法により検出され得る（例えば、Ｉｓａａｃ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９３を参照のこと）。典型的には、非放射能性検出は、クロモゲン又は化学ルミネセンス基質の酵素転換により達成される。例示的な非放射性成分は、ビオチン、フルオレセイン及びジゴキシゲニンを包含する。
【０２５８】
ｚａｃｒｐ３ｘ２オリゴヌクレオチドプローブはまた、インビボ診断のためにも有用である。例示として、^１６Ｆ−ラベルされたオリゴヌクレオチドが対象に投与され、そして陽電子射出断層撮影法により可視可され得る（Ｔａｖｉｔｉａｎ など．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４： ４６７， １９９８）。
【０２５９】
多くの診断方法は、検出方法の感度を高めるために、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を利用する。ＰＣＲを実施するための標準技法は良く知られている（一般的には、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９１； Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ．）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９３； Ｃｏｔｔｅｒ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９６； Ｈａｎａｕｓｅｋ ａｎｄ Ｗａｌａｓｚｅｄ （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９８； Ｌｏ （ｅｄ．）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＣＲ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９８及びＭｅｌｔｚｅｒ （ｅｄ．）， ＰＣＲ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９８を参照のこと）。
【０２６０】
診断アッセイについてのＰＣＲの１つの変法は、逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である。ＲＴ−ＰＣＲ技法においては、ＲＮＡが生物学的サンプルから単離され、ｃＤＮＡに逆転写され、そしてそのｃＤＮＡがｚａｃｒｐ３ｘ２プライマーと共にインキュベートされる（例えば、Ｗｕなど． （ｅｄｓ．）， “Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃＤＮＡ ｏｒ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＰＣＲ”， ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐ． １５−２８， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９７を参照のこと）。次に、ＰＣＲが行われ、そして生成物が標準技法を用いて分析される。
【０２６１】
例示のように、ＲＮＡは、例えば上記グアニジニウム−チオシアネート細胞溶解を用いて、生物学的サンプルから単離される。他方では、固相技法が、細胞溶解物からｍＲＮＡを単離するために使用され得る。逆転写反応は、ランダムオリゴヌクレオチド、ｄＴの短いホモポリマー、又はｚａｃｒｐ３ｘ２アンチセンスオリゴマーを用いて、単離されたＲＮＡにより感作され得る。オリゴ−ｄＴプライマーは、対照の標的配列を提供することができる種々のｍＲＮＡヌクレオチド配列が増幅される利点を提供する。ｚａｃｒｐ３ｘ２配列は、典型的には２０個の長さの塩基である２種のフランキングオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応により増幅される。
【０２６２】
ＰＣＲ増幅方法は、種々のアプローチを用いて検出され得る。例えば、ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動により分別され、そして臭化エチジウム染色により可視化される。他方では、分別されたＰＣＲ生成物は、膜に移行され、検出できるようにラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２プローブによりハイブリダイズされ、そしてオートラジオグラフィーにより試験され得る。追加の他のアプローチは、化学ルミネセンス検出及びＣ−ＴＲＡＫ比色アッセイを提供するために、ジゴキシゲニンによりラベルされたデオキシリボ核酸三ミリ酸の使用を包含する。
【０２６３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２発現の検出のためのもう１つのアプローチは、サイクリングプローブ技法（ＣＰＴ）であり、ここで一本鎖ＤＮＡ標的物が過剰のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラプローブと結合し、複合体を形成し、ＲＮＡ部分がＲＮアーゼＨにより分化され、そして分解されたプローブの存在が検出される（例えば、Ｂｅｇｇｓなど．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４： ２９８５， １９９６， 及び Ｂｅｋｋｕｏｕｉなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０： ２４０， １９９６を参照のこと）。ｚａｃｒｐ３ｘ２配列の検出のための他の方法は、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、交差ハイブリダイゼーションによる鋳型の協同増幅（ＣＡＴＣＨ）及びリガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）のようなアプローチを利用することができる（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌなど．， アメリカ特許第５，６８６，２７２号（１９９７）、Ｄｙｅｒなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６０： １６１， １９９６； Ｅｈｒｉｃｈｔなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４３： ３５８， １９９７； 及びＣｈａｄｗｉｃｋなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０：５９， １９９８を参照のこと）。他の標準方法も当業者に知られている。
【０２６４】
ｚａｃｒｐ３ｘ２プローブ及びプライマーはまた、組織サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現を検出し、そして位置決定するためにも使用され得る。そのような現場ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｃｈｏｏ （ｅｄ．）， Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９４； Ｗｅ など． （ｅｄｓ．）， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｏｒ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｍＲＮＡ ｂｙ Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＲＩＳＨ）， “ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ２５９−２７８， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９７； 及びＷｕなど． （ｅｄｓ．）， “Ｌｏｃａｌｉｚａｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ ｍＲＮＡ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＲＩＳＨ），” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ２７９−２８９， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９７を参照のこと）。
【０２６５】
種々の追加の診断アプローチも当業者に良く知られている（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９１； Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９６； 及びＥｌｌｅｓ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９６を参照のこと）。
【０２６６】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ヌクレオチド配列は、種々の疾病についての連鎖に基づく試験に、及び対象の染色体がｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子に突然変異を含むかどうかを決定するために使用され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子座での検出できる染色体異常性は、異数性、遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位変化及び転移を包含するが、但しそれらだけには制限されない。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を不活性化する遺伝子変更が特に興味あるものである。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子座に関連する逸脱は、分子遺伝子技法、例えば制限フラグメント長さ他型現象（ＲＦＬＰ）分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、増幅−不応性突然変異システム（ＡＲＭＳ）分析、一本鎖コンホメーション多型現象（ＳＳＣＰ）検出、ＲＮアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ（ＦＡＭＡ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る。
【０２６７】
（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９１）， Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５ （１９９５）， Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｅｌｌｅｓ （ｅｄ．） Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （ｅｄ．）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｂｕｒｒｅｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． ２： Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８）， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）， 及びＲｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｇｅｓ ８３−８８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓａ． Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）
【０２６８】
タンパク質切断試験はまた、翻訳−終結突然変異がコードされたタンパク質の一部のみを生成する、遺伝子の不活性化を検出するために有用である（例えば、Ｓｔｏｐｐａ−Ｌｙｎｎｅｔ など．， Ｂｌｏｏｄ ９１： ３９２０ （１９９８） を参照のこと）。このアプローチによれば、ＲＮＡが生物学的サンプルから単離され、そしてｃＤＮＡを合成するために使用される。
【０２６９】
次に、ＰＣＲが、ｚａｃｒｐ３ｘ２標的物配列を増幅し、そしてＲＮＡポリメラーゼプロモーター、翻訳開始配列及びインフレ−ムＡＴＧトリプレットを導入するために使用される。ＰＣＲ生成物が、ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、そして転写体がＴ７−結合された網様体溶解物システムによりインビトロで翻訳される。次に、翻訳生成物が、その翻訳生成物の長さを決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別される。タンパク質切断試験は、例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ｐ．９．１１．１−９．１１．１８ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８） により記載される。
【０２７０】
本発明はまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現のための診断アッセイを行うための又は対象のｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子座を分析するためのキットも企画する。そのようなキットは、核酸プローブ、例えば配列番号１のヌクレオチド配列、又はそのフラグメントを含んで成る二本鎖分子、及び配列番号１のヌクレオチド配列、又はそのフラグメントを有する一本鎖核酸分子を含んで成る。プローブ分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及び同様のものであり得る。キットは、ＰＣＲを行うための核酸プライマーを含んで成る。そのようなキットは、上記核酸診断アッセイを行うためのすべての必要な要素を含むことができる。
【０２７１】
キットは、ｚａｃｒｐ３ｘ２プローブ又はプライマーを含んで成る少なくとももう１つの容器を含むであろう。キットはまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２配列の存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光色素、化学ルミネセント剤、及び同様のものを包含する。
【０２７２】
キットはまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２プローブ及びプライマーがｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現を検出するために使用される、使用者に知られるための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入されている核酸分子が、ｚａｃｒｐ３ｘ２をコードする核酸分子、又はｚａｃｒｐ３ｘ２コードのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する核酸分子のいずれかを検出するために、又はｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子座に関連する染色体配列を分析するために使用され得ることを記載する。その文書の材料は、容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０２７３】
本発明はまた、診断用途に使用される試薬を提供する。例えば、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子、すなわちｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ ＤＮＡ又はＲＮＡ又はその副配列を含んで成るプローブは、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子がヒト染色体、例えば染色体５上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するために使用され得る。ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ０１０６３７号及びＡＣ０１０６３７号）の一部を含むヒトゲノムＤＮＡのフラグメントの注釈に基づけば、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２は、染色体５の５ｐ１２領域に位置する。ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺伝子コピー数変化、異種性の損失（ＬＯＨ）、トランスロケーション、挿入、欠失、制限部位変更及び転位を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２７４】
それらの異常性は、コード配列内、イントロン内、又は上流のプロモーター及び調節領域を包含するフランキング配列内で発生することができ、そしてコード配列内での物理的変更、又は遺伝子発現レベルでの変化として明らかである。そのような異常性は、分子遺伝学的技法、例えば制限フラグメント長さ多型現象（ＲＥＬＰ）分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法を用いることによって、本発明のポリヌクレオチドを用いて検出され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記；Ａｕｓｕｂｅｌ など．， 前記；Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８： ２５５−６５， １９９５）。
【０２７５】
遺伝子位置の正確な知識は、次のような多くの目的のために有用である：１）配列が存在するコンティグの一部であるかどうかの決定及び種々の形、例えばＹＡＣ， ＢＡＣ又はｃＤＮＡクローンにおける追加の周囲遺伝子配列の獲得；２）同じ染色体領域への結合を示す遺伝的な疾病についての可能な候補体遺伝子の提供；及び３）特定遺伝子が有する機能の決定を助けるモデル生物、例えばマウスの相互参照。
【０２７６】
ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子は、染色体５の５ｐ１２領域に領域に位置する。既知機能のいくつかの遺伝子は、ヒト疾病に連結されるこの領域に位置する。従って、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子は染色体５ｐ１２に位置するので、本発明のｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、染色体５モノソミーの存在及び他の染色体５ｐ１２欠失、及び特に腫瘍に関連する染色体５モノソミー及び欠失、及び５ｐ１２での染色体異常、例えば欠失、転移及び染色体分解点、及びトランスロケーションを検出し、そして診断するために使用され得る。
【０２７７】
