KR20210069510A

KR20210069510A - 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20210069510A
Application number: KR1020190159420A
Authority: KR
Inventors: 안동준; 이예담; 김도년; 이찬석; 우상욱; 박수현
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 부경대학교 산학협력단; 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2021-06-11
Also published as: JP2021100378A; US11800864B2; JP7170276B2; US20210161125A1; KR102368783B1

Abstract

본 발명은 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 및 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 상기 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산을 포함하는 핵산 구조체를 포함함으로써, 얼음 재결정 억제 효과가 우수하여, 세포 동결 보존 시에 세포의 생존률을 높일 수 있으며, 식품의 동결에 사용시에도 그 식품의 식감을 유지할 수 있도록 하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물{COMPOSITION FOR INHIBITING ICE RECRYSTALLIZATION}

본 발명은 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물에 관한 것이다.

저온보호제 (cryoprotective agent) (CPA)는 용액에 존재할 때 0℃ 아래의 온도에 노출된 용액에서 얼음 결정 형성을 감소 또는 저해시킬 수 있는 화합물이다. 현재의 CPA 는 소분자 (종종 침투성 CPA 로서 지칭됨), 합성 폴리머, 및 동결방지제 단백질을 포함한다.

장기 이식은 현재 생존율, 삶의 질, 및 비용 효과의 면에서 말기 장기 부전에 대한 최선의 치료법이다. 불행하게도, 장기 이식물의 공급과 수요 사이에 가파른 간격이 존재하며, 이는 쇠약하게 하는 질환을 갖는 환자가 오랜 기간 대기 시간에 걸쳐 낮은 삶의 질을 겪게 만드는 중대한 의료 장벽 중 하나이다. 장기의 뚜렷한 결여는 신뢰할 수 있는 보존 방법의 부재로부터의 상당한 폐기물로 인한 것이다. 실제로, 폐, 췌장, 및 심장의 50% 초과가 사망한 기증자로부터 수확되지 않은 채로 남는다.

장기를 적절하게 보존하기 위해서, 장기를 보존 용액으로 씻어서 혈액을 제거하고 장기를 안정화시켜야 한다. 보존 용액 중에 안정화시킨 후에도, 기증자로부터의 제거 후에 장기 할당, 수송, 및 이식에 이용가능한 시간은 제한적이다 (~6-12 시간). 이러한 작은 시간은 대부분의 장기가 지역 환자에게로 가는 것을 초래하며, 그 이유는 원격 환자 매치는 종종 제한된 시간 안에 확인될 수 없기 때문이다. 이러한 부족의 결과로서 및 사람의 장기의 판매를 금지하는 거의 모든 나라에 존재하는 법에도 불구하고, 불법 장기 거래 및 인신 매매가 증가하여 수요를 공급해 왔다.

장기 보존에서 사용되는 현재의 침투성 CPA 는 일반적으로 특히 에틸렌 글리콜, 1,2-프로판디올, 디메틸 술폭시드, 포름아미드, 글리세롤, 수크로스, 락토스, 및 D-만니톨을 포함한다. 장기 보존 온도에서 얼음 결정 성장을 감소 또는 저해시키기 위해서, 침투성 CPA 의 유효 농도는 매우 높아야 한다 (60% 이상이 종종 요구된다). 그러한 높은 농도에서 이들 화합물은 그들이 보존하려고 시도하는 조직에 독성일 수 있고, 이식 전 가온 (warming) 시에 CPA 의 대량 제거는 비가역적인 세포사를 초래할 수 있다.

얼음 결정 형성을 감소 또는 저해시키는데 사용되는 기타 CPA 는 합성 폴리머 및 동결방지제 단백질을 포함한다. 침투성 CPA 와 유사하게, 이들 각각은 그들의 결점을 갖는다. 예를 들어, 합성 폴리머는 세포 막을 침투할 수 없다. 따라서, 합성 폴리머 CPA 는 오직 세포외 얼음 형성만을 제어할 수 있다. 생물 샘플을 효과적으로 보존하기 위해서, 얼음 결정 형성은 세포 내부 및 외부 둘다에서 제어되어야 한다. 자연적으로-발생하는 동결방지제 단백질, 예컨대 어류, 식물, 또는 곤충에서 단리된 단백질은 얼음 형성을 방지하는데 고도로 효과적이지만, 현재 이용가능한 동결방지제 단백질은 순도가 낮고 엄청나게 비싸다. 부가적으로, 생물 샘플을 보존하기 위한 동결방지제 단백질의 사용은 면역원성의 잠재적 공급원을 도입한다.

DNA 오리가미 기술은 통상 7,000∼8,000개 정도의 염기를 지닌 긴 DNA 가닥(strand)을 수십에서 수백 개의 짧은 DNA 가닥들로 접고 고정하여 원하는 구조물을 만드는 기술이다.

DNA 나노기술에서는 원하는 형상의 구조물을 만들기 위해 왓슨-크릭 결합법칙을 이용하여 미리 프로그래밍된 특정한 염기서열의 DNA 가닥들을 합성한다. 해당 DNA는 자신과 상보적인 염기서열을 갖는 다른 DNA와 자가조립되어 이중나선 DNA를 이루며, 같은 원리를 이용하면 홀리데이 정션(Holliday junction)이라 불리는 결합부위(접힌 부위)를 통해 두 개의 이중나선 DNA를 평행하게 연결할 수 있다. 이와 같은 방법으로 다수의 이중나선 DNA를 연결하면 2차원 평면상에서 특정한 형상을 갖는 DNA 나노구조물을 제작할 수 있으며, 같은 원리를 공간상으로 확장하면 특정한 격자구조를 갖는 3차원 형태의 구조물이 만들어진다.

DNA 오리가미에서는 구조물을 만들기 위한 기본 뼈대로 7,000∼8,000개 정도의 염기로 구성된 긴 단일가닥 DNA를 사용하며, 이를 스캐폴드(scaffold)라 부른다. 또한, 스캐폴드의 특정한 부분들을 연결하여 나노구조물 만들기 위해 20∼50개 정도의 염기로 구성된 짧은 단일가닥 DNA를 약 200개 정도 화학적으로 합성해 사용하며, 이러한 DNA를 스테이플(staple)이라 한다. 스테이플은 만들고자 하는 구조물의 형상에 따라 스캐폴드의 특정한 부분에만 결합될 수 있도록 그 개수 및 염기서열이 정확하게 설계되어야 한다.

스캐폴드 및 스테이플의 상호결합은 수용액 상에서 이루어지며, 그 안에는 완충용액 버퍼와 DNA 사이의 정전기적 반발력을 완화시키기 위한 염이온(MgCl₂ 또는 NaCl)이 첨가된다. 모든 반응물이 포함된 용액을 80℃정도의 온도로 가열시킨 후 수 시간에서 수십 시간 동안 천천히 온도를 낮추는 열풀림(thermal annealing) 기법을 이용하면 수용액 속 스테이플들이 스캐폴드의 지정된 위치에 상보적으로 결합하면서 DNA 나노구조물을 이루게 된다.

