KR101536395B1

KR101536395B1 - 변이서열을 포함하는 결빙방지 단백질 및 그 용도

Info

Publication number: KR101536395B1
Application number: KR1020130031889A
Authority: KR
Inventors: 진언선; 곽윤호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2013-03-26
Filing date: 2013-03-26
Publication date: 2015-07-22
Also published as: KR20140119211A

Abstract

본원은 효능이 개선된 결빙방지 단백질, 이를 코팅하는 유전자, 이를 포함하는 벡터 및 미생물을 개시한다. 본원에 따른, 극지해양 규조인 키토세로스 네오그래실 유래의 결빙방지 단백질은 일부 아미노산의 치환을 통한 개량을 통해 기존의 단백질과 비교하여 활성이 월등히 증가하였을 뿐아니라 미생물을 이용한 대량생산이 가능하여 산업적, 상업적으로 매우 유용하다.

Description

변이서열을 포함하는 결빙방지 단백질 및 그 용도 {Antifreeze protein with mutation and its use}

본원은 결빙방지 단백질과 관련된 분야이다.

극지 혹은 저온 환경에 서식하는 생물체는 저온 환경에 적응하기 위해 다양한 생존, 적응 기작을 가지고 있다. 이러한 저온 적응 기작은 고등한 동물 및 식물에서부터 박테리아와 같은 단세포 생물에서도 보고되고 있다.

저온 적응 기작 중 가장 대표적인 방법이 결빙방지 단백질 (Antifreeze protein, AFP)의 생산이다. 따라서 매우 다양한 종에서 결빙방지 단백질이 보고되고 있다 (Janech MG, Krell A, Mock T, Kang J-S, & Raymond JA (2006) Ice-binding proteins from sea ice diatoms (Bacillariophyceae); Raymond JA, Janech MG, & Fritsen CH (2009) Novel ice-binding proteins from a psychrophilic Antarctic alga (Chlamydomonadaceae, chlorophyceae); Uhlig C, et al. (2011) Heterologous expression, refolding and functional characterization of two antifreeze proteins from Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae); Ewart KV, Li Z, Yang DS, Fletcher GL, & Hew CL (1998) The ice-binding site of Atlantic herring antifreeze protein corresponds to the carbohydrate-binding site of C-type lectins; Lauersen KJ, Brown A, Middleton A, Davies PL, & Walker VK (2011) Expression and characterization of an antifreeze protein from the perennial rye grass, Lolium perenne; Bayer-Giraldi M, Uhlig C, John U, Mock T, & Valentin K (2010) Antifreeze proteins in polar sea ice diatoms: diversity and gene expression in the genus Fragilariopsis; Gwak IG, Jung WS, Kim HJ, Kang SH, & Jin E (2010) Antifreeze protein in Antarctic marine diatom, Chaetoceros neogracile).

결빙방지 단백질은 얼음에 직접적으로 부착하여 얼음의 성장을 억제하고 용액의 어는점을 낮추어 녹는점과 어는점 사이의 온도 차이를 형성하여 저온에서 생물의 생존이 가능하게 한다. 이런 어는점 낮춤 현상을 열적이력현상 (Thermal hysteresis) 라 한다 (Raymond JA & DeVries AL (1977) Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes; Duman JA & Olsen TM (1993)Thermal hysteresis protein activity in bacteria, fungi and phylogenetically diverse plants).

이러한 결빙방지 단백질은 혈액 보존, 난자의 보관 등의 의학 분야, 저온 발표 및 음식의 저장의 식품분야 등 등 다양한 분양서 적용 및 응용이 가능하다고 알려져 있다 (Koushafar H, Pham L, Lee C, Rubinsky B (1997) Chemical adjuvant cryosurgery with antifreeze proteins; Rubinsky B, Arav A, Fletcher GL (1991) Hypothermic protection?fundamental property of antifreeze proteins; Carpenter JF, Hansen TN (1992) Antifreeze protein modulated cell survival during cryopreservation: mediation through influence on ice crystal growth; Margesin R, Neuner G, Storey KB (2007) Cold-loving microbes, plants, and animals-fundamental and applied aspects).

