CZ303983B6

CZ303983B6 - Zpusob výroby heterologního proteinu

Info

Publication number: CZ303983B6
Application number: CZ20031659A
Authority: CZ
Inventors: de Laar@Antonius Martinus Johannes Van; Malcolm Lindner@Nigel; Nieuwpoort@Peter
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 2000-12-13
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2013-07-31
Also published as: HUP0302655A3; US20040077069A1; SK7402003A3; WO2002048382A3; DE60126148T2; SK287621B6; ATE351911T1; AU1604902A; JP4494716B2; CA2427665C; JP2004515249A; CA2427665A1; WO2002048382A2; US7560249B2; PL204737B1; CZ20031659A3; IL156438A0; EP1349945B1; MXPA03005358A; EP1349945A2

Abstract

Zpusob výroby heterologního proteinu houbami, který se vyznacuje tím, ze zahrnuje kroky, pri nichz se uvedené houby pestují v médiu obsahujícím zdroj uhlíku, pricemz 50 az 100 % hmotnostních tohoto uhlíkového zdroje predstavuje ethanol a médium nádavkem obsahuje induktor.

Description

Způsob výroby heterologního proteinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby heterologního proteinu nebo peptidu v houbách.

Dosavadní stav techniky

Produkce heterologního proteinu v hostiteli, jako jsou houby, je dobře známá. EP-A-481 008 předkládá výrobu heterologního proteinu v kvasinkách, pěstovaných na glukóze.

Průmyslová výroba heterologního proteinu, tedy výroba ve velkém měřítku, hostitelským organismem v napájeném (vyživovaném) vsádkovém kvašení obecně vykazuje tři fáze.

První fází je vsádková fáze, která je definována jako fáze, při níž jsou buňky pěstovány až k dosažení požadované koncentrace. V této fázi rostou buňky exponenciálně. Modely vyjadřující vsádkovou fázi předpokládají, že buňky neumírají, že kyslík je přítomný v nadbytku a že všechny ostatní podmínky jsou takové, že může probíhat neomezený růst. To také předpokládá, že ve vsádkové fázi jsou všechny výživové požadavky plněny v dostatečném množství. Souhrnně lze říci, že vsádková fáze je fází, při níž jsou množeny buňky, zatímco produkce (heterologního) proteinu je stále nízká.

Druhou fází je fáze přísunu potravy, vyživovací fáze, která je definována jako fáze, při níž jsou zdroj uhlíku a další požadované látky přiváděny do kvasné nádoby, fermentorů, v poměrně zahuštěném proudu tekutiny předem vypočtenou rychlostí, tedy „rychlostí vyživování“. V této fázi je důraz kladen na produkci proteinu pěstovanými buňkami a na buněčný růst, vedoucí k nárůstu biomasy. Substrát, který je přiváděn do kvasné nádoby, se v tomto stádiu obecně používá pro buněčný růst a syntézu produktu. Buněčný růst je řízen rychlostí vyživování tak, aby bylo dosaženo optimálního buněčného růstu a produkce heterologního proteinu.

Nakonec je dosaženo třetí fáze, která je definována jako fáze poklesu, při níž nastávají omezující podmínky. V této fázi je například koncentrace kyslíku v kvasné nádobě snížena na nulu, což v některých případech vede k vytváření ethanolu. V tomto stádiu se většina buněk soustředí na své udržení, zachování a syntéza produktu je obvykle snížena. Ačkoli může být i v této fázi stále pozorován buněčný růst, růst je obecně velmi omezený a to až k nule. Buňky mohou v tomto stádiu postupně ztrácet svou životnost.

Produkce heterologního proteinu v médiu, které obsahuje zdroj uhlíku jako je glukóza nebo jiný zdroj uhlíku na cukerné bázi, je uspokojující do té doby, než se ke konci fáze vyživování začnou projevovat omezující podmínky. Příklady omezujících podmínek zahrnují sníženou koncentraci kyslíku, snížení množství živin jako jsou vitamíny, uhlík a dusík, a nahromadění toxických sloučenin v růstovém médiu.

Pokud jsou houby a zejména kvasinky pěstovány v médiu obsahujícím jako zdroj uhlíku glukózu, je produkce, výroba heterologního proteinu podstatně snížena hned, jakmile nastanou omezující podmínky.

U kvasinek, pěstovaných v běžném médiu, obsahujícím jako zdroj uhlíku cukr, se při vyživovaném vsádkovém kvašení projevují výše popsané fáze. Tedy jakmile je započata fáze poklesu, specifická produkce, která je definována jako množství heterologního proteinu nebo peptidu, vyprodukovaného na 1 gram biomasy, je pouze udržována, nebo se sníží. I když je buněčná hustota vysoká, syntéza produktu je od této chvíle ve fázi poklesu nízká.

- 1 CZ 303983 B6

Jinou nevýhodou běžného média, které často obsahuje jako zdroj uhlíku glukózu, je velké množství substrátu, které je místo přeměny na produkt, jímž je obvykle heterologní protein v kontextu tohoto vynálezu, přeměňováno na biomasu. Z tohoto důvodu produkci velkých množství heterologního proteinu v podobných systémech nevyhnutelně doprovází poměrně velké množství biomasy.