이러한 DNA 오리가미 기술은 수 나노미터(nm) 이내의 높은 정밀도로 기존의 하향식 제작기법으로 만들 수 없는 복잡한 형상의 2차원/3차원 나노구조물을 제작할 수 있다.

그러나 이러한 DNA 구조체와 얼음 재결정화와의 관련성은 알려져 있지 않다.

한국공개특허 제2018-0084782호

본 발명은 신규한 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 세포 또는 조직 동결용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 식품 동결용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 세포 또는 조직의 동결 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 및 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산와 상보적인 서열을 가져, 상기 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산을 포함하는 핵산 구조체를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 그 음전하의 적어도 일부에 결합된 양이온을 포함하는, 조성물.

3. 위 2에 있어서, 상기 핵산 구조체는 상기 양이온은 Na⁺, NH₄ ⁺, 또는 Mg²⁺인, 조성물.

4. 위 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 2개 이상의 나선 다발을 포함하면서, 얼음 결정과 접촉할 수 있는 면을 포함하는, 조성물.

5. 위 1에 있어서, 상기 핵산 구조체의 나선 중 적어도 하나는 적어도 일부에 단일 가닥으로 이루어진 갭을 갖는, 조성물.

6. 위 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 비틀림을 갖거나 곡선의 나선 다발을 포함하는, 조성물.

7. 위 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포 또는 조직 동결용 조성물.

8. 위 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 동결용 조성물.

9. 위 7의 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 동결 방법.

본 발명의 조성물은 얼음 재결정 억제 효과가 우수하다. 이에, 이를 통해 세포 동결 보존 시, 세포의 생존률을 높일 수 있으며, 식품의 동결에 사용시에도 그 식품의 식감을 유지할 수 있다.

도 1은 스캐폴드 핵산과 스테이플 핵산이 결합하여 구조체를 형성하는 경우를 나타낸 도면이다.
도 2는 여러 핵산 오리가미 구조체를 도시한 것이다. A는 4 나선 다발 (견고 구조), B는 4 나선 다발(유연구조), C는 로테문트 스퀘어, D는 12 나선 다발(견고구조), E는 12 나선 다발(90도 굽은 구조), F는 12 나선 다발(45도 굽은 구조)이다.
도 3은 4, 6, 12 나선 다발 견고 구조를 도시한 것이다.
도 4는 4 나선 다발 유연구조, 6 나선 다발 유연구조를 도시한 것이다.
도 5는 갭을 갖는, 또는 갖지 않는 오리가미 구조체를 도시한 것이다.
도 6은 1차 쉘 내의 양이온을 둘러싼 물 분자의 옥타헤드럴 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 양이온의 2차 쉘 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 온도 225K에서의 다양한 이온 농도에 따른 얼음 성장(Ice fraction) 결과이다. (A)는 control(no ions+ pure water)에 대한 10 mM NaCl과 10 mM MgCl₂ 용액의 얼음 성장(Ice fraction). MgCl₂(Pink), NaCl (Brown), control (Green). (B)는 control (no ions+ pure water)에 대한 50 mM NaCl과 50 mM MgCl₂ 용액의 얼음 성장(Ice fraction). MgCl₂(Blue), NaCl (Cyan), control (Green). (C)는 control(no ions+ pure water)에 대한 150 mM NaCl과 150 mM MgCl₂ 용액의 얼음 성장(Ice fraction). MgCl₂(Red), NaCl (Orange), control (Green). (D)는 (A), (B),(C)를 함께 도시한 도면.
도 9는 Mg²⁺ 이온과 물 분자의 라디칼 분포 함수이다.
도 10은 동적 평형화된 DNA 구조체들을 나타낸 것이다.
도 11은 10 mM MgCl₂ 존재 하의 5개 DNA 구조체의 RMSD 값을 나타낸 것이다.
도 12는 10 mM MgCl₂ 존재 하의 5개 DNA 구조체의 SASA 값을 나타낸 것이다.
도 13은 DNA 백본에서 10Å 이내의 Mg²⁺ 이온의 수를 나타낸 것이다.
도 14는 40ns DNA 백본에서 10Å 이내의 Mg²⁺ 이온의 분포를 나타낸 것이다.
도 15는 다양한 DNA 오리가미 구조체의 얼음 성장(ice fraction)을 나타낸 것이다.
도 16은 0ns에서의 환형(circular) DNA 오리가미 구조체의 최초 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 17은 30ns에서의 환형 DNA 오리가미 구조체의 동적 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), clipped plane 상에 있는 Mg²⁺ 이온(Red), 성장하는 얼음(Cyan), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 18은 0ns에서의 굽은(curved) DNA 오리가미 구조체의 최초 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 19는 30ns에서의 굽은(curved) DNA 오리가미 구조체의 동적 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 20은 0ns에서의 직선형 DNA 오리가미 구조체의 최초 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 21은 30ns에서의 직선형 DNA 오리가미 구조체의 동적 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 22는 0ns에서의 환형 측면형(cirle side) DNA 오리가미 구조체의 최초 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 23은 30ns에서의 환형 측면형 DNA 오리가미 구조체의 동적 구조를 나타낸 것이다. Ice seed층: 두께 8Å 의 prism surface (Blue), DNA 백본 (Orange), Mg²⁺ 이온 (Green), (a) 측면, (b) 앞, (c) 뒤.
도 24는 직선형 DNA 오리가미 주변의 Mg²⁺ 이온의 수를 나타낸 것이다.
도 25는 환형 DNA 오리가미 주변의 Mg²⁺ 이온의 수를 나타낸 것이다.
도 26은 굽은 DNA 오리가미 주변의 Mg²⁺ 이온의 수를 나타낸 것이다.
도 27은 환형 측면형 DNA 오리가미 주변의 Mg²⁺ 이온의 수를 나타낸 것이다.
도 28은 여러 DNA 오리가미의 20ns 동안 RMSD 값을 나타낸 것이다.
도 29는 여러 DNA 오리가미의 20ns 동안 SASA 값을 나타낸 것이다.
도 30은 여러 DNA 오리가미의 20ns 동안 얼음 성장을 나타낸 것이다.
도 31은 RI 효과 측정 방법을 나타낸 개략도이다.
도 32 및 33은 순수한 증류수에 MgCl₂만 함유된 버퍼 용액에 대한 RI 측정 결과이다.
도 34 및 35는 구조화되지 않은 단일 가닥 상태의 DNA가 존재하는 용액에 대한 RI 측정 결과이다.
도 36 및 37은 스캐폴드 DNA 시료의 RI 측정 결과이다.
도 38은 4헬릭스 번들 견고 구조 및 유연 구조를 나타낸 것이다.
도 39는 6헬릭스 번들 견고 구조 및 유연 구조를 나타낸 것이다.
도 40은 로테문트 스퀘어 구조를 나타낸 것이다.
도 41은 12헬릭스 번들 견고 구조 및 굽은 구조를 나타낸 것이다.
도 42 내지 45는 DNA 오리가미 구조체의 RI 효과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물은 얼음 결정의 형성 또는 성장을 억제할 수 있다.

