WO2005095586A1 - 不凍糖タンパク質誘導体を含有する細胞凍結保存用組成物 - Google Patents

不凍糖タンパク質誘導体を含有する細胞凍結保存用組成物 Download PDF

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cell
solution
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English (en)
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Inventor
Shinichiro Nishimura
Original Assignee
Shionogi & Co., Ltd.
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

Definitions

  • the present invention relates to a composition for cryopreserving mammalian cells, a solution containing the composition, and a preservation method.
  • Cryopreservation technology which preserves living cells semi-permanently while living, is currently used to preserve blood cells for blood transfusion, preserve bone marrow cells and living tissues for bone marrow transplantation and organ transplantation, artificial insemination and genetics. It is being widely used for preserving sperm and fertilized eggs for preserving resources.
  • the rate of functional recovery of living tissues after thawing is not high, and there is a need for the development of more desirable preservation techniques.
  • Non-Patent Document 1 reports a macromolecular antifreeze compound in blood, and this macromolecular antifreeze compound is currently called “antifreeze glycoprotein” (AFGP).
  • AFGP antifreeze glycoprotein
  • Patent Document 1 describes a method for protecting and preserving living cells using a heat hysteresis protein extracted from fish, but this effect is based on the interaction with the heat hysteresis protein and cells and cell membranes. And is independent of its effect on the propagation of ice (propagatior).
  • Non-Patent Document 2 and Patent Document 2 do not specifically describe the effect of preserving a force cell, tissue, organ, or the like, which describes the AFGP derivative or the method for producing the same according to the present invention.
  • Non-Patent Document 1 Science, 163, p. 1073-1075 (1969)
  • Non-Patent Document 2 Angeuvante Chemie International Edition (
  • Patent Document 1 International Publication WO91Z10361 pamphlet
  • Patent document 2 International publication WO00Z09546 pamphlet
  • An object of the present invention is to provide a technique for long-term cryopreservation of mammalian cells, tissues or organs without deteriorating the feasibility.
  • the present invention provides
  • the present invention relates to the following (2) to (8).
  • the compound represented by the formula (I), wherein n is one kind selected from 2 to 10, a salt thereof, or a composition containing only a solvate thereof, is substantially free from impurities.
  • the impurities include components other than AFGP, which are mixed when extracting AFGP from fish or the like, proteins derived from organisms that may adversely affect the human body such as antigenicity, and viruses derived from organisms.
  • a compound represented by the formula (I) selected, a salt thereof or a solvate thereof, and two or more compounds represented by the formula (I) selected from 2 to 10 different from n described above, a salt thereof or A composition comprising a mixture of these solvates and substantially free of impurities is meant.
  • the impurities include components other than AFGP, which are mixed when extracting AFGP from fish and the like, proteins derived from organisms that may adversely affect the human body, such as antigenicity, and viruses derived from organisms. Include.
  • composition according to (1) which is:
  • composition according to (1) wherein the cells are in the form of mammalian cells or tissues or organs.
  • Equation (6)
  • a method for cryopreserving cells comprising contacting a cell with a compound represented by the formula (1), a salt thereof, or a solvate thereof.
  • a method for cryopreserving cells comprising:
  • composition of the present invention makes it possible to cryopreserve cells for a long period of time.
  • the preserved cells maintain their functions at a high level with minimal cell damage. Therefore, cells, tissues or organs preserved using the composition of the present invention can be suitably used for transplantation and the like even after thawing, and can prevent or improve tissue damage and organ damage after transplantation. It is possible.
  • FIG. 1 is a fluorescence micrograph of splenic islets after cryopreservation.
  • FIG. 2 is a micrograph of erythrocytes after cryopreservation.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the absorbance of the supernatant after cryopreservation.
  • FIG. 4 is a micrograph of splenic islets after cryopreservation.
  • FIG. 5 is a fluorescence micrograph of splenic islets after cryopreservation.
  • cells include animal cells and plant cells, and are preferably mammalian cells.
  • mammal means a warm-blooded mammal, including humans, pigs, and sea lions.
  • the “cells” in the present specification may be in the form of a tissue or an organ by assembling a plurality of them.
  • mammalian “cells” include spleen islets, hepatocytes, leukocytes, Cells such as erythrocytes, platelets, oocytes and embryos, tissues such as skin tissue, bone marrow tissue and corneal tissue, and organs such as spleen, liver, brain, lung, heart, stomach, kidney, spleen, ovary and testis Includes
  • “Cryopreservation” includes freezing and preserving cells, organs or tissues by slow freezing, quick freezing, vitrification freezing, or the like.