従って、本発明のｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子は、この決定的領域に位置するので、本発明のｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、それらの疾病に関連する染色体欠失、トランスロケーション及び転移を検出し、そして診断するために使用され得る。公的に入手できるＷＷＷサーバーに基づいてのヒト染色体５及び５ｐ１２のこの領域については、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ^ＴＭ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ） 遺伝子地図、及びそこにおける文献を参照のこと。それらのすべては、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子と同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝的疾患についての可能な候補体遺伝子として作用する。従って、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０２７８】
診断は、疾病のタイプ及び適切な関連する治療の決定において医者を助けることができるか、又は遺伝的カウンセリングを助けることができる。それ自体、本発明の抗−ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２抗体、ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリペプチド、ｍＲＮＡ又は抗−ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２抗体の検出のために使用され、従って当業界において知られており、そして本明細書において記載される方法を用いて、本明細書に記載されるようにして、遺伝的疾病又は癌の検出のためのマーカーとして作用し、そしてそのために直接的に使用される。
【０２７９】
さらに、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、ヒト疾病、例えば上記に記載されるような疾病に関連する染色体５ｐ１２欠失、染色体５モノソミー及びトランスロケーション、又は悪性又は他の癌における染色体転位に関与することが予測される、腫瘍の悪性進行又は他の５ｐ１２突然変異に関与する他のトランスロケーションに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０２８０】
同様に、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブが、染色体５ｐ１２三染色体性、及びヒト疾病又は自然流産に関連する染色体欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。それらのすべては、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子と同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝性疾病についての可能性ある候補体遺伝子として作用する。従って、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、それらの欠失に関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０２８１】
当業者は、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドが、異種性の欠失（ＬＯＨ）、染色体獲得（例えば、トリソミー）、トランスロケーション、染色体欠失（モノソミー）、ＤＮＡ増幅及び同様のものに関連する全体的な染色体５異常性の診断のために特に有用であることを認識する。ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子が位置する染色体遺伝子座５ｐ１２内のトランスロケーションは、ヒト疾病に関連することが知られている。例えば、５ｐ１２欠失、モノソミー及びトランスロケーションは、上記で論じられたような特定のヒト疾病に関連している。従って、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子はこの決定的領域に位置するので、本発明のｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、上記のような５ｐ１２トランスロケーション、欠失及びトリソミーに関連する異常性又は遺伝子型を検出するために使用され得る。
【０２８２】
上記で論じられるように、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子自体における欠陥は、遺伝性ヒト疾病状態をもたらすことができる。本発明の分子、例えば本発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体は、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子欠陥に関連する疾病の検出、診断予防及び処理を助ける。さらに、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリペプチドプローブは、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２染色体遺伝子座で、疾病又は非疾病の個人間での対立遺伝子差異を検出するために使用され得る。それ自体、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２配列は、法的なＤＮＡプロフィーリングにおける診断として使用され得る。
【０２８３】
一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界において知られている。分析用プローブは一般的に、少なくとも２０個の長さのｎｔを有するが、但し幾分短いプローブも使用され得る（例えば、１４−１７ｎｔ）。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５個の長さのｎｔ、好ましくは１５又はそれ以上の長さのｎｔ、より好ましくは２０−３０個の長さのｎｔである。遺伝子又は染色体ＤＮＡの全体的な分析のために、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブは、完全なエキソン又はそれ以上を含むことができる。
【０２８４】
エキソンは、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２配列（配列番号１又は５）とｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２についてのヒトゲノムＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ０１０６３７号及びＡＣ０１０６３７号）とを比較することによって、容易に決定される。一般的に、患者における遺伝子異常性又は異常型を検出するために遺伝子連鎖分析に使用される診断方法は、当業界に知られている。
【０２８５】
ほとんどの診断方法は、
（ｉ）潜在的に疾病の患者、疾病の患者又は劣性疾病対立遺伝子の可能性ある非疾病キャリヤーから遺伝子サンプルを得；
（ｉｉ）ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより（ここで、前記ポリヌクレオチドは、ＲＦＩＰ分析においては、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）、又は適切なＰＣＲ反応条件下でＰＣＲ反応において、センス及びアンチセンスプライマーと共に遺伝子サンプルをインキュベートすることにより、第１反応生成物を生成し；
【０２８６】
（ｉｉｉ）前記第１反応生物を、電気泳動及び／又は他の既知方法により可視化し、例えば、前記第１反応生成物を、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２ポリヌクレオチドプローブ（ここで、前記ポリヌクレオチドは第１反応の相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう）により可視化し、そして
（ｉＶ）正常又は対照の個人からの遺伝子サンプルの第２対照反応生成物と、前記可視化された第１反応生成物とを比較する段階を含んで成る。
【０２８７】
第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、疾病又は潜在的に疾病の患者における遺伝子異常性の、又は非疾病患者についてのヘテロ接合性劣性キャリヤー表現型の存在の、又は疾病患者からの腫瘍における遺伝子欠陥の存在の、又は胎児又は移植前胚における遺伝子異常性の存在の表示である。例えば、制限フラグメントパターン、ＰＣＲ生成物の長さ、ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子座の反復性配列の長さ、及び同様のもの差異は、遺伝子異常性、遺伝子異常型、又は正常な対照に比較しての対立遺伝子差異の表示である。対照は、サンプルの試験及び利用性に依存して、影響されていないファミリーメンバー又は無関係の個人からであり得る。
【０２８８】
本発明内への使用のための遺伝子サンプルは、患者からのいずれかの組織又は他の生物学的サンプル、例えば血液、唾液、精子、胚細胞、羊水及び同様のもの（但し、それらだけには限定されない）から単離されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを包含する。ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、そして配列番号１又は５の一部、配列番号１又は５の補体、又はそれらのＲＮＡ同等物を含んで成る。ヒト疾病表現型ヘの遺伝子連鎖分析を示すそのような方法は、当業界において良く知られている。
【０２８９】
診断における、ＰＣＲに基づく方法の参照のためには、一般的、次の文献を参照のこと：Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９１）， Ｗｈｉｔｅ （ｅｄ）， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， １９９３）， Ｃｏｔｔｅｒ （ｅｄ）， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｈａｎａｕｓｅｋ ａｎｄ Ｗａｌａｓｚｅｋ （ｅｄｓ．）， Ｔｕｍｏｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ。（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）． Ｌｏ （ｅｄ）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９８）， 及びＭｅｌｔｚｅｒ （ｅｄ）， ＰＣＲ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９８））。
【０２９０】
ｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子座に関連する突然変異は、直接的名突然変異分析のための標準の方法、例えば制限フラグメント長さ他型現象分析、ＰＣＲ技法を用いる短いタンデム反復体分析、増幅−不応性突然変異システム分析、一本鎖コンホメーション多型現象検出、ＲＮアーゼ切断方法、変性グラジエントゲル電気泳動、蛍光−助力のミスマッチ分析、及び当業界において知られている他の遺伝子分析により、本発明の核酸分子を用いて検出され得る。
【０２９１】
（例えば、Ｍａｔｈｅｗ （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９１）， Ｍａｒｉａｎ， Ｃｈｅｓｔ １０８：２５５ （１９９５）， Ｃｏｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｏｎｇａｌｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｅｌｌｅｓ （ｅｄ．） Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６）， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （ｅｄ．）， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６）， Ｂｕｒｒｅｎ など． （ｅｄｓ．）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． ２： Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９９８）， Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ など． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）， 及びＲｉｃｈａｒｄｓ ａｎｄ Ｗａｒｄ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，” ｉｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｐａｇｅｓ ８３−８８ （Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓａ． Ｉｎｃ． １９９８） を参照のこと）
【０２９２】
突然変異についてのｚａｃｒｐ３又はｚａｃｒｐ３Ｘ２遺伝子の直接的な分析は、対象のゲノムＤＮＡを用いて行われ得る。末梢血液リンパ球から得られるゲノムＤＮＡを増幅するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉなど． （ｅｄｓ．）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ａｔ ｐａｇｅ ７．１．６ ｔｏ ７．１．７ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８） を参照のこと）。
【０２９３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質を検出するためへの抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体の使用：
本発明は、ｚａｃｒｐ３ｘ２の存在についてインビトロで生物学的サンプルをスクリーンするためへの抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体の使用を企画する。１つのタイプのインビトロアッセイにおいては、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体が液相において使用される。例えば、生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２の存在は、生物学的サンプルと、微量のラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２及び抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体とを、ｚａｃｒｐ３ｘ２とその抗体との間の結合を促進する条件下で混合することによって試験され得る。
【０２９４】
サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２及び抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２の複合体が、前記複合体を、抗体、例えばＦｃ抗体又はスタフィロコーカスタンパク質Ａと結合する同定されたタンパク質とを接触することによって、反応混合物から分離され得る。生物学的サンプルにおけるｚａｃｒｐ３ｘ２の濃度は、抗体に結合されるラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２の量に反比例し、そして遊離ラベルにされたｚａｃｒｐ３ｘ２の量に直接的に関連する。例示的な試験サンプルは、血液、尿、唾液、組織生検及び検死材料を包含する。
【０２９５】
他方では、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体が固相キャリヤーに結合されるインビトロアッセイが行われ得る。例えば、抗体が、不溶性支持体、例えばポリマー−被覆されたビーズ、プレート又は管に抗体を結合するために、ポリマー、例えばアミノデキストランに結合され得る。他の適切なインビトロアッセイは、当業者に明らかであろう。
【０２９６】
もう１つのアプローチにおいては、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体が、生検検体から調製された組織切片においてｚａｃｒｐ３ｘ２を検出するために使用され得る。そのような免疫化学的検出が、比較的多くのｚａｃｒｐ３ｘ２を決定するために、及び試験される組織におけるｚａｃｒｐ３ｘ２の分布を決定するために使用され得る。一般的な免疫化学的技法は、十分に確立されている（例えば、Ｐｏｎｄｅｒ， “Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍｏｎｋ （ｅｄ．）， ｐａｇｅｓ １１５−３８ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７）， Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ５．８．１−５．８．８， Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５） ａｔ ｐａｇｅｓ １４．６．１ ｔｏ １４．６．１３ （Ｗｉｌｅｙ ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ １９９０）， ａｎｄ Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．）， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． １０： Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｃｏｌｓ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９２） を参照のこと）。
【０２９７】
免疫化学的検出は、生物学的サンプルと抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体とを接触し、そして次に、前記生物学的サンプルと、抗体に結合する検出できるラベルされた分子とを接触せしめることによって行われ得る。例えば、前記検出できるラベルされた分子は、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体に結合する抗体成分を含んで成る。他方では、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体は、アビジン／ストレプタビジン（又はビオチン）により接合され、そして検出できるラベルされた分子はビオチン（又はアビジン／ストレプタビジン）を含むことができる。この基本的技法の多くの変法は、当業者に良く知られている。
【０２９８】
