RU2785227C1 - Криоконсервирующий раствор, не содержащий дмсо, и способ его получения и применение - Google Patents
Криоконсервирующий раствор, не содержащий дмсо, и способ его получения и применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2785227C1 RU2785227C1 RU2021123860A RU2021123860A RU2785227C1 RU 2785227 C1 RU2785227 C1 RU 2785227C1 RU 2021123860 A RU2021123860 A RU 2021123860A RU 2021123860 A RU2021123860 A RU 2021123860A RU 2785227 C1 RU2785227 C1 RU 2785227C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- cryopreservation
- pva
- buffer
- freezing
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 6
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 149
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 79
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 53
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 42
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 239000002977 biomimetic material Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 claims abstract 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 250
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 claims description 61
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 45
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 45
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 45
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 30
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 28
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 16
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims description 13
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 8
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002338 cryopreservative Effects 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N Thr-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O QOLYAJSZHIJCTO-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- VUKAUDKDFVSVFT-UHFFFAOYSA-N 2-[6-[4,5-bis(2-hydroxypropoxy)-2-(2-hydroxypropoxymethyl)-6-methoxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxyoxane-3,4-diol Chemical compound COC1C(OC)C(OC2C(C(O)C(OC)C(CO)O2)O)C(COC)OC1OC1C(COCC(C)O)OC(OC)C(OCC(C)O)C1OCC(C)O VUKAUDKDFVSVFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 claims description 2
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 2
- 108091006822 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 claims description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000002840 non-reducing disaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 claims 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 64
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 51
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 30
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 18
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 11
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 11
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 210000003954 Umbilical Cord Anatomy 0.000 description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 229960003589 Arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 4
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N Ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 3
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 2
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N Glucono δ-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 229960003681 Gluconolactone Drugs 0.000 description 2
- 210000003958 Hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 description 2
- 229940021015 I.V. solution additive Amino Acids Drugs 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000182 glucono-delta-lactone Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003071 parasitic Effects 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2S)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3H-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 1
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 229940055695 Pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 210000003856 Spermatozoa Anatomy 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000003014 Totipotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000002444 Unipotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;hexafluorophosphate Chemical compound F[P-](F)(F)(F)(F)F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002710 gonadal Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- -1 polysucrose Chemical compound 0.000 description 1
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО, способ получения криоконсервирующего раствора, замораживающий уравновешивающий раствор, не содержащий ДМСО, криоконсервирующий реагент, не содержащий ДМСО, и применение криоконсервирующего раствора и/или замораживающего уравновешивающего раствора для криоконсервации биологических тканей. В одном из вариантов реализации криоконсервирующий раствор содержит на 100 мл 0,01–50 г биомиметического материала для подавления нарастания льда, 5,0–45 мл многоатомного спирта, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1–1,0 моль/л, 0–30 мл сыворотки, и остальное составляет буфер, где биомиметический материал для подавления нарастания льда выбран из атактического ПВС, характеризующегося синдиотактичностью, составляющей 15–60%, молекулярной массой 10–500 кДа или более, и степенью гидролиза более 80%, или указанного атактического ПВС и аминокислотного биомиметического материала для подавления нарастания льда. Изобретение расширяет арсенал средств для криоконсервации. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 9 табл., 8 пр.
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Китая №201910281978.2, поданной в Национальное ведомство по интеллектуальной собственности Китая 9 апреля 2019 года под названием «КРИОКОНСЕРВИРУЮЩИЙ РАСТВОР, НЕ СОДЕРЖАЩИЙ ДМСО, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ», и заявки на патент Китая №201910281986.7 под названием «ПЕПТИДНОЕ СОЕДИНЕНИЕ И СОДЕРЖАЩИЙ ЕГО КРИОКОНСЕРВИРУЮЩИЙ РАСТВОР», каждая из которых включена в настоящую заявку в полном объеме посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к технической области биомедицинских материалов и, в частности, к криоконсервирующему раствору, не содержащему ДМСО, и способу его получения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Технология криоконсервации стала одной из самых незаменимых исследовательских методик в области естественных наук с момента ее создания и имеет широкое применение. С улучшением качества жизни и развитием медицинской техники криоконсервация половых клеток человека (сперматозоидов и ооцитов), гонадных тканей и т.п. становится важным средством сохранения репродуктивной способности. Кроме того, по мере старения мировой популяции, быстро растет потребность в криоконсервации донорских клеток, тканей или органов человека, которые могут быть использованы для регенеративной медицины и трансплантации органов. Следовательно, вопрос эффективной криоконсервации ценных клеток, тканей и органов становится важной темой в области естественных наук.
В настоящее время наиболее распространенным способом криоконсервации является витрификация. Несмотря на то, что технология витрификации обеспечивает витрификацию жидкости внутри и снаружи клетки непосредственно в ходе процесса быстрой заморозки, что позволяет избегать повреждения, обусловленного образованием кристаллов льда в процессе замораживания, реагенты для криоконсервации, известные из уровня техники, являются неэффективными в отношении контроля роста и перекристаллизации кристаллов льда в ходе процесса размораживания, что, таким образом, приводит к повреждению клетки. Диметилсульфоксид (ДМСО) является широко используемым сорастворителем и криоконсервантом для клеток проникающего типа для клеточной культуры in vitro. Однако ДМСО оказывает неблагоприятное побочное действие в клинических исследованиях, а также проявляет высокую цитотоксичность. Различные типы клеток характеризуются разными показателями чувствительности к концентрации ДМСО, что приводит к токсическим и побочным эффектам реагентов для криоконсервации при поглощении клетками ДМСО в качестве основного компонента защитного агента. Таким образом, применение реагентов для криоконсервации ограничено. В настоящее время при витрификации обычно используется высокая концентрация (≥15%) ДМСО, что оказывает серьезное влияние на выживаемость и даже безопасность (потомства) и проявления функциональности у криоконсервированных объектов после восстановления. В заключение, реагенты для криоконсервации, используемые в настоящее время, характеризуются проблемами, связанными с их неспособностью обеспечивать эффективный контроль роста и перекристаллизации кристаллов льда в ходе процесса размораживания, а также с их высокой токсичностью.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для преодоления вышеуказанных недостатков предшествующего уровня техники согласно настоящему изобретению предложены криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО, и способ его получения.
Согласно настоящему изобретению предложено следующее техническое решение:
криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО, содержащий в пересчете на объем 100 мл 0,01-50,0 г биомиметического материала для подавления нарастания льда, 5,0-45 мл многоатомного спирта, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1 моль/л, 0-30 мл сыворотки, и остальное составляет буфер, причем биомиметический материал для подавления нарастания льда выбран из поливинилового спирта (ЛВС) и/или аминокислотного биомиметического материала для подавления нарастания льда, при этом криоконсервирующий раствор не содержит диметилсульфоксида (ДМСО).
Согласно настоящему изобретению аминокислотный биомиметический материал для подавления нарастания льда выбран из одного или двух или более из следующих компонентов: полиаминокислота (со степенью полимеризации ≥2, предпочтительно 8-40, такой как 8, 15 или 20 и т.д.), аминокислота и пептидное соединение.
