JP7170276B2 - 氷結晶の形成または成長抑制用組成物 - Google Patents
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Description
1.分子動力学シミュレーションによる陽イオン及びDNAによる氷結晶の成長抑制効果の確認
(1)Mg2+陽イオン周囲の水分子の結集様態の分析
まず、分子レベルでMg2+イオンによる氷結晶の態様の変化を調べる。図6、7には、Mg2+イオン周囲の水分子の配列が示されている。分子動力学(MD)シミュレーションの間、Mg2+イオンに最初に束縛された水分子6個(First shell)は、周囲の他の水分子と容易に切り替えられず、特有の幾何構造(八面体)を保持することを確認した(図6)。また、Mg2+イオン周囲の水分子をより詳細に分析したところ、Second shellにも12個の水分子が束縛されていることを発見した(図7)。First Shellと比べて束縛は強力ではないが、これらのSecond shellに存在する水分子は、氷結晶の成長に用いられるが、成長速度を遅延させる役割をすることにより、氷結晶の成長を遅延させるものであると予想される。緑色で表示される6つの水分子は、First shellに束縛されているオクタヘドロン(octahedron)構造の水分子であり、残りの水分子は、Second shellに束縛されているMg2+イオン周囲の12個の水分子である。青色で表示されるイオンはMg2+イオンである。Mg2+周囲の水分子は、Mg2+ポテンシャル内に存在しており、周囲の氷結晶の成長に参加するにあたり、純粋な水分子のみからなる溶液の氷結晶の成長とは相違することがわかる。
DNAオリガミ構造体の自由な設計のためには、DNAバックボーンのリン酸基の陰電荷間の反発力を相殺することが必要であり、この反発力を減らすために陽イオンの使用を必要とする。
DNAが構造体の形態に密集するために必須な陽イオンの一つであるMg2+イオンが氷結晶の成長を抑制することをMDシミュレーションにより確認した。これにより、氷結晶の成長面とMg2+イオンの分布は、氷結晶の成長に非常に重要な役割を果たしていることが分かる。これに基づいて、DNAオリガミは、DNAバックボーンのリン酸基の陰電荷により、周辺のMg2+イオンの分布に影響を与えることになり、結局、DNAオリガミ構造が異なると、これによりMg2+イオンの分布に変化が生じ、氷結晶の成長に影響を与え得ることを推論できる。
(1)2HB_right1ins(塩基(base)1個を追加することにより、DNAバンドルのねじれ方向を右にしたもの)。
(2)2HB_right2ins(base2個を追加することにより、DNAバンドルのねじれ方向を右にしたもの)。
(3)2HB_left1del(base1個を除去することにより、DNAバンドルのねじれ方向を左にしたもの)。
(4)2HB_left2del(base2個を除去することにより、DNAバンドルのねじれ方向を左にしたもの)。
(5)2HB_straight(ねじれのないバンドル構造体)
左回り(Left-turn)構造のRMSD値が大きいことが特徴的であり(図11)、StraightとRight-turn構造に比べて2倍以上のRMSDの変化を示した。カノニカル(canonical)DNAのらせん方向が右であることを考慮すると、Left-turnらせん構造のDNAオリガミの設計時に、より多くのトーション(torsion)エネルギーが発生したと考えられる。この構造体が溶液内で動的に緩和(Dynamical relaxation)される過程で、より大きなRMSDの変化を示したものと解釈することができる。
SASAは、タンパク質またはDNAなどの表面積が溶媒にいかに多く露出するかに関する値を意味する。我々の計算結果の場合、SASAが大きいほどDNAのバックボーンが溶媒に多く露出し、より多くのMg2+イオンがDNA構造に集まると予想した。これを確認するために、DNAバックボーンからの距離によるMg2+イオンの数を計算して、Mg2+イオンの分布を5種類の互いに異なる構造体で比較した。SASAとMg2+イオン分布の計算結果、SASAが最も大きい構造体のバックボーンから10Å内に最も多くのMg2+イオンが集まったことを確認した。DNAオリガミの互いに異なる構造によって、DNAバックボーンの近く(10Å)に異なるように分布するMg2+の分布が氷結晶の成長に互いに異なる影響を与えると推論した。
