KR100978758B1 - 키토세로스 네오그래실 유래 얼음-결합 단백질 유전자, 그유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 그 유전자로 암호화된단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터, 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 얼음-결합 단백질에 관한 것이다.

본 발명에 의한 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하는 경우, 미생물을 이용하여 얼음-결합 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있으며, 진핵 생물에서 발현되는 얼음-결합 단백질과 달리 당화 과정이 없어도 충분한 활성을 나타내어 대량 생산에 유용하다.

키토세로스 네오그래실, 얼음-결합 단백질, 결빙방지 단백질, 규조류, 열적이력현상

Description

키토세로스 네오그래실 유래 얼음-결합 단백질 유전자, 그 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 그 유전자로 암호화된 단백질{Ice-binding protein gene derived from Chaetoceros neogracile, recombinant vector comprising the gene, and protein encoded by the gene}

본 발명은 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로부터 유래한 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터, 및 상기 유전자로 암호화된 단백질에 관한 것이다.

지구의 70%이상을 차지하는 물은 어는점에 가깝거나 더 낮은 온도로 유지되는 극한 생태계로 이루어져 있다. 극한 서식지에는 심해, 고산지대, 극지 환경이 포함된다. 그 중 극지 환경에서의 주된 스트레스로는 불변하는 낮고 어는점에 가까운 온도, 빙하의 물리적 방해, 정기적인 극한의 계절 등을 들 수 있다.

극지 환경에 사는 생물들은 저온에 적응하기 위한 여러 가지 생존 방법을 보유하고 있으며, 진화적으로 이러한 생존 메카니즘을 발전시켜 나가고 있다. 새와 같은 고등한 동물부터 박테리아까지 극지에 사는 모든 생물은 저온에 대한 보호 기작을 가지고 있으며 이로 인해 극한의 환경에서도 살아갈 수 있는 것이다.

저온 적응 기작에는 매우 여러 가지가 존재한다. 그 중 해수 및 담수에 사는 많은 미세 조류 또는 박테리아는 세포 외 기질을 분비하고 세포 주변의 염농도를 높임으로써 세포 주변의 어는점을 내리며, 이러한 방법은 세포 주위의 어는점을 낮추어 세포의 결빙을 방지해주는 방법이다. 그 이외에도 얼음 결정에 직접 붙어서 얼음 결정이 커지는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 알려진 특별한 단백질을 세포 외로 분비하는 기작이 알려져 있다. 특히 극지 규조류에서 분비되는 단백질에서 얼음 표면에 부착하여 얼음 결정이 자랄 때 표면에 구멍을 만들거나 얼음 결정의 형태를 변화시키는 특징(Buckley 1951 Buckley, H. E. 1951. Crystal Growth. Wiley, New York, 319 pp.)이 관찰된 후 얼음 결합(ice-binding activity) 효과를 나타내는 단백질의 특성이 연구되어 왔다. 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein(IBP))은 이후 어류, 곤충, 식물, 곰팡이, 미생물 등에서도 발견되었으며, 결빙방지(anti-freeze)효과 및 재결정(ice recrystallization) 저해 능력을 가지거나, 빙핵 단백질(ice nucleators)로 기능할 수 있다(Janech MG., A. Krell , T. Mock , J-S. Kang and JA. Raymond. 2006. Ice-binding proteins from sea ice diatom(Bacillariophyceae). J. Phycol. 42, 410-416).

몇몇 어류에서 유래된 결빙방지 단백질(anti-freezing protein, AFP)의 경우 역시 세포 외로 분비되는 단백질이며, 단백질 합성 후 변형(post-translational modification) 과정인 당화(glycosylation)가 필요하다고 알려져 있다(Raymond et al. 2007). 이와 같은 단백질은 세포막 사이의 이온 농도를 유지시켜 (Negulescu et al. 1992, Fish Antifreeze proteins block Ca entry into rabbit parietal cells. Am J Physiol 263, C1310-C1313), 저온에서 생물의 생존력을 높여준다(Rubinsky et al. 1991, Hypothermic protection - a fundamental property of "antifreeze" proteins. Biochem Biophys Res Commun 180, 566-571).

결빙방지 단백질은 얼음의 결정에 결합하여 얼음 결정의 성장을 억제하는데 그 결과로 물의 어는점을 낮추어 빙해(freezing injury)를 막아준다(Duman et al. 1993, Duman, J.A., and Olsen, T.M. Thermal hysteresis protein activity in bacteria, fungi and phylogenetically diverse plants. Cryobiology, 30: 322-328.). 나아가, 결빙방지 단백질의 작용으로 빙점과 융점의 차이를 발생하는 현상인 열적이력 현상(Thermal hysteresis)을 나타내며, 상기 열적이력 현상은 나노리터 오스모미터(nanolitre osmometer)로 쉽게 측정할 수 있다. 얼음 표면에 결합된 결빙방지 단백질은 열역학적으로 유리한 얼음의 성장을 방해하게 된다. 현재까지 남극 규조류에서 알려진 얼음-결합 단백질(ice-binding protein, IBP) 중 결빙방 지(anti-freeze) 기능을 확실하게 보여주는 연구, 및 특히 열적이력 현상의 기능을 측정해 보고한 연구는 없다.

위와 같이 얼음 형성을 방지하는 단백질과 관련된 유전자는 인간에게 매우 유용하게 이용될 수 있다. 예를 들어, 어류에서 추출한 결빙 방지 단백질을 식물에 형질전환시켰을 경우 식물체가 추위와 냉해에 저항성을 지닌다는 연구는 오래전에 밝혀졌다(Davies, 1987, Antifreeze proteins: prospects for transferring freeze resistance. New biotechnol. 1, 1057-1063; Cutler, 1989, Winter flounder antifreeze proteins improves the cold hardiness of plant tissue. J. Plant Physiol. 135, 351-354). 그리고 이러한 결빙방지 단백질의 당화(glycoprotein)는 얼음의 결정 형성을 유도하는 단백질의 형성을 억제하여 냉해에 의한 식물의 피해를 미연에 방지할 수 있다(Parody-Morreale et al. 1988, Inhibition of bacterial ice nucleators by fish antifreeze glycoproteins. Nature 333, 782-783). 또한 난자와 적혈구, 토끼 간 등의 냉동 보존에 사용될 수 있으며(Rubinsky et al. 1991; Carpenter & Hansen, 1992, Antifreeze protein modulates cell survival during cryopreservation: mediation through influence on ice crystal growth. Proc Natl Acad Sci U.S.A 89, 8953-8957; Lee et al. 1992, Hypothermic preservation of whole mammalian organs with "antifreeze" proteins. Cryo-Letters 13, 59-66), 냉동 수술 시 선택적인 세포 파괴를 용이하게 하는 화학적 보조제로 이용될 수 있다(Koushafer et al. 1997, Chemical adjuvant cryosurgery with antifreeze proteins. J Surg Oncol 66, 114-121). 그 외에도 식품의 보존, 보다 효과적인 저온 발효 등의 매우 다양한 분야(Margesin et al. 2007, Cold-loving microbes, plant, and animals-fundamental and applied aspects. Naturwissenschaften 94, 77-99)에서 적용 및 응용이 가능하며, 그 발전 가능성과 응용 가능성은 무한하다.

한편, 호냉성 미생물 중 남극 규조류인 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)은 극지의 중요한 플랑크톤으로 극지 미세조류의 주된 생물량 생산자 중 하나이다. 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)은 저온에 적응하기 위해 얼음-결합 단백질(IBP) 유전자를 가지며 이 유전자의 발현 산물인 얼음-결합 단백질을 세포 외로 분비하여 저온 적응에 이용하는 것으로 알려져 있다. 극지 규조류의 얼음-결합 단백질 유전자는 온대성 규조류의 유전체에서는 발견이 되지 않는 독특한 유전자로서 이러한 유전자 산물을 활용하기 위해 상기 규조류를 대량 배양하여 다량의 얼음-결합 단백질을 확보하는 것은 매우 경제성이 낮은 방법으로 생각되고 있다. 또한, 규조류를 냉장 조건에서 배양하고 분비된 얼음-결합 단백질을 회수하는 방법 역시 고비용이 요구되는 실정이다.

