PL204737B1 - Sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby - Google Patents

Sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby

Info

Publication number
PL204737B1
PL204737B1 PL362773A PL36277301A PL204737B1 PL 204737 B1 PL204737 B1 PL 204737B1 PL 362773 A PL362773 A PL 362773A PL 36277301 A PL36277301 A PL 36277301A PL 204737 B1 PL204737 B1 PL 204737B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
feed
ethanol
phase
carbon source
medium
Prior art date
Application number
PL362773A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362773A1 (pl
Inventor
De Laar Antonius Martinus Johannes Van
Nigel Malcolm Lindner
Peter Nieuwpoort
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of PL362773A1 publication Critical patent/PL362773A1/pl
Publication of PL204737B1 publication Critical patent/PL204737B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heterologicznego białka lub peptydu przez grzyby.
Wytwarzanie białka heterologicznego w gospodarzu takim jak grzyby jest dobrze znane. EP-A-481008 ujawnia wytwarzanie białka heterologicznego w drożdżach hodowanych na glukozie.
Przemysłowa produkcja na dużą skalę białka heterologicznego w organizmie gospodarza metodą fermentacji typu okresowo-dolewowej zazwyczaj wykazuje trzy fazy.
Pierwsza faza jest fazą wsadu i jest określana jako faza, w której komórki hoduje się do wymaganego stężenia. W tej fazie komórki rosną wykładniczo. Modele opisujące fazę wsadu zakładają, że komórki nie umierają, że tlen jest dostępny w nadmiarze oraz że wszystkie inne warunki są tak dobrane, że występuje nieograniczony wzrost. Oznacza to, że w fazie wsadu wszystkie wymagane składniki odżywcze dostarcza się w wystarczającej ilości. Podsumowując, faza wsadu jest fazą, w której komórki są powielane, podczas gdy wytwarzanie (heterologicznego) białka jest jeszcze niskie.
Druga faza jest fazą zasilania i jest określana jako faza, w której do fermentora dostarcza się źródło węgla i inne wymagane środki w strumieniu względnie stężonej cieczy w obliczonym stosunku „wskaźniku zasilania. W tej fazie nacisk jest położony na wytwarzanie białka przez wyhodowane komórki a rozrost komórek prowadzi do wzrostu biomasy. Substrat dostarczany w tym etapie do fermentora jest zasadniczo wykorzystany do wzrostu komórek i syntezy produktu. Wzrost komórek kontroluje się wskaźnikiem zasilania w celu zapewnienia optimum wzrostu komórek i wytwarzania heterologicznego białka.
Ostatecznie osiąga się trzecią fazę, określana jako faza końcowa, w której pojawiają się warunki ograniczające. W tej fazie, na przykład stężenie tlenu w fermentorze spada do zera, co w niektórych przypadkach prowadzi do tworzenia etanolu. W tym etapie, większość komórek jest skupiona na utrzymywaniu się i zazwyczaj zmniejsza się synteza produktu. Chociaż w tej fazie ciągle można obserwować wzrost komórek, to ogólnie wzrost jest zazwyczaj ograniczony do zera. Stopniowo w fazie tej komórki mogą tracić żywotność.
Wytwarzanie heterologicznego białka w pożywce zawierającej powszechnie stosowane źródło węgla, jak glukoza czy inne źródło węgla na bazie cukru, jest satysfakcjonujące dopóki pod koniec fazy zasilania nie pojawią się warunki ograniczające. Przykłady warunków ograniczających obejmują zredukowane stężenie tlenu, zredukowaną ilość składników pokarmowych, jak witaminy, węgiel, azot, oraz gromadzenie się związków toksycznych w pożywce hodowlanej.
Jeśli grzyby, w szczególności drożdże hoduje się na pożywce zawierającej glukozę jako źródło węgla, to produkcja heterologicznego białka znacząco zmniejsza się z pojawieniem się warunków ograniczających.
Dla drożdży hodowanych na powszechnie stosowanej pożywce zawierającej cukier jako źródło węgla w procesie fermentacji typu okresowo-dolewowej występują opisane powyżej fazy. Dlatego z począ tkiem fazy schyłkowej specyficzna produkcja, określona jako ilość heterologicznego białka lub peptydu wytwarzanego na gram biomasy, utrzymuje się lub zmniejsza. Nawet jeśli w fazie końcowej gęstość komórek jest wysoka to synteza produktu jest niższa. Inną wadą powszechnie stosowanych pożywek, często zawierających glukozę jako źródło węgla, jest to, że wysoka ilość substratu przekształca się w biomasę zamiast w produkt, którym jest zazwyczaj heterologiczne białko w kontekście niniejszego wynalazku. Zatem w takich układach, względnie dużej ilości biomasy w sposób nieunikniony towarzyszy produkcja wysokich poziomów heterologicznego białka.
Taka duża ilość biomasy prowadzi do powstawania lepkiej pożywki fermentacyjnej, co na przykład łatwo doprowadza do ograniczenia tlenu.
Zatem istnieje zapotrzebowanie na sposób wytwarzania heterologicznego białka w gospodarzu takim jak grzyby, prowadzący do wysokiej wydajności białka heterologicznego nawet w warunkach ograniczających, gdzie normalnie pojawiłby się spadek i zmniejszenie specyficznej produkcji, podczas gdy w tym samym czasie specyficzna produkcja systemu hodowlanego utrzymywałaby się lub wzrastała w porównaniu ze znanymi układami hodowlanymi.
Sposób według wynalazku pozwala unikać co najmniej jednego ze wskazanych problemów.
Niespodziewanie stwierdzono, że grzyby hodowane na pożywce zawierającej etanol jako główne źródło węgla i induktor, jak galaktoza, do kontrolowania produkcji heterologicznego białka wykazują specyficzne wytwarzanie heterologicznego białka, przy czym to specyficzne wytwarzanie białka heterologicznego jest zaskakująco wysokie nawet w warunkach ograniczających.
PL 204 737 B1
Nieoczekiwanie grzyby hodowane według tego sposobu nie wykazują dobrze znanych cech hodowli schyłkowych, które posiadają grzyby hodowane na tradycyjnej pożywce z glukozą. W warunkach zasilania pożywką zawierającą takie specyficzne źródło węgla, grzyby utrzymują lub nawet podnoszą poziom całkowitego i specyficznego wytwarzania heterologicznego białka.
