JP7170276B2 - 氷結晶の形成または成長抑制用組成物 - Google Patents

氷結晶の形成または成長抑制用組成物 Download PDF

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Description

本発明は、氷結晶の形成または成長抑制用組成物に関する。
低温保護剤（cryoprotective agent、ＣＰＡ）は、溶液中に存在するとき、０℃下の温度にさらされる溶液における氷結晶の形成を低減または阻害できる化合物である。現在のＣＰＡは、小分子（浸透性ＣＰＡと呼ばれることもある。）、合成ポリマー、および凍結防止剤タンパク質を含む。
現在、臓器移植は、生存率、生活の質および費用対効果の側面で末期臓器不全の最良の治療法である。しかし、残念ながら、臓器移植物の供給と需要の間には相当な格差が存在する。この格差は、体を衰弱させる疾患を有する患者に長期間の待機期間中の生活の質の低下を招き、重大な医療障壁になっている。臓器の顕著な不足は、信頼できる保存方法の不在により発生するかなりの廃棄物に起因する。実際に肺、膵臓および心臓の５０％以上は、死亡したドナーから提供されないままである。
臓器を適切に保存するためには、臓器を保存溶液で洗浄して血液を除去し、臓器を安定化させなければならない。保存溶液中で安定化した後も、ドナーから摘出後に臓器の割り当て、輸送及び移植に利用可能な時間は限られている（６～１２時間）。この短い時間は、ほとんどの臓器が地域の患者に提供されることをもたらす。遠隔の患者とのマッチは、限られた時間内に確認できないことがしばしばあるからである。この不足の結果として、ほぼ全ての国で人間の臓器の売買を禁止する法律が存在しているにもかかわらず、違法な臓器売買および人身売買が増加して需要を供給してきた。
臓器保存で使用される現在の浸透性ＣＰＡは、一般的に、特にエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、スクロース、ラクトース、及びＤ－マンニトールを含む。臓器保存温度で氷結晶の成長を低減または阻害するためには、浸透性ＣＰＡの有効濃度が非常に高くなければならない（６０％以上がしばしば求められる。）。その高濃度では、これらの化合物は保存しようとする組織に毒性であることがあり、移植前の加温時のＣＰＡの大量除去は不可逆的な細胞死を引き起こすことがある。
氷結晶の形成を低減または阻害するのに使用される他のＣＰＡは、合成ポリマー及び凍結防止剤タンパク質を含む。浸透性ＣＰＡと同様に、これらはそれぞれ欠点を持っている。例えば、合成ポリマーは、細胞膜を浸透することができない。このため、合成ポリマーＣＰＡは、細胞外の氷の形成のみを制御できる。生物サンプルを効果的に保存するために、氷結晶の形成は、細胞の内部及び外部の両方で制御しなければならない。自然に発生する凍結防止剤タンパク質、例えば魚類、植物または昆虫から単離されたタンパク質は、氷の形成を防止するのに非常に効果的であるが、現在利用可能な凍結防止剤タンパク質は、純度は低く、非常に高価である。付加的に、生物サンプルを保存するための凍結防止剤タンパク質の使用は、免疫原性の潜在的な供給源を導入する。
ＤＮＡオリガミ技術は、通常７，０００～８，０００個程度の塩基を持った長いＤＮＡ鎖（strand）を、数十から数百個の短いＤＮＡ鎖で折り曲げて固定し、所望の構造物を作り上げる技術である。
ＤＮＡナノテクノロジーでは、所望の形状の構造物を作るために、ワトソン－クリック結合法則を利用して、予めプログラムされた特定の塩基配列のＤＮＡ鎖を合成する。当該ＤＮＡは、自身と相補的な塩基配列を持った他のＤＮＡと自己集合されて、二重らせんＤＮＡを成す。同じ原理を利用すれば、ホリデイジャンクション（Holliday junction）と呼ばれる接合箇所（折り曲げられた箇所）を介して２つの二重らせんＤＮＡを平行に連結できる。この方法で多数の二重らせんＤＮＡを連結すると、２次元平面上で特定の形状を有するＤＮＡナノ構造物を作成することができる。同じ原理を空間に拡張すると、特定の格子構造を有する３次元形状の構造物が作られる。
ＤＮＡオリガミでは、構造物を作るための基本骨格として、７，０００～８，０００個程度の塩基で構成される長い一本鎖ＤＮＡを使用するが、これをスキャフォールド（scaffold）と呼ぶ。また、スキャフォールドの特定の部分を連結してナノ構造物を作るために、２０～５０個程度の塩基で構成される短い一本鎖ＤＮＡを約２００個程度化学的に合成して使用するが、このＤＮＡをステープル（staple）と呼ぶ。ステープルは、作ろうとする構造物の形状によって、スキャフォールドの特定の部分のみに結合するように、その数および塩基配列が正確に設計されなければならない。
スキャフォールドとステープルの相互結合は水溶液中で行われ、その中には、緩衝溶液バッファとＤＮＡとの間の静電反発力を緩和するために塩イオン（ＭｇＣｌ２又はＮａＣｌ）が添加される。すべての反応物が含まれた溶液を８０℃程度の温度で加熱した後、数時間から数十時間の間、徐々に温度を下げる熱アニーリング（thermal annealing）手法を用いると、水溶液中のステープルがスキャフォールドの指定位置に相補的に結合してＤＮＡナノ構造物を成すことになる。
このＤＮＡオリガミ技術は、数ナノメートル（ｎｍ）以内の高精度で、従来のトップダウン手法では作成できない複雑な形状の２次元／３次元ナノ構造物を作成することができる。
しかし、このＤＮＡ構造体と氷の再結晶化との関連性は知られていない。
韓国公開特許第２０１８－００８４７８２号公報
本発明は、新規な氷結晶の形成または成長抑制用組成物を提供することを目的とする。
本発明は、細胞または組織凍結用組成物を提供することを目的とする。
本発明は、食品凍結用組成物を提供することを目的とする。
本発明は、細胞または組織の凍結方法を提供することを目的とする。
１．既に決定された位置で折り曲げられて複数の鎖をなすスキャフォールド核酸と、少なくとも一部が前記スキャフォールド核酸と相補的な配列を有し、前記複数の鎖の少なくとも一つに結合して二本鎖を形成する複数のステープル核酸とを含む核酸構造体を含む氷結晶の形成または成長抑制用組成物。
２．前記項目１において、前記核酸構造体は、その陰電荷の少なくとも一部に結合された陽イオンを含む、組成物。
３．前記項目２において、前記核酸構造体に結合された前記陽イオンは、Ｎａ＋、ＮＨ４ ＋、またはＭｇ２＋である、組成物。
４．前記項目１において、前記核酸構造体は、２つ以上のヘリックスバンドルを含み、かつ氷結晶と接触できる面を含む、組成物。
５．前記項目１において、前記核酸構造体のヘリックスの少なくとも一つは、少なくとも一部に一本鎖からなるギャップを有する、組成物。
６．前記項目１において、前記核酸構造体は、ねじれを持つか、又は曲線のヘリックスバンドルを含む、組成物。
７．前記項目１～６のいずれか一つの組成物を含む細胞または組織凍結用組成物。
