JP4494716B2 - 菌類による異種たんぱく質の生産方法 - Google Patents
菌類による異種たんぱく質の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4494716B2 JP4494716B2 JP2002550097A JP2002550097A JP4494716B2 JP 4494716 B2 JP4494716 B2 JP 4494716B2 JP 2002550097 A JP2002550097 A JP 2002550097A JP 2002550097 A JP2002550097 A JP 2002550097A JP 4494716 B2 JP4494716 B2 JP 4494716B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- carbon source
- medium
- ethanol
- weight
- feed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、菌類における異種たんぱく質又はペプチドの生産の方法に関する。
【０００２】
発明の背景
菌類のような宿主における異種たんぱく質の生産は良く知られている。欧州特許出願公開第４８１，００８号には、グルコースで増殖する酵母における異種たんぱく質の生産が開示されている。
【０００３】
流加発酵における宿主生物体による異種たんぱく質の工業的な大規模な生産は、一般的に3つの段階を示す。
【０００４】
最初の段階は、細胞が必要とされる濃度まで増殖する段階として定義されるバッチ期である。この段階において、細胞は指数的に増殖する。バッチ期を記載するモデルは、細胞が死なず、酸素が過剰に存在し、他のすべての条件が、増殖が無制限に生じることを仮定している。このことは、バッチ期において、すべての栄養的要件が十分な量で供給されることを意味する。要約すると、バッチ期は、(異種)たんぱく質生産はなお低いが、細胞は増幅される段階である。
【０００５】
二番目の段階は、炭素源及び他の要件が予じめ算定された速度、「供給速度」において、比較的濃縮された液体流れで発酵槽に供給される。この段階においては、増殖した細胞によるたんぱく質生産及びバイオマスの増加をもたらす細胞増殖に重きがおかれる。この段階において、発酵槽に供給される基質は細胞増殖及び生成物合成に一般的に用いられる。細胞増殖及び異種たんぱく質の生産における最適度を得るために細胞増殖は供給速度により制御される。
【０００６】
最後に、制限条件が生じる減退期として定義される三番目の段階になる。この段階において、例えば、発酵槽における酸素濃度は０まで低減し、いくつかの場合では、エタノールの生成をもたらす。この段階において、ほとんどの細胞は維持が中心になり、通常、生成物合成は低減する。この段階において、細胞増殖は、なお観察され得るが、増殖は、一般的に０まで非常に制限される。この段階において、一般的に、細胞は、生存力を緩慢にする。
【０００７】
グルコースのような通常の炭素源又は他の糖系炭素源を含有する培地での異種たんぱく質の生産は、制限条件が供給期の終わりに存在し始めるまで、十分である。制限条件の例には、低減された酸素濃度、低減された、ビタミン類、炭素、窒素のような栄養素、及び増殖培地における毒性化合物の蓄積が含まれる。
【０００８】
菌類、特に酵母が炭素原子としてのグルコースを含有する培地で増殖する場合、制限条件が生じるやいなや、異種たんぱく質生産は、かなり低減する。
【０００９】
炭素源として糖を含有する通常培地で増殖した酵母では、上記の段階は、流加発酵において存在する。従って、減退期が開始すると、バイオマスｇ当り生産される異種たんぱく質又はペプチドの量として定義される特異的生産は維持されるか又は低減される。細胞密度が高くても、減退期において生成物合成は従って低い。
【００１０】
炭素源としてしばしばグルコースを含有する通常培地の他の不利益は、本発明では通常、異種たんぱく質である生成物への変換の代わりに、バイオマスに変換される多量の基質である。従って、そのような系において、比較的多量なバイオマスは、多量の異種たんぱく質の生産を伴うことは避けられない。この多量のバイオマスは、例えば、酸素制限が容易に生じる粘性の発酵培地をもたらす。
【００１１】
従って、通常、減退し、低減された特異的生産が存在する制限条件下でさえ、高い異種たんぱく質収率をもたらし、同時に、公知の増殖系と比較して、増殖系の特異的生産が維持されるか又は増大する、菌類のような宿主における異種たんぱく質生産法に対する要望がある。
【００１２】
本発明の方法は、上記の問題の少なくとも１つを解消する。
【００１３】
発明の概要
主な炭素源としてエタノール、及び異種たんぱく質の生産を制御するためのガラクトースのような誘導物質を含有する培地での菌類の増殖が、高い異種たんぱく質の特異的生産を示し、制限条件下でさえ、異種たんぱく質の特異的生産が予期せぬことに高いことが予期せぬことに見出された。
【００１４】
本方法により増殖された菌類は、予期せぬことに、伝統的なグルコース系培地で増殖された菌類で遭遇するよく知られた減退の特徴を示さない。この特定の炭素源を含有する培地の供給の継続下で、菌類は、異種たんぱく質の絶対的かつ特異的生産を維持するか又は増大さえする。
【００１５】
従って、本発明は、炭素源を含み、付加的に誘導物質を含み、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地での菌類の増殖を含む、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明において、菌類という用語は、酵母及び糸状菌を包含する。
【００１７】
本発明の目的では、異種たんぱく質は、たんぱく質及びペプチドの両方を含むことを意味する。
【００１８】
異種たんぱく質は、菌類により天然に生産されず、菌類がこの程度に修飾された後にのみ生産される。
【００１９】
重量％が示されている場合、その重量％は、他に示されていなければ、総生成物又は総培地重量における重量％であることを意味する。
【００２０】
酸素濃度という用語が用いられる場合、実施例において示される方法により測定される溶解された酸素濃度をいう。
【００２１】
バッチ期の終わりとは、細胞に供給されたすべての炭素基質が消費された時点と定義される。
【００２２】
誘導期は、バッチ期後に開始し、異種たんぱく質の誘導が開始された時点から、用いられる特定の誘導物質濃度での最大誘導が得られるまでの段階と定義される。
【００２３】
炭素源とは、細胞に炭素及びエネルギーの供給を与える基質として定義される。菌類は、主に有機化合物から菌類の細胞炭素を得る。有機化合物は、通常、炭素源及びエネルギー源として役立つ。有機化合物は、細胞物質に消化吸収され、部分的に酸化されてエネルギーを供給する。このことについては、Ｈ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ｉｎ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９２年、７版、１９４頁を参照。
【００２４】
本発明は、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。異種たんぱく質を生産するために、菌類は、この異種たんぱく質又はペプチドの制御が可能なように一般的に修飾される。この遺伝子修飾のために、適する構築物又は形質転換方法が用いられ得る。適する構築物及び転換方法は、欧州特許出願公開第４８１，００８号に記載されており、その記載を引用により本明細書に組み込む。
【００２５】
一般的に、修飾された菌類は、修飾後、プロモーターの制御下で、異種たんぱく質をコードする遺伝子を含む(組み込まれた)ベクターを含有する。プロモーターの活性は、いわゆる誘導物質により制御される。プロモーターの例には、ガラクトースにより誘導されるＧＡＬ４、ＧＡＬ７のようなガラクトースプロモーター、メタノールにより誘導されるメタノールプロモーター、エタノールにより誘導されるエタノールプロモーター、温度変化により誘導される温度制御プロモーター、ホスフェートの存在により誘導されるホスフェートプロモーター、及びグルコースの不存在により誘導されるグルコース抑制性プロモーターが含まれる。
【００２６】
菌類は、培地中の誘導物質の存在と組み合わされた炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００％がエタノールである培地で増殖される。
【００２７】
本技術分野において、後に引用する開示により例示されるように、一般的に、炭素源としてのエタノールの使用は、失望される。要約すると、炭素源としてグルコースの代わりにエタノールを使用することは、バイオマス収量を低減し、より高い酸素消費を必要とし、従って、酸素制限条件下では、増殖をしないか又は制限された増殖しかしない。さらに、株のエタノール毒性により、生存力の損失及び細胞致死がもたらされる。このことは、例えば、Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ、３巻、２版、６章の表１に開示されている。酵母では、エタノールでの増殖速度は、グルコースでの増殖速度が０．３５時間−１なのに対して０．１時間−１であると記載する、特に、この開示の補遺１を参照。この補遺は、さらに、炭素基質としてエタノールを含有する培地で、酵母は、炭素基質としてグルコースを含有する培地でよりも高い酸素消費を示す。
【００２８】
炭素源としてのエタノールでの細胞の増殖は、さらに、Ｓｈｉｂａら(Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８９巻、４２６乃至４３０頁、２０００年)により開示されている。Ｓｈｉｂａは、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇａｌ８０突然変異種におけるＧＡＬ１０プロモーターを用いるカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)の発現を開示している。その増殖培地は単独の炭素源としてエタノールを含有する。エタノール供給の開始時、増殖速度及びＣＰＹ生産の両方が低減すると報告されている。この系は、誘導物質の制御下ではない。