他方では、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体が、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２免疫接合体を形成するために、検出できるラベルにより接合され得る。適切な検出できるラベルは、例えば放射生同位体、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル又はコロイド状金を包含する。そのような検出できるラベルされた免疫接合体の製造及び検出方法は、当業者に良く知られており、そして下記により詳細に記載される。
【０２９９】
検出できるラベルは、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位体であり得る。本発明のために特に有用である同位体は、^３Ｈ， ^１２５Ｉ， ^１３１Ｉ， ^３５Ｓ及び^１４Ｃである。
抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２免疫接合体はまた、蛍光化合物によりラベルされ得る。蛍光ラブルされた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫接合体を暴露し、そして得られる蛍光を検出することによって決定される。蛍光ラベル化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。
【０３００】
他方では、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２免疫接合体は、化合物ルミネセンス化合物に抗体化合物を接合することによって、検出的にラベルされ得る。化学ルミネセンス−標識された免疫接合体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。化学ルミネセンスラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルを包含する。
【０３０１】
同様に、化学ルミネセンス化合物は、本発明の抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２免疫接合体をラベルするために使用され得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高める生物学的システムに見出されるタイプの化学ルミネセンスである。生物ルミネセンスタンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することによって決定される。ラベリングのために有用である生物ルミネセンス化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【０３０２】
他方では、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２免疫接合体は、酵素に抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体化合物を接合することによって検出できるようラベルされ得る。抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２−酵素接合体が適切な基質の存在下でインキュベートされる場合、酵素成分は、分光光度、蛍光又は可視手段により検出され得る化学成分を生成するために基質と反応する。多くの特異的免疫接合体を検出できるようにラベルするために使用され得る酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを包含する。
【０３０３】
当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切なラベルを知っているであろう。抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体へのマーカー成分の結合は、当業界において知られている標準技法を用いて達成され得る。これに関しての典型的な方法論は、Ｋｅｎｎｅｄｙなど．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ７０：１ （１９７６）， Ｓｃｈｕｒｓなど．， Ｃｌｉｍ． Ａｃｔａ ８１：１ （１９７７）， Ｓｈｉｈなど．， Ｉｎｔ’ｌ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１ （１９９０）， ｓｔｅｉｎなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０：１３３０ （１９９０）， 及びＣｏｌｉｇａｎ、前記により記載される。
【０３０４】
さらに、免疫化学的検出の便利さ及び多様性は、アビジン、ストレプタビジン及びビオチンにより接合された抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体を用いることによって増強され得る（例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ． など．， （ｅｄｓ．）， “Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）， ａｎｄ Ｂａｙｅｒなど．， “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １０， Ｍａｎｓｏｎ （ｅｄ．） ｐａｇｅｓ １４９−１６２ （Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ． Ｉｎｃ． １９９２） を参照のこと）。
【０３０５】
イムノアッセイを行うための方法は十分に確立されている。例えば、Ｃｏｏｋ ａｎｄ Ｓｅｌｆ， “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｏｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，” ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｌａｄｙｍａｎ （ｅｄｓ．）， Ｐａｇｅｓ １８０−２０８． （Ｃａｍｂｒｉｄｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）， Ｐｅｒｒｙ， “Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｏｇｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｌｅｎｎｏｘ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ １０７−１２０ （Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９９５）， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９６ を参照のこと。
【０３０６】
関連するアプローチにおいては、ビオチン−又はＦＴＴＣ−ラベルされたｚａｃｒｐ３ｘ２が、ｚａｃｒｐ３ｘ２を結合する細胞を同定するために使用され得る。そのような結合は、例えば流動細胞計測法を用いて検出され得る。
本発明はまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現についての免疫学的診断アッセイを行うためのキットも企画する。そのようなキットは、抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体又は抗体フラグメントを含んで成る少なくとも１つの容器を含んで成る。キットはまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体又は抗体フラグメントの存在を示すことができる１又は複数の試薬を含んで成る第２容器を含むことができる。
【０３０７】
そのようなインジケーター試薬の例は、検出できるラベル、例えば放射性ラベル、蛍光ラベル、化学ルミネセンスラベル、酵素ラベル、生物ルミネセンスラベル、コロイド状金及び同様のものを包含する。キットはまた、ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体又は抗体フラグメントが、ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質を検出するために使用される、使用者に伝達するための手段を含んで成る。例えば、文書の説明書は、封入される抗体又は抗体フラグメントが、ｚａｃｒｐ３ｘ２を検出するために使用され得ることを言及する。文書の材料は容器に直接的に適用され、又は文書の材料は、パッケージング挿入体の形で提供され得る。
【０３０８】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド及びポリペプチドの使用：
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストは、哺乳類におけるエネルギーバランスを調整するか、又は外傷から内皮細胞を保護するために使用され得る。エネルギーバランスの調整に関して、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、細胞代謝反応を調整するために使用される。そのような代謝反応は、脂肪生成、糖新生、糖原分解、脂質生成、グルコース摂取、タンパク質合成、熟発生、酵素使用及び同様のものを包含する。
【０３０９】
ｚａｃｒｐ３ｘ２はまた、抗−微生物活性のためにも評価され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、虚血及び／又は炎症又は同様の工程による損傷を妨げる手術前処理のために使用され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドはまた、神経伝達物質として、又は神経伝達のモジュレーターとして使用され得る。これに関しては、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、例えば、脳又は同様のものにおける２−デオキシ−グルコース摂取により示されるように、栄養摂取の調整に使用され得る。
【０３１０】
当業界において知られているか又は本明細書に記載される他の方法の中で、哺乳類エネルギーバランスは、１又は複数の次の代謝機能をモニターすることによって評価され得る：脂肪生成、糖新生、糖原分解、脂質生成、グルコース摂取、タンパク質合成、熱発生、又は同様のもの。それらの代謝機能は、より詳細に下記に示されるように、当業者に知られている技法（アッセイ又は動物モデル）によりモニターされる。例えば、インスリンの糖調節効果は、肝臓、骨格筋及び脂肪組織において優先的に発揮される。インスリンは、それらの３種の組織におけるその細胞受容体に結合し、そして例えば、グルコース生成の阻害及びグルコース利用の刺激をもたらす組織−特異的作用を開始する。肝臓においては、インスリンは、グルコース摂取を刺激し、そして糖新生及び糖原分解を阻害する。骨格筋及び脂肪細胞においては、インスリンは、グルコースの摂取、貯蔵及び利用を刺激するよう作用する。
【０３１１】
上記代謝機能のすべてをモニターするための技術的に認識されている方法が存在する。従って、当業者は、代謝調節機能についてｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを評価することができる。典型的な調整技法は下記に示される。
【０３１２】
脂肪生成、糖新生及び糖原分解は、例えばｏｂ／ｏｂマウス又はｄｂ／ｄｂマウスを用いての既知技法により評価され得る哺乳類エネルギーバランスの相互関係のある成分である。ｏｂ／ｏｂマウスは、ｏｂ（肥満）遺伝子座での不活性化突然変異のためにホモ接合性である近交系マウスである。そのようなｏｂ／ｏｂマウスは過食及び代謝低下性であり、そして循環性ＯＢタンパク質の生成を欠いていると思われる。ｄｂ／ｄｂマウスは、ｄｂ （糖尿病）遺伝子座での不活性化突然変異のためにホモ接合性である近交系マウスである。ｄｂ／ｄｂマウスは、ｏｂ／ｏｂマウスの表現型に類似する表現型を示すが、但しａｂ／ａｂマウスはまた、糖尿病表現型を示す。そのようなｄｂ／ｄｂマウスは、循環性ＯＢタンパク質の効果に対して耐性であると思われる。また、それらのパラメーターを評価する種々のインビトロ方法は、当業者において知られている。
【０３１３】
インスリン−刺激された脂質生成は、トリグリセリド中への^１４Ｃ−アセテートの組込み（Ｍａｃｋａｌｌなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５１： ６４６２−４， １９７６）、又はトリグリセリド蓄積（Ｋｌｅｔｚｉｅｎなど．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４１： ３９３−８， １９９２）を測定することによってモニターされ得る。
【０３１４】
グルコース摂取は、例えばインスリン−刺激されたグルコース輸送についてのアッセイにおいて評価され得る。トランスフェクトされていない、分化されたＬ６筋管（Ｇ４１８の存在下で維持される）が、１ｇ／ｌのグルコース、０．５又は１．０％のＢＳＡ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， 及び２ｍＭのグルタミンを含むＤＭＥＭに配置される。２〜５時間の培養の後、培地が、０．５又は１．０％のＢＳＡ、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのピルベート及び２ｍＭのグルタミンを含む新鮮なグルコースフリーのＤＭＥＭにより置換される。適切な濃度のインスリン又はＩＧＦ−１、又は試験物質の一連の希釈溶液が添加され、そして細胞が２０〜３０分間インキュベートされる。
【０３１５】
^３Ｈ又は^１４Ｃ−ラベルされたデオキシグルコースが約５０μＭの最終濃度まで添加され、そして細胞が約１０〜３０分間インキュベートされる。次に、細胞が冷緩衝液（例えば、ＰＢＳ）により、すばやくすすがれ、次に、適切な溶解剤（例えば、１％ＳＤＳ又は１ＮのＮａＯＨ）により溶解される。次に、細胞溶解物がシンチレーションカウンターによる計数により評価される。細胞−結合された放射能が、サイトカラシンｂ、すなわちグルコース輸送のインヒビターの存在下で細胞をインキュベートすることによって決定されるように、非特異的結合を控除した後、グルコース輸送の測定として取られる。他の方法は、例えば、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６６ （Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ２９）： Ｅ３２６−Ｅ３３３， １９９４（インスリン−刺激されたグルコース輸送）により記載されるそれらの方法を包含する。
【０３１６】
タンパク質合成は、例えば^３５Ｓ−メチオニンと共に試験細胞をインキュベーションした後、^３５Ｓ−メチオニン−ラベルされたタンパク質の沈殿、例えば^３５Ｓ−メチオニン及びタンパク質合成の推定上のモジュレーターを比較することによって評価され得る。
【０３１７】
熱発生は、Ｂ．Ｓｔａｎｌｅｙ ｉｎ Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ｗ． Ｃｏｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｃ． Ｗａｈｅｓｔｅｄｔ （ｅｄｓ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｔｔａｗａ， １９９３， ｐｐ． ４５７−５０７； Ｃ． Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ など．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６０： Ｒ３２１， １９９１； Ｎ． Ｚａｒｊｅｖｓｋｉなど．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３３： １７５３， １９９３； Ｃ． Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６６： Ｒ１７６５， １９９４； Ｈｅｌｌｅｒなど．， Ａｍ． Ｊ． ｐｈｙｓｉｏｌ． ２５２ （４Ｐｔ２）： Ｒ６６１−７， １９８７； 及びＨｅｌｌｅｒ など．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２４５： Ｒ３２１−８， １９８３により記載のようにして評価され得る。種々の技法により測定され得る代謝速度は、熱発生の間接的測定である。
【０３１８】
酸素使用は、Ｈｅｌｌｅｒなど． Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ３６９： ５５−９， １９７７に記載のようにして評価され得る。この方法はまた、視床下部温度及び代謝熱生成の分析を包含する。酸素使用及び熱調節はまた、Ｈａｓｋｅｌｌなど．， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５１： ９４８−５４， １９８１により記載のようにして、ヒトにおいて評価されて来た。
【０３１９】
当業者において知られているか又は本明細書に記載される他の方法の中で、神経伝達機能は、脳における２−デオキシ−グルコース摂取をモニターすることによって評価され得る。このパラメーターは、当業者に知られている技法（アッセイ又は動物モデル）、例えばオートラジオグラフィーによりモニターされる。有用なモニター技法は、例えばＫｉｌｄｕｆｆなど．， Ｊ． Ｎｅｕｒａｓｃｉ． １０： ２４６３−７５， １９９０により記載されており、そして関連する技法は、Ｇｅｒｂｅｒなど．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４： ６５１−８， １９９６及びＦａｌｌａｖｏｌｌｉｔａなど．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９５： １９００−９， １９９７に記載のようにして、“冬眠心臓”を評価するために使用される。
【０３２０】
さらに、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、そのフラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗−微生物用途のために治療的に有用である。例えば、補体成分Ｃ１ｑは、感染剤、例えば細菌及びウィルスに対する宿主防御において役割を演じる。Ｃ１ｑは、いくつかの特定の機能を示すことが知られている。例えば、Ｃ１ｑは、結合された抗体又はＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）との相互作用を通して補体カスケードを誘発する。また、Ｃ１ｑは、一定の細菌、ＲＮＡウィルス、マイコプラスマ、尿酸結晶、細菌内毒素の脂質Ａ成分、及び一定の細胞内オルガネラの膜と直接的に相互作用する。Ｃ１ｑ受容体に結合するＣ１ｑは、ファゴサイトーシスを促進すると思われる。Ｃ１ｑはまた、宿主防御システムの抗体形成点を増強すると思われる。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ． １２ （１１）： ９３３−１１， １９９３を参照のこと。従って、可溶性Ｃ１ｑ−様分子は、感染剤の溶解又はファゴサイトーシスを促進する抗−微生物剤として有用である。
【０３２１】