８．前記項目１～６のいずれか一つの組成物を含む食品凍結用組成物。
９．前記項目７の組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法。
本発明の組成物は、氷の再結晶の抑制効果に優れる。これにより、細胞の凍結保存時の細胞生存率を高めることができ、食品凍結に使用時にもその食品の食感を維持することができる。
図１は、スキャフォールド核酸とステープル核酸が結合して構造体を形成することを示す図である。 図２は、様々な核酸オリガミ構造体を示すものである。Ａは４ヘリックスバンドル（堅固構造）、Ｂは４ヘリックスバンドル（柔軟構造）、Ｃはロゼムンド・スクエア、Ｄは１２ヘリックスバンドル（堅固構造）、Ｅは１２ヘリックスバンドル（９０度曲がった構造）、Ｆは１２ヘリックスバンドル（４５度曲がった構造）である。 図３は、４、６、１２ヘリックスバンドルの堅固構造を示すものである。 図４は、４ヘリックスバンドルの柔軟構造、６ヘリックスバンドルの柔軟構造を示すものである。 図５は、ギャップを有するかまたは有しないオリガミ構造体を示すものである。 図６は、１次シェル内の陽イオンを取り囲む水分子のオクタヘドラル構造を示すものである。 図７は、陽イオンの２次シェル構造を示すものである。 図８は、温度２２５Ｋにおける様々なイオン濃度による氷成長（Ice fraction）の結果である。（Ａ）は、コントロール（no ions＋pure water）に対する１０ｍＭ ＮａＣｌと１０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液の氷成長（Ice fraction）であり、ＭｇＣｌ２（Pink）、ＮａＣｌ（Brown）、ｃｏｎｔｒｏｌ（Green）を示す。（Ｂ）は、コントロール（no ions＋pure water）に対する５０ｍＭ ＮａＣｌと５０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液の氷成長（Ice fraction）であり、ＭｇＣｌ２（Blue）、ＮａＣｌ（Cyan）、ｃｏｎｔｒｏｌ（Green）を示す。（Ｃ）は、コントロール（no ions＋pure water）に対する１５０ｍＭ ＮａＣｌと１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液の氷成長（Ice fraction）であり、ＭｇＣｌ２（Red）、ＮａＣｌ（Orange）、ｃｏｎｔｒｏｌ（Green）を示す。（Ｄ）は、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）を共に示す図である。 図９は、Ｍｇ２＋イオンと水分子のラジカル分布関数である。 図１０は、動的平衡化されたＤＮＡ構造体を示すものである。 図１１は、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下における５つのＤＮＡ構造体のＲＭＳＤ値を示すものである。 図１２は、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下における５つのＤＮＡ構造体のＳＡＳＡ値を示すものである。 図１３は、ＤＮＡバックボーンにおける１０Å以内のＭｇ２＋イオンの数を示すものである。 図１４は、４０ｎｓ ＤＮＡバックボーンにおける１０Å以内のＭｇ２＋イオンの分布を示すものである。 図１５は、様々なＤＮＡオリガミ構造体の氷成長（ice fraction）を示すものである。 図１６は、０ｎｓにおける環状（circular）ＤＮＡオリガミ構造体の最初の構造を示すものである。アイスシード（Ｉｃｅ ｓｅｅｄ）層：厚さ８Åのプリズム面（ｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ）（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図１７は、３０ｎｓにおける環状ＤＮＡオリガミ構造体の動的構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、クリップ面（ｃｌｉｐｐｅｄ ｐｌａｎｅ）上のＭｇ２＋イオン（Red）、成長する氷（Cyan）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図１８は、０ｎｓにおける曲がった（curved）ＤＮＡオリガミ構造体の最初の構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図１９は、３０ｎｓにおける曲がった（curved）ＤＮＡオリガミ構造体の動的構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図２０は、０ｎｓにおける直線状ＤＮＡオリガミ構造体の最初の構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図２１は、３０ｎｓにおける直線状ＤＮＡオリガミ構造体の動的構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図２２は、０ｎｓにおける環状側面型（circle side）ＤＮＡオリガミ構造体の最初の構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図２３は、３０ｎｓにおける環状側面型ＤＮＡオリガミ構造体の動的構造を示すものである。Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層：厚さ８Åのｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅ（Blue）、ＤＮＡバックボーン（Orange）、Ｍｇ２＋イオン（Green）、（ａ）側面、（ｂ）前面、（ｃ）後面。 図２４は、直線状ＤＮＡオリガミ周囲のＭｇ２＋イオンの数を示すものである。 図２５は、環状ＤＮＡオリガミ周囲のＭｇ２＋イオンの数を示すものである。 図２６は、曲がったＤＮＡオリガミ周囲のＭｇ２＋イオンの数を示すものである。 図２７は、環状側面型ＤＮＡオリガミ周囲のＭｇ２＋イオンの数を示すものである。 図２８は、様々なＤＮＡオリガミの２０ｎｓの間のＲＭＳＤ値を示すものである。 図２９は、様々なＤＮＡオリガミの２０ｎｓの間のＳＡＳＡ値を示すものである。 図３０は、様々なＤＮＡオリガミの２０ｎｓの間の氷成長を示すものである。 図３１は、ＲＩ効果の測定方法を示す概略図である。 図３２は、純粋な蒸留水にＭｇＣｌ２のみを含有するバッファ溶液のＲＩ測定結果である。 図３３は、純粋な蒸留水にＭｇＣｌ２のみを含有するバッファ溶液のＲＩ測定結果である。 図３４は、構造化されていない一本鎖状態のＤＮＡが存在する溶液のＲＩ測定結果である。 図３５は、構造化されていない一本鎖状態のＤＮＡが存在する溶液のＲＩ測定結果である。 図３６は、スキャフォールドＤＮＡ試料のＲＩ測定結果である。 図３７は、スキャフォールドＤＮＡ試料のＲＩ測定結果である。 図３８は、４ヘリックスバンドルの堅固構造および柔軟構造を示すものである。 図３９は、６ヘリックスバンドルの堅固構造および柔軟構造を示すものである。 図４０は、ロゼムンド・スクエア構造を示すものである。 図４１は、１２ヘリックスバンドルの堅固構造および曲がった構造を示すものである。 図４２は、ＤＮＡオリガミ構造体のＲＩ効果を示すものである。 図４３は、ＤＮＡオリガミ構造体のＲＩ効果を示すものである。 図４４は、ＤＮＡオリガミ構造体のＲＩ効果を示すものである。 図４５は、ＤＮＡオリガミ構造体のＲＩ効果を示すものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、氷結晶の形成または成長抑制用組成物に関するものである。