얼음 결정은 얼음 재결정화를 통해 성장할 수 있는데, 이는 작은 얼음 결정으로부터 더 큰 얼음 결정으로 성장하는 과정을 의미하고, 이 성장은 오스왈드 숙성(Ostwald ripening) 메커니즘을 따라 일어난다. 오스왈드 숙성(Ostwald ripening)은 상온 및 결정 사이 표면 에너지 차이로 인한 압력으로 인해 융해-확산-재동결 또는 승화-확산-응축 메커니즘으로 진행될 수 있다. 다시 말하자면, 얼음 결정의 성장은 얼음끼리 붙어서 성장하는 것이 아니라, 작은 얼음 결정이 결정 사이에서 융해되어 큰 얼음 결정 쪽으로 확산된 후 큰 얼음 결정의 일부가 되어 재동결되면서 일어나게 된다.

얼음 결정의 성장 억제는 얼음이 형성되지 않도록 하거나 얼음 형성 속도를 늦추거나, 얼음의 재결정화가 되지 않도록 하거나, 얼음 재결정화 속도를 늦추거나, 얼음 결정의 크기를 작게 유지하는 작용을 의미한다.

본 발명의 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물은 핵산 구조체를 포함한다.

핵산 구조체는 핵산 오리가미 구조체일 수 있다.

핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

핵산 오리가미 구조체는 도 1에 예시된 바와 같이, 스캐폴드 핵산이 복수개의 스테이플 핵산과 결합하면서, 스캐폴드 핵산의 소정 부분이 접혀 형성되는 구조체이다.

스캐폴드 핵산은 단일가닥의 핵산으로서 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 통상적으로 7000 내지 8000 뉴클레오티드(nt) 정도의 길이를 가진 종류를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 7,249nt 길이의 M13mp18 DNA를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. M13mp18 스캐폴드 DNA를 사용하여 DNA 구조체를 제작한 경우, 만들어진 구조체 하나의 분자량은 약 5 메가달턴이며, 이는 약 10^-20 kg에 상응하나 이에 제한되는 것은 아니다.

스테이플 핵산은 적어도 일부분이 상기 스캐폴드 핵산의 적어도 일부분과 상보적인 서열로 이루어져, 스캐폴드 핵산과 결합하여 이중 가닥을 형성하며, 스캐폴드 핵산이 특정 위치에서 접히거나 고정되도록 할 수 있다.

스테이플 핵산은 그 길이는 형성하고자 하는 구조체의 길이, 크기, 모양 등에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 예를 들면 20 내지 50nt일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

핵산 오리가미 구조체는 스테이플 핵산이 스캐폴드 핵산의 특정 위치에 결합하여 스테이플 핵산이 특정 위치에서 접혀 특정의 구조체를 형성하는 것으로서, 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산이 그러한 특정 구조체를 갖도록 설계된다.

스테이플 핵산의 설계는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들면 caDNAno 등의 디자인 프로그램을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

핵산 오리가미 구조체는 통상의 열풀림(thermal annealing) 기법을 사용하여 제조될 수 있다.

이는 원재료인 스캐폴드 핵산과 스테이플 핵산을 고온(예를 들어 70~100℃)으로 가열하여 모든 핵산 가닥이 단일가닥 상태로 있도록 만들어 주는 것으로 시작한다. 핵산 가닥은 염기서열에 따라 녹는점(melting temperature)이 존재하며 이 온도 이상이면 주로 단일가닥, 이하일 경우 주로 이중가닥으로 존재하게 된다. 이후 반응 용액의 온도를 천천히 낮춰주게 되면, 핵산 가닥이 상보적으로 결합하면서 이중가닥으로 존재하기 시작하며, 핵산 오리가미에서는 200개 정도의 스테이플 핵산이 협력적으로 결합하면서 설계했던 위치에 결합, 원하는 형상의 구조체가 생성된다.

스테이플 핵산마다 염기서열이 다르므로 결합 시점은 조금씩 다르지만 통상의 열풀림 기법은 충분한 시간(수 시간 이상)에 걸쳐 서서히 온도를 낮추기 때문에 모든 스테이플 핵산이 결합하기 충분한 조건이며, 따라서 구성하는 스테이플 핵산의 염기서열과 무관하게 원하는 형상을 갖도록 제작할 수 있다.

스캐폴드 핵산은 기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이루고, 스테이플 핵산은 스캐폴드 핵산이 기결정된 위치에서 접히도록 설계된 서열들을 갖는 것으로서, 상기 방법으로 스캐폴드 핵산에 결합하면서 스캐폴드 핵산이 소정의 구조를 형성하도록 한다.

스캐폴드 핵산 가닥과 스테이플 핵산이 결합하여 이중 가닥(이중 나선)을 이룰 수 있는데, 핵산 오리가미 구조체는 예를 들면 2 내지 50, 2 내지 45, 2 내지 40, 2 내지 35, 2 내지 30, 2 내지 25 또는 2 내지 20, 2 내지 12, 4 내지 12 나선 다발(helix bundle)을 가질 수 있고, 구체적으로는 4 나선 다발 내지 12 나선 다발을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 도 2 및 4에는 여러 개의 나선 다발을 갖는 핵산 오리가미 구조체가 예시되어 있다.

핵산 오리가미 구조체는 적어도 일부의 인접한 스테이플 핵산의 양 말단 사이에 갭(gap)을 갖는 것일 수 있다.

갭(gap)은 도 5 좌측에 예시된 바와 같이, 인접한 스테이플 핵산의 양 말단 사이에 형성된 단일 가닥 영역을 의미하는 것으로서, 스테이플 핵산과 상보적으로 결합하지 못한 스캐폴드 핵산 단일가닥 영역을 의미하는 것일 수 있으며, 그 구체적인 도식은 도 4, 5 등에서 확인할 수 있다.

상기 갭(gap)은 스테이플 핵산과 상보적으로 결합하지 못하여 이중나선 구조를 형성하지 못함에 따라, 해당 갭을 포함하는 대상 부위는 강성이 약해지는 결과를 낳고, 거시적으로는 핵산 오리가미 구조체 전체의 강성이 하향되는 방향으로 제어될 수 있다.