タンパク質、例えばＣ１ｑ及びマイクロファージスキャベンジャー受容体のコラーゲンドメインは、酸性リン脂質、例えばＬＰＡを結合することが知られている。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストとミトゲン性アニオン、例えばＬＰＡとの相互作用は、当業界において知られているアッセイを用いて決定され得る。例えば、Ａｃｔｏｎなど．， 前記を参照のこと。本発明のポリペプチド及び抗体による炎症工程の阻害はまた、創傷部位での感染を妨げることにおいて有用である。
【０３２２】
抗−微生物保護剤は、直接的に又は間接的に作用することができる。膜結合又は作用の孔形成機構を通して作用するそのような剤は、攻撃性微生物に直接的に結合する。抗−微生物剤はまた、酵素機構、すなわち微生物保護物質又はその細胞壁／膜の分解を通して作用することができる。微生物増強又は作用を阻害するか、又は上記に示されたいずれかの機能により微生物統合性を破壊することができる抗−微生物剤は、その抗−微生物活性に対して敏感な微生物による細胞培養物における汚染を妨げるための方法において有用である。そのような技法は、有効量の前記ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの存在下で細胞を培養することを包含する。
【０３２３】
また、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド又はそのアゴニストは、外因性微生物感染、例えば細菌、ウィルス又は菌類感染のインビトロ研究における細胞培養試薬として使用され得る。そのような成分はまた、感染のインビボ動物モデルにおいても使用され得る。
【０３２４】
ｚａｃｒｐ３ｘ２フラグメント、及びｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体は、当業界において知られている方法に従って、それらの抗−微生物性質に関して評価され得る。例えば、Ｂａｒｓｕｍなど．， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｎ． Ｊ． ８ （５）： ７０９−１４， １９９５； Ｓａｎｄｏｖｓｋｙ−Ｌｏｓｉｃａなど．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｅｔ． Ｍｙｃｏｌ． （Ｅｎｇｌａｎｄ） ２８ （４）： ２７９−８７， １９９０； Ｍｅｈｅｎｔｅｅなど．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （Ｅｎｇｌａｎｄ） １３５ （Ｐｔ． ８）： ２１８１−８， １９８９； Ｓｅｇａｌ ａｎｄ Ｓａｖａｇｅ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｖｅｔ． Ｍｙｃｏｌ． ２４： ４７７−９， １９８６及び同様のものを参照のこと。
【０３２５】
所望には、これに関してのｚａｃｒｐ３ｘ２の性能は、これに関して機能的であることが知られているタンパク質、例えばプロリンに富んでいるタンパク質、リゾチーム、ヒスタチン、ラクトペルオキシダーゼ又は同様のものに比較され得る。さらに、ｚａｃｒｐ３ｘ２フラグメント、ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体は、相乗効果を同定するために１又は複数の抗−微生物剤と組合して評価され得る。当業者は、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト及び抗体の抗−微生物性質が同様に評価され得ることを理解するであろう。
【０３２６】
神経伝達物質又は神経伝達モジュレーターとして、本発明のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドフラグメント、及びｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、融合タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト又は抗体はまた、カルシウムイオン、筋肉収縮、ホルモン分泌、ＤＮＡ合成又は細胞増殖、イノシトールリン酸ターンオーバー、アラキドン酸放出、ホスホリンパーゼ−Ｃ活性化、胃空腹化、好中球活性化又はＡＤＣＣ能力、スーパーオキシドアニオン生成及び同様のものを調整することができる。それらの性質の評価は、既知方法、例えば本明細書に示されるそれらの方法により行われ得る。
【０３２７】
細胞内カルシウムレベルに対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＤｏｂｒｚａｎｋｉなど．， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ４５： ３４１−５２， １９９３及び同様のものに記載されるそれらの方法により評価され得る。筋肉収縮に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＳｍｉｔｓ ＆ Ｌｅｂｅｂｖｒｅ， Ｊ． Ａｕｔｏｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １４： ３８３−９２， １９９４； Ｂｅｌｌｏｌｉなど．， Ｊ． Ｖｅｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ． １７： ３７９−８３， １９９４； Ｍａｇｇｉなど．， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５３： ２５９−７４， １９９４及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。
【０３２８】
ホルモン分泌によるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＨｅｎｒｉｋｓｅｎなど．， Ｊ． Ｒｅｃｅｐ． Ｓｉｇ． Ｔｒａｎｓｄ． Ｒｅｓ． １５ （１−４）： ５２９−４１， １９９５及び同様のものに記載されるプロラクチン放出についての方法により評価され得る。
【０３２９】
ＤＮＡ合成又は細胞増殖に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＤｏｂｒｚａｎｋｉなど．， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｒｅｐｔｉｄｅｓ ４５： ３４１−５２， １９９３及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。イノシトールホスフェートターンオーバーに対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＤｏｂｒｚａｎｓｋｉなど．， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ４５： ３４１−５２， １９９３及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。
【０３３０】
また、アラキドン酸放出に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＤｏｂｒｚａｎｓｋｉなど．， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ４５： ３４１−５２， １９９３及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。ホスホリパーゼ−Ｃ活性化に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＤｏｂｒｚａｎｓｋｉなど．， Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ４５： ３４１−５２， １９９３及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。
【０３３１】
胃空腹に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＶａｒｇａなどＥｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２８６： １０９−１１２， １９９５及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。ヒト好中球活性化及びＡＤＣＣ能力に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＷｏｚｎｉａｋなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７３： ６２９−３４， １９９３及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。スーパーオキシドアニオン生成に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの影響力は、当業界において知られている方法、例えばＷｏｚｎｉａｋなど．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７３： ６２９−３４， １９９３及び同様のものにより記載されるそれらの方法により評価され得る。
【０３３２】
細胞表面付着分子、例えばＥ−セレクチン（内皮白血球付着分子）、Ｖ−ＣＡＭ（血管細胞付着分子）、及びＩ−ＣＡＭ（細胞内付着分子）の発現に対するｚａｃｒｐ３ｘ２の効果は、Ｏｕｃｈｉなど．， （Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００： ２４７３−７， １９９９） に従って細胞ＥＬＩＳＡにおける微小血管骨髄細胞（ＴＲＢＭＥＣ）を用いて測定され得る。この活性は、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ（腫瘍壊死因子）からの刺激に比較され得る。Ｏｕｃｈｉなど．， （前記）及びＣｙｂｕｌｓｋｙ ａｎｄ Ｇｉｍｂｒｏｎｅ， （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： ７８８−９１， １９９１） に従ってのＴＨＰ−１単球付着アッセイは、ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を測定するためにも使用され得る。
【０３３３】
コラーゲンは、血小板凝集の可能性あるインジューサーである。血小板は、血栓を形成するために、損傷された血管壁と相互作用する。応答の程度は、暴露される内皮下層組織及び損傷された領域における血流により等級化される。これは、血管損傷から回復する患者に対する危険性を付与する。コラーゲン−誘発された血小板凝集のインヒビターは、コラーゲン−被覆された表面への血小板の結合の阻止、及び関連するコラーゲン−誘発された血小板凝集の低下のために有用である。Ｃ１ｑは補体経路の成分であり、そして防御機構を刺激し、そして組織損傷を引き起こす毒性酸素種の生成を誘発することが見出されている。（Ｔｅｎｎｅｒ， Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９３： ２４１−５３， １９９３）。
【０３３４】
Ｃ１ｑ結合部位は、血小板上に見出される。Ｃ１ｑは、免疫結合パートナーとは無関係に、血小板付着又は形状変化でなく、血小板凝集を阻害することが見出されている。Ｃ１ｑのアミノ末端領域は、コラーゲンと相同性を共有する（Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ ａｎｄ Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： ２９８４−８８， １９９０）。Ｃ１ｑ及びその補体経路の阻害は、本明細書において開示されるか又は当業界において知られている方法、例えばＳｕｂａ ａｎｄ Ｃｓａｋｏ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７： ３０４−９， １９７６に記載される方法を用いて決定され得る。これに関しては、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、止血の調節、血管損傷を流れる血流の上昇、及びコラーゲン表面の静止において有用である。
【０３３５】
コラーゲン−介在血小板付着、活性化及び凝集に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの活性は、本明細書に記載されるか又は当業界において知られている方法、例えば血小板凝集アッセイ（Ｃｈｉａｎｇなど．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ． ３７： ６０５−１２， １９８５）及び血小板付着アッセイ（Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ ａｎｄ Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４： ２２１−２５， １９９０）を用いて測定され得る。コラーゲンへの血小板付着、及びコラーゲン−誘発された血小板凝集阻害の阻害についてのアッセイは、Ｋｅｌｌｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ５４５０−６， １９９３； Ｗａｘｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ５４４５−９， １９９３； Ｎｏｅｓｋｅ−Ｊｕｎｇｂｌｕｔなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ５０５０−３， １９９４， 又はＤｅｃｋｍｙｎなど．， Ｂｌｏｏｄ ８５： ７１２−９， １９９５に記載される方法を用いて測定され得る。
【０３３６】
本発明のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、付着し、そして活性化される血小板の数、及び血小板凝集体のサイズを低めることによって、哺乳類の血管系内での血流を促進する方法において使用され得る。そのような方法は、そのような処理の必要な哺乳類への、治療的有効量のｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストの投与を包含し、それによりｚａｃｒｐ３ｘ２は、哺乳類の血管系内のトロンボゲン及び補体活性を低める。そのような方法に使用される、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、哺乳類における急性血管損傷の前、その間又はそれに続いて投与され得る。
【０３３７】
１つのそのような方法においては、血管損傷は、血管再構成、例えば血管形成、血管内膜切除、冠動脈バイパス移植片、微小血管修復又は血管移植片の吻合のためである。外傷、発作又は動脈瘤による血管損傷がまた考慮される。好ましい方法においては、血管損傷は、プラーク破壊、血管系の劣化、糖尿病に関する合併症及びアテローム硬化症のためである。冠動脈におけるプラーク破壊は、心臓発作を誘発し、そして大脳動脈においては、発作を誘発する。そのような方法へのｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストの使用はまた、免疫系に関連する血管の完全なシステム患者、例えば播種性血管内凝集（ＤＩＣ）及びＳＩＤの改善のために有用である。さらに、補体阻害活性は、非血管系免疫疾患、例えばアテローム硬化症の処理のために有用である。
【０３３８】
相互関係が、局在化される虚血性心筋におけるＣ１ｑの介在と、冠状動脈閉塞及び再灌流に続く白血球の蓄積との間に見出された。組織損傷に続く細胞成分の放出は、心筋損傷の主要原因である毒性酸素生成物をもたらす補体活性化を誘発する（Ｒｏｓｓｅｎなど．， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ６２： ５７２−８４， １９９８， 及びＴｅｎｎｅｒ、前記）。補体経路の阻止は、再灌流損傷から虚血性心筋を保護することが見出された（Ｂｕｅｒｋｅなど．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒｐ． ２８６： ４２９−３８， １９９８）。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの補体阻害及びＣ１ｑ結合活性が、そのような目的のために有用である。
大動脈環の血管拡張に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、アゴニスト又はアンタゴニストの活性は、Ｄａｉｎｔｙなど．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １００： ７６７， １９９０及びＲｈｅｅなど．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘ． １６： １７９， １９９５の方法に従って測定され得る。
【０３３９】
種々のインビトロ及びインビボモデルは、虚血性及び再灌流損傷に対するｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体タンパク質、抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト効果を測定するために入手できる。例えば、Ｓｈａｎｄｅｌｙａなど．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：２８１２−２６， １９９３； Ｗｅｉｓｍａｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： １４６−１５１， １９９１； Ｂｕｅｒｋｅなど．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９１： ３９３−４０２， １９９５； Ｈｏｒｓｔｉｃｋなど．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９５： ７０１−８， １９９７及びＢｕｒｋｅなど．， Ｊ． Ｐｈａｒ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒｐ． ２８６： ４２９−３８， １９９８を参照のこと。
【０３４０】
エクスビボハムスター血小板凝集アッセイは、Ｂｅｃｋｍｙｎなど．， 前記により記載される。ハムスター及びヒヒにおける放血時間は、Ｄｅｃｋｍｙｎなど．， 前記により記載されるモデルを用いて、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの注入に続いて測定され得る。本発明のタンパク質の投与に応答しての血栓の形成は、Ｄｅｃｋｍｙになど．， 前記により提供されるハムスター大腿静脈血栓症モデルを用いて測定され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２の投与に続く流動条件下での血小板付着の変化は、Ｈａｒｓｆａｈｉなど．， Ｂｌｏｏｄ ８５： ７０５−１１， １９９５に記載される方法を用いて測定され得る。
【０３４１】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストの補体阻害及び創傷治癒活性は、単独で、又はコラーゲン−誘発された血小板活性化及び凝集の他の既知インヒビター、例えばパルジピン、モウバチン又はカリンと組合してアッセイされ得る。