本発明の氷結晶の形成または成長抑制用組成物は、氷結晶の形成または成長を抑制することができる。
氷の結晶は、氷の再結晶化により成長できるが、これは小さな氷結晶から更に大きな氷結晶に成長する過程を意味する。この成長は、オストヴァルト熟成（Ostwald ripening）のメカニズムにより起こる。オストヴァルト熟成（Ostwald ripening）は、常温と結晶の間の表面エネルギーの差による圧力によって、融解－拡散－再凍結または昇華－拡散－凝縮のメカニズムで進行され得る。換言すれば、氷結晶の成長は、氷同士がくっついて成長するのではなく、小さな氷結晶が結晶の間で融解して大きな氷結晶に向かって拡散した後、大きな氷結晶の一部となって再凍結されて起こる。
氷結晶の成長抑制は、氷が形成されないようにするか氷の形成速度を遅らせたり、氷の再結晶化が行われないようにしたり、氷再結晶化の速度を遅らせたり、氷結晶の大きさを小さく維持する作用を意味する。
本発明の氷結晶の形成または成長抑制用組成物は、核酸構造体を含む。
核酸構造体は、核酸オリガミ構造体であってもよい。
核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
核酸オリガミ構造体は、図１に示されるように、スキャフォールド核酸が複数のステープル核酸と結合し、スキャフォールド核酸の所定の部分が折り曲げられて形成される構造体である。
スキャフォールド核酸は、一本鎖の核酸であり、その長さは形成しようとする構造体の長さ、大きさ、形状等によって適宜選択でき、通常７，０００～８，０００ヌクレオチド（ｎｔ）程度の長さを有する種類を使用することができる。本発明の具体的な実施例では、７，２４９ｎｔの長さのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを使用しているが、これに限定されるものではない。Ｍ１３ｍｐ１８スキャフォールドＤＮＡを用いてＤＮＡ構造体を作成した場合、作られた構造体一つの分子量は約５メガダルトンであり、これは約１０－２０ｋｇに相当するが、これに限定されるものではない。
ステープル核酸は、少なくとも一部が前記スキャフォールド核酸の少なくとも一部と相補的な配列からなり、スキャフォールド核酸と結合して二本鎖を形成し、スキャフォールド核酸が特定の位置で折り曲げられるか、固定されるようにすることができる。
ステープル核酸の長さは、形成しようとする構造体の長さ、大きさ、形状等によって適宜選択でき、例えば２０～５０ｎｔであってもよいが、これに限定されるものではない。
核酸オリガミ構造体は、ステープル核酸がスキャフォールド核酸の特定の位置に結合し、ステープル核酸が特定の位置で折り曲げられて特定の構造体を形成するものである。ステープル核酸は、スキャフォールド核酸がそのような特定の構造体を持つように設計される。
ステープル核酸の設計は、通常の方法によって行うことができ、例えばｃａＤＮＡｎｏなどのデザインプログラムを使用できるが、これに限定されるものではない。
核酸オリガミ構造体は、通常の熱アニーリング（thermal annealing）手法を用いて作成することができる。
これは、原材料であるスキャフォールド核酸とステープル核酸を高温（例えば、７０～１００℃）で加熱して、すべての核酸鎖が一本鎖の状態にあるようにすることから始まる。核酸鎖は、塩基配列によって融点（melting temperature）が存在し、その温度以上であると、主に一本鎖で、その温度以下であると、主に二本鎖で存在することになる。その後、反応溶液の温度を徐々に下げると、核酸鎖が相補的に結合して二本鎖で存在し始め、核酸オリガミでは２００個程度のステープル核酸が協力的に結合しながら設計位置に結合し、所望の形状の構造体が生成される。
ステープル核酸ごとに塩基配列が異なるので結合時点が少しずつ異なるが、通常の熱アニーリング手法では十分な時間（数時間以上）にわたって徐々に温度を下げるため、すべてのステープル核酸が結合するに十分な条件である。したがって、構成するステープル核酸の塩基配列とは無関係に所望の形状を有するように作成することができる。
スキャフォールド核酸は、既に決定された位置で折り曲げられて複数の鎖を成す。ステープル核酸は、スキャフォールド核酸が既に決定された位置で折り曲げられるように設計された配列を有するものであり、前記方法でスキャフォールド核酸に結合し、スキャフォールド核酸が所定の構造を形成するようにする。
スキャフォールド核酸鎖とステープル核酸が結合して二本鎖（二重らせん）をなし得るが、核酸オリガミ構造体は、例えば、２～５０、２～４５、２～４０、２～３５、２～３０、２～２５または２～２０、２～１２、４～１２ヘリックスバンドル（helix bundle）を持つことができる。具体的には、４ヘリックスバンドル～１２ヘリックスバンドルを持つことができるが、これらに限定されるものではない。図２及び４には、様々なヘリックスバンドルを持つ核酸オリガミ構造体が示されている。
核酸オリガミ構造体は、少なくとも一部の隣接するステープル核酸の両末端の間にギャップ（gap）を有するものであってもよい。
ギャップ（gap）は、図５の左側に示されるように、隣接するステープル核酸の両末端の間に形成された一本鎖領域を意味するものであり、ステープル核酸と相補的に結合していないスキャフォールド核酸の一本鎖領域を意味し得る。その具体的な図式は、図４、５等から確認できる。
前記ギャップ（gap）は、ステープル核酸と相補的に結合できず二重らせん構造を形成できないことにより、当該ギャップを含む対象部位は、剛性が弱まる結果を生み出し、巨視的には、核酸オリガミ構造体全体の剛性が下向する方向に制御され得る。
