KR100772917B1 - 결빙방지용 포로사이라 속 극지 미세조류 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결빙방지 활성을 가지는 포로사이라 속(Porosira genus) 극지 미세조류에 관한 것으로서, 구체적으로는 결빙방지 물질을 생산하여 결빙방지 활성을 가지는 포로사이라 속 미세조류 및 그 배양액을 결빙방지용 첨가제로 이용하는 포로사이라 속 미세조류의 이용방법에 관한 것이다.

결빙방지, 포로사이라 속, 극지, 미세조류

Description

결빙방지용 포로사이라 속 극지 미세조류{Antarctic microalgae Porosira genus for anti-freezing}

도 1은 포로사이라 슈도덴티큘라타(Porosira pseudodenticulata)의 전자현미경 사진이고,

도 2는 포로사이라 슈도덴티큘라타의 결빙방지 활성을 확인한 사진이고,

도 3은 프라질라리아 스트리아튤라(Fragilaria striatula)의 결빙방지 활성을 측정한 사진이고,

도 4는 포로사이라 슈도덴티큘라타의 배양 온도별 클로로필 데이터를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 결빙방지 활성을 가지는 포로사이라 속(Porosira genus) 극지 미세조류에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 결빙방지 물질을 생산하여 결빙방지 활성을 가지는 포로사이라 속 미세조류 및 그 배양액을 결빙방지용 첨가제로 이용하는 포로사이라 속 미세조류의 이용방법에 관한 것이다.

극지 생물을 이용한 결빙방지 물질 검색 및 이용 기술은 분자세포공학기술 분야에 해당하는 기술로 극한지 생물자원을 활용하여 실생활에 이용하고자하는 특징을 가진다(Fletcher, G. L. et al. (2000) Annual Review of Physiology 63: 359-390; Gordon, M. S. et al. (1962) Biological Bulletin 122: 52-62).

결빙방지 단백질 (Antifreeze proteins; 이하 “AFPs”로 약칭함)이란 얼음과 결합하여 얼음 결정이 더 이상 커지는 것을 방지하는 특성을 가진 물질로서 얼음결합 단백질(Ice-binding proteins; 이하 “IBPs”로 약칭함)이라고도 알려져 있으며, 생물이 냉해를 극복하기 위한 기작으로 만들어 내는 물질을 칭한다(DeVries, A. L. et al. (1969) Science 163: 1074-1075; DeVries, A. L. et al. (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913).

AFPs는 얼음결정의 표면과 수소결합을 통해 단단히 결합하고 그 결과 AFPs가 부착되지 않는 곳에서만 비정형적으로 얼음결정의 성장이 일어난다. 따라서 얼음 표면에는 깊은 골짜기(pit)가 생기며, AFPs가 부착된 부위와 부착되지 않는 부위에 뚜렷한 경계를 관찰할 수 있다.

1971년 해산 어류로부터 결빙방지 물질의 존재가 알려진 이후로 꾸준한 연구를 통해 한 종류의 AFGPs(Antifreeze Glycoproteins)와 네 종류의 AFPs의 존재 및 구조가 밝혀졌다 (DeVries, A. L. et al. (1969) Science 163: 1074-1075; DeVries, A. L. et al. (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913; Fletcher, G. L. (1981) Canadian Journal of Zoology 59: 193-201; Chao, H. et al. (1994) Protein Science 3 (10): 1760-1769; Fletcher G. L. et al. (1982) Canadian Journal of Zoology 60: 348-355; Davies, P. L. and Hew, C. L. (1990) FASEB Journal 4(8): 2460-2468; Xue, Y. Q. et al. (1994) J. Mol. Biol. 237 (3): 351-353).

현재, 대구와 넙치를 비롯한 17종의 어류에서 결빙방지물질이 생산되는 것이 알려졌으며, 당근 및 민들레를 비롯한 27종 이상의 고등 식물에서도 결빙방지 물질이 생산되는 것이 알려져 있다(DeVries, A. L. et al. (1970) Journal of Biological Chemistry 245: 2901-2913; Hincha, D. K. et al. (1992) J. Plant Physiol. 140: 236-240; Sun, X. Y. et al. (1995) Can. J. Microbiol. 41 (9): 776-784; Griffith, M. et al. (1997) Physiologia Plantarum. 100 is. 2: 327-332; Smallwood, M. et al. (1999) Biochemical Journal. 340: 385-391).