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、本明細書に記載されるか又は当業界において知られている方法、例えばブタにおける皮膚層の治癒（Ｌｙｎｃｈなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７６９６−７００， １９８７）及び遺伝的糖尿病マウスにおける十分な厚さの皮膚創傷（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈなど．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３６： １２３５−４６， １９９０）を用いて評価され得る。本発明のポリペプチドは、単独で、又は上記に記載される他の既知補体インヒビターと組合してアッセイされ得る。
【０３４２】
コラーゲンを結合するタンパク質は、損傷されたコラーゲン組織阻害血小板付着、活性化又は凝集、及び毒性酸素生成物の放出を導く炎症工程の活性化を低めるために有用である。補体活性、血栓活性及び免疫活性化のような工程に対して、暴露された組織を不活性にすることによって、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、虚血及び再灌流の損傷効果を低めることにおいて有用である。特に、そのような損傷は、外傷性虚血症、腸紋扼、及び血流の前−及び後−確立に関連する損傷を包含する。ｚａｃｒｐ３ｘ２は、心肺バイパス虚血及び後退、心筋梗塞及び後外傷性血管痙攣、例えば発作又は経皮管腔血管形成、及び偶発的又は手術−誘発された血管外傷の処理において有用である。
【０３４３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合体、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストはまた、補体活性化、血栓活性又は免疫活性化に対して材料の表面を不活性化するよう補綴生物材料及び手術用装置を静めるためにも有用である。そのような材料は、コラーゲン、フラグメント−被覆された生物材料、ゼラチン−被覆された生物材料、フィブリン−被覆された生物材料、フィブロネクチン−被覆された生物材料、ヘパリン−被覆された生物材料、コラーゲン及びゲル−被覆されたステント、動脈移植片、合成心臓弁、人工器官、又は１×１０^８以上でｚａｃｒｐ３ｘ２を結合する血液に暴露されるいずれかの補綴適用を包含するが、但しそれらだけには限定されない。そのような材料の被覆は、当業界において知られている方法を用いて行われ得る。例えば、アメリカ特許第５，２７２，０７４号（Ｒｕｂｅｎｓ）を参照のこと。
【０３４４】
補体及びＣ１ｑは、炎症において役割を演じる。補体活性化は、免疫グロブリンへのＣ１ｑの結合により開始される（Ｊｏｈｒｓｔｏｎ， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ． １２： ９３３−４１， １９９３； Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ， Ｔｈｅｒａｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： ７７−９４， １９９５）。Ｃ１ｑ及び補体のインヒビターは、抗−炎症剤として有用である。そのような適用は、感染を妨げるために行われ得る。さらに、そのようなインビビターは、補体活性化及びＣ１ｑへの免疫複合体の結合により介在される炎症を有する個人に投与され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、フラグメント、融合タンパク質、抗体、アゴニスト又はアンタゴニストは、欠陥性創傷治療を克服することによって創傷治癒の進行を増強する創傷修復の介在方法において有用である。創傷治癒の進行は、炎症の縮小、線維芽細胞回復、創傷の収縮及び感染の低下のような要素を包含する。
【０３４５】
コラーゲンに結合する腫瘍の細胞の能力は、腫瘍の転位に寄与する。コラーゲン結合のインヒビターはまた、腫瘍の付着相互作用及び転移性拡張を介在するためにも有用である（Ｎｏｅｓｋ−Ｊｕｎｇｂｕｌｔなど．， アメリカ特許第５，７２３，３１２号）。
血小板付着、活性化及び凝集は、本明細書に開示されるか又は当業界において知られている方法、例えば血小板凝集アッセイ（Ｃｈｉａｎｇなど．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ． ３７： ６０５−１２， １９８５）及び血小板付着アッセイ（Ｐｅｅｒｓｃｈｋｅ ａｎｄ Ｇｈｅｂｒｅｈｉｗｅｔ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４： ２２１−２５， １９９０）を用いて評価され得る。
【０３４６】
Ｃ１ｑ及び補体経路の阻害は、本明細書に開示されるか又は当業界において知られている方法、例えばＳｕｂａ ａｎｄ Ｃｓａｋｏ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７： ３０４−９， １９７６に記載される方法を用いて決定され得る。コラーゲンへの血小板付着、及びコラーゲン−誘発された血小板凝集の阻害についてのアッセイは、Ｋｅｌｌｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ５４５０−６， １９９３； Ｗａｘｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ５４４５−９， １９９３； Ｎｏｅｓｋｅ−Ｊｕｎｇｂｌｕｔなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ５０５０−３， １９９４又はＤｅｃｋｍｙｎなど．， Ｂｌｏｏｄ ８５： ７１２−９， １９９５に記載される方法を用いて測定され得る。
【０３４７】
Ｃ１ｑ及びマイクロファージスキャベンジャー受容体の正の荷電された、細胞外三ヘリックスのコラーゲンドメインは、リガンド結合において役割を演じることが決定されており、そしてポリアニオンに対して広い結合特異性を有することが示されている（Ａｃｔｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ３５３０−３７， １９９３）。リゾリン脂質成長因子（リゾホスファチジン酸、ＬＰＡ）及び他のミトゲン性アニオンは、損傷された組織の部位に位置し、そして創傷修復を助ける。ＬＰＡは、多くの生物学的効果、例えば血小板の活性化及びマトリックスアッセンブリーのアップ−レギュレーションを発揮する。ＬＰＡは他の血液凝集因子を補強し、そして創傷治癒に介在すると思われる。
【０３４８】
ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有するポリペプチドの治療使用：
本発明は、ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有するタンパク質、ポリペプチド及びペプチド（例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチド、抗−イディオタイプ抗−ｚａｃｒｐ３ｘ２抗体及びｚａｃｒｐ３ｘ２融合タンパク質）の、ｚａｃｒｐ３ｘ２タンパク質の必要な対象への使用を包含する。
【０３４９】
一般的に、投与されるポリペプチド、タンパク質又はペプチドの用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（剤の量／患者の体重）の範囲である、ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有する分子の用量（但し、それよりも低いか又は高い用量もまた、環境が指図する場合、投与され得る）を、受容体に供給することが所望される。
【０３５０】
ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有する分子の対象への投与は、局部カテーテルを通しての灌流によるか又は直接的な病変内注入による、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、鞘内投与であり得る。注射により治療用タンパク質を投与する場合、投与は連続的注入によるか、又は一回又は複数回のボーラスによることができる。１つの形の投与は、血管損傷の部位で、又はその近くで行われる。
【０３５１】
ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はヘプチドを含んで成る医薬組成物は、医薬的に有用な組成物を調製する既知の方法に従って配合され得、それによれば、治療用タンパク質が医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。組成物は、その投与が受容体患者により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。無菌リン酸緩衝溶液は、医薬的に許容できるキャリヤーの１つの例である。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５） を参照のこと。
【０３５２】
治療のためには、ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有する分子及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的に有効な量で患者に投与される。ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はペプチド、及び医薬的に許容できキャリヤーの組み合わせは、 その投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的に有効な量”で投与されると言われる。剤は、その存在が、臨床医又は他の資格のある観察者により示されるように、受容体患者の生理学において検出される変化をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０３５３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２活性を有する分子を含んで成る医薬組成物は、液体形又は固体形で供給され得る。液体形、例えばリポソーム−封入された製剤は、注射用溶液及び経口懸濁液により例示される。典型的な固体形は、カプセル、錠剤及び調節された開放形、例えばミニ浸透ポンプ及び移植体を包含する。他の用量形は、例えばＡｎｓｅｌ ａｎｄ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）， Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９５）， 及びｂｙ Ｒａｎａｄｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９６） により示されるように、当業者により考案され得る。
【０３５４】
例示のように、ｚａｃｒｐ３ｘ２医薬組成物は、ｚａｃｒｐ３ｘ２を含んで成る容器を含んで成るキットとして供給され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２は、１回又は複数回の用量のために注射溶液の形で、又は注射の前、再構造される無菌粉末として供給され得る。そのようなキットはさらに、医薬組成物の表示及び使用法に対する書面の情報を含んで成ることができる。さらに、そのような情報は、ｚａｃｒｐ３ｘ２組成物がｚａｃｒｐ３ｘ２に対する既知過敏症を有する患者において禁忌を示される表示を包含することができる。
【０３５５】
教育的な使用：
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、遺伝子学及び分子生物学、タンパク質化学及び抗体生成及び分析に関連する過程のための実験室用実施キットにおける教育手段として有用である。そのユニークなポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のために、ｚａｃｒｐ３ｘ２の分子は試験目的のための標準として、又は“未知のもの”として使用され得る。例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリヌクレオチドは、ｚａｃｒｐ３ｘ２が発現されるべき遺伝子である、融合構成体を包含する、細菌、ウィルス又は哺乳類発現のための発現構成体をいかにして調製するか、生徒に教授するための；ポリヌクレオチドの制限エンドヌクレアーゼ分解部位の決定のための；組織におけるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリヌクレオチドのｍＲＮＡ及びＤＮＡ局在化の決定のための（すなわち、ノザン及びサザンブロット、及びポリメラーゼ鎖反応による）；及び核酸ハイブリダイゼーションにより関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定のための助剤として使用され得る。
【０３５６】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドは、抗体の調製の教授のための；ウェスターンブロットによるタンパク質の同定のための；タンパク質精製のための；発現される合計タンパク質に対する比率としての発現されるｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドの重量を決定するための；ペプチド分解部位の同定のための；アミノ及びカルボキシル末端標識のカップリングのための；アミノ酸配列分析のための；及び天然及び標識されたタンパク質の両者の生物学的活性のインビトロ及びインビボでのモニターのための助剤として使用され得る。
【０３５７】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ポリペプチドはまた、分析熟練、例えば、特に４種のαヘリックスのコンホメーションを決定するために質量分光学、円二色性を、原子的に詳細に立体構造を決定するためにＸ−線結晶学を、溶液でのタンパク質の構造を表すために核磁気共鳴分光学を教授するためにも使用され得る。例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２を含むキットは、分析する学生に与えられ得る。アミノ酸配列は教授によっては知られているので、すなわちタンパク質は、学生の熟練を決定するか、又は学生の熟練を開発するための試験として学生に与えられるので、教授は、学生がポリペプチドを正しく分析したか又はしなかったかを知るであろう。あらゆるポリペプチドはユニークであるので、ｚａｃｒｐ３ｘ２の教育学的利用性はそれ自体ユニークであろう。
【０３５８】
ｚａｃｒｐ３ｘ２に対して特異的に結合する抗体は、ｚａｃｒｐ３ｘ２を精製するために親和製クロマトグラフィーカラムをいかにして調製するかを、学生に教授するための教授助剤として、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、そして配列決定するための教授助剤として、及び従って、ヒト型化抗体をいかにして企画するか、学生を教授するための実習課目として使用され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子、ポリペプチド又は抗体は、試薬会社によりパッケージングされ、そして学生が分子生物学の熟練を得るために教育機関に市販されている。個々の遺伝子及びタンパク質はユニークであるので、個々の遺伝子及びタンパク質は実験実習課目における学生のためのユニークな挑戦及び学習経験を創造する。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子ポリペプチド又は、抗体を含むそのような教育用キットは、本発明の範囲内にあると思われる。
【０３５９】
ｚａｃｒｐ３ｘ２ヌクレオチド配列の治療的使用：
本発明は、ｚａｃｒｐ３ｘ２を、そのような処理の必要な対象に供給するためへのｚａｃｒｐ３ｘ２ヌクレオチド配列の使用を包含する。さらに、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現を阻害する治療用発現ベクター、例えばアンチセンス分子、リボザイム又は外部案内配列分子が供給され得る。
【０３６０】
ｚａｃｒｐ３ｘ２を発現する組換え宿主細胞の使用、ｚａｃｒｐ３ｘ２をコードする裸の核酸の供給、ｚａｃｒｐ３ｘ２をコードする核酸分子と共にカチオン性脂質キャリヤーの使用、及びｚａｃｒｐ３ｘ２を発現するウィルス、例えば組換えレトロウィルス、組換えアデノ−関連ウィルス、組換えアデノウィルス、及び組換えヘルペス単純ウィルス（ＨＳＶ）の使用を包含する、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を対象に導入するための多くのアプローチが存在する（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ９２６ （１９９３）， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： １５７５ （１９８８）， ＬａＳａｌｌｅ など．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０： ９８８ （１９９３）， Ｗｏｌｆｆなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７： １４６５ （１９９０）， Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｄｅｌｕｃａ， Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３： ２０３ （１９９１） を参照のこと）。エクスビボアプローチにおいては、細胞が対象から単離され、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を発現するベクターによりトランスフェクトされ、そして次に、対象中に移植される。
【０３６１】
ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子の発現をもたらすために、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、遺伝子転写を制御するために、コアプロモーター及び任意には、調節要素に作用可能に連結される発現ベクターが構成される。発現ベクターの一般的な必要性は、上記に記載されている。
【０３６２】
他方では、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子は、組換えウィルスベクター、例えばアデノウィルスベクター（例えば、Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｔｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １１４９８ （１９９３）， Ｋｏｌｉｓ など．， ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ２１５ （１９９４）， Ｌｉなど．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ４；４０３ （１９９３）， Ｖｉｎｃｅｎｔ など．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ５：１３０ （１９９３）， ａｎｄ Ｚａｂｎｅｒ など．， Ｃｅｌｌ ７５： ２０７ （１９９３））、アデノウィルス−関連ウィルスベクター（Ｆｌｏｔｔｅなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０６１３ （１９９３））、アルファウィルス、例えば“Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ウィルス及びＳｉｎｄｂｉｓウィルス（Ｈｅｒｔｚ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｊ． Ｖｉｒ． ６６： ８５７ （１９９２）， Ｒａｊｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｊ．ｖｉｒ． ６５：２５０１ （１９９１）， 及びＸｉｏｎｇなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３： １１８８ （１９８９））、ヘルペスウィルスベクター（Ｋｏｅｒｉｎｇなど．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ． Ｔｈｅｒａｐ． ５： ４５７ （１９９４））、ポックスウィルスベクター（Ｏｚａｋｉなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９３： ６５３ （１９９３）， Ｐａｎｉｃａｌｉ ａｎｄ Ｐａｏｉｅｔｔｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９： ４９２７ （１９８２））、
