KR101860902B1 - 남극 요각류 티그리오푸스 킹세종엔시스 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 남극 요각류 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 남극 요각류 티그리오푸스 킹세종엔시스(Tigriopus kingsejongensis) 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소(Stearoyl-CoA Deasaturase; delta 9 fatty acid desaturase; SCD) 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법에 관한 것이다.

Description

남극 요각류 티그리오푸스 킹세종엔시스 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소 및 이의 용도{Stearoyl-CoA Deasaturase Derived from Tigriopus kingsejongensis and Use Thereof}

본 발명은 남극 요각류 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 남극 요각류 티그리오푸스 킹세종엔시스(Tigriopus kingsejongensis) 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소(Stearoyl-CoA Deasaturase; delta 9 fatty acid desaturase; SCD) 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법에 관한 것이다.

수생 생태계에서, 동물성플랑크톤은 먹이사슬에서 유기체의 높은 영얀단계를 지지하는 중요한 미생물이다. 동물성플랑크톤 중에서, 조간대(intertidal) 요각류인 티그리오푸스(Tigriopus)는 바위 사이 웅덩이 주변 얕은 조상대(supratidal) 지역에 전 세계적으로 분포되어있고, 침수, 가뭄 및 온도 조건 하에서 극적인 변동을 겪는다(Davenport et al., 1997. J Mar Biol Assoc UK 77:3-16). 다양한 환경적 스트레스 하에서, 이 미생물은 몇 가지 생존 전략을 개발하였다. 따라서, 티그리오푸스는 환경 생물학 및 독성에 관한 연구의 넓은 범위에서 대표적인 모델로 사용된다(Raisuddin et al., 2007. Aquat Toxicol 83:161-173).

T. kingsejongensis는 남극의 해양 및 조간대에 서식하는 고유종이다. 다양한 환경 스트레스에서 티그리오푸스의 적응과 관련된 생리학을 이해하는 것이 중요하지만, 이 미생물에 대해 적은 유전 정보만이 보고되었다(Lenz et al., 2012. Comp Biochem Phys 7:110-123). 티그리오푸스는 짧은 생활주기, 작은 몸체 사이즈 및 독특한 생존 전략을 지닌다. 티그리오푸스의 세포 기능과 유전 정보는 미토콘드리아 게놈 및 상보적 DNA(cDNA) 서열에서 얻은 정보로부터 밝혀졌다(Machida et al., 2002. Mar Biotechnol 4:406-417; Jung et al., 2006. J Exp Mar Biol Ecol 333:251-262). 최근, 티그리오푸스 자포니쿠스(Tigriopus japonicus)의 cDNA는 40,000개 이상의 발현서열태그(expressed sequence tag, ESTs)와 모든 ESTs 중 대략 5,000개의 중요 ESTs를 갖는 것으로 나타났다. T. japonicus의 cDNA 데이터로부터 DNA 수선, 돌연변이, 해독(detoxification) 및 스트레스 반응 유전자와 관련된 많은 유전 정보가 밝혀졌다.

남극 미생물은 추위 및 동결상태를 피하거나 견디는 능력을 갖는다. 특히, 그들은 염류 및 다른 용질로 인해 반고체 얼음 모체와 관련된 조건 및 겨울동안 매우 추운 해수 온도를 견딘다. 추운 조건에서 자라고 성장하는 대부분의 저온성(psychrophilic) 미생물은 영양소 부재, 감소된 생화학 반응률(Wiebe et al., 1992. Appl Environ Microbiol 359-364), 막유동성 변동(fluctuation)(Nichols et al., 1993. Antrarct Sci 5 271-278; White et al., 2000. Antrarct Sci 12 386-393), 단백질 미스폴딩 및 세포 내 구간 결빙(Zhang et al., 2011. Mar Biotechnol 13, 393-401)에 대한 다양한 생존 전략 유형을 개발하였다. 게다가, 극지 미생물은 유동성을 유지하기 위해 그들의 세포막 내에 단일불포화(monounsaturated fatty acid; MUFA) 및 다불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA)을 증가시키는 경향이 있다. 많은 연구에서 증가된 지방산의 양은 내한성을 증가시키고 Δ9불포화효소는 낮은 온도에서 막 유동성을 유지하기 위해 불포화지방산을 증가시킴으로써 추위 적응 경로를 형성한다고 보고되었다(Bertin et al., 1998. Plant Growth Regul 24 31-41; Cruz et al., 2010. Braz J Plant Physiol 22 199-207; Svensk et al., 2013. PLoS Genet 9 e1003801).

게다가, 요각류 지질은 신규의 상업용 해양 오일을 제공한다. 따라서, 남극종인 Tigriopus kingsejongensis의 추위 적응 전략으로 효소 활성 또는 효율의 가능한 차이를 확인하기 위해, 지질 관련 효소를 코딩하는 유전자는 주요대상이 된다. 티그리오푸스 킹세종엔시스는 1) 실험실에서 배양할 수 있고, 2) 비교를 위해 온화종 T. japonicus와 밀접하게 관련되며, 3) 남극의 고유종이기 때문에, 좋은 후보이다.