前記ギャップ（gap）の長さは、一本鎖領域のヌクレオチド塩基数で示すことができ、１～２０、１～１９、１～１８、１～１７、１～１６、１～１５、１～１４、１～１３、１～１２、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５ヌクレオチド長さであってもよい。より具体的には、１～１０ヌクレオチド長さであってもよいが、適切な長さのギャップを維持して、核酸オリガミ構造体全体の形状維持と自己組立過程の完全性を考慮する側面から、好ましくは１～５ヌクレオチド長さであってもよい。
前記ギャップ（gap）の数は、剛性調節の対象部位内の一本鎖領域の数を意味するものであり、（ステープル核酸の数－２）をギャップの最大数とし、当該ギャップを含む対象部位および核酸オリガミ構造体全体の剛性を制御することができる。
前記ギャップ（gap）は、ホリデイジャンクション（Holliday junction）と１０ヌクレオチド以上、９ヌクレオチド以上、８ヌクレオチド以上、７ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、または３ヌクレオチド以上の間隔になるように形成することができる。スキャフォールド核酸とステープル核酸との完全な自己組立過程により核酸オリガミ構造体を形成する側面から、好ましくは３ヌクレオチド以上になるように形成できる。
核酸オリガミ構造体は、核酸バックボーンのリン酸基の陰電荷間の反発力を相殺するために、その形成を陽イオンの存在下で行うことができる。これにより、核酸オリガミ構造体は、その陰電荷に結合された陽イオンをさらに含むことができる。
陽イオンは、１価または２価の陽イオンであり、例えばＮａ＋、Ｍｇ２＋、ＮＨ４＋などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
核酸オリガミ構造体では、陽イオンに水分子が束縛され、水分子が氷結晶の成長に使用されることを阻害すると判断される。具体的には、図６、７にＭｇ２＋イオン周囲の水分子の配列が示されているが、本発明者らはＭｇ２＋イオンに最初に束縛された水分子６個（First shell）は、ＭＤシミュレーションの間に周囲の他の水分子と容易に切り替えられず、特有の幾何（Octahedron）構造を維持することを確認した。また、Ｍｇ２＋イオン周囲の水分子をより詳細に分析したところ、第２のシェル（Ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｅｌｌ）にも１２個の水分子が束縛されていることを発見した。第１のシェル（Ｆｉｒｓｔ Ｓｈｅｌｌ）と比べて束縛は強力ではないが、これらのＳｅｃｏｎｄ ｓｈｅｌｌに存在する水分子は、氷結晶の成長に用いられるが、成長速度を遅延させる役割をすることにより、氷結晶の成長を遅延させるものであると予想される。緑色で表示される６つの水分子は、Ｆｉｒｓｔ ｓｈｅｌｌに束縛されているオクタヘドロン（octahedron）構造の水分子であり、残りの水分子は、Ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｅｌｌに束縛されているＭｇ２＋イオン周囲の１２個の水分子である。青色で表示されるイオンはＭｇ２＋イオンである。Ｍｇ２＋周囲の水分子は、Ｍｇ２＋ポテンシャル内に存在しており、周囲の氷結晶の成長に参加するにあたり、純粋な水分子のみからなる溶液の氷結晶の成長とは相違することがわかる。これが分子レベルにおけるＭｇ２＋の氷結晶の成長抑制の原因であると考えられる。
もちろん、核酸鎖が構造体を成していない場合でも、核酸バックボーンの陰電荷により、周囲のＭｇ２＋イオンの濃度を部分的に増加させることはできるが、核酸が一定の形状および剛性を持ったまま密集して構造体を成していないと、周囲の氷結晶が成長する過程でＭｇ２＋イオンに束縛された水分子を継続的に捕まえておくことができないため、ＲＩ効果を示すことが難しいと考えられる。
核酸オリガミ構造体は、氷結晶の成長時の氷の表面に多くの陽イオンが分布するようにする構造を有することができる。
これに関し、本発明に係る核酸オリガミ構造体は、ねじれを持つか、又は曲線のヘリックスバンドルを含むことができる。
例えば、ヘリックスバンドルのねじれ方向は塩基の挿入または欠失で調節できるものであり、ヘリックスに塩基が挿入されてバンドルが右方向にねじれるか、または塩基が欠失されて左方向にねじれ得る。ねじれの程度は、塩基の数で調節することができる。挿入または欠失される塩基の数は、ヘリックスが二度回転する毎２１塩基長さ当たり１個または２個であってもよく、それ以上であっても、構造を維持するのに問題がなければ特に制限されない。
また、例えば複数のヘリックスのうち、一側のヘリックスに塩基を挿入し、他側のヘリックスに塩基を挿入しないか、塩基を欠失させ、ヘリックス間に長さの差を生じさせてヘリックスバンドルを曲線にすることができる。
また、核酸オリガミ構造体は、氷結晶の生成または成長抑制の側面で、氷結晶の成長面と接触できる面を含むことができる。線状ではなく、面形状の広い面積で氷結晶の成長面と接触して、氷結晶の生成または成長の抑制効果を最大化することができる。
また、本発明は、前記組成物を含む細胞または組織凍結用組成物に関するものである。
細胞または組織を凍結保存すると、その後の使用時、凍結された細胞または組織を溶かす過程で、氷の再結晶化は、細胞膜の損傷、細胞の脱水を進行させ、細胞および組織に損傷を与える。低温環境に住む有機体は、氷の再結晶化によってより簡単に損傷してしまうことがある。
本発明の組成物は、通常的に保存のために凍結して使用するすべての細胞がその適用対象となり、例えば、原核細胞；真核細胞；微生物；動物細胞；癌細胞、精子；卵子；成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞を含む幹細胞；臍帯血、白血球、赤血球、および血小板を含む血液細胞；腎細胞、肝細胞および筋肉細胞を含む組織細胞であってもよいが、これらに限定されない。
また、組織は、同様に保存のために凍結して使用するすべての組織がその適用対象となり、例えば、角膜、腎臓、心臓、小腸、膵臓、肺、肝臓などのすべての組織を制限なく使用することができる。
本発明の組成物は、細胞、組織を凍結保存するための保存液を含むことができる。保存液は水であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、核酸構造体を０．００１～０．５重量％、具体的には０．０１～０．０３重量％含むことができるが、これらに限定されるものではない。
現在、組織の保存過程で使用される浸透性小分子は、数十％に達する高い重量比が求められるのに対して、本発明の核酸オリガミ構造体は、はるかに低い含有量でも氷結晶の成長抑制効果を有することができ、細胞および組織の保存にさらに有利であり得る。
また、本発明は、前記組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法に関するものである。
前記組成物の存在下で対象細胞または組織を凍結させる場合、その後の解凍時の氷再結晶を阻害し、細胞または組織が損傷されることを防止できる。