또한, 대한민국 등록 특허 제 0543063호의 경우 유전자를 식물체에 형질 전환 시켜 식물로부터 유용 단백질을 발현 및 분리 정제하는 것으로서, 그 밖의 많은 연구들이 실제 생물체에서 분비되는 단백질에 대한 활성 실험을 수행하였으나 실제 로 진핵 생물에서 발현되는 얼음-결합 단백질은 당화 과정을 필요로 하는 단점이 있다. 따라서 이러한 단백질을 대장균 등에서 대량으로 발현시키고, 상기 단백질을 그대로 응용할 수 있는 방법이 요구된다.

이에 본 발명의 한 측면은, 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하며 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로부터 유래한 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하며, 성숙 단백질(mature IBP)을 코딩하는 서열번호 1 또는 성숙-전 단백질(pre-mature IBP)을 코딩하는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터가 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 유전자로 암호화되며 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 성숙 단백질(mature IBP) 또는 서열번호 4(pre-mature IBP)의 아미노산 서열을 갖는 성숙-전 단백질(pre-mature IBP)이 제공된다.

본 발명은 극지 규조류 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 얼음-결합 단백질 유전자를 분리한 후 대장균을 이용하여 발현시켜 대량생산을 가능하게 한다. 특히, 진핵 생물에서 발현되는 얼음-결합 단백질이 당화 과정을 필요로 하는 것과 달리 본 발명에 의한 얼음-결합 단백질을 대장균 등을 통해 발현시키는 경우에는 단백질 합성 후 변형(post-translational modification) 과정을 거치지 않아도 충분한 활성을 나타냄으로써, 대량 발현 및 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 극지에서 서식하는 규조류인 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)이 저온에 적응하기 위해 발현하는 얼음-결합 단백질(ice-binding protein, IBP) 유전자의 서열을 밝힘으로써, 이러한 얼음결합 단백질 유전자를 재조합 단백질로서 대장균에서 대량 발현시켜 경제적으로 활성이 향상된 단백질의 제조를 가능하게 하는 것이다.

본 발명에 의하면, 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하며, 서 열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 유전자가 제공되며, 본 발명에서 사용된 극지 규조류는 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로 한국 해양 연구원 부설 극지 연구소(Korea Ocean Polar Research Institute, KOPRI)로부터 분양받았다. 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)에서 mRNA 를 추출하여 cDNA 라이브러리를 제조하였고 cDNA 의 일부 염기서열을 분석하여 완성된 EST를 NCBI(National Center for Biotechnology Information) EST database에 accession 번호(EL620615-EL622495)로 등록하였다.

키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 얼음-결합 단백질을 코딩하는 유전자의 획득을 위해, 먼저cDNA 라이브러리를 제조하였고 상기에서 제조된 cDNA는 피블루스크립트(pBluescript) 벡터에 유지, 보관하였다. 상기에서 획득한 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 cDNA를 시퀀싱(sequencing)하여 얼음-결합 단백질의 ORF(open reading frame) 부분의 염기서열을 확보하였으며, 이 서열의 길이는 849 bp로 측정되었으며, 서열 번호 2의 염기 서열을 갖는다. 상기 서열 중 5' 말단으로부터 90 bp의 염기 서열은 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열로 확인되었으며, 이 부분을 제외한 성숙 단백질 부분의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열을 갖는다.

서던 블롯(Southern Blot) 분석을 통해 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)에는 얼음-결합 단백질이 다 유전자 패밀리(multi gene family)로 존재 한다는 것을 알 수 있었으며, 이를 도 5에서 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 얼음-결합 단백질의 ORF 유전자를 단백질 발현 벡터에 삽입하기 위하여 표 2에 나타난 3가지의 프라이머를 제조하였다. 성숙-전(pre-mature) 얼음-결함 단백질(IBP) 및 성숙(mature) 얼음-결합 단백질(IBP)의 정방향 프라이머(forward primer)의 경우 앞 부분 서열은 개시 코돈을 포함하고 있으며 클로닝을 위한 제한효소로 EcoRI을 이용하기 위해 개시 코돈 바로 앞에 EcoRI 제한효소 자리를 추가하였고, 제한효소 앞 부분에는 이 제한효소의 인식이 안정적일 수 있도록 pProEX 벡터의 EcoRI 자리 앞의 3개 염기를 추가하였다. 성숙-전 및 성숙한 얼음결합 단백질의 역방향 프라이머(reverse primer)는 동일하며 정지 코돈을 포함하고 있다. 이 부분의 5` 말단에는 역시 클로닝을 위해 제한효소인 XhoI 자리를 추가하고 제한효소가 안정적으로 인식되도록 pProEX 벡터의 XhoI 자리 뒤의 3개 염기를 추가하였다. 상기 프라이머 제작 시, 바람직하게는 단백질 발현 벡터에 라이게이션(ligation) 할 수 있도록 앞부분에 EcoRI, 뒷부분에 XhoI 제한효소 자리를 추가하며, 나아가 그 밖의 NcoI, AvaI, StuI, SalI, SpeI, NotI, XbaI, SphI, KpnI, HindIII등 당업계에 일반적으로 사용되는 어떠한 제한효소를 프라이머의 고안에 따라 이용할 수 있다.

성숙-전(pre-mature) 얼음-결합 단백질(IBP)의 경우 시그널 펩타이드(signal peptide) 부분이 존재하는 것을 의미하며, 상기 시그널 펩타이드는 단백질 번역 후 단백질의 분비를 위한 정보를 지니고 분비 후에는 제거되며, 제거된 단백질이 활성을 나타내게 된다. 즉, 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)이 얼음에 노출되는 경우 성숙-전 단백질이 합성되고 그 후 세포 밖으로 분비 될 때에는 시그널 펩타이드 부분이 제거되어야 활성을 보일 것으로 추측할 수 있다. 본 명세서에서 상기 두 가지의 형태를 모두 제조하여 시그널 펩타이드가 존재하는 경우 및 이 부분이 결여된 성숙 얼음-결합 단백질 경우의 활성차이를 비교한 결과, 실제 구덩이(pitting)에 의한 결과, 얼음결정의 변화, 열적이력현상(Thermal hysteresis, TH) 값 모두에서 성숙한 얼음-결합 단백질의 활성이 우수함을 확인할 수 있다.

즉, 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 cDNA는 성숙-전(Pre-mature) 단백질을 코딩하고 있으며, 성숙 단백질을 획득하기 위해 상기와 같이 시그널 펩타이드 부분을 제외하고 바로 다음에 위치하는 유전자 서열 부분에서 프라이머를 제작하여 활성이 높은 성숙 얼음-결합 단백질을 제조할 수 있었다.

본 발명에 따라 제공되는 유전자를 다양한 숙주세포에 도입하기 위해 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 어떠한 벡터가 이용될 수 있으며, 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드 벡터는 필수적인 구성 요소로서 벡터의 복제를 위한 ori 부분, 항생제 저항성 부분, 멀티플 클로닝 사이트, 및 유전자 작동을 위한 프로모터 부분을 포함하며, 나아가 단백질 발현 벡터의 경우 발현 후의 정제를 위해 His- taq 혹은 T7-tag과 같이 단백질 정제 시 컬럼과 상호작용하는 부분 및 목적 유전자를 발현시키기 위한 lac 오페론 위치를 포함하여야 한다. 예를 들어 도 2에 나타난 바와 같은 pProEX HTa 벡터가 이용될 수 있다. pProEX HTa 는 단백질 발현 벡터로서 ori 사이트, 암피실린 저항성 사이트, 및 멀티플 클로닝 사이트를 포함하며, 상기 멀티플 클로닝 사이트 앞 부분에는 정제 시 이용되는 6XHis-Tag 부분을 포함한다. 또한 Trc 프로모터가 존재하여 목적 유전자의 전사를 개시한다. 도3은 pProEX HTa 벡터의 멀티플 클로닝 사이트(multiple cloning site) 에 삽입 위치를 나타내며, 도 4는 극지 규조류의 얼음-결합 단백질이 삽입된 EcoR1 및 Xhol 클로닝 위치가 표시된 벡터의 구조를 나타낸다.

