KR102054390B1

KR102054390B1 - 북극 미세조류 유래 신규 얼음결정 생성억제 단백질 및 그 용도

Info

Publication number: KR102054390B1
Application number: KR1020180022891A
Authority: KR
Inventors: 이정은; 김상희; 박현; 이형석; 최한구; 조성미; 조호진
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2019-12-11
Also published as: KR20190102470A

Abstract

본 발명은 북극 미세조류인 Chloromonas sp. KNF032 유래의 신규 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 저온 내성을 가지는 형질전환 식물체에 관한 것으로, 본 발명에 따라 제작된 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 유전자로 형질전환된 식물체는 저온 또는 동결 내성을 가지고 있어, 작물의 성장 향상과 수확량 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

북극 미세조류 유래 신규 얼음결정 생성억제 단백질 및 그 용도{Novel Ice Recrystalization Inhibiting Protein from Artic Microalgae and The Use thereof}

본 발명은 북극 미세조류 유래 신규 얼음결정 생성억제 단백질에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 북극 미세조류인 Chloromonas sp. KNF032 유래의 신규 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질 및 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 저온 내성을 가지는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

Psychrophilic 조류는 0-4℃의 저온에서 내성을 가지고 성장하며, 15℃ 이하에서 최적 성장률을 보이는 종으로, 극지방의 설원, 빙하 지역 및 담수호에 성공적으로 적응한 종이다(Leya et al., FEMS Microbiol Ecol. : 67, 432, 2009). 그러나 이들 조류는 자연에서 여전히 저온, 동결-해동의 반복, 광선 조사, 건조, 낮은 pH 및 영양 불균형 등의 극심한 비생물적 스트레스 요인에 대처할 필요가 있다. 담수 조류가 지속적으로 빙점 근처의 온도에 노출되면, 얼음 결정이 성장하고, 이는 세포를 둘러싸고 있는 물의 반복된 동결-해동 사이클로 인하여 세포에 심각한 물리적 손상을 일으킬 수 있다. 얼음 결정의 크기와 모양은 주위 온도와 결정 성장 과정에서의 온도에 대한 노출 시간의 영향을 받는다. 세포 내 또는 세포 외 얼음 결정이 성장하기 시작하면 탈수와 함께 세포가 파손되어 극지 생물에 심각한 손상을 입힌다.

얼음결합단백질(IBP, Ice-binding protien)은 얼음 결정의 평면에 결합할 수 있는 세포보호 단백질로, 활성에 따라 부동화 단백질(AFP, antifreeze protein), 부동 당단백질 (AFGP, antifreeze glycoproteins) 또는 얼음 재결정 억제 단백질 (IRIPs, ice recrystallization inhibiting protein)로 불리며, 곤충, 다년생 식물, 균류, 효모, 해빙 규조류, 녹조류 및 박테리아를 포함하여 다양한 psychrophilic 및 psychro-tolerant 생물체에서 많이 발견된다(Raymond et al.,J Phycol : 42, 410, 2006)

이들 유기체에서 보고된 IBP는 결빙온도를 해빙온도보다 낮추는 온도이격활성(thermal hysteresis, TH) 및 얼음 재결정 저해 (ice-recrystalization inhibition ,IRI) 활성을 나타낸다. 남극 어류 및 곤충의 AFPs 또는 AFGP에서 기술 된 TH 활성은 융점 이하의 빙점을 낮추므로 얼음 결정이 저온에서 형성된다. 반면에, IRIS에서 일반적으로 동결 내성 식물 및 미세조류의 IRI 활성은 영하의 온도에서 얼음 결정의 성장을 억제하여, 세포 외 또는 세포 내 얼음 결정의 입자를 작게 유지시킨다.

IBP의 구조 및 생화학적 기작에 대한 연구에 따르면, 모든 IBP가 얼음 결합 친화력을 공유하지만 구조적 다양성이 존재하므로 독립적인 계통에서 유래한 것으로 생각되어왔다. 콜웰리아(Colwellia) 및 플라보박테리움 (Flavobacterium)의 세균성 IBP가 일부 종에서 IBP의 기원이라는 흥미로운 가설이 제기되었다. 이들 단백질은 X 선 분석을 통해, 알파 나선과 함께 베타 솔레노이드 폴드를 포함하는 기능이 알려지지 않은 3494 도메인(DUF3494)을 포함하는 것으로 확인되었으며, 이 도메인 구조는 진균, 북극 효모, 담녹조강(prasinophytes), 규조류 및 남극 녹조류의 IBP에서도 발견된다. 이들 단백질은 서로 높은 서열 유사성을 나타내었으며, 이러한 유형의 IBP 단백질은 박테리아로부터의 수평 유전자 전이를 통해 전이되었다고 여겨진다다(Raymond et al.,J Phycol : 53, 848, 2017). 그러나 베타-솔레노이드 형태를 갖는 IBP의 다른 유형은 월동 식물 및 곤충에서 발견되었으나, 이들 사이의 상동성은 매우 낮으며, 이러한 서열과 구조의 다양성은 기원이 다른 아직 발견되지 않은 IBP가 존재할 가능성을 시사한다.