また、本発明は、前記組成物を含む食品凍結用組成物、そして前記組成物の存在下で食品を氷点下の温度にさらすステップを含む食品の凍結方法に関するものである。
本発明の組成物は、すべての冷凍食品に適用できるものであり、これを使用することにより、解凍時にその食品の食感が低下することを最小限に抑えることができる。
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明することにする。
実施例
１．分子動力学シミュレーションによる陽イオン及びＤＮＡによる氷結晶の成長抑制効果の確認
（１）Ｍｇ２＋陽イオン周囲の水分子の結集様態の分析
まず、分子レベルでＭｇ２＋イオンによる氷結晶の態様の変化を調べる。図６、７には、Ｍｇ２＋イオン周囲の水分子の配列が示されている。分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの間、Ｍｇ２＋イオンに最初に束縛された水分子６個（First shell）は、周囲の他の水分子と容易に切り替えられず、特有の幾何構造（八面体）を保持することを確認した（図６）。また、Ｍｇ２＋イオン周囲の水分子をより詳細に分析したところ、Ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｅｌｌにも１２個の水分子が束縛されていることを発見した（図７）。Ｆｉｒｓｔ Ｓｈｅｌｌと比べて束縛は強力ではないが、これらのＳｅｃｏｎｄ ｓｈｅｌｌに存在する水分子は、氷結晶の成長に用いられるが、成長速度を遅延させる役割をすることにより、氷結晶の成長を遅延させるものであると予想される。緑色で表示される６つの水分子は、Ｆｉｒｓｔ ｓｈｅｌｌに束縛されているオクタヘドロン（octahedron）構造の水分子であり、残りの水分子は、Ｓｅｃｏｎｄ ｓｈｅｌｌに束縛されているＭｇ２＋イオン周囲の１２個の水分子である。青色で表示されるイオンはＭｇ２＋イオンである。Ｍｇ２＋周囲の水分子は、Ｍｇ２＋ポテンシャル内に存在しており、周囲の氷結晶の成長に参加するにあたり、純粋な水分子のみからなる溶液の氷結晶の成長とは相違することがわかる。
（２）陽イオンが含まれた水溶液における氷再結晶の抑制効果の分析
ＤＮＡオリガミ構造体の自由な設計のためには、ＤＮＡバックボーンのリン酸基の陰電荷間の反発力を相殺することが必要であり、この反発力を減らすために陽イオンの使用を必要とする。
ＤＮＡオリガミと氷結晶の成長との相互関係を分子レベルで理解するために、水に溶解しているイオンの濃度および種類による氷結晶の成長に関してＭＤシミュレーションを行った。ＭＤシミュレーションは、ＮＡＭＤパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）２．１２を使用し、ＣＨＡＲＭＭフォースフィールド（ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）を用いた。効果的な氷結晶の成長のために、ウォーター（water）モデルとしてはＴＩＰ４を使用した。
イオンの種類による影響を確認するために、ＮａＣｌとＭｇＣｌ２、そしてｃｏｎｔｒｏｌ（水のみのモデル）の３つの比較群を作った。イオンの濃度による比較のために、ＮａＣｌ溶液とＭｇＣｌ２溶液の０．０１ｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌモデルを作り、各１２０ｎｓまでＭＤシミュレーションを行った。水分子の数は約４１，５００個である。シミュレーションの温度は氷の迅速な成長のために、２７３Ｋよりも低い２２５ＫでＩｃｅ ｓｅｅｄ層から氷が成長できる環境を作った。氷が全方向に成長する場合、周期的境界条件（Periodic boundary condition）によって氷が成長してウォーターボックス（water box）の外に押し出されないように、Ｉｃｅ ｓｅｅｄ層の下の一部の水分子層（width＝5）に制約（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）をかけて一方向にのみ成長するように誘導した。Ｉｃｅ ｓｅｅｄとしては、ｐｒｉｓｍ ｓｕｒｆａｃｅを使用した。
図８を参照すると、ＮａＣｌとＭｇＣｌ２により、２２５Ｋでの氷の成長がｃｏｎｔｒｏｌに比べて抑制されていることが確認できる。それぞれ５０ｍＭのＮａＣｌとＭｇＣｌ２、そして１５０ｍＭのＮａＣｌとＭｇＣｌ２の氷成長の抑制効果は、類似していた。一方、１０ｍＭのＮａＣｌとＭｇＣｌ２の濃度では、ＭｇＣｌ２の氷成長の抑制効果がＮａＣｌに比べて大きくなっている。
また、Ｍｇ２＋イオン周囲の水分子の数を確認するために、ＭＤシミュレーションの結果に基づいて、動径分布関数（Radial Distribution Function）（RDF：g（r））を計算した。
図９を参照すると、ｇ（ｒ）関数の結果は、Ｍｇ２＋から２Åの近くに６個の水分子が存在していることを示し（First shell）、２Åよりも大きい距離にも周辺の水分子が存在していることを示す。具体的には、２．７Åの近くに４個、４Åの近くに２個、そして４Åよりも遠い距離にも水分子が存在している。
（３）５種類の互いに異なるＤＮＡオリガミ構造体と氷結晶成長シミュレーション
ＤＮＡが構造体の形態に密集するために必須な陽イオンの一つであるＭｇ２＋イオンが氷結晶の成長を抑制することをＭＤシミュレーションにより確認した。これにより、氷結晶の成長面とＭｇ２＋イオンの分布は、氷結晶の成長に非常に重要な役割を果たしていることが分かる。これに基づいて、ＤＮＡオリガミは、ＤＮＡバックボーンのリン酸基の陰電荷により、周辺のＭｇ２＋イオンの分布に影響を与えることになり、結局、ＤＮＡオリガミ構造が異なると、これによりＭｇ２＋イオンの分布に変化が生じ、氷結晶の成長に影響を与え得ることを推論できる。
この推論を確認するために、２つの二重らせんＤＮＡで構成され、互いに異なる構造を有する５種類のＤＮＡバンドル構造体をシミュレートした。
（１）２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ１ｉｎｓ（塩基（ｂａｓｅ）１個を追加することにより、ＤＮＡバンドルのねじれ方向を右にしたもの）。
（２）２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ２ｉｎｓ（ｂａｓｅ２個を追加することにより、ＤＮＡバンドルのねじれ方向を右にしたもの）。
（３）２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌ（ｂａｓｅ１個を除去することにより、ＤＮＡバンドルのねじれ方向を左にしたもの）。
（４）２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌ（ｂａｓｅ２個を除去することにより、ＤＮＡバンドルのねじれ方向を左にしたもの）。