  • the storage temperature is preferably 20 ° C or lower, more preferably 70 ° C or lower, and most preferably 80 ° C to 1200 ° C.
  • the compound (I) includes pharmaceutically acceptable salts thereof, for example, salts of mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, and hydrobromic acid; formic acid, acetic acid, Salts of organic acids such as tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, conodic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, naphthalenesulfonic acid and camphorsulfonic acid; Salts of organic bases such as ammonium, trimethylammonium, and triethylammonium; salts of alkali metals such as sodium and potassium, and salts of alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, and hydrobromic acid
  • Compound (I) also includes a solvate thereof, and one molecule of compound (I) may be coordinated with an arbitrary number of solvent molecules.
  • n in compound (I) is an integer of 2 or more, it can be suitably used in the present invention, but is preferably 4 or more, more preferably 5 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 50 or less, more preferably 15 or less, further preferably 10 or less, and most preferably 8 or less.
  • the weight average molecular weight is preferably at least 1.2 kDa, more preferably at least 2 kDa, even more preferably at least 3 kDa.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 40 kDa or less, more preferably 15 kDa or less, more preferably 7 kDa or less, and most preferably 5 kDa or less.
  • the lower limit of the number average molecular weight is preferably 1.5 kDa or more, more preferably 2.8 kDa or more, and the upper limit is preferably 5 kDa or less, more preferably 4 kDa, and still more preferably 3.5 kDa.
  • Preferred examples of the compound (I) include the following compounds.
  • compositions, shape and the like of the composition of the present invention are not particularly limited as long as it contains compound (I).
  • Compound (I) may be used alone in any case.R 1 and Z or n are different. May be used in combination.
  • the shape of the composition may be a deviation such as a powder, granules, or solution.
  • the composition can be prepared by mixing with various additives and solvents that are generally used in addition to compound (I).
  • the solution of the present invention is not particularly limited as long as it contains the composition of the present invention.
  • the solution of the present invention is added to a preservation solution or a reflux solution clinically used for preserving tissues and organs. It is obtained by doing.
  • the preservation or reflux solutions used clinically include physiological saline, Ringer's solution, Collins solution, Eurocollins solution, UW solution, PFC (perfluorocarbon) emulsion, dimethylsulfoxide (DMSO) solution, Glycerin solution and the like. Particularly preferred is a DMS O solution.
  • the solution of the present invention can be obtained by adding the composition of the present invention to the above-mentioned stock solution or reflux solution.
  • concentration of compound (I) in the solution of the present invention depends on the type of cells, organs or tissues, storage conditions, the type of storage or reflux solution, and the types and concentrations of other additives.
  • z gZml ⁇ It can be changed appropriately within the range of LOmgZml.
  • the lower limit of the concentration is preferably at least 0.5 / z gZml, more preferably at least 0.5 / z gZml, and most preferably at least 1 / z gZml.
  • the upper limit of the concentration is preferably lmgZml or less, more preferably 800 ⁇ gZml or less, and most preferably less than 500 ⁇ gZml.
  • additives such as commonly used intracellular protective agents and vitrifying agents may be added.
  • intracellular protective or vitrifying agents examples include DMSO, glycerin, propylene glycol, ethylene glycolone, gnorecose, sucrose, torenodulose, propanediole, butanediol, carboxymethylcellulose or its salts, and polypyrrolidone. No.
  • the concentration of the intracellular protective agent or vitrification agent is, for example, in the range of 0.01 mmol / ml to 20 mmol / ml, depending on the type, the type of cell, organ or tissue, storage conditions, and the concentration of the conjugate (I). It can be changed as appropriate.
  • the lower limit of the concentration is preferably at least 0.5 mmol Zml, more preferably at least 0.5 mmol Zml, most preferably at least I mmol Zml.
  • the upper limit of the concentration is preferably 10 mmol Zml or less, more preferably 5 mmol Zml or less, and Is also preferably 2 mmol Zml or less.
  • the cells When storing the cells, the cells may be suspended in the solution of the present invention and then frozen.
  • the cells When the cells are in the form of tissues or organs, it is preferable to freeze the cells after immersing or refluxing them for a certain period of time in order to sufficiently bring the solutions of the present invention into contact with the tissues or organs. For example, it may be frozen by slow freezing, rapid freezing, vitrification freezing, etc. after several minutes to several hours while immersing or refluxing under the conditions of 0 to 10 ° C.