일반적으로 얼음은 녹는점보다 몇도 이하의 온도에서 재결정화(re crystallization)되는 경향이 있고, 이 때 작은 결정이 사라지고 큰 결정이 형성된다. 이러한 큰 결정은 식물과 같이 생체 세포에 비가역적인 손상을 초래한다. 따라서 식물 AFPs의 주요한 역할은 얼음의 재결정 과정을 저해하여 냉동에 의해 발생될 수 있는 손상을 감소시키는 것이다. 반면 남극 해양 어류의 AFPs는 얼음 결정 성장을 조절함으로써 어류내의 물의 어는 온도를 낮추는 부가적인 온도 이력(thermal hysteresis) 활성을 가진다.

AFPs의 응용 범위는 원핵생물 혹은 진핵생물을 유전적으로 변형시켜 그 전에는 존재하지 않던 AFPs를 생산하게 하는 것으로부터, 분자생물학적 시료에 결빙방지용 첨가제로 사용하는 것에까지 이른다. 시험관내 전사/해독 시스템과 같이 냉동 에 특히 민감한 분자생물학적 시료는 AFPs가 존재함으로써 혜택을 볼 수 있다. 대장균 시료, 효모, 혈소판, 적혈구, 난자 및 정자, 배 등의 전세포(whole cell)는 AFPs의 얼음 재결정 저해 활성에 의하여 보호될 수 있다.

AFPs는 아이스크림과 같은 미세 결정 구조가 바람직한 냉동식품이나, 냉동 과일과 같이 냉동식품의 해동시에도 식품의 상태가 우수하게 보존되어야 하는 냉동 식품에 유용하게 사용될 수 있다. 현재 재결정은 냉동 식품의 맛과 조직에 실질적으로 부정적인 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다.

국제공개 제WO 92/22581호에는 식물에서 분리한 AFPs를 아이스크림에서 얼음 결정형태를 조절하는 데 사용하는 방법이 개시되어 있다. 또한 국제공개 제WO 99/37782호에는 화본과 초본에서 AFPs를 분리하고 이를 아이스크림이나 냉동 요구르트와 같은 냉동 식품에 사용하는 방법을 개시하고 있다. 특히 흥미로운 것은 Lolium AFPs는 고온에서도 안정하다는 것이다. 따라서 파스테리제이션과 같은 고온 처리로 미생물의 증식을 막는 식품 산업분야에도 적용될 수 있다. 또한 AFPs는 정육 산물의 냉동보관 후에도 육질과 향을 보존하는 데 이용가능하다.

얼음 재결정을 변형시키는 능력은 산업적 결정 과정에 널리 이용가능하다. 일 예 로는 약제, 농화학제 및 색소의 생산에서 분리, 정제 및 보관에 이용될 수 있으며, AFPs는 결정 형성의 조절이 강력히 요구되는 설탕 산업에 이용될 수 있다.

결정 구조의 조정이 요구되는 또 다른 분야는 의료 산업이다. AFPs는 세포 손상을 촉진시키는 헥사고날 바이피라미드(hexagonal bipyramids)를 형성하는 성질이 있는 종양에 투여될 수 있다. 이러한 형태의 치료는 수술에 의존하지 않아도 되 며 전통적인 화학요법에 관련된 부작용을 수반하지 않기 때문에 특히 흥미롭다. 통풍이나 신장 결석과 같은 질환에서 결정을 형성하는 것을 조절하는 데에도 적용될 수 있다.

상기와 같이 효과적인 결빙방지 물질 및 신기능성 물질 개발은 향후 의학 및 신소재 산업의 변화를 가져와 그 수요가 증가할 것임에 틀림없다. 결빙방지 물질은 고부가가치 산물로서 의료, 군수, 냉동식품 산업 및 냉해방지 농작물 저장법 등 매우 다양하게 이용될 수 있을 것으로 생각되기 때문이다.