상기 갭(gap)의 길이는 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드 염기 수로 나타낼 수 있고, 이는 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5 뉴클레오티드 길이로 형성될 수 있으며, 보다 구체적으로는 1 내지 10 뉴클레오티드 길이일 수 있으나, 적절한 길이의 갭을 유지하여 핵산 오리가미 구조체 전체의 형상 유지와 자가조립 과정의 완전성을 고려한다는 측면에서 바람직하게는 1 내지 5 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

상기 갭(gap)의 개수는 강성 조절 대상 부위 내 단일 가닥 영역의 수를 의미하는 것으로서, (스테이플 핵산의 개수 -2)을 갭의 최대 개수로 하여, 해당 갭을 포함하는 대상 부위 및 핵산 오리가미 구조체 전체의 강성을 제어할 수 있다.

상기 갭(gap)은 홀리데이 교차점(holliday junction)과 10 뉴클레오티드 이상, 9 뉴클레오티드 이상, 8 뉴클레오티드 이상, 7 뉴클레오티드 이상, 6 뉴클레오티드 이상, 5 뉴클레오티드 이상, 4 뉴클레오티드 이상 또는 3 뉴클레오티드 이상의 간격이 되도록 형성될 수 있고, 스캐폴드 핵산과 스테이플 핵산 간 완전한 자가조립 과정을 통해 핵산 오리가미 구조체를 형성한다는 측면에서 바람직하게는 3 뉴클레오티드 이상이 되도록 형성할 수 있다.

핵산 오리가미 구조체는 핵산 백본의 인산기의 음전하 간의 반발력 상쇄를 위해 그 형성은 양이온 존재 하에서 수행될 수 있다. 이에 따라, 핵산 오리가미 구조체는 그 음전하에 결합된 양이온을 더 포함할 수 있다.

양이온은 1가 또는 2가 양이온으로서 예를 들면 Na⁺, Mg²⁺, NH₄ ⁺ 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

핵산 오리가미 구조체에서 양이온에 물 분자가 속박되어, 물 분자가 얼음 결정 성장에 사용되는 것을 방해하는 것으로 판단된다. 구체적으로 도 6, 7에는 Mg²⁺ 이온 주위의 물 분자 배열이 도시되어 있는데, 본 발명자들은 Mg²⁺ 이온에 처음 속박된 물 분자 6개(First shell)는 MD simulation 동안 다른 주변의 물 분자와 쉽게 교체되지 않고, 특유의 기하 구조(Octahedron) 구조를 유지함을 확인하였다. 또한, Mg²⁺ 이온 주위의 물 분자에 대한 보다 자세한 분석으로부터, Second shell에도 12개의 물 분자들이 속박되어 있다는 것을 발견하였다. First Shell에 비해 속박은 강력하지 않지만, 이들 Second shell에 존재하는 물 분자들은 얼음 결장 성장에 이용되지만, 성장 속도를 지연 시키는 역할을 함으로서, 얼음 결정 성장을 지연시키는 것으로 예상된다. 녹색으로 표시된 6개의 물 분자들은 First shell에 속박되어 있는 octahedron 구조의 물 분자들이고, 나머지 물 분자들은 Second shell에 속박되어 있는 Mg²⁺ 이온 주위의 12개의 물 분자들이다. 파란색으로 표시된 이온이 Mg²⁺ 이온이다. Mg²⁺ 주변의 물 분자들은 Mg²⁺ 포텐셜 내에 존재하고 있어서, 주변 얼음 결정 성장에 참여하는 데에 있어서, 순수 물분자 만으로 이루어진 용액의 얼음 결정 성장과는 다름을 알 수 있다. 이것이 분자 수준에서 Mg²⁺의 얼음 결정 성장 억제의 원인으로 생각된다.

물론, 핵산 가닥이 구조체를 이루지 않는 경우에도 핵산 백본의 음전하로 인해 주위의 Mg²⁺ 이온 농도를 부분적으로 증가시킬 수는 있으나, 핵산이 일정한 형상 및 강성을 가진 채 밀집하여 구조체를 이루고 있지 않으면 주위의 얼음 결정이 성장하는 과정에서 Mg²⁺ 이온에 속박된 물 분자를 지속적으로 붙잡아둘 수 없기 때문에 RI 효과를 나타내기 어려운 것으로 보인다.

핵산 오리가미 구조체는 얼음 결정 성장 시에 얼음 표면에 양이온이 많이 분포하도록 하는 구조를 가질 수 있다.

이와 관련하여, 본 발명에 따른 핵산 오리가미 구조체는 비틀림을 가지거나 곡선인 나선 다발을 포함할 수 있다.

예를 들면 나선 다발의 비틀리는 방향은 염기의 삽입 또는 결실로 조절될 수 있는 것으로, 나선에 염기가 삽입되어 다발이 오른쪽 방향으로 뒤틀리거나, 염기가 결실되어 왼쪽 방향으로 뒤틀릴 수 있다. 뒤틀리는 정도는 염기의 개수로 조절될 수 있다. 삽입 또는 결실되는 염기의 수는 나선이 두 번 회전하는 매 21염기 길이당 1개 또는 2개일 수 있고, 그 이상인 경우라도 구조가 유지되는 데에 문제가 없다면 특별히 제한되지 않는다.

또한, 예를 들면 복수개의 나선 중 일측의 나선에는 염기를 삽입하고, 타측의 나선에는 염기를 삽입하지 않거나, 염기를 결실시켜, 나선 간 길이 차이가 나도록 하여 나선 다발이 곡선이 되도록 할 수 있다.

또한, 핵산 오리가미 구조체는 얼음 결정 생성 또는 성장 억제 측면에서 얼음 결정 성장면과 접촉할 수 있는 면을 포함할 수 있다. 선의 형태가 아닌, 면의 형태로 넓은 면적으로 얼음 결정 성장면과 접촉하여 얼음 결정 생성 또는 성장 억제 효과를 극대화할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 세포 또는 조직 동결용 조성물에 관한 것이다.

세포 또는 조직의 동결 보존하면, 이후 사용하고자 할 때 동결된 세포 또는 조직을 녹이는 과정에서 얼음 재결정화는 세포막을 손상시키고 세포 탈수를 진행시킴으로 인해 세포 및 조직에 손상을 입힌다. 저온 환경에 사는 유기체들은 얼음 재결정화로 인해 더 쉽게 손상을 받을 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상 보존을 위해 동결하여 사용하는 모든 세포가 그 적용대상이 될 수 있으며, 예를 들면 원핵 세포; 진핵 세포; 미생물; 동물 세포; 암 세포, 정자; 난자; 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 역분화 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포; 제대혈, 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함하는 혈액 세포; 신장 세포, 간 세포, 및 근육 세포를 포함하는 조직 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한 조직으로는 마찬가지로 보존을 위해 동결하여 사용하는 모든 조직이 그 적용대상이 될 수 있으며, 예를 들면, 각막, 신장, 심장, 소장, 췌장, 폐, 간 등 모든 조직이 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 세포, 조직 동결 보존을 위한 보존액을 포함할 수 있다. 보존액은 물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 핵산 구조체를 0.001 내지 0.5중량%, 구체적으로 0.01 내지 0.03중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

현재 조직 보존 과정에서 사용되는 침투성 소분자가 수십 퍼센트에 이르는 높은 무게비를 요구하는 것에 비해, 본 발명의 핵산 오리가미 구조체는 월등히 낮은 함량에서도 얼음 결정 성장 억제 효과를 가질 수 있어 세포 및 조직 보존에 보다 유리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 동결 방법에 관한 것이다.