보다 상세하게, 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얼음-결합 단백질 유전자의 ORF 부분을 증폭시킨 후, 증폭된 DNA와 벡터를 제한효소인 EcoRI 과 XhoI등의 제한효소를 이용하여 절단한 후 리가아제(ligase)를 이용하여 라이게이션 한다. 다만, 상기 제한 효소에 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 사용되는 어떠한 제한 효소를 사용할 수 있다. 즉, 도 4에 나타난 pProEX HTa 벡터와 같이 클로닝 부위를 EcoRI과 XhoI와 같은 제한 효소를 이용하여 절단한 후 성숙-전(pre-mature form) 또는 성숙한 얼음-결합 단백질 유전자와 결합시켜 재조합 벡터를 제작할 수 있다.

상기 재조합 벡터로 미생물을 형질전환 할 수 있으며, 상기 미생물은 바람직 하게는 대장균이다. 보다 바람직하게, 대장균(E. coli )BL21 균주에 형질전환(transformation) 할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 cDNA 라이브러리(library)에서 확인된 유전자를 유전자 재조합 과정을 통하여 대장균(E.coli)에서 발현시킨 재조합 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)이 제공되며, 상기에서 획득한 얼음-결합 단백질은 282 아미노산 길이와 31kDa의 분자량을 갖고 있으며, 서열번호 4의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다. Signal P3.0 프로그램으로 스캔한 결과 상기 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 30 개의 아미노산 서열은 시그널 펩타이드 부분에 해당되는 것을 확인할 수 있으며(도 10a 및 도 10b), 상기 시그널 펩타이드 부분을 제외한 성숙 얼음-결합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다. 시그널 펩타이드를 제외한 성숙한 단백질은 252 아미노산 길이와 약 27kDa 의 분자량을 갖는다.

키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로부터 획득한 얼음-결합 단백질의 ORF 유전자의 아미노산 서열로 진화적 계통수를 그린 결과를 도 1에 나타내었으며, 이는 이미 보고된 남극 규조류인 나비큘라 글라시에(Navicula glaciei)의 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein(IBP))과 는 계통적으로 높은 유사도를 보였다. 상기 나비큘라 글라시에(Navicula glaciei)의 얼음-결합 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진다.

도 11은 얼음-결합 단백질과 유사한 단백질의 아미노산서열 정렬(alignment)을 나타낸 것이다. 얼음-결합 단백질로 알려진 다른 생물의 아미노산 서열과의 유사도를 비교하기 위해 SDSC biology workbench(http://workbench.sdsc.edu.)의 정렬 프로그램을 이용하여 멀티플 정렬(multiple alignment)을 나타내었다. 상기 연구에서 같은 규조류의 얼음-결합 단백질과는 61%, 눈곰팡이(Typhula ishikariensis)의 결빙방지 단백질과는 47%, 이외의 다른 두 종의 극지 박테리아(Colwellia sp., 및 Psychromonas ingrahamii)와는 45-47% 의 상동성(identity)만을 보이고, 이미 알려진 극지어류, 극지곤충, 그리고 결빙 스트레스로 유도된 식물의 결빙방지 단백질의 아미노산 서열을 정렬(align)하였을 때 유의있는 유사도(simility)는 보이지 않았다.

키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 배양액으로 분비한 얼음결합 단백질 및 cDNA 라이브러리(library)에서 확인된 유전자의 재조합 과정을 통하여 대장균(E. coli)에서 발현시켜 정제한 얼음결합 단백질의 활성 강도를 성장하는 얼음표면의 형태 관찰을 통해 측정한 결과가 도 8a, 8b, 8c 및 8d에 나타나 있으며, 대조군(도 8b)의 경우 얼음조각의 표면이 매끄러운 것을 볼 수 있는 반면, 얼음-결합 단백질이 존재하는 완충제에서는 얼음 표면에 구덩이 같은 형태를 나타내는 것을 확인할 수 있으며, 얼음의 주변 부분도 뾰족하게 변하는 것을 볼 수 있다(도 8c 및 8d). 나아가, 성숙-전(pre-mature) 얼음결합 단백질(도 8c) 보다는 성 숙한(mature) 얼음-결합 단백질(도 8d)의 얼음-결합 활성(Ice-binding activity)이 더욱 우수함을 알 수 있으며, 이는 얼음의 표면에 존재하는 구덩이 같은 형태의 정도로 확인할 수 있다. 반면, 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 배양액으로 분비한 얼음결합 단백질의 경우(도 8a) 대조군에 비하면 선명한 구덩이 형태를 가지나 재조합 단백질에 비해서는 활성 강도가 약한 것으로 관찰되었다.

또한, 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)에서 분비되는 얼음결합 단백질이 얼음의 결정 형태를 변화시키는 능력을 측정하였고 그 얼음결정 형태를 사진으로 촬영하였으며(Canon A620), 이를 도 9a 및 9b에 나타내었다. 대장균에서 발현시킨 재조합 얼음결합 단백질에 얼음 결정의 형태를 변화시키는 활성을 대조군 및 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)에서 분비되는 얼음결합 단백질의 활성과 비교하였다. 도 9b에서 대조군(좌측 상단)의 경우 얼음 결정은 각이 없고 둥그렇게 자라는 반면, 얼음-결합 단백질이 존재하는 경우(좌측 하단 및 우측 하단) 얼음 결정 표면에 얼음결합 단백질이 결합하여 각을 형성하는 것을 확인할 수 있다. 단백질을 발현시키지 않은 대장균에서 추출한 단백질의 경우(우측 상단)는 대조군 보다는 불규칙한 원형을 이루지만, 얼음-결합 단백질이 존재하는 경우보다는 형성된 각이 완만한 것을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정 되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 키토세로스 네오그래실( C. neogracile )의 cDNA 라이브러리( library ) 제작

1. 키토세로스 네오그래실( Chaetoceros neogracile )의 배양

본 연구에 사용된 극지 규조류는 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로 한국 해양 연구원 부설 극지 연구소(Korea Ocean Polar Research Institute, KOPRI) 로부터 분양 받았다. 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)은 4℃의 온도 조건과 20μmol photons m^-2s^-1의 광도 조건 하에서 F/2배지와 Kalle’s배지를 1:1로 섞은 배지에서 배양한다.

2. cDNA 라이브러리( library ) 제작

키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 cDNA 라이브러리(library)를 제작하기 위해서 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA는 QIAGEN 사의 RNeasy midi kit을 사용하여 준비하였다. 이후의 모든 RNA 추출 과정은 4℃의 온도가 유지되는 조건에서 진행하였다. 배양한 키토세로스 네오그래실을 50ml 튜브에 분취하고 원심분리를 통하여 세포만을 수집한다. 그리고 세포의 3~4 배 가량의 RNAlater(QIAGEN 사)를 첨가하여 4℃에서 16~18시간 반응시킨다. 이후 RLC 완충제(buffer) 2ml 넣고 잘 섞어준 후 5분간 3,000~ 5,000g 의 속도로 원심분리 한다(RLC 완충제는 상기 키트(kit) 내에 있는 RLT 완충제 1ml및 β-머캅토에탄올10μl의 혼합물). 이후 상등액을 15ml 튜브에 옮긴 후 1.4ml의 100% 에탄올을 첨가해준다. 이렇게 섞인 혼합액을 미디(midi) 컬럼에 넣어준 후 5분간 원심분리 한다. 이후 하등액은 버리고 컬럼에 4ml의 RW1 완충제를 넣어주고 다시 5분간 원심분리 한다. 컬럼의 세척을 위해 RPE 완충제를 2.5 ml 넣어주고 5분간 원심분리 한 후 하등액을 버린다. 다시 한 번 RPE 완충제 2.5 ml을 컬럼에 넣어준 후 5분간 원심분리를 한다. 새로운 15ml 튜브에 컬럼을 결합한 후 컬럼 중앙에 리보핵산 분해 효소가 제거된 물(RNase free water) 를 150μl 넣어주고 RNA가 충분히 녹도록 10분간 방치한다. 이후 원심분리를 통하여 전체 RNA를 수집한다. 이후 1.2 % 포름알데히드 아가로즈 젤에 전기영동 하여 전체 RNA를 확인하였다.