현재 생산되고 있는 결빙방지 물질은 어류로부터 추출하고 있으며, 1g 당 1000 만원의 고가로 판매되고 있다. 하지만, 고가의 결빙방지제는 실제 응용할 수 있는 범위가 매우 광대함에도 불구하고 비용에 따른 부담으로 실생활에 응용되는 가시적 결과가 아직 부족하다.

따라서 고가의 결빙방지 물질의 응용도를 높이기 위해서는 가격단가를 낮추는 노력이 필요하며, 결빙방지 물질을 지속적으로 저가에 생산할 수 있는 대체생물이 필요하다.

극지방에 서식하는 생물 중 호냉성 규조류는 얼음에 서식하며 결빙방지 물질을 만들어 낼 것으로 추정되는 대표적인 하등생물이다. 따라서 본 발명자는 남극에 서식하는 미세조류 중에서 실제 얼음에 부착하는 단백질을 분비하여 결빙을 방지하는 종을 분리하기 위하여 스크리닝하던 중, 결빙방지 활성을 가지는 포로사이라 슈도덴티큘라타(Porosira pseudodenticulata)를 확인하고 이를 분리 동정하여 본 발명을 완성하였다. 본 명세서에 기재된 참고 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 포함 된다.

본 발명은 산업적으로 유용한 결빙방지 물질 및 이를 대량으로 수득할 수 있는 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포로사이라 속(Porosira genus) 미세조류 또는 그 배양액을 포함하는 결빙방지용 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 시료에 포로사이라 속 미세조류 또는 그 배양액을 이용하여 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 포로사이라 속 미세조류를 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 포로사이라 속 미세조류 또는 그 배양액을 포함하는 결빙방지용 첨가제를 제공한다.

본 발명에 따른 포로사이라 속 미세조류는 결빙방지 물질을 생산함으로써 결빙방지 활성을 가지게 되고, 이때 결빙방지 물질은 IBPs이다.

또한 이 균주는 저온 배양시 유사 결빙방지물질(Antifreeze like ice-binding molecules, IBMs)을 분비한다.

일반적으로 AFPs는 식물, 어류, 곤충 및 세균을 포함한 많은 종류의 생물에 서 발견되었다. AFPs는 모두 IBPs이지만 그 구조나 아미노산 서열은 생물체간에 서로 다르다.

IBPs는 얼음에 결합하여 결정이 더 자라는 것을 저해한다. 즉, IBPs는 얼음에 부착하여 그 자리에서(in situ) 얼음의 재결정을 저해하고 수용액의 어는점을 농도-의존적으로 낮추는 특이 생리작용을 가진다. 따라서 이러한 IBPs의 작용은 얼음의 미세구조를 관찰함으로써 확인할 수 있다(Raymond (2000) Polar Biology 23:721-729).

본 발명에 따른 포로사이라 속 미세조류는 남극의 해수와 빙하의 접경지역(sea-ice margin) 해수로부터 분리가능하다.

구체적으로 본 발명에서는 결빙방지 활성을 가지는 포로사이라 속 미세조류를 제공하기 위하여, 남극의 해수-빙하 접경지역에서 미세조류를 채집하고 모세관 분리법으로 단일 세포로 분리하였다. 종의 동정을 위하여 시료를 산으로 처리한 후 전자현미경으로 검경하여 Kozlova 문헌에 따라 포로사이라 슈도덴티큘라타 호세 (Porosira pseudodenticulata Jouse)로 동정하였다(Kozlova. O.G. (1962) Trudy Inst. Okeanol. 61:1-18)(도 1 참조).

본 발명에 따른 포로사이라 슈도덴티큘라타를 2005년 12월 6일에 한국생명공학연구원 부설 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10878BP).

포로사이라 속 미세조류가 결빙방지 활성을 가진다는 사실을 확인하기 위하여, 상기에서 분리 동정한 포로사이라 슈도덴티큘라타를 배양한 배지의 결빙방지 활성을 측정하여 포로사이라 슈도덴티큘라타가 결빙방지 물질인 IBPs을 합성하는지 관찰하였다.