상기 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 동결시키는 경우에, 이후 해동시에 얼음 재결정을 저해하여 세포 또는 조직이 손상되는 것을 방지할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 식품 동결용 조성물, 그리고 상기 조성물 존재 하에 식품을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 식품의 동결 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 모든 냉동 식품에 적용될 수 있으며, 이를 사용하면 해동시에 그 음식의 식감이 방지되는 것을 최소화 할 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 분자동역학 시뮬레이션을 통한 양이온 및 DNA에 따른 얼음 결정 성장 억제 효과 확인

(1) Mg ²⁺ 양이온 주위의 물 분자 결집 양상 분석

우선 분자 수준에서 Mg²⁺이온에 따른 얼음 결정 양상 변화를 살펴보았다. 도 6, 7에는 Mg²⁺ 이온 주위의 물 분자 배열이 도시되어 있다. 분자동역학(MD) 시뮬레이션 동안 Mg²⁺ 이온에 처음 속박된 물 분자 6개(First shell)는 다른 주변의 물 분자와 쉽게 교체되지 않고, 특유의 기하 구조(팔면체)를 유지함을 확인하였다(도 6). 또한, Mg²⁺ 이온 주위의 물 분자에 대한 보다 자세한 분석으로부터, Second shell에도 12개의 물 분자들이 속박되어 있다는 것을 발견하였다(도 7). First Shell에 비해 속박은 강력하지 않지만, 이들 Second shell에 존재하는 물 분자들은 얼음 결장 성장에 이용되지만, 성장 속도를 지연 시키는 역할을 함으로서, 얼음 결정 성장을 지연시키는 것으로 예상된다. 녹색으로 표시된 6개의 물 분자들은 First shell에 속박되어 있는 octahedron 구조의 물 분자들이고, 나머지 물 분자들은 Second shell에 속박되어 있는 Mg²⁺ 이온 주위의 12개의 물 분자들이다. 파란색으로 표시된 이온이 Mg²⁺ 이온이다. Mg²⁺ 주변의 물 분자들은 Mg²⁺ 포텐셜 내에 존재하고 있어서, 주변 얼음 결정 성장에 참여하는 데에 있어서, 순수 물분자 만으로 이루어진 용액의 얼음 결정 성장과는 다름을 알 수 있다.

(2) 양이온이 포함된 수용액에서의 얼음 재결정 억제 효과 분석

DNA 오리가미 구조체의 자유로운 설계를 위해서는, DNA backbone의 인산기의 음전하 간의 반발력을 상쇄하는 것이 필요한데, 이러한 반발력을 줄여 주기 위해 양이온의 사용을 필요로 한다.

DNA origami와 얼음 결정 성장의 상호 관계에 대한 분자 수준에서의 이해를 위해서, 물에 용해되어 있는 이온의 농도 및 종류에 따른 얼음 결정 성장에 대한 MD simulation을 진행하였다. MD simulation은 NAMD package 2.12를 사용하였고, CHARMM force field를 이용하였다. 효과적인 얼음 결정 성장을 위하여, water 모델은 TIP4를 사용하였다.

이온의 종류에 따른 영향을 확인하기 위하여 NaCl과 MgCl₂, 그리고 control(물만 있는 모델)의 세 가지 비교군을 만들었다. 이온의 농도에 따른 비교를 위해 NaCl 용액과 MgCl₂ 용액 0.01mol/L, 0.05mol/L, 0.15mol/L 의 모델을 만들어, 각 120ns까지 MD simulation을 진행하였으며, 물 분자의 개수는 약 41,500 개 가량이다. Simulation 온도는 얼음의 빠른 성장을 위해 273K 보다 낮은 225K에서 Ice seed 층으로부터 얼음이 성장할 수 있는 환경을 만들었다. 얼음이 전 방향으로 성장할 경우 Periodic boundary condition에 의해 얼음이 성장하면서 water box 밖으로 밀려나가지 않도록 Ice seed 층 아래의 일부 물 분자 층 (width = 5)에 constraint을 걸어 한 방향으로만 성장할 수 있게 유도하였다. Ice seed 는 prism surface를 사용하였다.

도 8을 참고하면, NaCl과 MgCl₂에 의해 225K에서 얼음 성장이 control에 비해 억제되고 있음을 확인할 수 있다. 각각 50 mM의 NaCl과 MgCl₂ 그리고 150 mM 의 NaCl과 MgCl₂의 얼음 성장 억제 효과는 유사하게 나타났다. 반면에, 10 mM의 NaCl과 MgCl₂의 농도에서는 MgCl₂의 얼음 성장 억제 효과가 NaCl에 비해 보다 크다는 것을 보여 주고 있다.

또한, Mg²⁺ 이온 주위의 물 분자의 개수를 확인하기 위해, MD simulation 결과를 바탕으로 Radial Distribution Function (RDF: g(r))을 계산하였다.

도 9를 참고하면, g(r) 함수 결과는 Mg²⁺로부터 2 Å 근처에 6개의 물 분자가 존재하고 있음을 보여 주고(First shell), 2 Å 보다 큰 거리들에도 주변의 물 분자들이 존재하고 있음을 보여 준다. 구체적으로, 2.7 Å 근처에 4개, 4 Å 근처에 2개, 그리고 4 Å 보다 먼 거리에도 물 분자가 존재하고 있다.

(3) 다섯 종류의 서로 다른 DNA 오리가미 구조체와 얼음 결정 성장 시뮬레이션

DNA가 구조체의 형태로 밀집하기 위해 필수적인 양이온 중 하나인 Mg²⁺ 이온이 얼음 결정 성장을 억제함을 MD simulation을 통해서 확인하였다. 이를 통해, 얼음 결정 성장 면과 Mg²⁺ 이온의 분포는 얼음 결정 성장에 매우 중요한 역할을 하고 있음을 알 수 있다. 이 사실을 바탕으로, DNA 오리가미는 DNA 백본의 인산기의 음전하로 인하여, 주변의 Mg²⁺ 이온의 분포에 영향을 주게 되고, 결국, DNA 오리가미 구조가 다르면, 이에 따른 Mg²⁺ 이온의 분포 변화가 생김으로써, 얼음 결정 성장에 영향을 줄 수 있음을 추론할 수 있다.

이 추론을 확인하기 위하여, 2개의 이중나선 DNA로 구성되며 서로 다른 조를 가지는 5종류의 DNA 다발 구조체를 시뮬레이션 하였다:

(1) 2HB_right1ins (base 1개를 추가 시킴으로써, DNA 다발의 뒤틀림 방향을 오른쪽으로 만든 것).