Zatem przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby, który obejmuje hodowanie grzyba, korzystnie drożdży lub pleśni, na pożywce zawierającej źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol i dodatkowo zawierającej induktor, z wyłączeniem sposobów ekspresji, w których etanol jest stosowany zarówno jako induktor oraz częściowo jako źródło węgla.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje fazę wsadu i fazę zasilania, przy czym pożywka fazy zasilania zawiera źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol i pożywka fazy zasilania dodatkowo zawiera induktor.
Zwłaszcza korzystnie pożywka fazy zasilania zawiera źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol i dodatkowo zawiera galaktozę jako induktor.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się fermentor zasilany pożywką z takim wskaźnikiem zasilania, że stężenie etanolu w fermentorze utrzymuje się poniżej 10% objętościowych.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje fazę wsadu, fazę indukcji i fazę zasilania, przy czym w fazie zasilania:
a) komórki grzyba hoduje się do gęstości komórek co najmniej 5 g/l, w pożywce zawierającej dowolne źródło węgla, bez specyficznych preferencji, a następnie komórki grzyba są hodowane do gęstości komórek ponad 5 g/l, korzystnie 10 do 90 g/l, bardziej korzystnie 40 do 60 g/l, przy użyciu pożywki zawierającej induktor i źródło węgla, w którym 50-100% wagowych stanowi etanol;
b) po osiągnięciu gęstości komórek z etapu (a) doprowadza się hodowlę do limitujących warunków wzrostu;
c) po ustaleniu takich limitujących warunków, komórki dalej hoduje się na pożywce zawierającej źródło węgla, w którym 50-100% wagowych stanowi etanol.
Korzystnie sposób według wynalazku jest powtarzanym procesem okresowo-dolewowym.
Korzystnie w sposobie według wynalazku induktor jest wybrany z grupy obejmującej galaktozę, metanol, temperaturę i fosforany.
Korzystnie pożywka zasilająca zawiera od 0,1 do 10% wagowych galaktozy.
Korzystnie w sposobie według wynalazku źródło węgla zawiera 80-100% wagowych etanolu.
Korzystnie w sposobie według wynalazku grzybem są drożdże, korzystnie Saccharomyces cerevisiae.
Korzystnie heterologiczne białko lub peptyd są wyselekcjonowane z peptydów zapobiegających zamarzaniu, przeciwciał lub ich fragmentów i enzymów.
Korzystnie pożywka wsadu zawiera 1-40% wagowych glukozy, wodę, metale śladowe, ewentualnie środek przeciwpieniący, ekstrakt drożdżowy, witaminy, sole fosforanowe i sole siarczanowe, przy czym pożywka zasilająca zawiera od 5 do 35% wagowych etanolu, 0,1-10% wagowych galaktozy, wodę, metale śladowe i ewentualnie środek przeciwpieniący, ekstrakt drożdżowy, witaminy, sole fosforanowe i sole siarczanowe, przy czym „wskaźnik zasilania ,,φ wynosi od 0,25 do 4 g/minutę w skali 10 litrów.
W kontekście niniejszego wynalazku określenie grzyb obejmuje drożdże i pleśnie.
Dla celów wynalazku, określenie białko heterologiczne oznacza zarówno białka jak i peptydy.
Białko heterologiczne jest białkiem, które nie jest naturalnie wytwarzane przez grzyba, lecz tylko po modyfikacji grzyba w tym zakresie.
Kiedy podano procenty wagowe to są to procenty wagowe liczone na wagę całego produktu lub całej pożywki, o ile nie podano inaczej.
Kiedy stosuje się określenie stężenie tlenu, dotyczy ono stężenia rozpuszczonego tlenu, zmierzone metodą zilustrowaną w przykładach.
Koniec fazy wsadu określa się jako moment gdy zużyty jest cały substrat węglowy dostarczany komórkom.
Faza indukcji jest określana jako faza rozpoczynająca się po fazie wsadu, od momentu gdy rozpoczyna się indukcja heterologicznego białka do momentu osiągnięcia maksymalnej indukcji dla danego stężenia specyficznego induktora.
Źródłem węgla określa się substrat dostarczający komórce zapasu węgla i energii. Grzyby pozyskują swój węgiel komórkowy głównie ze związków organicznych. Te zazwyczaj stanowią zarówno
PL 204 737 B1 źródło węgla jak i źródło energii: są częściowo przyswajane przez materiał komórkowy, a częściowo utleniane dla dostarczenia energii. W tym kontekście przytacza się publikację H. Schlegel w General microbiology, Cambridge University press, 1992, wyd. 7, str. 194.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heterologicznego białka przez grzyba. W celu wytworzenia tego białka, grzyb zasadniczo zmodyfikuje się tak, że możliwa jest kontrolowana produkcja heterologicznego białka lub peptydu.
Do takiej modyfikacji genetycznej można zastosować dowolny odpowiedni konstrukt, lub metodę transformacji. Przykłady odpowiednich konstruktów i metod transformacji podano publikacji patentowej EP-A-481008.
Zazwyczaj zmodyfikowany grzyb będzie po modyfikacji obejmującej (zintegrowany) wektor, obejmujący gen kodujący heterologiczne białko pod kontrolą promotora. Aktywność promotora reguluje się tak zwanym induktorem. Przykłady promotorów obejmują promotory galaktozowe jak GAL4, GAL7 indukowane przez galaktozę; promotory metanolowe, indukowane metanolem; promotory etanolowe, indukowane etanolem; promotory regulowane temperaturą, indukowane zmianą temperatury; promotory regulowane fosforanem, indukowane obecnością fosforanu oraz promotory reprymowane glukozą, indukowane przy braku glukozy,
Grzyb hoduje się w pożywce obejmującej źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol w kombinacji z obecnym w pożywce induktorem.