【０３６３】
ポックスウィルス、例えばカナリヤポックスウィルス又はワクシニアウィルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈなど．， Ｐｒｏｃ． Ｈａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ３１７ （１９８９） 及びＦｌｅｘｎｅｒ など．， Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５６９： ８６ （１９８９））、及びレトロウィルス（Ｂａｂａ など．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９： ７２９ （１９９３）， Ｒａｍ など．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：８３ （１９９３）， Ｔａｋａｍｉｙａなど．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ３３： ４９３ （１９９２）， Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ９６２ （１９９３）， Ｖｉｌｅ ａｎｄ Ｈａｒｔ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ３８６０ （１９９３） 及びＡｎｄｅｒｓｏｎなど．， アメリカ特許第５，３９９，３４６号）を用いて供給され得る。種々の態様においては、ウィルスベクター自体又はウィルスベクターを含むウィルス粒子のいずれかが、下記に記載される方法及び組成物に使用され得る。
【０３６４】
１つシステムの例示として、アデノウィルス、すなわち二本鎖ＤＮＡウィルスは、異種核酸分子の供給のための十分に特徴づけられた遺伝子トランスファーベクターである（Ｂｅｃｋｅｒなど．， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：１６１ （１９９４）； Ｄｏｕｇｌａｓ ａｎｄ Ｃｕｒｉｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：４４ （１９９７））。アデノウィルスシステムは、次のいくつかの利点を提供する：（ｉ）比較的大きなＤＮＡ挿入体を収容する能力、（ｉｉ）高い力価に増殖する能力、（ｉｉｉ）広範囲の哺乳類細胞型を感染する能力、及び（ｉＶ）多くの異なったプロモーター、例えば遍在性で、組織特異的な、及び調節できるプロモーターと共に使用される能力。さらに、アデノウィルスは、そのウィルスが血流において安定しているので、静脈内注射により投与され得る。
【０３６５】
アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスベクターを用いて、挿入体は、直接的な連結により、又は同時トランスフェクトされたプラスミドによる相同組換えにより、ウィルスＤＮＡ中に組み込まれる。典型的なシステムにおいては、必須Ｅ１遺伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、Ｅ１遺伝子が宿主細胞により供給されない場合、複製しないであろう。損なわれていない動物に静脈内供給される場合、アデノウィルスは主に、肝臓を標的化する。Ｅ１遺伝子欠失を有するアデノウィルス供給システムが宿主細胞において複製しない場合、宿主の組織は、コードされた異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするであろう。宿主細胞はまた、その対応する遺伝子が分泌シグナル配列を含む場合、異種タンパク質を分泌するであろう。分泌されたタンパク質は、異種遺伝子を発現する組織（例えば、高く血管化された肝臓）から循環に侵入するであろう。
【０３６６】
さらに、ウィルス遺伝子の種々の欠失を含むアデノウィルスベクターは、そのベクターに対する免疫応答を低めるか又は排除するために使用され得る。そのようなアデノウィルスは、Ｅ１−欠失され、そしてさらに、Ｅ２Ａ又はＥ４の欠失を含む（Ｌｕｓｋｙなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０２２ （１９９８）； Ｒａｐｅｒ など．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ６７１ （１９９８））。Ｅ２ｂの欠失はまた、免疫応答を低めることが報告されている（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９２６ （１９９８））。完全なアデノウィルスゲノムを欠失することによって、異種ＤＮＡの非常に大きな挿入体が収容され得る。すべてのウィルス遺伝子が欠失されている、いわゆる“不活性（ｇｕｔｌｅｓｓ）”アデノウィルスの生成は、異種ＤＮＡの大きな挿入体の挿入のために特に好都合である（Ｙｅｈ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１： ６１５ （１９９７） を参照のこと）。
【０３６７】
治療用遺伝子を発現できる組換えウィルスの高い力価のストックが、標準方法を用いて、感染された哺乳類細胞から得られる。例えば、組換えＨＳＶは、Ｖｅｒｏ細胞において、Ｂｒａｎｄｔなど．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２０４３ （１９９１）， Ｈｅｒｏｌｄ など．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１２１１ （１９９４）， Ｖｉｓａｌｌｉ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｔ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５：４１９ （１９９１）， Ｇｒａｕなど．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３０： ２４７４ （１９８９）， Ｂｒａｎｄｉなど．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ． ３６：２０９ （１９９２）， 及びＢｒａｗｎ ａｎｄ ＭａｃＬｅａｎ （ｅｄｓ．）， ＨＳＶ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ １９９７） により記載のようにして、調製され得る。
【０３６８】
他方では、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を含んで成る発現ベクターは、リポソームを用いてのインビボリポフェクションにより、対象の細胞に導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（Ｆｅｌｇｎｅｒ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４： ７４１３−１７， １９８７； 及びＭａｃｋｅｙ など．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ８０２７−３１， １９８８）。インビボで特定の器官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的な利点を有する。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白である。脂質は、標的化のために他の分子に化学的に得られる。標的化されたペプチド（例えば、ホルモン又は神経伝達物質）、タンパク質、例えば抗体又は非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【０３６９】
エレクトロポレーションは、投与のもう１つの態様である。例えば、Ａｉｈａｒａ ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６： ８６７ （１９９８） は、筋肉中への遺伝子トランスファーのためへのインビボエレクトロポレーションの使用を示している。
【０３７０】
遺伝子療法へのもう１つのアプローチにおいては、治療用遺伝子は、ｚａｃｒｐ３ｘ２の発現を阻害するｚａｃｒｐ３ｘ２アンチセンスＲＮＡをコードすることができる。アンチセンス構造体の調製方法は当業界に知られている。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎなど．， Ｄｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １４： ２７４ （１９９３） ［トランジェニックマウス］、Ａｕｇｕｓｔｉｎｅなど．， Ｄｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １４： ５００ （１９９３ ［ネズミ完全胚培養物］、及びＯｌｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｂｏ， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２４１： １３４ （１９９８） ［培養された細胞］ を参照のこと。ｚａｃｒｐ３ｘ２アンチセンス分子のための適切な配列は、本明細書に開示されるｚａｃｒｐ３ｘ２のヌクレオチド配列から誘導され得る。
【０３７１】
他方では、調節要素がリボザイムをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結される発現ベクターが構成され得る。リボザイムは、ｍＲＮＡ分子における一定の標的配列に向けられるエンドヌクレアーゼ活性を発現するよう企画され得る（例えば、Ｄｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｍａｃｅｊａｋ， アメリカ特許第５，４９６，６９８号、ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ， アメリカ特許第５，５２５，４６８号、Ｃｈｏｗｒｉｒａ ａｎｄ ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ， アメリカ特許第５，６３１，３６９号及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， アメリカ特許第５，２２５，３３７号を参照のこと）。本発明においては、リボザイムはｚａｃｒｐ３ｘ２ ｍＲＮＡと結合するヌクレオチド配列を包含する。
【０３７２】
もう１つのアプローチにおいては、調節要素がｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子のＲＮアーゼＰ−介在性切断を促進できるＲＮＡ転写体の生成を方向づける発現ベクターが構成され得る。このアプローチによれば、外部案内配列が、細胞リボザイムにより続いて切断される、特定種の細胞内ｍＲＮＡに内因性リボザイム、すなわちＲＮアーゼＰを向けるために構成され得る（例えば、Ａｌｔｍａｎなど．， アメリカ特許第５，１６８，０５３号、Ｙｕａｎなど．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３： １２６９ （１９９４）， Ｐａｃｅなど．， ＷＯ９６／１８７３３号、Ｇｅｏｒｇｅなど．， ＷＯ９６／２１７３１号及びＷｅｍｅｒなど．， ＷＯ９７／３３９９１号を参照のこと）。
【０３７３】
好ましくは、前記外部案内配列は、ｚａｃｒｐ３ｘ２ ｍＲＮＡに対して相補的な１０〜１５個のヌクレオチド配列、及び３’−ＮＣＣＡヌクレオチド配列（ここで、Ｎは好ましくはプリンである）を含んで成る。外部案内配列転写体は、ｍＲＮＡと相補的外部案内配列との間での塩基対の形成により、標的化されたｍＲＮＡ種に結合し、従って、前記塩基対合された領域の５’側に位置するヌクレオチドでのＲＮアーゼＰによるｍＲＮＡの切断を促進する。
【０３７４】
一般的に、ｚａｃｒｐ３ｘ２ヌクレオチド酸配列を有する治療用ベクター、例えば組換えウィルスを含んで成る組成物の用量は、対照の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及びこれまでの医学的歴史のような要因に依存して変化するであろう。治療用ベクターの適切な投与経路は、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、及び腫瘍を含む腔中への注射を包含する。
【０３７５】
本発明のウィルスベクター、非ウィルスベクター又はウィルス及び非ウィルスベクターの組み合わせを含んで成る組成物は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知方法に従って配合され得、それによれば、ベクター又はウィルスは、医薬的に許容できるキャリヤーと共に混合される。上記で示されるように、組成物、例えばリン酸緩衝溶液は、その投与が受容体対象により許容され得る場合、“医薬的に許容できるキャリヤー”であると言われる。他の適切なキャリヤーは、当業者に良く知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９^ｔｈ Ｅｄ． （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９９５）， 及びＧｉｌｍａｎ’ｓ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ７^ｔｈ Ｅｄ． （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８５） を参照のこと）。
【０３７６】
治療のためには、治療用遺伝子ベクター、又はそのようなベクターを含んで成る組換えウィルス、及び医薬的に許容できるキャリヤーが、治療的有効量で対象に投与され得る。発現ベクター（又はウィルス）及び医薬的に許容できるキャリヤーの組み合わせは、投与される量が生理学的に有意である場合、“治療的有効量”で投与されると言われる。剤は、その存在が受容体対象の生理学において検出できる変化をもたらす場合、生理学的に有意である。
【０３７７】
治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスにより処理される対象がヒトである場合、治療は好ましくは、体細胞遺伝子治療である。すなわち、治療用遺伝子発現ベクター又は組換えウィルスによるヒトの好ましい処理は、ヒト生殖細胞系の一部を形成し、そして次の世代に通され得る核酸分子を細胞中に導入すること（すなわち、ヒト生殖系遺伝子治療）を必要としない。
【０３７８】
トランスジェニックマウスの生成：
トランスジェニックマウスは、すべての組織において、又は組織−特異的又は組織に好ましい調節要素の制御下で、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を過剰発現するよう構築され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２のそれらの過剰生成体は、過剰発現に起因する表現型を特徴づけるために使用され得、そしてトランスジェニック動物は過剰ｚａｃｒｐ３ｘ２により引き起こされるヒト疾病のためのモデルとして作用することができる。ｚａｃｒｐ３ｘ２を過剰発現するトランスジェニックマウスはまた、大きな動物の乳汁又は血液におけるｚａｃｒｐ３ｘ２、例えば可溶性ｚａｃｒｐ３ｘ２の生成のためのモデル生物反応体を提供する。
【０３７９】
トランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｊａｃｏｂ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，” ｉｎ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ， Ｊａｃｏｂ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １１１−１２４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ． １９９４）， Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ ａｎｄ Ｒｏｂｌ （ｅｄｓ．）， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ １９９５）， ａｎｄ Ａｂｂｕｄ ａｎｄ Ｎｉｌｓｏｎ， “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｉｃ Ｍｉｃｅ，” ｉｎ Ｇｅｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ： ｕｓｉｎｇ Ｎａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｒｔ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ａｎｄ Ｈｏｅｆｆｌｅｒ （ｅｄｓ．）， ｐａｇｅｓ ３６７−３９７ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９９９）を参照のこと）。
【０３８０】
例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを生成するための方法は、成熟した受精能雄（種マウス）（Ｂ６Ｃ３ｆ１， 生後２−８ヶ月（Ｔａｃｏｍｉｃ Ｆａｒｍｓ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ， ＮＹ））、精管切除された雄（ｄｕｄｓ）（Ｂ６Ｄ２ｆ１， ２−８ヶ月（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ））、 思春期直前受胎能雌（ドナー）（Ｂ６Ｃ３ｆ１， ４−５週（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ））、及び成熟した受胎能雌（受容体）（Ｂ６Ｄ２ｆ１， ２−４ヶ月（ｔａｃｏｎｉｃ ｆａｒｍｓ））により開始することができる。ドナーは、１週間、気候順応化され、そして次に、約８ＩＵ／マウスのＰｒｅｇｎａｎｔ Ｍａｒｅ’ｓ Ｓｅｒｕｍ ゴナドトロピン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）Ｉ．Ｐ． により、及び４６−４７時間後、８ＩＵ／マウスのヒトＣｈｏｒｉｏｎｉｃ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ （ｈＣＧ （Ｓｉｇｍａ）） Ｌ．Ｐ． により注射され、過剰排卵を誘発された。ドナーが、ホルモン注射に続いて、種マウスにより交配される。排卵は一般的に、ｈＣＧ注射の１３時間以内に生じる。交接は、交配の次の朝、膣栓の存在により確認される。