（５）２ＨＢ_ｓｔｒａｉｇｈｔ（ねじれのないバンドル構造体）
これらのＤＮＡ構造は、長さはほぼ同じであり、主にＤＮＡバンドルのねじれ方向に変化を与えた構造である。これらの５個の互いに異なる構造が氷結晶の成長にどのような影響を与えるかを確認するために、ＭＤシミュレーションにより、ｉｃｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＤＮＡオリガミ構造周囲のＭｇ２＋イオンの分布、ＤＮＡバックボーンＲＭＳＤ（Root Mean Square Deviation）、及びＳＡＳＡ（Solvent Accessible Surface Area）などを測定した。以前と同様に、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２イオンの環境と２２５Ｋの温度でＭＤシミュレーションを４０ｎｓ間行った（図１０）。
上からＩＣＥ ｓｅｅｄ層を見下ろす方向に、２ＨＢ_ｓｔｒａｉｇｈｔは黒色、２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ１ｉｎｓは赤色、２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ２ｉｎｓは黄色、２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌは青色、２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌは緑色で表示する。
１）ＲＭＳＤ
左回り（Ｌｅｆｔ－ｔｕｒｎ）構造のＲＭＳＤ値が大きいことが特徴的であり（図１１）、ＳｔｒａｉｇｈｔとＲｉｇｈｔ－ｔｕｒｎ構造に比べて２倍以上のＲＭＳＤの変化を示した。カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＤＮＡのらせん方向が右であることを考慮すると、Ｌｅｆｔ－ｔｕｒｎらせん構造のＤＮＡオリガミの設計時に、より多くのトーション（ｔｏｒｓｉｏｎ）エネルギーが発生したと考えられる。この構造体が溶液内で動的に緩和（Dynamical relaxation）される過程で、より大きなＲＭＳＤの変化を示したものと解釈することができる。
２）ＳＡＳＡ（Solvent-Accessible Surface Area）とＤＮＡ周囲のＭｇ２＋イオン
ＳＡＳＡは、タンパク質またはＤＮＡなどの表面積が溶媒にいかに多く露出するかに関する値を意味する。我々の計算結果の場合、ＳＡＳＡが大きいほどＤＮＡのバックボーンが溶媒に多く露出し、より多くのＭｇ２＋イオンがＤＮＡ構造に集まると予想した。これを確認するために、ＤＮＡバックボーンからの距離によるＭｇ２＋イオンの数を計算して、Ｍｇ２＋イオンの分布を５種類の互いに異なる構造体で比較した。ＳＡＳＡとＭｇ２＋イオン分布の計算結果、ＳＡＳＡが最も大きい構造体のバックボーンから１０Å内に最も多くのＭｇ２＋イオンが集まったことを確認した。ＤＮＡオリガミの互いに異なる構造によって、ＤＮＡバックボーンの近く（１０Å）に異なるように分布するＭｇ２＋の分布が氷結晶の成長に互いに異なる影響を与えると推論した。
ＳＡＳＡの計算で「プローブ半径（ｐｒｏｂｅ ｒａｄｉｕｓ）」としては、１．４Åを用いた。２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ２ｉｎｓ構造では、ＳＡＳＡが最も大きく示され、時間による変化もまた大きく示された。これに対して、Ｌｅｆｔ－ｔｕｒｎに設計された二つの構造、２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌと２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌ構造では、ＳＡＳＡが相対的に小さい値で示された。中でも２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌ構造体では、ＳＡＳＡが、他の５つの構造体の中で最も小さい値で示された（図１２）。
ＤＮＡバックボーンから１０Å内のＭｇ２＋イオンの数は、ＳＡＳＡの結果と類似した順で２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ２ｉｎｓ構造の近くのＭｇ２＋イオンの数が最も多く計算された。これに対して、Ｌｅｆｔ－ｔｕｒｎに設計された二つの構造、２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌと２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌでは、構造体周囲のＭｇ２＋イオンの数が相対的に小さく計算された。中でも２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌでは、構造体周囲のＭｇ２＋イオンの数が、他の５つの構造体の中で最も小さい値で示された（図１３）。
図１４は、互いに異なる５つの構造体の開始構造（０ｎｓ）と動的に緩和された４０ｎｓでの構造を示す。また、ＤＮＡバックボーン構造で１０Å内のＭｇ２＋イオンの分布もあわせて示す。２ＨＢ_ｓｔｒａｉｇｈｔは黒色、２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ１ｉｎｓは赤色、２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ２ｉｎｓは黄色、２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌは青色、２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌ構造は緑色で表示する。
右回り（Ｒｉｇｈｔ－ｔｕｒｎ）で作成されたＤＮＡ構造体では、初期構造（０ｎｓ）に対してＤＮＡバックボーン間の距離が開いていることがわかる。これらのｒｉｇｈｔ－ｔｕｒｎで作成されたＤＮＡオリガミ構造体では、ＤＮＡバックボーン間の隙間が開き（open）、ＳＡＳＡの値が増加したと考えられる。そして、これらの開かれた隙間にＭｇ２＋イオンが集まってきて、ＤＮＡバックボーンから１０Å内のＭｇ２＋イオンの数が増加することがわかる。これに対して、Ｌｅｆｔ－ｔｕｒｎで作成されたＤＮＡオリガミ構造体では、ＲＭＳＤが大きい変化を示すにもかかわらず、４０ｎｓに動的平衡を成したことから、大きい値のＲＭＳＤは初期構造（０ｎｓ）に対して、主にｔｏｒｓｉｏｎエネルギーと関連する回転による構造変化によるものであることが分かり、実際にＤＮＡバックボーン間の隙間はむしろ減ったことがわかる（closed）。Ｌｅｆｔ－ｔｕｒｎ構造体は、大きいＲＭＳＤの変化にもかかわらず、Ｒｉｇｈｔ－ｔｕｒｎ構造体に対して相対的に小さいＳＡＳＡ値を有していることが分かる。
３）氷の成長（Ice fraction）