【００２９】
本発明は、特に、炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地の存在下で、特に増殖制限条件が生ずるときに、たんぱく質生産が維持されるか又は増大さえする方法を提供する。さらに、本発明による本方法は、いずれの種類の菌類にも適用でき、増殖のために特異的ｇａｌ８０突然変異種を必要としない。又、本発明の方法は、誘導により良好に制御できる。
【００３０】
Ｓａｌｉｏｌａ，Ｍら(Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年１月、５３乃至６０頁)は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおける異種遺伝子発現のためのエタノール誘導性ＫＩＡＤＨ４プロモーターの使用を開示している。この文献は、流加系においてプロモーターとして、かつ同時に唯一の炭素源としてエタノールが用いられた場合に発現は最適であると教示している。この生産系は、供給期において、遺伝子発現の制御を可能にしない。
【００３１】
本発明の方法の他の利点は、熱に不安定なたんぱく質の生産に重要である熱発生の制御である。
【００３２】
すべての段階を通して、培地が、培地中の誘導物質の存在と組み合わされた炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールであることが好ましいが、供給期培地によりそれらの要件が満たされる限り、バッチ期においてそれらの用件を満たさない培地の使用が可能であることが見出された。
【００３３】
好ましい態様において、バッチ期及び供給期を有し、供給期培地は炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールであり、供給期培地は、付加的に誘導物質を含有する、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。
【００３４】
主な炭素源として通常、グルコース又は他の糖を含有する公知の増殖系と比較して、本発明の培地は、制限条件下でさえも、高い特異的生産レベルを可能にする、すなわち、好ましくは減退期がない。
【００３５】
特異的生産は、酸素制限条件下の供給期において最も高いことが見出されさえし、一方、グルコース系増殖系では、最も高い特異的生産は、通常、供給期において見出されるが、バイオマスの量は、なお比較的低い。
【００３６】
いずれの理論によっても縛られることを望まないが、本願発明者らは、本発明の方法において、炭素源を含有し、その炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地の使用により、減退期が延期されるか又は存在しなくなりさえすると考える。
【００３７】
異種たんぱく質を製造する方法において、細胞増殖速度及び異種たんぱく質生産が最適であるように、供給条件が好ましくは最適にされる。先に記載したように、菌類が工業的スケールで増殖される場合、発酵槽を用いる流加系が非常に好ましい。
【００３８】
他の好ましい態様において、本発明は、バッチ期、誘導期及び供給期を含み、供給期において、
ａ）菌類細胞が、特定の選択をせずに、いずれかの炭素源を含有する培地で少なくとも５ｇ／ｌの細胞密度まで増殖させ、続いて、菌類細胞を、誘導物質及び炭素源を含有し、その炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである、培地を用いて、5ｇ／ｌより多い、好ましくは１０乃至９０ｇ／ｌの、より好ましくは４０乃至６０ｇ／ｌの細胞密度に増殖させ、
ｂ）工程ａ）の細胞密度が得られた後に、増殖制限条件が生じ、
ｃ）それらの制限条件が開始された後に、炭素源を含有し、その炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地でさらに前記細胞を増殖させる
ことを含む、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。
【００３９】
この好ましい方法において、第一の段階において、バッチ期において炭素基質が消費されるまで細胞は増殖し、第二の段階において、異種たんぱく質生産が多量に行われるのに十分な細胞密度まで細胞は増殖する。この第二の段階の最初の段階において、供給培地への誘導物質の添加により、異種たんぱく質生産は誘導される。０誘導、そして従って、非常に少量の異種たんぱく質生産から、誘導が最大になるまでに至るのにかかる時間を誘導期と呼ぶ。この誘導期は、供給期の最初の段階を構成する。
【００４０】
発酵槽の制限条件は、いくつかの方法により得られる。制限条件は、指数的な細胞の増殖はもはや可能ではなく、細胞増殖は低減すると定義される。
【００４１】
本発明の方法において、好ましくは、培地における制限条件は、
ａ）好ましくは３０％未満の、より好ましくは１５％未満の、発酵槽培地における酸素濃度の低減、
ｂ）培地中のエタノール濃度が、培地において増殖する株の細胞についての増殖制限濃度になるか又は増殖制限濃度より高くなるまで、培地へのエタノールの過剰供給、
ｃ）細胞の増殖のための、好ましくは、窒素、燐、硫黄及びビタミン類から選ばれる他の必須成分の濃度を低減させること
を含む群から選ばれる方法によって生じる。
【００４２】
好ましくは、バッチ期の後に、供給分布は、バイオマス生産とともに指数的に増大する。酸素制限が生じ、減退期に入るときに、供給速度を、好ましくは、発酵槽培地において１０容量％未満のエタノール濃度を維持するような速度に設定する。このことは、例えば、線状供給速度又は脈動的供給速度又は段階的供給速度により得られる。
【００４３】
さらにより好ましい態様において、本発明の方法は、繰り返される流加法として行われる。
【００４４】
好ましくは、誘導物質は、宿主菌類の形質転換に用いられる遺伝子構築物における異種遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターを作動させるのに適する。好ましい誘導物質はガラクトース、メタノール、温度及びホスフェートである。
【００４５】
最も好ましい誘導物質はガラクトースである。
【００４６】
本発明は、エタノールが誘導物質として、かつ炭素源(の一部)として両方として用いられる発現方法に関するものではない。
【００４７】
ガラクトースが誘導物質である場合、培地中のガラクトースの量は非常に低くガラクトースが代謝しないが、プロモーターが望ましい程度に作動するような量でなくてはならない。このことを防ぐために、誘導物質を代謝させることができない株を用いることが可能である。
【００４８】
好ましくは、供給培地の組成は、発酵槽における培地が、０．１乃至１０重量％のガラクトース、より好ましくは０．０５乃至１重量％、さらにより好ましくは０．０５乃至０．２重量％のガラクトースを含有するような組成である。
【００４９】
本発明による培地中の炭素源は、少なくとも５０重量％以上で１００重量％以下のエタノールを含有する。好ましくは、炭素源は、８０乃至１００重量％のエタノールを含有する。炭素源の残りは、例えば、グルコース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、フルクトースのような糖、又はグリセロール、アセテートのような他の化合物、又はホエー及び糖蜜のような複雑な炭素基質であることができる。
【００５０】
菌類は、酵母又は糸状菌であることができる。適する酵母属の例には、サッカロミセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)、クルイベロミセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)、ハンセヌラ(Ｈａｎｓｅｎｕｌａ)が含まれる。適する糸状菌の例には、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)、リゾプス(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)が含まれる。特に好ましい生物は、サッカロミセス・セレビシアエ(Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｅｖｉｓｉａｅ)である。
【００５１】
異種たんぱく質は、その生産が望ましいいずれかのたんぱく質又はペプチドであることができる。本発明の方法は、不凍化ペプチド、抗体又は抗体のフラグメント、又はクチナーゼ(ｃｕｔｉｎａｓｅ)及びガラクトシダーゼのような酵素の生産に特に適していることが見出された。不凍化ペプチドは、氷の成長を修飾する能力を有し、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖｅｎｃｅｓ、１３巻、3号、３７５乃至４０２頁、１９９５年に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈらにより記載されており、その記載を引用により本明細書に組み込む。
【００５２】
菌類の増殖における種々の段階のための培地は、一般的に、炭素源、バッチ期の後にその存在が必要である任意に誘導物質、並びに、任意に、ビタミン類、酵母エキス、痕跡金属イオン類、望ましい程度にｐＨを維持するための酸性化剤、燐酸塩、硫酸塩水及び消泡剤のような他の成分を含有する。
【００５３】