W stanie techniki zazwyczaj odradza się stosowanie etanolu jako źródła węgla, jak przykładowo w ujawnieniu cytowanym poniż ej. W skrócie podawano, ż e stosowanie etanolu zamiast glukozy jako źródła węgla redukuje ilość biomasy, wymaga wyższego zużycia tlenu a tym samym prowadzi do braku lub ograniczenia wzrostu w warunkach ograniczających tlen. Ponadto, toksyczność etanolu dla szczepów może prowadzić do utraty żywotności i śmierci komórek. Jest to na przykład pokazane w Tab.1 z publikacji The yeasts, t.3, wyd.2, rozdz.6. Specyficznie odnosz ąc się do Załącznika 1 tej publikacji, gdzie pokazano, że współczynnik wzrostu dla drożdży na etanolu wynosi 0,1 godz.-1 w stosunku do 0,35 godz.-1 na glukozie. Ten Załącznik ujawnia ponadto, że na pożywce z etanolem jako substratem węglowym drożdże wykazują wyższe zużycie tlenu niż na pożywce zawierającej glukozę jako substrat węglowy.
Wzrost komórek na etanolu jako źródle węgla jest także opisany przez Shiba i wsp. (J. of bioscience and bioengineering, t.89, str.426-430, 2000). Shiba ujawnia ekspresję karboksypeptydazy Y (CPY) przy użyciu promotora GAL10 w mutancie Saccharomyces cerevisiae gal80. Pożywka hodowlana zawiera etanol jako jedyne źródło węgla. Po rozpoczęciu zasilania etanolem, notowano spadek zarówno współczynnika wzrostu jak i wytwarzania CPY. Ten układ nie znajduje się pod kontrolą induktora.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu, w którym wytwarzanie białka utrzymuje się, lub nawet indukuje, w obecności pożywki zawierającej źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol, w szczególności gdy pojawiają się limitujące warunki wzrostu. Ponadto, sposób według wynalazku można stosować dla dowolnego typu grzyba i do hodowli nie są wymagane specyficzne mutanty gal80. Sposób według wynalazku jest także kontrolowany przez indukcję.
Saliola, M i wsp. (Applied and environmental microbiology, Jan. 1999, str. 53-60) ujawnia stosowanie promotora KlADH4 indukowanego etanolem dla ekspresji genu heterologicznego w Kluyveromyces lactis. Dokument podaje, że ekspresja jest optymalna gdy etanol stosuje się jako pobudzające, a jednocześnie jedyne źródło węgla w układzie okresowo-dolewowym. Taki układ wytwarzania uniemożliwia kontrolowanie ekspresji genu w fazie zasilania.
Kolejną korzyścią sposobu według wynalazku jest kontrolowanie wytwarzanego ciepła, co jest ważne przy wytwarzaniu białek wrażliwych na temperaturę.
Korzystnie pożywka zawierała źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol w kombinacji z obecnym w poż ywce induktorem, przez wszystkie fazy, choć ustalono, że można stosować pożywkę nie spełniającą tych wymagań w fazie wsadu, jeśli wymagania te spełnia pożywka z fazy zasilania.
W korzystnym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heterologicznego biał ka przez grzyba, gdzie sposób obejmuje fazę wsadu i fazę zasilania, przy czym pożywka fazy zasilania zawiera źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol, przy czym pożywka z fazy zasilania dodatkowo zawiera induktor.
W porównaniu ze znanymi ukł adami hodowlanymi, zazwyczaj zawierają cymi glukozę , lub inny cukier, jako główne źródło węgla, pożywka zgodnie z wynalazkiem umożliwia specyficzne
PL 204 737 B1 wytwarzanie na wysokim poziomie, nawet w limitowanych warunkach; tzn. korzystnie nie występuje faza schyłkowa.
Stwierdzono, że specyficzne wytwarzanie było wyższe w fazie zasilania nawet w warunkach ograniczonego tlenu, podczas gdy w układach hodowlanych na bazie glukozy wyższe specyficzne wytwarzanie zazwyczaj występuje w fazie zasilania, gdzie ilość biomasy jest stale względnie mała.
Bez potrzeby wiązania się jakąkolwiek teorią, twórcy wynalazku uważają, że w sposobie według wynalazku, faza schyłkowa jest rozciągnięta, lub nawet nie występuje ze względu na stosowanie pożywki zawierającej źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol.
W sposobie wytwarzania heterologicznego białka, warunki zasilania korzystnie optymalizuje się tak, że współczynnik wzrostu komórek i wytwarzanie heterologicznego białka są optymalne.
Jak podkreślono wyżej, jeśli grzyb hoduje się na skalę przemysłową to bardzo korzystny jest układ okresowo-dolewowy wykorzystujący fermentor.
W innym korzystnym wykonaniu, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heterologicznego białka przez grzyba, który to sposób obejmuje fazę wsadu, fazę indukcji i fazę zasilania, przy czym w tej fazie zasilania:
a) komórki grzyba hoduje się do gęstości komórek co najmniej 5 g/l, w pożywce zawierającej dowolne źródło węgla, bez specyficznych preferencji, a następnie komórki grzyba hoduje się do gęstości komórek ponad 5 g/l, korzystnie 10 do 90 g/l, bardziej korzystnie 40 do 60 g/l, przy użyciu pożywki zawierającej induktor i źródło węgla, gdzie 50-100% wagowych źródła węgla stanowi etanol;
b) po osiągnięciu gęstości komórek z etapu (a) stwarza się limitujące warunki wzrostu;
c) po ustaleniu takich limitujących warunków, komórki dalej hoduje się na pożywce zawierającej źródło węgla, gdzie 50-100% wagowych źródła węgla stanowi etanol.
W tym korzystnym sposobie, w pierwszym etapie komórki hoduje się w fazie wsadu aż do zużycia substratu węglowego a w drugim etapie komórki hoduje się do wystarczającej gęstości umożliwiającej wytwarzanie heterologicznego białka w dużych ilościach. W pierwszych etapach drugiej fazy, wytwarzanie heterologicznego białka indukuje się przez dodanie do pożywki zasilającej induktora. Czas potrzebny na przejście od indukcji zero, a tym samym wytwarzania heterologicznego białka na bardzo niskim poziomie, do indukcji maksymalnej nazywa się fazą indukcji. Ta faza indukcji trwa przez pierwszy etap fazy zasilania.
Warunki limitujące w fermentorze można uzyskać różnymi drogami. Warunki limitujące określa się jako takie warunki, w których wykładniczy wzrost komórek nie jest dłużej możliwy i wzrost komórek maleje.