남극 해양성 규조인 키토세로스 네오그래실 (Chaetoceros neogracile) 또한 결빙방지 단백질을 생산한다. 이 결빙방지 단백질의 열적이력활성은 어류의 평균 활성과 매우 비슷하다고 보고되었다 (Gwak IG, Jung WS, Kim HJ, Kang SH, & Jin E (2010) Antifreeze protein in Antarctic marine diatom, Chaetoceros neogracile).

대한민국 등록특허 제0978758호는 키토세로스 네오그래실 유래의 얼음-결합 단백질에 관한 것으로, 얼음에 결합하여 결빙을 방지하는 단백질을 개시한다.

하지만 이런 결빙방지 단백질을 상용화 하기 위해서는 활성이 증가된 단백질의 개발 및 이 단백질의 대량생산 시스템이 필요하다.

이에 본원은 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 기존의 결빙방지 단백질과 비교하여 성능이 향상된 개량 결빙방지 단백질을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 야생형 결빙단백질을 코딩하는 서열번호 1의 서열을 기준으로 143번째 글라이신이 타이로신 또는 트레오닌 중 하나 이상으로 치환된, 서열을 갖는 결빙방지 단백질을 코딩하는 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 따른 단백질은 결빙이 필요한 분야에서 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 일 구현예에서는 수용액 중의 단백질의 결빙을 방지하며, 특히 얼음에 직접적으로 결합하여 얼음결정 형성을 억제하여 용액의 어는 점을 낮춘다.

본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며 일 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 서열을 가진다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 이러한 벡터는 특히 원핵세포 발현용 벡터로, 본원에 따른 단백질을 발현할 수 있는 한 다양한 벡터가 사용될 수 있으며, 예를 들면 pET28a, pET 시리즈, pGEX 시리즈, pQE 시리즈, pDEST 시리즈, pCOLD 시리즈, pColdI, 또는 pProEX를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원의 폴리뉴클레오타이드 또는 본원의 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 한 구현예에서, 본원의 미생물은 원핵세포 예를 들면 대장균을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 결빙방지용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 극지해양 규조인 키토세로스 네오그래실 유래의 결빙방지 단백질은 일부 아미노산의 치환을 통한 개량으로, 기존의 단백질과 비교하여 활성이 약 150% 증가하였을 뿐 아니라, 대장균을 이용한 대량생산이 가능하여 산업적, 상업적으로 매우 유용하다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 개량된 결빙방지 단백질(Antifreeze Protein, AFP)을 포함하는 pColdI 벡터의 개열지도이다.
도 2는 키토세로스 네오그래실 유래의 결빙방지 단백질의 3차 구조를 분석도이다.
도 3은 본원에 따른, 키토세로스 네오그래실 유래의 결빙방지 단백질의 염기치환 부위 및 치환된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 본원에 따른 돌연변이가 도입된 개량형 단백질의 세포내 발현을 분석한 결과이다.
도 5는 키토세로스 네오그래실 유래 AFP 및 본원에 따른 개량형 단백질의 얼음 결합 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 키토세로스 네오그래실 유래 AFP 및 본원에 따른 개량형 단백질의 열적이력 활성을 측정한 결과이다.

본원은 결빙방지 단백질의 효소활성 부위 아미노산의 치환을 통해 특정 아미노산을 다른 잔기로 치환한 결과 야생형과 비교하여 그 활성이 월등이 증가하였다는 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 키토세로스 네오그래실 유래의 서열번호 1의 서열을 갖는 결빙방지 단백질에서 143번째 아미노산인 글라이신이 타이로신 및/또는 트레오닌으로 치환된 서열을 갖는 결빙방지 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.