  • AFGP from which natural product power is also extracted, contains impurities such as proline. If a preservation solution containing natural AFGP is used, it may cause cell damage to cells, tissues or organs during storage or thawing. Become. However, since the composition of the present invention uses compound (I) which is a synthetic AFGP having high purity, the influence of impurities can be minimized.
  • compound (I) can be produced in large quantities by chemical synthesis, and it is possible to prepare a large amount of the composition of the present invention at low cost.
  • a compound having a weight average molecular weight of 4690 and a number average molecular weight of 3000 was used to examine the viability after cryopreservation of splenic islets.
  • the spleen of an 8-week-old Wistar rat was digested by a collagenase perfusion method (Worthington TypelV collagenase O.09%) using total bile duct force-urification.
  • the spleen islets were isolated by specific gravity centrifugation using Ficoll-Conray (FicoU-Conray) solution (manufactured by Amersham Bioscience).
  • the spleen islets were cultured overnight in RPMI1640 (Sigma (Sigma)) 10% FCS medium to recover from cell injury during the isolation process, and then used for freezing experiments.
  • spleen islets were frozen in 200 1 of the following freezing medium. (DMSO and RPMI1640: Sigma)
  • Freezing was performed using a program freezer CryoEmbryo (manufactured by HOXAN) using a slow freezing program.
  • Freezing program seeding at 5.5 ° C, freezing to 80 ° C at 0.3 ° C / min, and storing in liquid nitrogen (gas phase)
  • the results of PI / FDA staining are shown in FIG.
  • the addition group of DMS01M alone was stained red, and the group of DMS01M and synthetic AFGP added at 1 ⁇ g / ml was stained yellow-green. In the latter, a clear effect of maintaining the spleen islet shape after thawing was observed.
  • Table 1 below shows the results of the viability evaluation by PI / FDA staining as the viable cell rate (FDA positive rate / FDA positive rate + PI positive rate).
  • Test Example 1 The same compound as in Test Example 1 was used as the synthetic AFGP to determine the morphology and degree of hemolysis after cryopreservation of red blood cells! I studied.
  • FIGS. As is evident from FIG. 2, morphologically, the red blood cell morphology after thawing was maintained in a concentration-dependent manner in the group to which the synthetic AFGP was added. In addition, as apparent from FIG. 3, the degree of hemolysis was low in a concentration-dependent manner in the group to which the synthetic AFGP was added.
  • rat spleen islets with a diameter of 100 to 200 m isolated by collagenase digestion were used in Test Example 1 in 2 M DMSO RPMI 1640 + 10% FCS medium in 1.5 ml cryotubes (Nunk).
  • the synthesized AFGP was stored at a concentration of 0 or 500 g / ml.
  • freezing use a program freezer at a freezing rate of -0.3 ° C / min, inoculate at -5.5 ° C, freeze to -40 ° C, and then store in liquid nitrogen gas phase. . After storing for 1 week, it was quickly thawed at 200 ° C / min. After serial dilution with 0.75 MSucrose RPMI1640 + 10% FCS, centrifugation, and removal of supernatant, RPMI1640 + 10% FCS medium in the presence of 5% CO at 37 ° C for 24 hours
  • the culture was continued for a while. After culturing for 24 hours, the number of spleen islets with a diameter of 10 or more was counted.
  • the number of spleen islets after freeze-thawing was preserved at an AFGP concentration of 500 g / ml.
  • FIGS. 4 and 5 show photographs of splenic islet cells at a synthetic AFGP concentration of 0,500 g / ml and PI staining results 24 hours after freezing and thawing.
  • rat splenic islets were frozen and thawed.
  • 50 rat spleen islets having a diameter of 100 to 200 ⁇ m were picked up by hand under a stereomicroscope, and washed with 2.8 mM Glucose (basal) Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer (KRB).
  • KRB Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer
  • Preculture was performed for 1 hour in the presence of C, 5% C02. Thereafter, the medium was replaced with 2.8 mM glucose (basal) KRB, and after culturing for 1 hour, the supernatant was recovered. Further, after the medium was replaced with 16.7 mM glucose (stimulation) KRB and the cells were cultured for 1 hour, the supernatant was recovered.
  • the insulin concentration in each of the collected supernatants was measured by ELISA, and the Static stimulation index was calculated. Table 3 shows the results.
  • the freezing process of the spleen islets in a solution to which various concentrations (0 or 500 ⁇ g / ml) of the synthetic AFGP was added was observed under a cryomicroscope (Olympus) and recorded in a video.
  • the results showed that in the test with an AFGP concentration of 500 g / ml, the effect of inhibiting ice crystal formation was highly effective in preventing spleen islet destruction during freezing.