Согласно настоящему изобретению пептидное соединение представляет собой полипептид (предпочтительно пептид, состоящий из 2-8 разных аминокислот, такой как дипептид, трипептид или тетрапептид), производное гликопептида или соединение формулы (I):
где R выбран из замещенного или незамещенного алкила, причем заместитель может быть выбран из -ОН, -NH2, -СООН, -CONH2 и т.п.; например, R представляет собой замещенный или незамещенный C1-6алкил, и предпочтительно R представляет собой -CH3, -СН2СН3 или -СН2СН2СООН; n представляет собой целое число, которое больше или равняется 1 и меньше или равняется 1000, и, например, может представлять собой целое число в диапазоне от 1 до 100. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения n представляет собой целое число, такое как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
Согласно настоящему изобретению многоатомный спирт может представлять собой многоатомный С2-5-спирт, предпочтительно С2-С3 двухатомный спирт и трехатомный спирт, и, например, любой из этиленгликоля, пропиленгликоля и глицерина.
Согласно настоящему изобретению водорастворимый сахарид может представлять собой по меньшей мере одно из невосстанавливающего дисахарида, водорастворимого полисахарида, водорастворимой целлюлозы и гликозида, например, может быть выбран из сахарозы, трегалозы, полисахарозы и гидроксипропилметилцеллюлозы. Водорастворимый сахарид может защищать клеточные мембраны и препятствовать седиментации клеток. Согласно настоящему изобретению буфер может представлять собой по меньшей мере один из DPBS, HEPES-забуференного HTF-буфера и других буферов для клеток.
Согласно настоящему изобретению сыворотка может представлять собой человеческий сывороточный альбумин или его заменитель, такой как додецилсульфат натрия (ДСН), для криоконсервации материала, полученного из организма человека, и может представлять собой фетальную бычью сыворотку или бычий сывороточный альбумин для криоконсервации материала, полученного из организма, отличного от человека.
В криоконсервирующем растворе, раскрытом в настоящей заявке, биомиметический материал для подавления нарастания льда может представлять собой ПВС, при этом содержание ПВС составляет 0,1-6,0 г, например, 0,5-5,0 г, и, в частности, может составлять 1,0 г, 2,0 г, 3,0 г или 4,0 г.
В соответствии с криоконсервирующим раствором, раскрытым в настоящей заявке, биомиметический материал для подавления нарастания льда может представлять собой полиаминокислоту или аминокислоту, при этом содержание полиаминокислоты или аминокислоты составляет 0,01-50 г, например, 1,5-50 г, и, в частности, может составлять 8,0 г, 10 г, 15 г, 20 г, 30 г или 40 г.
В соответствии с криоконсервирующим раствором, раскрытым в настоящей заявке, материал для подавления нарастания льда может представлять собой комбинацию ПВС и полиаминокислоты, например, состоит из 0,1-5,0 г ПВС и 1,0-9,0 г полиаминокислоты.
В соответствии с криоконсервирующим раствором, раскрытым в настоящей заявке, материал для подавления нарастания льда может представлять собой комбинацию ПВС и аминокислоты, например, состоит из 0,1-5,0 г ПВС и 8,0-35 г аминокислоты.
В соответствии с криоконсервирующим раствором, раскрытым в настоящей заявке, содержание многоатомного спирта составляет 6,0-28 мл, например, 7,0-20 мл или 10-15 мл на 100 мл криоконсервирующего раствора.
В соответствии с криоконсервирующим раствором, раскрытым в настоящей заявке, содержание сыворотки составляет 0,1-30 мл, например, 5,0-20 мл или 10-15 мл на 100 мл криоконсервирующего раствора.
В криоконсервирующем растворе, раскрытом в настоящей заявке, содержание сыворотки предпочтительно составляет 0 на 100 мл криоконсервирующего раствора.
В криоконсервирующем растворе, раскрытом в настоящей заявке, содержание водорастворимого сахарида составляет 0,1-1,0 моль/л на 100 мл криоконсервирующего раствора, например, 0,1-0,8 моль/л или 0,2-0,6 моль/л, и, в частности, например, 0,25 моль/л, 0,5 моль/л или 1,0 моль/л.
В соответствии с криоконсервирующим раствором, раскрытым в настоящей заявке, рН криоконсервирующего раствора составляет 6,5-7,6, например, 6,9-7,2.
В качестве варианта реализации настоящего изобретения криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
0,01 6,0 г ПВС,
5,0-45 мл многоатомного спирта,
0,1-30 мл сыворотки,
водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, и
остальное составляет буфер.
Предпочтительно криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
1,0-6,0 г ПВС,
5-30 мл этиленгликоля,
0,1-20 мл сыворотки,
сахароза в концентрации 0,2-0,8 моль/л, и
остальное составляет DPBS.
В качестве варианта реализации настоящего изобретения криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов на 100 мл в объеме:
1,0-5,0 г ПВС,
10-45 мл многоатомного спирта,
водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, и
остальное составляет буфер.
Предпочтительно криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
1,0-5,0 г ПВС,
10-30 мл этиленгликоля,
сахароза в концентрации 0,2-0,8 моль/л, и
остальное составляет DPBS.
В качестве варианта реализации настоящего изобретения криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
2,0-50 г аминокислоты,
0,1-6 г ПВС,
10-30 мл многоатомного спирта,
водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л,
10-20 мл сыворотки, и
остальное составляет буфер.
Предпочтительно криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
5,0-18 г L-Arg,
3,0-12 г L-Thr,
1,0-6,0 г ПВС,
10-20 мл этиленгликоля,
сахароза в концентрации 0,2-0,8 моль/л,
10-20 мл сыворотки, и
остальное составляет DPBS.
В качестве варианта реализации настоящего изобретения криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
0,1-9,0 г полиаминокислоты,
0,01-6,0 г ПВС,
10-30 мл многоатомного спирта,
водорастворимый сахарид в концентрации 0,1-1,0 моль/л, и
остальное составляет буфер.
Предпочтительно криоконсервирующий раствор состоит из следующих компонентов в пересчете на объем 100 мл:
0,1-5,0 г полипролина или полиаргинина,
1,0-6,0 г ПВС,
10-20 мл этиленгликоля,
сахароза в концентрации 0,2-0,8 моль/л, и
остальное составляет DPBS.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения криоконсервирующего раствора, который включает следующие стадии: растворение в DPBS биомиметического материала для подавления нарастания льда, охлаждение до комнатной температуры перед регулированием рН, растворение других компонентов, за исключением сыворотки, в оставшемся DPBS, и смешивание после охлаждения, и снова подтверждение или регулирование рН, а также добавление буфера для достижения заданного объема, причем сыворотку добавляют при применении криоконсервирующего раствора.
Способ получения согласно настоящему изобретению включает следующие стадии:
(1) растворение ПВС в порции буфера и охлаждение до комнатной температуры перед регулированием рН с получением раствора 1;
(2) необязательно растворение полиаминокислоты или аминокислоты в порции буфера и охлаждение до комнатной температуры перед регулированием рН с получением раствора 2;
(3) растворение водорастворимого сахарида в другой порции буфера и после полного растворения водорастворимого сахарида добавление других компонентов, за исключением сыворотки, с получением раствора 3; и
(4) смешивание раствора 1, необязательно раствора 2 и раствора 3 после их охлаждения до комнатной температуры, и регулирование рН, и доведение объема до заданного объема буфером с получением криоконсервирующего раствора.