한편, 남극 녹색 조류, Chlamydomonas sp. CCMP681, Chlamydomonas raudensis UWO241 및 Chloromonas brevispina의 IBP 다양성에 대해서 집중적으로 연구되어왔다(Raymoond et al.,PLoS One : 8, e59186, 2013) 상기 조류 IBP는 높은 IRI 활성을 갖는 세포외 단백질로 확인되었으며, 세포 주위를 액상으로 유지시키는데 역할을 할 것으로 생각된다. Chlamydomonas raudensis UWO241과 Chloromonas brevispina는 각각 9개와 11개의 isoform을 가지고 있으며, 확인된 모든 isoform 유전자는 DUF3494 도메인을 포함하고 있다. 그러나, Chlamydomonas sp. CCMP681 유래의 4개의 isoform은 intron-present 유전자 구조를 가지고 있으며 예측 가능한 영역을 가지고 있지 않지만, 곤충 AFPs 및 식물 IRIPs와 같이 얼음 결합 부위로 작용한다고 생각되는 보존된 Thr-X-Thr 모티프를 가지고 있다. 따라서, Chlamydomonas sp. CCMP681의 IBPs은 박테리아가 아닌 다른 혈통에서 비롯된 것일 가능성이 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 얼음결정 생성 억제능을 가지는 단백질을 개발하고자 노력한 결과, 북극 미세조류인 Chloromonas sp. KNF032의 전사체 분석을 통하여, 세균 유래 IBP와는 구조가 다른 CmIRIP1 단백질을 선별하였으며, 상기 단백질을 코딩하는 유전자로 형질전환된 애기장대 식물이 CmIRIP1 단백질의 발현에 의하여 동결방지효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 새로운 얼음결정 생성 억제능을 가지는 단백질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 저온 또는 동결 내성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 CmIRIP1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자가 도입된 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자가 도입된 저온 또는 동결 내성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 CmIRIP1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 CmIRIP1 단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 CmIRIP1 단백질을 수득하는 단계.를 포함하는 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질을 포함하는 세포동결보존제를 제공한다.

본 발명에 따라 제작된 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 유전자로 형질전환된 식물체는 저온 또는 동결 내성을 가지고 있어, 작물의 생장 향상과 상품성 증대 등에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 CmIRIP1 mRNA의 저온 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 것으로, A는 8℃에서 배양한 Chloromonas sp. KNF032를 각각 4℃, 8℃, 12℃, 16℃ 및 20℃로 옮겨 1주이상 배양한 후, RNA-Seq을 수행하여, IRIP1의 상대적 발현량을 RPKM 값으로 표현한 결과를 나타낸 것이고, B는 냉각 온도인 8℃에서 배양한 Chloromonas sp. KNF032를 동결 온도인 0℃로 옮긴 후 CmIRIP1의 발현의 변화를 매일 모니터링한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 CmIRIP1 단백질의 다중 서열 얼라이먼트(multiple-sequence alignment) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 CmIRIP1 단백질의 계통분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CmIRIP1의 3차원 단백질 구조 (beta-solenoid) 예상(A) 및 TXT repeats(B)를 나타낸 것이다.
도 5는 CmIRIP1 재조합 단백질의 재조합 단백질 정제(A) 및 IRI (Ice Recrystalization Inhibition, 얼음재결정억제)효과(B)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 CmIRIP1을 과발현하는 애기장대 형질전환체 제작을 위한 바이너리벡터를 나타낸 것이다.
도 7의 A는 CmIRIP1 형질전환체에서 CmIRIP1의 과발현을 확인한 결과를 나타낸 것이고, B는 CmIRIP1 과발현체의 세포추출물의 얼음재결정 억제효과를 야생형과 비교한 결과를 나타낸 것이고, C는 CmIRIP1 과발현체의 결빙에 따른 이온용출을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

Chloromonas 속은 Chlamydomonadaceae에서 두 번째로 큰 그룹이며, 이들 중 남극, 북극 및 고산 지역의 눈 지역 및 담수에서 발견되는 몇몇 종은 호냉성 조류에 속한다. 호냉성 조류의 색소 형성과 지방산 구성 등의 생리 특성에 관하여는 연구되어왔지만, 상기 조류의 게놈 전체에 대한 저온 내성을 가지기 위한 생존 전략에 관한 유전 정보는 거의 알려지지 않았다. 본 발명에서는 노르웨이 스발바르(Svalbard)의 다산(Dasan)역 근처의 담수에서 분리한 호냉성 조류인, Chloromonas sp. KNF032 (KCCPM, KOPRI Culture Collection of Polar Microalgae, strain number: KCCPM-KNF032)를 선택하고, 상기 조류의 온도 변화에 대한 전사체 분석을 통해 상기 조류가 낮은 온도에서 점진적으로 얼음 결합 단백질(IBP, Ice-binding protien)을 생산하는 것을 확인하였다. 또한, 게놈 DNA 서열분석을 통하여, Chloromonas sp. KNF032에는 세균 유래 IBP와는 다른 다중 엑손-인트론 구조로 구성된 적어도 7개의 IBP 유전자 (CmIBP, Chloromonas IBP 라 함)가 존재하고 각 유전자의 프로모터 영역에 식물 시스템에서 보존되고 있는 저온 반응성 시스 요소가 존재하는 것을 확인하였다. 상기 IBP 단백질들은 Chlamydomonas sp.CCMP681의 4 개의 IBP 이소형태와 유사하며, 예측 가능한 도메인 대신에 보존된 Thr-X-Thr (TXT) 모티프를 갖는다. in silico 분석에 의하여 CmIRIP1 단백질이 곤충 AFP 단백질들과 식물 IRIP 단백질에서 얼음 결합 표면으로 작용한다고 알려진 5개의 TXT 모티프로 구성된 평행한 평면을 가진 베타 - 솔레노이드 형태를 보유하고 있음을 확인하였다. 또한 본 발명에서는 CmIRIP를 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis)를 제조하고, 이의 동결 내성과 IRI 활성을 분석하여, CmIRIP1이 형질전환 식물에서, 동결 방지 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질에 관한 것이다.

극지방에서 많은 호냉성 (psychrophilic)과 내냉성(psychrotolerant) 조류가 보고되었지만, 전사 수준에서 이들 조류의 저온 반응은 크게 알려지지 않았다. 본 발명에서는 북극지방에서 발견된 녹조류 Chloromonas sp. KNF032에서 온도가 감소함에 따라 얼음결합단백질 (IBPs)을 생산하는 것을 보여주었다.. IBP의 존재는 3종류의 남극 녹조류인 Chlamydomonas sp. CCMP681, Chlamydomonas raudensis 및 Chloromonas brevispina의 경우에도 밝혀진 바가 있으나, 현재까지 온도 감소에 영향을 받는 IBP 유전자군의 온도별 전사 반응을 보여주는 것은 이번이 처음이다. 또한, Arctic Chloromonas KNF032에서 얼음 결합 부위로 Thr-X-Thr (TXT) 모티프를 갖는 독특한 유형의 녹조류 IBP 유전자군을 발견하였고, 이중 하나인 CmIRIP1이 Arabidopsis thaliana 식물의 내한성을 향상시킬 수 있음을 입증했다.