Korzystnie w sposobie według wynalazku, warunki limitujące w pożywce tworzy się sposobem wybranym z grupy obejmującej:
a) redukcję stężenia tlenu w pożywce w fermentorze, korzystnie do poniżej 30%, bardziej korzystnie do poniżej 15%;
b) zwiększenie zasilania pożywki etanolem aż poziom etanolu w pożywce jest równy lub wyższy od stężenia limitującego wzrost komórek szczepu hodowanego w pożywce;
c) obniżenie poziomu innych składników niezbędnych dla wzrostu komórek, gdzie omawiane składniki są wybrane spośród azotu, fosforu, siarki i witamin.
Korzystnie, po fazie wsadu profil zasilania wzrasta wykładniczo wraz z wytwarzaniem biomasy. Kiedy wzrasta ograniczenie tlenu to rozpoczyna się faza schyłkowa, współczynnik zasilania korzystnie ustala się na takim poziomie, aby utrzymać stężenie etanolu poniżej 10% w pożywce w fermentorze. Można to uzyskać, na przykład przez liniowy współczynnik zasilania, albo przez pulsujący współczynnik zasilania, albo przez skokowy współczynnik zasilania.
W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu, sposób wedł ug wynalazku prowadzi się jako powtarzany proces okresowo-dolewowy.
Korzystnie induktor odpowiednio włącza promotor, który jest funkcjonalnie połączony z heterologicznym genem w konstrukcie genowym stosowanym do transformacji gospodarza grzybowego. Korzystnymi induktorami są galaktoza, metanol, temperatura i fosforany.
Najbardziej korzystnym induktorem jest galaktoza.
Niniejszy wynalazek nie dotyczy sposobów ekspresji, w których etanol stosuje się zarówno jako induktor oraz częściowo jako źródło węgla.
Kiedy galaktoza jest źródłem węgla, to ilość galaktozy w pożywce powinna korzystnie być taka, że promotor jest włączony na żądanym poziomie przy niskiej ilości galaktozy, która sama nie
PL 204 737 B1 jest metabolizowana. Dla ochrony przed tym można stosować szczep niezdolny do metabolizowania induktora.
Korzystnie skład pożywki zasilającej jest taki, że pożywka w fermentorze zawiera od 0,1 do 10% wagowych galaktozy bardziej korzystnie 0,05 do 1% wagowego, jeszcze bardziej korzystnie od 0,05 do 0,2% wagowych galaktozy.
Źródło węgla w pożywce, zgodnie z wynalazkiem zawiera, co najmniej 50% wagowych i do 100% wagowych etanolu. Korzystnie, źródło węgla zawiera od 80 do 100% wagowych etanolu. Pozostałą część źródła węgla może stanowić, na przykład cukier, jak glukoza, galaktoza, laktoza, sacharoza, fruktoza, czy inny związek, jak glicerol, octan lub kompleks substratów węglowych, jak serwatka lub melasa.
Grzybami mogą być drożdże lub pleśnie. Przykłady odpowiednich rodzajów drożdży obejmują Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula. Przykłady odpowiednich rodzajów pleśni obejmują Aspegillus, Rhizopus, Trichoderma.
Szczególnie korzystnym organizmem jest Saccharomyces cerevisiae.
Białkiem heterologicznym może być dowolne białko lub peptyd, którego wytwarzanie jest pożądane. Sposób według wynalazku jest szczególnie odpowiedni do wytwarzania peptydów zapobiegających zamarzaniu, przeciwciał lub ich fragmentów, albo enzymów, jak kutynaza i galaktozydaza.
Peptydy zapobiegające zamarzaniu są białkami posiadającymi zdolność modyfikowania wzrostu lodu i na przykład są opisane w publikacji Biotechnology advances t.13, nr 3, str.375-402, 1995 przez Griffith i wsp.
Pożywka dla różnych faz wzrostu grzyba zazwyczaj zawiera źródło węgla, ewentualnie induktor, którego obecność jest wymagana po fazie wsadu, oraz ewentualnie dodatkowe składniki, jak witaminy, ekstrakt drożdżowy, jony metali śladowych, środki zakwaszające utrzymujące pH na odpowiednim poziomie, sole fosforanowe, uwodnione sole siarczanowe oraz środek przeciwpieniący.
Zgodnie z innym korzystnym wykonaniem wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania heterologicznego białka lub peptydu, gdzie pożywka wsadu zawiera 1-40% wagowych glukozy, wodę, metale śladowe, ewentualnie środek przeciwpieniący, ekstrakt drożdżowy, witaminy, sole fosforanowe i sole siarczanowe, i gdzie pożywka zasilająca zawiera od 5 do 35% wagowych etanolu, 0,1-10% wagowych galaktozy, wodę, metale śladowe, ewentualnie środek przeciwpieniący, ekstrakt drożdżowy, witaminy, sole fosforanowe i sole siarczanowe, gdzie „wskaźnik zasilania „φ wynosi od 0,25 do 4 g/min. w skali 10 litrowej, lub odpowiednią wartość dla fermentacji na większą skalę.
Ponadto wynalazek dotyczy wydzielania heterologicznego białka, w szczególności wydzielania peptydu zapobiegającego zamarzaniu, wytworzonego sposobem według wynalazku.
Wynalazek zostanie bliżej zilustrowany podanymi poniżej nieograniczającymi przykładami.
Podłoża i hodowla
Wszystkie dane dotyczące pożywek i hodowli podane są dla fermentacji etanolowej w skali 10 litrów.
Podobnie jest dla skali 10 m3, przy uwzględnieniu czynnika skali 1000.
Podłoża:
Podłoża do wstępnej hodowli:
Podłoża do inokulacji Składnik g/l Dostawca
YNB Yeast nitrogen base YNB w/o aminokwasy 6,7 Difco
Glukoza*1 aqua 5 AVEBE
W wodzie demineralizowanej
YPD Yeast peptone dextrose YE 10 Difco
Pepton bacto 20 Difco
Glukoza*1 aqua 20 AVE BE
W demineralizowanej wodzie
PL 204 737 B1
W Tabeli 1 podano składy poż ywki wsadu i zasilającej dla skali 10 litrów.