Способ получения согласно настоящему изобретению включает следующие стадии:
(1) растворение полиаминокислоты или аминокислоты в порции буфера и охлаждение до комнатной температуры перед регулированием рН с получением раствора 1;
(2) растворение ПВС в порции буфера и охлаждение до комнатной температуры перед регулированием рН с получением раствора 2;
(3) растворение водорастворимого сахарида в другой порции буфера и после полного растворения водорастворимого сахарида добавление других компонентов, за исключением сыворотки, с получением раствора 3; и
(4) смешивание раствора 1, необязательно раствора 2 и раствора 3 после их охлаждения до комнатной температуры, и регулирование рН, и доведение объема до заданного объема буфером с получением криоконсервирующего раствора.
Согласно способу получения, раскрытому в настоящей заявке, если криоконсервирующий раствор содержит сыворотку, то сыворотку добавляют при применении криоконсервирующего раствора.
Согласно способу получения, раскрытому в настоящей заявке, на стадии (1) ПВС растворяют при нагревании на теплой бане, например, при нагревании на масляной бане или на водяной бане. Например, температура водяной бани составляет 60-95°С, предпочтительно 80°С. На стадии (1) растворение включает стадию перемешивания.
Согласно способу получения, раскрытому в настоящей заявке, на стадии (2) растворение представляет собой растворение с помощью ультразвука.
Предложен не содержащий ДМСО замораживающий уравновешивающий раствор, содержащий в пересчете на объем 100 мл 0-5,0 г ПВС, 5,0-45 мл многоатомного спирта, 0-30 мл сыворотки, и остальное составляет буфер.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в настоящей заявке, содержание ПВС составляет 0,1-5,0 г, например, 0,1 г, 0,5 г, 1,0 г или 2,0 г.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в настоящей заявке, содержание многоатомного спирта составляет 6,0-28 мл, например, 7,0-20 мл или 10-15 мл.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в настоящей заявке, содержание сыворотки составляет 0,1-30 мл, например, 5,0-20 мл или 10-15 мл. В качестве варианта реализации настоящего изобретения содержание сыворотки составляет 0.
В качестве варианта реализации настоящего изобретения замораживающий уравновешивающий раствор в пересчете на объем 100 мл содержит 7,5-15 мл многоатомного спирта, 10-20 мл сыворотки, и остальное составляет DPBS.
В качестве варианта реализации настоящего изобретения замораживающий уравновешивающий раствор в пересчете на объем 100 мл содержит 1,0-5,0 г ПВС, 7,5-15 мл многоатомного спирта, и остальное составляет буфер.
В замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытом в настоящей заявке, ПВС, многоатомный спирт и сыворотка могут быть выбраны из типов соответствующих компонентов криоконсервирующего раствора.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ получения замораживающего уравновешивающего раствора, который включает растворение соответствующих компонентов в буфере, при этом сыворотку хранят отдельно и добавляют к замораживающему уравновешивающему раствору при его применении.
Предложен криоконсервирующий реагент, не содержащий ДМСО, содержащий замораживающий уравновешивающий раствор, описанный выше, и криоконсервирующий раствор, описанный выше, причем замораживающий уравновешивающий раствор и криоконсервирующий раствор представлены независимо соответственно.
Согласно криоконсервирующему реагенту, раскрытому в настоящей заявке, содержание сыворотки в криоконсервирующем растворе составляет 0, при этом замораживающий уравновешивающий раствор содержит в пересчете на объем 100 мл 1,0-5,0 г ПВС, 7,5-15 мл многоатомного спирта, и остальное составляет буфер.
В криоконсервирующем реагенте, раскрытом в настоящей заявке, замораживающий уравновешивающий раствор содержит в пересчете на объем 100 мл следующие компоненты:
0-5,0 г ПВС,
0-15 г полиаминокислоты,
5,0-45 мл многоатомного спирта,
0-30 мл сыворотки, и
остальное составляет буфер;
криоконсервирующий раствор содержит следующие компоненты в пересчете на общий объем 100 мл:
0,01-6,0 г ПВС,
0-50 г аминокислоты или полиаминокислоты,
5,0-45 мл многоатомного спирта,
0-30 мл сыворотки,
водорастворимый сахарид в концентрации
0,1-1,0 моль/л, и
остальное составляет буфер.
Согласно настоящему изобретению ПВС выбран из одного или комбинации двух или более ПВС, таких как изотактический ПВС, синдиотактический ПВС и атактический ПВС. Например, ПВС характеризуется синдиотактичностью 15-60%, предпочтительно 45-60%, такой как 50-55%.
Согласно настоящему изобретению ПВС может быть выбран из ПВС с молекулярной массой 10-500 кДа или более, такой как 10-30 кДа, 30-50 кДа, 80-90 кДа или 200-500 кДа.
Согласно настоящему изобретению ПВС может быть выбран из ПВС со степенью гидролиза более 80%, такой как 80-99%, 82-87%, 87-89%, 89-99% или 98-99%.
Согласно настоящему изобретению полиаминокислота может представлять собой гомополимер (со степенью полимеризации ≥2) по меньшей мере одного, выбранного из лизина, аргинина, пролина, треонина, гистидина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и т.п.
Согласно настоящему изобретению пептидное соединение представляет собой полипептид, который состоит из двух или более аминокислот и может быть выбран из одного или более из L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L-Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT) и L-Ala-L-Ala-L-Thr (AAT). Эти полипептиды могут быть синтезированы с применением способа синтеза полипептидов, известного из уровня техники, такого как способ твердофазного синтеза.
Согласно настоящему изобретению гликопептидное производное синтезировано с использованием сахарида и аминокислоты, например, представляет собой молекулу, состоящую из глюконо-дельта-лактона (GDL) и аминокислоты, характеризующейся сродством со льдом, посредством химического связывания, и, например, представляет собой GDL-L-Thr, GDL-L-Gln, GDL-L-Asn, GDL-L-Phe, GDL-L-Tyr или GDL-L-Thr. Гликопептидное соединение может быть получено путем осуществления реакции сахарида, известного из уровня техники, с аминокислотой, например, способом твердофазного синтеза или путем осуществления реакции сахарида с аминокислотой в органическом растворителе.
Согласно настоящему изобретению пептидное соединение имеет структуру в соответствии с любой из формул (1) - (8):
Согласно настоящему изобретению соединение формулы (I) имеет структуру, соответствующую любой из представленных:
Согласно настоящему изобретению соединение, представленное формулой (9), получают с применением следующего пути синтеза:
В криоконсервирующем растворе и замораживающем уравновешивающем растворе, раскрытых в настоящей заявке, количества всех компонентов представлены в пересчете на общий объем раствора 100 мл, при этом остальное представляет собой буфер.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено применение криоконсервирующего раствора при криоконсервации различных клеток, органов и тканей, включая криоконсервацию ооцитов, эмбрионов, различных стволовых клеток, органов и тканей, причем органы и ткани включают, но не ограничиваются ими, овариальные органы и овариальные ткани.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ замораживания и размораживания клеток или эмбрионов, включающий:
(1) помещение клеток или эмбрионов в криоконсервирующий раствор, раскрытый в настоящей заявке, с получением суспензии клеток, и замораживание; и
(2) помещение замороженных клеток или эмбрионов в размораживающий раствор для размораживания и восстановления.