MUFA(monounsaturated fatty acid)는 막을 형성하는 글리세롤지질에 통합되고, 고체에서 액정상(liquid crystalline phase)으로 전이 온도를 감소시킬 수 있으며, 이는 세포막의 필수 유동성을 부여한다(Mouritsen and Jorgensen, 1992. BioEssays 14 129-136). Stearoyl-CoA 불포화효소(SCD)는 MUFA 합성 및 지방산 구성의 대사조절에 중요한 역할을 한다.(Paton and Ntambi, 2009. Am J Physiol Endocrinol Metab 297:E28-E37). SCD는 트리글리세리드, 막 인지질 및 다른 물질에 결정적인 요소로서 올레오일(oleoyl)-CoA 및 팔미톨레오일(palmitoleoyl)-CoA를 생성한다(Enoch et al., 1976. J Biol Chem 251:5095-5103; Los and Murata, 1998. Biochem Biophys Acta 1394:3-15; Tocher et al., 1998. Prog Lipid Res 37:73-117). SCD의 효소 활성에 기초하여, MUFA를 포함하는 불포화 지방산은 살아있는 유기체의 생체막에 적절히 작용할 수 있다(Paton and Ntambi, 2009. Am J Physiol Endocrinol Metab 297:E28-E37).

이에, 본 출원의 발명자들은 지방산 생성능이 개선된 미생물 및 이를 이용한 불포화 지방산의 제조방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 남극 요각류인 티그리오푸스 킹세종엔시스(Tigriopus kingsejongensis)로부터 신규의 스테아로일-CoA 불포화효소를 획득하였고, 이를 코딩하는 유전자를 대장균에 도입함으로써 재조합 대장균의 총 지방산 생산량, 팔미톨레산(palmitoleic acid, C16:1, n-7) 및 올레산(oleic acid, C18:1, n-9)을 포함하는 불포화 지방산의 생산량이 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규한 스테아로일-CoA 불포화효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 핵산을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 스테아로일-CoA 불포화효소를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 불포화 지방산을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 스테아로일-CoA 불포화효소를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 스테아로일-CoA 불포화효소를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 스테아로일-CoA 불포화효소를 회수하는 단계를 포함하는, 스테아로일-CoA 불포화효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 불포화 지방산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 불포화 지방산을 회수하는 단계를 포함하는, 불포화 지방산의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 티그리오푸스 킹세종엔시스 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 불포화 지방산의 생산수율을 증대시킬 수 있다.

도 1은 광학현미경으로 관찰되는 T. kingsejongensis의 형태를 나타낸 것이다.
도 2는 Tigriopus kingsejongensis의 스테아로일-CoA 불포화효소의 아미노산 서열과 관련된 다양한 유기체 유래 지방산 대사 효소의 아미노산 서열 얼라이먼트를 나타낸 것으로, 별표(*)는 막결합 지방산 불포화효소의 특성으로 알려진 일반적인 히스티딘 잔기를 가리킨다. 도 2a는 TkSCD-1의 아미노산 서열과 관련된 FAD(fatty acid desaturase)로서, Tig_kings, T. kingsejonesis; Cal_roger, Caligus rogercresseyi; Pyt_splen, Pythium splendens; Phy_infes, Phytophthora infestans; Pyt_aphan, Pythium aphanidermatum; 및 Sap_dicli, Saprolegnia diclina의 아미노산 서열 정렬(sequence alignment)을 나타내며, 도 2b는 TkSCD-2의 아미노산 서열과 관련된 FAD로서, Tig_kings, T. kingsejonesis; Ara_thali, Arabidopsis thaliana; Try_cruzi, Trypanosoma cruzi; Ash_gossy, Ashbya gossypii; Neu_crass, Neurospora crassa; 및 Mus_muscu, Mus musculus의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 UPGMA(unweighed pair group method with arithmetic mean)에 의해 생성되는 T. kingsejongensis의 두 SCD와 관련된 유기체로부터의 FAD 계통수를 나타낸 것이다.
도 4는 (A) TkSCD-1 및 (B) TkSCD-2의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 이탤릭, 볼드 및 밑줄 친 영역은 막 관통영역을 나타낸다.
도 5는 TkSCD-1 및 TkSCD-2의 막관통 부분의 예상 및 도해이다.
도 6은 대장균으로부터 재조합 TkSCD의 이종숙주 발현 및 면역 블롯 분석에 의한 발현의 검출을 나타낸 것으로, (A) 쿠마씨 블루 염색 및 (B) 웨스턴 블롯 분석이며, M 및 U는 각각 단백질 사이즈 마커 및 유도되지 않은 E. coli (pET32a(+) 벡터)를 나타내고, 1 및 2는 각각 TkSCD-1 및 TkSCD-2를 발현하는 세포를 나타낸다. (B)에서 검은색 화살표는 항-His 항체에 의해 검출된 TkSCD를 나타낸다.
도 7은 TkSCD-1 및 TkSCD-2 유전자가 도입된 E. coli 및 대조군(비도입)으로부터 총 지방산에 대한 가스 크로마토그래피의 피크 프로파일을 나타낸 것으로, 위에는 도입되지 않은 E. coli; 중간은 TkSCD -1 유전자가 도입된 E. coli; 아래는 TkSCD-2 유전자가 도입된 E. coli를 나타낸다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 킹조지 아일랜드 세종기지 근처 조수 웅덩이(tidal pool)에서 수집한 남극 요각류 티그리오푸스 킹세종엔시스(Tigriopus kingsejongensis)로부터 신규의 스테아로일-CoA 불포화효소를 분리하였다. 서열분석 결과, 이는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었으며, TkSCD-1(Tigriopus kingsejongensis Stearoyl-CoA deasaturase-1)이라 명명하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 스테아로일-CoA 불포화효소에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 스테아로일-CoA 불포화효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 스테아로일-CoA 불포화효소인 TkSCD-1(T. kingsejongensis Stearoyl-CoA deasaturase-1) 일 수 있다.

본 발명에서 스테아로일-CoA 불포화효소는 스테아르산을 올레산으로 불포화를 촉진시키고, 단일불포화(monounsaturated) 지방산(MUFAs)의 세포 내(intracellular) 수준을 조절하는 지방산 대사의 주요 조절제이다.