1mg/mL의 RNA를 Poly(A) Track mRNA isolation system(Promega, Madison, WI, U.S.A.)을 사용해 Poly(A)+ mRNA를 만들고, ZAP-cDNA synthesis kit와 ZAP-cDNA Gigapack Ⅲ Gold packaging extract(Stratagene, La Jolla, CA, U.S.A.)를 이용해 cDNA 라이브러리를 만든다. 각 라이브러리의 총 초기 적정농도는 플라그-형성 단위(Plaque-forming unit)당 6.5×10⁶으로 한다. 증폭 후, cDNA 라이브러리의 샘플은 람다(Lambda)에서 서브클론 파지미드 벡터(subclone phagemid vector)로 변환시키기 위해 절단하여 서브클론 삽입(subclone insert)으로 사용되었다. 파지미드 라이 브러리는 암피실린(50mg/L)이 들어간 LB배지에 소량을 도말 한 후 콜로니들을 LB 배지에 키워 플라스미드를 추출한다.

3. 뉴클레오티드 시퀀싱( sequencing )

무작위로 선별한 2,500개의 콜로니에서 플라스미드DNA를 추출한다. 플라스미드 DNA를 GeneClean(Millipore, MA, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열 분석을 전문업체에 의뢰하였다.

4. cDNA 분석과 기능분류

분석된 염기서열을 컴퓨터 프로그램(Lasergene software, DNASTAR, Inc., Madison, WI, U.S.A)을 이용하여 벡터를 제거시킨다. 편집된 EST 염기서열은 정렬 프로그램(Lasergene software, DNASTAR, Inc., Madison, WI, U.S.A)으로 뉴클레오타이드를 비교하여 그룹으로 나눈다. BlastX 검색을 통해 가장 높은 연관성을 보이는 것과 accession 번호의 중복이 없는 것을 선택함으로써 그 염기서열을 확인하는 기준으로 삼았다. E-Value값은 두 염기서열의 유사도를 보여주는 파라미터로, 본 연구에서는 E-Value의 최소값을 10^-4으로 정하여 EST를 밝혀나갔다. 완성된 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) EST database에 accession 번호(EL620615-EL622495)로 등록되어있다.

5. cDNA library 를 이용한 EST 분석

키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 cDNA 라이브러리는 pBluescript의 XhoI과 EcoRI 위치를 이용해 Uni-ZAP 벡터 안에 넣어 제작하였다. cDNA 라이브러리에서 무작위로 2,500개의 클론을 선택하였고, 그 중 XhoI과 EcoRI의 효소 절편을 통해 확인된 1,881개의 클론의 염기서열을 확인하였다.

정렬 프로그램(Alignment program)인 DNA STAR를 이용해 154개의 contig와 1,540개의 singletone으로 이뤄진 1,694개의 중복되지 않는 EST(Expressed sequence taq) 그룹을 얻었다(표1). 각 EST의 서열은 NCBI의 BLAST X 서치의 결과와 대조하여 가장 높은 연관성을 나타내는 것을 선택하였다. E-Value의 최소값을 10^-4으로 정하여 공개 대이타베이스와 유사성을 비교해본 결과, EST 1,694개 중 939개가 데이타베이스에 등록된 유전자와 비슷하다는 것을 발견하였다. 540개의 EST는 알려지지 않은 것으로 나타났으며, 나머지 215개의 EST는 알려진 유전자들과의 유사성을 나타내지 않는 새로운 염기서열로 보였다

표 1. 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 EST

	Contigs의 수	클론의 수
단일(single)	1,540	1,540
그룹(Group)	154	342
총(Total)	1,694	1,881

상기에서 제조된 cDNA는 피블루스크립트(pBluescript) 벡터에 유지, 보관하였다.

<실시 예 2> 클로닝( Cloning )

상기에서 획득한 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 cDNA를 시퀀싱(sequencing) 하여 얼음결합 단백질의 ORF(open reading frame) 부분의 염기서열을 확보하였으며, 이는 서열번호 2의 염기서열로 나타나고 그 서열의 길이는 849 bp로 측정되었다.

1. 프라이머의 제작

먼저 얼음결합 단백질의 ORF 유전자를 단백질 발현 벡터에 삽입하기 위하여 프라이머를 제작하여 이용하였으며, 본 실험에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다. 상기 프라이머는cDNA 서열을 분석하여 얻은 결과를 토대로 바이오닉스 사에 의뢰하여 제작하였으며, 이때 파우더 상태로 입수한 프라이머에 DNA 분해효소가 제거된 물(DNase free water)을 성숙-전 정방향 프라이머(Pre-mature form forward primer)의 경우 191μl, 성숙 정방향 프라이머(mature-form forward primer)의 경우 189μl, 역방향 프라이머(reverse primer)의 경우 206μl 를 넣어준다. 이렇게 되면 100 pmole의 프라이머 원료가 만들어지는데, 이를 10pmole로 희석한 프라이머 1μl을 사용하였다.

표 2. 극지 규조류의 얼음결합 단백질을 대장균에서 발현시키기 위해 제작한 프라이머 서열

명칭	서열
성숙-전 정방향 프라이머 (Pre-form Forward primer)	5`- CCG GAATTC ATGAGTCTTATTACA - 3`
성숙 정방향 프라이머 (Mature-form Forward primer)	5`-CCG GAATTC CTCCGTCAGGAGAAA- 3`
역방향 프라이머(Reverse primer)	5`- TGC CCTGAG TTAGTTTGGTGC- 3`

상기 프라이머 제작 시, 단백질 발현 벡터인 pProEX에 라이게이션(ligation) 할 수 있도록 앞 부분에 EcoRI, 뒷부분에 XhoI 제한효소 자리를 하기와 같이 추가하였다. 상기 프라이머 서열 중 밑줄 친 굵은 글씨체로 표시한 부분의 서열은 제한효소 자리를 나타내며, 즉 정방향 프라이머의 GAATTC 는 EcoRI 자리이며 CCTGAG 는 XhoI 자리이다. 밑줄 친 굵은 글씨체로 표시한 부분 앞의 3개 염기 서열은 제한효소 자리를 안정적으로 인식하기 위해 벡터 서열에 존재하는 염기 서열을 추가한 것이다. 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 성숙-전(Pre-mature) 단백질을 코딩하는 cDNA로부터 성숙 단백질을 획득하기 위해 상기와 같이 시그널 펩타이드 부분을 제외하고 바로 다음에 위치하는 유전자 서열 부분에서 프라이머를 제작하여(성숙 정방향 프라이머) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 활성이 높은 성숙 얼음-결합 단백질을 제조할 수 있다.

2. 벡터의 제작

이렇게 제작된 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얼음-결합 단백 질 유전자의 ORF 부분을 증폭시켰다. 상기 PCR의 수행 조건은 성숙-전 정방향 프라이머(pre-mature form forward primer)의 경우 상기 프라이머 1 μl, cDNA 1 μl, 역방향 프라이머 1 μl, dNTP(2.5mM) 4 μl, 10X i-Tag 폴리머라제 완충제 2 μl, i-Tag (intron) 0.5 μl, 및 DNA 분해효소가 제거된 물(DNase free water) 10.5 μl를 혼합하여, 예비-변성(pre- denature)(95℃) 1분, 변성(denature)(95℃) 30초, 복원(annealing)( 59℃) 45초, 연장(extension)( 72℃) 1분, 그리고 총 연장(total extension)( 72℃) 10분의 과정을 거치고, 상기 변성 내지 연장의 단계를 30번 반복하여 수행하며, 성숙 정방향 프라이머(mature form forward primer)의 경우 성숙-전 정방향 프라이머 대신 성숙 정방향 프라이머를 사용하고 증폭 과정 중 복원(annealing) 단계를 63℃에서 45초간 수행하는 것을 제외하고 성숙-전 정방향 프라이머(pre-mature form forward primer)의 경우와 동일한 조건에서 수행한다.