Согласно способу замораживания и восстановления, раскрытому в настоящей заявке, клетки или эмбрионы помещают в уравновешивающий раствор для уравновешивания перед их помещением в криоконсервирующий раствор.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ криоконсервации стволовых клеток, в котором применяют микрокапельный метод. Например, способ криоконсервации стволовых клеток включает следующие стадии: добавление к стволовым клеткам криоконсервирующего раствора, пипетирование смеси с диспергированием стволовых клеток с получением суспензии стволовых клеток и помещение суспензии стволовых клеток на предметное стекло для замораживания и осуществление криоконсервации в жидком азоте (-196°С).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения размораживание криоконсервированных стволовых клеток включает помещение предметного стекла для замораживания со стволовыми клетками в среду а-МЕМ и размораживание клеток при температуре 37°С.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения стволовые клетки представляют собой различные стволовые клетки, которые известны в данной области техники и способны к дифференциации, такие как тотипотентные, плюрипотентные или унипотентные стволовые клетки, включая, но не ограничиваясь ими, эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки различных типов (например, мезенхимальные стволовые клетки пуповины, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки и т.п.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен способ криоконсервации органов и/или тканей, включающий: помещение органа и/или ткани в замораживающий уравновешивающий раствор для уравновешивания, помещение указанных органа и/или ткани в криоконсервирующий раствор, помещение указанных органа и/или ткани на предметное стекло для замораживания и осуществление криоконсервации в жидком азоте.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения орган и/или ткань представляют собой овариальную ткань или овариальный орган, которые могут представлять собой срез овариальной ткани или цельную овариальную ткань.
Согласно настоящему изобретению термины «криоконсервация» и «криогенная консервация» имеют одно и то же значение и используются взаимозаменяемо для обозначения консервации вещества или клетки, ткани или органа при низкой температуре с сохранением их исходной физико-химической и/или биологической активности, а также их физиологических и биохимических функций.
Согласно настоящему изобретению тип «стволовых клеток» конкретно не ограничен. Криоконсервирующий раствор, раскрытый в настоящей заявке, можно применять для криоконсервации различных стволовых клеток, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, мезенхимальные стволовые клетки пуповины, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, гемопоэтические стволовые клетки и т.п.
Согласно настоящему изобретению биологическая ткань может быть получена из животных, включая теплокровных млекопитающих, таких как люди и приматы; птиц; домашних или сельскохозяйственных животных, таких как кошки, собаки, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади и свиньи; лабораторных животных, таких как мыши, крысы и морские свинки; рыб; рептилий; и зоопарковых животных, и диких животных, и т.п.
Преимущества
Криоконсервирующий раствор и замораживающий уравновешивающий раствор, раскрытые в настоящей заявке, не содержат ДМСО. При применении для криоконсервации ооцитов и эмбрионов мышей они могут обеспечивать достижение показателей выживаемости клеток и тканей, а также стабильности проявления функциональности, аналогичных или даже выше, чем у коммерческого криоконсервирующего раствора (содержащего ДМСО в объемной концентрации 15%), и, таким образом, они обладают относительно высокой эффективностью консервации. Криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО и не содержащий сыворотки, дополнительно обеспечивает решение проблем, заключающихся в том, что коммерческие криоконсервирующие растворы, обычно используемые в клинической практике в настоящее время, являются недостаточно стабильными и склонны к включению паразитарных биологических загрязнителей, обусловленных наличием сыворотки. Криоконсервирующий раствор, раскрытый в настоящей заявке, характеризуется простотой состава, легкодоступностью исходных материалов и низкой стоимостью, а также может широко применяться при криоконсервации ооцитов, клеточных клеток (таких как эмбрионы), стволовых клеток, тканей и органов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 представляет собой изображение окрашенного среза свежего (незамороженного) овариального органа новорожденной мыши 3-дневного возраста;
ФИГ. 2 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированного интактного овариального органа согласно сравнительному варианту реализации 7 после размораживания;
ФИГ. 3 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированного интактного овариального органа согласно варианту применения 14 после размораживания;
ФИГ. 4 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированного интактного овариального органа согласно варианту применения 15 после размораживания;
ФИГ. 5 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированного овариального органа согласно варианту реализации 16 после размораживания;
ФИГ. 6 представляет собой изображение окрашенного среза свежей (незамороженной) овариальной ткани половозрелой мыши;
ФИГ. 7 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани согласно сравнительному варианту реализации 8 после размораживания;
ФИГ. 8 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани согласно варианту применения 17 после размораживания;
ФИГ. 9 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани согласно варианту применения 18 после размораживания; и
ФИГ. 10 представляет собой изображение окрашенного среза криоконсервированной овариальной ткани согласно варианту применения 19 после размораживания.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Способ получения согласно настоящему изобретению будет более подробно проиллюстрирован со ссылкой на следующие конкретные примеры. Следует понимать, что следующие примеры представлены лишь с целью типичной иллюстрации и пояснения настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как ограничивающие объем правовой охраны настоящего изобретения. Все методики, разрабатываемые на основании вышеуказанного содержания настоящего изобретения, подпадают под объем правовой охраны настоящего изобретения.
Если не указано иное, экспериментальные методы, используемые в следующих примерах, представляют собой традиционные методы. Если не указано иное, реагенты, материалы и т.п., используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными.
ПВС, используемый в примерах настоящего изобретения, характеризуется синдиотактичностью 50-55%, молекулярной массой 13-23 кДа и степенью гидролиза 98%.
В примерах настоящего изобретения поли-L-пролин, используемый в замораживающем растворе, характеризуется степенью полимеризации 8 или 15 и молекулярной массой 795 или 1475, при этом используемый поли-L-аргинин характеризуется степенью полимеризации 8 и молекулярной массой 1267. Поли-L-пролин в размораживающем растворе характеризуется степенью полимеризации 8 и молекулярной массой 795.
Показатель выживаемости в примерах настоящего изобретения представляет собой среднее для показателя выживаемости в 3 12 повторных экспериментах.
Пример 1. Криоконсервация ооцитов и эмбрионов мышей
1. Получение криоконсервирующих растворов: криоконсервирующие растворы получали согласно приведенным ниже составам.
Криоконсервирующий раствор А содержит на 100 мл следующие компоненты:
2,0 г ПВС растворяли в 25 мл DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и доводили рН до 7,0 с получением раствора 1; 1,5 г поли-L-пролина растворяли под воздействием ультразвука в дополнительных 20 мл DPBS и доводили рН до 7,0 с получением раствора 2; 17 г (0,05 моль) сахарозы (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли под воздействием ультразвука в 25 мл DPBS и после полного растворения сахарозы добавляли 10 мл этиленгликоля с получением раствора 3; после повторного достижения комнатной температуры раствор 1, раствор 2 и раствор 3 хорошо смешивали, доводили рН до 7,0 и доводили объем до общего объема 100 мл с помощью DPBS с получением криоконсервирующего раствора А для последующего применения.
Криоконсервирующий раствор В содержит на 100 мл следующие компоненты:
Стадии получения криоконсервирующего раствора В: 2,0 г ПВС растворяли в 20 мл DPBS на водяной бане при 80°С при нагревании и с использованием магнитной мешалки и доводили рН до 7,1 с получением раствора 1; 8,0 г L-Arg и 4,0 г L-Thr растворяли в 20 мл DPBS и доводили рН до 7,1 с получением раствора 2; 17 г (0,05 моль) сахарозы (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли под воздействием ультразвука в 20 мл DPBS и после полного растворения сахарозы добавляли 10 мл этиленгликоля с получением раствора 3; после повторного достижения комнатной температуры раствор 1, раствор 2 и раствор 3 хорошо смешивали, доводили рН до 7,1 и объем доводили до 80% от общего объема с помощью DPBS; при применении криоконсервирующего раствора добавляли 20 мл сыворотки.