서열번호 1의 서열은 다음과 같으며, 변이가 유발된 부위는 밑줄로 나타냈다: HRQEKRGGLRRQLDDEPLSAVKLLTAGRFAILTKTGVTTTGPTDLKGDMGTSPITGAAITGFGLITDPSDTTFSTSSLVTGQVFASDYTSPTPNMLTVAVLDMQAAYVDAAGRPDPDYVELGAGNIEGLTLEPGLYKWGTDV G FTNSLTFDGSDTDIWILQIDGDVTAGSGAKVKLINDAKAENIFWQIAGKTDLGTTSHVEGVFLCSTAITFKTGSSMNGAALAQTAVTLDSATIVKESVCDVDVGCVAPN.

본원에서 결빙방지 활성이란 당 기술분야에서 통상적인 의미로 이해되며, 얼음 결정 성장을 억제하는 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 즉 결빙방지 단백질은 얼음에 직접적으로 부착하여 얼음의 성장을 억제하고 용액의 어는점을 낮추어 녹는점과 어는점 사이의 온도 차이를 형성하여 저온에서 단백질의 동결을 방지하며. 이런 어는점 낮춤 현상을 열적이력현상이라 한다. 일 구현예에서는 수용액의 어는점을 낮추는 기능을 한다.

본원에서 폴리펩타이드는 상기 전장 또는 그 활성을 갖는 다양한 길이의 단편을 포함하며, 또한 상기와 같은 변이를 포함하는 한, 상기 변이에 추가하여 서열의 일부가 기타 목적을 위해 인위적으로 변형되거나 또는 자연적으로 발견되는 변이를 포함하는 것이다. 이러한 변이는 핵산(염기서열) 및/또는 아미노산 수준에서의 변이를 포함하며, 핵산 서열의 변이는 상응하는 아미노산의 변형을 수반하거나 하지 않을 수 있으며, 아미노산의 변형을 수반하는 경우에는 이러한 변형이 유발된 유전자는 이에 의해 코딩되는 단백질에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 암호화하는 것으로, 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함하는 것이다.

폴리뉴클레오타이드 서열의 경우, 변이가 아미노산의 변형을 수반하지 않는 경우는 예를 들어 축중변이가 있고, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 서열에 포함된다. 또한 본원에 따른 결빙 방지 단백질을 적절한 숙주에서 발현시키기 위해, 숙주의 종류에 따른 아미노산 코돈 선호도에 따른 염기서열의 변이가 있을 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이는 하기 서열번호 2의 서열을 가지며, 이로 제한하는 것은 아니다. 야생형 서열과 비교하여 변이된 부분인 타이로신을 코딩하는 부분은 밑줄로 표시하였다.

서열번호 2의 서열은 다음과 같으며, 변이 부위는 밑줄로 나타냈다:

CACCGTCAGGAGAAACGTGGAGGTCTTAGGCGTCAGCTCGATGACGAACCACTATCTGCTGTCAAGCTACTCACAGCAGGAAGGTTTGCCATTTTGACAAAAACTGGTGTGACGACCACCGGTCCAACAGATCTGAAAGGTGATATGGGCACGAGTCCTATCACAGGCGCGGCCATCACGGGATTTGGTTTGATTACGGATCCCAGCGATACCACTTTCTCCACATCCTCCCTTGTGACAGGACAGGTATTCGCATCAGACTACACATCCCCCACACCCAATATGCTAACTGTAGCAGTCCTCGACATGCAGGCCGCATATGTTGATGCTGCAGGCCGCCCTGACCCCGACTACGTTGAGCTTGGTGCTGGAAACATTGAGGGCCTCACTCTTGAACCTGGCCTATACAAGTGGGGGACTGATGTC TA CTTCACCAACAGTCTCACCTTCGATGGTTCTGACACTGATATTTGGATCTTGCAGATCGATGGGGATGTCACAGCAGGAAGCGGTGCAAAAGTCAAACTCATTAACGATGCCAAGGCTGAGAACATCTTTTGGCAGATTGCGGGCAAGACTGATCTAGGCACCACGTCCCATGTTGAGGGTGTGTTCCTCTGTAGCACAGCAATCACTTTCAAAACTGGAAGCAGCATGAATGGTGCTGCACTAGCACAGACAGCAGTCACGTTGGATTCCGCTACGATCGTGAAGGAGTCCGTATGCGATGTGGATGTTGGGTGTGTGGCACCAAACTAA