  • composition is useful as a composition for long-term cryopreservation without reducing the viability of mammalian cells, tissues or organs.

Landscapes

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Description

明 細 書
不凍糖タンパク質誘導体を含有する細胞凍結保存用組成物
技術分野
[0001] 本発明は哺乳動物の細胞を凍結保存するための組成物、それを含有する溶液お よび保存方法に関する。
背景技術
[0002] 生細胞を生きたまま半永久的に保存する凍結保存技術は、現在、輸血のための血 球の保存、骨髄移植や臓器移植のための骨髄細胞や生体組織の保存、人工授精 や遺伝資源の保存のための精子や受精卵の保存等に幅広く利用されつつある。し かし、解凍後の生体組織の機能回復率は高いとは言えず、より望ましい保存技術の 開発が求められている。
細胞、組織または臓器を凍結保存した場合の致死的な要因は、氷点以下に冷却 することによって細胞内に発生した氷が物理的に核やミトコンドリア等の細胞内小器 官などを破壊してしまうことであると考えられて 、る。
非特許文献 1にお 、て血液中における巨大分子不凍化化合物が報告され、この巨 大分子不凍化化合物は現在では「不凍糖タンパク質」（AFGP)と呼ばれている。 AF GPは以下のような機能を有して 、る。
(a)氷結晶の形態を変化させる。
(b)形状を保ったまま、氷結晶の成長を抑制する。
(c)熱ヒステリシス活性を有する。すなわち、融点は純水と氷の平衡温度とほとんど変 化させず、 AFGPの濃度 '分子量に依存して凝固点を数度下げる。
(d)氷結晶の再結晶化を抑制する。
(e)細胞膜などの脂質を低温下で安定化させる。
AFGPはこのような生理学的役割やその機能に着目され、食品、医療等の凍結に 関わる様々な分野への応用が期待されている。しかし、 AFGPはほとんどが魚類、昆 虫等からの単離 ·精製により入手されるものであり、大量入手が困難である、不純物 を含む等の理由から、今だ実用化に至っていない。 特許文献 1には魚類等力 抽出された熱ヒステリシスタンパク質を用いた生細胞の 保護および保存する方法が記載されているが、この効果は熱ヒステリシスタンパク質 および細胞 ·細胞膜との相互作用に基づくものであり、氷の広がり（propagatior)に 対する作用とは無関係である旨記載されている。
非特許文献 2および特許文献 2には、本発明に係る AFGP誘導体またはその製造 方法が記載されている力 細胞、組織または臓器等の保存効果について具体的に 記載されていない。
[0003] 非特許文献 1 :サイエンス（Sci ence)、 163、 p. 1073〜1075 (1969年）
非特許文献 2 :アンジュヴアンテ ケミー インターナショナル エディション（
Angewandte Chemie I International edition)、第 43卷、 p. 856— 862、 2004年 特許文献 1：国際公開 WO91Z10361号パンフレット
特許文献 2：国際公開 WO00Z09546号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明の目的は哺乳動物の細胞、組織または臓器のノ ィアビリティを低下させるこ となく長期に凍結保存するための技術を提供することである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、
(1)式 (I) :
[化 1]
Figure imgf000004_0001
(式中、 R1は
Figure imgf000005_0001
であり、 Acはァセチルであり、 nは 2以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物（以下、化合物 (I)とする）を含有 することを特徴とする、細胞凍結保存用組成物に関する。
詳しくは、以下の（2)〜（8)に関する。
(2) nが 2〜10から選択される 1種である式 (I)で示される化合物、その塩またはそれ らの溶媒和物のみまたは nが 2〜10から選択される 2種以上である式 (I)で示される 化合物、その塩またはそれらの溶媒和物の混合物のみを含有する（1)記載の組成 物。
ここで、 nが 2〜10から選択される 1種である式 (I)で示される化合物、その塩または それらの溶媒和物のみを含有する組成物とは、実質的に不純物を含まないことを意 味する。ここで、不純物とは、魚類等から AFGPを抽出する際に混入する AFGP以外 の成分、抗原性等人体に悪影響を与える可能性のある生物由来のタンパク質、生物 由来のウィルスを包含する。