구체적으로 남극에서 분리한 미세조류 포로사이라 슈도덴티큘라타가 결빙방지 물질인 IBPs을 합성하는지 관찰하기 위하여, 2주간 2℃에서 배양한 뒤 세포는 원심분리기를 통해 분리해내고 배양액을 -4℃에서 동결시켜 얼음의 미세구조를 관찰함으로써 결빙방지 활성을 측정하였다.

그 결과 포로사이라 슈도덴티큘라타를 배양한 배지에서는 IBPs가 얼음에 부착하여 얼음결정의 성장을 방해한 골짜기(pit)가 넓은 분포로 관찰되어 이 종은 IBPs를 합성하는 것으로 확인되었다(도 2 참조).

또한 이 균주는 +4 ~ +6℃에서 최대성장을 보이며 -1 내지 12℃에서 지속적인 성장이 관찰되는 저온성 균주로 유사 결빙방지물질을 합성하는 것이 처음으로 밝혀졌다.

포로사이라 속 미세조류에서 결빙방지 물질이 생산된다는 사실은 지금까지 알려진 바 없으며, 따라서 본 발명은 포로사이라 속 극지 미세조류의 결빙방지 활성을 최초로 확인한 것이다.

또한 본 발명은 서열목록 1의 염기서열 또는 그 일부를 포함하는 포로사이라 슈도덴티큘라타의 계통 분류학적 지위를 알아보고자 18S rDNA의 유전자 염기서열을 분석하였다.

일반적으로 18S rDNA는 종에 따라 특이서열을 가지는 것으로 분류학에 이용될 수 있다는 사실이 널리 알려져 있다(Nelson et al. (2001) Cryptogamie Algologie 22: 263-284).

본 발명은 포로사이라 속 미세조류를 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 방법은 ⅰ) 포로사이라 속 미세조류를 배양배지에 접종하는 단계; ⅱ) -10 내지 +15℃에서 배양하는 단계; 및 ⅲ) (ⅱ) 단계로부터 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.

배양배지는 조류(algae)의 배양배지는 모두 이용가능하나 ASW 배지, Aquil 배지(Price, N. M. et al. (1988/89) Biol. Oceanogr. 6:443-462), F/2 배지(Guillard, R. R. P et al. (1962) Com. J. Microbiol. 8:229-239), F/5 배지 , F/10 배지 및 이들을 변형한 배지로 이루어진 군에서 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한 성장률의 급격한 감소 및 사멸 등의 이유로 ASW(artificial sea water) 배지보다는 남극 해수를 포함하는 F/2 배지에서 배양하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 ⅱ) 단계의 배양온도는 조건은 -10 ~ +15℃에서 배양가능한데, -5 ~ +8℃에서 배양하는 것이 바람직하다. 극지 미세조류는 호냉성 이므로 12℃ 이상의 온도에 장기간 노출되면 세포가 사멸하기 때문에 세포의 배양온도는 매우 중요하며, 저온에서의 배양시 세포의 성장률은 다소 감소하나 세포가 IBMs 합성을 촉진한다.

배양 시간에는 제한이 없으나 세포가 지수성장기(exponential growth stage)에 이를 수 있는 시간 이상으로 배양하는 것이 바람직하다. 배양 조건으로는 12 ~ 24시간 광주기로 맞추는 것이 바람직하고, 극지 하계조건을 고려하여 24시간 광주기로 맞추어주는 것이 더욱 바람직하다.

구체적으로 최대 배양이 이루어지게 하기 위하여는 배양조건을 -3 ~ +7℃에 서 24시간 광주기로 14일 이상으로 하는 것이 바람직하며, 흔들어주어서 세포가 광원과 접할 수 있는 확률을 높여주고 가스 교환이 잘 일어나도록 하는 것이 가장 바람직하다.