다른 관점에서, 본 발명은 CmIRIP1 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 CmIRIP1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

지금까지 녹조류에서 저온 반응 경로는 보고된 예가 매우 드물다. 본 발명에서는 Chloromonas sp. KNF032의 전사체 분석과 게놈 분석을 수행한 결과, 흥미롭게도 Chloromonas sp. KNF032가 식물과 유사한 저온 반응 경로를 가지는 것을 확인하였다. 전사체와 게놈 서열의 비교는 각 CmIRIP 유전자의 예측된 프로모터 영역이 식물 저온 / 비생물의 스트레스 반응에 대한 주요 조절 단백질인 CBF, PIF3, ABI 및 WRKY 계열과 같은 전사 인자 단백질에 결합하는 다양한 cis- 요소 서열을 함유하는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 CmIRIP 유전자의 발현이 상기 전사 인자의 상동유전자들에 의해 조절될 수 있음을 나타낸다. 기존에 알려진 조류 IBP 유전자와는 달리, 본 발명의 CmIRIP1은 진핵세포 계통의 유전자들의 특징을 지닌다. . Chlamydomonas raudensis와 Chloromonas brevispina의 IBPs는 박테리아 IBP 유전자에 존재하는 DUF3494 (Domain of Unknown Function 3494)의 보존 도메인을 가지고 있어, 이들 IBP 유전자의 기원은 박테리아 IBP 유전자로부터 수평 유전자 전달을 통해 도입되었을 것으로 생각되어 지고 있다. 그러나 본 발명의 CmIRIP1의 경우 DUF3494는 발견되지 않으며, 얼음결합부위 (IBS)로서 잘 보존된 Thr-X-Thr (TXT) 모티프를 가지고 있다. 또한, 상기 IBS 서열의 Thr 잔기는 TH 활성을 증가시키고 얼음 결정의 형성을 억제하는데 결정적인 역할을 한다 (Jung et al., PLoS One : 11, e0154056, 2016). IBS의 이러한 특징은 곤충, 어류 및 식물과 같은 많은 진핵 생물의 IBP 단백질 군에서 일반적으로 발견된다. 또한, CmIRIP1의 유전 구조는 다중 엑손-인트론으로 나타났으며, CmIRIP1 유전자가 박테리아 유형의 IBP 유전자와 구별되는 진핵 세포 계통으로 진화되어 왔음을 제시한다.

본 발명에서는 CmIRIP1을 과발현하는 형질전환 애기장대(Arabidopsis)를 제조하고, 상기 애기장대 형질전환체가 빙결과 해동이 반복되는 조건에서 식물세포 주변에 생성되는 얼음 재결정의 크기를 감소시키는 얼음 재결정 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명의 CmIRIP1이 과발현된 애기장대 식물체의 경우, 대조군에 비하여 저온에서 이온 용출이 감소되는 것을 확인할 수 있으며, 식물체에 도입된 CmIRIP1의 활성이 형질 전환 식물에서의 동결 내성을 부여하는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, CmIRIP1를 코딩하는 유전자가 도입된 저온 또는 동결 내성을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 CmIRIP1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하여 CmIRIP1 단백질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 CmIRIP1 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질을 포함하는 세포동결보존제에 관한 것이다.

본 발명에서 "과발현"이란 보통상태에서 세포내 해당유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 pET-SLTI66인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 대장균 또는 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된(이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Chloromonas sp. KNF032의 저온 반응성 유전자 분리

담수 녹색 조류, Chloromonas sp. KNF032(극지연구소 미세조류 은행collection No. KCCPM_KNF032)는 북극의 스발바르 (Svalbard) 나이-알레세룬 (Ny-Alsesund)의 다산(Dasan) 기지에서 분리하였으며, 구형이고, staionary phase에서 균체 내에 작은 과립이 많이 관찰되는 특징이 있다.

Chloromonas sp. KNF032는 4℃에서 배양 시에 최대 성장률을 나타내고, 배양 온도가 20℃까지 증가함에 따라 성장율은 서서히 감소하여, 호냉성 조류로 확인되었다(Jung et al., Algae : 31, 61, 2016). 18S rRNA를 이용한 계통수(phylogenetic tree)분석에서, KNF032는 두 개의 남극 녹조류인 Chloromonas sp. CCCryo273-06 및 Chlamydomonas sp. CCMP681 균주와 가까우며, Chloromonas reticulata, Chloromonas brevispina 및 Chloromonas nivalis 등을 포함한 다른 Chloromonas clade와는 상당히 멀리 떨어져 있었다.

본 실시예에서는 저온 조건에서 호냉성 Chloromonas sp. KNF032가 어떻게 잘 성장하는 지를 알아보기 위하여, 전사체(transcriptome) 분석을 통하여, 온도 반응성 유전자를 조사하였다.

균주의 배양은 Bold 's basal medium(BBM)에서 지속적인 빛조건(30μmol photons m-2s-1) 하에서 8℃에서 수행하였다.

8℃(대조 온도)에서 배양한 KNF032를 저온(4 ℃) 및 고온 (12℃ 및 16℃)으로 옮긴 후, 1 주일 동안 각각 배양한 후, 조류세포를 원심 분리하여 수득하고, 수득된 세포를 막자사발 및 액체 질소로 균질화 하였다. 총 RNA 추출은 RNeasy 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.