본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 두 개 이상의 아미노산의 중합체로단백질과 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 플라즈미드에 관한 것이다. 본원에 따른 벡터는 다양한 목적 예를 들면 숙주세포에서의 단백질 발현 등의 목적으로 사용되며, 상기 목적을 포함하여 다양한 목적에 부합하는 벡터가 본원에 사용될 수 있다. 벡터는 숙주의 게놈과 독립적으로 존재하며 복제가능한 약 2000 내지 10,000 bp(base pair)의 DNA로 복제원점, 프로모터를 포함하는 전사조절부위 또는 전사단위체 항생제 내성 유전자 및 클로닝에 적합한 제한효소 부위를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일구현예에서 본원의 벡터의 전사 단위체는 유전자 전사의 조절/촉진에 관여하는 프로모터를 포함하는 조절부위 및 단백질 코딩부위를 포함한다. 다른 구현예에서 본원의 벡터는 단백질 분리정제에 필요한 추가의 아미노산 서열, 예를 들면 Histidine Tag 또는 Glutathione S-Transferase를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 발현 벡터에 포함된 결빙방지 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 ‘작동가능하게 연결된’은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 인듀서)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본원의 발현 벡터에 이용 가능한 프로모터는 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 미생물, 특히 원핵세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 예를 들면 Cold shock 프로모터, T7 프로모터, Trc 프로모터와 같은 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용될 수 있는 벡터의 예로는 pColdI, pET28a(Novagen, USA), pET series, pGEX series (GE Healthcare Life Sciences, USA)), pQE series (Qiagen, USA), pDEST series (Invitrogen, USA), pCOLD series (Takara Bio, Janpan)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현예에서 벡터는 도 1의 개열지도로 표시되는 플라즈미드이다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다. 미생물은 특히 원핵세포로, 예를 들면 대장균을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 형질전환에 사용될 수 있는 미생물은 재조합단백질, 특히 제한효소의 발현에 적합한 유전자 변이/변형을 포함할 수 있으며, 이러한 변이/변형을 포함하는 다양한 미생물이 본원에 사용될 수 있다. 대장균의 경우 상기 유전자 변이는 예를 들면 프로테아제 유전자, 예컨대 lon 및 ompT가 결핍되어 있거나, T7 폴리머라제를 발현하도록 유전자를 추가로 포함하거나, 유전자의 전사조절에 필요한 벡터 예컨대 pLysS 벡터 (T7 RNA 폴리머라제의 억제제인 T7 라이소자임을 코딩)를 추가로 포함한 것을 들 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 대장균은 Novagen사 (USA)에서 입수가능한 BL21(DE3)/pLysS (F?, ompT, hsdS_B (r_B-, m_B-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cm^r) (Novagen), Rosetta(DE3)/pLysS, Rosetta2(DE3)/pLysS, StratagenArcticExpress(DE3), Overexpress 사 (France)에서 입수가능한 C41(DE3), C43(DE3)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한구현예에서, 대장균은 BL21(DE3)이다.