nが 2〜10から選択される 2種以上である式 (I)で示される化合物、その塩またはそ れらの溶媒和物の混合物のみを含有する組成物とは、 nが 2〜10から選択される式（ I)で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物、および前記の nとは異なる 2 〜10から選択される 2以上の式 (I)で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和 物の混合物を含み、実質的に不純物を含まない組成物を意味する。ここで、不純物 とは、魚類等から AFGPを抽出する際に混入する AFGP以外の成分、抗原性等人 体に悪影響を与える可能性のある生物由来のタンパク質、生物由来のウィルスを包 含する。
(3) が
[化 3]
Figure imgf000006_0001
(式中、 Acはァセチル）
である、（1)記載の組成物。
(4)細胞が、哺乳動物の細胞、または組織もしくは臓器の形態である、（1)記載の組 成物。
(5) (1)〜 (4)の ヽずれかに記載の組成物を含有する細胞凍結保存用溶液。
(6)式 (I) :
[化 4]
Figure imgf000006_0002
(式中、 R1は
[化 5]
Figure imgf000006_0003
であり、 Acはァセチルであり、 nは 2以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物と細胞を接触させることを特徴と する、細胞の凍結保存方法。
(7) 0 (5)記載の溶液および細胞を接触させる工程、および
ii)該細胞を 20°C以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の凍結保存方法、および
(8) 0 (1)〜 (4)のいずれかに記載の組成物を、 0.： gZml〜： LmgZmlの濃度で 含有する細胞凍結保存用溶液および細胞を接触させる工程、および
ii)該細胞を 20°C以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の凍結保存方法。
発明の効果
[0008] 本発明組成物の使用により、細胞を長期に凍結保存することが可能となる。保存さ れた細胞は、細胞障害等が最小限に抑えられ、その機能を高度に維持している。従 つて、本発明組成物を用いて保存された細胞、組織または臓器は解凍後においても 移植等に好適に用いることができ、移植後の組織障害、臓器障害等を予防または改 善することが可能である。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]凍結保存後の脾島の蛍光顕微鏡写真である。
[図 2]凍結保存後の赤血球の顕微鏡写真である。
[図 3]凍結保存後の上清の吸光度測定結果である。
[図 4]凍結保存後の脾島の顕微鏡写真である。
[図 5]凍結保存後の脾島の蛍光顕微鏡写真である。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本明細書中において、「細胞」とは動物細胞および植物細胞を包含し、好ましくは 哺乳動物の細胞である。ここで「哺乳動物」とはヒト、ブタおよびゥシ等を含む温血哺 乳動物を意味する。
本明細書中における「細胞」は複数個が集合することにより、組織または臓器の形 態をとつていてもよい。哺乳動物の「細胞」としては、例えば脾島、肝細胞、白血球、 赤血球、血小板、卵母細胞および胚等の細胞、皮膚組織、骨髄組織および角膜組 織等の組織、並びに脾臓、肝臓、脳、肺、心臓、胃、腎臓、脾臓、卵巣および精巣等 の臓器を包含するものである。
「凍結保存」とは、緩速凍結、急速凍結またはガラス化凍結等の方法により細胞、臓 器または組織を凍結して保存することを包含する。保存温度好ましくは 20°C以下、 さらに好ましくは 70°C以下、最も好ましくは 80°C〜一 200°Cである。
[0011] 化合物 (I)はその製薬上許容される塩を包含し、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸 、フッ化水素酸、臭化水素酸等の鉱酸の塩;ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クェン酸、フ マール酸、マレイン酸、コノヽク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスル ホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸等の有機 酸の塩；アンモ-ゥム、トリメチルアンモ-ゥム、トリェチルアンモ -ゥム等の有機塩基 の塩;ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩またはカルシウム、マグネシウム等の アルカリ土類金属の塩等を挙げることができる
化合物 (I)はその溶媒和物も包含し、化合物 (I) 1分子に対し、任意の数の溶媒分 子と配位していてもよい。