T a b e l a 1
Składnik Dostawca Stężenie (g/kg)
Wsad Etanol zasilający Materiał odżywczy np. glukoza
Glukoza Avebe 22,0 - 440,0
Woda z kranu
Etanol* Lamers & Pleuger - 333,84 -
Woda z kranu
Galaktoza HMS - 3,0 3,0
Woda z kranu
YE Kat G Ohly 10,0 25,0 25,0
KH2PO4 Acros 2,1 12,0 12,0
MgSO4x7H2O Merck 0,6 2,5 2,5
Witaminy Egli Patrz Tab. 2 1,0 2,0 2,0
Metale śladowe Egli Patrz Tab. 2 10,0 20,0 20,0
Structol J 673 Schill & Seilacher 0,4 0,8 0,8
Woda z kranu
Waga ogółem (g) 5,500 4,000 4,000
* Czysty etanol, 96,2% objętoś ciowych, niedenaturowany
Wszystkie podłoża sterylizowano przez 25 minut w warunkach 121°C/1,2 bara (autoklaw Linden), cukry osobno. Objętości wody z kranu są podane poniżej a całkowita objętość jest taka, aby ogólna waga wynosiła jak podano w dolnym wierszu tabeli 1.
T a b e l a 2: Kompozycja witamin i skład metali ś ladowych Egli
Witaminy Egli (roztwór podstawowy 1000x) Metale śladowe Egli (roztwór podstawowy 100x)
Składnik g/l Składnik g/l
Tiamina (HCI) 5,00 CaCI2 x 2 H2O 5,50
Meso-inosit 47,00 FeSO4 x 7 H2O 3,73
Pirydoksyna 1,20 MnSO4 x 1 H2O 1,40
Pantotenian 23,00 ZnSO4 x 7 H2O 1,35
Biotyna 0,05 CuSO4 x 5 H2O 0,40
CoCI2 x 6 H2O 0,45
Witaminy sterylizowano przy użyciu filtra 0,22 μm
Szczep:
Stosowano szczep Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A. Szczep wyjściowy S. cerevisiae CEN.PK2 jest dostępny handlowo z firmy EUROSCARF, Institute for Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt, Marie-Curie Strasse 9; Bulding N250, D-60439 Frankfurt, Germany.
PL 204 737 B1
Szczep S. cerevisiae nie jest zdolny do metabolizowania galaktozy, ze względu na to, że gen GAL1 został uszkodzony przez insercję sekwencji pochodzącej z genu URA3 z S. cerevisiae. Szczep gospodarza stransformowano plazmidem ekspresyjnym obejmującym następujące elementy:
Promotor: promotor GAL7, lider GAPDH. Promotor GAL7: obecne są zawsze dwie położone powyżej sekwencje aktywujące. Są one 2 naturalnymi elementami, które są częścią przyłączanej sekwencji.
Marker selekcyjny: Leu2d
Sekwencja sygnałowa: inwertazy (SUC2)
Miejsce integracji: fragment powtórzenia rDNA z unikatowym miejscem restrykcyjnym dla integracji docelowej w specyficzny obszar w chromosom XII drożdży. Gen heterologiczny:
P r z y k ł a d 1: Gen białka zapobiegającego zamarzaniu kodujący białko zapobiegające zamarzaniu HPLC12 z ryby oceanicznej Trispoterus luscus (WO-A-9702343).
P r z y k ł a d 2: K609B, przeciwciało skierowane przeciwko czynnikom wirulencji u prosiąt.
P r z y k ł a d 3: Białko VHH G, HGL11, które jest łańcuchem ciężkim immunoglobuliny; inhibitor lipazy przeciwko ludzkiej lipazie żołądkowej ujawniony w publikacji patentowej EP-A-1134231.
P r z y k ł a d 4: Białko VHH P, HGL18, które jest łańcuchem ciężkim immunoglobuliny; inhibitor lipazy przeciwko ludzkiej lipazie trzustki ujawniony w publikacji patentowej EP-A-1134231.
Białka z przykładów 2-4 są przeciwciałami uzyskanymi poprzez immunizację lamy według procedur ujawnionych w EP-A-1134231.
Hodowla
Przechowywanie szczepu: Szczepy przechowywano w -80°C w jednej porcji pochodzącej z hodowli w YNB, rozcieńczone 1:1 mieszaniną odtłuszczonego mleka i 20% glicerolem.
Inokulacja: 50 ml YNB zaszczepiano 1 ml szczepu do przechowania i inkubowano przez 48 godz. ± 2 godz. w temperaturze 30°C przy 150 obrotach na minutę. Następnie hodowlę inokulum przenoszono do 500 ml 2% YPD, i inkubowano przez 24 godz. ± 2 godz. w 30°C przy 150 obrotów na minutę.
Fermentor: Fermentację prowadzono w standardowych fermentorach z objętością roboczą dziesięciu litrów. W celu kontrolowania temperatury, fermentor wyposażono w spiralę chłodzącą i grzałkę. Przegrody posiadały standardowe wymiary. Do mieszania stosowano mieszadło typu Rushton z sześcioma ramionami.
Rozpuszczony tlen (DO2) mierzono elektrodą Ingold do DO2 typu (Mettler-Toledo) a pH mierzono elektrodą Ingold Impro 3000 gel (Mettler-Toledo). Do pomiaru uwalnianego gazu stosowano spektrofotometr masowy Prima 600 (systemy VG gas analisis). Cały proces fermentacji był zautomatyzowany i kontrolowany przy pomocy oprogramowania, ale również mógłby być prowadzony ręcznie w oparciu o informacje dostarczone poniżej. W celu kontrolowania fermentacji narzucono profil zasilania. Kontrolowano pH przy użyciu 3M kwasu fosforowego (Baker) i 12,5% (v/v) amoniaku (Merck). DO2 utrzymywano na poziomie 30% przez automatyczne dostosowywanie szybkości mieszadła aż do osiągnięcia maksymalnej szybkości mieszania (1000 obrotów) na minutę).
W czasie trwania fermentacji pobierano 5 ml próbki, przy pomocy automatu do pobierania próbek, i schładzano w 4°C w celu określenia suchej masy i badania stężenia produktu.