본원에 따른 벡터는 미생물에 공지된 다양한 형질전환 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 다양한 형질전환 방법이 공지되어 있으며, 예를 들면 열 및 CaCl₂를 이용한 방법, 전기천공법, 샷건 등의 방법을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 아미노산의 치환된 AFP 구축

1-1 벡터 구축

기존 C. neogracile AFP mature 유전자 (특허출원번호 제 2008-0060392)를 주형으로 KpnI 제한효소 부위가 포함된 정방향 프라이머와 HindIII 제한효소 부위가 포함된 역방향 프라이머 (표 1의 서열참조) 및 Eplis 사의 5X Pfu master premix를 사용하여 유전자를 증폭하였다. 이렇게 증폭된 유전자를 KpnI 과 HindIII 를 이용하여 5’ 말단과 3’ 말단을 절단하였다. 이와 동시에 pColdI 벡터 (Takara, Japan)를 같은 효소로 절한 후, 이렇게 절단된 유전자와 벡터를 DNA 라이게이즈를 이용하여 접합하였다. 이어 접합된 유전자와 벡터를 대량생산 대장균주인 BL21 pLysS에 형질전환하였다.

1-2 Directed evolution 기법을 이용한 단백질 개량

상기 1-1에서 구축된 벡터를 표 1 에 나타난 프라이머들을 이용하여 기존의 결빙방지 단백질 서열을 염기치환 하였다.

치환된 부위 및 아미노산의 잔기의 위치 및 종류는 도 2 및 3과 같다. 사용한 PCR 조건은 다음과 같다. 95℃ 4 분; 95℃ 30 초, 55℃ 1 분, 72℃ 5 분, 16회 반복; 72℃ 15 분. 상기 구축된 벡터를 대량생산 균주인 BL21 pLysS 에 형질전환 하였다.

구체적으로 1-1에서 구축한 벡터를 주형으로 이용하여 표 1 에 나타난 프라이머(#3-#16)를 이용하여 7개의 염기치환된 유전자를 포함하는 pColdI 벡터를 구축하였다. 단백질 구조 예측 프로그램을 통해 C. neogracile 결빙방지 단백질의 3차 구조는 도 2에 나타나 있다 (Lee JH, Park AK, Do H, Park KS, Moh SH,Cji YM, Kim HJ (2012) Structural Basis for Antifreeze Activity of Ice-binding Protein from Arctic Yeast, Protein database number: 3UYU) 이는 구조를 기반으로 Phyre2 program 과 Modeller (v 9.9) program을 이용하여 단백질 구조를 예측 분석한 것이다. 결빙방지 단백질은 삼각형 모양의 정단면을 가지고 각면이 β-시트로 이루어져 있으며 그 중 a면이 α-helix 로 덮혀있다. 이 단백질의 활성 부위는 b면이며 이 부위에서 염기치환법을 이용하여 단백질 개량을 수행하였다. 염기 치환된 부위는 도 3에 나타나 있다. PM1, PM2, PM4, PM6, PM7 은 트레오닌 (Threonine)을 타이로신 (Tyrosin) 으로 치환하였고 PM3 은 글라이신 (Glycine)을 타이로신으로 PM5 는 아스파르트산(Aspartic acid)을 타이로신으로 치환 하였다.

[표 1]

실시예 2 단백질 발현 및 정제

실시예 1에서 제작된 야생형 및 돌연변이 AFP를 포함하는 형질전환 대장균 (BL 21(DE3))을 100μg/ml 농도의 암피실린(ampicillin)이 들어 있는 3ml의 LB 배지에 넣고 37℃에서 150rpm으로 배양하였다. 약 16시간 배양한 후 100μg/ml 농도의 암피실린이 들어 있는 50ml의 LB 배지에 옮겨서 O.D₆₀₀ 값이 0.5~0.6 이 될 때까지 배양하였다. 이후 15 ℃ 에서 약 30분간 방치한 후 IPTG를 최종농도 1mM로 첨가하여 15 ℃에서 약 24시간 동안 배양하였다. 이어, 원심분리를 통해 세포를 수확하고 상층액을 제거하였다. 수집된 세포를 -20℃에서 약 16시간 보관 냉동한 후, 세포에 5ml의 용해 완충액(lysis buffer)(50mM Tris-HCl, pH 9.0)를 넣고 볼텍스로 현탁하였다. 이후 소니케이터(sonicater)로 5초 초음파 주파/ 10초 얼음 냉각을 5분 동안 반복적으로 수행한 후 원심분리를 이용하여 상층액을 수거하였다. 이후 모여진 세포 덩어리들에 다시 완충용액을 1.5 ml 첨가후 초음파를 3초 주파/ 5초 ice cooling 을 2분 동안 반복 수행한 후, 원심분리기를 이용하여 상층액을 수집하여, SDS-PAGE 젤에 로딩하여 단백질 과발현여부를 확인하였다. 결과는 도 4에 있으며, 대장균에서의 우수한 발현 양상을 나타낸다.