化合物 (I)中の nは 2以上の整数であれば本発明に好適に用いることができるが、 好ましくは 4以上、さらに好ましくは 5以上である。上限は特に限定されないが、好まし くは 50以下、さらに好ましくは 15以下、さらに好ましくは 10以下、最も好ましくは 8以 下である。
重量平均分子量は好ましくは 1. 2kDa以上、より好ましくは 2kDa以上、さらに好ま しくは 3kDa以上である。上限は特に限定されないが、好ましくは 40kDa以下、さらに 好ましくは 15kDa以下、より好ましくは 7kDa以下、最も好ましくは 5kDa以下である。 数平均分子量の下限は好ましくは 1. 5kDa以上、より好ましくは 2. 8kDa以上であ り、上限は好ましくは 5kDa以下、より好ましくは 4kDa、さらに好ましくは 3. 5kDaであ る。
[0012] 化合物 (I)の好ま ヽ具体例として、下記化合物が挙げられる。
Figure imgf000009_0001
Mn:数平均分子量
Mw:重量平均分子量
(Acはァセチル）
本発明組成物は化合物 (I)を含むものであれば、特にその組成および形状等は限 定されない。化合物 (I)はいずれ力 1種単独で用いてもよぐ R1および Zまたは nが異 なる 2種以上を混合して用いてもよい。当該組成物の形状は粉末、顆粒、または溶液 等の 、ずれであってもよ 、。化合物 (I)以外に通常使用される各種添加剤や溶媒と 混合して組成物とすることも可能である。
[0014] 本発明溶液は本発明組成物を含むものであれば特に限定されないが、好ましくは 、組織や臓器の保存に臨床上使用されている保存液または還流液に本発明組成物 を添カロすることにより得られる。
臨床上使用されている保存液または還流液としては、生理食塩水、リンゲル液、コリ ンズ液、ユーロコリンズ液、 UW液、 PFC (パーフルォロカーボン）乳剤、ジメチルスル ホキシド (以下、 DMSO)溶液、グリセリン溶液等が挙げられる。特に好ましくは DMS O溶液である。
上記保存液または還流液に本発明組成物を添加すれば本発明溶液が得られる。 本発明溶液中の化合物 (I)の濃度は細胞、臓器または組織の種類、保存条件、保 存液または還流液の種類、並びにその他の添加剤の種類および濃度等により、例え ば 0. Ol /z gZml〜： LOmgZmlの範囲で適宜変更することができる。濃度の下限は、 好ましくは 0. Ι /z gZml以上、さらに好ましくは 0. 5 /z gZml以上、最も好ましくは 1 /z gZml以上である。濃度の上限は、好ましくは lmgZml以下、さらに好ましくは 80 0 μ gZml以下、最も好ましくは 500 μ gZml未満である。
[0015] さらに必要に応じて、通常使用されている細胞内保護剤、ガラス化剤等の 1種以上 の添加剤が添加されて 、てもよ 、。
細胞内保護剤またはガラス化剤としては DMSO、グリセリン、プロピレングリコール 、エチレングリコーノレ、グノレコース、スクロース、トレノヽロース、プロパンジォーノレ、ブタ ンジオール、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、およびポリビュルピロリドン 等が挙げられる。
細胞内保護剤またはガラス化剤の濃度はその種類、細胞、臓器または組織の種類 、保存条件およびィ匕合物（I)の濃度等により、例えば 0. 01mmol/ml~20mmol/ mlの範囲で適宜変更が可能である。濃度の下限は、好ましくは 0. ImmolZml以上 、さらに好ましくは 0. 5mmolZml以上、最も好ましくは ImmolZml以上である。濃 度の上限は、好ましくは lOmmolZml以下、さらに好ましくは 5mmolZml以下、最 も好ましくは 2mmolZml以下である。
[0016] 細胞を保存する場合には、本発明溶液に細胞を懸濁した後、凍結すればよ!ヽ。細 胞が組織または臓器の形態である場合には、十分に本発明溶液と組織または臓器 を接触させるため、一定時間本発明溶液中に浸漬または還流した後に凍結すること が好ましい。例えば 0〜10°Cの条件下、浸漬または還流させながら数分〜数時間経 過後に緩速凍結法、急速凍結法、ガラス化凍結法等の方法により凍結させればよい
[0017] 低温保存した細胞、組織または臓器は解凍した後に移植等に用いるが、通常、そ の生存率、機能回復率は高いとは言えない。しかし、本発明組成物を用いて凍結保 存された細胞は凍結 ·融解過程にぉ 、て構造が破壊されることなく良好なバイアビリ ティを維持するため、解凍後の高い生存率、機能回復率を示す。
天然物力も抽出される AFGPはプロリン等の不純物が混入しているため、天然 AF GPを含む保存液を使用した場合、保存中または解凍中に細胞、組織または臓器等 に対する細胞障害等の誘因となる。しかし、本発明組成物は純度の高い合成 AFGP である化合物 (I)を使用することから、不純物による影響は最小限に抑えることができ る。