상기 ⅲ) 단계의 배양액은 미생물을 분리해낸 후 수득한 것이거나 혹은 미생물을 포함한 채로 수득한 것을 포함한다. 즉 본 발명의 포로사이라 속 극지 미세조류는 결빙방지 물질을 생산하여 분비하므로 미생물 그 자체는 물론 미생물을 배양하고 미생물을 분리해낸 후 얻은 미생물 배양액을 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득할 수 있다.

미생물을 분리해 낸 후 배양액을 수득하는 방법으로는 원심분리, 필터링 또는 사이펀(siphon)을 이용하여 미생물을 배양액으로부터 제거하는 것이 가능하다. 미생물을 포함하는 경우에도 미생물을 파쇄한 상태로 포함하거나 intact cell로 포함하는 것 등을 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 포로사이라 속 극지 미세조류는 IBPs를 생산하여 세포외로 분비하기 때문에, 특히 세포를 파쇄하지 않고 연속 배양하면서 IBPs를 수득할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 포로사이라 슈도덴티큘라타 미세조류를 이용하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득하는 또 다른 방법은 ⅰ) 포로사이라 속 미세조류의 AFPs를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 다른 원핵생물이나 진핵생물을 유전적으로 변형시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 형질전환체를 배양하여 이로부터 AFPs를 대량으로 수득하는 단계를 포함한다.

이 때 상기 ⅰ) 단계의 포로사이라 속 미세조류의 AFPs를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 정보는 본 발명에 따른 포로사이라 속 미세조류를 이용하여 당업자간에 주지의 방법으로 획득가능하다.

또한 본 발명은 시료에 포로사이라 속 미세조류 또는 그 배양액을 첨가하여 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는 방법을 제공한다.

이 때 상기 일정 온도는 시료 혹은 시료를 보관하기 위한 용액의 어는점보다 0 ~ 10°낮은 온도를 말하며, 0 ~ 4°낮은 온도에서는 시료의 결빙이 효과적으로 저해된다. 이러한 온도에서는 포로사이라 속 미생물이 생산하는 결빙방지 물질에 의하여 얼음이 재결정화되는 것을 저해하여 시료 및 시료 보관액의 결빙을 저해한다.

상기 시료는 냉동 식품, 약품, 농화학제, 색소 및 생물학적 재료 등을 포함한다.

이 때 냉동 식품으로는 아이스크림, 냉동 과일, 정육 등 낮은 온도에서 보관하는 것이 바람직한 모든 냉동 혹은 저온 보관 식품을 포함한다.

구체적으로 아이스크림, 얼려먹는 요거트, 아이스블랜드, 슬러리 등의 냉동 디저트류에서 AFPs는 시료의 어는 점 이하의 온도에서 얼음 재결정에 의하여 큰 결정이 생성되는 것을 방지함으로써 냉동 식품의 얼음 결정 구조를 미세하게 유지하여 냉동 식품의 맛과 질을 향상시킨다.

또한 냉동 과일, 냉동 야채 및 정육 등의 냉동 혹은 저온보관 식품에서 AFPs는 얼음 재결정 활성을 통하여 식품의 냉동시 큰 결정이 형성되어 식품의 원상태가 파괴됨으로써 냉동 상태로 혹은 해동 후 섭취하는 경우 식품의 맛과 질이 현저히 손상되는 것을 방지한다.

치료 약물, 혈장 및 조직 배양을 위한 포유동물 세포 등과 같은 생물학적 재로에는 냉동과 해동 과정이 세포의 생존능을 크게 감소시키게 되며, 장기 이식시에는 조직을 냉동시키는 것은 살아있는 세포의 기능에 심각한 손상을 초래하게 되며, 식물의 냉해는 농업에 심각한 문제를 발생시킬 뿐 아니라, 약물은 엄격한 온도 조건에서 보존되지 않으면 약효가 파괴되거나 오히려 위험해질 수 있다. 이러한 경우 AFPs는 얼음 재결정 저해 활성을 통하여 생물학적 시료가 급격한 온도 변화에 저항할 수 있게 해 준다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않음은 자명하다.

<실시예 1> 미세조류의 분리 및 동정

세종기지 마리안 소만 빙벽 주변 해역에서 채집한 미세조류는 채집된 즉시 냉암소에 보관하여 실험실로 운반하였다.

이들을 현미경하에서 파스퇴르 파이펫을 이용한 분리법(isolation)을 이용하여 각 한 개의 세포만으로 분리한 뒤 세척(washing)을 통해 이물질을 제거하고, 100㎍ 페니실린으로 정제(purification)하여 무균상태의 미세조류를 분리하였다.

종의 동정을 위하여 시료를 산으로 처리한 후 전자현미경(SEM, Philips 515)으로 관찰한 결과 상기 채집 미세조류는 포로사이라 슈도덴티큘라타 (Porosira pseudodenticulata Jouse)로 확인되었다. Porosira pseudodenticulata 는 단독, 혹 은 뚜껑면에 점액성분의 실에 의해 서로 연결되어 사슬형태의 모양을 가지고 있다. 뚜껑면은 원형이고 직경은 36 - 80 ㎛이며, 두께축 (pervalvar axis)은 10 -30 ㎛이다(Scott and Marchant 2005). 10 ㎛내에 망목 (areolae)은 10 - 12개가 있고, 외부에 노출된 입술돌기는 그 길이가 짧다(Scott F.J and Marchant H. J. Antarctic marine protists 2005 p87).

<실시예 2> 미세조류의 배양

실시예 1에서 분리한 단일 세포들을 우선 F/10 배지와 F/5 배지에서 세척한 뒤, 121℃, 1.5 기압에서 20분간 멸균한 F/2 배지(Guillard, R. R. L. and J. H. Ryther (1962) Com. J. Microbiol., 8: 229-239)에서 장기 배양하였다.

모든 종들은 동일한 조건인 2℃ 배양기(incubator)에서 배양하였으며, 남극 하계기간의 특성에 맞추어 광주기는 24시간 연속으로하여 배양하였다. 한국해양연구원 부설 극지연구소로 운반된 종은 +2 ℃ 저온배양기에서 지속 배양되고 있다.

실시예 1에서 분리한 종은 지수 성장기에 일부 시료를 채취하여 18S rDNA의 일부 염기서열을 분석하였다. 구체적인 분석방법은 세포를 원심분리기를 통해 수확한 뒤 1M tris-buffer로 씻어주고, vortexing 하여 세포를 깨고 전체 DNA 추출 키트(genomic DNA extraction kit)를 이용하여 순수 DNA를 얻었다. 수확된 DNA는 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 18S rDNA 만을 증폭시키고 클로닝하였다. 클로닝 PCR 산물은 정제된 다음 시퀀싱(sequencing) 하여 18S rDNA의 일부 염기 서열을 분석하였다.

그 결과 서열목록 1 또는 그 일부를 포함하는 포로사이라 슈도덴티큘라타의 18S rDNA를 확인하였다.

<실시예 3> 배양 종의 냉해적응성 측정

실시예 1에서 분리된 종의 결빙방지물질 합성 여부는 종을 배양한 배지를 이용해 결빙방지 활성을 측정함으로서 결정할 수 있다. 배양되는 종이 냉해를 극복하기 위한 기작이 있는가를 판단할 수 있는 가장 기본이 되는 방법으로는 최적배양온도 보다 저온에서 배양을 실시하여 비교하는 것이다.

실시예 1에서 분리한 종을 -0.5 내지 +20.5℃의 연속적인 온도 조건에서 남극 여름의 환경 조건에 따라 24시간 광주기 아래에서 연속 배양을 실시한 뒤 포로사이라 슈도덴티큘라타의 성장 패턴을 분석하였다. 구체적으로, 식물플랑크톤 생물량의 지수가 되는 클로로필(Chl a) 농도를 측정하여 성장패턴을 분석 비교하였으며 종의 성장 패턴은 Fluorometer (10-AU)를 이용한 형광분석을 통해 측정된 클로로필 농도 지표로 얻어졌다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이,

또한 4 내지 6℃ 사이가 최적 배양온도이며, -0.5 내지 11.5℃까지 생장가능한 온도였고, 16℃이상 온도에서는 9일 이상 생장하지 못하고 사멸하는 것으로 나타났다.

<실시예 4> 배양 종의 결빙방지 활성 측정

실시예 1에서 분리한 남극 미세조류 포로사이라 속 균주가 유사결빙방지 물질인(Antifreeze like ice-binding molecules, IBMs)을 합성하는지 관찰하기 위하여 2주간 2℃에서 배양 뒤 세포는 원심분리기를 통해 분리해내고 배양액의 결빙방 지 활성을 측정하였다. 측정방법은 레이몬드의 방법을 변형하였다(Raymond (2000) Polar Biology 23:721-729). 레이몬드는 배양된 시료를 이용하지 않고 현장에서 채집한 mixed population에서 측정을 하였기 때문에 이 방법에 따라서는 배양액을 이용한 결빙방지 활성을 측정할 수 없었다. 따라서 본 실험을 통해서는 배지를 분리하고 배지의 염분을 측정한 뒤 레이몬드의 방법과 동일하게 측정하였다. 대조군으로 남극 미세조류인 Fragilaria striatula을 이용하였다.

그 결과 본 발명에 따른 포로사이라 속 균주를 배양한 배지의 경우 IBPs에 의하여 생기는 골짜기가 넓은 분포로 관찰되어 결빙방지 활성이 높은 것으로 확인되었으며 이 종은 IBPs를 합성하는 것으로 밝혀졌다 (도 2 참조). 반대로 대조군인 Fragilaria striatula 는 IBPs에 의한 ice pitting 이 발견되지 않아 결빙방지 활성이 낮거나 없는 것으로 확인되었다(도 3 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 포로사이라 속 극지 미세조류는 냉해를 극복하기 위한 기작중 하나로서 세포내에서 얼음에 부착하는 특성을 갖는 유사 결빙방지물질을 분비하는 것으로 확인되었다.

따라서 상기 미생물을 배양하여 결빙방지 물질을 대량으로 수득할 수 있고, 포로사이라 속 미세조류 혹은 그 배양액은 의료, 군수, 냉동식품산업 및 냉해방지 농작물 저장법등의 산업에서 매우 다양하게 결빙방지용 첨가제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. 포로사이라 슈도덴티큘라타 (Porosira pseudodenticulata)(수탁번호: KCTC 10878BP) 또는 그 배양액을 포함하는 결빙방지용 첨가제.
2. (ⅰ) 포로사이라 슈도덴티큘라타(Porosira pseudodenticulata)(수탁번호: KCTC 10878BP)를 배양 배지에 접종하는 단계;

   (ⅱ) (i)을 -10 내지 +15℃에서 배양하는 단계; 및

   (ⅲ) 상기 (ⅱ)단계로부터 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 포로사이라 슈도덴티큘라타(Porosira pseudodenticulata)(수탁번호: KCTC 10878BP)를 배양한 배양액을 결빙방지 물질로서 대량으로 수득하는 방법.
3. 제2 항에 있어서, 상기 (ⅰ) 단계의 배양배지는 ASW 배지, Aquil 배지, f/2 배지, f/5 배지, f/10 배지 또는 이들의 변형배지로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 방법.
4. 제2 항에 있어서, 상기 (ⅱ) 단계의 배양온도는 -5℃ ~ +8℃ 인 방법.
5. 제2 항에 있어서, 상기 (ⅱ) 단계의 배양조건은 12시간 ~ 24시간 광주기인 방법.
6. 제2 항에 있어서, 상기 (ⅱ) 단계의 배양시간은 7일 이상인 방법.
7. 시료에 포로사이라 슈도덴티큘라타(Porosira pseudodenticulata)(수탁번호: KCTC 10878BP) 또는 그 배양액을 첨가하여 일정 온도에서 시료의 결빙을 방지하는 결빙방지 방법.
8. 제7 항에 있어서, 상기 일정 온도는 시료 혹은 시료보관을 위한 용액의 어는점보다 0 내지 10°낮은 온도인 결빙방지 방법.
9. 제7 항에 있어서, 상기 시료는 식품, 약품, 색소, 농화학제 및 생물학적 재료로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 방법.
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