Toto velké množství biomasy vede ke vzniku viskózního kvasného média, ve kterém snadno dochází například k omezení množství kyslíku.

Existuje tedy potřeba způsobu výroby heterologního proteinu v hostiteli jako jsou houby, který by vedl k vysokému výtěžku heterologního proteinu i za omezujících podmínek, při nichž by normálně došlo ke snížení a omezení specifické produkce, a při němž by zároveň byla specifická produkce růstového systému uchována nebo zvýšena ve srovnání se známými růstovými systémy.

Způsob podle předkládaného vynálezu překonává nejméně jeden z uvedených problémů.

Podstata vynálezu

Překvapivě bylo zjištěno, že houby pěstované v médiu, obsahujícím jako hlavní zdroj uhlíku ethanol a dále obsahujícím křížení produkce (výroby) heterologního proteinu induktor jako galaktózu, vykazují vysokou specifickou produkci heterologního proteinu, přičemž specifická produkce heterologního proteinu je překvapivě vysoká dokonce i za omezujících podmínek.

Houby, pěstované podle tohoto způsobu, překvapivě nevykazují dobře známé charakteristiky poklesu růstu, se kterými se lze setkat u hub, pěstovaných v tradičních médiích na bázi glukózy. Za pokračujícího vyživování médiem, obsahujícím tento specifický zdroj uhlíku, si houby udržují nebo dokonce zvyšují absolutní a specifickou hladinu produkce heterologního proteinu.

Vynález se proto týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami, který zahrnuje kroky, při nichž se uvedené houby pěstují v médiu obsahujícím zdroj uhlíku, přičemž 50 až 100 % hmotnostních tohoto uhlíkového zdroje představuje ethanol a médium nádavkem obsahuje induktor.

Podrobný popis vynálezu

V kontextu tohoto vynálezu termín houba či houby zahrnuje kvasinky a plísně.

Pro účely tohoto vynálezu je výraz heterologní protein zamýšlen k zahrnutí jak proteinů, tak i peptidů.

Heterologním proteinem je takový protein, který není houbou přirozeně produkován, ale je jí produkován až poté, co byla tato houba v příslušném rozsahu modifikována.

Pokud jsou uváděna hmotnostní procenta, jedná se o hmotnostní procenta vzhledem k celkové hmotnosti produktu nebo k celkové hmotnosti média, pokud však není uvedeno jinak.

Pokud je používán výraz koncentrace kyslíku, je činěn odkaz na koncentraci rozpuštěného kyslíku, která se měří způsobem, popsaným v Příkladech provedení vynálezu.

Konec vsádkové fáze se definuje jako okamžik, kdy byl spotřebován veškerý uhlíkový substrát, poskytnutý buňkám.

Indukční fáze je definována jako fáze, která začíná po vsádkové fázi od toho okamžiku, kdy začne indukce heterologního proteinu až do okamžiku, kdy je získána maximální indukce pro použitou koncentraci speciálního induktoru.

Zdroj uhlíku je definován jako substrát, který buňce poskytuj dodávání uhlíku a energie. Houby získávají svůj buněčný uhlík především z organických sloučenin. Ty běžně slouží jako zdroj uhlíku i jako zdroj energie: Jsou částečně asimilovány (vstřebány) do buněčného materiálu a částečně oxidovány k poskytnutí energie. V tomto kontextu je činěn odkaz na práci H. Schlegela v General Microbiology, Cambridge University Press, 1992, 7. vydání, strana 194.

Vynález se týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami. K vytváření tohoto proteinu jsou houby geneticky modifikovány tak, aby byla možná řízená produkce tohoto heterologního proteinu nebo peptidu.

K takové genetické modifikaci může být použit jakýkoliv vhodný konstrukt nebo způsob transformace. Příklady vhodných konstruktů a způsobů transformace jsou uvedeny v EP-A-481 008, kteráje zde začleněna jako odkaz.

Obecně bude modifikovaná, pozměněná houba po modifikaci obsahovat (integrovaný) vektor, který obsahuje gen, kódující heterologní protein, pod kontrolou promotoru. Aktivita promotoru je řízena tak zvaným induktorem. Příklady promotorů zahrnují galaktázové promotory jako GAL4 či GAL7, které jsou indukovány galaktózou; methanolem indukované promotory, které jsou indukované methanolem; ethanolové promotory, které jsou indukované ethanolem; teplotou řízené promotory, které jsou indukované změnou teploty; fosfátem (fosforečnanem) řízené promotory, které jsou indukované přítomností fosfátu a glukózou potlačitelné promotory (glucose repressible promoters), indukované nepřítomností glukózy.

Houby se pěstují v médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol, v kombinaci s přítomností induktoru v médiu.

Ve stavu techniky se od použití ethanolu jako zdroje uhlíku obecně odrazuje, jak je doloženo příklady v níže uvedeném popisu. Souhrnně se udává, že použití ethanolu místo glukózy jako zdroje uhlíku snižuje výtěžek biomasy, vyžaduje vyšší spotřebu kyslíku a proto poskytuje nulový nebo omezený růst v podmínkách omezujících přítomnost kyslíku. Nadto může toxicita ethanolu vůči buněčným kmenům vést ke ztrátě životnosti buněk a k jejich smrti. To je například uvedeno v Tabulce 1 publikace The Yeasts, díl 13, 2. vydání, kapitola 6. Zvláštní odkaz je činěn na doplněk 1 tohoto popisu, který udává, že pro kvasinky je rychlost růstu na ethanolu 0,1 h“¹ oproti rychlosti růstu 0,35 h¹ na glukóze. Tento doplněk dále udává, že v médiu s ethanolem jako zdrojem uhlíku vykazují kvasinky větší spotřebu kyslíku než v médiu, obsahujícím jako uhlíkový substrát glukózu.