(2) 2HB_right2ins(base 2개를 추가 시킴으로써, DNA 다발의 뒤틀림 방향을 오른쪽으로 만든 것).

(3) 2HB_left1del (base 1개를 제거 함으로써, DNA 다발의 뒤틀림 방향을 왼쪽으로 만든 것).

(4) 2HB_left2del (base 2개를 제거 함으로써, DNA 다발의 뒤틀림 방향을 왼쪽으로 만든 것).

(5) 2HB_straight(뒤틀림이 없는 다발 구조체)

이들 DNA 구조는 길이는 거의 같고, 주로 DNA 다발의 뒤틀리는 방향에 변화를 준 구조들이다. 이들 5개의 서로 다른 구조가 얼음 결정 성장에 어떤 영향을 미치는지를 MD simulation을 통하여 ice fraction, DNA origami 구조 주변의 Mg²⁺ 이온 분포, DNA 백본 RMSD (Root Mean Square Deviation) 및 SASA (Solvent Accessible Surface Area)등을 측정하였다. 이전과 동일하게 10 mM MgCl₂ 이온 환경과 225K 온도에서 MD simulation을 40 ns 동안 수행하였다(도 10).

위에서 ICE seed 층으로 내려 보는 방향으로 2HB_straight은 검은색, 2HB_right1ins는 빨간색, 2HB_right2ins는 노란색, 2HB_left1del는 파란색, 2HB_left2del는 초록색으로 나타냈다.

1) RMSD

Left-turn 구조의 RMSD 값들이 큰 것이 특징적으로 나타났다(도 11). Straight와 Right-turn 구조에 비해 2배 이상의 RMSD 변화를 보였다. 이는 canonical DNA의 나선 방향이 오른쪽임을 고려하면, Left-turn 나선 구조의 DNA 오리가미 설계시에 보다 많은 torsion 에너지가 발생하였다고 생각할 수 있다. 이러한 구조체가 용액 내에서 동적으로 완화(Dynamical relaxation)되는 과정에서 보다 큰 RMSD 변화를 보인 것으로 해석할 수 있다.

2) SASA (Solvent-Accessible Surface Area)와 DNA 주변의 Mg ²⁺ 이온

SASA는 단백질 혹은 DNA 등의 표면적이 용매에 얼마나 많이 노출되는 가에 대한 값을 의미한다. 우리 계산 결과의 경우 SASA가 클수록 DNA의 백본이 용매에 많이 노출되며, Mg²⁺ 이온이 DNA 구조에 보다 많이 모일 것으로 예상하였다. 이것을 확인하기 위해, DNA 백본으로부터의 거리에 따른 Mg²⁺ 이온 개수를 계산을 통한 Mg²⁺ 이온 분포를 5종류의 서로 다른 구조체에 대해 비교하였다. SASA와 Mg²⁺ 이온 분포 계산 결과, SASA가 가장 큰 구조체의 백본으로부터 10 Å 내에서, Mg²⁺ 이온이 가장 많이 모여든 것을 확인했다. DNA 오리가미의 서로 다른 구조에 따라서, DNA 백본 근처 (10 Å)에 다르게 분포하는 Mg²⁺ 분포가 얼음 결정 성장에 서로 다른 영향을 줄 것으로 추론하였다.

SASA 계산에서 "probe radius" 는 1.4 Å을 사용하였다. 2HB_right2ins 구조의 SASA가 가장 크게 나타났고, 시간에 따른 변화 역시 크게 나타났다. 반면에, Left-turn으로 설계된 두 개의 구조 2HB_left1del과 2HB_left2del 구조의 SASA가 상대적으로 작은 값으로 나타났고, 그 중에서도 2HB_left2del 구조체의 SASA가 다른 5개의 구조체 SASA 중에서 가장 작은 값으로 나타났다(도 12).

DNA 백본으로부터 10 Å 내의 Mg²⁺ 이온의 개수는 SASA 결과와 유사한 순서로 2HB_right2ins 구조 근처의 Mg²⁺ 이온 개수가 가장 많은 것으로 계산되었다. 반면에, Left-turn으로 설계된 두 개의 구조, 2HB_left1del 과 2HB_left2del 구조체 주변의 Mg²⁺ 이온의 개수가 상대적으로 작은 것으로 계산되었다. 그 중에서도 2HB_left1del 구조체 주변의 Mg²⁺ 이온의 개수가 다른 5개의 구조체 SASA 중에서 가장 작은 값으로 나타났다(도 13).

도 14는 서로 다른 5개 구조체의 시작 구조 (0 ns) 와 동적으로 완화된 40 ns 에서의 구조를 보여 준다. 또한, DNA backbone 구조에서 10 Å 내의 Mg²⁺ 이온의 분포도 함께 나타냈다. 2HB_straight은 검은색, 2HB_right1ins는 빨간색, 2HB_right2ins는 노란색, 2HB_left1del는 파란색, 2HB_left2del 구조는 초록색으로 나타냈다.

Right-turn으로 제작된 DNA 구조체들은 초기 구조(0 ns)에 대해 DNA 백본 사이의 거리가 벌어져 있음을 알 수 있다. 이들 right-turn으로 제작된 DNA 오리가미 구조체들은 DNA 백본 사이의 틈새들이 벌어져서(open), SASA 값이 증가한 것으로 생각된다. 그리고, 이들 벌어진 틈새로 Mg²⁺ 이온들이 모여 들어서, DNA 백본으로부터 10 Å 내의 Mg²⁺ 이온의 개수들이 증가함을 알 수 있다. 반면에, Left-turn으로 제작된 DNA 오리가미 구조체들은 큰 RMSD 변화를 보임에도 불구하고, 40 ns 에 동적 평형을 이룬 구조로부터, 큰 값의 RMSD는 초기 구조 (0 ns)에 대하여 주로 torsion 에너지와 관련한 회전에 따른 구조 변화에 의한 것임을 알 수 있고, 실제로 DNA 백본 간의 틈새는 오히려 줄어들었음을 알 수 있다(closed). Left-turn 구조체들은 큰 RMSD 변화에도 불구하고, 상대적으로 Right-turn 구조체에 대해 작은 SASA값을 가지고 있음을 알 수 있다.

3) 얼음 성장(Ice fraction)

SASA 값이 가장 작은 2HB_left2del(Green)의 얼음 결정 성장이 가장 느리게 나타났고, 그 다음으로 얼음 결정 성장이 억제된 것은 2HB_left1del(Blue)로 나타났다. 즉, DNA 백본 구조체의 틈새들이 상대적으로 크게 벌어지지 않음으로써, DNA 백본으로부터 10 Å 내의 Mg²⁺ 이온의 개수가 가장 적은 구조들이 얼음 결정 성장이 가장 억제 되었음을 보여 준다. 반면 가장 큰 SASA 값을 갖고, 10 Å 내의 Mg²⁺ 이온의 개수가 가장 큰 값을 가지고 있는 2HB_right1ins(Red)와 2HB_right2ins(Orange)의 구조들은 상대적으로 얼음 결정 성장 억제가 적었다(도 15).