また、化合物 (I)は化学合成により大量に製造することが可能であり、安価に大量の 本発明組成物を調製することが可能である。
以下に実施例および試験例を示すが、これらは本発明の範囲を限定するものでは ない。
実施例
[0018] 試験例 1
合成 AFGPとして、式：
[化 7]
Figure imgf000012_0001
(Acはァセチル）
で示され、重量平均分子量が 4690、数平均分子量が 3000である化合物を使用し、 脾島凍結保存後のバイアビリティの検討を行った。
8週齢ウィスターラット（ホクドー製)の脾を総胆管力-ユレーシヨンによるコラゲナー ゼ灌流法（Worthington TypelV collagenaseO.09%)によって消化した。フイコール'コ ンレイ (FicoU- Conray)液 (アマシャムバイオサイエンス (Amersham Bioscience)製)に よる比重遠心法にて脾島を単離した。脾島は単離過程における細胞傷害から回復さ せるため RPMI1640 (シグマ（Sigma製） ) 10%FCSの培地にてオーバーナイト培養後、 凍結実験に用いた。
以下の凍結用培地 200 1に脾島各 100個ずつ凍結した。 （DMSOおよび RPMI1640 ：シグマ（Sigma)製）
培地： RPMI1640に DMSOを 1Mを添カロ
RPMI1640に DMS01Mおよび合成 AFGP1 μ g/mlを添カロ
凍結はプログラムフリーザー CryoEmbryo (ホクサン（HOXAN)製）を用い、緩徐凍結 プログラムにて行った。
凍結プログラム： 5.5°Cにて植氷、 0.3°C/分にて 80°Cまで凍結後、液体窒素（ 気相）にて保存
保存は液体窒素 (気相）中にて 1週間保存した。解凍は 37°Cウォーターバスにて急 速解凍した。 DMSOを 0.75Mスクロースを含む RPMI1640培地にて除去後、 RPMI1640 10%FCSの培地にてオーバーナイト培養した。
解凍翌日に倒立型蛍光顕微鏡 EclipSeTS100 (-コン製)を用い、形態と PI/FDA染 色によるバイアビリティ評価を行った。 (PI：ヨウ化プロビジゥム (シグマ製）、 FDA:フル ォレセイン ジァセテート (Fluorescein diacetate) (モレキュラープローブ (Molecular Probe)製）
PI/FDA染色結果を図 1に示す。 DMS01Mのみの添力卩群は赤色に、 DMS01Mおよ び合成 AFGP 1 μ g/ml添加群は黄緑に染色されており、後者において明らかな解凍 後の脾島形態保持効果を認めた。下記表 1に PI/FDA染色によるバイアビリティ評価 の結果を生細胞率 (FDA陽性率/ FDA陽性率 +PI陽性率)で示す。
[0020] [表 1]
Figure imgf000013_0001
*： ρ < 0 . 0 5
[0021] 試験例 2
合成 AFGPとして試験例 1と同様の化合物を用い、赤血球凍結保存後の形態およ び溶血度につ！、て検討した。
健常ヒトボランティアより提供をうけ、 CPD(Citrate Phosphate Dextrose)液にて採血 、遠心後上清をのぞいたヒト赤血球濃厚液 (Ht80%)にグリセリン (シグマ製)を最終濃 度 35%となるように添加した。合成 AFGPを各濃度に振って保存液に添カロ（
0,10,50,100,500,1000 μ g/ml)L,クライオチューブに lmlずつ分注し液体窒素にて急 速凍結した。液体窒素中（気相）に 1週間保存後、 37°Cウォーターバスにて急速解凍 した。
PBS (-)にて洗浄後、倒立顕微鏡 EclipSeTS10 (-コン製）にて形態、および遠心後 の上清の 576nm吸光度測定 (BioRad Model550)によって溶血度を測定した。
結果を図 2および図 3に示す。図 2から明らかな通り、形態上、合成 AFGP添加群は 濃度依存性に解凍後の赤血球細胞形態が保持されていた。また、図 3から明らかな 通り、溶血度は合成 AFGP添加群において濃度依存性に低ぐ合成 AFGPによる凍結 時の赤血球細胞保護作用を認めた。
CPD液組成 (g/1)
結晶リン酸二水素ナトリウム 2.51 クェン酸ナトリウム 6.3
クェン酸 3.27
ブドウ糖 23.2 (全て和光純薬製）
[0022] 試験例 3
コラゲナーゼ消化法にて単離した直径 100〜200 mのラット脾島を各々 100個ずつ 、 1.5mlクライオチューブ (Nunk)中に、 2M DMSO RPMI 1640+10%FCS培地にて、試験 例 1で用いた合成 AFGP濃度を 0または 500 g/mlとして凍結保存した。凍結を行う際 は、プログラムフリーザーを用い、凍結速度- 0.3°C/分で、植氷を- 5.5°Cで行い、 -40 °Cまで凍結し、その後、液体窒素気相中にて保存した。 1週間保存した後、 200°C/分 にて急速解凍した。 0.75MSucrose RPMI1640+10%FCSにて段階希釈し、遠心分離を 行い、上清を除去した後、 RPMI1640+10%FCS培地にて 5%CO存在下、 37°Cで 24時