Růst buněk na ethanolu jako zdroji uhlíku je dále popsáno Shibou a spoluautory (J. of Bioscience and Bioengineering 89, 426-430, 2000). Shiba objevil za použití promotoru GAL10 expresi karboxypeptidázy. Y (CPY) v mutantu gal 180 rodu Saccharomyces cerevisiae. Růstové médium obsahovalo jako jediný zdroj uhlíku ethanol. Během počátku dodávání ethanolu byly jak rychlost růstu, tak i produkce CPY popsány jako klesající. Tento systém nebyl pod kontrolou induktoru.

Nyní předkládaný vynález poskytuje postup, při němž je produkce proteinu zachována nebo dokonce zvýšena v přítomnosti média, obsahujícího zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % představuje ethanol, zejména pokud nastanou omezující podmínky růstu. Kromě toho je způsob podle vynálezu použitelný pro kterýkoli typ hub a nevyžaduje pro růst specifické mutanty gal 180. Způsob podle tohoto vynálezu lze také dobře řídit indukcí.

M. Saliola se spoluautory (Applied and Environmental microbiology, leden 1999, str. 53-60) uvádí použití ethanolem indukovatelného promotoru KIADH4 pro expresi heterologního genu

-3 CZ 303983 B6 v Kluyveromyces lactis. Tato práce udává, že optimální exprese se dosahuje při použití ethanolu jako promotoru a současně jako jediného zdroje uhlíku v napájeném vsádkovém systému. Tento produkční systém neumožňuje kontrolu genové exprese ve fázi přísunu výživy.

Jin, S. et al (Journal of Biotechnology, sv. 54, str. 161 až 174, 1997) popisují růst rekombinantní kvasinky S. cerevisiae na směsi galaktosy a ethanolu.

Jiným přínosem způsobu podle předkládaného vynálezu je kontrola vytváření tepla, což je důležité při produkci za tepla labilních proteinů.

Přednost se dává tomu, aby médium obsahovalo zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol, v kombinaci s přítomností induktoru v médiu a to ve všech fázích; bylo však také zjištěno, že pokud jsou tyto nároky splněny médiem používaným ve fázi přísunu výživy, je možné použít i médium, které ve vsádkové fázi tyto nároky nesplňuje.

V přednostním provedení se vynález týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami, přičemž tento způsob zahrnuje vsádkovou fázi a fázi přísunu výživy, přičemž médium ve fázi přísunu výživy obsahuje zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol a médium fáze přísunu výživy nádavkem obsahuje induktor.

Ve srovnání se známými růstovými systémy, které obvykle obsahují jako hlavní zdroj uhlíku glukózu nebo jiný cukr, umožňuje médium podle předkládaného vynálezu vysoké specifické hladiny produkce dokonce i za omezujících podmínek; tj. s výhodou zde nedochází k fázi poklesu.

Bylo zjištěno, že specifická produkce je dokonce vyšší ve fázi přísunu výživy za podmínek omezené přítomnosti kyslíku, zatímco u růstových systémů na bázi glukózy je nejvyšší specifická produkce obvykle nalezena ve fázi přísunu výživy, při níž je množství biomasy stále poměrně malé.

Aniž by bylo žádoucí vázat se teorií, autoři tohoto vynálezu předpokládají, že ve způsobu podle předkládaného vynálezu je fáze poklesu prodloužená nebo dokonce nepřítomná v důsledku použití média, obsahujícího zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol.

Ve způsobu výroby heterologního proteinu jsou podmínky přísunu výživy s výhodou optimalizovány tak, že rychlost buněčného růstu a produkce heterologního proteinu jsou optimální.

Jak bylo uvedeno výše, pokud se houby pěstují v průmyslovém měřítku, vysoce se upřednostňuje vyživovaný vsádkový systém, využívající kvasný tank (fermentor).

V jiném upřednostňovaném ztělesnění se vynález týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami, přičemž tento způsob zahrnuje vsádkovou fázi, indukční fázi a fázi přísunu výživy, přičemž ve zmíněné fázi vyživování

a) se buňky hub pěstují k dosažení buněčné hustoty alespoň 5 g/1 v médiu obsahujícím jakýkoliv zdroj uhlíku, bez specifické volby, a následně jsou buňky hub pěstovány k dosažení buněčné hustoty větší než 5 g/1, s výhodou od 10 do 90 g/1 a ještě lépe od 40 do 60 g/1, za použití média, obsahujícího induktor a zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol;

b) se poté, co je dosaženo buněčné hustoty kroku (a), vytvoří podmínky omezeného růstu;

c) se poté, co se ustaví tyto omezující podmínky, buňky dále pěstují na médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol.