Криоконсервирующий раствор С содержит в пересчете на объем 100 мл следующие компоненты:
2,0 г ПВС растворяли в 25 мл DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и доводили рН до 6,9 с получением раствора 1; 17 г (0,05 моль) сахарозы (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли под воздействием ультразвука в 25 мл DPBS и после полного растворения сахарозы добавляли 10 мл этиленгликоля с получением раствора 2; после повторного достижения комнатной температуры раствор 1 и раствор 2 хорошо смешивали, регулировали рН и объем доводили до 80% от общего объема; 20 мл сыворотки хранили отдельно и добавляли при применении криоконсервирующего раствора.
Криоконсервирующий раствор D содержит в пересчете на объем 100 мл следующие компоненты:
2,0 г ПВС растворяли в 30 мл DPBS на водяной бане при 80°С при нагревании и с использованием магнитной мешалки и доводили рН до 7,0 с получением раствора 1; 17 г (0,05 моль) сахарозы (конечная концентрация сахарозы в криоконсервирующем растворе составляла 0,5 моль/л) растворяли под воздействием ультразвука в 25 мл DPBS и после полного растворения сахарозы добавляли 10 мл этиленгликоля с получением раствора 2; после повторного достижения комнатной температуры раствор 1 и раствор 2 хорошо смешивали, регулировали рН и доводили объем до общего объема 100 мл с получением криоконсервирующего раствора D для последующего применения.
2. Получение замораживающих уравновешивающих растворов: замораживающие уравновешивающие растворы получали согласно приведенным ниже составам.
Замораживающий уравновешивающий раствор а: 2,0 г ПВС растворяли в 50 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и после полного растворения ПВС доводили рН до 7,0, добавляли 7,5 мл этиленгликоля, тщательно перемешивали все компоненты и доводили объем до 100 мл с помощью буфера DPBS с получением замораживающего уравновешивающего раствора а для последующего применения.
Замораживающий уравновешивающий раствор b (общий объем: 100 мл): 7,5 мл этиленгликоля растворяли в 72,5 мл DPBS, и тщательно перемешивали, и при применении замораживающего уравновешивающего раствора добавляли 20 мл сыворотки.
Сравнительный пример 1
Замораживающий уравновешивающий раствор №1 содержит, в пересчете на 1 мл, 7,5% (об./об.) ДМСО, 7,5% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор №1 содержит, в пересчете на 1 мл, 15% (об./об.) ДМСО, 15% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, 0,5 М сахарозы, и остальное составляет DPBS.
Замораживающий уравновешивающий раствор b содержит, в пересчете на 1 мл, 7,5% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор №2 содержит, в пересчете на 1 мл, 10% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, 0,5 М сахарозы, и остальное составляет DPBS.
Три состава размораживающих растворов, используемых в Примере 1 и Сравнительном примере 1, описанных в настоящей заявке, представляли собой следующие:
Размораживающий раствор №1 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS) и размораживающий раствор IV (20% сыворотки, и остальное составляет DPBS).
Размораживающий раствор №2 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS).
Размораживающий раствор №3 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, полипролин в концентрации 10 мг/мл, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, полипролин в концентрации 5,0 мг/мл, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, полипролин в концентрации 2,5 мг/мл, и остальное составляет DPBS) и размораживающий раствор IV (ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS).
Пример применения 1:
Замораживающие уравновешивающие растворы и криоконсервирующие растворы из примера и сравнительного примера, описанных выше, применяли для криоконсервирования ооцитов и эмбрионов согласно схемам, представленным в Таблице 1 и Таблице 2, соответственно.
1. Криоконсервация ооцитов
Ооциты мышей сначала уравновешивали в замораживающем уравновешивающем растворе в течение 5 минут, а затем уравновешивали в полученном криоконсервирующем растворе в течение 1 минуты. Ооциты, уравновешенные в криоконсервирующем растворе, загружали на соломинки и соломинки быстро помещали в жидкий азот (-196°С), а затем закрывали для криоконсервации. Во время размораживания криоконсервированные ооциты уравновешивали в размораживающем растворе I при 37°С в течение 5 минут, а затем уравновешивали последовательно в размораживающих растворах II-IV по 3 минуты в каждом. После того, как размороженные ооциты инкубировали в течение 2 ч, наблюдали количество выживших клеток и рассчитывали показатели выживаемости (см. Таблицу 1).
2. Криоконсервация эмбрионов
Эмбрионы мышей сначала уравновешивали в замораживающем уравновешивающем растворе в течение 5 мин, а затем уравновешивали в полученном криоконсервирующем растворе в течение 50 с. Эмбрионы, уравновешенные в криоконсервирующем растворе, загружали на соломинки, и соломинки быстро помещали в жидкий азот (-196°С) и закрывали для криоконсервации. При размораживании замороженные эмбрионы уравновешивали в размораживающем растворе I при 37°С в течение 3 минут, а затем последовательно уравновешивали в размораживающих растворах II-IV по 3 минуты в каждом. После того, как размороженные эмбрионы инкубировали в течение 2 ч, наблюдали количество выживших эмбрионов и рассчитывали показатели выживаемости (см. Таблицу 2).
Согласно данным каждого из Примера 1 и Сравнительного примера 1 видно, что несмотря на отсутствие добавления ДМСО не содержащие ДМСО криоконсервирующий раствор и замораживающий уравновешивающий раствор, раскрытые в настоящей заявке, за счет синергетического эффекта всех компонентов по-прежнему обеспечивают надлежащее криоконсервирующее действие в отношении ооцитов и эмбрионов и обеспечивают устранение дефекта, заключающегося в том, что существующие криоконсервирующие растворы токсичны для клеток или эмбрионов из-за добавления ДМСО в относительно высокой концентрации. Кроме того, как видно из вариантов применения 2 и 6-8, когда в уравновешивающем растворе, замораживающем растворе и размораживающем растворе отсутствуют сыворотка и ДМСО, показатели выживаемости криоконсервированных ооцитов и эмбрионов могут превосходить таковые для существующих коммерческих криоконсервирующих растворов при совместном действии биомиметического материала для подавления нарастания льда, раскрытого в настоящей заявке, проницаемого защитного вещества, а именно этиленгликоля, и т.п. Дополнительно решаются проблемы, заключающиеся в том, что коммерческие криоконсервирующие растворы, обычно используемые в клинической практике в настоящее время, имеют короткий срок годности и склонны к включению паразитарных биологических загрязнителей, обусловленных наличием сыворотки.
Пример 2. Криоконсервация пуповинных мезенхимальных стволовых клеток человека
1. Получение криоконсервирующих растворов: криоконсервирующие растворы получали согласно приведенным ниже составам.
