KR100427408B1 - 형질전환된 피키아 파스토리스ＧＳ１１５／ｐＰＩＤＥ（ＫＣＴＣ １０３２ＢＰ）로부터디펜신의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형진전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)로부터 디펜신의 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 곤충 유래의 디펜신 발현을 위한 재조합 플라스미드 pPDIDE(KCTC 1031BP)를 제조하고, 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 상기 재조합 플라스미드(KCTC 1031BP)로 형질전환시켜 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)를 유전자 구조물이 발현되도록 배양하고 항균펩티드를 회수하고 순수 정제함으로써 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)에서 항균활성을 보유한 활성형 항균펩티드인 디펜신을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

형질전환된 피키아 파스토리스 ＧＳ１１５／ｐＰＩＤＥ（ＫＣＴＣ １０３２ＢＰ）로부터 디펜신의 생산방법{The Method for the Production of Active Defensin Using a Transformed Strain of Pichia pastoris GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)}

본 발명은 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)로부터 디펜신의 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 곤충 유래의 디펜신 발현을위한 재조합 플라스미드 pPIDE(KCTC 1031BP)를 제조하고, 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 상기 재조합 플라스미드(KCTC 1031BP)로 형질전환시켜 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)를 유전자 구조물이 발현되도록 배양하고 항균펩티드를 회수하고 순수 정제함으로써 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)에서 항균활성을 보유한 활성형 항균펩티드인 디펜신을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

식물, 곤충, 어류, 양서류, 인간 등에 널리 분포되어 있는 항균펩티드들은 병원성 미생물에 대한 초기 면역반응을 수행하며, 열이나 알칼리 등에 의하여 항균활성이 거의 소실되지 않는 강한 물리·화학적 안정성을 가지고 있다. 포유동물의 디펜신과는 별도로 여러 곤충에서도 발견된 곤충 유래의 디펜신 항균펩티드는 그람양성 세균의 세포막에 채널를 형성함으로써 여러 이온들을 유출시켜 항균활성을 나타낸다[Cociancich, S. A. 등 J. Biol. Chem.268. 19239 (1993)]. 또한, 이러한 항균펩티드는 미생물에 대한 내성이 문제시되고 있는 기존의 항생제들과는 다른 기작에 의해 항균활성을 나타내므로 내성을 유발할 가능성이 적다는 장점을 가지고 있다. 항균펩티드는 외부 미생물의 공격으로부터 자신을 방어하는데 중요한 역할을 하므로 항균펩티드는 제약산업에서 항균제, 사료첨가 항균제, 식품산업에서 식품보존 항균제 등으로의 산업적 응용 가능성이 매우 높다. 실제로 유산균에서 생산되는 박테리오신의 일종인 니신(nisin)은 식품보존제로 늘리 사용되고 있다. 그러나, 곤충 유래의 디펜신을 이용한 이러한 응용에 관한 내용은 없는 실정이다.

효모는 양조산업이나 제빵 산업에서 오랫동안 널리 사용되었으며 일반적으로 인체에 무해한 미생물로 알려져 있다. 또한, 효모의 분비경로는 복잡한 단백질을 분비시키면서 많은 전사 후 변형이 일어나는 고등 진핵세포와 유사하다. 이러한 효모의 분비경로를 이용하고 유전공학 기술을 적용하면 효모로부터 항균활성을 보유한 활성형의 항균펩티드를 발효배양액으로부터 얻을 수 있으며 항균활성이 있는 항균펩티드를 분비하는 효모를 육종하여 산업적 응용이 높을 것으로 기대된다.

항균펩티드의 산업적 이용을 위해서는 항균펩티드의 효율적인 생산법이 요구되고 있다. 이를 위하여 대장균 숙주에서 재조합 항균펩티드를 생산하기 위한 연구가 시도되었다. 그러나, 대장균은 원핵세포이므로 진핵세포의 특징인 단백질의 전사 후 변형이 일어나지 않아 불활성화된 항균펩티드가 과량 생성되어 시험관내에서 추가로 재접힘 과정(refolding process)을 거쳐야 하는 단점이 있다. 또한, 지금까지 많이 사용된 화학합성법은 항균펩티드의 아미노산 잔기가 증가할수록 합성단가가 늘어나는 단점이 있다.

한편, 효모세포를 숙주로 사용한 항균펩티드의 생산은 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 주로 항진균 펩티드가 대부분이었으며 생산성이 낮았다. 지금까지 수많은 재조합 단백질이 사카로미세스 세레비지애에서 생산되었다. 그러나, 사카로미세스 세레비지애는 일반적으로 재조합 단백질의 생산성이 낮으며 당쇄의 양상이 고등세포와 비교해 비균질하고 과량(heterogenous hyper-glycosylation) 일어나는 단점이 있다. 따라서, 이러한 단점을 극복하기위해서 비 사카로미세스 세레비지애인 피키아나 한센눌라와 같은 메탄올 자화성 효모를 숙주로 사용하는 많은 연구가 시도되고 있다. 이러한 메탄올 자화성 효모는 값싼 배지를 사용하여 고농도 배양이 가능하고 메탄올 유도성 프러모터가 존재하여 재조합 단백질의 생산성이 높은 장점이 있다. 또한 당쇄의 양상도 고등세포와 유사하다.

국내ㆍ외적으로 아직까지 효모 피키아 파스토리스에서 곤충 유래의 항균펩티드를 생산한 연구는 밝혀진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 효과적인 항균펩티드의 생산을 위한 생물계를 확립하기 위한 모델계로서 상기와 같은 장점을 가진 피키아 파스토리스를 숙주로 사용하여 곤충 유래 디펜신의 세포외로 분비, 생산를 시도한 결과, 효모세포에서 항균펩티드인 활성형의 디펜신을 세포외로 분비시켜 배양액으로부터 활성형 디펜신의 분리정제가 용이하고, 또한 효모배양의 배지 단가를 낮추어서 디펜신을 경제적으로 생산할 수 있는 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 활성형 디펜신을 세포 외로 분비하여 항균활성을 갖는 효모균체를 활용할 수 있는 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)를 제조하고, 이로부터 디펜신 항균펩티드를 생산하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 항균펩티드 디펜신 합성 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 디펜신 발현벡터인 재조합 플라스미드 pPIDE(KCTC 1031BP)의 제작과정을 개략적으로 나타낸 것이다.

도 3은 pPIDE(KCTC 1031BP)를 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 도입한 효모 형질전환체(KCTC 1032BP)의 항균활성을 보여주는 그림이다.

도 4a는 형질전환되어 활성형의 디펜신을 분비하는 선별된 대표적인 재조합 피키아 파스토리스 4개 균주의 세포성장을 나타낸 것이다.

도 4b는 형질전환되어 활성형의 디펜신을 분비하는 선별된 대표적인 재조합 피키아 파스토리스 4개 균주의 항균활성을 나타낸 것이다.

도 5는 형질전환체(KCTC 1032BP)의 항산암모늄으로 농축한 배양 상등액의 에스피-세파로즈(SP-Sepharose) 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 에스피-세파로즈 크로마토그래피로부터 얻어진 활성분획에 대한 1차 역상 고성능 액체 크로마토그라피(RP-HPLC)한 결과를 나타낸 것이다[분획 3: 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)대해 항균활성을 나타내는 것].

도 7은 활성분획 3을 동일한 조건하에서 2차 RP-HPLC한 결과를 나타낸다[단일 피크(RT 25.7분)는 마이크로코커스 루테우스에 대해 항균활성을 나타내는 부위].

도 8은 2차 RP-HPLC로 분리한 활성분획(RT 25.7분, lane 4)과 1차 RP-HPLC에서 나타난 분획 1(RT 22.4분, lane 2) 및 분획 2(RT 24.8분, lane 3) 등을 Tricine/Tris/SDS-PAGE로 분석한 결과이다[A:분자량, B: 항균활성; 투명환을 나타내는 시료(lane 4)는 마이크로코커스 루테우스에 대해 항균활성을 나타내는 성분].

도 9는 액체배양 시 여러 시험균에 대한 IC₅₀값을 구하기 위해 순수 정제한 디펜신의 농도에 따른 여러 시험균의 세포성장을 저해하는 항균활성을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 디펜신 발현을 위한 재조합 플라스미드 pPIDE(KCTC 1031BP)를 제조하고 이를 효모에 형질전환시킨 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP) 및 이 형질전환체로부터 디펜신 항균펩티드를 생산하는 방법을 그 특징으로 한다.

본 발명에 따른 디펜신은 쉬파리(Phormia terranovae)에서 유래한 디펜신 항균펩티드를 의미한다.

이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 효모 세포에서 작동 가능한 프로모터 서열과 상기 프로모터에 연결되어 디펜신 항균펩티드를 코딩하는 서열로 이루어지는 재조합 플라스미드pPIDE(KCTC 1031BP)를 제조하고 디펜신 항균펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 상기 재조합 플라스미드를 효모 세포에 형질전환시킨다. 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)를 대상으로 시험균인 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대한 항균활성을 확인하고, 형질전환된 효모 세포를 배양하여 항균펩티드를 회수함으로써 효모로부터 디펜신 항균펩티드를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 디펜신 항균펩티드는 아미노산 잔기 40개로 구성되며[서열번호 1], 질량분석기로 분석한 분자량은 약 4074 Da으로 나타났다.

또한, 본 발명에 의해 항균활성이 있는 디펜신을 분비하는 효모인 피키아는 사료첨가제로서 순수 정제한 디펜신은 항생제, 구강 청정제, 식품보존제 또는 연고첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

특히, 본 발명에 따른 디펜신 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화 하여 사용할 수 있다.

디펜신의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎／㎏(몸무게)／1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위는 다음 실시예에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. 곤충 유래 디펜신 발현용 재조합 플라스미드 제작

본 발명에 사용한 쉬파리(Phormia terranovae)의 디펜신 항균펩티드 중 항균활성을 나타내는 숙성된 펩티드(mature peptide)를 코딩(coding)하는 유전자를 연속적인 하나의 올리고머로 합성하는 것이 불가능하므로 세 부위로 나누어 합성하였다. 디펜신 유전자에 해당되는 유전자를 올리고머(oligomer) F1, R1, F2, R2, F3, 및 R3[서열번호 2 ∼ 7]로 화학 합성하였으며, 올리고머 F1[서열번호 2]와 R3[서열번호 7]의 5′과 3′말단에는 제한효소 인식부위XbaI과EcoRI이 각각 함유되게 합성하여 서브클로닝을 용이하게 하였다. 올리고머 F1의 5′말단에는 디펜신의 염기서열뿐만 아니라 효모의 교배인자(mating factor α1, MFα1)의 프로서열(prosequence)의 카르복시 말단의 아미노산(루신-아스파트산-라이신-아르기닌)에 해당하는 염기서열이 추가로 포함되게 합성하였다. 교배인자가 효모세포에서KEX2유전자산물에 의해 프로세싱(processing)될 때 필요한 라이신-아르기닌 서열 다음에 디펜신을 바로 연결하여 본래 디펜신의 아미노말단인 알라닌이 되도록 시도하였다. 또한, 교배인자 프로서열의 카르복시말단, 상기의 네 가지 아미노산을 포함하는 본래의 염기서열(서열번호 8:TTGGAT AAA AGA)을 서열번호 2의 5'말단의 CTA GAT AAA AGA로 바꾸어 합성하여 아미노산의 변화없이(루신) 제한효소XbaI 인식부위(TCTAGA)를 새로이 만들어 교배인자와의 연결을 용이하게 하였다[도 1]. 여섯 부위로 나누어 합성한 디펜신 유전자는 우선 중간 부위에 해당하는 올리고머 F2[서열번호 4]와 R2[서열번호 5] 가닥의 5′말단을 동시에 인산화시키고 모든 올리고머를 섞고 65 ℃로 5분간 가열한 후 상온까지 서서히 냉각하였다. DNA 리가제(ligase)를 처리하고 재구성한 디펜신 합성유전자의 5′말단을 인산화시켰다.

서열번호 2 : 올리고머 F1

5'- CTA GAT AAA AGA GCT ACT TGT GAC TTG TTG TCT GGT ACC GGT ATC -3'

서열번호 3 : 올리고머 R1

5'- TA TTT TCT CGA TGA ACA CTG AAC AAC AGA CCA TGG CCA TAG TTG GTG -3'

서열번호 4 : 올리고머 F2

5'- AAC CAC TCT GCT TGT GCT GCT CAC TGT TTG TTG AGA GGT AAC AGA -3'

서열번호 5 : 올리고머 R2

5'- AGA CGA ACA CGA CGA GTG ACA AAC AAC TCT CCA TTG TCT CCA CCA -3'

서열번호 6 : 올리고머 F3

5'- GGT GGT TAC TGT AAC GGT AAG GCT GGT TGT GTT TGT AGA AAC TAA TAG -3'

서열번호 7 : 올리고머 R3

5'- AAT TCA TTG CCA TTC CGA CAA ACA CAA ACA TCT TTG ATT ATC AGC T -3'

이 유전자를 pUC19[KCTC]에 재조합하여 클로닝하고, 디펜신 항균펩티드 유전자의 염기서열을 분석하여 정확한 클론을 선택하였다. 상기 유전자 생성물의 직접적 아미노산 번역으로부터 이들이 성숙한 단백질에 대한 완전 암호화 서열에 상응함을 알 수 있다. 최종적으로 확인된 디펜신 항균펩다이드 유전자의 정확한 염기서열 및 아미노산 서열을 도 1에 나타내었다.

생성된 디펜신을 세포 외로 분비시킬 목적으로 효모의 교배인자를 분리하기 위해 제한효소BamHI 인식부위를 함유하는 MFprepro forward primer(서열번호 9: CGAAGGATCCAAACGATGAG)와 교배인자 프로서열의 카르복시말단과 아미노산의 변화없이 루신에 대한 코돈 TTG를 CTA로 바꾸어XbaI 인식부위를 함유하는 MFprepro reverse primer(서열번호 10: GCCTCTAGAGAGATACCCCTTC)를 사용하여 피키아용 발현벡터인 pPIC9K[KAIST]로부터 PCR을 통해 교배인자 240 bp DNA 단편을 분리하고 pUC19에 클로닝하여 염기서열분석을 통해 정확한 서열을 가진 클론을 선택하였다. 얻어진 디펜신 항균펩티드 유전자, 효모의 교배인자서열, pPIC9K를 연결하여 재조합 플라스미드 pPIDE를 얻었다. 상기 재조합 플라스미드 pPIDE를 대장균 DH5에도입하여 제조된Escherichia coliDH5@/pPIDE로 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 6월 14일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 1031BP이다. 또한, 디펜신 항균펩티드를 코딩하는 유전자를 가지는 재조합 플라스미드인 pPIDE를 제작하는 과정을 도 2에 나타내었다.

실시예 2. 활성형의 디펜신을 분비하는 효모균주의 선별

재조합 플라스미드 pPIDE(KCTC 1031BP)를 숙주인 효모에 도입하기 위해 Dohmen 등[Yeast 7, 691 (1991)]의 방법으로 효모의 형질전환을 수행하였다. 아미노산 히스티딘이 결여된 완전 최소배지에 일차 선별된 형질전환체들을 0.5% 메탄올과 G-418 항생제가 첨가된 YPD 한천배지(효모추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로오스 2%)에 찍어서 24간 배양한 플레이트에 NB 액체배지에서 OD₆₀₀1.3 ∼ 1.5 까지 배양한 마이크로코커스 루테우스 배양액을 0.8％ 소프트 한천과 혼합액을 붓고 하룻밤 배양 후 나타나는 투명존의 생성 여부를 관찰하여 항균활성이 있는 효모 형질전환체를 선별하였다[도 3, T1: pPIC9K로 형질전환된 피키아 파스토리스; T2: 형질전환된 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE]. 투명환의 크기로 선별한 대표적인 4개 균주의 세포성장과 항균활성을 도 4에 나타내었다. 이 중 항균활성이 가장 우수한 3번 균주인, 피키아 파스토리스 GS115/pPIDE를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 6월 14일자로 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC 1032BP이다.

실시예 3. 효모 형질전환체의 배양 상등액에서 디펜신의 정제

효모에서 활성형으로 분비된 디펜신의 분자량, 항균력 및 기타 특성을 조사하기 위해 디펜신의 정제를 시도하였다. 형질전환된 피키아 파스토리스(KCTC 1032BP)를 YPM 배지(효모추출물 1%, 펩톤 2%, 메탄올 2%)에서 2일 동안 배양하고 배양 상등액을 회수한 후 황산암모늄 0 ∼ 70%의 농도로 농축하여 침전물을 0.1 M 소디움 포스페이트/시트레이트(pH 5.2) 완충액으로 투석하여 황산암모늄을 제거하였다. 황산암모늄으로 농축한 배양상등액을 0.1 M 소디움 포스페이트/시트레이트(pH 5.2) 완충액으로 평형이 된 SP-세파로스 음이온 교환수지에 결합시키고 완충액으로 세척한 후 NaCl 0 ∼ 1.0 M 선형 농도구배로 용출한 후 각 분획의 흡광도(OD₂₈₀)와 항균활성을 측정하여 항균활성이 있는 분획만[도 5] 증류수에서 투석을 하여 동결 건조하였다.

상기 방법에 의해 얻어진 활성분획을 증류수에 녹여 YMC J sphere(obs-H80) 칼럼에 흡착시킨 후 80% 아세토니트릴(0.1% TFA) 용매를 20% 농도구배로 30분간 세척한 후 40분간 동일 용매 20 ∼ 100%의 농도구배로 용출한 RP-HPLC를 통해 추가로 정제하였다. 그 결과, 세 개의 분획이 나타났으며 분획 3에서만 항균활성이 나타났다[도 6]. 이렇게 얻어진 세 개의 분획은 각각 증류수에서 투석을 하여 동결 건조하였다. 분획 3은 이차 RP-HPLC를 통해 단일피크를 보이는 순수한 디펜신을 정제하였다[도 7].

실시예 4. 정제된 디펜신 항균펩티드의 특성

정제한 디펜신의 분자량과 항균활성력의 유무를 확인하기 위하여 Tricine/Tris/SDS-PAGE에서 분석하였다. 두 개의 gel에 동일한 시료를 전기영동 한 후 하나(A)는 40% 메탄올, 10% 초산으로 고정하고 염색용액으로 약 1시간 염색하고 10% 초산으로 세척하여 단백질 밴드를 확인하였고, 또 다른 하나(B)는 2.5 % Triton X-100으로 30분간 세척한 후에 증류수에서 30분간 5번 세척하고 시험균인 마이크로코커스 루테우스를 함유한 0.8% NB 한천배지(효모추출물 0.25%, 하트인퓨전 1.25%, 뉴트리언트 브로스 0.5%)를 붓고 37 ℃에서 하룻밤 배양하여 항균활성을 조사하였다. 첨부도면 도 8에 나타난 바와 같이 이차 RP-HPLC의 분획의 단일 밴드에서 항균활성이 나타났으나 일차 RP-HPLC의 분획 1(RT 22.4분)와 분획 2(RT 24.8분)에서는 항균활성이 없었다.

순수 정제한 디펜신의 정확한 분자량을 구하기 위해 질량분석기로 분석한 결과 4074 Da이었다. 이것은 Tricine/Tris/SDS-PAGE로 분석한 분자량과 거의 일치하였다. 효모 피키아에서 분비된 디펜신이 정확히 절단되는 위치를 알기 위해 정제한 디펜신의 아미노 말단의 아미노산 서열을 15개 분석한 결과 의도한 대로KEX2절단부위에서 정확하게 절단되어 분비된 디펜신의 아미노말단이 알라닌이었다. 분석한 아미노 말단의 아미노산 15개의 서열[서열번호 10]은 다음과 같다.

서열번호 11: A-T-C-D-L-L-S-G-T-G-I-N-H-S-A

이렇게 얻은 디펜신의 항균활성범위, pH 및 열안정성, 여러 가수분해효소에 대한 내성 등 특성을 항균활성 측정법에 따라 조사하였다.

(1) 디펜신의 항균활성 범위조사

각각의 세균 배양액 0.5%를 함유한 아가 플레이트에 구멍을 만든 후 디펜신 10 ㎍을 증류수에 녹인 후 구멍에 넣고 37 ℃에서 배양하여 생성된 투명환의 크기를 측정하여 디펜신의 항균활성을 알아보았다. 다음 표 1에 보는 것과 같이 그람 음성균인 대장균과 살모넬라 타이피머리움(Salmonella typhimurium)에는 항균활성이 없었으나 병원성균인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 등에 강한 항균활성을 나타내었다.

시험균	투명환의 크기(cm)
마이크로코커스 루테우스	2.0
바실러스 세레우스	-
바실러스 코아걸란스	1.3
바실러스 서브틸리서	0.9
스타필로코커스 아우레우스	1.5
살모넬라 타이피머리움	－
리스테리아 모노사이토제네스	0.8
대장균	－
레우코노스톡 메센테로이데스	-
락토바실러스 플란타룸	1.0
락토바실러스 아시도필러스	－
페디오코커스 아시딜락티시	1.0

강한 항균활성을 보이는 균주를 대상으로 IC₅₀값을 측정하였다. 각각의 대상 균주를 하룻밤 배양한 후 본 배양하여 1 ×10⁴cell을 94-well 플레이트에 넣고 디펜신 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0 ㎍을 각각 첨가하였다. 10시간 배양 후에 OD₆₃₀에서 측정하여 IC₅₀값을 결정하였다. 그 결과, 마이크로코커스 루테우스는 약 9 ㎍/㎖, 바실러스 코아걸란스(Bacillus coagulans)는 약 12 ㎍/㎖, 스타필로코커스 아우레우스는 약 10 ㎍/㎖, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 약 13 ㎍/㎖, 그리고 페디오코커스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici)는 약 13 ㎍/㎖로 IC₅₀를 나타내었다[도 9].

(2) 열안정성

실시예 3에서 얻은 순수 정제한 디펜신 20 ㎍(약 160 AU/㎖의 항균활성을 갖는다)을 30분간 끓이면서 5분 간격으로 시료를 취하여 남아 있는 항균활성을 측정한 결과를 다음 표 2에 나타내었다. 디펜신은 30분까지 끓여도 항균활성을 대부분 유지하였다.

가열시간 (분)	AU/ml
0	160
5	160
10	160
15	160
20	140
25	140
30	140

(3) pH 안정성

상기의 방법으로 순수 정제하여 RP-HPLC에서 용출시간 25.7분내의 분획[도 6] 디펜신 20 ㎍을 pH가 2 ∼ 12 인 완충액에 각각 녹여서 상온에 두 시간 방치한 후 남아 있는 항균활성을 측정하였다. 다음 표 3에서 볼 수 있듯이 디펜신은 상기의 전 범위의 pH에서 항균활성이 대부분 안정하게 활성을 유지하였다.

pH	AU/ml
2	140
3	160
4	160
5	160
6	160
7	160
8	160
9	140
10	140
11	140
12	140

(3) 여러 가수분해효소에 대한 안정성

상기의 방법으로 순수 정제한 25.7분 분획의 디펜신 20 ㎍을 단백질분해효소, 전분질분해효소, 지질분해효소 등을 1 ㎎/㎖의 농도로 처리하고 5시간 반응시키고 효소를 불활성화시키기 위해 10분간 끓이고 잔류 항균활성을 측정하였다. 다음 표 4에 나타난 바와 같이 펩신을 제외한 사용한 모든 단백질 분해효소에 의해 항균활성이 완전히 사라졌으나 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 및 리파아제(lipase) 등은 전혀 영향이 없었다.

효소	AU/ml
프로테아제 K	0
프로테아제 IX	0
서브틸리신	0
트립신	0
α-키모트립신	0
펩신	160
α-아밀라아제	160
β-아밀라아제	160
아밀로글루코사다아제	160
리파아제	160

실시예 5 : 연고제의 제조

본 발명의 디펜신을 함유한 연고제의 제조방법은 다음과 같다.

디펜신 5 ㎎

멸균 정제수 10 ㎎

파라옥시안식향산메칠 2 ㎎

무수 라놀린 100 ㎎

백색 바셀린 ad. 1 g

멸균한 유리제 사발에 디펜신과 파라옥시안식향산메칠을 취하고, 디펜신을 가하여 녹인 후, 여기에 무수 라놀린을 가하면서 연합하여 균질하게 될 때까지 혼화하여 제조하였다.

실시예 6 : 정제의 제조

디펜신 0.1 g

락토스 0.7 g

결정성 셀룰로오스 0.15 g

마그네슘 스테아레이트 0.05 g

총 량 1 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 1 ㎎이다.

실시예 7 : 분말제의 제조

디펜신 0.1 g

옥수수 전분 0.5 g

카르복시 셀룰로오스 0.4 g

총 량 1 g

상기에 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 6 번 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

실시예 8: 독성시험

본 발명의 디펜신에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.

디펜신을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, 이하 DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 1 g/kg을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모에서 항균활성을 갖는 펩티드 항생물질을 효과적으로 대량 생산할 수 있으므로 항균펩티드인 디펜신이 세포 외로 분비되어 항균활성을 갖는 재조합 효모를 육성하여 산업적으로 활용할 수 있다.

따라서, 본 발명에 의해 디펜신 이외의 다른 항균펩티드도 효모로부터 대량 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 본 발명에 의해 디펜신을 분비하는 효모인 피키아는 사료첨가제로서 순수 정제한 디펜신은 항생제, 구강 청정제, 식품보존제 또는 연고첨가제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1. 도 2에 나타낸 바와 같이, 곤충 유래 디펜신 유전자가AOX1프로모터, 효모의 교배인자,AOX1전사종결부위와 연결되며, 효모의 교배인자와 디펜신 유전자를 연결시 교배인자의 아미노산 서열의 변화 없이XbaI 인식부위를 새로 만들어 연결하는 것을 특징으로 하는 재조합 플라스미드 pPIDE(KCTC 1031BP).
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3. 재조합 플라스미드 pPIDE를 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 도입하여 형질전환시킨 것임을 특징으로 하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115/pPIDE(KCTC 1032BP).
4. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) GS115/pPIDE(KCTC 1032BP)을 배양하여 분비한 디펜신을 회수, 정제하는 것임을 특징으로 하는 곤충 유래 디펜신의 생산방법.
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