V tomto upřednostňovaném způsobu se v prvním kroku buňky pěstují ve vsádkové fázi, dokud není spotřebován zdroj uhlíku a ve druhém kroku se buňky pěstují k dosažení dostatečné buněčné

-4Ofl0W?WÍ3S!

hustoty k umožnění produkce heterologního proteinu ve vysokých množstvích. V prvních stádiích této druhé fáze se produkce heterologního proteinu indukuje přidáním induktoru do výživového média. Doba, trvající od nulové indukce a tedy velmi nízké hladiny produkce heterologního proteinu do maximální úrovně této produkce, se nazývá indukční fáze. Tato indukční fáze představuje první stádium fáze přísunu výživy.

Limitujících podmínek jev kvasném tanku (fermentoru) možné dosáhnout různými způsoby. Omezující podmínky jsou definovány jako takové podmínky, při nichž není dále možný exponenciální buněčný růst a růst buněk je klesající.

Ve způsobu podle tohoto vynálezu jsou omezující podmínky v médiu vytvořeny metodou, zvolenou ze skupiny, která zahrnuje:

a) snížení koncentrace kyslíku ve fermentorovém médiu, s výhodou na méně než 30 % a lépe na méně než 15 %;

b) přeplňování média ethanolem tak dlouho, dokud hladina ethanolu v médiu není rovna koncentraci omezující růst buněk rodu, který je pěstován v médiu, nebo dokud není vyšší;

c) snížení hladiny dalších esenciálních (nezbytných) přísad pro růst buněk, přičemž se taková přísada s výhodou zvolí z dusíku, fosforu, síry a vitamínů.

Po vsádkové fázi je vyživovací (napájecí) profil s výhodou exponenciálně rostoucí s produkcí biomasy. Jakmile nastane omezení kyslíku a započne fáze poklesu, rychlost vyživování se s výhodou ustaví na rychlosti, udržující koncentraci ethanolu ve fermentorovém médiu pod 10 % objemovými. Toho lze například dosáhnout lineární, přímkovou rychlostí vyživování nebo impulzní rychlostí vyživování, anebo stupňovitou rychlostí vyživování.

V ještě upřednostňovanějším ztělesnění se způsob podle předkládaného vynálezu provádí jako opakovaný vyživovaný (napájený) vsádkový postup.

Induktor je s výhodou vhodný pro „zapnutí“ promotoru, který je operativně připojen na heterologní gen v genovém konstruktu, použitém pro transformaci hostitelské houby. Upřednostňovanými induktory jsou galaktóza, methanol, teplota a fosfáty.

Nej upřednostňovanějším induktorem je galaktóza.

Předkládaný vynález se netýká způsobů exprese při nichž se ethanol používá jako induktor a zároveň jako zdroj uhlíku nebo částečný zdroj uhlíku.

Pokud je induktorem galaktóza, mělo by být množství galaktózy v médiu s výhodou takové, aby byl promotor zapnut na požadovanou úroveň už při množství tak nízkém, že galaktóza není metabolizována. K prevenci metabolizování galaktózy je možné použít rod, který není schopný induktor metabolizovat.

Složení výživového (napájecího) média je s výhodou takové, že médium ve fermentoru obsahuje od 0,1 % hmotnostního do 10 % hmotnostních galaktózy, lépe od 0,05 do 1 % hmotnostního galaktózy a ještě lépe od 0,05 do 0,2 % hmotnostního galaktózy.

Zdroj uhlíku v médiu podle předkládaného vynálezu obsahuje alespoň 50 % hmotnostních a až do 100 % hmotnostních ethanolu. S výhodou zdroj uhlíku obsahuje od 80 do 100 % hmotnostních ethanolu. Zbytkem uhlíkového zdroje může být například cukr jako glukóza, galaktóza, laktóza, sacharóza, fruktóza, nebo jiná sloučenina, jako glycerol či acetát, nebo to mohou být komplexní, složené uhlíkové substráty jako syrovátka nebo melasa.

-5CZ 303983 B6

Houbou mohou být kvasinky nebo plísně. Příklady vhodných rodů kvasinek zahrnují Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula. K. příkladům vhodných plísní patří Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma.

Zvláště upřednostňovaným organismem jsou kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae.

♦

Heterologním proteinem může být jakýkoliv protein nebo peptid, jehož výroba je žádoucí. Bylo zjištěno, že způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště výhodný k výrobě nemrznoucích peptidů (antifreeze peptides), protilátek nebo jejich fragmentů, nebo enzymů, jako je kutináza a galaktosidáza.

Nemrznoucí peptidy jsou proteiny, které mají schopnost modifikovat růst ledu a jsou například popsány Griffithem a spoluautory v práci, která je zde začleněna jako odkaz (Biotechnology Advances 73(3), 375-402, 1995).

Médium pro různé fáze růstu hub obecně zahrnuje zdroj uhlíku, volitelně induktor, jehož přítomnost je vyžadována po vsádkové fázi a volitelně další přísady jako vitamíny, kvasničný extrakt, stopové kovové ionty, okyselující činidla k udržení pH na požadované úrovni, fosforečné sole, síranové sole, vodu a protipěnicí činidlo.