RNA 무결성 및 농도는 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Germany) 및 Qubit　 RNA Broad-range Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 각각 확인하였다. RNA-Seq 라이브러리를 제작하기 위해 TruSeq RNA 샘플 준비 키트 v2 (Illumina, San Diego, USA)에 각 시료의 총 RNA 1.5μg을 사용하였으며, 라이브러리는 Bioanalyzer를 사용하여 정량화하고 Illumina 지침에 따라 라이브러리 qPCR 정량화 방법을 사용하여 정량화하였다. 정량 후, 동일 비율로 multiplexed하고 Illumina HiSeq Rapid SBS 키트 v2 (2 ㅧ 100 실행)에 로드하였다. 시퀀싱은 HiSeq2500 Sequencer 시스템 (Illumina)에서 수행하였으며, 총 16.2 Gb 의 시퀀싱 데이터가 생성되었다(Q30> 93 %).

드 노보(De novo) 어셈블리는 CLC Genomics Workbench v7.5 소프트웨어 (QIGAEN)를 사용하여 수행하였다. 낮은 품질 시퀀스 (품질 스코어 <0.001, 모호성 <2 bps) 및너무 짧은 시퀀스 (길이> 50 bps) 및 중복을 제외하고 어댑터 시퀀스를 트리밍하여 필터링하였으며, 매개 변수 (word size = 20 및 bubble size = 50, 길이> 200bps)로 조립된 콘티그가 CD-HIT64를 사용하여 클러스터되었으며 이들 콘티그를 대상으로 E-value threshold가 1 ㅧ 10^-5 이하 조건으로 비중복 단백질 데이터베이스에 대해 BLASTX 검색하였고 그 결과, 총 29,631개의 유전자가 어노테이션 결과를 얻었으며 이들 중 5,153개의 유전자가 대조 온도 (8 ℃)와 비교하여 발현의 변화를 보였다. 저온 적응에 관여하는 유전자군을 선별하기 위하여, 그 중 4℃ (4℃ vs 8℃, FDR <0.05, 차이>0)에서 발현이 증가된 유전자를 선택하였다.

그 결과, 101개의 유전자가 저온에서 발현의 차이를 보였고, 62개의 유전자가 NCBI의 NR 데이터베이스 또는 Uniprot 데이터베이스에서 상동유전자를 갖는 것으로 확인되었으며, 저온에서 특이적으로 발현되고 온도가 증가함에 따라 발현이 감소하는 28개 유전자를 확인하였다.

상기 28개 저온 특이적 발현 유전자 중 6 개 (~ 21 %)의 유전자가 얼음 결합 단백질(IBP)로 분석되었다. 이 중 저온 조건에서 현저하게 높은 발현을 나타내는 유전자를 CmIRIP1 유전자로 명명하였다.

도 1의 A에는 8℃에서 배양한 KNF032를 섭씨 4, 8, 12, 16, 20℃로 옮겨 1주이상 배양후 RNA-Seq 분석 결과, CmIRIP1의 상대적 발현량을 RPKM 값으로 표현한 결과를 나타내었으며, B에는 8℃에서 배양한 KNF032를 0℃로 옮긴후 매일 샘플링을 한후 CmIRIP1의 발현의 변화를 모니터링한 결과로서 IRIP1의 발현은 3일 후 최대를 보이며 이후 저온에서 지속되는 것을 확인하였다.

CmIRIP1 유전자는 3 일에 걸쳐 2배 이상 점차적으로 증가하였으며, 이는 상기 유전자가 온도 변화로부터 세포를 보호하는데 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

실시예 2: CmIRIP1의 서열 및 계통분석

CmIRIP1 유전자는 340 내지 415 개의 아미노산 길이로 번역되며, 분자량은 28 kDa 내지 35 kDa 일 것으로 예상된다. CmIRIP1 서열의 BLAST 검색결과, 기존에 보고된 Chloromonas의 ChloroIBP(AHF22079), Chlamydomonas sp. CCMP681유래 4개의 IBP (EU190445-EU190448)와 높은 서열상동성을 보였다(도 2).

계통 발생 분석 및 도메인 구조 예측에 따르면 CmIRIP 유전자는 다른 박테리아, 균류, 효모, 많은 규조류 및 녹색 조류에서 흔히 발견되는 DUF3494를 가진 다른 IBP 유전자와 완전히 별개의 클러스터를 구성하였다(도 3). Chloromonas KNF032와 Chlamydomonas sp. CCMP681은 DUF3494-less 그룹을 구성하고, Chloromonas brevispina, Chlamydomoans raudensis UWO241, 규조류, prasinophyte, 진균류, 효모 및 박테리아의 나머지 IBP는 DUF3494 함유 그룹을 구성한다. DUF3494 함유 IBP 단백질의 기원은 수평 유전자 전이(HGT)를 통해 박테리아에서 유래되었을 것으로 생각되고 있다(Raymond J and Morgan-Kiss R. PlosOne : 8, e59186, 2013; Raymond J. Extremophiles : 18, 987, 2014).

도 3에 나타난 바와 같이, CmIRIP1은 DUF3494 (Domain of unknown function3494) 도메인을 갖고 있지 않으며, Signal peptide를 보유하고 있는 단백질이며, 단백질 서열 기반의 Neighbor-Joining 계통수를 구축한 결과 DUF3494 도메인을 포함하고 있는 규조류, 녹조류, Prasinophyte, 균류 및 박테리아의 Ice Binding Protein (IBP) 단백질군으로부터 계통적으로 독립된 그룹으로 확인되었다.