Криоконсервирующий раствор Е (общий объем: 100 мл) содержит 10 мл этиленгликоля, 20 мл сыворотки, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 4,0 г поли-L-аргинина (со степенью полимеризации 8), 1,0 г ПВС, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор F (общий объем: 100 мл) содержит 20 мл этиленгликоля, 20 мл сыворотки, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 16 г L-Arg, 8,0 г L-Thr, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор G (общий объем: 100 мл) содержит 10 мл этиленгликоля, 20 мл сыворотки, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 2,0 г ПВС, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор Н (общий объем: 100 мл) содержит 10 мл этиленгликоля, 20 мл сыворотки, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 28 г TR, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор I (общий объем: 100 мл) содержит 10 мл этиленгликоля, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 2,0 г ПВС, и остальное составляет DPBS.
Способы составления криоконсервирующих растворов были аналогичны таковым из Примера 1.
Способ получения TR заключается в следующем:
(1) 2-хлортритилхлоридную смолу помещали в реакционную пробирку и добавляли ДХМ (20 мл/г). Полученную смесь встряхивали в течение 30 мин. С помощью воронки с фильтром с песчаным сердечником удаляли растворитель путем отсасывания. К полученному остатку добавляли трехкратный молярный избыток Fmoc-L-Thr(tBu)-OH и восьмикратный молярный избыток DIEA, после чего добавляли ДМФА с обеспечением растворения. Полученную смесь встряхивали в течение 30 мин. Для блокирования концевых групп применяли обработку метанолом в течение 30 мин.
(2) Удаляли растворитель ДМФА. Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г) и через 5 мин удаляли растворитель; затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г) и через 15 мин удаляли раствор пиперидина. Отбирали небольшое количество смолы и промывали этанолом три раза, затем добавляли нингидриновый реагент и нагревали при 105-110°С в течение 5 мин. Появлялось темно-синее окрашивание, что предусматривает положительную реакцию.
(3) После того как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промыли ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), в реакционную пробирку добавляли двукратный избыток Fmoc-Arg(Pbf)-OH, растворенный в как можно меньшем количестве ДМФА, и добавляли двукратный избыток HBTU. Сразу после этого добавляли восьмикратный избыток DIEA и оставляли для протекания реакции на 30 мин.
(4) После удаления раствора путем отсасывания отбирали небольшое количество смолы и промывали этанолом три раза, затем добавляли нингидриновый реагент и нагревали при 105-110°С в течение 5 мин. Бесцветная смесь предполагала отрицательную реакцию, то есть реакция была завершена.
(5) После того как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промыли ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДМФА (15 мл/г, дважды), растворитель удаляли. Затем добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г) и через 5 мин удаляли растворитель; затем снова добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (10 мл/г) и через 15 мин удаляли раствор пиперидина. Отбирали небольшое количество смолы и промывали этанолом, добавляли нингидриновый реагент и нагревали при 105-110°С в течение 5 минут. Появлялось темно-синее окрашивание, что предусматривает положительную реакцию.
(6) После того как продукт, полученный в результате вышеприведенной реакции, последовательно промыли ДМФА (15 мл/г, дважды), метанолом (15 мл/г, дважды) и ДХМ (15 мл/г, дважды), смолу высушивали путем отсасывания.
(7) Полученный продукт отделяли с помощью отщепляющей жидкости (15 мл/г, ТФУК: вода: EDT:Tis=95:1:2:2, об./об.) в течение 90 мин. Отщепляющую жидкость продували до сухого состояния азотом, а затем лиофилизировали с получением неочищенного продукта, представляющего собой полипептид.
(8) Полипептид очищали с помощью ВЭЖХ и подвергали солевой трансформации или обессоливанию. ВЭЖХ: tR=4,8 мин (модель колонки для очистки: Kromasil 100-5С18, 4,6 мм*250 мм; градиент элюента: ацетонитрил с 0,1% ТФУК и водный раствор с 0,1% ТФУК, 0 мин 1:99, 20 мин 1:4. Очищенный раствор лиофилизировали с получением готового продукта L-Thr-L-Arg (TR). Выход составлял около 80%. Масс-спектр соответствовал [М+Н]+ при 276,2.
Сравнительный пример 2:
Криоконсервирующий раствор №3 содержит, в пересчете на 1 мл: 10% (об./об.) ДМСО, 15% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, и остальное составляет среда а-МЕМ (С12571500 ВТ, Invitrogen, США).
Пуповинные мезенхимальные стволовые клетки человека подвергали криоконсервации с применением криоконсервирующих растворов, описанных выше, согласно схеме, представленной в Таблице 3. Способ криоконсервации пуповинных стволовых клеток человека представляет собой, в частности, микрокапельный способ, а именно: пуповинные мезенхимальные стволовые клетки человека в чашке для культивирования расщепляли с использованием 25% панкреатина в течение 2 мин, помещали в культуральный раствор (10% FBS + культуральная среда а-МЕМ) того же объема и осторожно пипетировали до полного отделения стволовых клеток; клетки добавляли в центрифужную пробирку вместимостью 1,5 мл для центрифугирования в течение 5 мин при 1000 об/мин и отбрасывали надосадочную жидкость для отделения клеток от культуральной среды; добавляли 10 мкл замораживающего раствора в нижнюю часть центрифужной пробирки, осторожно пипетировали стволовые клетки с диспергированием кластеров стволовых клеток и помещали 10 мкл замораживающего раствора со стволовыми клетками на предметное стекло для замораживания, а затем криоконсервировали в жидком азоте (-196°С). При размораживании предметное стекло для замораживания с клетками и замораживающим раствором помещали непосредственно в среду а-МЕМ при 37°С для размораживания. После размораживания клетки окрашивали трипановым синим для изучения показателей выживаемости и подсчитывали число клеток с использованием прибора JIMBIO-FIL; показатель выживаемости представляет собой отношение числа живых клеток к общему числу клеток (см. Таблицу 3).
Когда раскрытый в настоящей заявке криоконсервирующий раствор применяют для криоконсервации пуповинных мезенхимальных стволовых клеток человека, показатель выживаемости стволовых клеток может достигать 92,4% (Вариант применения 9), несмотря на отсутствие добавления ДМСО, и может достигать 77,1% (Вариант применения 13) даже при отсутствии добавления ДМСО и сыворотки. Это означает, что криоконсервирующий реагент может обеспечивать достижение такой же эффективности, что и традиционный замораживающий раствор при замораживании стволовых клеток, при этом показатель выживаемости после размораживания для него даже значительно выше, чем для криоконсервирующего раствора (Сравнительный вариант реализации 5), содержащего 10% ДМСО, обычно используемого в настоящее время, и криоконсервирующий эффект криоконсервирующего раствора на основе ПВС значительно превосходит эффект криоконсервирующего раствора на основе ПВС, используемого в Сравнительном варианте реализации 6 без ПВС.
Пример 3. Криоконсервация интактных овариальных органов и срезов овариальной ткани
Криоконсервирующий раствор J (общий объем: 100 мл) содержит 10 мл этиленгликоля, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 2,0 г ПВС, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор K (общий объем: 100 мл) содержит 10 мл этиленгликоля, 20 мл сыворотки, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 1,0 г ПВС, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор L содержит 10 мл этиленгликоля, 20 мл сыворотки, 17 г сахарозы (0,5 моль/л), 4,0 г поли L-аргинина (со степенью полимеризации 8), 1,0 г ПВС, и остальное составляет DPBS.
Сравнительный пример 3: криоконсервирующий раствор содержит, в пересчете на 1 мл, 15% (об./об.) ДМСО, 15% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) сыворотки, 0,5 М сахарозы, и остальное составляет DPBS.