Podle jiného upřednostňovaného ztělesnění se předkládaný vynález týká způsobu výroby heterologního proteinu nebo peptidů, přičemž vsádkové médium obsahuje 1 až 40 % hmotnostních glukózy, vodu, stopové kovy, volitelně protipěnicí činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečné sole a síranové sole a výživové, napájecí médium obsahuje od 5 do 35 % ethanolu, 0,1 až 10 % hmotnostních galaktózy, vodu, stopové kovy a volitelně protipěnicí činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečné soli a síranové soli a kde „rychlost vyživování“, „φ“, je v desetilitrovém měřítku od 0,25 do 4 g/min, nebo má odpovídající hodnotu při kvašení ve větším měřítku.

Předkládaný vynález se dále týká izolátu heterologního peptidů, zvláště izolátu nemrznoucího peptidů, získaného způsobem podle tohoto vynálezu.

Vynález bude nyní ozřejměn následujícími Příklady provedení vynálezu, na něž se neomezuje.

Příklady provedení vynálezu

Média a kultivace

Veškerá média a údaje, týkající se kultivace, se vztahují k ethanolovému kvašení v rozsahu 10 litrů.

Pro rozsah 10 m³ platí zhruba totéž po vynásobení faktorem měřítka, tedy jedním tisícem.

-6χ^

Média

Předkultivační média:

Inokulační (očkovací) média	sloučenina	g.i·¹	dodavatel
YNB	YNB w/o aminokyseliny	6,7	Difco
i kvasinky	glukóza Glucose*1aq	5	AVEBE
dusík báze 1 1 •	v demineralizované vodě
YPD	YE	10	Difco
j kvasinky	baktopepton	20	Difco
pepton glukóza	glukóza Glucose*1aq	20	AVEBE
v demineralizované vodě

Vsádková a napájecí, výživová médiajsou uvedena v Tabulce 1 pro rozsah 10 litrů.

Tabulka 1

sloučenina	dodavatel koncentrace (g.kg'¹)
11	vsádka	ipřiváděný ethanol	priváď. komp. pr. glukóza
glukóza	Avebe 22,0	-	440,0
vodovodní voda

EtOH*	Lamers & Pleuger	333,84

galaktóza	HMS	3,0	3,0
vodovodní voda

YE Kat G	Ohiy 10,0	25,0	25,0
KH₂PO₄	Acros 2,1	12,0	12,0
MgSO, . 7H₂0	Merck 0,6	2,5	2,5
vitamíny Egli	vit Tabulku 2 1,0	1,0	2,0
stopové prvky Egli	vit Tabulku 2 10,0	20,0	20,0
Structol J 673	Schill & 0,4 Seilacher	0,8	0,8
vodovodní voda

celková hmotnost (g)	5 500	4 000	4 000

* čistý ethanol, obsah 96,2 % objem/objem, nedenaturovaný

Všechna média byla sterilizována 25 minut při 121 °C a tlaku 120 kPa (1,2 bar) v autoklávu Lin den, cukry odděleně. Množství vodovodní vody jsou uvedena níže a celkové množství bylo tako vé, aby celková hmotnost odpovídala údaji, uvedenému ve spodním řádku Tabulky 1.

o

Složení vitamínů Egli a stopových prvků

-8CZ 303983 Β6

Tabulka 2

Vitamíny Egli (1000 x zásobní roztok)	stopovéprvky Egli (100 x zásobní roztok)
sloučenina	g.i·¹	sloučenina	gi'¹
thiamin (HCI)	5,00	CaCI₂. 2 H₂O	5,50
meso-inosit	47,00	FeSO₄ . 7 H₂O	3,73
pyridoxin	1.20	MnSO₄. 1 H₂O	1,40
kys. listová	23,00	ZnSO₄ . 7 H₂O	1,35 j
biotin	0,05	CuSO₄ . 5 H₂O	0,40
	CoCI₂. 6 H₂O	0,45

Vitamíny byly sterilizovány filtrací přes filtr o velikosti pórů 0,22 pm.

Rod

Použit byl rod Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A. Základní rod 5. cerevisiae CEN.PK2 je komerčně dostupný od firmy EUROSCARF Mikrobiologického ústavu Goetheho university ve Frankfurtu (Institute of Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt, Marie— Curie-Strasse 9, budova N250, D-60 439 Frankfurt, Německo).

Tento rod S. cerevisiae není schopný metabolizovat galaktózu, neboť gen GAL1 byl přerušen zavedením sekvencí, získaných z genu 5. cerevisiae URA3. Hostitelský rod byl transformován expresním plazmidem, obsahujícím následující prvky:

Promotor:

GAL7 promotor, zaváděcí část GAPDH. GAL7 promotor: dvě po směru aktivující sekvence jsou vždy přítomné. Jsou dvěma přírodními prvky, které jsou částí sekvence, jak je uvedena.

Selekční markér: Leu2d

Signální sekvence: invertáza (SUC2)

Cíl integrace: fragment opakované rDNA s jediným restrikčním místem pro cílovou integraci do specifické oblasti v kvasinkovém chromozomu XII.