ＳＡＳＡの値が最も小さい２ＨＢ_ｌｅｆｔ２ｄｅｌ（Green）では、氷結晶の成長が最も遅いことが示された。その次に氷結晶の成長が抑制されたのは、２ＨＢ_ｌｅｆｔ１ｄｅｌ（Blue）であった。つまり、ＤＮＡバックボーン構造体の隙間が相対的に大きく開かないことにより、ＤＮＡバックボーンから１０Å内のＭｇ２＋イオンの数が最も少ない構造において、氷結晶の成長が最も抑制されることを示す。これに対して、最も大きいＳＡＳＡ値を有し、１０Å内のＭｇ２＋イオンの数が最も大きい値を有する２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ１ｉｎｓ（Red）と２ＨＢ_ｒｉｇｈｔ２ｉｎｓ（Orange）構造では、相対的に氷結晶の成長抑制が少なかった（図１５）。
（４）巨大構造の互いに異なるＤＮＡオリガミ構造体と氷結晶成長シミュレーション
先にＭＤシミュレーションにより、ＤＮＡ構造体の様々なねじれの方向及び程度と、氷結晶の成長速度との相関関係を類推した。より明確な差異を観察するために、同じ断面を持っているが形状の差異が大きい４種類の構造を設計した。
１）環状（Circular）ＤＮＡバンドル構造体
２）直線状（Straight）ＤＮＡバンドル構造体
３）曲がった（Curved）ＤＮＡバンドル構造体
４）環状ＤＮＡバンドル構造体と氷表面との接触面を変えたシステム（環状側面型（Circle-Side）と命名）
これらの４つの互いに異なる構造が氷結晶の成長にどのような影響を与えるかを確認するために、ＭＤシミュレーションにより、ｉｃｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＤＮＡオリガミ構造周囲のＭｇ２＋イオンの分布、ＤＮＡバックボーンＲＭＳＤ（Root Mean Square Deviation）、及びＳＡＳＡ（Solvent Accessible Surface Area）などを測定した。以前と同様に、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２イオン環境と２２５Ｋの温度でＭＤシミュレーションを３０ｎｓ間行った。
システムサイズ：Number of Atoms
環状ＤＮＡバンドル構造体（Circular DNA bundle structure）：1,333,311
曲がったＤＮＡバンドル構造体（Curved DNA bundle structure）：1,430,960
直線状ＤＮＡバンドル構造体（Straight DNA bundle structure）：1,290,309
環状側面型ＤＮＡバンドル構造体（Circle_side DNA bundle structure）：1,881,446
図１６～２３を参照すると、ＤＮＡ構造体が氷結晶の成長を抑制し、氷結晶の成長面と隣接する面積が高い構造体が、より高い成長抑制率を示すことを確認できる。
図２４～２７は、それぞれのＤＮＡバックボーンからＭｇ２＋イオン数の分布を示している。
図２８は、２０ｎｓの間の４種類のＤＮＡオリガミ構造体のＲＭＳＤ値を示している。最も大きいＲＭＳＤの変化を示すものは、環状（circular）ＤＮＡオリガミ構造体であり、その次は環状側面型（Circle_side）ＤＮＡオリガミ構造体であった。環状ＤＮＡオリガミ構造体に格納されたｔｏｒｓｉｏｎエネルギーの動的緩和によって大きな変化を示している。
図２９は、４種類のＤＮＡオリガミ構造体のＳＡＳＡの変化を示している。時間によって最も大きい変化を示す構造体は、環状（circular）ＤＮＡ構造体と環状側面型（Circle_side）構造体である。
図３０は、Ｉｃｅ ｆｒａｃｔｉｏｎの結果であり、環状（circular）ＤＮＡオリガミ構造体の氷結晶の成長が最も大きく抑制されたことを示している。これに対して、環状側面型（circle_side）ＤＮＡオリガミ構造体では、氷結晶の成長が最も大きいことが示された。これらの結果から、ＤＮＡオリガミ構造体と氷結晶の成長面との距離が比較的遠く、ＤＮＡ構造体の接触面が氷の成長に大きく影響しないことが示された。つまり、ＤＮＡオリガミ構造体が氷結晶の成長を抑制するためには、陽イオンを保有した状態で、様々なサイズおよび方向を有する氷結晶面と効果的に接触することが重要であり、そのためにはＤＮＡが一定の形状および剛性を有する状態で密集に集まっているべきであることが分かる。
２．実験による陽イオンおよびＤＮＡ構造体による氷結晶の成長抑制効果の確認
分子レベルにおける陽イオン及びＤＮＡ鎖の氷結晶成長抑制（recrystallization inhibition、以下「ＲＩ」という。）の効果を確認したことに続き、実際の巨視的な観測によって示されるＲＩ効果を観察するために一連の実験を行った。
（１）氷結晶の成長の実験方法
ＲＩ効果を測定するために、通常知られているスプラット冷却（splat cooling）法を用いた（図３１）。まず、液体窒素で予め冷却された金属板の上にカバーグラスを載せて（カバーガラスの表面温度は約－１５０℃）、約１．５ｍの高さから、ＲＩ効果を測定しようとする材料が分散された溶液を２０μｌ落とす。溶液は、カバーガラスの上に触れてすぐに急速冷却されながら薄く広がって凍りつくことになり、急激な冷却によって非常に小さな氷結晶が多数生成される。その後、カバーガラスを、穴があいていて光学顕微鏡で観察可能なコールドステージ（cold stage）に移す。コールドステージは－６℃に維持され、３０分間小さい結晶がだんだん集まって氷結晶（ice grain）が成長する様子を観測する。その後、氷結晶の大きさを測定し、対照群（氷結制御の材料のない溶液のみのサンプル）と比べて氷結晶がいかに少なく成長したのかを比較する。
（２）陽イオンが含まれた水溶液および構造化されていないＤＮＡ試料のＲＩ効果の観測
まず、純粋な蒸留水にＭｇＣｌ２のみを含有するバッファ溶液に対してＲＩ測定実験を行い、イオン濃度が増加するにつれて氷結晶の成長が抑制されることを確認した（図３２、３３）。本実験結果に基づいて、後の実験での基準（reference）バッファ溶液のＭｇＣｌ２濃度は５ミリモル（ｍＭ）とした。試料のＲＩ性能は、基準バッファに対して試料の相対的なＲＩ性能を比較して測定した。値が小さいほどＲＩ性能が高いことを意味する。
次に、構造化されていない一本鎖状態のＤＮＡが存在する溶液に対してＲＩ測定実験を行った。実験で使用したＤＮＡの濃度は、通常の製造工程により作られたＤＮＡ構造体の濃度と類似した５０～２００ｎｇ／ｕＬとした。６ヘリックスバンドルの堅固構造を構成する１６９種類のステープルＤＮＡが一本鎖状態で混ぜられた試料のＲＩ性能を測定したところ、０．８７から１．０の間で、バッファに比べて氷結晶の成長抑制効果がほとんどないことが観察された（図３４、３５）。つまり、ＤＮＡ鎖がＭｇ２＋イオンを結集する効果があるとはいえ、水溶液中で一定の形状及び剛性を有する構造体を成していないと、Ｍｇ２＋イオンを捕まえておくことができないため、巨視的にはＲＩ効果がほとんど発生しないことを実験的に確認した。