본 발명에 있어서, 바람직하게 상기 스테아로일-CoA 불포화효소는 남극 요각류 Tigriopus kingsejongensis 유래인 것일 수 있다.

또한, TkSCD-1와 함께 티그리오푸스 킹세종엔시스로부터 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 스테아로일-CoA 불포화효소를 분리하였으며, TkSCD-2(Tigriopus kingsejongensis Stearoyl-CoA deasaturase-2)이라 명명하였다. TkSCD-1 및 TkSCD-2는 별개의 그룹으로 완전히 분리되기 때문에, 아미노산 서열 분석은 그들이 다소 다른 효소 유형인 것으로 나타난다(도 3). 다만, 각 TkSCD는 아직 기능이 정의되지 않은 몇몇 효소와 함께 분류될 수 있으므로, TkSCD-1 및 TkSCD-2는 유사한 지방산 효소 유형일 수 있다.

TkSCD의 유추되는 아미노산 서열은 도 2에 나타난 바와 같이, 세 히스티딘-풍부 모티프(TkSCD-1에 대한 HDCGH, HRHHH 및 HQIHH; TkSCD-2에 대한 HRLGH, HKHHH 및 HYCHH)를 갖는 것으로 나타났다. 세 모티프의 일반적인 특성에 기초하여, TkSCD-1은 아마도 막-통합(membrane-integrated) 불포화효소이다. 세 보존 히스티딘-풍부 모티프는 SCD의 독특한 특징으로 보고되었고, 이는 리간드로서 제2철(ferric iron) 결합을 위한 촉매부위를 제공하는 것으로 여겨진다(Los and Murata, 1998. Biochem Biophys Acta 1394:3-15; Heinemann and Ozols, 2003. Prostag Leokotr Ess 38:123-133; Meesapyodsuk and Qiu, 2014. ACS Chem Biol 9:922-934). Δ12 아실-지질 불포화효소 내 보존 히스티딘 부분 및 제2철은 단백질의 세포질영역 내 촉매중심을 형성하는 것으로 예상되었다(Los and Murata, 1998. Biochem Biophys Acta 1394:3-15).

최근, 아실-CoA Δ9 불포화효소의 구조적 결정요소가 해양 요각류, Calanus hyperboreus로부터 연구되었다(Meesapyodsuk and Qiu, 2014. ACS Chem Biol 9:922-934). C. hyperboreus로부터 Δ9 불포화효소에 대한 실험적인 연구는 소포체에 위치한 C. hyperboreus의 두 Δ9 불포화효소(ChDes9-1 및 ChDes9-2)가 막관통 단백질(integral membrane protein; IMP)이며, 이의 N- 및 C-말단은 세포질 구획으로 향한다는 것을 확인하였다.

특히, 막 내 통합되는 두 번째 막관통영역은 불포화효소 활성에 매우 중요하고, 특히 두 번째 막관통영역 내 티로신 잔기는 기질의 지방산 사슬의 길이를 결정하는 중요한 역할을 한다는 것으로 나타났다(Meesapyodsuk and Qiu, 2014. ACS Chem Biol 9:922-934).

TkSCD-1은 ChDes9-1 및 ChDes9-2와 유사한 막 구조를 나타낸다. 예상되는 TkSCD-1의 통합 영역(integrated region)의 위치에 기초하여, 티로신 잔기는 두 번째 막 관통 부분 내 위치할 가능성이 있다(도 4). 게다가, 두 번째 및 세 번째 막관통영역 사이의 두 히스티딘 잔기 및 C-말단 주변의 하나의 히스티딘 잔기는 세포질 공간에 노출될 것으로 예상된다. 이전의 연구들에서 설명된 불포화효소의 구조적 유사성에 기초하여, TkSCD-1은 세포내에서 높은 불포화효소 활성을 나타낼 수도 있다. TkSCD-2의 경우, 두 번째 및 세 번째 막관통 부분 사이의 노출된 공간이 제2철과 히스티딘 클러스터(cluster)를 형성하기에는 너무 좁기 때문에 TkSCD-1에 비해 낮은 효소 활성을 보일 것이다. IMP(integral membrane protein)는 광합성, 호흡, 분자 수송 및 촉매 반응과의 관련성 때문에, 그들의 생물학적 및 의학적 사용에 대해 조사되어왔다(Carpenter et al., 2008. Curr Opin Struc Biol 18:581-586).

티그리오푸스의 데이터베이스로부터, 지방산 생합성과 밀접하게 관련된 유전자를 식별하고 TkSCD-1 및 TkSCD-2로 명명하였으며, 이는 각각 1,110 bp (서열번호 3) 및 681bp 길이로서, 369개(서열번호 1) 및 226개(서열번호 2)의 아미노산을 코딩한다(도 4).

따라서, 다른 관점에서 본 발명은, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게 상기 스테아로일-CoA 불포화효소 TkSCD-1를 코딩하는 핵산은 서열번호 3의 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 핵산은 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 효소를 코딩하는 염기서열 일부(partial) 또는 전부(complete)를 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 핵산은 Tigriopus kingsejongensis로부터 PCR법에 의해 합성할 수 있으며, 기타 유사한 종으로부터 합성하거나 이미 알려진 염기 서열을 기초로 화학적 합성법에 의해 합성할 수도 있을 것이다. 일 예로 상기 목표 유전자 함유 선형 DNA를 제작하기 위하여 상기 유전자의 개시코돈 및 종결코돈을 모두 포함할 수 있도록 PCR용 프라이머를 이용할 수 있으며, 본 발명에서 사용된 프라이머는 하기 표 1에 개시하였으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 목표 유전자를 증폭시키기 위하여 사용할 수 있는 당업자가 설계 가능한 모든 프라이머를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사 효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 혈우병 치료제에 대한 항체 생성여부를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이제 제한되는 것은 아니나, pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a, pET-22b(+), pET32a 및 pGEX로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 pET32a 벡터일 수 있다.