Heterologní gen:

Příklad 1: gen nemrznoucího proteinu, kódující nemrznoucí protein

HPLC12 sliznatky slepé (oceán pout) (ad WO-A-9702343);

Příklad 2: K609B, protilátka vůči virulentním faktorům selat;

Příklad 3: Protein VHH G, kterým je HGL11, tedy imunoglobulin tvořený těžkým řetězcem; inhibitor lipázy působící vůči lidské gastrické lipáze, uvedený v EP-A-1 134 231;

-9CZ 303983 B6

Příklad 4: Protein VHH P, kterým je HPL18, tedy imunoglobulin tvořený těžkým řetězcem;

inhibitor lipázy působící vůči lidské pankreatické lipáze, uvedený v EP-A-1 134 231;

Proteiny z příkladů 2 až 4 jsou protilátky, které lze získat imunizací lamy postupem uvedeným v EP-A-1 134231.

Kultivace

Uchovávání rodů

Rody kvasinek byly uchovávány při -80 °C v jediné vsádce z růstových kultur YNB, naředěných v poměru 1:1 směsí odstředěného mléka a 20% glycerolu.

Zaočkování:

ml YNB bylo zaočkováno 1 ml uchovávaného rodu a inkubováno 48 ± 2 hodiny při 30 °C a rychlosti míchání 150 otáček za minutu. Inokulum bylo následně převedeno do 500 ml 2% YPD a inkubováno 24 ± 2 hodiny při 30 °C a rychlosti míchání 150 otáček za minutu.

Fermentor

Kvašení bylo prováděno ve standardních kvasných tancích (fermentorech) s pracovním objemem 10 litrů. Pro kontrolu teploty byl fermentor vybaven chladicí spirálou a zahříváním. Přepážky měly standardní velikosti. Pro míchání byl použit rotor typu Rushton se šesti lopatkami. Rozpuštěný kyslík (DO₂) byl měřen elektrodou Ingold DO₂-electrode (Mettler-Toledo) a hodnoty pH byly měřeny gelovou elektrodou Ingold Impro 3000 (Mettler-Toledo). K měření odpadního plynu byl používán spektrofotometr Prima 600 (VG plynový analyzační systém). Celý kvasný proces byl automatizován a softwarově řízen, ale lze ho provádět také manuálně na základě pokynů uvedených níže.

K řízení kvašení byl využit profil vyživování. Hodnota pH byla řízena za použití 3 mokl^-1 roztoku kyseliny fosforečné (Baker) a 12,5 % roztoku (objem/objem) amoniaku.

DO₂ byl regulovaný na 30% hodnotu automatickou úpravou rychlosti rotoru až k dosažení maximální rychlosti míchání (1000 otáček za minutu).

Během kvašení byly prostřednictvím automatického zařízení na odběr vzorků odebírány vzorky o objemu 5 ml a ochlazeny na 4 °C ke stanovení sušiny a koncentrace produktu.

Vsádková fáze

K započetí vsádkové fáze bylo 500 ml inokula YPD přidáno do 5,5 litru vsádkového média. Parametry kvašení odpovídaly parametrům, uvedeným v Tabulce 3. Jakmile obsah ethanolu v odpadním plynu pokles na 300 dílů z milionu, bylo zahájeno exponenciální vyživování.

Fáze vyživování

Vyživovací médium bylo rozděleno do dvou vyživovacích lahví, připojených na stejné čerpadlo.

Jedna vyživovací láhev obsahovala ethanol a vodovodní vodu v množství do 2 litrů objemu a obsah byl přiváděn do fermentoru přes spodní desku. Druhá vyživovací láhev obsahovala všechny ostatní složky výživy a vodu v množství do 2 litrů objemu a obsah byl přiváděn do fermentoru přes horní desku.

- 10CZ 303983 B6

Z obou lahví, připojených na stejné čerpadlo, byla aplikována stejná exponenciální rychlost vyživování podle rovnice 1. Pro dvě lahve je výsledná rychlost vyživování rovna dvojnásobku rychlosti čerpání.

μ.Χ,-e^

Φ_ν(=--[g/min] (rovnice 1)

	Pvyž- ^.S-60
Φ,,	= rychlost vyživování	g/min
A	= rychlost růstu	h-‘
Xo	= biomasa na začátku vyživování	g (mol. hm. = 24,6 g/mol)
t	= doba od začátku vyživování	min
Pvyi	= hustota (hutnost) vyživování	g EtOH/g vyživování
Yx.s	= odhad, výtěžek biomasy	g X/g substrátu
60	= časový faktor	min/h

Parametry vyživování odpovídaly parametrům, jak jsou uvedeny v Tabulce 3.

- 11 CZ 303983 B6

Tabulka 3: Parametry přísunu kvasné výživy pro kvašení s 10 litry ethanolu

parametr	hodnota
μ (l/h)	; 0,06
Xo	1,06
P\tyi	í 0,41
γ ^r x.s	í 0,45
T vsádky (°C)	: 30

I výživy (°C) j 21

průtok vzduchu vsádkou (l/min)	i \| 2
průtok vzduchu výživou (l/min)	i 6
DO₂ (%)	í 30
minimum DO₂ (%)	⁰
pH	⁵
SS min. (otáčky za minutu)	300
SS max. (otáčky za minutu)	I 1 000
kriterium EtOH na začátku vyživování (díly z mil.)	ΐ 300 ,
kriterium EtOH na začátku poklesu (díly z mil.)	800
maximum EtOH (díly z mil.)	\| 2 000
počáteční celková rychlost vyživování (g/min)	0,28
lineární celková rychlost vyživování (g/min)	I I 2

Jakmile byla koncentrace kyslíku 0%, byly ustaveny omezující podmínky a rychlost čerpání byly upravena na lineární rychlost čerpání. Toto vyživování pokračovalo tak dlouho, dokud nebyla vyčerpána veškerá výživa.