【０３８１】
受精された卵を手術用スコープ下で集める。卵管を集め、そして卵を、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含む尿検査用スライド中に開放する。卵を、１度、アヒルロニダーゼにより洗浄し、そして２度、Ｗｈｉｔｔｅｎ’ｓ Ｗ６４０ 媒体（Ｍｅｎｉｎｏ ａｎｄ Ｏ’ｃｌｏｒａｙ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ７７： １５９ （１９８６）， 及びＤｉｅｎｈａｒｔ ａｎｄ Ｄｏｗｎｓ， Ｚｙｇｏｔｅ ４： １２９ （１９９６） により記載される）により洗浄し、これを５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２及び９０％Ｎ_２と共に３７℃でインキュベートする。次に、卵を、マイクロインジェクションまで、３７℃／５％ＣＯ_２のインキュベーターに貯蔵する。
【０３８２】
ｚａｃｒｐ３ｘ２コード配列を含むプラスミドＤＮＡ１０〜１２μｇを、線状化し、ゲル精製し、そしてマイクロインジェクションのために５−１０ｎｇ／μｌの最終濃度で、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）， ０．２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液に再懸濁する。例えば、ｚａｃｒｐ３ｘ２コード配列は、配列番号２又は６のアミノ酸残基をコードすることができる。
【０３８３】
プラスミドＤＮＡを、暖かな、ＣＯ_２平衡化された鉱油により被覆された１度のＷ６４０媒体に含まれる、収穫された卵中にマイクロインジェクトする。ＤＮＡを注射用針中に吸い込み（０．７５ｍｍのＩＤ， １ｍｍのＯＤ硼珪酸塩ガラス細管から引き抜かれる）、そして個々の卵中に注入する。注射用針により、個々の卵の、ハプロイド前核の１つ又は両者中に貫通する。
【０３８４】
数ピコリットルのＤＮＡを前核中に注入し、そして注射用針を、核と接触しないよう引き抜く。前記方法を、すべての卵が注入されるまで、反復する。都合良くマイクロインジェクトされた卵を、前もってガス抜きされたＷ６４０媒体を有する器官組織−培養皿中に移し、３７℃／５％ＣＯ_２のインキュベーターにおいて一晩、貯蔵する。
【０３８５】
次の日、２細胞の胚を、偽妊娠受容体中に移す。受容体は、精管切除されたｄｕｄｓとの交接の後、膣栓の存在により同定される。受容体に麻酔をし、そして背面左側上の毛を剃り、そして手術用顕微鏡に移す。切開を、皮膚において、及び胸郭、背部及び後脚により概略される腹部の中央、すなわち膝と脾臓との間の中途まで筋肉壁を通して行う。生殖器官を、小さな手術用ドレープ上に切除する。脂肪パッドを、手術用ドレープ上に広げ、そして子供用止血小鉗子（Ｒｏｂｏｚ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を、脂肪パットに取り付け、そしてマウスの背部上をつるし、器官が腹部にスライドすることを防ぐ。
【０３８６】
鉱油、続いて交互にＷ６４０及び空気気泡を含む精巧なトランスファーピペットにより、前日の注入からの１２〜１７個の健康な２−細胞胚を、受容体中に移す。膨張した膨大部を位置決定し、そしてその膨大部と包との間の卵管を保持し、卵管の刻み目を前記包に隣接して、２８ｇの針により行い、膨大部又は包を裂かないことを確かめる。
【０３８７】
ピペットを、卵管における刻み目に移し、そして胚を吹き込み、最初の空気気泡のピペットからの除去を可能にする。脂肪パッドを軽く、腹膜中に押し込み、そして生殖器官を滑り込ませる。腹膜壁を、１つの縫合により閉じ、そして皮膚を傷口用クリップにより閉じる。マウスは、少なくとも４時間、３７℃の暖かなスライド上で回復した。
【０３８８】
受容体を、対でカゴに戻し、そして１９−２１日の妊娠を可能にする。誕生後、１９−２１日の産後を、離乳の前に可能にする。離乳子供の性別を鑑別し、そして別々の性別のカゴに入れ、そして０．５ｃｍの生検（遺伝子型識別のために使用される）を、尾から、無菌のハサミにより取る。
【０３８９】
ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＤＮＥＡＳＹキットを用いて、その製造業者の説明書に従って、切り取られた尾から調製する。ゲノムＤＮＡを、同じプラスミドに導入されたｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子又は選択マーカー遺伝子を増幅するために企画されたプライマーを用いて、ＰＣＲにより分析する。動物がトランスジェニックであることが確かめられた後、それらは、トランスジェニック雌を野生型雄と共に、又はトランスジェニック雄を１又は複数の野生型雌と共に配置することによって、近交系に戻し交雑する。子供が生まれ、そして離乳され、性別を分け、そしてそれらの尾を、遺伝子型識別のために切り取る。
【０３９０】
生存動物におけるトランスジーンの発現について調べるために、部分肝切除を行う。手術準備を、ｚｙｐｈｏｉｄ工程下で直接的に上部腹部に行う。無菌技法を用いて、小さな１．５−２ｃｍの切開を、胸骨下で行い、そして肝臓の左側葉を取り出す。４−０絹糸を用いて、下部葉を体腔外に確保するために、その下部葉の回りを縛る。クランプを用いて、その結び目を保持し、そして吸収性Ｄｅｘｏｎ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ； Ｗａｙｎｅ， Ｎ． Ｊ．） の第２ループを、最初の結び目に隣接して配置する。遠位切断をＤｅｘｏｎ結び目から行い、そして約１００ｍｇの切除された肝臓組織を、無菌ペトリ皿に配置する。
【０３９１】
切除された肝臓切片を、１４ｍｌのポリプロピレン丸底管に移し、そして液体窒素において凍結し、そして次に、ドライアイス上に貯蔵する。手術部位を、縫合及び傷口用クリップにより閉じ、そして動物のカゴを、３７℃で加熱されるパッド上に、手術の後、２４時間、配置する。動物を手術の後、毎日調べ、そして傷口用クリップを、手術の７−１０日後に取り除く。ｚａｃｒｐ３ｘ２ ｍＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーションアッセイ又はポリメラーゼ鎖反応を用いて、個々のトランスジェニックマウスについて試験する。
【０３９２】
ｚａｃｒｐ３ｘ２を過剰発現するトランスジェニックマウスを生成する他に、その遺伝子を異常に低く発現するか、又はまったく発現しないトランスジェニックマウスを構築することは有用である。そのようなトランスジェニックマウスは、ｚａｃｒｐ３ｘ２の欠失に関連する疾病のための有用なモデルを提供する。上記で論じられたように、ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現は、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子、又は外部案内配列遺伝子を用いて阻害され得る。ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を過少発現するトランスジェニックマウスを生成するためには、そのような阻害配列がｚａｃｒｐ３ｘ２ ｍＲＮＡに標的化される。特定の遺伝子の異常に低い発現をトランスジェニックマウスを生成するための方法は、当業者に知られている（例えば、Ｗｕなど．， “Ｇｅｎｅ Ｕｎｄｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐ． ２０５−２２４ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９７） を参照のこと）。
【０３９３】
ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子発現をほとんどか又はまったく有さないトランスジェニックマウスを生成するための他のアプローチは、非官能性ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子により置換された、少なくとも１つの正常ｚａｃｒｐ３ｘ２対立遺伝子を有するマウスを生成することである。非官能性ｚａｃｒｐ３ｘ２遺伝子を企画する１つの方法は、もう１つの遺伝子、例えば選択マーカー遺伝子を、ｚａｃｒｐ３ｘ２をコードする核酸分子内に挿入することである。
【０３９４】
いわゆるそれらの“ノックアウトマウス”を生成するための標準の方法は、当業者に知られている（例えば、Ｊａｃｏｂ， “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ，” ｉｎ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ， Ｊａｃｏｂ （ｅｄ．）， Ｐａｇｅｓ １１１−１２４ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｔｄ， １９９４）， 及びＷｕなど．， “Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ，” ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｇｅｓ ３３９−３６５ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９７）を参照のこと）。
本発明は、次の非−制限的例によりさらに例示される。
【０３９５】
実施例
例１．ＰＣＲ を用いての組織パネルにおけるヒト ｚａｃｒｐ３ｘ２ の組織分布
ヒト組織からのｃＤＮＡのパネルを、ＰＣＲを用いて、ヒトｚａｃｒｐ３（Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎなど．， ＷＯ００／６３３７７号）発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ヒト組織からのマラソンｃＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルを包含し、そして細胞系は下記表５に示される。前記ｃＤＮＡは自家ライブラリーからであり、又はマラソンｃＤＮＡは自家ＲＮＡ調製物、すなわちＣｌｏｎｔｅｃｈ ＲＮＡ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＮＡからであった。
【０３９６】
マラソンｃＤＮＡは、マラソン−Ｒｅａｄｙ^ＴＭ キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて製造され、そしてクラスリンプライマーＺＣ２１，１９５（配列番号９）及びＺＣ２１，１９６（配列番号１０）によりＱＣ試験し、そして次に、クラスリンバンドの強さに基づいて希釈された。パネルサンプルの性質を評価するために、品質管理（ＱＣ）についての次の３種の試験を行った：（１）ライブラリーのために使用されるＲＮＡ品質を評価するために、自家ｃＤＮＡを、個々のｃＤＮＡライブラリーについてのベクター配列に対して特異的であるベクターオリゴによるＰＣＲにより、平均挿入体について試験し；（２）パネルサンプルにおけるｃＤＮＡの濃度の標準化を、５’ベクターオリゴＺＣ１４，０６３（配列番号１１）及び３’α−チューブリン特異的オリゴプライマーＺＣ１７，５７４（配列番号１２）又は３’Ｇ３ＰＤＨ特異的オリゴプライマーＺＣ１７，６００（配列番号１３）を用いて、十分な長さのαチューブリン又はＧ３ＰＤＨ ｃＤＮＡを増幅するために、標準のＰＣＲ方法を用いて達成し；そして（３）サンプルを、可能なリボソーム又はミトコンドリアＤＮＡ汚染について調べるために配列決定に送った。
【０３９７】
パネルを、ヒトゲノムのＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ， Ａｌｔｏ， ＣＡ）陽性対照サンプルを含む９６−ウェル形式において組みたてた。個々のウェルは約０．２〜１００ｐｇ／μｌのｃＤＮＡを含んだ。ＰＣＲ反応を、オリゴＺＣ２３，９８９（配列番号１４）及びＺＣ２３，８９９（配列番号１５）を用いて組みたてた。増幅を次の通りに行った：９４℃で２分（１サイクル）、９４℃で１５秒、６８℃で４５秒（３５サイクル）、続いて７２℃で７分（１サイクル）。約１０μｌのＰＣＲ反応生成物を、４％アガロースゲルを用いての標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。予測されるｚａｃｒｐ３の他に、２２９ｂｐでのバンドは約６００ｂｐのバンドである。
【０３９８】
脳、胎児肝臓、腎臓、前立腺、脊椎及び唾液腺からのＰＣＲ生成物を、
Ｑｉａｅｘ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて、製造業者の説明書に従って，
切除し、プールし、そして精製し、そして配列決定のために提出した。配列決定は、ｚａｃｒｐ３のスプライス変異体として６００ｂｐのバンドを同定した。７３個のアミノ酸残基のスプライスが、ｚａｃｒｐ３の開始Ｍｅｔに続いて７個のアミノ酸残基を生ぜしめる。ｚａｃｒｐ３及びｚａｃｒｐ３ｘ２は特異的に発現される；下記表５を参照のこと（太字の記入は、ｚａｃｒｐ３及びｚａｃｒｐ３ｘ２の両者による発現を意味し、Ｘは、ｚａｃｒｐ３ｘ２のみを意味する）。ｚａｃｒｐ３ｘ２は、脳、リンパ節、乳腺、胎盤、子宮及び肝臓において独立的に発現した。
【０３９９】
【表４】

【０４００】
【表５】

【０４０１】
Ｂ．正常−対−疾病心臓からの ｚａｃｒｐ３ についての ＲＴ ＰＣＲ 実験：
ＲＴ ＰＣＲ実験を、ｚａｃｒｐ３について行った。ＲＴ ＰＣＲは、胎児の正常又は疾病心臓からの９種のＲＮＡサンプルを含んだ。サンプルは、購入され、又は自家源からであり、そして６，９及び１２週での胎児心臓、すなわち疾病心臓（右及び左心室）及び正常心臓を包含した。ＲＴ ＰＣＲ反応を、ＺＣ２３８９８（配列番号１６）及びＺＣ２３８９９（配列番号１７）を用いて構成した。３０秒の延長時間及び合計３５のサイクルと共に６４．６℃のアニーリング温度を用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ段階ＲＴ＿ＰＣＲシステム（ＧｉｂＣｏ−ＢＲＬ）を行った。ｚａｃｒｐ３Ｘ２についての陽性サンプルは、６，９及び１２週での胎児心臓であった。ｚａｃｒｐ３Ｘ１（ＷＩＰＯ公開ＷＯ００／６３３７７号）についての陽性サンプルは、６，９及び１２週での、正常心臓及び疾病心臓（右及び左心室）の胎児心臓であった。
【０４０２】
例２．ｚａｃｒｐ３Ｘ２ のクローニング及び単離
Ａ．ｚａｃｒｐ３Ｘ２ についての明白な十分な長さの ｃＤＮＡ を得るために、次の ＰＣＲ 反応を設定した：
オリゴＺＣ３８８２４（配列番号１８）及びＺＣ３８８２５（配列番号１９）、６２℃のアニーリング温度、３５サイクル及びＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｊａｐａｎ） を用いてのＰＣＲ反応を、ヒト心臓ｃＤＮＡから約１，０３６ｋｂのフラグメントを得るために行った。生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， Ｃａ） を用いて精製した。次に、１，０３６ｋｂのフラグメントを、配列決定のためのＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａ） を用いて、ベクターｐＣＲ４．０−ＴＯＰＯ中に連結した。
【０４０３】
オリゴＺＣ２１９０９（配列番号２０）及びＺＣ２０８３８（配列番号２１）、５５℃のアニーリング温度、３５サイクル及びＴａＫａＲａ Ｅｘｔａｑ （ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｊａｐｏｎ） を用いて、ＰＣＲを行い、約１３１ｂｐのフラグメントを得、そしてクローンを上記のようにしてスクリーンした。２種のクローンを配列決定に送った。クローンにおける塩基対差異は予測以上であった。
ＥｃｏＲＩ（ＧｉｂＣｏ−ＢＲＬ）及びＳｍａＩ（ＧｉｂＣｏ−ＢＲＬ）による２種のクローンの消化は、配列番号２に示されるようなｚａｃｒｐ３Ｘ２のポリペプチド配列をコードする、配列番号１に示されるようなｚａｃｒｐ３Ｘ２についての正しく明白な、十分な長さのｃＤＮＡを得るために一緒に連結されるフラグメントを生成した。
【０４０４】
例３．染色体割り当て及び ｚａｃｒｐ３ の配置
ｚａｃｒｐ３を、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐａｎｅｌ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ） の市販バージョンを用いて、ヒト染色体５に対してマッピングした。そのＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ ＲＨ Ｐａｎｅｌ は、完全なヒトゲノムのそれぞれ８３の放射線ハイブリッドクローンからのＰＣＲ可能ＤＮＡ、及び２種の対照ＤＮＡ（ＲＭドナー及びＡ３受容体）を含む。公的に入手できるＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｓｈｇｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）は、マーカーの染色体位置決定を可能にする。
【０４０５】
Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ ＲＨ Ｐａｎｅｌによるｚａｃｒｐ３のマッピングのために、２０μｌの反応体を、９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に提供し、そして”ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎ ９６” 熱サイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において使用した。個々の８５のＰＣＲ反応体は、２μｌの１０×ＫｌｅｎＴａｑ ＰＣＲ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、１．６μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ、ＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、１μｌのセンスプライマー、ＺＣ２１，９１３ （配列番号２２）、１μｌのアンチセンスプライマー、ＺＣ２１，９１４ （配列番号２３）、２μｌのＲｅｄｉＬｏａｄ （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）、０．４μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＫｌｅｎＴａｑ ポリメラーゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、２５ｎｇ の個々のハイブリッドクローン又は対照からのＤＮＡ、及び２０μｌの合計体積のためのｄｄＨ_２Ｏから構成された。
【０４０６】
反応を同量の鉱油により被覆し、そして密封した。ＰＣＲサイクラー条件は次の通りであった：９４℃で５分間の変性、初期の１サイクル、９４℃で４５秒間の変性、６２℃で４５秒間のアニーリング及び７２℃で１．１５分間の延長、３５サイクル、続いて７２℃で７分間の延長、最終の１サイクル。反応を、２％アガロースゲル上で電気泳動により分離した（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ， ＮＪ）。
【０４０７】
結果は、１５．５８のＬＯＤ評点及びマーカーからのＯｃＲ＿１００００の距離を伴なって、ヒト染色体５骨格マーカーＳＨＧＣ−５６５８８へのｚａｃｒｐ３の連鎖を示した。周囲マーカーの使用は、完全なＬＤＢヒト染色体５地図上の５ｐ１２領域におけるｚａｃｒｐ３を位置決定する（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｏｃａｔｉｏｎ Ｃａｔａｂａｓｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｈａｍｐｔｏｎ， ＷＷＷサーバー：ｈｔｔｐ：／／ｃｅｄａｒ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｓｏｔｏｎ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂｌｉｃ＿ｂｔｍｌ／）。
ゲノムクローンはまた、５ｐ１２−ｐ１３．３でのｚａｃｒｐ３の染色体位置決定及びその変異体ｚａｃｒｐ３ｘ２を示す（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 受託番号ＡＣ０１０６３７号ＡＣ０１０６３７号）。
【０４０８】
例４．付着分子アッセイ
炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ（腫瘍壊死因子）による刺激に基づいて、ヒト微小血管骨髄細胞（ＴＲＢＭＥＣ）は、細胞表面付着分子、例えばＥ−セレクチン（内皮白血球付着分子）、Ｖ−ＣＡＭ（血管細胞付着分子）、及びＩ−ＣＡＭ（細胞間付着分子）を発現する。
【０４０９】
細胞表面付着分子の発現に対するｚａｃｒｐ３Ｘ２の効果を、Ｏｕｃｈｉなど．， （Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １００： ２４７３−７， １９９９） に従って、細胞に基づくＥＬＩＳＡにおいて微小血管骨髄細胞（ＴＲＢＭＥＣ）を用いて決定した。手短に言及すれば、ＴＲＢＭＥＣ細胞を、９６ウェルの平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ）において集密性まで増殖する。野生型対照培地及びｚａｃｒｐ３Ｘ２を発現する細胞からのｚａｃｒｐ３Ｘ２培地の両者を、試験の前、製造業者の説明書に従って、１０倍に濃縮する（Ｃｅｎｔｒｉｃｏ Ｃｏｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ５，０００Ｋカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）。個々のウェルに、９０μｌのｚａｃｒｐ３Ｘ２含有培地又は対照培地を添加し、そしてプレートを、３７℃で５％ＣＯ_２において一晩インキュベートする。次の日、サンプルの半分は、１０μｌのＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ， Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）を受け、他の半分のサンプルは未処理であり、基本的発現を測定する。次に、プレートを、３７℃で、５％ＣＯ_２下で４時間インキュベートする。
【０４１０】
インキュベーションに続いて、培地を、プレートから除去し、そして５０μｌの抗−ヒトＶＣＡＭ抗体（１ｍｇ／ｍｌの原液の１：１０００の希釈、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）， ５０μｌの抗−ヒトＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（１ｍｌ／ｍｌの原液の１：１０００の希釈、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は５０μｌの抗−ヒトＥ−セレクチン抗体（１ｍｇ／ｍｌの原液の１：１０００の希釈、Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、三重反復ウェルに添加し、そしてプレートを、３７℃で５％ＣＯ_２下で１時間インキュベートする。
【０４１１】
抗体溶液を除去し、そしてプレートを、温ＲＰＭＩ＋５％ＦＢＳにおいて３度、洗浄する。最後の洗浄の後、ウェル当たり１００μｌの０．０５％グルテルアルデヒド溶液（ＰＢＳ中、５０％グルテルアルデヒドの１：１０００の希釈）をウェルに添加し、そしてプレートを室温で１０時間インキュベートする。プレートをＰＢＳにより３度、洗浄し、そしてウェル当たり５０μｌの第２抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ完全分子ＨＲＰ接合体の１：１０００の希釈；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ） をすべてのウェルに添加する。プレートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０４１２】
次に、プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）により５度、洗浄し、そしてウェル当たり１００μｌのＴＭＢ溶液（１０ｍｌの６０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０及び１００μｌの１．２％Ｈ_２Ｏ_２における、ＤＭＳＯ中、４ｍｇ／ｍｌのテトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ）１００μｌ）を、個々のウェルに添加する。プレートを室温で１５−２０分間、進行せしめ、この時点で、反応を、ウェル当たり１００μｌの１Ｍの硫酸を添加することによって停止する。プレートを、６５５ｎｍの対照波長を伴なって、４５０ｎｍで読みとる。
【０４１３】
ｚａｃｒｐ３（配列番号３）のように、ｚａｃｒｐ３Ｘ２は、ＩＣＡＭ−１発現に対して効果を示さないが、しかしＶＣＡＭ−１発現に対して効果は示すことが予測される。最大ＴＮＦ応答に比較される場合、ｚａｃｒｐ３により処理された細胞は、約５０％の阻害性を示した。ｚａｃｒｐ３はまた、低いけれども、Ｅ−セレクチン発現の１０％阻害効果を有した。ｚａｃｒｐ３Ｘ２はまた、類似する活性を示すことが予測される。
【０４１４】
ＶＣＡＭ−１発現を、ＴＲＢＭＥＣ細胞の直接的なアデノウィルス感染に続いて、測定する。手短に言及すれば、ＴＲＢＭＥＣ細胞を、ｚａｃｒｐ３を含むアデノウィルス又は親アデノウィルス株により直接的に感染する。ウィルスを、種々の感染の多重度（モイ５００、１，０００及び５，０００）で添加する。細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２下で４３時間インキュベートする。感染に続いて、アデノウィルス感染された細胞を、４時間ＴＮＦ（１ｎｇ／ｍｌ）により攻撃する。ＶＣＡＭ発現を上記のようにして測定する。ＶＣＡＭ−１発現の阻害は、モイ５０００であり約１３％、モイ１０００で約５％であり、そしてモイ５００で効果は見出されない。
【０４１５】
アデノウィルスならし培地を、製造業者の説明書に従って、１０倍に濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ ５，０００ｋ カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）、続いて５０℃で３０分間、熱不活性化する。濃縮され、熱不活性化されたサンプルを、上記のようにしてアッセイする。ＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンに関しては、阻害性は１００％である。類似する結果が、ＩＬ−１又はＬＰＳのいずれかが付着分子発現を誘発するために使用される場合、観察される。ＩＣＡＭ−１に関しては、阻害はほぼ基線まで低められる。実験を、種々の濃度のｚａｃｒｐ３Ｘ２熱不活性化されたアデノウィルスならし培地により反復する。ｚａｃｒｐ３のように、ａｃｒｐ３Ｘ２は、５Ｘで完全な阻害、２．５Ｘで５０％の阻害を示し、そして０．５Ｘで阻害を示さないことが予測される。
【０４１６】
Ｏｕｃｈｉなど．， （前記）及びＣｙｂｕｌｓｋｙ ａｎｄ Ｇｉｍｂｒｏｎｅ （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１： ７８８−９１， １９９１）に従ってのＴＨＰ−１単球付着アッセイは、上記ＶＣＡＭ−１について見出されるので同じ結果を示す。
【０４１７】
例５．コラーゲン誘発された血小板凝集の阻害
１０倍のｚａｃｒｐ３Ｘ２アデノウィルスならし培地及び親対照を用いて、コラーゲン誘発された血小板凝集に対する効果を測定する。クロノロギュー アグレゴメーター（ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｕｅ ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ．， Ｈａｖｅｒｔｏｎ， ＰＡ）を用いて、Ｉ型コラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏ−ｐａｒ ＃３８５）のみに対する、又はｚａｃｒｐ３Ｘ２含有ならし培微の存在下でのそのコラーゲンに対する血小板凝集を測定する。
５０μｌの５０倍のｚａｃｒｐ３Ｘ２アデノウィルスならし培地を、４５０μｌの洗浄された血小板懸濁液に添加する。血小板を軽く混合し、そしてコラーゲンを添加し、５μｇ／ｍｌの最終濃度にする。凝集を、％光透過率を記録することによって測定する。
【０４１８】
配列番号４によりコードされるｚａｃｒｐ３ポリペプチドに関しては、コラーゲン誘発された血小板凝集は、１倍の最終濃度のｚａｃｒｐ３含有ならし培地により、コラーゲン対照の約８０％、阻害された。親対照は阻害性を示さなかった。０．５倍の最終濃度で、凝集は約２５％で阻害された。ｚａｃｒｐ３Ｘ２変異体は、類似するコラーゲン誘発された血小板凝集活性を示すことが予測される。
【０４１９】
さらに、血液を健康なボランティアから、クエン酸ナトリウムを含む管中に採血し、室温で維持し、そして採血の４時間以内に使用する。完全な血液を、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ５６０Ａ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ｌｕｍｉ−Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ （Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ．， Ｈａｖｅｒｔｏｎ， ＰＡ） を用いて、製造業者の説明書に従って、血小板活性化について分析する。個々の試験点に関しては、５００μｌの血液を、撹拌棒、及び０〜２０μｇ／ｍｌの濃度でｚｓｉｇ３７を含む等張塩溶液５００μｌを含む反応管に添加する。その混合物を、４分間インキュベートし、続いて、血小板活性化を、血液／ｚｓｉｇ３７混合物への１ｍｇ／ｍｌの交差連結されたコラーゲン（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ．）５μｌの添加により開始する。ＡＤＰ（１０μＭの最終濃度）及びトロンビン（１Ｕ／ｍｌの最終濃度）による活性化の阻害を、類似する手段で試験する。
【０４２０】
例６．微小血管内皮細胞を用いての ＮＦ κ Ｂ の阻害及びルシフェラーゼ ＮＦ κ Ｂ レポーターアッセイ
微小血管内皮細胞を、５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中、５０，０００個の細胞／ウェルでプレートする。次の日、Ｂ２−２ ＮＦκＢアデノウィルス構造体を、５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中、５，０００の感染の多重度で添加する。１５時間後、１０倍のｚａｃｒｐ３Ｘ２含有アデノウィルスならし培地及び親対照培地を個々のウェルに添加する。細胞を一晩インキュベートする。次の日、アゴニストＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）， ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）を、ウェルの半分に添加し、そしてプレートを３７℃で４．５時間インキュベートする。次に、プレートを、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ及びｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて進行せしめ、そしてルシフェラーゼを発光計を用いて測定する。
【０４２１】
配列番号４によりコードされるｚａｃｒｐ３ポリペプチドに関しては、親対照は、最大ＴＮＦ応答を約２５％、及びＬＰＳ応答を約１０％低める、いくらかの低い阻害効果を有した。効果は、最大ＩＬ−１応答に対しては見られなかった。５倍の最終濃度でのｚａｃｒｐ３含有ならし培地は、ＴＮＦ， ＩＬ−１及びＬＰＳ応答を約９０％低めた。ｚａｃｒｐ３Ｘ２変異体はまた、類似する阻害活性を示すことが予測される。
【０４２２】
さらに、予備実験においては、ｚａｃｒｐ３ならし培地を、アデノウィルス ルシフェラーゼレポーター構造体により感染された細胞に対して試験した。試験されるならし培地は、ＢＨＫ細胞、バキュロウィルス、ＴＲＢＭＢ細胞からの２種のサンプル、及び２９３細胞からであった。使用されるレポーターは、ＳＴＡＴ／ＳＲＥ、ＮＦκＢ及びＣＲＥであった。予備結果は、結腸細胞系における応答を示し、その結果、４種の結腸又は小腸系が試験された。ならし培地対照に対するシグナルの阻害がすべての細胞系において見られた。しかしながら、この応答は、レポーターに対して特異的ではなかった。Ｃｈａｎｇ肝臓及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を試験し、効果が細胞型関連されるかどうかを決定した。それらの細胞型はまた、すべてのレポーターによる阻害を示した。
【０４２３】
ならし培地に含まれる他の因子の効果を排除するために、同時感染実験を行った。上記と同じ結腸又は小腸細胞系を、ｚａｃｒｐ３アデノウィルス及びルシフェラーゼレポーター構造体により感染した。ＬｏＶｏ細胞（ヒト結腸）は、３種の別々の実験に基づいてのＣＲＥレポーターによる阻害を示した。ＩＥＣ−６細胞（ラット小腸）は、ＮＦκＢ及びＳＴＡＴ／ＳＲＥレポーターの両者による阻害を示した。Ｃｈａｎｇｅ肝臓細胞は、ＮＦκＢレポーターによる刺激を示した。それらのすべてのサンプルを、ウェスターン分析によりｚａｃｒｐ３２ついて試験したが、しかしウェスターンアッセイ条件下で陰性であった。ｚａｃｒｐ３Ｘ２変異体はまた、類似する阻害活性を示すことが予測される。
【０４２４】
ＮＦκＢは、免疫又は炎症応答および細胞増殖対照に関与するタンパク質をコードする遺伝子の活性化及び転写を調節する（Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ．Ｓ．， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４： ６４９−８１， １９９６）。ＮＦκＢ結合部位は、ＴＮＦ、ＩＬ−１及びＩＬ−６を包含する多くのプロ−炎症遺伝子のプロモーターに見出される。従って、ＮＦκＢの活性化は、慢性炎症性患者、例えばリウマチ様関節炎又はアテローム硬化症の進行において、又は急性情況、例えば敗血性ショックにおいて決定的な役割を演じる。炎症性サイトカイン生成のＬＰＳ刺激は、多量のそれらのタンパク質をもたらし、究極的には、低められた血圧及び一般的な器官不全を導く。
【０４２５】
ＮＦκＢのインヒビターは、それらのプロ−炎症状態のための治療剤として使用される。関節炎を処理するために現在使用される治療剤、例えばプレドニゾン又は金化合物は、ＮＦκＢを阻止することが知られている。他の状態、例えばアルツハイマー症は、アミロイドβペプチドによるＮＦκＢ活性を包含する。ＮＦκＢはまた、自己免疫疾患、例えばＮＤκＢ活性化のインヒビターが治療剤である全身性エリテマトーデスにも包含される。
前記から、本発明の特定の態様が例示の目的のために本明細書において記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは、理解されるであろう。

Claims (14)

1. 配列番号２を含んで成る単離されたポリペプチド。
2. 親和性標識、毒素、放射性核種、酵素及びフルオロフォアー（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）から成る群から選択された成分に、アミノ又はカルボキシル末端で共有結合される請求項１記載の単離されたポリペプチド。
3. （ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３−１８６から成るポリペプチド；及び
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２３−３１９から選択されたポリペプチドから成る第１部分、及びペプチド結合により結合される、もう１つのポリペプチドを含んで成る第２部分を含んで成る融合タンパク質。
4. 医薬的に許容できるビークルと組合される請求項１記載の単離されたポリペプチド。
5. 請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント。
6. 前記抗体が、
   （ａ）ポリクローナル抗体；
   （ｂ）ネズミモノクローナル抗体；
   （ｃ）（ｂ）由来のヒト型化抗体；
   （ｄ）抗体フラグメント；及び
   （ｅ）ヒトモノクローナル抗体から成る群から選択される請求項５記載の抗体。
7. 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）， Ｆ（ａｂ）， Ｆａｂ’， Ｆａｂ， Ｆｖ， ｓｃＦｖ及び最小の認識単位から成る群から選択される請求項５記載の抗体フラグメント。
8. 請求項５記載の抗体に対して特異的に結合する抗−イディオタイプ抗体。
9. 配列番号２のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
10. ａ）配列番号１の核酸分子；及び
    ｂ）配列番号７の核酸分子から成る群から選択された、単離された核酸分子。
11. ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３−１８６から成るポリペプチド；及び
    ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２３−３１９から成るポリペプチドから成る群から選択された第１部分、及びペプチド結合により結合される、もう１つのポリペプチドを含んで成る第２部分を含んで成る融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
12. 次の作用可能に連結された要素：
    転写プロモーター；
    請求項１記載のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメント；及び
    転写ターミネーターを含んで成る発現ベクター。
13. 請求項１３記載の発現ベクターが導入されている、前記ＤＮＡセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
14. ポリペプチドの生成方法であって、
    請求項１３記載の発現ベクターが導入されている細胞を培養し；
    それにより前記細胞が前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを発現し；そして
    前記発現されたポリペプチドを回収することを含んで成る方法。