상기 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 DNA는 전사 및 번역 제어 서열에 "작동되도록 결합"되어 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 상기 스테아로일-CoA 불포화효소 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 상기 스테아로일-CoA 불포화효소 유전자가 벡터 내로 라이게이션된다는 것을 의미할 수 있다.

핵산의 염기 서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 직접적인 영향을 끼치는 요소들이며, 코딩서열에 작동 가능하도록 적절한 위치에 배치 혹은 연결되며; 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치며 코딩 서열에 작동 가능하도록 코딩서열의 직전에 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 DNA 서열이 물리적으로 연결되어 있으며, 또한 분비 리더 서열의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 핵산 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

당업계에 주지된 바와 같이, 재조합 미생물에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다. 재조합 미생물이 진핵세포인 경우에는, 재조합 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상기 핵산 또는 상기 재조합 벡터는 미생물에 형질주입 또는 형질전환된다. "형질주입" 또는 "형질전환"을 위해 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 열 충격, 전기 영동법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 있어 상기 유전자(핵산)를 미생물 변이체(재조합 미생물)의 게놈 염색체에 삽입하여서도 상기와 같이 재조합 벡터를 미생물 변이체(재조합 미생물)에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

또한, 본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

또한, 형질전환방법에는 발현벡터를 이용한 방법 외에도, 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다.

일반적으로 전기천공법(electroporation), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂)침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수 있다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, Transfectam^TM 및 LIPOFECTIN^TM 이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO 91/17424 및 WO 91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 스테아로일-CoA 불포화효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물은 재조합 벡터가 형질전환되지 않은 미생물에 비하여 팔미톨레산 및/또는 올레산의 함량이 증가되는 것일 수 있다.

아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는, T. kingsejongensis 유래 스테아로일-CoA 불포화효소의 제한된 생산량을 증대시키기 위하여 TkSCD(T. kingsejongensis Stearoyl-CoA deasaturase)의 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용할 경우 스테아로일-CoA 불포화효소의 생산 효율이 증대됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 스테아로일-CoA 불포화효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 스테아로일-CoA 불포화효소의 제조방법은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 스테아로일-CoA 불포화효소를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 스테아로일-CoA 불포화효소를 회수하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, TkSCD(T. kingsejongensis Stearoyl-CoA deasaturase)의 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용할 경우 바이오에너지 원료 생산을 비롯한 기타 산업적 용도가 다양한 불포화 지방산인 팔미톨레산(palmitoleic acid, C16:1) 및 올레산(oleic acid, C18:1)의 생산 효율이 증대됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 불포화 지방산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 불포화 지방산의 제조방법은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 불포화 지방산을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 불포화 지방산을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 불포화 지방산은 팔미톨레산 및/또는 올레산일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 티그리오푸스 킹세종엔시스 수집

남극 요각류인 티그리오푸스 킹세종엔시스는 남극 세종기지(62°13'S, 58°47'W) 주변 조간대(intertidal zone)에서 수집하였다. 티그리오푸스 킹세종엔시스는 현미경 관찰(Leica M205C, Leica Microsystems, Mannheim, Germany)로 약 1mm의 크기(꼬리 제외)를 나타낸다(도 1). 균주는 멸균 유리 파스퇴르 피펫(Pasteur pipettes)을 이용하여 단일 성체의 수집에 의해 단리하였다. 티그리오푸스 킹세종엔시스를 여과된 남극 해양수에서 배양하고, 진탕 없이 클로렐라(Chlorella sp.)((주)단양클로렐라에서 구입)을 공급하였다. 티그리오푸스 킹세종엔시스는 빛 강도 25μmol photon m^-2s^-1 및 16시간 빛/8시간 암 주기 하에서 배양하고, 추가적인 실험까지 3℃로 유지하였다.

실시예 2: 티그리오푸스 킹세종엔시스 스테아로일-CoA 불포화효소 개방형 해독틀의 분리

스테아로일-CoA 불포화효소 유전자(TkSCD-1 및 TkSCD-2) 서열을 한국극지연구소(Korea Polar Research Institute; KOPRI)의 남극 게놈 프로젝트 중 티그리오푸스 킹세종엔시스 전사체로부터 얻었다. TkSCD-1 및 TkSCD-2는 개시 및 종결코돈을 포함하여 각각 1,110 bp (서열번호 3) 및 681 bp 길이이다. 상응하는 ORF(open reading frame)에 의해 유추되는 TkSCD-1 및 TkSCD-2 서열은 각각 43 kDa 및 26 kDa 분자량의 단백질을 만드는 369개(서열번호 1) 및 226개(서열번호 2)의 아미노산으로 구성된다.

SCD 유전자를 코딩하는 개방형 해독틀(open reading frame; ORF)를 분리하기 위하여, 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit를 이용하여 제조사(Qiagen)의 프로토콜에 따라 추출하였다. T. kingsejongensis RNA의 준비 후, 상보적 DNA(complementary DNA; cDNA)를 SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase(Invitrogen사)을 이용하여 RT-PCR에 의해 합성하였다. 각 SCD에 특이적인 두 프라이머 쌍을 주형 cDNA를 증폭하기 위하여 사용하였다(표 1).