SASAの値が最も小さい2HB_left2del(Green)では、氷結晶の成長が最も遅いことが示された。その次に氷結晶の成長が抑制されたのは、2HB_left1del(Blue)であった。つまり、DNAバックボーン構造体の隙間が相対的に大きく開かないことにより、DNAバックボーンから10Å内のMg2+イオンの数が最も少ない構造において、氷結晶の成長が最も抑制されることを示す。これに対して、最も大きいSASA値を有し、10Å内のMg2+イオンの数が最も大きい値を有する2HB_right1ins(Red)と2HB_right2ins(Orange)構造では、相対的に氷結晶の成長抑制が少なかった(図15)。
先にMDシミュレーションにより、DNA構造体の様々なねじれの方向及び程度と、氷結晶の成長速度との相関関係を類推した。より明確な差異を観察するために、同じ断面を持っているが形状の差異が大きい4種類の構造を設計した。
1)環状(Circular)DNAバンドル構造体
2)直線状(Straight)DNAバンドル構造体
3)曲がった(Curved)DNAバンドル構造体
4)環状DNAバンドル構造体と氷表面との接触面を変えたシステム(環状側面型(Circle-Side)と命名)
環状DNAバンドル構造体(Circular DNA bundle structure):1,333,311
曲がったDNAバンドル構造体(Curved DNA bundle structure):1,430,960
直線状DNAバンドル構造体(Straight DNA bundle structure):1,290,309
環状側面型DNAバンドル構造体(Circle_side DNA bundle structure):1,881,446
分子レベルにおける陽イオン及びDNA鎖の氷結晶成長抑制(recrystallization inhibition、以下「RI」という。)の効果を確認したことに続き、実際の巨視的な観測によって示されるRI効果を観察するために一連の実験を行った。
RI効果を測定するために、通常知られているスプラット冷却(splat cooling)法を用いた(図31)。まず、液体窒素で予め冷却された金属板の上にカバーグラスを載せて(カバーガラスの表面温度は約-150℃)、約1.5mの高さから、RI効果を測定しようとする材料が分散された溶液を20μl落とす。溶液は、カバーガラスの上に触れてすぐに急速冷却されながら薄く広がって凍りつくことになり、急激な冷却によって非常に小さな氷結晶が多数生成される。その後、カバーガラスを、穴があいていて光学顕微鏡で観察可能なコールドステージ(cold stage)に移す。コールドステージは-6℃に維持され、30分間小さい結晶がだんだん集まって氷結晶(ice grain)が成長する様子を観測する。その後、氷結晶の大きさを測定し、対照群(氷結制御の材料のない溶液のみのサンプル)と比べて氷結晶がいかに少なく成長したのかを比較する。
まず、純粋な蒸留水にMgCl2のみを含有するバッファ溶液に対してRI測定実験を行い、イオン濃度が増加するにつれて氷結晶の成長が抑制されることを確認した(図32、33)。本実験結果に基づいて、後の実験での基準(reference)バッファ溶液のMgCl2濃度は5ミリモル(mM)とした。試料のRI性能は、基準バッファに対して試料の相対的なRI性能を比較して測定した。値が小さいほどRI性能が高いことを意味する。
DNA鎖同士が密集して連結されて一定の断面形状および剛性を有するDNA構造体に対して実験を行った。DNAオリガミ手法の例として設計された9種類の構造体は、
(1)4ヘリックスバンドルの堅固構造、
(2)4ヘリックスバンドルの柔軟構造(ギャップ5nt)、
(3)6ヘリックスバンドルの堅固構造、
(4)6ヘリックスバンドルの柔軟構造(ギャップ3nt)、
(5)6ヘリックスバンドルの柔軟構造(ギャップ5nt)、
(6)ロゼムンド・スクエア(Rothemund square)構造、
(7)12ヘリックスバンドルの堅固構造、
(8)12ヘリックスバンドルの曲がった構造(90°)、
(9)12ヘリックスバンドルの曲がった構造(45°)である。