他の好ましい態様によると、本発明は、バッチ培地が、１乃至４０重量％のグルコース、水、痕跡金属、任意に消泡剤、酵母エキス、ビタミン類、燐酸塩及び硫酸塩を含有し、供給培地が、５乃至３５容量％のエタノール、０．１乃至１０重量％のガラクトース、水、痕跡金属、並びに任意に消泡剤、酵母エキス、ビタミン類、燐酸塩及び硫酸塩を含有し、「供給速度」「ψ」は、１０リットルスケールで０．２５乃至４ｇ／分又はより大きいスケール発酵では相当する値である、異種たんぱく質又はペプチドを生産する方法に関する。
【００５４】
本発明は、さらに、本発明による方法により得られる異種たんぱく質単離物、特に不凍化ペプチド単離物に関する。
【００５５】
以下に、本発明を、下記の非制限的な実施例により示す。
【００５６】
実施例
培地及び培養
すべての培地及び培養データーは、１０リットルスケールのエタノール発酵に基づいている。
【００５７】
１０ｍ３スケールでは、およそスケール係数１，０００に適合する。
【００５８】
培地：
予備培養培地：
【表１】
【００５９】
バッチ培地及び供給培地を、１０リットルスケールについて表１に記載する。
【００６０】
【表２】
【００６１】
すべての培地を、糖を別にして、１２１℃／１.２バール(Ｌｉｎｄｅｎオートクレーブ)において２５分間滅菌した。水道水の量は下記に示しており、総量は、総重量が表１の最下列に示されたような量である。
【００６２】
Ｅｇｌｉビタミン類及び痕跡金属類の組成
【表３】
【００６３】
株
用いられた株は、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ CEN．PK１０２−3Ａであった。塩基性CEN．ＰＫ2 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈａｎｎ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｇｏｅｔｈｅ-Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｍａｒｉｅ−Ｃｕｒｉｅ−Ｓｔｒａｓｓｅ ９；Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｎ２５０、Ｄ−６０４３９ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、ドイツ国、から市販されている。
【００６４】
このＳ．ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ株は、ＧＡＬ１遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺伝子から誘導された配列の挿入により分裂されているので、ガラクトースを代謝することができない。宿主株は、下記の要素を含有する発現プラスミドで形質転換された：
プロモーター：ＧＡＬ７プロモーター、リーダーＧＡＰＤＨ。ＧＡＬ７プロモーター：2つの上流活性化配列は常に存在する。それらは、結合される配列の部分である2つの天然要素である。
【００６５】
選択マーカー：Ｌｅｕ2ｄ
シグナル配列：インベルターゼ(ＳＵＣ２)
組み込み標的物：酵母染色体ＸＩＩにおける特異的領域への標的化組み込みのための独特の制限部位を有するｒＤＮＡ繰り返しのフラグメント
異種遺伝子：
実施例１：ゲンゲＨＰＬＣ１２不凍化たんぱく質をコードする不凍化たんぱく質遺伝子(ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９７／０２３４３)
実施例２：Ｋ６０９Ｂ、子豚におけるビルレンスファクターに対する抗体
実施例３：重鎖免疫グロブリンであるＨＧＬ１１であるたんぱく質ＶＨＨ Ｇ；欧州特許出願公開第１，１３４，２３１号に開示された、ヒト胃性リパーゼに対するリパーゼインヒビター
実施例４：重鎖免疫グロブリンであるＨＰＬ１８であるたんぱく質ＶＨＨ Ｐ；欧州特許出願公開第１，１３４，２３１号に開示された、ヒトすい臓性リパーゼに対するリパーゼインヒビター
実施例２乃至４のたんぱく質は、欧州特許出願公開第１，１３４，２３１号に開示された操作によるラマの免疫化により得られる抗体である。
【００６６】
培養
株貯蔵
株は、スキムミルク及び２０％のグリセロールの混合物を含有する１：１で希釈されたＹＮＢで増殖された培養物から単一のバッチにおいて−８０℃において貯蔵された。
【００６７】
接種
５０ｍｌのＹＮＢに１ｍｌの貯蔵された株を接種し、３０℃で１５０回／分において４８時間±２時間、インキュベーションした。次に、接種原を２％ＹＰＤ５００ｍｌに移し、次に３０℃で１５０回／分において４８時間±２時間、インキュベーションした。
【００６８】
発酵槽
標準発酵槽で１０リットルの作業容量で発酵を行なった。温度制御のために、発酵槽は、冷却コイル及び加熱フィンガーを備えていた。そらせ板は、標準寸法のものであった。攪拌するために６枚の羽根を有するＲｕｓｈｔｏｎタイプの羽根車を用いた。溶解された酸素(ＤＯ２)をＩｎｇｏｌｄ ＤＯ２電極(Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ)を用いて測定し、ｐＨをＩｎｇｌｏｌｄ Ｉｍｐｒｏ ３０００ゲル電極(Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ)を用いて測定した。排ガスを測定するために質量分光光度計Ｐｒｉｍａ ６００(ＶＧガス分析装置)を用いた。全発酵工程は、自動化され、ソフトウェアーで制御されていたが、後に与えるガイダンスに基づいて手動でも行なうことができる。
【００６９】
発酵を制御するために供給分布が課された。３Ｍのリン酸(Ｂａｋｅｒ)及び１２.５％ｖ／ｖアンモニア(Ｍｅｒｃｋ)を用いてｐＨを調整した。
【００７０】
最大攪拌機速度(１，０００回／分)が生じるまで、羽根車速度の自動的調整によりＤＯ２を３０％において調整した。
【００７１】
乾燥重量決定及び生成物濃度分析のために、発酵中、自動試料採取器を用いて５ｍｌの試料を取り出し、４℃において冷却した。
【００７２】
バッチ期
バッチ期を開始するために、５００ｍｌのＹＰＤ接種原を５.５リットルのバッチ培地に添加した。発酵パラメーターは表３.１によるようであった。排ガス中のエタノール含量が３００ｐｐｍに低減するときに、指数的供給を開始した。
【００７３】
供給期
供給培地を、同じポンプに接続した２つの供給壜に分離した。１つの供給壜は、エタノール及び２リットルまでの水道水を含有し、ボトムプレートにより発酵槽に供給した。第２の供給壜は、すべて他の供給成分及び2リットルまでの水を含有し，トッププレートにより供給した。
【００７４】
１つのポンプに連結された両方の壜から、式１による同じ指数的供給速度を適用した。2つの壜のために得られた供給速度はポンプ速度の２倍である。
【００７５】
【数１】
【００７６】
Φｖ，ｔ＝供給速度 ｇ／分
μ＝増殖速度 時間−１
Ｘ０＝供給開始におけるバイオマス ｇ(Ｍｗ＝２４.６ｇ／モル)
ｔ＝供給開始からの時間 分
ρ供給＝供給密度 ｇエタノール／ｇ供給物質
ＹＸ，Ｓ＝バイオマスの推定収率 ｇバイオマス／ｇ基質
６０＝時間係数 分／時間
供給パラメーターは、表３による。
【００７７】
【表４】
【００７８】
酸素濃度が０％のときに、制限条件が始まり、ポンプ速度を、線状供給速度にした。すべての供給物がなくなるまで供給を続けた。
【００７９】
結果：
実施例１
【表５】
【００８０】
これらの結果に基づいて、供給期において制限条件が生じた後にＡＦＰ生産が生じる場合、１００重量％エタノールである炭素源を含有する培地の供給が続けられることにより、予期しないことに、ＡＦＰの高い特異的生産がもたらされることが結論付けられる。
【００８１】
純粋のＡＦＰ生産性の損失なく、バイオマス生産が一定であったことが見出された。
【００８２】
比較例
供給期における増殖培地は、エタノールを含有せず、炭素源として１００重量％のグルコースを含有した。この実験のための培地は、先に記載している。又、発酵槽供給条件は、供給培地が、すべての成分を含有する1つの供給壜から発酵槽に用いられ、ボトムプレートにより発酵槽に供給されることを除いては先に特定している通りである。式１による指数的供給速度が用いられた。
【００８３】
供給パラメーターは、1つの供給壜を用いて、1つのポンプにおける2つの供給壜を用いるエタノール発酵におけるのと同じ供給速度をもたらすために、２.１１モルに設定されたＸ０値を除いて、表３によるパラメーターであった。
【００８４】
その結果は下記のごとくであった。
【００８５】
【表６】
【００８６】
増殖培地が炭素源としてグルコースしか含有しない場合に、制限条件が開始されたときからＡＦＰ生産は低減することが結論付けられる。ＡＦＰ生産は、もはや増大せず、ＡＦＰ生産は減退する。
【００８７】
結果−実施例２
【表７】
【００８８】
炭素源としてエタノールを用いる異種たんぱく質の特異的生産は、炭素源としてグルコースにおけるよりもずっと高いことが結論付けられる。
【００８９】
結果−実施例３
【表８】
【００９０】
炭素源としてエタノールを用いる異種たんぱく質の特異的生産は、炭素源としてグルコースにおけるよりもずっと高いことが結論付けられる。
【００９１】
結果−実施例４
【表９】
【００９２】
炭素源としてエタノールを用いる異種たんぱく質の特異的生産は、炭素源としてグルコースにおけるよりもずっと高いことが結論付けられる。
発明の分野
本発明は、菌類における異種たんぱく質又はペプチドの生産の方法に関する。
【０００２】
発明の背景
菌類のような宿主における異種たんぱく質の生産は良く知られている。欧州特許出願公開第４８１，００８号には、グルコースで増殖する酵母における異種たんぱく質の生産が開示されている。
【０００３】
流加発酵における宿主生物体による異種たんぱく質の工業的な大規模な生産は、一般的に3つの段階を示す。
【０００４】
最初の段階は、細胞が必要とされる濃度まで増殖する段階として定義されるバッチ期である。この段階において、細胞は指数的に増殖する。バッチ期を記載するモデルは、細胞が死なず、酸素が過剰に存在し、他のすべての条件が、増殖が無制限に生じることを仮定している。このことは、バッチ期において、すべての栄養的要件が十分な量で供給されることを意味する。要約すると、バッチ期は、(異種)たんぱく質生産はなお低いが、細胞は増幅される段階である。