- 12CZ 303983 B6

Výsledky:

Příklad 1

ethanol jako zdroj uhlíku
čas (h)	AFP (mg/kg kvasného bujónu)	sušina (g/kg)	specifická produkce* (mg/g)
o	0	2,4	0
3	0	3,4	0
6	0	5,7	0
1 ⁹	0	7,6	0
12	0	10,9	0
15	0	10,5	0
18	0	11,7	0
21	0	13,3	0
24	0	15,6	0
27	7,0	17,9	0,393
30	11,4	20,7	0,549
33	17,9	24,8	0,721
36	24,2	28,8	0,840
39	32,4	32,7	0,990
42	41,8	38,4	1,089
45	52,4	42,7	1,227

- 13 CZ 303983 B6

čas (h)	AFP (mg/kg kvasného bujónu)	sušina (g/kg)	specifická produkce* (mg/g)
48	66,9	49,0	1,366
51	78,7	55,0	1,432
54	93,7	60,6	1,546
57	112,2	64,8	1,732
60	132,1	68,6	1,925
63	151,2	71,9	2,104
66	165,8 .................	75,5 -........................ ...........	2,195 --li

specifická produkce: mg AFP/g sušiny

Na základě těchto výsledků byl učiněn závěr, že pokud produkce AFP, ve vyživovací fázi po omezujících podmínkách, stoupá a pokud pokračuje vyživování médiem, obsahujícím zdroj uhlíku, který je ze 100 % představován ethanolem, dochází k překvapivě vysoké specifické produkci AFP.

Bylo pozorováno, že produkce biomasy zůstala konstantní, aniž by došlo k úbytku absolutní produktivity AFP.

Srovnávací příklad

Růstové médium ve vyživovací fázi neobsahovalo jako zdroj uhlíku ethanol, ale 100 % hmotnostních glukózy. Médium pro tento pokus bylo popsáno výše. Také podmínky vyživování, přiváděného do fermentoru, jsou popsány výše, přičemž byly uplatněny následující výjimky:

Vyživovací médium bylo dodáváno do fermentoru pouze z jedné vyživovací láhve, obsahující veškeré složky a přívod byl do fermentoru zajištěn přes dolní desku. Použitá byla exponenciální rychlost vyživování podle rovnice 1.

Parametry vyživování odpovídaly těm, které jsou uvedeny v Tabulce 3 kromě toho, že hodnota X_o byla ustavena na 2,11 mol k dosažení takové rychlosti vyživování při použití jedné láhve, jaká byla v ethanolovém kvašení dosahována za použití dvou vyživovacích lahví, zapojených najedno čerpadlo.

- 14CZ 303983 B6

Výsledky jsou následující:

čas (h)	AFP (mg/kg	sušina (g/kg)	specifická produkce* (mg/g)
0	0	1,9	0
3	0	3,3	0
6	0	5,5	0
9	0	7,2	0
12	0	10,4	0
15	0	11,4	0
18	0	11,7	0 ί
21	0,8	15,8	0,049
24	2,6	18,4	0,142
27	5,8	20,3	0,286
30	10,3	24,6	0,421
33	16,8	28,6	0,721
36	25,5	33,0	0,773
39	35,4	37,5	0,942
42	46,8	43,4	1,077
45	60,3	50,0	1,204
48	74,4	55,9	1,33

čas (h)	AFP (mg/kg kvasného bujónu)	sušina (g/kg)	specifická produkce* (mg/g)
51	90,8	62,9	1,445
57	126,4	79,2	1,596
60	135,2	79,5	1,701
63	135,13	79,3	1,705

- 15 CZ 303983 B6

Byl učiněn závěr, že pokud růstové médium obsahuje jako zdroj uhlíku pouze glukózu, produkce AFP je snížena od okamžiku, kdy se ustaví omezující podmínky. Produkce AFP dále nestoupá a specifická produkce klesá.

Výsledky - Příklad 2

i ethanol jako zdroj uhlíku	glukóza jako zdroj uhlíku (srovnávací příklad 2)
VHH ί (mg/kg kvas. bujónu)	sušina (g/kg)	specifická produkce* (mg/g)	VHH (mg/kg kvas. bujónu)	\| sušina (g/kg)	specifická produkce* (mg/g) i
0	0,91	0	0	6,63	0,00
0	6,17	0	0	12,34	0,00
0	11,66	0	106,33	25,60	4,15
141,77	21,26	6,67	248,09	35,65	6,96
927,40	48,68	19,05	425,30	45,02	9,45
1063,26	51,65	20,58	673,40	57,59	11,69
1222,75	56,68	21,57	856,52	72,22	11,86
1151,87	55,31	20,83	915,59	71,31	12,84

io * specifická produkce: mg heterologního proteinu / g sušiny

Byl učiněn závěr, že specifická produkce heterologního proteinu, využívající jako zdroj uhlíku ethanol, je mnohem vyšší než specifická produkce za použití glukózy jako zdroje uhlíku.