Замораживающий уравновешивающий раствор а: 2,0 г ПВС растворяли в 50 мл буфера DPBS на водяной бане при 80°С с использованием магнитной мешалки при нагревании и после полного растворения ПВС доводили рН до 7,0, добавляли 7,5 мл этиленгликоля, тщательно перемешивали все компоненты, регулировали рН и объем доводили до 100 мл с получением замораживающего уравновешивающего раствора а для последующего применения.
Замораживающий уравновешивающий раствор b: 7,5 мл этиленгликоля добавляли в 72,5 мл DPBS, и тщательно перемешивали, и при применении замораживающего уравновешивающего раствора добавляли 20 мл сыворотки.
Сравнительный пример 3:
Замораживающий уравновешивающий раствор №1 содержит, в пересчете на 1 мл, 7,5% (об./об.) ДМСО, 7,5% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, и остальное составляет DPBS.
Криоконсервирующий раствор №1 содержит, в пересчете на 1 мл: 15% (об./об.) ДМСО, 15% (об./об.) этиленгликоля, 20% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки, сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, и остальное составляет DPBS.
Размораживающий раствор №1 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий 20% сыворотки, и остальное составляет DPBS).
Размораживающий раствор №2 содержит размораживающий раствор I (содержащий сахарозу в концентрации 1,0 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор II (содержащий сахарозу в концентрации 0,5 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS), размораживающий раствор III (содержащий сахарозу в концентрации 0,25 моль/л, ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS) и размораживающий раствор IV (содержащий ПВС в концентрации 20 мг/мл, и остальное составляет DPBS).
Интактные овариальные органы новорожденных мышей возрастом до 3 дней и срезы овариальной ткани половозрелых мышей подвергали криоконсервации с использованием криоконсервирующих растворов, описанных выше, и замораживающих уравновешивающих растворов и криоконсервирующих растворов из сравнительного примера согласно схемам, представленным в Таблице 4 и Таблице 5.
Цельные овариальные органы или срезы овариальной ткани сначала уравновешивали в уравновешивающем растворе при комнатной температуре в течение 25 мин, затем уравновешивали в полученном криоконсервирующем растворе в течение 15 мин и после этого загружали на соломинки; соломинки помещали в жидкий азот для консервации. После размораживания интактные овариальные органы или срезы овариальной ткани инкубировали в культуральном растворе (10% FBS+а-МЕМ) в инкубаторе при 37°С/5% СО2 в течение 2 ч для дальнейшего размораживания, а затем фиксировали с использованием 4% параформальдегида, заливали в парафин и окрашивали НЕ для морфологического исследования. Результаты показаны на ФИГ. 1-10. ФИГ. 1 представляет собой изображение среза свежего незамороженного овариального органа, и ФИГ. 6 представляет собой изображение среза свежей незамороженной овариальной ткани.
Как видно на ФИГ. 1-5, по отношению к Сравнительному варианту реализации 7, в котором отсутствует аминокислотный биомиметический материал для подавления нарастания льда, и свежим, незамороженным овариальным органам, примеры 14-16 характеризуются следующим: исходная структура фолликул остается относительно интактной, интерстициальная структура остается относительно интактной, цитоплазма клеток является однородной и слегка окрашенной в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание являются относительно умеренными, структура сосудистой стенки является интактной, разрушение просвета является относительно небольшим, цитоплазма клеток эндотелия является однородной и слегка окрашенной, а сокращения ядер и глубокое окрашивание являются относительно умеренными. Видно, что примеры 14-16 характеризуются лучшим эффектом криоконсервации в отношении овариальных органов.
Как видно на ФИГ. 6-10, по отношению к Сравнительному варианту реализации 8 и свежей незамороженной овариальной ткани, схемы из Примеров 17-19 характеризуются следующим: структура антральных фолликул является относительно интактной, интерстициальная структура является относительно интактной, цитоплазма клеток является однородной и слегка окрашенной в относительно небольшом количестве, а сокращения ядер и глубокое окрашивание являются относительно умеренными. Видно, что раскрытые в настоящей заявке криоконсервирующие растворы оказывают лучший эффект в отношении криоконсервации овариальных тканей по сравнению с криоконсервирующими растворами, известными из уровня техники.
Выше были описаны конкретные примеры согласно настоящему изобретению. Однако настоящее изобретение не ограничено вышеприведенными примерами. Какая-либо модификация, эквивалент, улучшение и т.п., выполненные без отступления от сущности и принципа настоящего изобретения, безусловно подпадают под действие правовой охраны настоящего изобретения.
Claims (37)
1. Криоконсервирующий раствор, не содержащий ДМСО, содержащий на 100 мл 0,01–50 г биомиметического материала для подавления нарастания льда, 5,0–45 мл многоатомного спирта, водорастворимый сахарид в концентрации 0,1–1,0 моль/л, 0–30 мл сыворотки, и остальное составляет буфер,
характеризующийся тем, что
биомиметический материал для подавления нарастания льда выбран из атактического ПВС, характеризующегося синдиотактичностью, составляющей 15–60%, молекулярной массой 10–500 кДа или более, и степенью гидролиза более 80%, или указанного атактического ПВС и аминокислотного биомиметического материала для подавления нарастания льда,
при этом аминокислотный биомиметический материал для подавления нарастания льда выбран из одного или двух или более из полиаминокислоты со степенью полимеризации ≥ 2, аминокислоты и пептидного соединения;
при этом пептидное соединение представляет собой полипептид, производное гликопептида или соединение формулы (I):
формула (I),
где R выбран из замещенного или незамещенного алкила, причем заместитель может быть выбран из -OH, -NH2, -COOH, -CONH2; n представляет собой целое число, которое больше или равняется 1 и меньше или равняется 1000,
при этом полипептид выбран из L-Thr-L-Arg (TR), L-Thr-L-Pro (TP), L-Arg-L-Thr (RT), L-Pro-L-Thr (PT), L-Thr-L-Arg-L-Thr (TRT), L-Thr-L-Pro-L-Thr (TPT) и L-Ala-L-Ala-L-Thr (AAT);
при этом производное гликопептида представляет собой по меньшей мере одно из GDL-L-Thr, GDL-L-Gln, GDL-L-Asn, GDL-L-Phe, GDL-L-Tyr, GDL-L-Val и GDL-L-Ser.
2. Криоконсервирующий раствор по п. 1, в котором R представляет собой замещенный или незамещенный C1–6алкил, и предпочтительно R представляет собой -CH3, -CH2CH3 или -CH2CH2COOH.
3. Криоконсервирующий раствор по п. 1 или 2, в котором содержание атактического ПВС составляет 0,1–6,0 г;
при этом предпочтительно многоатомный спирт может представлять собой многоатомный C2–5-спирт, такой как любой из этиленгликоля, пропиленгликоля и глицерина;
предпочтительно водорастворимый сахарид может представлять собой по меньшей мере одно из невосстанавливающего дисахарида, водорастворимого полисахарида и гликозида, например, выбран из сахарозы, водорастворимой целлюлозы (например, гидроксипропилметилцеллюлозы), трегалозы и полисахарозы;
предпочтительно буфер может представлять собой по меньшей мере одно из DPBS, HEPES-забуференного HTF-буфера и других буферов для клеток;
согласно настоящему изобретению сыворотка может быть выбрана из человеческого сывороточного альбумина или его заменителя, такого как додецилсульфат натрия, для криоконсервации материала, полученного из организма человека, и может представлять собой фетальную бычью сыворотку или бычий сывороточный альбумин для криоконсервации материала, полученного из организма, отличного от человека.