2
間培養した。解凍力も 24時間培養した後、直径 10 以上の脾島数を計測した。
[0023] [表 2]
Figure imgf000014_0001
上記のように、凍結解凍後の脾島数は AFGP濃度 500 g/mlにおいて保存されてい た。
図 4および図 5に、凍結解凍 24時間後における合成 AFGP濃度 0, 500 g/mlの脾 島細胞、および PI染色結果の写真を示した。
[0024] 試験例 4
試験例 3記載の方法にしたがって、ラット脾島の凍結および解凍を行った。 直径 100〜200 μ mのラット脾島を実体顕微鏡下に各 50個ずつハンドピックアップし 、 2.8mM Glucose(basal) Krebs- Ringer Bicarbonate Buffer (KRB)にて洗净した。 37。C 、 5%C02存在下にて 1時間、前培養した。その後、培地を 2.8mMグルコース (basal) KRBに交換し、 1時間培養した後に上清を回収した。さらに、 16.7mMグルコース (stimulation) KRBに培地を交換し 1時間培養した後に、上清を回収した。 それぞれ回収した上清中のインスリン濃度を ELISAにて測定し、 Static stimulation indexを算出した。その結果を表 3に示した。
[表 3]
Figure imgf000015_0001
上記のように、凍結解凍後グルコース刺激インスリン分泌能 (Static stimulation index) は、合成 AFGP濃度 500 g/mlにおいて良好な結果であった。
[0026] 試験例 5
各種濃度 (0または 500 μ g/ml)の合成 AFGPを添加した溶液中での脾島の凍結過 程を、低温顕微鏡 (Olympus社製)下で観察し、ビデオに記録した。その結果から、 AFGP濃度 500 g/mlの試験において、氷晶形成抑制による凍結時脾島破壊防止効 果が高いことがわ力つた。
産業上の利用可能性
[0027] 哺乳動物の細胞、組織または臓器のバイアビリティを低下させることなく長期に凍結 保存するための組成物として有用である。

Claims

Figure imgf000016_0001
(式中、 R1は
[化 2]
Figure imgf000016_0002
であり、 Acはァセチルであり、 nは 2以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含有することを特徴とする、細 胞凍結保存用組成物。
[2] nが 2〜10から選択される 1種である式 (I)で示される化合物、その塩またはそれらの 溶媒和物のみまたは nが 2〜 10から選択される 2種以上である式 (I)で示される化合 物、その塩またはそれらの溶媒和物の混合物のみを含有する請求項 1記載の組成 物。
[3] が
[化 3]
Figure imgf000017_0001
(式中、 Acはァセチル）
である、請求項 1記載の組成物。
[4] 細胞が、哺乳動物の細胞、または組織もしくは臓器の形態である、請求項 1記載の組
、
成物。
[5] 請求項 1〜4のレヽずれかに記載の組成物を含有する細胞凍結保存用溶液。
[6] 式 (I) :
[化 4]
Figure imgf000017_0002
(式中、 R1は
[化 5]
または
Figure imgf000017_0003
であり、 Acはァセチルであり、 nは 2以上の整数である）
で示される化合物、その塩またはそれらの溶媒和物と細胞を接触させることを特徴と する、細胞の凍結保存方法。
[7] i)請求項 5記載の溶液および細胞を接触させる工程、および
ii)該細胞を 20°C以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の凍結保存方法。
[8] i)請求項 1〜4のいずれかに記載の組成物を、 0. 1 gZml〜： LmgZmlの濃度で 含有する細胞凍結保存用溶液および細胞を接触させる工程、および
ii)該細胞を 20°C以下で保存する工程
を含むことを特徴とする、細胞の凍結保存方法。
上段:明視野 xlOO 下段: PI/FDA染色
Figure imgf000019_0001
IM DMSOのみ IM DMSO
合成 AFGPl g/ml
[図 2]
Figure imgf000019_0002
0 g/ml 10 g/ml
Figure imgf000019_0003
100 g/ml 1000 g/ml
差眷ぇ用紙（規則 26) 2/3
[図 3]
吸光度 576nm
Figure imgf000020_0001
[図 4]
Figure imgf000020_0002
Oug/ml 500ug/ml 差替え用紙 OTJ26) 3/3
[図 5]
Figure imgf000021_0001
差眷ぇ用紙（規則 26)
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