【０００５】
二番目の段階は、炭素源及び他の要件が予じめ算定された速度、「供給速度」において、比較的濃縮された液体流れで発酵槽に供給される。この段階においては、増殖した細胞によるたんぱく質生産及びバイオマスの増加をもたらす細胞増殖に重きがおかれる。この段階において、発酵槽に供給される基質は細胞増殖及び生成物合成に一般的に用いられる。細胞増殖及び異種たんぱく質の生産における最適度を得るために細胞増殖は供給速度により制御される。
【０００６】
最後に、制限条件が生じる減退期として定義される三番目の段階になる。この段階において、例えば、発酵槽における酸素濃度は０まで低減し、いくつかの場合では、エタノールの生成をもたらす。この段階において、ほとんどの細胞は維持が中心になり、通常、生成物合成は低減する。この段階において、細胞増殖は、なお観察され得るが、増殖は、一般的に０まで非常に制限される。この段階において、一般的に、細胞は、生存力を緩慢にする。
【０００７】
グルコースのような通常の炭素源又は他の糖系炭素源を含有する培地での異種たんぱく質の生産は、制限条件が供給期の終わりに存在し始めるまで、十分である。制限条件の例には、低減された酸素濃度、低減された、ビタミン類、炭素、窒素のような栄養素、及び増殖培地における毒性化合物の蓄積が含まれる。
【０００８】
菌類、特に酵母が炭素原子としてのグルコースを含有する培地で増殖する場合、制限条件が生じるやいなや、異種たんぱく質生産は、かなり低減する。
【０００９】
炭素源として糖を含有する通常培地で増殖した酵母では、上記の段階は、流加発酵において存在する。従って、減退期が開始すると、バイオマスｇ当り生産される異種たんぱく質又はペプチドの量として定義される特異的生産は維持されるか又は低減される。細胞密度が高くても、減退期において生成物合成は従って低い。
【００１０】
炭素源としてしばしばグルコースを含有する通常培地の他の不利益は、本発明では通常、異種たんぱく質である生成物への変換の代わりに、バイオマスに変換される多量の基質である。従って、そのような系において、比較的多量なバイオマスは、多量の異種たんぱく質の生産を伴うことは避けられない。この多量のバイオマスは、例えば、酸素制限が容易に生じる粘性の発酵培地をもたらす。
【００１１】
従って、通常、減退し、低減された特異的生産が存在する制限条件下でさえ、高い異種たんぱく質収率をもたらし、同時に、公知の増殖系と比較して、増殖系の特異的生産が維持されるか又は増大する、菌類のような宿主における異種たんぱく質生産法に対する要望がある。
【００１２】
本発明の方法は、上記の問題の少なくとも１つを解消する。
【００１３】
発明の概要
主な炭素源としてエタノール、及び異種たんぱく質の生産を制御するためのガラクトースのような誘導物質を含有する培地での菌類の増殖が、高い異種たんぱく質の特異的生産を示し、制限条件下でさえ、異種たんぱく質の特異的生産が予期せぬことに高いことが予期せぬことに見出された。
【００１４】
本方法により増殖された菌類は、予期せぬことに、伝統的なグルコース系培地で増殖された菌類で遭遇するよく知られた減退の特徴を示さない。この特定の炭素源を含有する培地の供給の継続下で、菌類は、異種たんぱく質の絶対的かつ特異的生産を維持するか又は増大さえする。
【００１５】
従って、本発明は、炭素源を含み、付加的に誘導物質を含み、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地での菌類の増殖を含む、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。
【００１６】
発明の詳細な記載
本発明において、菌類という用語は、酵母及び糸状菌を包含する。
【００１７】
本発明の目的では、異種たんぱく質は、たんぱく質及びペプチドの両方を含むことを意味する。
【００１８】
異種たんぱく質は、菌類により天然に生産されず、菌類がこの程度に修飾された後にのみ生産される。
【００１９】
重量％が示されている場合、その重量％は、他に示されていなければ、総生成物又は総培地重量における重量％であることを意味する。
【００２０】
酸素濃度という用語が用いられる場合、実施例において示される方法により測定される溶解された酸素濃度をいう。
【００２１】
バッチ期の終わりとは、細胞に供給されたすべての炭素基質が消費された時点と定義される。
【００２２】
誘導期は、バッチ期後に開始し、異種たんぱく質の誘導が開始された時点から、用いられる特定の誘導物質濃度での最大誘導が得られるまでの段階と定義される。
【００２３】
炭素源とは、細胞に炭素及びエネルギーの供給を与える基質として定義される。菌類は、主に有機化合物から菌類の細胞炭素を得る。有機化合物は、通常、炭素源及びエネルギー源として役立つ。有機化合物は、細胞物質に消化吸収され、部分的に酸化されてエネルギーを供給する。このことについては、Ｈ．Ｓｃｈｌｅｇｅｌ ｉｎ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９２年、７版、１９４頁を参照。
【００２４】
本発明は、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。異種たんぱく質を生産するために、菌類は、この異種たんぱく質又はペプチドの制御が可能なように一般的に修飾される。この遺伝子修飾のために、適する構築物又は形質転換方法が用いられ得る。適する構築物及び転換方法は、欧州特許出願公開第４８１，００８号に記載されており、その記載を引用により本明細書に組み込む。
【００２５】
一般的に、修飾された菌類は、修飾後、プロモーターの制御下で、異種たんぱく質をコードする遺伝子を含む(組み込まれた)ベクターを含有する。プロモーターの活性は、いわゆる誘導物質により制御される。プロモーターの例には、ガラクトースにより誘導されるＧＡＬ４、ＧＡＬ７のようなガラクトースプロモーター、メタノールにより誘導されるメタノールプロモーター、エタノールにより誘導されるエタノールプロモーター、温度変化により誘導される温度制御プロモーター、ホスフェートの存在により誘導されるホスフェートプロモーター、及びグルコースの不存在により誘導されるグルコース抑制性プロモーターが含まれる。
【００２６】
菌類は、培地中の誘導物質の存在と組み合わされた炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００％がエタノールである培地で増殖される。
【００２７】
本技術分野において、後に引用する開示により例示されるように、一般的に、炭素源としてのエタノールの使用は、失望される。要約すると、炭素源としてグルコースの代わりにエタノールを使用することは、バイオマス収量を低減し、より高い酸素消費を必要とし、従って、酸素制限条件下では、増殖をしないか又は制限された増殖しかしない。さらに、株のエタノール毒性により、生存力の損失及び細胞致死がもたらされる。このことは、例えば、Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ、３巻、２版、６章の表１に開示されている。酵母では、エタノールでの増殖速度は、グルコースでの増殖速度が０．３５時間−１なのに対して０．１時間−１であると記載する、特に、この開示の補遺１を参照。この補遺は、さらに、炭素基質としてエタノールを含有する培地で、酵母は、炭素基質としてグルコースを含有する培地でよりも高い酸素消費を示す。
【００２８】
炭素源としてのエタノールでの細胞の増殖は、さらに、Ｓｈｉｂａら(Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８９巻、４２６乃至４３０頁、２０００年)により開示されている。Ｓｈｉｂａは、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｇａｌ８０突然変異種におけるＧＡＬ１０プロモーターを用いるカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)の発現を開示している。その増殖培地は単独の炭素源としてエタノールを含有する。エタノール供給の開始時、増殖速度及びＣＰＹ生産の両方が低減すると報告されている。この系は、誘導物質の制御下ではない。
【００２９】
本発明は、特に、炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地の存在下で、特に増殖制限条件が生ずるときに、たんぱく質生産が維持されるか又は増大さえする方法を提供する。さらに、本発明による本方法は、いずれの種類の菌類にも適用でき、増殖のために特異的ｇａｌ８０突然変異種を必要としない。又、本発明の方法は、誘導により良好に制御できる。
【００３０】
Ｓａｌｉｏｌａ，Ｍら(Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年１月、５３乃至６０頁)は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓにおける異種遺伝子発現のためのエタノール誘導性ＫＩＡＤＨ４プロモーターの使用を開示している。この文献は、流加系においてプロモーターとして、かつ同時に唯一の炭素源としてエタノールが用いられた場合に発現は最適であると教示している。この生産系は、供給期において、遺伝子発現の制御を可能にしない。
【００３１】
本発明の方法の他の利点は、熱に不安定なたんぱく質の生産に重要である熱発生の制御である。
【００３２】
すべての段階を通して、培地が、培地中の誘導物質の存在と組み合わされた炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールであることが好ましいが、供給期培地によりそれらの要件が満たされる限り、バッチ期においてそれらの用件を満たさない培地の使用が可能であることが見出された。
【００３３】