- 16CZ 303983 B6

Výsledky - Příklad 3

ethanol jako zdroj uhlíku	glukóza jako zdroj uhlíku (srovnávací příklad 3)
čas (h)	VHH (mg/kg kvas. bujónu)	sušina (g/kg)	specií. produk- ce* (mg/g)	čas (h)	VHH (mg/kg kvas. bujónu)	sušina (g/kg)	specií produk- ce* (mg/g)
3	0	2,87	0	21	103,45	17,19	6,02
6	0	5,73	0	27	127,59	20,78	6,14
9	0	6,93	0	33	227,59	28,66	7,94
33	268,97	45,37	5,93	39	272,41	36,78	7,41
36	417,24	50,86	8,20	45	327,59	47,52	6,89
39	537,93	54,45	9,88	51	413,79	57,07	7,25
42	689,66	56,36	12,24	57	503,45	64,48	7,81
				63	565,52	67,10	8,43
				69	596,55	69,73	8,56

* specifická produkce: mg heterologního proteinu/g sušiny

- 17CZ 303983 B6

Výsledky - Příklad 4

í ethanol jako zdroj uhlíku		glukóza jako zdroj uhlíku (srovnávací příklad 4)
čas (h)	VHH (mg/kg kvas. bujónu)	l sušina (g/kg)	specif. produk- ce* (mg/g)	čas (h)	VHH (mg/kg kvas. bujónu)	sušina (g/kg)	specif. produk- ce* (mg/g)
0	0,00	0,72	0,00	15	13,79	10,51	1,31
12	0,00	9,79	0,00	21	27,59	16,00	1,72
18	13,79	17,19	0,80	27	55,17	19,10	2,89
24	155,17	25,31	6,13	33	117,24	25,07	4,68
30	275,86	35,82	7,70	39	155,17	32,00	4,85
36	403,45	46,80	8,62	45	213,79	45,13	4,74
39	472,41	50,63	9,33	51	210,34	56,83	3,70
42	620,69	53,49	11,60	57	255,17	68,30	3,74
45	675,86	58,03	11,65		i i i

specifická produkce: mg proteinu/g sušiny

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby heterologního proteinu houbami, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, při nichž se uvedené houby pěstují v médiu obsahujícím zdroj uhlíku, přičemž 50 až 100 % hmotnostních tohoto uhlíkového zdroje představuje ethanol a médium nádavkem obsahuje induktor, s tou výhradou, že se tento způsob netýká způsobů exprese, při nichž se ethanol používá

20 jako induktor a také jako zdroj uhlíku nebo část takového zdroje.
2. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje vsádkovou fázi a vyživovací fázi, přičemž médium pro vyživovací fázi obsahuje zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol a médium vyživovací fáze nádavkem obsahuje induktor.

- 18CZ 303983 B6

Aftí
3. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že médium pro vyživovací fázi obsahuje zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol a toto médium pro vyživovací fázi nádavkem obsahuje induktor.
5 4. Způsob výroby podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že způsob se provádí ve fermentoru, který se vyživuje médiem takovou rychlostí vyživování, že koncentrace ethanolu ve fermentoru je udržována nižší než 10 % objemových.

5. Způsob výroby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který zahrnuje vsádkovou fázi, indukční i o fázi a fázi vyživování, vyznačující se tím, že v uvedené fázi vyživování

a) se buňky hub pěstují k dosažení buněčné hustoty alespoň 5 g/1 v médiu obsahujícím jakýkoliv zdroj uhlíku, bez specifické volby, a následně jsou buňky hub pěstovány k dosažení buněčné hustoty větší než 5 g/1, s výhodou od 10 do 90 g/1 a ještě lépe od 40 do 60 g/I, za použití média,

15 obsahujícího induktor a zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol;

b) se poté, co je dosaženo buněčné hustoty kroku (a), vytvoří podmínky omezeného růstu;

c) se poté, co se ustaví tyto omezující podmínky, buňky dále pěstují na médiu, obsahujícím zdroj

20 uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol.
6. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, v y z π a č u j í c í se tím, že způsob se provádí jako opakující se vyživovaný vsádkový proces.

25
7. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že induktor se zvolí ze skupiny, zahrnující galaktózu, methanol, teplotu a fosforečnany.
8. Způsob výroby podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, vyznačující se tím, že vyživovací médium obsahuje 0,1 až 10 % hmotnostních galaktózy.
9. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zdroj uhlíku obsahuje 80 až 100 % hmotnostních ethanolu.
10. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím,

35 že houbami jsou kvasinky, s výhodou rodu Saccharomyces cerevisiae.
11. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že heterologní protein nebo peptid se zvolí z nemrznoucích peptidů, z protilátek nebo jejich fragmentů a z enzymů.
12. Způsob výroby podle nároku 5, vyznačující se tím, že vsádkové médium zahrnuje 1 až 40 % hmotnostních glukózy, vodu, stopové kovové prvky, volitelně protipěnivé činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečnanové soli a síranové soli a vyživovací médium obsahuje 5 až 35 % objemových ethanolu, 0,1 % hmotnostního až 10 % hmotnostních galaktózy, vodu,

45 stopové kovové prvky, volitelně protipěnivé činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečnanové soli a síranové soli a rychlost vyživování „Φ“ je od 0,25 do 4 g/min v desetilitrovém měřítku.