Faza wsadu
Dla wystartowania fazy wsadu 500 ml inokulum z YPD dodano do 5,5 l pożywki wsadu. Parametry fermentacji były zgodne z podanymi w tabeli 3. Ekspotencjalne zasilanie rozpoczynano wówczas, gdy zawartość etanolu w uwalnianym gazie spadała poniżej 300 ppm.
Faza zasilania
Pożywka zasilająca była rozdzielona na dwie butelki zasilające podłączone do pompy.
Jedna butelka zasilająca zawierała etanol i wodę z kranu do 2 litrów, podawano z niej do fermentora przez dolną płytę.
Druga butelka zasilająca zawierała wszystkie inne składniki odżywcze i wodę z kranu do 2 litrów i podawano z niej do fermentora przez górną płytę.
Dla obu butelek, podłączonych do pompy, stosowano taki sam wykładniczy wskaźnik zasilania według równania 1. Dla dwóch butelek uzyskiwany wskaźnik podawania jest dwukrotnie wyższy od szybkości pompy.
PL 204 737 B1 μ * Xo * e^ Pzasilania * YX,S * 60
[g/min]
Φν,( = wskaźnik zasilania μ = wskaźnik wzrostu
Xo = biomasa przy rozpoczęciu zasilania t = czas od rozpoczęcia zasilania Pzasilania = gęstość zasilania YX,S = szacunkowy przyrost biomasy 60 = współczynnik czasu (równanie 1) g/min.
h-1 g (Mw = 24,6 g/mol) min.
g etanolu /g materiału odżywczego g X/ g substratu min./godz.
Parametry zasilania w oparciu o dane z tabeli 3.
T a b e l a 3: Parametry zasilania fermentacji dla 10-litrowej fermentacji etanolowej
Parametr Wartość
μ (1/godz.) 0,06
Xo (mol) 1,06
P zasilania (g/g) 0,41
Yx,s (g/g) 0,45
T wsadu (°C) 30
T zasilania (°C) 21
Przepływ powietrza w fazie wsadu (1/min.) 2
Przepływ powietrza w fazie zasilania (1/min.) 6
DO2 (%) 30
DO2 minimum (%) 0
PH 5
SS min (rpm) 300
SS max (rpm) 1000
Kryterium EtOH rozpoczęcia fazy zasilania (ppm) 300
Kryterium EtOH rozpoczęcia fazy końcowej (ppm) 800
Maximum EtOH (ppm) 2000
Początkowy wskaźnik całkowitego zasilania (g/min.) 0,28 g/min
Liniowy wskaźnik całkowitego zasilania (g/min.) 2 g/min
Gdy stężenie tlenu wynosiło 0%, warunki ograniczające były ustalone i szybkość pompy regulowano tak by wskaźnik zasilania był liniowy. Zasilanie kontynuowano do wyczerpania całego materiału odżywczego.
Wyniki:
P r z y k ł a d 1
Etanol jako źródło węgla
Czas (godz.) AFP (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g)
1 2 3 4
0 0 2,4 0
PL 204 737 B1 ciąg dalszy
1 2 3 4
3 0 3,4 0
6 0 5,7 0
9 0 7,6 0
12 0 10,9 0
15 0 10,5 0
18 0 11,7 0
21 0 13,3 0
24 0 15,6 0
27 7,0 17,9 0,393
30 11,4 20,7 0,549
33 17,9 24,8 0,721
36 24,2 28,8 0,840
39 32,4 32,7 0,990
42 41,8 38,4 1,089
45 52,4 42,7 1,227
48 66,9 49,0 1,366
51 78,7 55,0 1,432
54 93,7 60,6 1,546
57 112,2 64,8 1,732
60 132,1 68,6 1,925
63 151,2 71,9 2,104
66 165,8 75,5 2,195
*Specyficzna produkcja: mg AFP/g substancji suchej
Na podstawie uzyskanych wyników ustalono, że jeśli w fazie zasilania, po warunkach ograniczających, produkcja AFP wzrasta, a zasilanie pożywką zawierającą źródło węgla, które stanowi w 100% wagowych etanol kontynuuje się, to otrzymuje się wysoce specyficzne wytwarzanie AFP.
Zaobserwowano, że wytwarzanie biomasy było stałe bez straty bezwzględnej produktywności AFP.
Przykład porównawczy
Pożywka wzrostowa fazy zasilania nie zawierała etanolu jako źródła węgla, lecz glukozę, 100% wagowych. Stosowana w tym doświadczeniu pożywka jest opisana powyżej. Również warunki zasilania fermentora podano powyżej z następującymi wyjątkami:
Fermentor zasilano przez dolną płytę z jednej butelki zasilającej, zawierającej pożywkę zasilającą z wszystkimi składnikami. Stosowano taki sam wykładniczy wskaźnik zasilania według równania 1.
Stosowano parametry zasilania według tabeli 3 z wyjątkiem wartości Xo, która wynosiła 2,11 mola, co dało taki sam wskaźnik zasilania z jedną butelką jak w fermentacji etanolowej z dwiema butelkami przy jednej pompie.
Uzyskano następujące wyniki:
Czas (godz.) AFP (mg/kg) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g)
1 2 3 4
0 0 1,9 0
3 0 3,3 0
PL 204 737 B1 ciąg dalszy
1 2 3 4
6 0 5,5 0
9 0 7,2 0
12 0 10,4 0
15 0 11,4 0
18 0 13,3 0
21 0,8 15,8 0,049
24 2,6 18,4 0,142
27 5,8 20,3 0,286
30 10,3 24,6 0,421
33 16,8 28,6 0,588
36 25,5 33,0 0,773
39 35,4 37,5 0,942
42 46,8 43,4 1,077
45 60,3 50,0 1,204
48 74,4 55,9 1,331
51 90,8 62,9 1,445
57 126,4 79,2 1,596
60 135,2 79,5 1,701
63 135,13 79,3 1,705
Ustalono, że od momentu ustalenia warunków ograniczających wytwarzanie AFP obniża się, gdy podłoże wzrostowe zawiera jedynie glukozę jako substrat węglowy. Wytwarzanie AFP już więcej nie wzrasta i produkcja obniża się.