따라서, 이 결과는 본 발명의 CmIRIPs와 CCMP681 IBP가 박테리아가 아닌 독립적인 혈통에서 진화되었을 가능성이 있음을 시사한다. CmIRIP 개별 유전자의 경우 N 말단 시그널 펩타이드 또는 transmembrane(TM) 도메인을 가진다. CmIRIP1 및 CmIRIP7은 CCMP681 IBP4와 그룹화되고, CmIRIP2는 ChloroIBP AHF22079와 100% 동일성으로 발견되고 CCMP681 IBP1과 그룹화된다. 반면, CmIRIP3와 CmIRIP5는 N- 말단 신호 펩타이드가 없는 TM 도메인을 가지며 나머지 CmIRIP 단백질은 IBP3와 CCMP681 IBP2로 그룹화 된 N- 말단 시그널 펩타이드만 가지고, CmIRIP4와 CmIRIP6는 CCMP681 IBPs와는 독립적인 그룹으로 나뉘어진다.

실시예 3: CmIRIP1의 단백질 구조 분석

CmIRIP1의 3차원 단백질구조를 예측하기 위해 Phyre2 sever ()를 이용하였다. CmIRIP1의 372개 아미노산 서열을 서버에 입력하면 UniProtKB/TrEMBL 단백질 데이터베이스를 활용하여 서열간의 정렬이 가능한 구간을 최대로 하는 단백질을 주형으로 하여 query 단백질의 3차원 구조를 예측가능하였다. 검색결과 CmIRIP1은 lyase (PDB id: c5gkdA)와 single-stranded right handed beta helix (PDB id: d1ru4a)와 높은 신뢰도를 갖는 것으로 나타났다. 두 단백질 모두 다수의 beta-helix가 원통형 구조를 형성하는 단백질로 CmIRIP1의 단백질은 이와 유사한 형태를 갖을 가능성이 가장 높다. 예측된 CmIRIP1의 단백질구조는 PyMOL을 이용하여 수정하였다.

CmIRIP1과 4 개의 CCMP681 IBP의 다중 정렬을 통하여, 7 개의 보존 된 Thr (T) -X-Thr (T) (TXT, X는 Phe 또는 Trp) 모티프를 공유한다는 것을 확인하였다. 다섯 번째 및 일곱 번째 모티프는 각각 TFT, TFT 및 TWT로 완전히 보존되고, 다른 모티프는 1 번째 또는 3 번째 Thr 잔기에서 Lys (K), Ile (I), Ser (S), Val (V) 및 Asp (D)로 치환되어 있었다. 예측 된 이차 구조는 CmIRIP 단백질이 주로 β 시트와 N 말단에있는 소수의 알파 나선으로 구성되며 모든 TXT 모티프는 β 시트 에 포함되어 있음을 보여 주었다(도 4).

도 4에 나타난 바와 같이, Phyre2 웹 포털에 의해 예측된 3 차 단백질 구조는 CmIRIP1 단백질이 β-솔레노이드 형태를 나타내고 세 번째 내지 일곱 번째 TXT 모티프가 병렬로 배열된다는 것을 발견했다. TXT 모티프 3 ~ 7은 곤충 AFP 및 식물 IRIP 단백질에서와 같이 얼음 결합 부위와 같이 작용한다고 여겨지는 소수성 특성을 갖는 평면을 형성하였다. 또한, 곤충 AFP 및 식물 IRIP의 3 차 구조는 많은 IBP의 경우와 같이, 이들 사이의 서열상 동성이 검출되지는 않지만, CmIRIP의 예측된 단백질 구조와 유사하다. 전반적으로, CmIRIP 단백질은 DUF3494 도메인 대신에 기능성 TXT 모티프에 의해 형성된 소수성 평면을 갖는 3차 구조를 가지며, 이러한 생화학적 특성은 Chloromonas brevispina 및 Chlamydomoans raudensis UWO241의 조류 IBP보다 곤충의 AFP 및 식물의 IRIP와 유사한 것으로 판단된다.

실시예 4: 재조합 CmIRIP1 단백질의 정제 및 IRI 활성 측정

CmIRIP1 유전자 코딩부분의 5'말단과 3'말단에 제한효소 BamHI (GGATCC)과 XhoI (CTCGAG)의 인식부위 서열을 추가하여 프라이머를 디자인하였다 (KNF32 CmIRIP1 F BamHI(서열번호 3): CGGGATCCGATGGCCGAGGTCACGTGC, KNF32 CmIRIP1 R XhoI(서열번호 4): CCGCTCGAGCTGGGCCGGGCAGAG). 제작된 프라이머는 저온순응된 Chloromonas sp. KNF032의 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하고 PCR산물의 정제를 수행하였다. 정제된 PCR 산물과 pET22b(+) 플라스미드는 제한효소 BamHI과 XhoI (NEB, England) 1ul씩을 첨가하여 37℃에서 6시간 이상 반응을 시킨 뒤, 정제과정을 수행하였다. 제한효소 절단과정을 통해 sticky 말단이 노출된 PCR 산물과 플라스미드는 T4 ligase를 이용하여 16℃에서 하룻밤 ligation 과정을 수행한 뒤, DH5a 대장균세포에 열충격 방식으로 형질전환을 수행한다. 형질전환된 대장균 세포는 Ampicilin을 포함하는 고체 LB배지에 도말하여 37℃에서 16시간 배양하였다. 단일콜로니를 선별하고 이것을 주형으로 vector의 T7 promoter F 프라이머와 CmIRIP1 R 프라이머를 이용하여 colony PCR을 수행하였다. 1% 아가로즈젤에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하고 형질전환이 이루어진 해당 콜로니를 20ml LB배지 (Amp포함)에 접종하여 37℃ 진탕배양기에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 대장균 세포는 플라스미드 정제를 수행하여 pET22b(+)-CmIRIP1 벡터를 수득하였다. 염기서열분석법을 통해 삽입된 CmIRIP1의 염기서열과 전사시작부위로부터의 코돈프레임을 확인하여 CmIRIP1:His6 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드를 선별하였다. 선별된 플라스미드는 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3) competent cell에 열충격방식으로 형질전환을 수행하여 LB배지 (Amp포함)에 도말한 뒤, 37℃ 배양기에서 하룻밤 배양한 후,. 단일 콜로니를 선별하여 15ml LB배지에 접종하고 37℃ 진탕배양기에서 하룻밤 배양하였다. 대장균의 세포 농도가 OD600=0.1이 되도록 500ml의 LB배지에 접종한 뒤, 37℃ 진탕 배양기에서 2시간 배양하였다. 접종한 대장균의 세포농도가 OD600=0.4~0.6이 되었을 때 50mM의 IPTG를 처리한 뒤, 15℃ 진탕배양기로 옮겨 약 2일간 배양한 후, 배양된 대장균 세포는 원심분리하여 (7000rpm, 4℃, 20분) 상등액을 완전히 제거한 뒤, 수득한 대장균 세포는 단백질 정제과정에 이용할때까지 -80℃ 동결보관하였다. 동결보관된 대장균세포 침전물을 20ml lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH8.0, 100mM NaCl, 10% Glycerol, 0.1% NP40, EDTA-free Protease inhibitor cocktail (Roche))에 현탁한 후, 초음파파쇄기를 이용하여 세포를 용해하였다. 용해된 상등액을 Poly-Prep Chromatography Columns (Bio-Rad)을 이용하여 1ml Ni-NTA agarose resine (Qiagen)과 결합시킨 후, washing buffer (50mM Tris-HCl, pH8.0, 300mM NaCl, 20mM Imidazole, 10% Glycerol, 0.1% NP40, EDTA-free Protease inhibitor cocktail (Roche))로 3회 가량 남은 상등액을 제거하고 3ml elution buffer (50mM Tris-HCl, pH8.0, 300mM NaCl, 250mM Imidazole)로 Ni-NTA agarose resine에 결합한 CmIRIP:His 단백질을 분리시켜 용해된 용액을 얻었다. Amicon Ultra-15 Centrifugal filter units (Merck)를 이용하여 50mM Tris-HCl (pH8.0)로 버퍼교환을 한 뒤, Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad)를 통해 단백질의 농도를 확인하였다.