이어 각 단백질의 과발현을 확인한 후 상등액 4ml당 1ml의 50% Ni-NTA(Qiagen, Germany) 를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 교반기로 잘 혼합하였다. 이후 컬럼에 상기 혼합물을 로딩하여 목적 단백질이 Ni-NTA에 결합하도록 하였다. 이어 세척 완충액(wash buffer)(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH 8.0) 4ml로 컬럼을 두 번 세척한 후 용리 완충액(elution buffer)(50mM NaH2PO4, 200mM NaCl, 250mM imidazole, pH 8.0) 0.2ml씩을 7회 추가하여 단백질을 수득하였다. 성숙한 결빙 방지 단백질은 252 아미노산 길이와 27 kDa의 분자량을 갖는다.

실시예 3 얼음 결합 및 열적 이력 활성도 측정

상기 실시예 1에서 제작된 개량형 단백질들과 야생형 단백질들을 이용하여 결빙방지 활성의 척도가 되는 열적이력현상 및 얼음 결합 활성을 나노리터 삼투압계(Osmometer, Otago osmometers, New Zealand)를 이용하여 공지의 방법대로 측정하였다(kobashigawa et al. 2005, A part of ice nucleation protein exhibits the ice-binding ability. FEBS. 579, 1493-1497; Bravo and Griffith 2005, Characterization of antifreeze activity in Antarctic plants. J. Experiment. Bot. 56 (414), 1189-1196).

또한 활성을 측정하는 방법 중 하나로 성장하는 얼음 표면의 형태를 공지된 방법대로 측정하였다 (Raymond et al. 1989, Inhibition of growth of nonbasal planes in ice by fish antifreezes. PNAS. 86, 881-885; Raymond and Fristsen 2001, Semipurification and ice recrystallization inhibition activity of ice-active substances associated with Antarctic photosynthetic organisms. Cryobiology. 43, 63-70).

결과는 도 5 및 6에 기재되어 있다.

도 5는 결빙방지 활성의 하나로 알려진 얼음 결정의 형태를 변화시키는 현상을 보여주는 것으로, 대조군으로 사용한 Bovine serum albumin (BSA) 는 얼음 결합 활성이 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 대조군의 경우 얼음 결정은 각이 없고 둥그렇게 자란다. 반면 결빙방지 단백질이 존재할 경우 얼음 결정이 둥근 모양이 아닌 각을 지닌 모양으로 성장하게 된다. 기존의 결빙 방지 단백질의 경우 0.5 mg/ml 의 농도까지 육각형의 얼음결정 모양을 나타내고 그 이후에는 폭발형 결정을 나타낸다. 농도가 높아질수록 얼음 결정이 보다 얇고 가는 모양의 가지가 생성됨을 알 수 있다. 폭발형 결정은 얼음 결합 활성이 높다는 것을 의미한다고 알려져 있다 (Scotter AJ, et al. (2006) The basis for hyperactivity of antifreeze proteins). 동일한 농도 조건에서 모든 개량형 단백질의 활성을 측정한 결과 PM 1, 2, 5, 6 번은 야생형 단백질 보다 활성이 급격히 저하됨을 알 수 있었다. 이 단백질들은 농도가 높아지는 조건에서도 얼음 결정이 육각형을 나타내며 0.5 mg/ml 의 저농도에서는 육각형보다 활성이 낮다고 알려진 별모양 형태를 보인다. PM 4의 경우 야생형과 비슷한 얼음 결합 활성을 보인다. 반면, PM3 의 개량형 단백질의 경우 0.5 mg/ml 의 저농도에서부터 폭발형의 얼음결정을 나타내며 농도가 높아질수록 매우 날카롭고 얇은 가지모양의 폭발형 형태의 얼음결정을 나타내었다. 이는 PM3 개량형 단백질이 기존의 야생형 단백질보다 높은 활성을 지닌다는 것을 의미한다.