Wyniki - P r z y k ł a d 2
Etanol jako źródło węgla Glukoza jako źródło węgla (porównawczy przykład 2)
VHH (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g) VHH (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g)
0 0,91 0 0 6,63 0,00
0 6,17 0 0 12,34 0,00
0 11,66 0 106,33 25,60 4,15
141,77 21,26 6,67 248,09 35,65 6,96
927,40 48,68 19,05 425,30 45,02 9,45
1063,26 51,65 20,58 673,40 57,59 11,69
1222,75 56,68 21,57 856,52 72,22 11,86
1151,87 55,31 20,83 915,59 71,31 12,84
*specyficzna produkcja: mg heterologicznego białka/ g suchej substancji
Ustalono, że przy stosowaniu etanolu jako źródła węgla specyficzna produkcja heterologicznego białka jest znacznie wyższa niż przy stosowaniu glukozy jako źródła węgla.
PL 204 737 B1
Wyniki - P r z y k ł a d 3
Etanol jako źródło węgla Glukoza jako źródło węgla (porównawczy przykład 3)
Czas (godz.) VHH (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g) Czas (godz.) VHH (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g)
3 0 2,87 0 21 103,45 17,19 6,02
6 0 5,73 0 27 127,59 20,78 6,14
9 0 6,93 0 33 227,59 28,66 7,94
33 268,97 45,37 5,93 39 272,41 36,78 7,41
36 417,24 50,86 8,20 45 327,59 47,52 6,89
39 537,93 54,45 9,88 51 413,79 57,07 7,25
42 689,66 56,36 12,24 57 503,45 64,48 7,81
63 565,52 67,10 8,43
69 596,55 69,73 8,56
*specyficzna produkcja: mg heterologicznego białka/ g suchej substancji
Ustalono, że przy stosowaniu etanolu jako źródła węgla specyficzna produkcja heterologicznego białka jest znacznie wyższa niż przy stosowaniu glukozy jako źródła węgla.
Wyniki - P r z y k ł a d 4
Etanol jako źródło węgla Glukoza jako źródło węgla (porównawczy przykład 4)
Czas (godz.) VHH (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g) Czas (godz.) VHH (mg/kg bulionu fermentacyjnego) Sucha substancja (g/kg) Specyficzna produkcja* (mg/g)
0 0,00 0,72 0,00 15 13,79 10,51 1,31
12 0,00 9,79 0,00 21 27,59 16,00 1,72
18 13,79 17,19 0,80 27 55,17 19,10 2,89
24 155,17 25,31 6,13 33 117,24 25,07 4,68
30 275,86 35,82 7,70 39 155,17 32,00 4,85
36 403,45 46,80 8,62 45 213,79 45,13 4,74
39 472,41 50,63 9,33 51 210,34 56,83 3,70
42 620,69 53,49 11,60 57 255,17 68,30 3,74
45 675,86 58,03 11,65
*Specyficzna produkcja: mg białka/g suchej substancji
Ustalono, że przy stosowaniu etanolu jako źródła węgla specyficzna produkcja heterologicznego białka jest znacznie wyższa niż przy stosowaniu glukozy jako źródła węgla.

Claims (12)

1. Sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby, znamienny tym, że obejmuje hodowanie grzyba, korzystnie drożdży lub pleśni, na pożywce zawierającej źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol i dodatkowo zawierającej induktor, z wyłączeniem sposobów ekspresji, w których etanol jest stosowany zarówno jako induktor oraz częściowo jako źródło węgla.
PL 204 737 B1
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje fazę wsadu i fazę zasilania, przy czym pożywka fazy zasilania zawiera źródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol i pożywka fazy zasilania dodatkowo zawiera induktor.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że poż ywka fazy zasilania zawiera ź ródło węgla, którego 50-100% wagowych stanowi etanol i dodatkowo zawiera galaktozę jako induktor.
4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, ż e stosuje się fermentor zasilany pożywką z takim wskaźnikiem zasilania, że stężenie etanolu w fermentorze utrzymuje się poniżej 10% objętościowych.
5. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że obejmuje fazę wsadu, fazę indukcji i fazę zasilania, przy czym w fazie zasilania:
a) komórki grzyba hoduje się do gęstości komórek co najmniej 5 g/l, w pożywce zawierającej dowolne źródło węgla, bez specyficznych preferencji, a następnie komórki grzyba są hodowane do gęstości komórek ponad 5 g/l, korzystnie 10 do 90 g/l, bardziej korzystnie 40 do 60 g/l, przy użyciu pożywki zawierającej induktor i źródło węgla, w którym 50-100% wagowych stanowi etanol;
b) po osiągnięciu gęstości komórek z etapu (a) doprowadza się hodowlę do limitujących warunków wzrostu;
c) po ustaleniu takich limitujących warunków, komórki dalej hoduje się na pożywce zawierającej źródło węgla, w którym 50-100% wagowych stanowi etanol.
6. Sposób według zastrz. 1-5, znamienny tym, że jest powtarzanym procesem okresowo-dolewowym.
7. Sposób według zastrz. 1-7, znamienny tym, ż e induktor jest wybrany z grupy obejmują cej galaktozę, metanol, temperaturę i fosforany.
8. Sposób według zastrz. 2-7, znamienny tym, że pożywka zasilająca zawiera od 0,1 do 10% wagowych galaktozy.
9. Sposób wedł ug zastrz. 1-8, znamienny tym, ż e ź ródł o wę gla zawiera 80-100% wagowych etanolu.
10. Sposób według zastrz. 1-9, znamienny tym, że grzybem są drożdże, korzystnie Saccharomyces cerevisiae.
11. Sposób według zastrz. 1-10, znamienny tym, że heterologiczne białko lub peptyd są wyselekcjonowane z peptydów zapobiegających zamarzaniu, przeciwciał lub ich fragmentów i enzymów.
12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pożywka wsadu zawiera 1-40% wagowych glukozy, wodę, metale śladowe, ewentualnie środek przeciwpieniący, ekstrakt drożdżowy, witaminy, sole fosforanowe i sole siarczanowe, przy czym pożywka zasilająca zawiera od 5 do 35% wagowych etanolu, 0,1-10% wagowych galaktozy, wodę, metale śladowe i ewentualnie środek przeciwpieniący, ekstrakt drożdżowy, witaminy, sole fosforanowe i sole siarczanowe, przy czym „wskaźnik zasilania „φ wynosi od 0,25 do 4 g/minutę w skali 10 litrów.