(1)番及び(2)番の構造体は、断面が4つの二本鎖DNAで構成されており、一辺が約4.5nmの正四角形状にパッキング(packing)されている(図38)。約192ntの長さを基本にして同じ形態の連結が繰り返される構造を有し、構造体の合計の長さは約600nmである。(1)番の堅固構造体は、構造内に存在するすべてのステープルDNAの両末端が直接当接するように設計されている。(2)番の柔軟構造体は、150個の隣接するステープルDNAの両末端の間が5ntのssDNAで構成されている。
(3)、(4)、(5)番の構造体は、断面が6つの二本鎖DNAで構成されており、六角形状にパッキング(packing)されている(図39)。約168ntの長さを基本にして同じ形態の連結が繰り返される構造を有し、構造体の合計の長さは約400nmである。(3)番の堅固構造体は、構造内に存在するすべてのステープルDNAの両末端が直接当接するように設計されている。(4)、(5)番の柔軟構造体は、169個の隣接するステープルDNAの両末端の間がそれぞれ3nt及び5ntのssDNAで構成されている。
(6)番の構造体は、断面が24個の二本鎖DNAで構成されており、一直線に配列されてシート状をなす(図40)。構造体の長さは256ntで約90nmであり、幅は約55nmである。構造内に存在する192個のステープルDNAのすべての末端は、直接当接するように設計されている。
(7)、(8)、(9)番の構造体は、断面が12個の二本鎖DNAで構成されており、六角形の格子状にパッキング(packing)されている(図41)。(7)番の堅固構造体は、180個のステープルDNAのすべての末端が直接当接するように設計されている。(8)番及び(9)番の構造体は、構造体の中間に存在するステープルDNAの11個を除去して42ntの長さの柔軟部位を作成し、構造物の両端を連結するDNAの長さをそれぞれ357nt及び189ntに短くして、構造の中央が90度及び45度に曲がった形状に作成した。
一定の断面形状およびサイズを有するように構造化されたDNA構造体の氷結晶の成長抑制効果を確認した。前記の設計に基づいて作成された構造体の形状は、原子間力顕微鏡により測定した(図42、43、44の最初の列の画像)。少なくとも2種類の互いに異なる密度を持つ前記9種類のDNA構造体に対してRI実験を行ったところ、最大0.53のRI値が測定された(図4、5)。断面の面積が最も狭い4ヘリックスバンドル(1,2番のサンプル)に比べて、残りのサンプルでさらに高いRI性能が示され、構造体の濃度が高いほど全体的にRI性能が向上する傾向を示した。これは、断面の広さが一定レベルになって初めて、RI性能が発揮される程度のMg2+イオンを十分に結集させることができ、水溶液中で構造体の数が多いほど、氷結晶の成長を抑制できる領域が増加するからであると考えられる。
Claims (9)
- 既に決定された位置で折り曲げられて複数の鎖をなすスキャフォールド核酸と、少なくとも一部が前記スキャフォールド核酸と相補的な配列を有し、前記複数の鎖の少なくとも一つに結合して二本鎖を形成する複数のステープル核酸とを含む核酸構造体を含み、
前記核酸構造体は、4~24個のヘリックスバンドルを含 むことを特徴とする氷結晶の形成または成長抑制用組成物。 - 前記核酸構造体は、その陰電荷の少なくとも一部に結合された陽イオンを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記核酸構造体に結合された前記陽イオンは、Na+、NH4 +、またはMg2+である、請求項2に記載の組成物。
- 前記核酸構造体は、氷結晶と接触できる面を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記核酸構造体のヘリックスの少なくとも一つは、少なくとも一部に一本鎖からなるギャップを有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記核酸構造体は、ねじれを持つか、又は曲線のヘリックスバンドルを含む、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞または組織凍結用組成物。
- 請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物を含む、食品凍結用組成物。
- 請求項7に記載の組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法。
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