4. Криоконсервирующий раствор по любому из пп. 1–3, в котором материал для подавления нарастания льда представляет собой комбинацию атактического ПВС и аминокислоты и/или полиаминокислоты, и, например, состоит из 0,1–5,0 г ПВС, 8,0–35 г аминокислоты и/или 1,0–9,0 г полиаминокислоты.
5. Криоконсервирующий раствор по любому из пп. 1–4, в котором атактический ПВС характеризуется синдиотактичностью, составляющей 50–60%;
предпочтительно полиаминокислота представляет собой гомополимер по меньшей мере одного, выбранного из лизина, аргинина, пролина, треонина, гистидина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина.
6. Криоконсервирующий раствор по любому из пп. 1–5, в котором содержание многоатомного спирта составляет 6,0–28 мл;
при этом предпочтительно содержание сыворотки составляет 0;
предпочтительно содержание водорастворимого сахарида составляет 0,1–1,0 моль/л;
предпочтительно pH криоконсервирующего раствора составляет 6,5–7,6.
7. Способ получения криоконсервирующего раствора по любому из пп. 1–6, включающий: растворение материала для подавления нарастания льда в буфере, охлаждение до комнатной температуры перед регулированием рН, растворение других компонентов в остальном количестве буфера и перемешивание после охлаждения; при этом
предпочтительно способ получения включает:
(1) растворение атактического ПВС в порции буфера и охлаждение до комнатной температуры перед регулированием pH с получением раствора 1;
(2) необязательно растворение полиаминокислоты или аминокислоты в порции буфера и охлаждение до комнатной температуры перед регулированием pH с получением раствора 2;
(3) растворение водорастворимого сахарида в порции буфера и после полного растворения водорастворимого сахарида добавление других компонентов, за исключением сыворотки, с получением раствора 3; и
(4) смешивание раствора 1, необязательно раствора 2 и раствора 3 после их охлаждения до комнатной температуры, и регулирование pH, и доведение объема до заданного объема буфером с получением криоконсервирующего раствора;
необязательно, если криоконсервирующий раствор содержит сыворотку, то сыворотку добавляют при применении криоконсервирующего раствора.
8. Замораживающий уравновешивающий раствор, не содержащий ДМСО, содержащий на 100 мл 0–5,0 г атактического ПВС, 5,0–45 мл многоатомного спирта, 0–30 мл сыворотки, и остальное составляет буфер; характеризующийся тем, что атактический ПВС представляет собой атактический ПВС, характеризующийся синдиотактичностью, составляющей 15–60%, молекулярной массой 10–500 кДа или более, и степенью гидролиза более 80%.
9. Замораживающий уравновешивающий раствор по п. 8, в котором замораживающий уравновешивающий раствор содержит на 100 мл 7,5–15 мл многоатомного спирта, 10–20 мл сыворотки, и остальное составляет буфер;
при этом предпочтительно замораживающий уравновешивающий раствор содержит на 100 мл 0,5–3,5 г ПВС, 7,5–15 мл многоатомного спирта, и остальное составляет буфер.
10. Криоконсервирующий реагент, не содержащий ДМСО, содержащий криоконсервирующий раствор по любому из пп. 1–6 и замораживающий уравновешивающий раствор по любому из пп. 8, 9, причем криоконсервирующий раствор и замораживающий уравновешивающий раствор представлены независимо;
при этом предпочтительно содержание сыворотки составляет 0, и замораживающий уравновешивающий раствор содержит на 100 мл 0,5–2,5 г атактического ПВС, 7,5–15 мл многоатомного спирта, и остальное составляет буфер.
11. Применение криоконсервирующего раствора по любому из пп. 1–6 и/или замораживающего уравновешивающего раствора по любому из пп. 8, 9 для криоконсервации биологических тканей.
12. Применение по п. 11, в котором биологическая ткань выбрана из по меньшей мере одного из ооцита, эмбриона, стволовой клетки, органа и ткани.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910281978.2 | 2019-04-09 | ||
| CN201910281986.7 | 2019-04-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2785227C1 true RU2785227C1 (ru) | 2022-12-05 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991010361A1 (en) * | 1990-01-17 | 1991-07-25 | The Regents Of The University Of California | Composition to improve survival of biological materials |
| WO2013117925A1 (en) * | 2012-02-08 | 2013-08-15 | University Of Warwick | Cryopreservation of cells in absence of vitrification inducing agents |
| RU2661107C1 (ru) * | 2009-09-15 | 2018-07-11 | Зэ Юниверсити оф Токио | Новый способ получения дифференцированных клеток |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991010361A1 (en) * | 1990-01-17 | 1991-07-25 | The Regents Of The University Of California | Composition to improve survival of biological materials |
| RU2661107C1 (ru) * | 2009-09-15 | 2018-07-11 | Зэ Юниверсити оф Токио | Новый способ получения дифференцированных клеток |
| WO2013117925A1 (en) * | 2012-02-08 | 2013-08-15 | University Of Warwick | Cryopreservation of cells in absence of vitrification inducing agents |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020256502B2 (en) | Cryopreservation solution without DMSO, preparation method therefor and application thereof | |
| WO2018064975A1 (en) | Compositions and methods for maintaining cell viability | |
| CN111789105B (zh) | 一种氨基酸类冷冻保存液在干细胞冻存中的应用 | |
| JP6561173B2 (ja) | 哺乳動物細胞投与用液 | |
| WO2014162910A1 (ja) | 生物材料の低温保存用の保存剤及び低温での生物材料の保存方法 | |
| JP7323290B2 (ja) | 凍結保存組成物およびその使用方法 | |
| CN109832261A (zh) | 一种细胞冻存液及其应用 | |
| Hu et al. | Trehalose in biomedical cryopreservation–properties, mechanisms, delivery methods, applications, benefits, and problems | |
| CN111793111A (zh) | 一种含肽类化合物的冷冻保存液在干细胞冻存中的应用 | |
| RU2785227C1 (ru) | Криоконсервирующий раствор, не содержащий дмсо, и способ его получения и применение | |
| EP3939428A1 (en) | Serum-free cryopreservation solution and preparation method and application thereof | |
| WO2005056763A2 (en) | Process and formulation to improve viability of stored cells and tissue | |
| US20100267002A1 (en) | Peptide having life-lengthening effect on cells | |
| CN114467917A (zh) | 含有多肽的冷冻保存液在工程细胞和细胞系冷冻保存中的应用 | |
| JP7459130B2 (ja) | 融解液及びその調製方法並びに応用 | |
| RU2791227C1 (ru) | Размораживающая жидкость, способ ее приготовления и ее применение | |
| US20200396985A1 (en) | Preservation and cryopreservation media | |
| CN111789102B (zh) | 一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用 | |
| JP2008094752A (ja) | 生体材料を保護する機能を有するペプチド | |
| CN111789103A (zh) | 一种冷冻保存用解冻液及解冻方法 | |
| Briard | The Rational Design and Use of Novel Small-Molecule Ice Recrystallization Inhibitors for the Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells and Red Blood Cells | |
| WO2005095586A1 (ja) | 不凍糖タンパク質誘導体を含有する細胞凍結保存用組成物 |