단백질의 농도가 0.1mg/ml이 되도록 50mM Tris-HCl (pH8.0)에 희석하고 Linkam THMS600을 이용하여 얼음 재결정형성 억제 현상을 관찰하였다. 재조합 단백질 10μl를 원형의 글라스커버에 올린 뒤, 또 다른 글라스커버로 덮어 얇은 박편 디스크르 만든다. THMS600를 4℃로 맞춘뒤, 디스크를 올리고 다음의 조건을 통해 얼음 결정 형태를 확인하였다.

조건: -20℃에서 5분 (5℃/min), -10℃에서 5분 (2℃/min) 및 -6℃에서 30분 (1℃/min).

설정온도가 -6℃에 도달한 시점과 30분간 -6℃에 노출되었을 때 얼음결정이 재결정화 과정을 거친 정도를 광학 현미경 (Olympus BX2000)을 통해 관찰하였다. 형성된 얼음 결정의 모양과 크기를 통해 재결정 억제화과정의 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이,

얼음 결정의 형성과정은 다음과 같다. 불균등한 혼합물이 첨가된 물의 경우 -20℃에 도달하면 작은 얼음핵(ice nuclei)이 형성된다. -20℃에서 형성된 얼음핵은 온도를 천천히 상승하면서 가해진 에너지에 의해 얼음핵 경계의 물분자 사이의 에너지 균일화 과정을 거치게 된다. 이 과정을 통해 얼음핵은 주변의 얼음핵을 흡수하여 점점 큰 얼음결정 (ice grain)을 형성하게 된다. 얼음결정은 그 경계가 오목하거나 굴곡이 많은 형태를 띄는데 어는점 이하의 온도에서 일정하게 유지되면 얼음은 재결정과정 (ice recrystallization)을 겪게 된다. 얼음의 재결정화 과정은 얼음이 얼고 녹는 과정에 발생하는 에너지에 의해 얼음의 결정이 커지고 결정이 더욱 견고해져 육각 혹은 다각형의 결정모양을 형성하는 것을 의미한다. 따라서 얼음 재결정화과정을 억제하는 물질은 얼음결정의 형성, 얼음결정의 크기가 커지는 것, 얼음결정이 견고해져 다각형을 형성하는 과정을 억제하는 역할을 한다 (Kawahara H. 2013. Chapter 5 in Advanced Topics on Crystal Growth. http://dx.doi.org/10.5772/54535).

본 실시예에서 수행한 얼음재결정 억제현상의 관찰결과, CmIRIP1 단백질은 최초에 형성된 얼음핵이 얼음결정을 형성하는 과정을 강하게 억제하여, 대조군인 buffer나 동일농도의 BSA에 비해 주어진 실험조건 (-6℃, 30분 반응) 동안 얼음핵 상태를 유지하는 것으로 나타났다. 또한 주어진 실험조건 내에 대조군의 buffer나 동일농도의 BSA에 비해 -6℃에서 일부 얼음핵이 녹는 현상도 관찰되었다. 이러한 효과는 얼음핵이 얼음결정으로 커지는 얼음 재결정화과정의 초기단계를 강하게 억제하는 효과로 판단되며, 대조군인 BSA와 비교하여 월등히 강한 얼음 재결정 억제기작을 갖는 것으로 사료된다.

실시예 5: CmIRIP1을 발현하는 형질전환 애기장대 식물의 제작

CmIRIP1 단백질을 애기장대(A. thaliana)에서의 발현시키기 위하여, CmIRIP1의 ORF(open reading frame)를 저온순응시킨 Chloromonas sp.KNF032의 cDNA로부터 PCR로 증폭시켰고 사용한 프라이머는 다음과 같다 (KNF32 CmIRIP CDS F(서열번호 5): ATGGCCCCAGCAGCTGGCACA; KNF32 CmIRIP CDS R(서열번호 6): CTACTGGGCCGGGCAGAGTG).