이를 확인하기 위해 정량적으로 활성을 측정할 수 있는 열적이력 활성(Thermal hysteresis activity, TH)을 측정하였다. 열적이력 활성을 얼음 결합 활성 측정과 마찬가지로 나노리터-오스모미터 기기를 사용하였다 (Otago nanolitre-osmometer). 재조합 단백질의 결빙방지 활성을 측정하기 위하여 광학현미경에 결합된 나노리터-오스모미터 기기를 사용하였다(Otago nanolitre-osmometer).

상기 장비는 시료의 온도를 즉각적으로 조절할 수 있는 기기로서 시료의 녹는 점 및 어는 점, 그리고 열적이력현상(Thermal hysteresis, TH)의 측정이 가능한 장비로, 시료를 시료 챔버에 0.1-0.5 μl 넣고 시료 챔버의 온도를 -20℃로 강하시켜 시료를 냉동하였다. 이어 5분간 시료의 냉동상 태를 유지한 후 약 -5℃까지 온도를 올려준다. 이후 단일 얼음결정이 생성될 때까지 시료 챔버의 온도를 상승시켰다. 이어 얼음결정의 상(phase)이 정지된 온도(녹는 점, Tm)에서 0.05℃/분의 속도로 온도를 하강시키면서 단일 얼음결정의 상 변화를 광학 현미경으로 관찰한다. 온도 하강 시 단일 얼음결정이 성장하기 시작하는 온도(어는 점, freezing temperature)를 측정하였다. 녹는 점과 어는 점의 온도의 차이가 발생하게 되는 현상이 열적 이력현상 (Thermal hysteresis)으로서, 녹는 점과 어는 점의 온도차이로 나타냈다.

결과는 도 6에 있으며, 이에 나타난 바와 같이 PM3 번과 PM4 번을 제외한 나머지 개량형 단백질의 열적이력 활성은 야생형 단백질 보다 90% 가까이 감소하였다. PM4의 경우 야생형 보다 약 30% 정도 활성이 감소하였다. 반면, PM3 단백질의 경우 10mg/ml 의 농도에서 야생형의 활성보다 약 150% 증가하였다.