이후 상기에서 증폭된 DNA와 벡터를 제한효소인 EcoRI 과 XhoI을 이용하여 절단한 후 리가아제(ligase)를 이용하여 라이게이션한 후 대장균(E. coli) BL21(DE3)균주에 형질변환(transformation) 하였다. 즉, 도 4에 나타난 pProEX HTa (Invitrogen)벡터의 클로닝 부위를 EcoRI과 XhoI을 이용하여 절단한 후 성숙-전(pre-mature form) 얼음-결합 단백질 유전자 또는 성숙한 얼음-결합 단백질 유전자와 결합시켜 재조합 벡터를 제작하였다.

<실시 예 3> 서던 블롯( Southern Blot )

키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 염기서열 중 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein(IBP))을 코딩하는 유전자의 카피(copy) 수를 확인하기 위하여 서던 블롯 분석을 수행하였다. 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)에서 추출한 게노믹(genomic) DNA를 각각 15μg씩 분취한 후 각각의 분취한 게노믹 DNA튜브에 EcoRV, NcoI, SacI의 제한효소를 각각 처리하여 상기 세 종류의 튜브를 2시간 이상 반응 시킨 후 0.7% 아가로즈 젤(agarose big gel)에 러닝한 후 Hybond^TM-N⁺ 멤브레인에 옮겼다. 이 멤브레인은 얼음-결합 단백질의 ORF 유전자와 p-32 방사선 동위원소를 이용하여 61℃에서 18 시간 동안 접합(hybridization) 하였다. 그 후 -70℃에서 하루 동안 x-ray 필름에 노출하여 얼음-결합 단백질 유전자의 카피 수를 확인하였다.

상기 서던 블롯 분석 결과를 도 5에 나타내었으며, 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)에는 얼음-결합 단백질이 다 유전자 패밀리(multi gene family) 로 존재한다는 것을 알 수 있고, 본 실험에서는 4개의 카피를 확인하였다.

<실시 예 4> 노던 블롯( Northern Bot )

실제 동결 조건에서의 얼음-결합 단백질 발현 양상을 mRNA 수준에서 알아보기 위해 노던 블롯 분석을 수행하였다. 키토세로스 네오그래실(C. neogracile) 세포 200ml를 -20℃에서 3가지의 상태로 동결 스트레스를 주었다. 첫 번째 조건은 플 라스크 표면이 얼기 시작하는 시점(Freeze start, F.A.)에서 약 20분 정도, 두 번째 조건은 배양액에 얼음이 떠다니는 시점(1/2 Freeze, 1/2F.)에서 약 40분 정도, 마지막 조건은 배양액이 샤베트와 같은 상태(All Freeze, A.F.)에서 약 50분 정도의 시간 동안 스트레스를 주었다. 이렇게 획득한 세포로부터 Plant RNeasy mini kit(QIAGEN) 을 이용하여 RNA를 추출하였다. 이후 세 가지 조건의 스트레스에서 추출된 총 RNA를 각각 정량하여 1.2% 포름알데히드 아가로즈 젤에 러닝 한 후 Hybond^TM-N⁺ 멤브레인으로 옮겼다. 이후 과정은 상기 실시예 3의 서던 블롯 과정과 동일하게 진행하였다.

상기 세 가지 RNA를 추출하여 정량의 RNA를 1.2% 포름알데히드 아가로즈 젤에 러닝한 결과가 도 6에 나타나 있다. 도 6의 상단은 정량한 RNA의 사진을 나타내고, 도 6의 하단은 필름에 노출된 결과를 나타낸다. 그 결과 3번 레인, 즉 배양액에 얼음이 떠다니는(1/2 Freezing) 상태에서 IBP 유전자 발현이 가장 많음을 알 수 있다.

<실시 예 5> 얼음-결합 단백질의 발현

형질전환(transformation)된 대장균 (BL 21(DE3))을 50μg/ml 농도의 암피실린(ampicillin)이 들어 있는 10ml의 LB 배지에 넣고 37℃에서 150rpm 으로 배양한다. 약 16시간 배양한 후 50μg/ml 농도의 암피실린이 들어 있는 100ml의 LB 배지 에 옮겨서 O.D₆₀₀ 값이 0.5~0.6 이 될 때까지 배양한다. 그 후 IPTG를 1mM로 첨가하여 약 4시간 동안 배양한다. 그리고 나서, 원심분리를 통해 세포를 수확하고 상층액을 버린다. 수집된 세포를 -20℃에서 약 16시간 동안 저장하고, 이렇게 냉동시킨 세포에 10ml의 용해 완충액(lysis buffer)(50mM NaH₂PO₄, 200mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0)를 넣고 보텍스(vortex)로 얼린 세포를 풀어준다. 이후 소니케이터(sonicater)로 상층액이 투명해질 때가지 세포를 파쇄한다. 이후 원심분리기를 이용하여 상층액을 걷어낸다. 이렇게 얻어진 상등액을 SDS-PAGE 젤에 로딩하여 단백질의 과발현을 확인한다.

상기의 단백질 발현 결과가 도 7에 나타나 있으며, 도 7에서 A는 얼음결합 단백질이 과발현된 대장균의 단백질 혼합물, B는 얼음결합 단백질이 과발현되지 않은 대장균의 단백질 혼합물, C 단백질이 과발현된 대장균의 단백질 혼합물을 정제한 결과를 나타낸다.

<실시 예 6> 단백질의 정제

단백질의 과발현을 확인한 후 상등액 4ml당 1ml의 50% Ni-NTA(Qiagen, Germany) 를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 교반기로 잘 섞어준다. 이후 컬럼에 상기 혼합물을 넣어주면 Ni-NTA에 결합한 목적 단백질은 컬럼 위에 남고 나머지는 밑으로 떨어진다. 이렇게 위에 남은 아가로즈를 세척 완충액(wash buffer)(50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH 8.0) 4ml로 두 번 세척한 후 용리 완충액(elution buffer)(50mM NaH₂PO₄, 200mM NaCl, 250mM imidazole, pH 8.0) 0.5ml씩 4번 이상 흘려주어 단백질을 얻는다. 상기에서 획득한 성숙전 얼음결합 단백질은 282 아미노산 길이와 31kDa의 분자량을 갖지며 성숙한 얼음 결합 단백질은 252 아미노산 길이와 27kDa의 분자량을 갖는다.

키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)로부터 획득한 얼음-결합 단백질의 ORF 유전자의 아미노산 서열로 진화적 계통수를 그린 결과를 도 1에 나타내었으며, 이는 이미 보고된 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 남극 규조류인 나비큘라 글라시에(Navicula glaciei)의 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein(IBP))과 매우 높은 유사도를 보였다.

<실시 예 7> 얼음결합 단백질의 존재 및 활성 강도의 측정

키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 배양액으로 분비한 얼음결합 단백질과 cDNA 라이브러리(library)에서 확인된 유전자를 유전자 재조합 과정을 통하여 대장균(E.coli)에서 발현시켜 정제한 얼음결합 단백질의 존재 및 그 활성 강도를 측정하였다. 얼음결합 단백질의 활성을 측정하는 방법 중 하나인 성장하는 얼음표면의 형태를 측정하였다 (Raymond et al. 1989, Inhibition of growth of nonbasal planes in ice by fish antifreezes. PNAS. 86, 881-885; Raymond and Fristsen 2001, Semipurification and ice recrystallization inhibition activity of ice-active substances associated with Antarctic photosynthetic organisms. Cryobiology. 43, 63-70).