프라이머	프라이머 서열(5' → 3')	서열번호
TkSCD-1_pET32_For	GCGGGAATTCATGAGCACTGAGACAGTCACTCAGGC	4
TkSCD-1_pET32_Rev	GCGGCTCGAGTTACAGCTCCTTCTTGGGTACATAGGT	5
TkSCD-2_pET32_For	GCGGGAATTCATGGAATATCCGTCGGTGGAAAAGGT	6
TkSCD-1_pET32_Rev	GCGGCTCGAGTTAAGCCATGAGTCTCGACCAAGGGGC	7

상기 표 1의 프라이머 서열에서 밑줄은 pET-32 발현벡터에 라이게이션하기 위한 제한효소 부위이다.

증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사하였다. 정제된 PCR 산물을 pTA-TOPO 벡터(닥터프로틴, 한국)에 라이게이션하고, DH5α E. coli 수용성 세포(competent cell)(엔지노믹스 사, 한국)에 형질전환하였다. E. coli 형진전환체로부터 추출한 플라스미드 DNA를 DNA 시퀀싱(마크로젠, 한국)에 의해 분석하였다. tBlastx를 이용하여 TkSCD-1 및 TkSCD-2를 NCBI의 서열과 비교하여 확인하였다. 신호펩티드를 식별하기 위해 SignalP(Petersen et al., 2011. Nat Methods 8:785-786), TMpres(Hofmann and Stoffel, 1993. Biol Chem Hope-Seyler 374) 및 두 TkSCD의 막관통 위상(topology)를 예상하기 위해 DAS(Cserzo et al., 1997. Prot Eng 10:673-676)을 이용하여 발현되는 TkSCD-1 및 TkSCD-2의 아미노산서열을 조사하였다.

실시예 3: 아미노산 서열 정렬(alignment) 및 계통발생 분석(phylogenetic analysis)

BioEdit program(Hall, 1999. Nucl Acids Symp Ser 41:95-98)의 ClustalW algorithm(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res 11:4673-1680)을 이용하여 TkSCD 아미노산 서열을 다른 유기체의 아미노산 서열과 비교하였다.

TkSCD-1 아미노산 서열을 비교하기 위해, Caligus rogercresseyi(Cal_roger, ACO10720), Pythium aphanidermatun(Pyt_aphan, AGS55978), Pythium splendens (Pyt_splen, AGC59912), Phytophthora infestans(Phy_infes, XP_002902599) 및 Saprolegnia diclina(Sap_dicli, AAR20444)의 오메가-3 지방산 불포화효소(FAD)를 이용하였다(도 2A).

TkSCD-2 아미노산 서열 정렬(alignment)을 위해, Arabidopsis thaliana(Ara_thali, NP_186907), Trypanosoma cruzi (Try_cruzi, XP_804155), Ashbya gossypii (Ash_gossy, NP_985698), Neurospora crassa (Neu_crass, XP_962923) 및 Mus musculus (Mus_muscu, O88822)의 스테롤 불포화효소(strol desaturase; SD)를 선택하였다(도 2B).

TkSCD-1은 Caligus rogercresseyi (GenBank ID, ACO10720)의 오메가-3 지방산 불포화효소와 52% 서열 유사성을 공유하며, TkSCD-2는 Sandaracinus amylolyticus (GenBank ID, AKF03555)의 SD와 49% 서열 유사성을 공유한다.

다른 지방산 효소와 비교하여, TkSCD-1 및 TkSCD-2은 지방산 불포화효소 및 SD와 관련된 두 개의 다른 지방산 효소의 그룹에 속하는 것으로 밝혀졌다(도 3). 이러한 결과는 두 TkSCD가 T. kingsejongensis의 지방산 효소의 다른 유형을 나타낼 수도 있다는 것을 나타낸다.

BlastP algorithm을 이용하여 TkSCD-1 및 TkSCD-2와 높은 유사성을 보이는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 NCBI database를 이용하여 검색하였다(Microcoleus vaginatus, WP_006634013; Neosynechococcus sphagnicola, WP_036533587; Microcoleus sp., WP_015184746; Synechocystis sp., WP_010872924, WP_038019042 및 WP_041429662; Lyngbya sp. PCC8106, WP_009787974; Planktothrix prolifica, WP_026798760; Pseudanabaena sp. PCC8106. WP_026103003; Leptolyngbya sp., WP_023073403, WP_015134446 및 WP_035993872; Pseudanabawna biceps, WP_040689762; Crocosphaera watsonii, WP_007305601; Rivularia sp., WP_015120383; Calothrix parietina, WP_015197146; Scytonema tolypothrichoides, KIJ85050; Calothrix sp., WP_015128827; Nodularia spumigena, WP_006199120; Nostoc sp., WP_015140910 및 WP_010995766; Anabaena variabilis, WP_011320890; Caligus rogercresseyi, ACO10720; Pythium aphanidermatum, AGS55978; Saprolegnia diclina, AAR20444; Pythium splendens, AGC59912; Phytophthora infestans, XP_002902599; Paramecium tetraurelia, XP_001440490; Arabidopsis thaliana, NP_186907; Trypanosoma cruzi, XP_804155; Mus musculus, O8822; Ashbya gossypii, NP_985698; Neurospora crassa, XP_962923).

선택된 아미노산 서열을 정렬 분석으로 동일한 알고리즘에 의해 정렬하였다. 10,000번의 부트스트랩 반복(bootstrap repetition)을 이용하여 간격법(distance method)에 의해 아미노산 관계를 조사하였다. MEGA6 software(Tamura et al., 2013. Mol Biol Evol 30:2725-9)을 이용하여 계통수를 구성하기 위해 UPGMA(unweighed pair group method with arithmetic mean)을 적용하였다.

아미노산 서열의 다중정렬해석(multiple alignment)은 촉매 반응에 중요한 모티프와 관련된 많은 수의 히스티딘 잔기(His residues)로 구성된 세 보존 지역을 밝혔다(Thiede et al., 1986. J Biol Chem 261:13230-13235; Los and Murata, 1998. Biochem Biophys Acta 1394:3-15). 이러한 결과는 TkSCD의 막-관통(membrane-spanning) 특성과 관련되어 있다.

SignaIP program 분석(Petersen et al., 2011. Nat Methods 8:785-786)에 따라, TkSCD에서 신호펩티드가 검출되지 않았고, 이는 TkSCD가 세포 내에 위치할 수 있다는 것을 나타낸다. 히스티딘 잔기로 구성된 보존영역 발견을 기반으로, 세포막 내 TkSCD의 공간배치(topology)를 분석하였다. TMpred(Hofmann and Stoffel, 1993. Biol Chem Hoppe-Seyler 374)로부터 결과는 TkSCD-1의 6개 영역(62-83, 89-106, 119-139, 171-189, 215-233 및 243-262)이 세포막을 관통하고, 반면 N- 및 C-말단은 외막(outer membrane)에 위치하는 것으로 나타났다(도 4A 및 도 5B). TkSCD-2는 막-관통 영역(29-59, 62-84 및 132-153)을 갖지만, 두 말단은 막의 반대편에 위치하는 것으로 예상되었다(도 4B 및 도 5D). 게다가, TkSCD의 막관통 특성은 DAS 프로그램(Cserzo et al., 1997. Prot Eng 10:673-676)의 분석적인 결과에 의해 입증되고, 이는 TkSCD-1 및 TkSCD-2 내 각각 6개 및 3개의 막관통 영역을 나타낸다(도 5A 및 5C).

실시예 4: E. coli 내 재조합 TkSCD 의 클로닝

T. kingsejongensis 유래 SCD의 제한된 양으로 인해 T. kingsejongensis 유래 SCD 활성 특성을 나타내기 위하여, 발현 벡터에 TkSCD-1 및 TkSCD-2를 도입하였다. 또한, 이황화결합의 형성 및 검출을 위하여 잔여 아미노산 태그를 용이하게 하는 티오레독신(Trx)을 코딩하는 핵산을 함께 도입하였다.

Trx-TkSCD를 발현하기 위해 사용되는 유전자 서열을 각각 NcoI와 XhoI 제한효소 부위를 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머(표 1)로 증폭하고, T7 DNA 리가아제(엘피스바이오텍, 한국)를 이용하여 pET32a(+) 발현 벡터로 클로닝하였다. TkSCD-1 및 TkSCD-2 내 시스테인(Cys) 잔기의 많은 수(각각 6개 및 10개의 시스테인 잔기)로 인해 pET32a(+) 발현벡터를 이용하였다.

Trx-TkSCD-1 및 Trx-TkSCD-2를 포함하는 연결된 플라스미드를 DH5α E. coli 수용성 세포(엔지노믹스 사, 한국)에 형질전환하였다. E. coli 형질전환체로부터 추출한 발현 플라스미드를 DNA 시퀀싱(마크로젠, 한국)에 의해 확인하였다. 확인된 플라스미드를 BL21(DE3) 수용성 세포(엔지노믹스, 한국)에 형질전환시키고, 음성 대조군으로서 원형 pET32a(+)를 형질전환시켰다.

실시예 5: 재조합 균주의 배양 및 재조합 TkSCD의 검출

실시예 5-1: 재조합 균주의 배양

실시예 4의 음성대조군(원형 pET32a(+) 도입), Trx - TkSCD -1 도입 대장균 및 Trx-TkSCD-2 도입 대장균을 100 μg/ml 농도의 암피실린을 포함하는 LB broth에 접종하고, OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 지속적으로 흔들면서 37℃에서 배양하였다. IPTG (이소프로필 β-D-thiogalactopyranoside) 최종농도 1mM를 배지에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 연속적으로 진탕 배양하였다.

실시예 5-2: 재조합 Trx-TkSCD의 검출

상기 실시예 5-1에서 배양된 재조합 대장균을 12% SDS-PAGE로 분석하였다. 전기영동 후, SDS-PAGE 겔을 쿠마시 염색 용액으로 염색하여 재조합 대장균의 단백질 밴드를 보이게 하고, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 발현된 재조합 Trx-TkSCD를 검출하였다.

단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에 분리시키고, 반 건조 전달 계측기(semi-dry transfer instrument)(Atto, 일본)을 이용하여 PVDF(polyvinylindene fluoride) 막(Millipore, 미국)으로 옮겼다. 마우스에서 형성한 상업용 항-His 항체 및 항-마우스 IgG-겨자무과 산화효소(Young-In Frontier, 한국)을 두 재조합 Trx-TkSCD(Trx-TkSCD-1 및 Trx-TkSCD-2)에 대한 면역 블롯(immunoblot) 분석에 사용하였다. 비색(colorimetric) 웨스턴 블롯 시스템(Opti-4CN Substrate Kit, Bio-Rad, USA)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였고, 재조합 Trx-TkSCD의 발현 및 검출은 각각 3회씩 수행하였다.

재조합 Trx-TkSCD-1 및 Trx-TkSCD-2에 대해 각각 61 kDa 및 44 kDa의 분자량을 가질 것으로 예상하였다. 하지만, 두 Trx-TkSCD에 대해 예상한 분자량을 나타내는 발현된 단백질이 쿠마시 염색에 의해 crude sample에서 검출되지 않았다(도 6A). 그러므로, 세심한 검출을 위해 면역 블롯을 수행하였다. 그 결과, 두 Trx-TkSCD에 상응하는 재조합 단백질의 예상 크기로 검출하였다(도 6B).

실시예 6: 지방산 구성의 조사

음성 대조군, Trx-TkSCD-1 도입 대장균 및 Trx-TkSCD-2 도입 대장균 내 지방산의 조성 변화를 가스 크로마토그래피를 이용하여 FAME 분석에 의해 조사하였다. 불꽃이온화검출기(flame ionization detector) 및 모세관 컬럼(capillary column)(Agilent, 미국)이 장착된 가스 크로마토그래피(YL-6100GC, 한국)를 이용하여 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl ester; FAME) 분석에 의해 각 TkSCD로부터 유발된 지방산 구성을 조사하였다.

실시예 5에서 배양한 각 대장균을 원심분리 후, LB broth를 완전히 제거하고. 동결건조(freeze-dried) 시켜 각 샘플(20mg)을 지방산 분석에 이용하였다. 준비된 유기상을 glass vial에 로딩하고, 지방산 성분을 분석하였다. FAME 분석을 (1) 3ml/min 정량모드(constant flow mode), (2) 5분 동안 100℃에서 배양하고 온도를 240℃(4℃/min)까지 증가시킨 다음 20분 동안 프로그램을 홀딩 및 (3) 250℃ 검출기 온도의 각 단계로 수행하였다.

각 크로마토그래피 피크를 지정하고 표준으로 Supelco 37 Component FAME Mix(Sigma, 미국)를 사용하여 양을 나타냈다. 내부표준(C22:0 1mg)의 가스 크로마토그래피(Sigma, 미국)로부터 크로마토그래피 피크의 통합에 의해 전체 지방산 양을 평가하였다. E. coli 세포로부터 생산율을 단위(mg) FAME/g 건조중량으로 나타내었다. 재조합으로 발현되는 대장균에서 추출한 각 지방산 샘플을 가스 크로마토그래피 분석을 3회 수행하였다.

벡터만 발현하는 E. coli (음성 대조군), Trx - TkSCD -1 도입 대장균 및 Trx - TkSCD -2 도입 대장균의 건조 중량 20mg으로부터 전체 지방산을 추출하였다. 대조군, Trx - TkSCD-1 도입 대장균 및 Trx - TkSCD-2 도입 대장균에서 각각 34.33±3.74, 47.96±3.66 및 37.89±2.54 mg/g DCW의 농도의 전체 지방산이 생성되었다(표 2). FAME 표준과 비교에 따라, 크로마토그램에 팔미톨레산(C16:1, n-7) 및 올레산(C18:1, n-9)에 상응하는 두 지방산 피크가 나타났다(도 7). 각 크로마토그래피 피크의 정량분석으로부터, 두 TkSCD 유전자의 유도에 따라 팔미톨레산(C16:1, n-7) 및 올레산(C18:1, n-9)의 농도가 증가하였다. 음성 대조군의 팔미톨레산 농도와 비교하여, Trx-TkSCD-1 도입 대장균 및 Trx-TkSCD-2 도입 대장균에서 각각 팔미톨레산이 2.30 및 0.20 mg/g DCW의 향상을 나타냈다(표 2). 음성 대조군과 비교하여 올레산 농도는 Trx-TkSCD-1 도입 대장균 및 Trx-TkSCD-2 도입 대장균에서 각각 8.87 mg/g DCW(17.7배) 및 4.81 mg/g DCW(10.1배) 증가하였다(표 2). 대조군, Trx-TkSCD-1 도입 대장균 및 Trx-TkSCD-2 도입 대장균의 C16:0 대 C16:1 전환율은 각각 4.85, 12.45 및 5.95%로 계산되고, C18:0 대 C18:1은 각각 19.13, 74.28 및 69.17%로 계산되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC18465P 20160427

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Stearoyl-CoA Deasaturase Derived from Tigriopus kingsejongensis and Use Thereof <130> P16-B140 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tigriopus kingsejongensis Stearoyl-CoA Deasaturase-1 <400> 1 Met Ser Thr Glu Thr Val Thr Gln Ala Ala Asn Gly Ala Glu Lys Phe 1 5 10 15 Ser Glu Val Asp Phe Gln Lys Gly Val Pro Gln Lys Val Pro Ser Ile 20 25 30 Leu Glu Ile Lys Lys Ala Leu Pro Ala His Cys Phe Gln Pro Asp Leu 35 40 45 Ser Thr Ser Phe Tyr Tyr Met Phe Lys Asp Leu Ala Leu Val Ala Gly 50 55 60 Leu Tyr Ile Val Met Leu Leu Met Glu Ile Gln Pro Phe Phe Trp Leu 65 70 75 80 Gln Ala Ala Tyr Thr Pro Ile Tyr Trp Tyr Val Cys Gly Thr Leu Gly 85 90 95 Ala Ser Ile Phe Ile Val Gly His Asp Cys Gly His Glu Ser Phe Ser 100 105 110 His Asn Ser Leu Ile Asn Asp Ile Val Gly Asn Phe Met His Thr Ile 115 120 125 Ile Leu Val Pro Tyr Tyr Pro Trp Lys Leu Ser His Arg His His His 130 135 140 Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Lys Asp Glu Val Phe Tyr Pro Val Arg 145 150 155 160 Glu Thr His Ile Gly Gln Asp Pro Gly Phe Met Ile Pro Tyr Phe Gly 165 170 175 Leu Gly Val Gly Trp Ile Phe Tyr Leu Phe Lys Gly Tyr Ser Pro Arg 180 185 190 Thr Ile Asn His Phe Asn Pro Phe Asn His Leu Phe Ile Lys His Ser 195 200 205 Val Asn Cys Leu Ile Ser Met Ala Cys Met Ala Ala Trp Ile Ser Phe 210 215 220 Val Ile Val Pro Tyr Gly Ser Ala Phe Gly Phe Thr Arg Leu Phe Val 225 230 235 240 His Tyr Leu Met Pro Val Phe Ser Phe Met Cys Trp Ile Val Phe Ile 245 250 255 Thr Phe Leu His His His Asp Glu Asn Val Pro Trp Tyr Ala Asp Asp 260 265 270 Lys Trp Asp Phe Val Arg Gly Gln Leu Ser Ser Val Asp Arg Asp Tyr 275 280 285 Gly Trp Ala His Asp Val Leu His Asn Ile Gly Thr His Gln Ile His 290 295 300 His Leu Phe Ser Lys Ile Pro His Tyr His Leu Glu Glu Ala Thr Gln 305 310 315 320 Val Phe Arg Glu Gln Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys Ser Asp Glu Arg 325 330 335 Leu Ile Pro Ala Phe Val Arg Leu Phe His Met Phe Ser Glu Gln Val 340 345 350 Trp Ile Pro Ser Glu Thr Lys Ile His Thr Tyr Val Pro Lys Lys Glu 355 360 365 Leu <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tigriopus kingsejongensis Stearoyl-CoA Deasaturase-2 <400> 2 Met Glu Tyr Pro Ser Val Glu Lys Val Arg Asp Glu Ile Arg Gln Thr 1 5 10 15 Val Lys Gly Met Leu Cys Ala Thr Phe Cys Pro Ala Leu Ser Leu His 20 25 30 Leu Ala Ser Thr Gly Ala Leu Gly Gly Ile Ser Lys Ala Phe Cys Gly 35 40 45 Trp Gly Asp Tyr Ser Leu Ala Tyr His Ala Ala Ser Leu Leu Ile Ile 50 55 60 Leu Val Gly Ser Asp Phe Tyr Glu Phe Ala Tyr His Arg Leu Gly His 65 70 75 80 Val Asn Phe Thr Phe Trp Thr Gln His Lys His His His Val Phe Tyr 85 90 95 Asn Pro Ser Pro Phe Ser Val Ile Ala Asp Glu Trp Ile Asp Gln Phe 100 105 110 Phe Arg Ser Ala Pro Leu Leu Leu Phe Pro Ile Leu Met Pro Val Asn 115 120 125 Ile Asp Ala Met Phe Val Met Tyr Ala Ile Met Phe Tyr Phe Tyr Gly 130 135 140 Val Tyr Leu His Cys Gly His Glu Leu Ser Phe Leu Ser Ala His Asn 145 150 155 160 Ala Ile Met Asn Thr Ser Phe Gln His Tyr Cys His His Ala Arg Ser 165 170 175 Ser Met Asn Arg Pro Tyr His Cys Gly Phe Phe Val Lys Ile Trp Asp 180 185 190 Asp Leu Phe Gln Cys Ile Tyr Pro Lys Asp Lys Cys Phe Cys Ala Glu 195 200 205 Cys Ser Arg Ala Lys Gly Glu Arg Thr Leu Ser Ala Phe Lys Lys Val 210 215 220 Gln Ile 225 <210> 3 <211> 1110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene of Tigriopus kingsejongensis Stearoyl-CoA Deasaturase-1 <400> 3 atgagcactg agacagtcac tcaggctgcc aatggagcgg agaagttctc ggaggtggat 60 ttccagaagg gagtccccca gaaggtgccg agcatcttgg agatcaagaa ggctctcccg 120 gctcactgct tccaaccgga tctgagcacg tccttctact acatgttcaa ggatttggcc 180 ttggtggctg gcctctacat cgttatgttg ctcatggaga tccagccctt cttctggctt 240 caagctgcct acacgcccat ctattggtat gtgtgtggca ccctgggggc ctctatcttc 300 atcgtgggcc atgactgtgg gcacgagtca ttttcccaca acagcctcat caatgacatt 360 gtgggcaact tcatgcacac catcatcctg gtgccttatt atccttggaa gttgtctcat 420 cggcaccatc acaagaacac cgggaacatc gacaaggacg aggtcttcta cccagtgcgg 480 gagacccaca taggccagga ccccggtttc atgatcccct 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36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TkSCD-2_pET32_Forward primer <400> 6 gcgggaattc atggaatatc cgtcggtgga aaaggt 36 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TkSCD-2_pET32_Reverse primer <400> 7 gcggctcgag ttaagccatg agtctcgacc aaggggc 37

Claims (9)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 티그리오푸스 킹세종엔시스 (Tigriopus kingsejongensis) 유래의 스테아로일-CoA 불포화효소.
   
2. 삭제
3. 제1항의 스테아로일-CoA 불포화효소를 코딩하는 핵산.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
   
5. 제3항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
   
6. 제3항의 핵산 또는 제5항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
   
7. 다음 단계를 포함하는 스테아로일-CoA 불포화효소의 제조방법:
   (a) 제6항의 재조합 미생물을 배양하여 스테아로일-CoA 불포화효소를 생성하는 단계; 및
   (b) 상기 생성된 스테아로일-CoA 불포화효소를 회수하는 단계.
   
8. 다음 단계를 포함하는 불포화 지방산의 제조방법:
   (a) 제6항의 재조합 미생물을 배양하여 불포화 지방산을 생성하는 단계; 및
   (b) 상기 생성된 불포화 지방산을 회수하는 단계.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 팔미톨레산(palmitoleic acid) 및 올레산(oleic acid)을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

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