好ましい態様において、バッチ期及び供給期を有し、供給期培地は炭素源を含有し、炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールであり、供給期培地は、付加的に誘導物質を含有する、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。
【００３４】
主な炭素源として通常、グルコース又は他の糖を含有する公知の増殖系と比較して、本発明の培地は、制限条件下でさえも、高い特異的生産レベルを可能にする、すなわち、好ましくは減退期がない。
【００３５】
特異的生産は、酸素制限条件下の供給期において最も高いことが見出されさえし、一方、グルコース系増殖系では、最も高い特異的生産は、通常、供給期において見出されるが、バイオマスの量は、なお比較的低い。
【００３６】
いずれの理論によっても縛られることを望まないが、本願発明者らは、本発明の方法において、炭素源を含有し、その炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地の使用により、減退期が延期されるか又は存在しなくなりさえすると考える。
【００３７】
異種たんぱく質を製造する方法において、細胞増殖速度及び異種たんぱく質生産が最適であるように、供給条件が好ましくは最適にされる。先に記載したように、菌類が工業的スケールで増殖される場合、発酵槽を用いる流加系が非常に好ましい。
【００３８】
他の好ましい態様において、本発明は、バッチ期、誘導期及び供給期を含み、供給期において、
ａ）菌類細胞が、特定の選択をせずに、いずれかの炭素源を含有する培地で少なくとも５ｇ／ｌの細胞密度まで増殖させ、続いて、菌類細胞を、誘導物質及び炭素源を含有し、その炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである、培地を用いて、5ｇ／ｌより多い、好ましくは１０乃至９０ｇ／ｌの、より好ましくは４０乃至６０ｇ／ｌの細胞密度に増殖させ、
ｂ）工程ａ）の細胞密度が得られた後に、増殖制限条件が生じ、
ｃ）それらの制限条件が開始された後に、炭素源を含有し、その炭素源の５０乃至１００重量％がエタノールである培地でさらに前記細胞を増殖させる
ことを含む、菌類による異種たんぱく質の生産方法に関する。
【００３９】
この好ましい方法において、第一の段階において、バッチ期において炭素基質が消費されるまで細胞は増殖し、第二の段階において、異種たんぱく質生産が多量に行われるのに十分な細胞密度まで細胞は増殖する。この第二の段階の最初の段階において、供給培地への誘導物質の添加により、異種たんぱく質生産は誘導される。０誘導、そして従って、非常に少量の異種たんぱく質生産から、誘導が最大になるまでに至るのにかかる時間を誘導期と呼ぶ。この誘導期は、供給期の最初の段階を構成する。
【００４０】
発酵槽の制限条件は、いくつかの方法により得られる。制限条件は、指数的な細胞の増殖はもはや可能ではなく、細胞増殖は低減すると定義される。
【００４１】
本発明の方法において、好ましくは、培地における制限条件は、
ａ）好ましくは３０％未満の、より好ましくは１５％未満の、発酵槽培地における酸素濃度の低減、
ｂ）培地中のエタノール濃度が、培地において増殖する株の細胞についての増殖制限濃度になるか又は増殖制限濃度より高くなるまで、培地へのエタノールの過剰供給、
ｃ）細胞の増殖のための、好ましくは、窒素、燐、硫黄及びビタミン類から選ばれる他の必須成分の濃度を低減させること
を含む群から選ばれる方法によって生じる。
【００４２】
好ましくは、バッチ期の後に、供給分布は、バイオマス生産とともに指数的に増大する。酸素制限が生じ、減退期に入るときに、供給速度を、好ましくは、発酵槽培地において１０容量％未満のエタノール濃度を維持するような速度に設定する。このことは、例えば、線状供給速度又は脈動的供給速度又は段階的供給速度により得られる。
【００４３】
さらにより好ましい態様において、本発明の方法は、繰り返される流加法として行われる。
【００４４】
好ましくは、誘導物質は、宿主菌類の形質転換に用いられる遺伝子構築物における異種遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターを作動させるのに適する。好ましい誘導物質はガラクトース、メタノール、温度及びホスフェートである。
【００４５】
最も好ましい誘導物質はガラクトースである。
【００４６】
本発明は、エタノールが誘導物質として、かつ炭素源(の一部)として両方として用いられる発現方法に関するものではない。
【００４７】
ガラクトースが誘導物質である場合、培地中のガラクトースの量は非常に低くガラクトースが代謝しないが、プロモーターが望ましい程度に作動するような量でなくてはならない。このことを防ぐために、誘導物質を代謝させることができない株を用いることが可能である。
【００４８】
好ましくは、供給培地の組成は、発酵槽における培地が、０．１乃至１０重量％のガラクトース、より好ましくは０．０５乃至１重量％、さらにより好ましくは０．０５乃至０．２重量％のガラクトースを含有するような組成である。
【００４９】
本発明による培地中の炭素源は、少なくとも５０重量％以上で１００重量％以下のエタノールを含有する。好ましくは、炭素源は、８０乃至１００重量％のエタノールを含有する。炭素源の残りは、例えば、グルコース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、フルクトースのような糖、又はグリセロール、アセテートのような他の化合物、又はホエー及び糖蜜のような複雑な炭素基質であることができる。
【００５０】
菌類は、酵母又は糸状菌であることができる。適する酵母属の例には、サッカロミセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)、クルイベロミセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)、ハンセヌラ(Ｈａｎｓｅｎｕｌａ)が含まれる。適する糸状菌の例には、アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)、リゾプス(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)が含まれる。特に好ましい生物は、サッカロミセス・セレビシアエ(Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｒｅｖｉｓｉａｅ)である。
【００５１】
異種たんぱく質は、その生産が望ましいいずれかのたんぱく質又はペプチドであることができる。本発明の方法は、不凍化ペプチド、抗体又は抗体のフラグメント、又はクチナーゼ(ｃｕｔｉｎａｓｅ)及びガラクトシダーゼのような酵素の生産に特に適していることが見出された。不凍化ペプチドは、氷の成長を修飾する能力を有し、例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖｅｎｃｅｓ、１３巻、3号、３７５乃至４０２頁、１９９５年に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈらにより記載されており、その記載を引用により本明細書に組み込む。
【００５２】
菌類の増殖における種々の段階のための培地は、一般的に、炭素源、バッチ期の後にその存在が必要である任意に誘導物質、並びに、任意に、ビタミン類、酵母エキス、痕跡金属イオン類、望ましい程度にｐＨを維持するための酸性化剤、燐酸塩、硫酸塩水及び消泡剤のような他の成分を含有する。
【００５３】
他の好ましい態様によると、本発明は、バッチ培地が、１乃至４０重量％のグルコース、水、痕跡金属、任意に消泡剤、酵母エキス、ビタミン類、燐酸塩及び硫酸塩を含有し、供給培地が、５乃至３５容量％のエタノール、０．１乃至１０重量％のガラクトース、水、痕跡金属、並びに任意に消泡剤、酵母エキス、ビタミン類、燐酸塩及び硫酸塩を含有し、「供給速度」「ψ」は、１０リットルスケールで０．２５乃至４ｇ／分又はより大きいスケール発酵では相当する値である、異種たんぱく質又はペプチドを生産する方法に関する。
【００５４】
本発明は、さらに、本発明による方法により得られる異種たんぱく質単離物、特に不凍化ペプチド単離物に関する。
【００５５】
以下に、本発明を、下記の非制限的な実施例により示す。
【００５６】
実施例
培地及び培養
すべての培地及び培養データーは、１０リットルスケールのエタノール発酵に基づいている。
【００５７】
１０ｍ３スケールでは、およそスケール係数１，０００に適合する。
【００５８】
培地：
予備培養培地：
【表１】
バッチ培地及び供給培地を、１０リットルスケールについて表１に記載する。
【００６０】
【表２】
すべての培地を、糖を別にして、１２１℃／１.２バール(Ｌｉｎｄｅｎオートクレーブ)において２５分間滅菌した。水道水の量は下記に示しており、総量は、総重量が表１の最下列に示されたような量である。
【００６２】
Ｅｇｌｉビタミン類及び痕跡金属類の組成
【表３】
株
用いられた株は、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ CEN．PK１０２−3Ａであった。塩基性CEN．ＰＫ2 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株は、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈａｎｎ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｇｏｅｔｈｅ-Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｍａｒｉｅ−Ｃｕｒｉｅ−Ｓｔｒａｓｓｅ ９；Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｎ２５０、Ｄ−６０４３９ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、ドイツ国、から市販されている。