먼저, 일반 배양상태에서의 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 경우(도 8a) 얼음 표면에 미약한 육각 형태 등의 구덩이 형태가 관찰되었다. 또한 얼음 조각의 끝부분에서 성장하는 얼음의 형태가 활엽수의 잎과 유사한 둥근 형태를 보이는 것으로 보아 얼음 결합 단백질의 활성이 미약한 것으로 판단할 수 있다. 또한, 대조군인 용리 완충액과 얼음결합 단백질이 발현되지 않은 대장균의 용출액의 경우(도 8b)에는 얼음 표면에 구덩이가 없거나 둥근 형태의 적은 수의 구덩이(pitting)가 관찰된 것으로 보아 얼음 결합 단백질이 거의 존재하지 않는 것으로 판단할 수 있다. 상기 일반 배양 상태 및 대조군의 경우 관찰은 용리 완충액 염농도 702 mmol/kg, 온도 -1.5℃, 단백질이 발현되지 않은 대장균의 단백질 용액의 염농도 508 mmol/kg, 온도 -1.5℃, 배양액의 염농도 1056 mmol/kg 온도 -2℃에서 이루어진다.

유전자 재조합 과정을 통하여 대장균(E.coli)에서 발현시켜 정제한 얼음결합 단백질의 어는점(freezing temperature)을 결정하기 위하여 시료의 염 농도를 측정하였다(VAPRO5520, Wescor Ltd., USA). 그 결과 염농도는 각각 520 mmol/kg (성숙-전 IBP), 524 mmol/kg (성숙 IBP)로 측정되었으며, 그 결과 측정된 염농도를 기준 으로 하여 수조(water bath)의 온도를 -1.5 ℃로 설정하였다. 상기 설정 온도로 맞추어진 챔버에 샘플 튜브를 위치시켰다. 샘플 튜브의 온도를 챔버 내의 온도와 일치시킨 후 샘플 튜브에 시료를 넣었다. -20℃에서 미리 제작한 얼음조각을 샘플 튜브에 넣고 광학현미경(Olympus SZ61, Japan)으로 얼음조각의 표면을 관찰하였고, 그 형태를 사진으로 촬영하였으며 (Olympus Camedia C-5060, Olympus), 그 결과를 도 8c 및 도 8d에 나타내었다. 얼음결합 단백질이 존재하는 완충액에서는 상기의 두 경우와는 달리 얼음 표면에 깊고 가파른 많은 수의 구덩이가 관찰되었고, 얼음 표면의 끝부분에서도 침엽수 잎과 유사한 뾰족한 형태의 얼음이 성장하고 있음을 확인하였다. 특히 성숙(Mature) 단백질의 경우(도 8d)는 성숙-전(Pre-mature) 단백질(도8c)보다 더욱 깊은 구덩이가 관찰되었고, 그 모양도 육각형태를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 도 8d의 우측 그림에서와 같이 얼음표면의 끝부분에 매우 뾰족한 형태의 얼음결정이 생성된 것으로 보아 성숙-전 단백질보다 성숙 단백질의 얼음결합 단백질의 활성이 더욱 강한 것으로 판단되었다.

도 8a, 8b, 8c 및 8d는 얼음결합 단백질이 직접적으로 얼음에 결합하여 얼음의 성장을 억제하는지 여부를 나타낸 것이다. 얼음결합 단백질이 없거나 그 활성이 약한 경우에는 얼음 표면에 구덩이 깊이가 깊지 않은 둥근 형태의 모양이 나타나고 얼음표면의 끝부분에서는 활엽수의 잎 모양과 유사한 둥근 형태의 얼음이 성장한다. 반면, 강한 활성의 얼음결합 단백질은 얼음표면에 강하게 결합되어, 얼음과 결합한 부위에는 얼음의 성장을 억제하게 된다. 이러한 작용으로 인하여 얼음표면에 는 깊고 가파른 구덩이가 얼음표면 전체에 생성되고 얼음표면의 끝부분에서는 침엽수의 잎 모양과 유사한 뾰족한 형태의 얼음이 성장한다.

<실시 예 8> 얼음 결정의 형태 변화 측정

유전자 재조합 과정을 통하여 대장균(E.coli)에서 발현시켜 정제한 얼음결합 단백질이 얼음결정의 형태를 변화시키는 정도를 측정하기 위하여 나노리터 삼투압계(nanolitre osmometer)(Otago osmometers, New Zealand)를 사용하였다(kobashigawa et al. 2005, A part of ice nucleation protein exhibits the ice-binding ability. FEBS. 579, 1493-1497; Bravo and Griffith 2005, Characterization of antifreeze activity in Antarctic plants. J. Experiment. Bot. 56 (414), 1189-1196).

샘플 챔버 내에 유침 오일(immersion oil)(Olympus)을 채운 후 측정하고자 하는 시료를 유침 오일 위에 위치시켰다. 샘플 챔버를 나노리터 삼투압계의 스테이지(Stage)에 올려놓은 뒤 -20℃로 샘플 챔버 내부의 시료를 냉동시켰다. 시료의 냉동여부를 광학현미경(Zeiss Axiolab, Zeiss)으로 확인한 후 스테이지의 온도를 천천히 올려 얼음결정의 생성을 확인하였다. 얼음 결정이 모두 녹기 전까지 온도를 올리고 얼음결정이 완전한 구형이 되도록 온도를 조정하였다. 구형의 얼음결정 상태에서 0.01℃/sec 로 스테이지 온도를 내리면서 시료의 온도가 하강될 때 단일 얼음결정이 성장하며 보여지는 형태의 변화를 알아보기 위해 얼음결정 형태를 사진 으로 촬영하였으며(Canon A620), 이를 도 9a 및 9b에 나타내었다.

도 9a 및 9b는 얼음결합 단백질(IBP)이 결빙 방지 활성의 하나로 알려진 얼음 결정의 형태를 변화시키는 현상을 보여주는 것이다. 도 9b에서, 얼음결합 단백질이 존재하지 않는 용리 완충액를 대조군(도 9b좌측 상단)으로 하였으며 이러한 대조군의 경우 얼음 결정은 각이 없고 둥그렇게 자라는 반면, 얼음-결합 단백질이 존재하는 경우(도 9b 좌측 하단 및 우측 하단) 얼음 결정 표면에 얼음-결합 단백질이 결합하여 각을 형성하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 더욱 확실한 증명을 위해 얼음-결합 단백질을 발현시키지 않은 대장균(E. coli .) 세포를 파쇄한 상등액으로 얼음 결정의 형태변화 현상을 실험하였으며(도 b 우측 상단), 그 결과 대조군보다는 불규칙한 원형을 이루지만 얼음-결합 단백질이 존재할 때와 같은 각진 모양의 얼음 결정은 관찰되지 않았다. 성숙한 얼음-결합 단백질 및 성숙-전 얼음-결합 단백질의 결정 모양이 다른 것은 단백질의 구조에 기인하는 것으로 알려져 있으며, 성숙한 얼음-결합 단백질의 활성이 성숙-전 얼음-결합 단백질보다 우수한 것을 확인할 수 있다.

도9a는 일반 배양상태에서 키토세로스 네오그래실(Chaetoceros neogracile)의 배양액으로 분비한 얼음결합 단백질이 얼음 결정의 형태를 변화시키는 현상을 관찰한 것으로 얼음 결정 표면에 불규칙한 각을 이루는 정도에 불과하여, 각진 형태를 형성하는 본 발명의 본 발명의 재조합 단백질과 비교하여 그 활성이 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있다.