(4) 거대 구조의 서로 다른 DNA 오리가미 구조체와 얼음 결정 성장 시뮬레이션

앞서 MD simulation 을 통하여, DNA 구조체의 다양한 뒤틀림 방향 및 정도에 따른 얼음 결정 성장 속도 사이의 상관관계를 유추하였다. 보다 뚜렷한 차이를 관찰하기 위해, 같은 단면을 갖고 있으나 형상의 차이가 큰 4종류의 구조를 설계하였다.

1) 환형(Circular) DNA 다발 구조체

2) 직선형(Straight) DNA 다발 구조체

3) 굽은(Curved) DNA 다발 구조체

4) 환형 DNA 다발 구조체와 얼음 표면과의 접촉면을 바꾼 시스템 (환형 측면형(Circle-Side)으로 명명)

이들4개의 서로 다른 구조가 얼음 결정 성장에 어떤 영향을 미치는 지를 MD simulation을 통하여 ice fraction, DNA 오리가미 구조 주변의 Mg²⁺ 이온 분포, DNA 백본 RMSD (Root Mean Square Deviation) 및 SASA (Solvent Accessible Surface Area) 등을 측정하였다. 이전과 동일하게 10 mM MgCl₂ 이온 환경과 225K온도에서 MD simulation을 30 ns 동안 수행하였다

시스템 사이즈: Number of Atoms

Circular DNA bundle structure: 1,333,311

Curved DNA bundle structure: 1,430,960

Straight DNA bundle structure: 1,290,309

Circle_side DNA bundle structure: 1,881,446

도 16 내지 23을 참고하면, DNA 구조체들이 얼음 결정 성장을 억제하고, 얼음 결정 성장면과 인접하는 면적이 높은 구조체가 더 높은 성장 억제율을 나타내는 것을 확인할 수 있다.

도 24 내지 27은 각각의 DNA 백본으로부터 Mg²⁺ 이온 개수의 분포를 보여주고 있다.

도 28은 20 ns 동안의 4종류의 DNA origami 구조체에 대한 RMSD 값들을 보여주고 있다. 가장 큰 RMSD 변화는 circular DNA origami 구조체이고, 그 다음이 Circle_side DNA origami 구조체로 나타났다. 원형 DNA origami 구조체에 저장된 torsion 에너지 동적 완화를 통해 큰 변화를 보여 주고 있다.

도 29는 4 종류 DNA origami 구조체들의 SASA 변화를 보여준다. 시간에 따른 가장 큰 변화를 보여주는 구조체는 Circular DNA 구조체와 Circle_side 구조체 이다.

도 30은 Ice fraction 결과로서, circular DNA origami 구조체의 얼음 결정 성장이 가장 크게 억제되었다. 반면, circle_side DNA origami 구조체의 얼음 결정 성장이 가장 큰 것으로 나타났다. 이 결과는 DNA origami 구조체와 얼음 결정 성장면과의 거리가 비교적 멀어서, DNA 구조체의 접촉면이 얼음 성장에 크게 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다. 즉, DNA 오리가미 구조체가 얼음 결정 성장을 억제하기 위해서는 양이온을 보유한 상태에서 다양한 크기 및 방향을 가진 얼음 결정면과 효과적으로 접촉하는 것이 중요하며, 이를 위해서는 DNA가 일정한 형상 및 강성을 가진 상태로 밀집하게 뭉쳐 있어야 함을 예상할 수 있다.

2. 실험을 통한 양이온 및 DNA 구조체에 의한 얼음 결정 성장 억제 효과 확인

분자 수준에서의 양이온 및 DNA 가닥의 얼음 결정 성장 억제(recrystallization inhibition, 이하 RI) 효과를 확인한 것에 이어, 실제 거시적인 관측을 통해 나타나는 RI 효과를 관찰하기 위한 일련의 실험을 진행하였다

(1) 얼음 결정 성장 실험 방법

RI 효과 측정을 위해서 통상적으로 알려진 스플랫 쿨링(splat cooling) 실험 기법을 이용하였다 (도 31). 우선 액체질소로 미리 냉각된 금속 판 위에 커버글라스를 올리고(커버글라스 표면온도 약 -150°C), 약 1.5 m의 높이에서 RI 효과를 측정하고자 하는 소재가 분산된 용액을 20 ㎕ 떨어뜨린다. 용액은 커버글라스 위에 닿자마자 급속 냉각되면서 얇게 퍼지며 얼어붙게 되고, 급격한 냉각으로 인해 매우 작은 얼음 결정이 다수 생성된다. 이후 커버글라스를 구멍이 뚫려 있어 광학 현미경으로 관찰이 가능한 콜드 스테이지(cold stage)로 옮긴다. 콜드 스테이지는 -6°C로 유지되며, 30분간 작은 결정들이 점차 합쳐지면서 얼음 결정(ice grain)이 성장하는 모습을 관측한다. 이후 얼음 결정의 크기를 측정하여 대조군(결빙 제어 소재 없이 용액만 있는 샘플)과 비교해 얼마나 얼음 결정이 덜 성장하였는지를 비교한다.

(2) 양이온이 포함된 수용액 및 구조화되지 않은 DNA 시료의 RI 효과 관측

우선, 순수한 증류수에 MgCl₂만 함유된 버퍼 용액에 대한 RI 측정 실험을 진행하였으며, 이온 농도가 증가함에 따라 얼음 결정 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 32, 33). 본 실험 결과를 바탕으로, 이후 실험에서의 기준(reference) 버퍼 용액의 MgCl₂ 농도는 5 밀리몰(mM)로 하였다. 시료의 RI 성능은 기준 버퍼 대비 시료의 상대적인 RI 성능 비교를 통해 측정되었으며, 값이 작을수록 높은 RI 성능을 의미한다.

다음으로는, 구조화되지 않은 단일 가닥 상태의 DNA가 존재하는 용액에 대한 RI 측정 실험을 진행하였다. 실험에서 사용한 DNA의 농도는 통상의 제조 공정을 통해 만들어진 DNA 구조체의 농도와 유사한 50에서 200ng/uL로 하였다. 6힐릭스 번들 견고 구조를 구성하는 169종류의 스테이플 DNA가 단일가닥 상태로 섞인 시료의 RI 성능을 측정한 결과 0.87에서 1.0 사이로, 버퍼 대비 거의 얼음 결정 성장 억제 효과가 없음이 관찰되었다(도 34, 35). 즉, DNA 가닥이 Mg²⁺ 이온을 결집시키는 효과가 있다고 하나, 수용액 속에서 일정한 형상 및 강성을 갖는 구조체를 이루고 있지 않으면 Mg²⁺ 이온을 붙잡아둘 수 없기 때문에 거시적으로는 RI 효과가 거의 발생하지 않는 것을 실험적으로 확인하였다.