PCR 반응 조건은 95 ℃에서 2 분간 95 ℃에서 45 초간, 50 ℃에서 45 초간 및 72 ℃에서 1 분간의 35 사이클을 수행한 후, 72 ℃에서 7 분으로 유지하였으며, 증폭된 CmIRIP1단편을 콜리 플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터 및 노파린신타 제(NOS) 터미네이터를 갖는 바이너리 벡터인 pEarleygate203 벡터(Earley et al. Plant J. 45:616) ( 에 삽입시켜, pEarleyGate203-CmIRIP1을 제작하였으며, 시퀀싱에 의하여 구조를 확인하였다(도 6). pEarleyGate203-CmIRIP1를 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101 세포로 형질전환시킨 후의 생성물을 전기 영동에 의해 확인하였다. 아그로박테리움 매개 애기장대로의 형질전환은 플로럴 딥 방법을 사용하여 수행하였다 (Clough SJ and Bent AF. 1998. Plant J. 16:735). pEarleyGate203-CmIRIP1으로 형질전환된 식물을 하이그로마이신(hyugromycin) (50ug/mL)을 함유하는 0.5 MS 배지를 사용하여 선별하였다. pEarleyGate203-CmIRIP1가 도입된 두 개의 독립적인 애기장대 homozygous line (T3)를 선별하였다.

실시예 6: 애기장대 형질전화체의 얼음재결정화 억제능 확인

월동 식물 종에서 분리된 IRIP 단백질의 과발현은 아포플라스트 부위에서 얼음의 재결정화를 억제함으로써 식물 세포가 얼지 않도록 보호하는 것으로 알려져있다 (Bredow M et al. Plant Biotechnol J. (2016) 1-14 doi: 10.1111/pbi.12592). 언급한 바와 같이 녹조류로부터 분리 된 CmIRIP는 식물 IRIP와 유사한 3 차 구조를 가지고 있기 때문에 Arabidopsis 식물에서 과발현될 때 IRIP와 유사한 생리적 활성을 가질 것으로 기대된다.

따라서, 본 실시예에서는 CmIRIP1 유전자로 형질전환된 애기장대 형질전환체가 얼음재결정화 억제효과를 가지는지 확인하였다.

형질전환된 각 애기장대 식물은 빛의 세기가 120umol/m2/s인 조건에서 16시간: 8시간 (명: 암)주기에서 2 주동안 배양한 모종을 사용하였다. CmIRP1 단백질의 조 추출물을 얻기 위하여, 수확된 모종을 액체 질소로 분쇄하고, 200uL의 천연 단백질 추출 완충액 (10mM Tris HCl pH8.0, 25mM NaCl, EDTA-free Proteinase inhibitor (Roche)) 에 첨가하였다. 샘플을 볼텍싱(vortexing) 한 다음 얼음에서 10분간 유지하였다. 12,000rpm으로 10분간 원심분리 한 후, 상등액을 새로운 관으로 옮기고 DC Bradford 분석법 (Bio-Rad, USA)을 사용하여 총 단백질 농도를 계산하였다. 조 추출물은 0.1mg/ml로 제조하였고, IRI 분석은 Linkam THMS600을 이용하여 다음의 조건에서 수행하였다(Kawahara H. 2013. Chapter 5 in Advanced Topics on Crystal Growth. INTECH. http://dx.doi.org/10.5772/54535).

조건 : -20℃에서 5분 (5 ℃/ 분), -10℃에서 5분 (2℃/ 분 ) 및 -6℃에서 30분간(1℃/분). 광학현미경(Olympus BX2000)을 사용하여 얼음 결정 형태를 확인하였다.

그 결과, 도 7의 B에 나타난 바와 같이, CmIRIP1이 과발현된 애기장대 식물체에서 빙결조건과 해빙조건이 반복될 때 대조군보다 식물체 내에서 작은 얼음결정을 생성한다는 것을 확인하였다.

실시예 7: 애기장대 형질전화체의 이온 용출물 측정을 통한 저온 내성 확인

저온 조건에서의 CmIRIP1이 과발현 애기장대 형질전환체의 이온 용출을 분석하기 위하여, 형질전환된 각 애기장대 식물은 빛의 세기가 120umol/m2/s인 조건에서 16시간: 8시간 (명: 암)주기에서 3 주동안 재배한 모종을 사용하였다.

저온 순응 처리를 위해, 형질전환 식물을 연속 빛 조건에서 이틀 동안 4℃ 성장 챔버로 옮겼다. 이온 용출 분석은 Ishitani et al., 1998의 방법을 변형하여 사용하였다(Ishitani M et al., 1998. Plant Cell 10:1151-1161). 애기장대 모종에서 성숙한 두 개의 로제트 잎 (7 번째와 8 번째)을 잘라내어 250uL의 탈이온수가 들어있는 시험관에 넣었으며, 각각의 원하는 온도 처리를 위해 10 개의 잎을 준비하였다. 시험관을 -1℃의 순환 수조에서 1 시간 동안 처리한 다음 빙핵(ice nuclei)을 첨가하였다. 이 후, 온도는 1℃/h로 낮추면서, 온도가 -6 ℃에 도달하면서 순환 수조에서 시험관을 제거하였다. 실험 샘플을 밤새 4℃에서 해동시키고, 대조군 샘플은 밤새 4℃, 암조건에 보관하였다. 모든 잎과 증류수를 10 mL DW와 함께 50 mL 유리관으로 옮기고 밤새 실온에서 진탕하였다. 초기 도전율 (Ci)을 측정한 후, 오토클레이브(autoclave) 후 최종 전도율(Cf)을 측정하였으며, Ci / Cf의 비율을 구하였다. 이 실험은 세 번 반복되었고 유의성은 student-t test (P<0.05)에 의해 추정되었다.