<실시 예 9> 얼음결합 단백질( IBP ) 의 결빙방지( anti - freeze ) 활성의 측정

재조합 단백질의 결빙방지 활성을 측정하기 위하여 광학현미경에 결합된 나노리터-오스모미터 기기를 사용하였다(Otago nanolitre-osmometer). 본 기기는 시료의 온도를 즉각적으로 조절할 수 있는 기기로서 시료의 녹는 점 및 어는 점, 그리고 열적이력현상(Thermal hysteresis, TH)의 측정이 가능한 기기이다. 시료를 시료 챔버에 0.1-0.5 μl넣고 시료 챔버의 온도를 -20℃로 강하시켜 시료를 냉동시킨다. 5분간 시료의 냉동상 태를 유지한 후 약 -5℃까지 온도를 올려준다. 이후 단일 얼음결정이 생성될 때까지 시료 챔버의 온도를 상승시킨다. 단일 얼음결정의 상(phase)이 정지된 온도(녹는 점, Tm)에서 0.01℃/초의 속도로 온도를 하강시키면서 단일 얼음결정의 상 변화를 광학 현미경으로 관찰한다. 온도 하강 시 단일 얼음결정이 성장하기 시작하는 온도(어는 점, freezing temperature)를 측정한다. 녹는 점과 어는 점의 온도의 차이가 발생하게 되는 현상이 열적 이력현상(Thermal hysteresis)으로서, 녹는 점과 어는 점의 온도차이로 표현된다.

표 2. 시료 별 열적이력현상(TH) 값과 시료 별 얼음결정의 형태 변화 정도

	TH(℃)(열적이력현상)	얼음결정의 형태 변화정도b
배양액으로 분비된 키토세로스 네오그래실(C. neogracile) IBPa	0.05	각이 보이는 둥근디스크형
발현되지 않은 대장균의 단백질(Un-induced crude)	0.01	둥근디스형
성숙-전(pr-emature)	0.03	부정형
성숙(mature)	0.18	육각형

^a 2 ℃에서 5일 배양한 배양액을 여과하여 농축한다.

^b 얼음 결정의 모양

상기 표 2는 결빙-방지 활성(Anti-freeze activity)을 추정하는 근거가 될 수 있는 열적이력 현상(Thermal hysteresis, TH)를 정량하여 TH값과 얼음결정의 형태 변화능을 시료별로 비교한 결과이다. IBP 단백질의 활성이 없거나 IBP가 존재하지 않는 경우에는 열적 이력현상이 미미하고, 단일 얼음결정의 형태는 둥근 디스크의 형태로 나타난다. 반면, 얼음결합 단백질의 활성이 있는 경우에는 육각면체(Hexagonal) 또는 이중 피라미드(Bipyramical) 형태로 단일 얼음결정이 성장한다. 성숙한 IBP의 시료를 이용하여 TH활성을 관찰하였을 때 가장 높은 값을 가지며, 얼음 결정이 육각면체(Hexagonal)의 형태를 보이는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과를 통해 규조류 유래 얼음-결합 단백질은 결빙-방지(anti-freeze) 활성도 나타냄을 확인하였다.

<실시 예 10> 시그널 펩타이드(signal peptide)의 존재 여부 및 절단 부위의 예측

Signal P (3.0) 프로그램을 이용하여 시그널 펩타이드의 존재여부와 절단 부위를 예측하였으며, 확인결과 대부분 아미노산 서열 30-31(AEG-LR) 부위에 절단 부위가 있음이 예측되었다. NN 결과와 HMM 결과는 데이터 베이스를 해석하는 방법상의 차이를 가지는 것으로, 즉 어떤 방식으로 데이타를 정리했는지에 따라 구별된 다. 같은 이유로 Y-점수(score), C- 점수(score), S- 점수(score)의 경우도 분석한 데이타를 해석하는 방법에 따른 차이를 가진다. 초기에는 점수(score)를 주로 사용하고 버전이 업그레이드 되면서 정확한 결과를 분석하는 방향으로 제시되고 있다. 최신 버전에 사용하고 있는 것은 S- 점수(score)이며 다른 값은 참고로 하고 S- 점수(score)를 통해 시그널 펩타이드의 존재 여부를 확인할 수 있다.

1. 시그널 펩타이드의 존재여부 측정( SignalP - NN result )

Signal P (3.0) 프로그램을 이용하여 시그널 펩타이드의 존재여부를 예측하였으며, 그 결과는 도 10a및 하기 표 3과 같다.

표 3. 시그널 펩타이드의 존재여부 측정 결과

측정(Measure)	위치(Position)	값(Value)	절단(Cutoff)	시그널 펩타이드의 존재 여부
max. C	31	0.534	0.32	YES
max. Y	31	0.651	0.33	YES
max. S	13	0.988	0.87	YES
mean S	1-30	0.852	0.48	YES
D	1-30	0.751	0.43	YES

2. 시그널 펩타이드의 절단 부위 예측(SignalP - HMM result )

역시 Signal P (3.0) 프로그램을 이용하여 시그널 펩타이드의 절단 부위를 예측하였으며, 그 결과를 도 10b에서 확인할 수 있다. 그 결과 시그널 펩타이드 가능성(Signal peptide probability)은 0.917, 시그널 앵커(Signal anchor) 가능성 0.082, 최대 절단 부위 가능성(Max cleavage site probability)은 0.559로 아미노 산 서열 30-31 사이에서 확인되었다.

도 1은 키토세로스 네오그래실(C. neogracile)의 얼음결합 단백질이 나비큘라 글라시에(Navicula glaciei)의 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein(IBP))과 아미노산 서열에 있어서 유사하지만, 다른 분기군(clade)로 나뉘어 있는 것을 보여주는 계통수 분석이다.

도 2는 본 발명의 얼음-결합 단백질의 발현에 사용된 발현 벡터인 pProEX HTa의 지도를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 얼음-결합 단백질 단백질의 발현에 사용된 발현 벡터인 pProEX HTa의 다클로닝 위치(multiple cloning site) 및 삽입 위치(insertion site)를 나타낸다.

도 4는 극지 규조류의 얼음-결합 단백질이 삽입된 EcoRI및 XhoI 클로닝 위치가 표시된 pProEX HTa 벡터의 구조를 나타낸다.

도 5는 얼음-결합 단백질 유전자의 서던 블롯(southern bot) 분석을 나타내며, 레인 M은 마커, 레인 1 은 EcoRV로 절단한 키토세로스 네오그래실의 gDNA, 레인 2는 NcoI 로 절단한 키토세로스 네오그래실의 gDNA, 레인 3은 SacI 로 절단한 키토세로스 네오그래실의 gDNA 을 나타내며, 이렇게 절단된 gDNA에 얼음결합 단백 질의 유전자를 탐침으로 이용하여 몇 개의 카피가 존재하는지 알아본 결과를 나타낸다.

도 6는 동결 조건에서의 얼음-결합 단백질 유전자의 mRNA 발현을 나타내며, 레인 1은 대조군 RNA, 레인 2는 플라스크 표면이 얼기 시작하는 시점(Freeze start, F.A.)의 RNA, 레인 3은 배양액에 얼음이 떠다니는 시점(1/2 Freeze, 1/2F.)의 RNA, 레인 4는 배양액이 샤베트와 같은 상태(All Freeze, A.F.)의 RNA를 나타낸다.

도 7은 얼음-결합 단백질을 과발현한 결과를 나타내는 것으로, 레인 A는 얼음결합 단백질이 과발현 된 대장균의 단백질 혼합물, 레인 B는 얼음결합 단백질이 과발현 되지 않은 대장균의 단백질 혼합물, 레인 C는 성숙-전 얼음결합 단백질이 과발현된 대장균의 단백질 혼합물을 정제한 결과, 그리고 레인 D는 성숙 IBP를 정제한 결과를 나타낸다.

도 8a 내지 8d는 얼음 결합 단백질의 활성을 나타내는 것으로, 도 8a는 일반 배양 단백질, 도 8b는 대조군으로서 좌측은 용리 완충액이고 우측은 단백질이 발현되지 않은 대장균 용출액이며, 도 8c는 성숙-전(Pre-mature) 얼음결합 단백질, 도 8d는 성숙한 얼음결합 단백질의 활성을 각각 보여준다.