【００６４】
このＳ．ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅ株は、ＧＡＬ１遺伝子がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＵＲＡ３遺伝子から誘導された配列の挿入により分裂されているので、ガラクトースを代謝することができない。宿主株は、下記の要素を含有する発現プラスミドで形質転換された：
プロモーター：ＧＡＬ７プロモーター、リーダーＧＡＰＤＨ。ＧＡＬ７プロモーター：2つの上流活性化配列は常に存在する。それらは、結合される配列の部分である2つの天然要素である。
【００６５】
選択マーカー：Ｌｅｕ2ｄ
シグナル配列：インベルターゼ(ＳＵＣ２)
組み込み標的物：酵母染色体ＸＩＩにおける特異的領域への標的化組み込みのための独特の制限部位を有するｒＤＮＡ繰り返しのフラグメント
異種遺伝子：
実施例１：ゲンゲＨＰＬＣ１２不凍化たんぱく質をコードする不凍化たんぱく質遺伝子(ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９７／０２３４３)
実施例２：Ｋ６０９Ｂ、子豚におけるビルレンスファクターに対する抗体
実施例３：重鎖免疫グロブリンであるＨＧＬ１１であるたんぱく質ＶＨＨ Ｇ；欧州特許出願公開第１，１３４，２３１号に開示された、ヒト胃性リパーゼに対するリパーゼインヒビター
実施例４：重鎖免疫グロブリンであるＨＰＬ１８であるたんぱく質ＶＨＨ Ｐ；欧州特許出願公開第１，１３４，２３１号に開示された、ヒトすい臓性リパーゼに対するリパーゼインヒビター
実施例２乃至４のたんぱく質は、欧州特許出願公開第１，１３４，２３１号に開示された操作によるラマの免疫化により得られる抗体である。
【００６６】
培養
株貯蔵
株は、スキムミルク及び２０％のグリセロールの混合物を含有する１：１で希釈されたＹＮＢで増殖された培養物から単一のバッチにおいて−８０℃において貯蔵された。
【００６７】
接種
５０ｍｌのＹＮＢに１ｍｌの貯蔵された株を接種し、３０℃で１５０回／分において４８時間±２時間、インキュベーションした。次に、接種原を２％ＹＰＤ５００ｍｌに移し、次に３０℃で１５０回／分において４８時間±２時間、インキュベーションした。
【００６８】
発酵槽
標準発酵槽で１０リットルの作業容量で発酵を行なった。温度制御のために、発酵槽は、冷却コイル及び加熱フィンガーを備えていた。そらせ板は、標準寸法のものであった。攪拌するために６枚の羽根を有するＲｕｓｈｔｏｎタイプの羽根車を用いた。溶解された酸素(ＤＯ２)をＩｎｇｏｌｄ ＤＯ２電極(Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ)を用いて測定し、ｐＨをＩｎｇｌｏｌｄ Ｉｍｐｒｏ ３０００ゲル電極(Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ)を用いて測定した。排ガスを測定するために質量分光光度計Ｐｒｉｍａ ６００(ＶＧガス分析装置)を用いた。全発酵工程は、自動化され、ソフトウェアーで制御されていたが、後に与えるガイダンスに基づいて手動でも行なうことができる。
【００６９】
発酵を制御するために供給分布が課された。３Ｍのリン酸(Ｂａｋｅｒ)及び１２.５％ｖ／ｖアンモニア(Ｍｅｒｃｋ)を用いてｐＨを調整した。
【００７０】
最大攪拌機速度(１，０００回／分)が生じるまで、羽根車速度の自動的調整によりＤＯ２を３０％において調整した。
【００７１】
乾燥重量決定及び生成物濃度分析のために、発酵中、自動試料採取器を用いて５ｍｌの試料を取り出し、４℃において冷却した。
【００７２】
バッチ期
バッチ期を開始するために、５００ｍｌのＹＰＤ接種原を５.５リットルのバッチ培地に添加した。発酵パラメーターは表３.１によるようであった。排ガス中のエタノール含量が３００ｐｐｍに低減するときに、指数的供給を開始した。
【００７３】
供給期
供給培地を、同じポンプに接続した２つの供給壜に分離した。１つの供給壜は、エタノール及び２リットルまでの水道水を含有し、ボトムプレートにより発酵槽に供給した。第２の供給壜は、すべて他の供給成分及び2リットルまでの水を含有し，トッププレートにより供給した。
【００７４】
１つのポンプに連結された両方の壜から、式１による同じ指数的供給速度を適用した。2つの壜のために得られた供給速度はポンプ速度の２倍である。
【００７５】
【数１】
Φｖ，ｔ＝供給速度 ｇ／分
μ＝増殖速度 時間−１
Ｘ０＝供給開始におけるバイオマス ｇ(Ｍｗ＝２４.６ｇ／モル)
ｔ＝供給開始からの時間 分
ρ供給＝供給密度 ｇエタノール／ｇ供給物質
ＹＸ，Ｓ＝バイオマスの推定収率 ｇバイオマス／ｇ基質
６０＝時間係数 分／時間
供給パラメーターは、表３による。
【００７７】
【表４】
酸素濃度が０％のときに、制限条件が始まり、ポンプ速度を、線状供給速度にした。すべての供給物がなくなるまで供給を続けた。
【００７９】
結果：
実施例１
【表５】
これらの結果に基づいて、供給期において制限条件が生じた後にＡＦＰ生産が生じる場合、１００重量％エタノールである炭素源を含有する培地の供給が続けられることにより、予期しないことに、ＡＦＰの高い特異的生産がもたらされることが結論付けられる。
【００８１】
純粋のＡＦＰ生産性の損失なく、バイオマス生産が一定であったことが見出された。
【００８２】
比較例
供給期における増殖培地は、エタノールを含有せず、炭素源として１００重量％のグルコースを含有した。この実験のための培地は、先に記載している。又、発酵槽供給条件は、供給培地が、すべての成分を含有する1つの供給壜から発酵槽に用いられ、ボトムプレートにより発酵槽に供給されることを除いては先に特定している通りである。式１による指数的供給速度が用いられた。
【００８３】
供給パラメーターは、1つの供給壜を用いて、1つのポンプにおける2つの供給壜を用いるエタノール発酵におけるのと同じ供給速度をもたらすために、２.１１モルに設定されたＸ０値を除いて、表３によるパラメーターであった。
【００８４】
その結果は下記のごとくであった。
【００８５】
【表６】
増殖培地が炭素源としてグルコースしか含有しない場合に、制限条件が開始されたときからＡＦＰ生産は低減することが結論付けられる。ＡＦＰ生産は、もはや増大せず、ＡＦＰ生産は減退する。
【００８７】
結果−実施例２
【表７】
炭素源としてエタノールを用いる異種たんぱく質の特異的生産は、炭素源としてグルコースにおけるよりもずっと高いことが結論付けられる。
【００８９】
結果−実施例３
【表８】
炭素源としてエタノールを用いる異種たんぱく質の特異的生産は、炭素源としてグルコースにおけるよりもずっと高いことが結論付けられる。
【００９１】
結果−実施例４
【表９】
炭素源としてエタノールを用いる異種たんぱく質の特異的生産は、炭素源としてグルコースにおけるよりもずっと高いことが結論付けられる。
Claims (11)
- 炭素源を含有する培地における、ＧＡＬ７プロモーターを含む菌類の増殖を含み、前記炭素源の８０乃至１００重量％がエタノールであり、前記培地は誘導物質を付加的に含有する、菌類によるＧＡＬ７プロモーター制御下での異種たんぱく質の生産方法であり、エタノールが誘導物質としてかつ炭素源（の一部）としての両方として用いられる発現方法に関しない、生産方法。
- バッチ期及び供給期を含み、供給期培地は炭素源を含有し、その炭素源の８０乃至１００重量％がエタノールであり、供給期培地が誘導物質を付加的に含有する、請求項１に記載の方法。
- 供給期培地が炭素源、及び誘導物質として付加的にガラクトースを含有し、炭素源の８０乃至１００重量％がエタノールである、請求項２に記載の方法。
- 前記方法が発酵槽で行なわれ、発酵槽におけるエタノール濃度が１０容量％未満に維持されるような供給速度で培地が発酵槽に供給される、請求項２又は請求項３に記載の方法。
- 前記方法がバッチ期、誘導期及び供給期を含み、供給期において、
ａ）菌類細胞を、特定の選択をせずに、いずれかの炭素源を含有する培地で少なくとも５ｇ／ｌの細胞密度まで増殖させ、続いて、誘導物質及び炭素源を含有し、その炭素源の８０乃至１００重量％がエタノールである培地を用いて、菌類細胞を、５ｇ／ｌより多い、好ましくは１０乃至９０ｇ／ｌの、より好ましくは４０乃至６０ｇ／ｌの細胞密度に増殖させ、
ｂ）工程ａ）の細胞密度が得られた後に、増殖制限条件が生じ、
ｃ）それらの制限条件が開始された後に、炭素源を含有し、前記炭素源の８０乃至１００重量％がエタノールである培地でさらに前記細胞を増殖させる、
請求項１乃至４のいずれか１請求項に記載の方法。 - 前記方法が、繰り返される流加法として行なわれる、請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。
- 誘導物質が、ガラクトース、メタノール、温度及びホスフェートを含む群から選ばれる、請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載の方法。
- 供給培地が０．１乃至１０重量％のガラクトースを含有する、請求項２乃至７のいずれか１請求項に記載の方法。
- 菌類が、酵母であり、好ましくは、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１乃至８のいずれか１請求項に記載の方法。
- 異種たんぱく質又はペプチドが、不凍化ペプチド、抗体又は抗体のフラグメント及び酵素から選ばれる、請求項１乃至９のいずれか１請求項に記載の方法。
- バッチ培地が、１乃至４０重量％のグルコース、水、痕跡金属、並びに任意に消泡剤、酵母エキス、ビタミン類、リン酸塩及び硫酸塩を含有し、供給培地が，５乃至３５容量％のエタノール、０．１乃至１０重量％のガラクトース、水、痕跡金属、並びに任意に消泡剤、酵母エキス、ビタミン類、リン酸塩及び硫酸塩を含有し、「供給速度」「ψ」が、１０リットルスケールで０．２５乃至４ｇ／分である、請求項５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00311095 | 2000-12-13 | ||