그 결과, 도 7의 C에 나타난 바와 같이, CmIRIP1이 과발현된 애기장대 식물체의 경우, 대조군에 비하여 저온에서 이온 용출이 감소되는 것을 확인할 수 있으며, CmIRIP1의 IRIP 활성이 형질 전환 식물에서의 동결 내성을 부여하는 것을 시사하는 것이다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Polar Research Institute <120> Novel Ice Crystalization Inhibiting Protein from Artic Microalgae and The Use thereof <130> P17-B328 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 372 <212> PRT <213> Chloromonas sp. KNF032 <400> 1 Met Ala Pro Ala Ala Gly Thr Ile Ser Met Arg Trp Ala Leu Pro Ile 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Met Phe Ala Ser Leu Thr Gln Gln Ala Gly Ala Ala 20 25 30 Glu Val Thr Cys Thr Met Asn Ala Ile Ser Gly Val Gln Val Ser Gly 35 40 45 Thr Cys Ser Val Lys Asn Gly Thr Val Val Ala Phe Val Gly Ser Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Ala Gly Thr Asn Ile Thr Tyr Thr Ile Asp 65 70 75 80 Ala Asn Thr Lys Ser Ile Leu Phe Glu Cys Ala Ser Glu Asp Asp Val 85 90 95 Leu Thr Ile Asp Ser Ala Val Tyr Ser Gly Gln Thr Ile Asn Asn Cys 100 105 110 Asp Pro Pro Leu Leu Glu Phe Arg Gly Cys Ser Asn Ala Ala Leu Val 115 120 125 Asn Thr Thr Phe Thr Asp Ile Thr Arg Ser Asn Ala Ala Pro Ser Asn 130 135 140 Cys Gln Leu Ser Gln Tyr Gly Pro Cys Val Ala Val Ile Gly Gly Val 145 150 155 160 Asn Gln Thr Gln Asp Trp Met Phe Ser Met Ser Lys Ser Thr Phe Thr 165 170 175 Ser Val Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro Ser Ala Ile Ser Arg Leu Gly 180 185 190 Gly Gly Leu Ala Val Leu Lys His Glu Ser Val Gly Ala Val Gln Thr 195 200 205 Ile Val Thr Gly Gly Ser Phe Thr Thr Thr Ser Cys Asp Leu Gly Gly 210 215 220 Ala Ile His Thr Thr Asp Ala Ser Leu Lys Val Leu Asp Thr Thr Phe 225 230 235 240 Thr Thr Asn Thr Ala Val Asp Gly Gly Ser Ile Gln Phe Lys Asp Thr 245 250 255 Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gln Val Lys Gln Leu Phe Val Gln Arg 260 265 270 Cys Thr Phe Thr Thr Gln Lys Ala Asn Leu Asn Gly Gly Ser Ile Ala 275 280 285 Val Tyr Gly Gly Asn Val Thr Ile Phe Asp Thr Asp Phe Thr Phe Gly 290 295 300 Arg Ala Thr Glu Gly Asp Cys Val Tyr Leu Asp Ser Cys Ala Ser Tyr 305 310 315 320 His Lys Asp Gln Ile Val Asn Asn Lys Trp Thr Asn Cys Ser Pro Glu 325 330 335 Phe Thr Thr Leu Cys Cys Pro Ala Asn Gly Asn Val Trp Ser Ser Cys 340 345 350 Gly Ile Ala Gly Pro Ala Glu Cys Ser Ala Ala Val Pro Pro Ala Leu 355 360 365 Cys Pro Ala Gln 370 <210> 2 <211> 1119 <212> DNA <213> Chloromonas sp. KNF032 <400> 2 atggccccag cagctggcac aatctcgatg cgatgggcac ttcccattct ggcggcgctt 60 atgttcgcca gcttgacaca gcaggctggc gcagccgagg tcacgtgcac gatgaatgcc 120 atctctgggg tacaagtcag tgggacatgc tccgtcaaga atggcacggt cgttgcattc 180 gtgggctcgg gagctggcag ctacccactg gccggcacaa acatcaccta caccattgat 240 gccaacacca agtccatact ctttgaatgc gcgagtgagg atgacgtctt aaccattgat 300 tcagccgtat acagcgggca gaccatcaac aactgcgacc ctcccctact ggagttccgt 360 ggctgcagca atgcagcttt ggtcaacacg accttcacag acatcacacg cagcaatgct 420 gcacccagca actgccagct cagccagtat gggccgtgcg ttgctgtcat tggaggagtc 480 aaccagactc aagactggat gttttctatg tcaaagagca ccttcacatc agtgattgtc 540 tcgtctctcc agccctctgc aatatctcgt cttggtggcg gtcttgcagt cttgaaacac 600 gagtcagttg gtgcagtgca gaccattgtg acaggcgggt ccttcaccac cacatcatgt 660 gatctgggcg gtgccatcca caccacagac gcatccctga aagtgctgga taccaccttc 720 acgaccaaca ccgcagtgga tgggggctcc atccagttca aggacaccac ggctgctgct 780 gctggtgccc aagtcaagca gctgtttgtg cagcgctgca ctttcacaac acagaaggcc 840 aatctcaatg gagggtcgat tgcagtgtac ggaggcaatg tgacgatctt tgacactgac 900 tttactttcg gacgtgccac cgaaggggac tgcgtgtacc tagactcatg tgccagctat 960 cacaaggacc agattgtgaa caacaagtgg acaaactgct cccctgagtt caccaccttg 1020 tgctgccccg ccaacggcaa tgtctggtcc agctgtggca ttgcagggcc tgccgaatgt 1080 tcagcggcag ttcctcctgc actctgcccg gcccagtag 1119 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgggatccga tggccgaggt cacgtgc 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccgctcgagc tgggccgggc agag 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggccccag cagctggcac a 21 <210> 6 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질.
제1항의 CmIRIP1 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제3항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
제2항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 저온 또는 동결 내성을 갖는 형질전환 식물체.
다음 단계를 포함하는 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질의 제조방법:
(a) 제5항의 미생물을 배양하여 CmIRIP1 단백질을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 CmIRIP1 단백질을 수득하는 단계.
제1항의 얼음결정 생성 억제능을 가지는 CmIRIP1 단백질을 포함하는 세포동결보존제.