도 9a 및9b는 얼음 결정의 형태 변화를 측정한 것으로서, 도 9a는 배양액에 분비된 IBP의 경우를 나타내며, 도 9b에서 대조군으로 용리 완충액을 사용하였고(좌측 상단), 우측 상단은 얼음결합 단백질이 발현되지 않은 대장균의 단백질(Un-Induced) 혼합물을 나타내며, 좌측 하단 및 우측 하단은 각각 성숙-전 IBP 및 성숙 IBP가 얼음 결정의 형태를 변화시키는 정도를 나타낸 것이다.

도 10a 및 10b는 각각 Signal P (3.0) 프로그램을 이용하여 시그널 펩타이드의 존재여부 및 절단 부위를 예측한 것이다.

도 11은 얼음-결합 단백질과 유사한 단백질의 아미노산 서열 정렬(alignment)을 나타낸 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University Korea ocean research and development institute <120> Ice-binding protein gene derived from Chaetoceros neogracile, recombinant vector comprising the gene, and protein encoded by the gene <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 759 <212> DNA <213> Chaetoceros neogracile <400> 1 ctccgtcagg agaaacgtgg aggtcttagg cgtcagctcg atgacgaacc actatctgct 60 gtcaagctac tcacagcagg aaggtttgcc attttgacaa aaactggtgt gacgaccacc 120 ggtccaacag atctgaaagg tgatatgggc acgagtccta tcacaggcgc ggccatcacg 180 ggatttggtt tgattacgga tcccagcgat accactttct ccacatcctc ccttgtgaca 240 ggacaggtat tcgcatcaga ctacacatcc cccacaccca atatgctaac tgtagcagtc 300 ctcgacatgc aggccgcata tgttgatgct gcaggccgcc ctgaccccga ctacgttgag 360 cttggtgctg gaaacattga gggcctcact cttgaacctg gcctatacaa gtgggggact 420 gatgtcggct tcaccaacag tctcaccttc gatggttctg acactgatat ttggatcttg 480 cagatcgatg gggatgtcac agcaggaagc ggtgcaaaag tcaaactcat taacgatgcc 540 aaggctgaga acatcttttg 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Asp Val Gly Phe 130 135 140 Thr Asn Ser Leu Thr Phe Asp Gly Ser Asp Thr Asp Ile Trp Ile Leu 145 150 155 160 Gln Ile Asp Gly Asp Val Thr Ala Gly Ser Gly Ala Lys Val Lys Leu 165 170 175 Ile Asn Asp Ala Lys Ala Glu Asn Ile Phe Trp Gln Ile Ala Gly Lys 180 185 190 Thr Asp Leu Gly Thr Thr Ser His Val Glu Gly Val Phe Leu Cys Ser 195 200 205 Thr Ala Ile Thr Phe Lys Thr Gly Ser Ser Met Asn Gly Ala Ala Leu 210 215 220 Ala Gln Thr Ala Val Thr Leu Asp Ser Ala Thr Ile Val Lys Glu Ser 225 230 235 240 Val Cys Asp Val Asp Val Gly Cys Val Ala Pro Asn 245 250 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Chaetoceros neogracile <400> 4 Met Ser Leu Ile Thr Ile Asn His Thr Leu Val Val Thr Ala Leu Leu 1 5 10 15 Phe Ala Ala Val Ala Leu Leu Gly Val Pro Met Ala Glu Gly Leu Arg 20 25 30 Gln Glu Lys Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gln Leu Asp Asp Glu Pro Leu 35 40 45 Ser Ala Val Lys Leu Leu Thr Ala Gly Arg Phe Ala Ile Leu Thr Lys 50 55 60 Thr Gly Val Thr Thr Thr Gly Pro Thr Asp Leu Lys Gly Asp Met Gly 65 70 75 80 Thr Ser Pro Ile Thr Gly Ala Ala Ile Thr Gly Phe Gly Leu Ile Thr 85 90 95 Asp Pro Ser Asp Thr Thr Phe Ser Thr Ser Ser Leu Val Thr Gly Gln 100 105 110 Val Phe Ala Ser Asp Tyr Thr Ser Pro Thr Pro Asn Met Leu Thr Val 115 120 125 Ala Val Leu Asp Met Gln Ala Ala Tyr Val Asp Ala Ala Gly Arg Pro 130 135 140 Asp Pro Asp Tyr Val Glu Leu Gly Ala Gly Asn Ile Glu Gly Leu Thr 145 150 155 160 Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Gly Thr Asp Val Gly Phe Thr Asn 165 170 175 Ser Leu Thr Phe Asp Gly Ser Asp Thr Asp Ile Trp Ile Leu Gln Ile 180 185 190 Asp Gly Asp Val Thr Ala Gly Ser Gly Ala Lys Val Lys Leu Ile Asn 195 200 205 Asp Ala Lys Ala Glu Asn Ile Phe Trp Gln Ile Ala Gly Lys Thr Asp 210 215 220 Leu Gly Thr Thr Ser His Val Glu Gly Val Phe Leu Cys Ser Thr Ala 225 230 235 240 Ile Thr Phe Lys Thr Gly Ser Ser Met Asn Gly Ala Ala Leu Ala Gln 245 250 255 Thr Ala Val Thr Leu Asp Ser Ala Thr Ile Val Lys Glu Ser Val Cys 260 265 270 Asp Val Asp Val Gly Cys Val Ala Pro Asn 275 280 <210> 5 <211> 242 <212> PRT <213> Navicula glaciei <400> 5 Met Met Phe Leu Ala Lys Thr Val Thr Leu Leu Val Ala Leu Val Ala 1 5 10 15 Ser Ser Val Ala Ala Glu Gln Ser Ala Val Asp Leu Gly Thr Ala Gly 20 25 30 Asp Phe Ala Val Leu Ser Lys Ala Gly Val Ser Thr Thr Gly Pro Thr 35 40 45 Glu Val Thr Gly Asp Ile Gly Thr Ser Pro Ile Ala Ser Thr Ala Leu 50 55 60 Thr Gly Phe Ala Leu Ile Lys Asp Ser Ser Asn Thr Phe Ser Thr Ser 65 70 75 80 Ser Leu Val Thr Gly Lys Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Thr Ala Pro Thr 85 90 95 Pro Ser Lys Met Thr Thr Ala Ile Ser Asp Met Ser Thr Ala Phe Thr 100 105 110 Asp Ala Ala Gly Arg Ser Asp Pro Asp Phe Leu Glu Leu Gly Ala Gly 115 120 125 Ser Ile Glu Gly Glu Thr Leu Val Ala Gly Leu Tyr Lys Trp Gly Thr 130 135 140 Asp Val Ser Phe Thr Ser Ser Leu Val Phe Asp Gly Ser Ala Thr Asp 145 150 155 160 Val Trp Ile Leu Gln Val Ala Lys Asp Phe Ile Val Gly Asn Gly Ala 165 170 175 Gln Met Tyr Leu Thr Gly Thr Ala Lys Ala Glu Asn Ile Phe Ile Gln 180 185 190 Val Ser Gly Ala Val Asn Ile Gly Thr Thr Ala His Val Glu Gly Asn 195 200 205 Ile Leu Ser Ala Thr Ala Ile Ala Leu Gln Thr Gly Ser Ser Leu Asn 210 215 220 Gly Lys Ala Leu Ser Gln Thr Ala Ile Thr Leu Asp Ser Val Thr Ile 225 230 235 240 Val Ser

Claims (6)

1. 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하며, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자.
2. 얼음-결합 단백질(Ice-binding protein)을 코딩하며, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자.
3. 제 1항 또는 제 2항의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
4. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 ori 사이트, 암피실린 저항성 사이트, 멀티플 클로닝 사이트, 6XHis-Tag 사이트 및 Trc 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
5. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 얼음-결합 단백질.
6. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 얼음-결합 단백질.

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