また、同様な方式で行ったスキャフォールドＤＮＡ試料のＲＩ値は、最大０．７程度に測定された（図３６、３７）。スキャフォールドＤＮＡがステープルＤＮＡに比べて若干のＲＩ性能を有する理由は、長さの長いスキャフォールドＤＮＡの特性上、全領域が一本鎖状態で存在するのではなく、一部が互いに相補性を持って二本鎖に結合する二次構造（secondary structure）を形成しているためであると推定される。
（３）構造化されたＤＮＡオリガミの設計
ＤＮＡ鎖同士が密集して連結されて一定の断面形状および剛性を有するＤＮＡ構造体に対して実験を行った。ＤＮＡオリガミ手法の例として設計された９種類の構造体は、
（１）４ヘリックスバンドルの堅固構造、
（２）４ヘリックスバンドルの柔軟構造（ギャップ５ｎｔ）、
（３）６ヘリックスバンドルの堅固構造、
（４）６ヘリックスバンドルの柔軟構造（ギャップ３ｎｔ）、
（５）６ヘリックスバンドルの柔軟構造（ギャップ５ｎｔ）、
（６）ロゼムンド・スクエア（Rothemund square）構造、
（７）１２ヘリックスバンドルの堅固構造、
（８）１２ヘリックスバンドルの曲がった構造（９０°）、
（９）１２ヘリックスバンドルの曲がった構造（４５°）である。
それぞれの構造体の設計方法は、以下の通りである。
（１）４ヘリックスバンドルの堅固構造、及び（２）４ヘリックスバンドルの柔軟構造（ギャップ５ｎｔ）
（１）番及び（２）番の構造体は、断面が４つの二本鎖ＤＮＡで構成されており、一辺が約４．５ｎｍの正四角形状にパッキング（packing）されている（図３８）。約１９２ｎｔの長さを基本にして同じ形態の連結が繰り返される構造を有し、構造体の合計の長さは約６００ｎｍである。（１）番の堅固構造体は、構造内に存在するすべてのステープルＤＮＡの両末端が直接当接するように設計されている。（２）番の柔軟構造体は、１５０個の隣接するステープルＤＮＡの両末端の間が５ｎｔのｓｓＤＮＡで構成されている。
（３）６ヘリックスバンドルの堅固構造、（４）６ヘリックスバンドルの柔軟構造（ギャップ３ｎｔ）、及び（５）６ヘリックスバンドルの柔軟構造（ギャップ５ｎｔ）
（３）、（４）、（５）番の構造体は、断面が６つの二本鎖ＤＮＡで構成されており、六角形状にパッキング（packing）されている（図３９）。約１６８ｎｔの長さを基本にして同じ形態の連結が繰り返される構造を有し、構造体の合計の長さは約４００ｎｍである。（３）番の堅固構造体は、構造内に存在するすべてのステープルＤＮＡの両末端が直接当接するように設計されている。（４）、（５）番の柔軟構造体は、１６９個の隣接するステープルＤＮＡの両末端の間がそれぞれ３ｎｔ及び５ｎｔのｓｓＤＮＡで構成されている。
（６）ロゼムンド・スクエア
（６）番の構造体は、断面が２４個の二本鎖ＤＮＡで構成されており、一直線に配列されてシート状をなす（図４０）。構造体の長さは２５６ｎｔで約９０ｎｍであり、幅は約５５ｎｍである。構造内に存在する１９２個のステープルＤＮＡのすべての末端は、直接当接するように設計されている。
（７）１２ヘリックスバンドルの堅固構造、（８）１２ヘリックスバンドルの曲がった構造（９０°）、及び（９）１２ヘリックスバンドルの曲がった構造（４５°）
（７）、（８）、（９）番の構造体は、断面が１２個の二本鎖ＤＮＡで構成されており、六角形の格子状にパッキング（packing）されている（図４１）。（７）番の堅固構造体は、１８０個のステープルＤＮＡのすべての末端が直接当接するように設計されている。（８）番及び（９）番の構造体は、構造体の中間に存在するステープルＤＮＡの１１個を除去して４２ｎｔの長さの柔軟部位を作成し、構造物の両端を連結するＤＮＡの長さをそれぞれ３５７ｎｔ及び１８９ｎｔに短くして、構造の中央が９０度及び４５度に曲がった形状に作成した。
（４）ＤＮＡオリガミの作成およびＲＩ効果の観測
一定の断面形状およびサイズを有するように構造化されたＤＮＡ構造体の氷結晶の成長抑制効果を確認した。前記の設計に基づいて作成された構造体の形状は、原子間力顕微鏡により測定した（図４２、４３、４４の最初の列の画像）。少なくとも２種類の互いに異なる密度を持つ前記９種類のＤＮＡ構造体に対してＲＩ実験を行ったところ、最大０．５３のＲＩ値が測定された（図４、５）。断面の面積が最も狭い４ヘリックスバンドル（１，２番のサンプル）に比べて、残りのサンプルでさらに高いＲＩ性能が示され、構造体の濃度が高いほど全体的にＲＩ性能が向上する傾向を示した。これは、断面の広さが一定レベルになって初めて、ＲＩ性能が発揮される程度のＭｇ２＋イオンを十分に結集させることができ、水溶液中で構造体の数が多いほど、氷結晶の成長を抑制できる領域が増加するからであると考えられる。
一連の実験を通して、陽イオンが結集したＤＮＡ構造体を含む組成物は、構造体を形成していないＤＮＡと比較して、より高い氷結晶の成長抑制効果を発揮できることを実証した。

Claims (9)

  1. 既に決定された位置で折り曲げられて複数の鎖をなすスキャフォールド核酸と、少なくとも一部が前記スキャフォールド核酸と相補的な配列を有し、前記複数の鎖の少なくとも一つに結合して二本鎖を形成する複数のステープル核酸とを含む核酸構造体を含み、
    前記核酸構造体は、４～２４個のヘリックスバンドルを含 むことを特徴とする氷結晶の形成または成長抑制用組成物。
  2. 前記核酸構造体は、その陰電荷の少なくとも一部に結合された陽イオンを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記核酸構造体に結合された前記陽イオンは、Ｎａ＋、ＮＨ４ ＋、またはＭｇ２＋である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記核酸構造体は、氷結晶と接触できる面を含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記核酸構造体のヘリックスの少なくとも一つは、少なくとも一部に一本鎖からなるギャップを有する、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記核酸構造体は、ねじれを持つか、又は曲線のヘリックスバンドルを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞または組織凍結用組成物。
  8. 請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物を含む、食品凍結用組成物。
  9. 請求項７に記載の組成物の存在下で対象細胞または組織を氷点下の温度にさらすステップを含む、細胞または組織の凍結方法。
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