PL362773A 2000-12-13 2001-11-16 Sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby PL204737B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00311095 2000-12-13
PCT/EP2001/013457 WO2002048382A2 (en) 2000-12-13 2001-11-16 Method for the production of a heterologous protein by a fungus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362773A1 PL362773A1 (pl) 2004-11-02
PL204737B1 true PL204737B1 (pl) 2010-02-26

Family

ID=8173440

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362773A PL204737B1 (pl) 2000-12-13 2001-11-16 Sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby

Country Status (18)

Country Link
US (1) US7560249B2 (pl)
EP (1) EP1349945B1 (pl)
JP (1) JP4494716B2 (pl)
CN (1) CN1481439A (pl)
AT (1) ATE351911T1 (pl)
AU (2) AU1604902A (pl)
BR (1) BR0116675A (pl)
CA (1) CA2427665C (pl)
CZ (1) CZ303983B6 (pl)
DE (1) DE60126148T2 (pl)
ES (1) ES2278681T3 (pl)
HU (1) HU228689B1 (pl)
IL (1) IL156438A0 (pl)
MX (1) MXPA03005358A (pl)
PL (1) PL204737B1 (pl)
SK (1) SK287621B6 (pl)
WO (1) WO2002048382A2 (pl)
ZA (1) ZA200303353B (pl)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100093061A1 (en) * 2006-12-20 2010-04-15 Bodie Elizabeth A Assays for Improved Fungal Strains
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
AU2016273912B2 (en) * 2011-05-20 2018-08-02 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
PL2710114T3 (pl) * 2011-05-20 2022-01-17 H. Lundbeck A/S Wytwarzanie z wysoką czystością białek wielopodjednostkowych, takich jak przeciwciała, w transformowanych mikroorganizmach, takich jak pichia pastoris
US10150968B2 (en) 2011-08-19 2018-12-11 Alderbio Holdings Llc Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US20160024203A1 (en) 2013-03-15 2016-01-28 Bristol-Myers Squibb Company Methods of producing antibodies in yeast
CN105960451A (zh) * 2013-09-19 2016-09-21 纽约城市大学研究基金 用于增加酵母生物量的方法
WO2016156466A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Peptide construct having a protease-cleavable linker
WO2016156474A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin a
IL254577B2 (en) 2015-03-31 2023-11-01 Vhsquared Ltd polypeptides
WO2016156475A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b
EP3519438A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 VHsquared Limited Compositions
EP3986931A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
CN114555643A (zh) 2019-06-21 2022-05-27 索瑞索制药公司 组合物
WO2020254827A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vhsquared Limited Polypeptides

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3273609B2 (ja) 1989-07-07 2002-04-08 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 発現ベクターのマルチコピー組込みにより形質転換した真菌による蛋白質の製法
TR199701752T1 (xx) 1995-07-05 1998-05-21 Unilever N.V G�da gradl� bir organizmadan okyanus bal��� antifriz peptidinin elde edilmesi ve bunun g�da �r�nlerinde kullan�m�.
EP1134231B1 (en) 2000-03-14 2009-04-15 Unilever N.V. Antibody heavy chain variable domains against human dietary lipases, and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0302655A3 (en) 2004-10-28
US20040077069A1 (en) 2004-04-22
SK7402003A3 (en) 2003-09-11
WO2002048382A3 (en) 2003-01-30
DE60126148T2 (de) 2007-05-31
SK287621B6 (sk) 2011-04-05
ATE351911T1 (de) 2007-02-15
AU1604902A (en) 2002-06-24
JP4494716B2 (ja) 2010-06-30
CA2427665C (en) 2011-10-11
JP2004515249A (ja) 2004-05-27
CA2427665A1 (en) 2002-06-20
WO2002048382A2 (en) 2002-06-20
US7560249B2 (en) 2009-07-14
CZ20031659A3 (cs) 2003-11-12
IL156438A0 (en) 2004-01-04
EP1349945B1 (en) 2007-01-17
MXPA03005358A (es) 2003-10-06
EP1349945A2 (en) 2003-10-08
ZA200303353B (en) 2004-04-30
CZ303983B6 (cs) 2013-07-31
ES2278681T3 (es) 2007-08-16
PL362773A1 (pl) 2004-11-02
AU2002216049B2 (en) 2005-11-24
HU228689B1 (hu) 2013-05-28
HUP0302655A2 (hu) 2003-11-28
DE60126148D1 (de) 2007-03-08
BR0116675A (pt) 2003-11-04
CN1481439A (zh) 2004-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL204737B1 (pl) Sposób wytwarzania heterologicznego białka przez grzyby
Verduyn et al. A theoretical evaluation of growth yields of yeasts
JP5587795B2 (ja) 発酵培地、及びそのプロセス
Boze et al. Production of food and fodder yeasts
US3843466A (en) Method of producing dicarboxylic acids by fermentation
Preusting et al. Continuous production of poly (3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas oleovorans in a high-cell-density, two-liquid-phase chemostat
Jungo et al. Regulation of alcohol oxidase of a recombinant Pichia pastoris Mut+ strain in transient continuous cultures
CA1334515C (en) Fermentation process for carboxylic acids
Lee et al. Effects of substrate feed rates on heterologous protein expression by Pichia pastoris in DO-stat fed-batch fermentation
US4871669A (en) Production of natural flavor aldehydes from natural source primary alcohols C2 -C7
Hensing et al. Effects of cultivation conditions on the production of heterologous α-galactosidase by Kluyveromyces lactis
US6750045B2 (en) Fermentation medium and method
Porro et al. Development of high cell density cultures of engineered Saccharomyces cerevisiae cells able to grow on lactose
Mitsushima et al. Control of citrate and 2-oxoglutarate formation in Candida lipolytica mitochondria by adenine nucleotides
CN111909859B (zh) 一种巴斯德毕赤酵母低温型培养基
Lee et al. Functional expression and production of human H-ferritin in Pichia pastoris
RU2785901C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli
KR0177321B1 (ko) 재조합 효모로부터 인간 알파 인터페론의 대량 생산 방법
Gupta et al. Stability studies of recombinant Saccharomyces cerevisiae in the presence of varying selection pressure