| PCT/EP2001/013457 WO2002048382A2 (en) | 2000-12-13 | 2001-11-16 | Method for the production of a heterologous protein by a fungus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004515249A JP2004515249A (ja) | 2004-05-27 |
| JP4494716B2 true JP4494716B2 (ja) | 2010-06-30 |
Family
ID=8173440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002550097A Expired - Lifetime JP4494716B2 (ja) | 2000-12-13 | 2001-11-16 | 菌類による異種たんぱく質の生産方法 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7560249B2 (ja) |
| EP (1) | EP1349945B1 (ja) |
| JP (1) | JP4494716B2 (ja) |
| CN (1) | CN1481439A (ja) |
| AT (1) | ATE351911T1 (ja) |
| AU (2) | AU1604902A (ja) |
| BR (1) | BR0116675A (ja) |
| CA (1) | CA2427665C (ja) |
| CZ (1) | CZ303983B6 (ja) |
| DE (1) | DE60126148T2 (ja) |
| ES (1) | ES2278681T3 (ja) |
| HU (1) | HU228689B1 (ja) |
| IL (1) | IL156438A0 (ja) |
| MX (1) | MXPA03005358A (ja) |
| PL (1) | PL204737B1 (ja) |
| SK (1) | SK287621B6 (ja) |
| WO (1) | WO2002048382A2 (ja) |
| ZA (1) | ZA200303353B (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2121916A1 (en) * | 2006-12-20 | 2009-11-25 | Danisco US, INC., Genencor Division | Assays for improved fungal strains |
| US11214610B2 (en) | 2010-12-01 | 2022-01-04 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| AU2016273912B2 (en) * | 2011-05-20 | 2018-08-02 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| WO2012161956A2 (en) * | 2011-05-20 | 2012-11-29 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris |
| US10150968B2 (en) | 2011-08-19 | 2018-12-11 | Alderbio Holdings Llc | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| US20160024203A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-28 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods of producing antibodies in yeast |
| US20160230141A1 (en) * | 2013-09-19 | 2016-08-11 | Research Foundation Of The City University Of New York | Process for increased yeast biomass |
| CN107427577A (zh) | 2015-03-31 | 2017-12-01 | 韦斯夸尔德有限公司 | 具有蛋白酶可切割接头的肽构建体 |
| WO2016156474A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Vhsquared Limited | Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin a |
| EP3277706A1 (en) | 2015-03-31 | 2018-02-07 | VHsquared Limited | Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b |
| AU2016239948B2 (en) | 2015-03-31 | 2022-03-17 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides |
| WO2018060453A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Vhsquared Limited | Compositions |
| WO2020254828A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Vhsquared Limited | Compositions |
| US20220242945A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-08-04 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides |
| CA3144567A1 (en) | 2019-06-21 | 2020-12-24 | Scott Crowe | Polypeptides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE196505T1 (de) | 1989-07-07 | 2000-10-15 | Unilever Nv | Verfahren zur herstellung eines proteins mittels eines durch mehrfachkopie-integrierung eines expressionsvektors tranformierten pilzes |
| DK0836646T3 (da) | 1995-07-05 | 2005-12-19 | Unilever Nv | Anti-frysepeptider fra havfisk som additiver til födevareprodukter |
| ES2324280T3 (es) | 2000-03-14 | 2009-08-04 | Unilever N.V. | Dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos frente a lipasas dieteticas humanas y sus usos. |
-
2001
- 2001-11-16 ZA ZA200303353A patent/ZA200303353B/en unknown
- 2001-11-16 CN CNA018205372A patent/CN1481439A/zh active Pending
- 2001-11-16 AU AU1604902A patent/AU1604902A/xx active Pending
- 2001-11-16 HU HU0302655A patent/HU228689B1/hu unknown
- 2001-11-16 EP EP01270616A patent/EP1349945B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 ES ES01270616T patent/ES2278681T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 CA CA2427665A patent/CA2427665C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 AU AU2002216049A patent/AU2002216049B2/en not_active Expired
- 2001-11-16 WO PCT/EP2001/013457 patent/WO2002048382A2/en active IP Right Grant
- 2001-11-16 DE DE60126148T patent/DE60126148T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 JP JP2002550097A patent/JP4494716B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 US US10/450,211 patent/US7560249B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 IL IL15643801A patent/IL156438A0/xx active IP Right Grant