또한 같은 방식으로 수행한 스캐폴드 DNA 시료의 RI 값은 최대 0.7 정도로 측정되었다(도 36, 37). 스캐폴드 DNA가 스테이플 DNA에 비해 약간의 RI 성능을 갖는 이유는 길이가 긴 스캐폴드 DNA의 특성 상, 전 영역이 단일가닥 상태로 존재하는 것이 아니라, 일부분이 서로 상보성을 갖고 이중가닥으로 결합하는 세컨더리 스트럭쳐(secondary structure)를 형성하고 있기 때문인 것으로 추정된다.

(3) 구조화된 DNA 오리가미 설계

이제 DNA 가닥끼리 밀집하게 연결되어 일정한 단면 형상 및 강성을 지니는 DNA 구조체에 대한 실험을 진행하였다. DNA 오리가미 기법의 예시로 설계된 9종의 구조체는 (1) 4헬릭스 번들 견고 구조, (2) 4헬릭스 번들 유연 구조(갭 5nt), (3) 6헬릭스 번들 견고 구조, (4) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 3nt), (5) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 5nt), (6) 로테문트 스퀘어(Rothemund square) 구조, (7) 12헬릭스 번들 견고 구조, (8) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (90°), (9) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (45°)이다.

각각의 구조체에 대한 설계 방법은 아래와 같다.

(1) 4헬릭스 번들 견고 구조 및 (2) 4헬릭스 번들 유연(갭 5nt) 구조

(1)번 및 (2)번 구조체는 단면이 네 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 한 변이 약 4.5 nm인 정사각형 모양으로 패킹(packing)되어 있다 (도 38). 약 192nt 길이를 기본으로 하여 같은 형태의 연결이 반복되는 구조를 지니며, 구조체의 총 길이는 약 600 nm이다. (1)번의 견고 구조체는 구조에 존재하는 모든 스테이플 DNA의 양 말단이 직접 맞닿게 설계되었으며, (2)번의 유연 구조체는 150개의 인접한 스테이플 DNA의 양 말단 사이가 5nt의 ssDNA로 구성되어 있다.

(3) 6헬릭스 번들 견고 구조, (4) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 3nt) 및 (5) 6헬릭스 번들 유연 구조 (갭 5nt)

(3), (4), (5)번 구조체는 단면이 여섯 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 육각형 모양으로 패킹(packing)되어 있다 (도 39). 약 168nt 길이를 기본으로 하여 같은 형태의 연결이 반복되는 구조를 지니며, 구조체의 총 길이는 약 400 nm이다. (3)번의 견고 구조체는 구조에 존재하는 모든 스테이플 DNA의 양 말단이 직접 맞닿게 설계되었으며, (4),(5)번의 유연 구조체는 169개의 인접한 스테이플 DNA의 양 말단 사이가 각각 3nt 및 5nt의 ssDNA로 구성되어 있다.

(6) 로테문트 스퀘어

(6)번 구조체는 단면이 스물 네 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 일직선으로 배열되어 시트 형태를 이룬다 (도 40). 구조체의 길이는 256nt로 약 90nm이며, 폭은 약 55nm이다. 구조에 존재하는 192개의 스테이플 DNA의 모든 말단은 직접 맞닿게 설계되었다.

(7) 12헬릭스 번들 견고 구조, (8) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (90°), (9) 12헬릭스 번들 굽은 구조 (45°)

(7), (8), (9)번 구조체는 단면이 열두 개의 이중가닥 DNA로 구성되어 있으며, 육각형 격자 모양으로 패킹(packing)되어 있다(도 41). (7)번 견고 구조체는 180개의 스테이플 DNA의 모든 말단이 직접 맞닿게 설계되었다. (8)번 및 (9)번 구조체는 구조체 중간에 존재하는 스테이플 DNA 11개를 제거하여 42nt 길이의 유연부위를 만들었으며, 구조물 양 끝을 연결하는 DNA의 길이를 각각 357nt 및 189nt로 짧게 하여 구조 가운데를 90도 및 45도로 굽은 모양을 제작하였다.

(4) DNA 오리가미의 제작 및 RI 효과 관측

이제 일정한 단면 형상 및 크기를 갖도록 구조화된 DNA 구조체의 얼음 결정 성장 억제 효과를 확인하였다. 상기 설계에 따라 만들어진 구조체의 형상은 원자힘현미경을 통해 측정되었다(도 42, 43, 44의 첫 번째 열 이미지). 적어도 두 종류의 서로 다른 밀도를 가진 상기 아홉 가지 DNA 구조체에 대하여 RI 실험을 수행한 결과, 최대 0.53의 RI값이 측정되었다(도 45). 단면의 면적이 가장 좁은 4헬릭스 번들(1,2번 샘플)에 비해 나머지 샘플이 더 높은 RI성능을 보였으며, 구조체의 농도가 높을수록 전반적으로 RI성능이 향상되는 경향을 보였다. 이는 단면 넓이가 일정 수준이 되어야 RI성능이 발휘될 만큼 Mg²⁺이온을 충분히 결집시킬 수 있고, 수용액 상에서 구조체의 개수가 많을수록 얼음 결정 성장을 억제할 수 있는 영역이 증가하기 때문인 것으로 보인다.

일련의 실험을 통해 양이온이 결집된 DNA 구조체를 포함한 조성물은 구조체를 형성하고 있지 않은 DNA와 대비하여 더 높은 얼음 결정 성장 억제 효과를 발휘할 수 있음을 실증하였다.

Claims

기결정된 위치에서 접혀 복수개의 가닥을 이룬 스캐폴드 핵산, 및 적어도 일부가 상기 스캐폴드 핵산과 상보적인 서열을 가져, 상기 가닥 중 적어도 하나에 결합되어 이중 가닥을 형성하는 복수개의 스테이플 핵산을 포함하는 핵산 구조체를 포함하는 얼음 결정의 형성 또는 성장 억제용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 그 음전하의 적어도 일부에 결합된 양이온을 포함하는, 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 핵산 구조체에 결합된 상기 양이온은 Na⁺, NH₄ ⁺, 또는 Mg²⁺인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 2개 이상의 나선 다발을 포함하면서, 얼음 결정과 접촉할 수 있는 면을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 구조체의 나선 중 적어도 하나는 적어도 일부에 단일 가닥으로 이루어진 갭을 갖는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 구조체는 비틀림을 갖거나 곡선의 나선 다발을 포함하는, 조성물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포 또는 조직 동결용 조성물.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품 동결용 조성물.
청구항 7의 조성물 존재 하에 대상 세포 또는 조직을 영하의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 세포 또는 조직의 동결 방법.