정리하면, 본원에서는 발명은 키토세로스 네오그래실 유래의 결빙방지 단백질 코돈을 치환한 결과 이미 보고된 PM3 개량형 단백질의 경우 얼음결합 활성 및 결빙방지 단백질의 정량적 활성이 가능한 열적이력활성을 측정한 결과 10mg/ml 의 농도에서 기존 결빙방지 단백질 활성보다 약 1.5배 이상의 활성을 보였으며 얼음 결합 활성 또한 매우 높게 나타났다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Antifreeze protein with mutation and its use <130> DP201303003P <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Chaetoceros neogracile <220> <221> VARIANT <222> (143) <223> Gly to Thr or Tyr <400> 1 His Arg Gln Glu Lys Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gln Leu Asp Asp Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Ala Val Lys Leu Leu Thr Ala Gly Arg Phe Ala Ile Leu 20 25 30 Thr Lys Thr Gly Val Thr Thr Thr Gly Pro Thr Asp Leu Lys Gly Asp 35 40 45 Met Gly Thr Ser Pro Ile Thr Gly Ala Ala Ile Thr Gly Phe Gly Leu 50 55 60 Ile Thr Asp Pro Ser Asp Thr Thr Phe Ser Thr Ser Ser Leu Val Thr 65 70 75 80 Gly Gln Val Phe Ala Ser Asp Tyr Thr Ser Pro Thr Pro Asn Met Leu 85 90 95 Thr Val Ala Val Leu Asp Met Gln Ala Ala Tyr Val Asp Ala Ala Gly 100 105 110 Arg Pro Asp Pro Asp Tyr Val Glu Leu Gly Ala Gly Asn Ile Glu Gly 115 120 125 Leu Thr Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Gly Thr Asp Val Gly Phe 130 135 140 Thr Asn Ser Leu Thr Phe Asp Gly Ser Asp Thr Asp Ile Trp Ile Leu 145 150 155 160 Gln Ile Asp Gly Asp Val Thr Ala Gly Ser Gly Ala Lys Val Lys Leu 165 170 175 Ile Asn Asp Ala Lys Ala Glu Asn Ile Phe Trp Gln Ile Ala Gly Lys 180 185 190 Thr Asp Leu Gly Thr Thr Ser His Val Glu Gly Val Phe Leu Cys Ser 195 200 205 Thr Ala Ile Thr Phe Lys Thr Gly Ser Ser Met Asn Gly Ala Ala Leu 210 215 220 Ala Gln Thr Ala Val Thr Leu Asp Ser Ala Thr Ile Val Lys Glu Ser 225 230 235 240 Val Cys Asp Val Asp Val Gly Cys Val Ala Pro Asn 245 250 <210> 2 <211> 759 <212> DNA <213> Chaetoceros neogracile <400> 2 caccgtcagg agaaacgtgg aggtcttagg cgtcagctcg atgacgaacc actatctgct 60 gtcaagctac tcacagcagg aaggtttgcc attttgacaa aaactggtgt gacgaccacc 120 ggtccaacag atctgaaagg tgatatgggc acgagtccta tcacaggcgc ggccatcacg 180 ggatttggtt tgattacgga tcccagcgat accactttct ccacatcctc ccttgtgaca 240 ggacaggtat tcgcatcaga ctacacatcc cccacaccca atatgctaac tgtagcagtc 300 ctcgacatgc aggccgcata tgttgatgct gcaggccgcc ctgaccccga ctacgttgag 360 cttggtgctg gaaacattga gggcctcact cttgaacctg gcctatacaa gtgggggact 420 gatgtctact tcaccaacag tctcaccttc gatggttctg acactgatat ttggatcttg 480 cagatcgatg gggatgtcac agcaggaagc ggtgcaaaag tcaaactcat taacgatgcc 540 aaggctgaga acatcttttg gcagattgcg ggcaagactg atctaggcac cacgtcccat 600 gttgagggtg tgttcctctg tagcacagca atcactttca aaactggaag cagcatgaat 660 ggtgctgcac tagcacagac agcagtcacg ttggattccg ctacgatcgt gaaggagtcc 720 gtatgcgatg tggatgttgg gtgtgtggca ccaaactaa 759

Claims

서열번호 1의 서열을 기준으로 143번째 글라이신이 타이로신 또는 트레오닌으로 치환된 서열을 갖는 결빙방지 단백질.
제 1 항에 따른 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 수용액 중의 어는점을 낮추는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
제 2 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 서열을 갖는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
제 4 항의 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
제 5 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 원핵세포 발현용 벡터인, 재조합 벡터.
제 6 항에 있어서, 상기 벡터는 pET28a, pET 시리즈, pGEX 시리즈, pQE 시리즈, pDEST 시리즈, pCOLD 시리즈, pColdI, 또는 pProEX 인 재조합 벡터.
제 2 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제 5 항의 벡터로 형질전환된 미생물.
제 8 항에 있어서, 상기 미생물은 원핵생물인, 미생물.
제 9 항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 미생물.
제 1 항에 따른 하나 이상의 단백질를 포함하는 결빙방지용 조성물.