- 2001-11-16 PL PL362773A patent/PL204737B1/pl unknown
- 2001-11-16 BR BR0116675-1A patent/BR0116675A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-11-16 CZ CZ20031659A patent/CZ303983B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 AT AT01270616T patent/ATE351911T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 SK SK740-2003A patent/SK287621B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 MX MXPA03005358A patent/MXPA03005358A/es active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE60126148T2 (de) | 2007-05-31 |
| AU1604902A (en) | 2002-06-24 |
| CZ20031659A3 (cs) | 2003-11-12 |
| EP1349945B1 (en) | 2007-01-17 |
| WO2002048382A3 (en) | 2003-01-30 |
| US20040077069A1 (en) | 2004-04-22 |
| AU2002216049B2 (en) | 2005-11-24 |
| HUP0302655A3 (en) | 2004-10-28 |
| SK287621B6 (sk) | 2011-04-05 |
| US7560249B2 (en) | 2009-07-14 |
| PL362773A1 (en) | 2004-11-02 |
| PL204737B1 (pl) | 2010-02-26 |
| SK7402003A3 (en) | 2003-09-11 |
| CA2427665A1 (en) | 2002-06-20 |
| ATE351911T1 (de) | 2007-02-15 |
| HUP0302655A2 (hu) | 2003-11-28 |
| ES2278681T3 (es) | 2007-08-16 |
| ZA200303353B (en) | 2004-04-30 |
| HU228689B1 (hu) | 2013-05-28 |
| CN1481439A (zh) | 2004-03-10 |
| JP2004515249A (ja) | 2004-05-27 |
| IL156438A0 (en) | 2004-01-04 |
| WO2002048382A2 (en) | 2002-06-20 |
| EP1349945A2 (en) | 2003-10-08 |
| MXPA03005358A (es) | 2003-10-06 |
| BR0116675A (pt) | 2003-11-04 |
| CZ303983B6 (cs) | 2013-07-31 |
| CA2427665C (en) | 2011-10-11 |
| DE60126148D1 (de) | 2007-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4494716B2 (ja) | 菌類による異種たんぱく質の生産方法 | |
| EP2368444B1 (en) | Yeast extract with high glutamic acid content and producing method thereof | |
| US20200362371A1 (en) | Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts | |
| Kamzolova et al. | Fermentation conditions and media optimization for isocitric acid production from ethanol by Yarrowia lipolytica | |
| JP2022515199A (ja) | フルクトース利用の向上のために改変した微生物株 | |
| US20070224668A1 (en) | Process for producing 4-vinylguaiacol by biodecaroxylation of ferulic acid | |
| KR100405944B1 (ko) | 단백질 제조방법 | |
| JPH10127274A (ja) | パン酵母組成物及びその製造方法 | |
| Lang et al. | Optimization of fungal polygalacturonase synthesis by Saccharomyces cerevisiae in fed-batch culture | |
| Yalçin et al. | Determination of growth and glycerol production kinetics of a wine yeast strain Saccharomyces cerevisiae Kalecik 1 in different substrate media | |
| JP4149253B2 (ja) | 微生物の低温培養方法 | |
| US20040086990A1 (en) | Method for increasing the intracellular glutamate concentration in yeast | |
| WO2000061722A1 (en) | Process for the production of yeast biomass comprising functionally deleted $i(hxk2) genes | |
| RU2785901C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
| KR0177321B1 (ko) | 재조합 효모로부터 인간 알파 인터페론의 대량 생산 방법 | |
| Pyun et al. | Effects of oxygen on invertase expression in continuous culture of recombinant Saccharomyces cerevisiae containing the SUC2 gene | |
| JP2833037B2 (ja) | グルタチオン高含有酵母の製造方法 | |
| KR0128248B1 (ko) | 재조합 효모의 개선된 유가식 발효방법 | |
| CN114574377A (zh) | 一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用 | |
| KR100472082B1 (ko) | 재조합 단백질의 생산성 증가를 위한 재조합 효모의 배양방법 | |
| Alexander | Factors affecting the production of heterologous protein in Saccharomyces cerevisiae. | |
| JPH0686685A (ja) | 酵母を宿主とする異種蛋白質の効率的製造法 | |
| CS270332B1 (cs) | Způsob výroby kvasničných produktů z metanolu |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20041104 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20041104 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041108 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20041111 |
|
| RD05 | Notification of revocation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7425 Effective date: 20041130 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041217 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070731 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071019 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081202 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090302 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100309 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100408 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4494716 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140416 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |