CZ20031659A3 - Způsob výroby heterologního proteinu - Google Patents
Způsob výroby heterologního proteinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031659A3 CZ20031659A3 CZ20031659A CZ20031659A CZ20031659A3 CZ 20031659 A3 CZ20031659 A3 CZ 20031659A3 CZ 20031659 A CZ20031659 A CZ 20031659A CZ 20031659 A CZ20031659 A CZ 20031659A CZ 20031659 A3 CZ20031659 A3 CZ 20031659A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ethanol
- carbon source
- phase
- weight
- medium
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 151
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 65
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 65
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 30
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 30
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 28
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 19
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 19
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 11
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 11
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 11
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 6
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 claims description 5
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 3
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 20
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 4
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 4
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 4
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 3
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 3
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 3
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000941284 Homo sapiens Gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 101001134456 Homo sapiens Pancreatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229940086609 Lipase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 101710181008 P protein Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000235527 Rhizopus Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000007591 Tilia tomentosa Species 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000981595 Zoysia japonica Species 0.000 description 1
- XTUNVEMVWFXFGV-UHFFFAOYSA-N [C].CCO Chemical compound [C].CCO XTUNVEMVWFXFGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002535 acidifier Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 108010005400 cutinase Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004868 gas analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- -1 glycerol or acetate Chemical class 0.000 description 1
- 230000020169 heat generation Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 102000046759 human PNLIP Human genes 0.000 description 1
- 102000014957 human gastric lipase Human genes 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N inositol Chemical compound OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000006902 nitrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009428 plumbing Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 229910021655 trace metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu výroby heterologního proteinu nebo peptidu v houbách.
Dosavadní stav techniky
Produkce hetorologního proteinu v hostiteli, jako jsou houby, je dobře známá. EP-A-481 008 předkládá výrobu heterologního proteinu v kvasinkách, pěstovaných na glukóze.
Průmyslová výroba hetorologního proteinu, tedy výroba ve velkém měřítku, hostitelským organismem v napájeném (vyživovaném) vsádkovém kvašení obecně vykazuje tři fáze.
První fází je vsádková fáze, která je definována jako fáze, při níž jsou buňky pěstovány až k dosažení požadované koncentrace. V této fázi rostou buňky exponenciálně. Modely vyjadřující vsádkovou fázi předpokládají, že buňky neumírají, že kyslík je přítomný v nadbytku a že všechny ostatní podmínky jsou takové, že může probíhat neomezený růst. To také předpokládá, že ve vsádkové fázi jsou všechny výživové požadavky plněny v dostatečném množství. Souhrnně lze říci, že vsádková fáze je fází, při níž jsou množeny buňky, zatímco produkce (heterologního) proteinu je stále nízká.
Druhou fází je fáze přísunu potravy, vyživovací fáze, která je definována jako fáze, při níž jsou zdroj uhlíku a další požadavané látky přiváděny do kvasné nádoby, fermentoru, v poměrně zahuštěném proudu tekutiny předem vypočtenou rychlostí, tedy rychlostí vyživování. V této fázi je důraz kladen na produkci proteinu • ·
- 2 pěstovanými buňkami a na buněčný růst, vedoucí k nárůstu biomasy. Substrát, který je přiváděn do kvasné nádoby, se v tomto stádiu obecně používá pro buněčný růst a syntézu produktu. Buněčný růst je řízen rychlostí vyživování tak, aby bylo dosaženo optimálního buněčného růstu a produkce heterologního proteinu.
Nakonec je dosaženo třetí fáze, která je definována jako fáze poklesu, při níž nastávají omezující podmínky. V této fázi je například koncentrace kyslíku v kvasné nádobě snížena na nulu, což v některých případech vede k vytváření ethanolu. V tomto stádii se většina buněk soustředí na své udržení, zachování a syntéza produktu je obvykle snížena. Ačkoli může být i v této fázi stále pozorován buněčný růst, růst je obecně velmi omezený a to až k nule. Buňky mohou v tomto stádiu postupně ztrácet svou životnost.
Produkce heteroiogního proteinu v médiu, které obsahuje zdroj uhlíku jako je glukóza nebo jiný zdroj uhlíku na cukerné bázi, je uspokojující do té doby, než se ke konci fáze vyživování začnou projevovat omezující podmínky. Příklady omezujících podmínek zahrnují sníženou koncentraci kyslíku, snížení množství živin jako jsou vitamíny, uhlík a dusík, a nahromadění toxických sloučenin v růstovém médiu.
Pokud jsou houby a zejména kvasinky pěstovány v médiu obsahujícím jako zdroj uhlíku glukózu, je produkce, výroba heterologního proteinu podstatně snížena hned, jakmile nastanou omezující podmínky.
U kvasinek, pěstovaných v běžném médiu, obsahujícím jako zdroj uhlíku cukr, se při vyživovaném vsádkovém kvašení projevují výše popsané fáze. Tedy jakmile je započata fáze poklesu, specifická produkce, která je definována jako množství heterologního proteinu nebo peptidu, vyprodukovaného na 1 gram biomasy, je pouze
udržována, nebo se sníží. I když je buněčná hustota vysoká, syntéza produktu je od této chvíle ve fázi poklesu nízká.
Jinou nevýhodou běžného média, které často obsahuje jako zdroj uhlíku glukózu, je velké množství substrátu, které je místo přeměny na produkt, jímž je obvykle heterologní protein v kontextu tohoto vynálezu, přeměňováno na biomasu. Z tohoto důvodu produkci velkých množství heterologního proteinu v podobných systémech nevyhnutelně doprovází poměrně velké množství biomasy.
Toto velké množství biomasy vede ke vzniku viskózního kvasného média, ve kterém snadno dochází například k omezení množství kyslíku.
Existuje tedy potřeba způsobu výroby heterologního proteinu v hostiteli jako jsou houby, který by vedl k vysokému výtěžku heteroiogního proteinu i za omezujících podmínek, při nichž by normálně došlo ke snížení a omezení specifické produkce, a při němž by zároveň byla specifická produkce růstového systému uchována nebo zvýšena ve srovnání se známými růstovými systémy.
Způsob podle předkládaného vynálezu překonává nejméně jeden z uvedených problémů.
Podstata vynálezu
Překvapivě bylo zjištěno, že houby pěstované v médiu, obsahujícím jako hlavní zdroj uhlíku ethanol a dále obsahujícím k řízení produkce (výroby) heterologního proteinu induktor jako galaktózu, vykazují vysokou specifickou produkci heterologního proteinu, přičemž specifická produkce heterologního proteinu je překvapivě vysoká dokonce i za omezujících podmínek.
Houby, pěstované podle tohoto způsobu, překvapivě nevykazují dobře známé charakteristiky poklesu růstu, se kterými se lze setkat u hub, pěstovaných v tradičních médiích na bázi glukózy. Za pokračujícího vyživování médiem, obsahujícím tento specifický zdroj uhlíku, si houby udržují nebo dokonce zvyšují absolutní a specifickou hladinu produkce heterologního proteinu.
Vynález se proto týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami, který zahrnuje kroky, při nichž se uvedené huby pěstují v médiu obsahujícím zdroj uhlíku, přičemž 50 až 100 % hmotnostních tohoto uhlíkového zdroje představuje ethanol a médium nádavkem obsahuje induktor.
Podrobný popis vynálezu
V kontextu tohoto vynálezu termín houba či houby zahrnuje kvasinky a plísně.
Pro účely tohoto vynálezu je výraz heterologní protein zamýšlen k zahrnutí jak proteinů, tak i peptidu.
Heterologním proteinem je takový protein, který není houbou přirozeně produkován, ale je jí produkován až poté, co byla tato houba v příslušném rozsahu modifikována.
Pokud jsou uváděna hmotnostní procenta, jedná se o hmotnostní procenta vzhledem k celkové hmotnosti produktu nebo k celkové hmotnosti média, pokud však není uvedeno jinak.
Pokud je používán výraz koncentrace kyslíku, je činěn odkaz na koncentraci rozpuštěného kyslíku, která se měří způsobem, popsaným v Příkladech provedení vynálezu.
• · • · • ·
Konec vsádkové fáze se definuje jako okamžik, kdy byl spotřebován veškerý uhlíkový substrát, poskytnutý buňkám.
Indukční fáze je definována jako fáze, která začíná po vsádkové fázi od toho okamžiku, kdy začne indukce heterologního proteinu až do okamžiku, kdy je získána maximální indukce pro použitou koncentraci speciálního induktoru.
Zdroj uhlíku je definován jako substrát, který buňce poskytuje dodávání uhlíku a energie. Houby získávají svůj buněčný uhlík především z organických sloučenin. Ty běžně slouží jako zdroj uhlíku i jako zdroj energie: Jsou částečně asimilovány (vstřebány) do buněčného materiálu a částečně oxidovány k poskytnutí energie. V tomto kontextu je činěn odkaz na práci H. Schlegela v General Microbiology, Cambridge University Press, 1992, 7. vydání, strana 194.
Vynález se týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami. K vytváření tohoto proteinu jsou houby geneticky modifikovány tak, aby byla možná řízená produkce tohoto heterologního proteinu nebo peptidu.
K takové genetické modifikaci může být použit jakýkoliv vhodný konstrukt nebo způsob transformace. Příklady vhodných konstruktů a způsobů transformace jsou uvedeny v EP-A-481 008, která je zde začleněna jako odkaz.
Obecně bude modifikovaná, pozměněná houba po modifikaci obsahovat (integrovaný) vektor, který obsahuje gen, kódující heterologní protein, pod kontrolou promotoru. Aktivita promotoru je řízena tak zvaným induktorem. Příklady promotorů zahrnují galaktózové promotory jako GAL4 či GAL7, které jsou indukovány galaktózou; methanolem indukované promotory, které jsou indukované methanolem; ethanolové
promotory, které jsou indukované ethanolem; teplotou řízené promotory, které jsou indukované změnou teploty; fosfátem (fosforečnanem) řízené promotory, které jsou indukované přítomností fosfátu a glukózou potlačitelné promotory (glucose repressible promoters), indukované nepřítomností glukózy.
Houby se pěstují v médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol, v kombinaci s přítomností induktoru v médiu.
Ve stavu techniky se od použití ethanolu jako zdroje uhlíku obecně odrazuje, jak je doloženo příklady v níže uvedeném popisu. Souhrnně se udává, že použití ethanolu místo glukózy jako zdroje uhlíku snižuje výtěžek biomasy, vyžaduje vyšší spotřebu kyslíku a proto poskytuje nulový nebo omezený růst v podmínkách omezujících přítomnost kyslíku. Nadto může toxicita ethanolu vůči buněčným kmenům vést ke ztrátě životnosti buněk a k jejich smrti. To je například uvedeno v Tabulce 1 publikace The Yeasts, díl 13, 2. vydání, kapitola 6. Zvláštní odkaz je činěn na doplněk 1 tohoto popisu, který udává, že pro kvasinky je rychlost růstu na ethanolu 0,1 h'1 oproti rychlosti růstu 0,35 h'1 na glukóze. Tento doplněk dále udává, že v médiu s ethanolem jako zdrojem uhlíku vykazují kvasinky větší spotřebu kyslíku než v médiu, obsahujícím jako uhlíkový substrát glukózu.
Růst buněk na ethanolu jako zdroji uhlíku je dále popsáno Shibou a spoluautory (J. of Bioscience and Bioengineering 89, 426-430, 2000). Shiba objevil za použití promotoru GAL1& expresi karboxypeptidázy Y (CPY) v mutantu gal180 rodu Saccharomyces cerevisiae. Růstové médium obsahovalo jako jediný zdroj uhlíku ethanol. Během počátku dodávání ethanolu byly jak rychlost růstu, tak i produkce CPY popsány jako klesající. Tento systém nebyl pod kontrolou induktoru.
·« · I* ·· ··· ·
• ·
Nyní předkládaný vynález poskytuje postup, při němž je produkce proteinu uchovávána nebo dokonce zvyšována v přítomnosti média, obsahujícího zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % představuje ethanol, zejména pokud nastanou omezující podmínky růstu. Nadto je způsob (postup) podle nyní předkládaného vynálezu použitelný pro kterýkoli typ hub a nevyžaduje pro růst specifické mutanty gal180. Způsob podle tohoto vynálezu lze také řídit prostřednictvím indukce.
M. Saliola se spoluautory (Applied and Environmental microbiology, leden 1999, str. 53-60) předkládá použití ethanolem indukovatelného promotoru KIADH4 pro expresi heterologního genu v Kluyveromyces lactis. Tato práce udává, že optimální exprese je dosaženopři použití ethanolu jako promotoru a souběžně jako jediného zdroje uhlíku v napájeném vsádkovém systému. Tento produkční systém neumožňuje kontrolu genové exprese ve fázi přísunu výživy.
Jiným přínosem způsobu podle předkládaného vynálezu je kontrola vytváření tepla, což je důležité pro výrobu (produkci) teplotně labilních proteinů.
Přednost se dává tomu, aby médium obsahovalo zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol, v kombinaci s přítomností induktoru v médiu a to ve všech fázích; bylo ovšem také zjištěno, že pokud jsou tyto nároky splněny médiem používaným ve fázi přísunu výživy, je možné použít médium, které ve vsádkové fázi tyto nároky nesplňuje.
V upřednostňovaném ztělesnění se předkládaný vynález týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami, přičemž tento způsob zahrnuje vsádkovou fázi a fázi přísunu výživy, médium fáze přísunu výživy obsahuje zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních ·· ·«· « představuje ethanol a médium fáze přísunu výživy nádavkem obsahuje induktor.
Ve srovnání se známými růstovými systémy, které obvykle obsahují jako hlavní zdroj uhlíku glukózu nebo jiný cukr, umožňuje médium podle předkládaného vynálezu vysoké specifické hladiny produkce dokonce i za omezujících podmínek; tj. s výhodou zde nedochází k fázi poklesu.
Bylo zjištěno, že specifická produkce je dokonce vyšší ve fázi přísunu výživy za podmínek omezené přítomnosti kyslíku, zatímco u růstových systémů na bázi glukózy je nejvyšší specifická produkce obvykle nalezena ve fázi přísunu výživy, při níž je množství biomasy stále poměrně malé.
Aniž by bylo žádoucí vázat se teorií, autoři tohoto vynálezu předpokládají, že ve způsobu podle překládaného vynálezu je fáze poklesu prodloužená nebo dokonce nepřítomná v důsledku použití média, obsahujícího zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol.
Ve způsobu výroby heterologního proteinu jsou podmínky přísunu výživy s výhodou optimalizovány tak, že rychlost buněčného růstu a produkce heterologního proteinu jsou optimální.
Jak bylo uvedeno výše, pokud se houby pěstují v průmyslovém měřítku, vysoce se upřednostňuje vyživovaný vsádkový systém, využívající kvasný tank (fermentor).
V jiném upřednostňovaném ztělesnění se vynález týká způsobu výroby heterologního proteinu houbami, přičemž tento způsob zahrnuje •0 0 «« • · « 0 0 ·· 0 · ·
0·«« vsádkovou fázi, indukční fázi a fázi přísunu výživy, přičemž ve zmíněné fázi vyživování
a) se buňky hub pěstují k dosažení buněčné hustoty alespoň 5 g/l v médiu obsahujícím jakýkoliv zdoj uhlíku, bez specifické volby, a následně jsou buňky hub pěstovány k dosažení buněčné hustoty větší než 5 g/l, s výhodou od 10 do 90 g/l a ještě lépe od 40 do 60 g/l, za použití média, obsahujícího induktor a zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol;
b) se poté, co je dosaženo buněčné hustoty kroku (a), vytvoří podmínky omezeného růstu;
c) se poté, co se ustaví tyto omezující podmínky, buňky dále pěstují na médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol.
V tomto upřednostňovaném způsobu se v prvním kroku buňky pěstují ve vsádkové fázi, dokud není spotřebován zdroj uhlíku a ve druhém kroku se buňky pěstují k dosažení dostatečné buněčné hustoty k umožnění produkce heterologního proteinu ve vysokých množstvích. V prvních stádiích této druhé fáze se produkce heterologního proteinu indukuje přidáním induktoru do výživového média. Doba, trvající od nulové indukce a tedy velmi nízké hladiny produkce heterologního proteinu do maximální úrovně této produkce, se nazývá indukční fáze. Tato indukční fáze představuje první stádium fáze přísunu výživy.
Limitujících podmínek je v kvasném tanku (fermentoru) možné dosáhnout různými způsoby. Omezující podmínky jsou definovány jako takové podmínky, při nichž není dále možný exponenciální buněčný růst a růst buněk je klesající.
• * · • ·
• · · * • · · • ·»
• · · • · ·
··
Ve způsobu podle tohoto vynálezu jsou omezující podmínky v médiu vytvořeny metodou, zvolenou ze skupiny, která zahrnuje:
a) snížení koncentrace kyslíku ve fermentorovém médiu, s výhodou na méně než 30 % a lépe na méně než 15 %;
b) přeplňování média ethanolem tak dlouho, dokud hladina ethanolu v médiu není rovna koncentraci omezující růst buněk rodu, který je pěstován v médiu, nebo dokud není vyšší;
c) snížení hladiny dalších esenciálních (nezbytných) přísad pro růst buněk, přičemž se taková přísada s výhodou zvolí z dusíku, fosforu, síry a vitamínů.
Po vsádkové fázi je vyživovací (napájecí) profil s výhodou exponenciálně rostoucí s produkcí biomasy. Jakmile nastane omezení kyslíku a započne fáze poklesu, rychlost vyživování se s výhodou ustaví na rychlosti, udržující koncentraci ethanolu ve fermentorovém médiu pod 10 % objemovými. Toho lze například dosáhnout lineární, přímkovou rychlostí vyživování nebo impulsní rychlostí vyživování, anebo stupňovitou rychlostí vyživování.
V ještě upřednostňovanějším ztělesěnní se způsob podle předkládaného vynálezu provádí jako opakovaný vyživovaný (napájený) vsádkový postup.
Induktor je s výhodou vhodný pro ''zapnutí promotoru, který je operativně připojen na heterologní gen v genovém konstruktu, použitém pro transformaci hostitelské houby. Upřednostňovanými induktory jsou galaktóza, methanol, teplota a fosfáty.
Nejupřednostňovanějším induktorem je galaktóza.
- 11 ·· · · · • · · · · · • · ·· · ·
Předkládaný vynález se netýká způsobů exprese, při nichž se ethanol používá jako induktor a zárověň jako zdroj uhlíku nebo částečný zdroj uhlíku.
Pokud je índuktorem galaktóza, mělo by být množství gaiaktózy v médiu s výhodou takové, aby byl promotor zapnut na požadovanou úroveň už při množství tak nízkém, že galaktóza není metabolizována. K prevenci metabolizování gaiaktózy je možné použít rod, který není schopný induktor metabolizovat.
Složení výživového (napájecího) média je s výhodou takové, že médium ve fermentoru obsahuje od 0,1 % hmotnostního do 10 % hmotnostních gaiaktózy, lépe od 0,05 do 1 % hmotnostního gaiaktózy a ještě lépe od 0,05 do 0,2 % hmotnostního gaiaktózy.
Zdroj uhlíku v médiu podle předkládaného vynálezu obsahuje alespoň 50 % hmotnostních a až do 100 % hmotnostních ethanolu S výhodou zdroj uhlíku obsahuje od 80 do 100 % hmotnostních ethanolu. Zbytkem uhlíkového zdroje může být například cukr jako glukóza, galaktóza, laktóza, sacharóza, fruktóza, nebo jiná sloučenina, jako glycerol či acetát, nebo to mohou být komplexní, složené uhlíkové substráty jako syrovátka nebo melasa.
Houbou mohou být kvasinky nebo plísně. Příklady vhodných rodů kvasinek zahrnují Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula. K příkladům vhodných plísní patří Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma.
Zvláště upřednostňovaným organismem jsou kvasinky rodu Saccharomyces cerevisiae.
Heterologním proteinem může být jakýkoliv protein nebo peptid, jehož výroba je žádoucí. Bylo zjištěno, že způsob podle předkládaného • · φ · · · • · · φ φ ·
- 12 vynálezu je zvláště výhodný k výrobě nemrznoucích peptidů (antifreeze peptides), protilátek nebo jejich fragmentů, nebo enzymů, jako je kutináza a galaktosidáza.
Nemrznoucí peptidy jsou proteiny, které mají schopnost modifikovat růst ledu a jsou například popsány Griffithem a spoluautory v práci, která je zde začleněnna jako odkaz (Biotechnology Advances 13(3), 375-402, 1995).
Médium pro různé fáze růstu hub obecně zahrnuje zdroj uhlíku, volitelně induktor, jehož přítomnost je vyžadována po vsádkové fázi a volitelně další přísady jako vitamíny, kvasničný extrakt, stopové kovové ionty, okyselující činidla k udržení pH na požadované úrovni, fosforečné sole, síranové sole, vodu a protipěnící činidlo.
Podle jiného upřednostňovaného ztělesnění se předkládaný vynález týká způsobu výrovy heterologního proteinu nebo peptidu, přičemž vsádkové médium obsahuje 1 až 40 % hmotnostních glukózy, vodu, stopové kovy, volitelně protipěnící činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečné sole a síranové sole a výživové, napájecí médium obsahuje od 5 do 35 % ethanolu, 0,1 až 10 % hmotnostních galaktózy, vodu, stopové kovy a volitelně protipěnící činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečné soli a síranové soli a kde rychlost vyživování, φ, je v desetilitrovém měřítku od 0,25 do 4 g/min, nebo má odpovídající hodnotu při kvašení ve větším měřítku.
Předkládaný vynález se dále týká isolátu heterologního peptidu, zvláště izolátu nemrznoucího peptidu, získaného způsobem podle tohoto vynálezu.
Vynález bude nyní ozřejměn následujícími Příklady provedení vynálezu, na něž se neomezuje.
Příklady provedení vynálezu
Média a kultivace
Veškerá média a údaje, týkající se kultivace, se vztahují k ethanolovému kvašení v rozsahu 10 litrů.
Pro rozsah 10 m3 platí zhruba totéž po vynásobení faktorem měřítka, tedy jedním tisícem.
Média
Předkultivační média:
| Inokulační (očkovací) média | sloučenina | g-i-1 | dodavatel |
| YNB kvasinky dusík báze | YNB w/o aminokyseliny | 6,7 | Difco |
| glukóza Glucose*1 aq | 5 | AVEBE | |
| v demineralizované vodě | |||
| YPD kvasinky pepton glukóza | YE | 10 | Difco |
| baktopepton | 20 | Difco | |
| glukóza Glucose*1aq | 20 | AVEBE | |
| v demineralizované vodě |
Vsádková a napájecí, výživová média jsou uvedena v Tabulce 1 pro rozsah 10 litrů.
Tabulka 1
| sloučenina | dodavatel | koncentrace (g.kg'1) | ||
| vsádka | přiváděný ethanol | přiváď. komp. př. glukóza | ||
| glukóza | Avebe | 22,0 | - | 440,0 |
| vodovodní voda | ||||
| EtOH* | Lamers & Pleuger | - | 333,84 | - |
| galaktóza | HMS | - | 3,0 | 3,0 |
| vodovodní voda | ||||
| YE Kat G | Ohiy | 10,0 | 25,0 | 25,0 |
| KH2PO4 | Acros | 2,1 | 12,0 | 12,0 |
| MgSO4 . 7H20 | Merck | 0,6 | 2,5 | 2,5 |
| vitamíny Egii | vit Tabulku 2 | 1,0 | 1,0 | 2,0 |
| stopové prvky Egli | vit Tabulku 2 | 10,0 | 20,0 | 20,0 |
| Structol J 673 | Schill & Seilacher | 0,4 | 0,8 | 0,8 |
| vodovodní voda | ||||
| celková hmotnost (g) | 5 500 | 4 000 | 4 000 |
* čistý ethanol, obsah 96,2 % objem/objem, nedenaturovaný
Všechna média byla sterilizována 25 minut při 121 °C a tlaku 120 kPa (1,2 bar) v autoklávu Linden, cukry odděleně. Množství vodovodní
- 15 • 9 9 9 9 · · · · • ········· 9 • · · · 9 9 · 9 · * •999 999 99 99 «9 ·· vody jsou uvedena níže a celkové množství bylo takové, aby celková hmotnost odpovídala údaji, uvedenému ve spodním řádku Tabulky 1.
Složení vitamínů Egli a stopových prvků
Tabulka 2
| Vitamíny Egli (1000 x zásobní roztok) | stopovéprvky Egli (100 x zásobní roztok) | ||
| sloučenina | g.i'1 | sloučenina | g.i·1 |
| thiamin (HCI) | 5,00 | CaCI2. 2 H2O | 5,50 |
| meso-inosit | 47,00 | FeSO4 . 7 H2O | 3,73 |
| pyridoxin | 1,20 | MnSO4 . 1 H2O | 1,40 |
| kys. listová | 23,00 | ZnSO4.7 H2O | 1,35 |
| biotin | 0,05 | CuSO4 . 5 H2O | 0,40 |
| CoCI2. 6 H2O | 0,45 |
Vitamíny byly sterilizovány filtrací přes filtr o velikosti pórů 0,22 μπι.
Rod
Použit byl rod Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A. Základní rod S. cerevisiae CEN.PK2 je komerčně dostupný od firmy EUROSCARF Mikrobiologického ústavu Goetheho university ve Frankfurtu (Institute of Microbiology, Johann Wolfgang Goethe-University Frankfurt, Marie-Curie-Strasse 9, budova N250, D-60439 Frankfurt, Německo).
Tento rod S. cerevisiae není schopný metabolizovat galaktózu, neboť gen GAL1 byl přerušen zavedením sekvencí, získaných z genu S.
- 16 • fr ·· ·· ··· · • * · · · · • ·· · · · • · · · · · ···· · ·· ·· ·· cerevisiae URA3. Hostitelský rod byl transformován expresním plasmidem, obsahujícím následující prvky:
Promotor:
GAL7 promotor, zaváděcí část GAPDH. GAL7 promotor: dvě po směru aktivující sekvence jsou vždy přítomné. Jsou dvěma přírodními prvky, které jsou částí sekvence, jak je uvedena.
Selekční markér: Leu2d
Signální sekvence: invertáza (SÍ/C2)
Cíl integrace: fragment opakované rDNA s jediným restrikčním místem pro cílovou integraci do specifické oblasti v kvasinkovém chromosomu XII.
Heterologní gen:
Příkiad 1: gen nemrznoucího proteinu, kódující nemrznoucí protein
HPLC12 sliznatky slepé (oceán pout) (ad WO-A-9702343);
Příklad 2: K609B, protilátka vůči virulentním faktorům selat;
Příklad 3: Protein VHH G, kterým je HGL11, tedy imunoglobulin tvořený těžkým řetězcem; inhibitor lipázy působící vůči lidské gastrické lipáze, uvedený v EP-A-1 134 231;
Příklad 4: Protein VHH P, kterým je HPL18, tedy imunoglobulin tvořený těžkým řetězcem; inhibitor iipázy působící vůči lidské pankreatické lipáze, uvedený v EP-A-1 134 231;
Proteiny z příkladů 2 až 4 jsou protilátky, které lze získat imunizací lamy postupem uvedeným v EP-A-1 134 231.
Kultivace
Uchovávání rodů
- 17 ·· * «· ·· ·· ···· • * * · · · · · · · 9 • · 9 9 99 9 9 9 • · ···· · · « · ······· «· «φ M φφ
Rody kvasinek byly uchovávány při -80 °C v jediné vsádce z růstových kultur YNB, naředěných v poměru 1:1 směsí odstředěného mléka a 20% glycerolu.
Za očko ván i:
ml YNB bylo zaočkováno 1 ml uchovávaného rodu a inkubováno 48 ± 2 hodiny při 30 °C a rychlosti míchání 150 otáček za minutu. Inokulum bylo následně převedeno do 500 ml 2% YPD a inkubováno 24 ± 2 hodiny při 30 °C a rychlosti míchání 150 otáček za minutu.
Fermentor
Kvašení bylo prováděno ve standardních kvasných tancích (fermentorech) s pracovním objemem 10 litrů. Pro kontrolu teploty byl fermentor vybaven chladící spirálou a zahříváním. Přepážky měly standardní velikosti. Pro míchání byl použit rotor typu Rushton se šesti lopatkami. Rozpuštěný kyslík (DO2) byl měřen elektrodou Ingold DO2-electrode (Mettler-Toledo) a hodnoty pH byly měřeny gelovou elektrodou Ingold Impro 3000 (Mettler-Toledo). K měření odpadního plynu byl používán spektrofotometr Prima 600 (VG plynový analyzační systém). Celý kvasný proces byl automatizován a softwarově řízen, ale lze ho provádět také manuálně na základě pokynů uvedených níže.
K řízení kvašení byl využit profil vyživování. Hodnota pH byla řízena za použití 3 mol.l'1 roztoku kyseliny fosforečné (Baker) a 12,5 % roztoku (objem/objem) amoniaku.
DO2 byl regulovaný na 30% hodnotu automatickou úpravou rychlosti rotoru až k dosažení maximální rychlosti míchání (1000 otáček za minutu).
···
- 18 • ♦ ·
Během kvašení byly prostřednictvím automatického zařízení na odběr vzorků odebírány vzorky o objemu 5 ml a ochlazeny na 4 °C ke stanovení sušiny a koncentrace produktu.
Vsádková fáze
K započetí vsádkové fáze bylo 500 ml inokula YPD přidáno do 5,5 litru vsádkového média. Parametry kvašení odpovídaly parametrům, uvedeným v Tabulce 3. Jakmile obsah ethanolu v odpadním píynu poklesl na 300 dílů z milionu, bylo zahájeno exponenciální vyživování.
Fáze vyživování
Vyživovací médium bylo rozděleno do dvou vyživovacích lahví, připojených na stejné čerpadlo.
Jedna vyživovací láhev obsahovala ethanol a vodovodní vodu v množství do 2 litrů objemu a obsah byl přiváděn do fermentoru přes spodní desku. Druhá vyživovací láhev obsahovala všechny ostatní složky výživy a vodu v množství do 2 litrů objemu a obsah byl přiváděn do fermentoru přes horní desku.
Z obou lahví, připojených na stejné čerpadlo, byla aplikována stejná exponenciální rychlost vyživování podle rovnice 1. Pro dvě lahve je výsledná rychlost vyživování rovna dvojnásobku rychlosti čerpání.
μ · Xo · e μΑ [g/min] (rovnice 1)
Φν( = rychlost vyživování μ = rychlost růstu
Xo = biomasa na začátku vyživování g/min h'1 g (mol. hm. = 24,6 g/mol)
- 19 ♦ · · · ·
t = doba od začátku vyživování pvyž = hustota (hutnost) vyživování Yxs = odhad, výtěžek biomasy 60 = časový faktor min g EtOH/g vyživování g X/g substrátu min/h
Parametry vyživování odpovídaly parametrům, jak jsou uvedeny v Tabulce 3.
Tabulka 3: Paremetry přísunu kvasné výživy pro kvašení s 10 litry ethanolu
| parametr | hodnota |
| μ (l/h) | 0,06 |
| Xo | 1,06 |
| Pvyi | 0,41 |
| ^X,S | 0,45 |
| T vsádky (°C) | 30 |
| T výživy (°C) | 21 |
| průtok vzduchu vsádkou (l/min) | 2 |
| průtok vzduchu výživou (l/min) | 6 |
| DO2 (%) | 30 |
| minimum DO2 (%) | 0 |
| pH | 5 |
| SS min. (otáčky za minutu) | 300 |
| SS max. (otáčky za minutu) | 1 000 |
| kriterium EtOH na začátku vyživování (díly z mil.) | 300 |
| kriterium EtOH na začátku poklesu (díly z mil.) | 800 |
| maximum EtOH (díly z mil.) | 2 000 |
| počáteční celková rychlost vyživování (g/min) | 0,28 |
| lineární celková rychlost vyživování (g/min) | 2 |
- 20 • 9 « 99 99 999999 «990 0000 00 * ·· 99 99 999
9 9999 9999
999· 909 99 09 99 99
Jakmile byla koncentrace kyslíku 0%, byly ustaveny omezující podmínky a rychlost čerpání byly upravena na lineární rychlost čerpání. Toto vyživování pokračovalo tak dlouho, dokud nebyla vyčerpána veškerá výživa.
Výsledky:
Příklad 1
| ethanol jako zdroj uhlíku | |||
| čas | AFP (mg/kg | sušina | specifická |
| (h) | kvasného bujónu) | (g/kg) | produkce* (mg/g) |
| 0 | 0 | 2,4 | 0 |
| 3 | 0 | 3,4 | 0 |
| 6 | 0 | 5,7 | 0 |
| 9 | 0 | 7,6 | 0 |
| 12 | 0 | 10,9 | 0 |
| 15 | 0 | 10,5 | 0 |
| 18 | 0 | 11,7 | 0 |
| 21 | 0 | 13,3 | 0 |
| 24 | 0 | 15,6 | 0 |
| 27 | 7,0 | 17,9 | 0,393 |
| 30 | 11,4 | 20,7 | 0,549 |
| 33 | 17,9 | 24,8 | 0,721 |
| 36 | 24,2 | 28,8 | 0,840 |
| 39 | 32,4 | 32,7 | 0,990 |
| 42 | 41,8 | 38,4 | 1,089 |
| 45 | 52,4 | 42,7 | 1,227 |
·»· ·
- 21 • · « 9 ♦
·· · · • · · · · · t • · ·· · · · ·· ·· · · · · » • · · » · · · * * ·· ·· ♦♦ ♦♦
| čas (h) | AFP (mg/kg kvasného bujónu) | sušina (g/kg) | specifická produkce* (mg/g) |
| 48 | 66,9 | 49,0 | 1,366 |
| 51 | 78,7 | 55,0 | 1,432 |
| 54 | 93,7 | 60,6 | 1,546 |
| 57 | 112,2 | 64,8 | 1,732 |
| 60 | 132,1 | 68,6 | 1,925 |
| 63 | 151,2 | 71,9 | 2,104 |
| 66 | 165,8 | 75,5 | 2,195 |
* specifická produkce: mg AFP/g sušiny
Na základě těchto výsledků byiu učiněn závěr, že pokud produkce AFP, ve vyživovací fázi po omezujících podmínkách, stoupá a pokud pokračuje vyživování médiem, obsahujícím zdroj uhlíku, který je ze 100 % představován ethanolem, dochází k překvapivě vysoké specifické produkci AFP.
Byio pozorováno, že produkce biomasy zůstala konstantní, aniž by došlo k úbytku absolutní produktivity AFP.
Srovnávací příklad
Růstové médium ve vyživovací fázi neobsahovalo jako zdroj uhlíku ethanol, ale 100 % hmotnostních glukózy. Médium pro tento pokus bylo popsáno výše. Také podmínky vyživování, přiváděného do fermentoru, jsou popsány výše, přičemž byly uplatněny následující výjimky: Vyživovací médium bylo dodáváno do fermentoru pouze z jedné vyživovací láhve, obsahující veškeré složky a přívod byl do fermentoru zajištěn přes dolní desku. Použita byla exponenciální rychlost vyživování podle rovnice 1.
φφ φφφφ φ» φφ φ φ « φ φ φ φφ • φφφ φφφφ ΦΦΦΦ ΦΦ φφ
Parametry vyživování odpovídaly těm, které jsou uvedeny v Tabulce 3 kromě toho, že hodnota Xo byla ustavena na 2,11 mol k dosažení takové rychlosti vyživování při použití jedné lahve, jaká byla v ethanolovém kvašení dosahována za použití dvou vyživovacích lahví, zapojených na jedno čerpadlo.
Výsledky jsou následující:
| čas (h) | AFP (mg/kg | sušina (g/kg) | specifická produkce* (mg/g) |
| 0 | 0 | 1,9 | 0 |
| 3 | 0 | 3,3 | 0 |
| 6 | 0 | 5,5 | 0 |
| 9 | 0 | 7,2 | 0 |
| 12 | 0 | 10,4 | 0 |
| 15 | 0 | 11,4 | 0 |
| 18 | 0 | 11,7 | 0 |
| 21 | 0,8 | 15,8 | 0,049 |
| 24 | 2,6 | 18,4 | 0,142 |
| 27 | 5,8 | 20,3 | 0,286 |
| 30 | 10,3 | 24,6 | 0,421 |
| 33 | 16,8 | 28,6 | 0,721 |
| 36 | 25,5 | 33,0 | 0,773 |
| 39 | 35,4 | 37,5 | 0,942 |
| 42 | 46,8 | 43,4 | 1,077 |
| 45 | 60,3 | 50,0 | 1,204 |
| 48 | 74,4 | 55,9 | 1,33 |
·· * ♦ φ φ φφ
ΦΦ ΦΦΦΦ • · Φ
ΦΦΦ
- 23 • Φ Φ 4 ΦΦ ΦΦ
Φ Φ Φ Φ ΦΦ ΦΦ
| čas (h) | AFP (mg/kg kvasného bujónu) | sušina (g/kg) | specifická produkce* (mg/g) |
| 51 | 90,8 | 62,9 | 1,445 |
| 57 | 126,4 | 79,2 | 1,596 |
| 60 | 135,2 | 79,5 | 1,701 |
| 63 | 135,13 | 79,3 | 1,705 |
Byl učiněn závěr, že pokud růstové médium obsahuje jako zdroj uhlíku pouze glukózu, produkce AFP je snížena od okamžiku, kdy se ustaví omezující podmínky. Produkce AFP dále nestoupá a specifická produkce klesá.
Výsledky - Příklad 2
| ethanol jako zdroj uhlíku | glukóza jako zdroj uhlíku (srovnávací příklad 2) | ||||
| VHH (mg/kg kvas. bujónu) | sušina (g/kg) | specifická produkce* (mg/g) | VHH (mg/kg kvas. bujónu) | sušina (g/kg) | specifická produkce* (mg/g) |
| 0 | 0,91 | 0 | 0 | 6,63 | 0,00 |
| 0 | 6,17 | 0 | 0 | 12,34 | 0,00 |
| 0 | 11,66 | 0 | 106,33 | 25,60 | 4,15 |
| 141,77 | 21,26 | 6,67 | 248,09 | 35,65 | 6,96 |
| 927,40 | 48,68 | 19,05 | 425,30 | 45,02 | 9,45 |
| 1063,26 | 51,65 | 20,58 | 673,40 | 57,59 | 11,69 |
| 1222,75 | 56,68 | 21,57 | 856,52 | 72,22 | 11,86 |
| 1151,87 | 55,31 | 20,83 | 915,59 | 71,31 | 12,84 |
* specifická produkce: mg heterologního proteinu / g sušiny
| » 0 · | ♦ 0 | 00 | 0 0 | 0 00 0 | ||||
| • 0 | • 0 | 0 | 0 | 0 0 | 0 | • | 0 | |
| • | • | 0 | 0 | 00 | 0 | 0 | 0 | |
| « | ||||||||
| • | • | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 0 | |
| 000· | ·♦· | 0 0 | 00 | 00 | 00 |
Byl učiněn závěr, že specifická produkce heterologního proteinu, využívající jako zdroj uhlíku ethanol, je mnohem vyšší než specifická produkce za použití glukózy jako zdroje uhlíku.
Výsledky - Příklad 3
| ethanol jako zdroj uhlíku | glukóza jako zdroj uhlíku (srovnávací příklad 3) | ||||||
| čas (h) | VHH (mg/kg kvas. bujónu) | sušina (g/kg) | specif. produk- ce* (mg/g) | čas (h) | VHH (mg/kg kvas. bujónu) | sušina (g/kg) | specif. produk- ce* (mg/g) |
| 3 | 0 | 2,87 | 0 | 21 | 103,45 | 17,19 | 6,02 |
| 6 | 0 | 5,73 | 0 | 27 | 127,59 | 20,78 | 6,14 |
| 9 | 0 | 6,93 | 0 | 33 | 227,59 | 28,66 | 7,94 |
| 33 | 268,97 | 45,37 | 5,93 | 39 | 272,41 | 36,78 | 7,41 |
| 36 | 417,24 | 50,86 | 8,20 | 45 | 327,59 | 47,52 | 6,89 |
| 39 | 537,93 | 54,45 | 9,88 | 51 | 413,79 | 57,07 | 7,25 |
| 42 | 689,66 | 56,36 | 12,24 | 57 | 503,45 | 64,48 | 7,81 |
| 63 | 565,52 | 67,10 | 8,43 | ||||
| 69 | 596,55 | 69,73 | 8,56 |
* specifická produkce: mg heterologního proteinu/g sušiny
Byl učiněn závěr, že specifická produkce heterologního proteinu, využívající jako zdroj uhlíku ethanol, je mnohem vyšší než specifická produkce za použití glukózy jako zdroje uhlíku.
Výsledky - Příklad 4 • · • · · · ·
0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 * · · · 0
0 »0
- 25 0
| ethanol jako zdroj uhlíku | glukóza jako zdroj uhlíku (srovnávací příklad 4) | ||||||
| čas (h) | VHH (mg/kg kvas. bujónu) | sušina (g/kg) | specif. produk- ce* (mg/g) | čas (h) | VHH (mg/kg kvas. bujónu) | sušina (g/kg) | specif. produk- ce* (mg/g) |
| 0 | 0,00 | 0,72 | 0,00 | 15 | 13,79 | 10,51 | 1,31 |
| 12 | 0,00 | 9,79 | 0,00 | 21 | 27,59 | 16,00 | 1,72 |
| 18 | 13,79 | 17,19 | 0,80 | 27 | 55,17 | 19,10 | 2,89 |
| 24 | 155,17 | 25,31 | 6,13 | 33 | 117,24 | 25,07 | 4,68 |
| 30 | 275,86 | 35,82 | 7,70 | 39 | 155,17 | 32,00 | 4,85 |
| 36 | 403,45 | 46,80 | 8,62 | 45 | 213,79 | 45,13 | 4,74 |
| 39 | 472,41 | 50,63 | 9,33 | 51 | 210,34 | 56,83 | 3,70 |
| 42 | 620,69 | 53,49 | 11,60 | 57 | 255,17 | 68,30 | 3,74 |
| 45 | 675,86 | 58,03 | 11,65 |
* specifická produkce: mg proteinu/g sušiny
Byl učiněn závěr, že specifická produkce heterologního proteinu, využívající jako zdroj uhlíku ethanol, je mnohem vyšší než specifická produkce za použití glukózy jako zdroje uhlíku.
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby heteroiogníhoproteinu houbami, vyznačující se t í m , že zahrnuje kroky, při nichž se uvedené huby pěstují v médiu obsahujícím zdroj uhlíku, přičemž 50 až 100 % hmotnostních tohoto uhlíkového zdroje představuje ethanol a médium nádavkem obsahuje induktor, s tou výhradou, že se tento způsob netýká způsobů exprese, při nichž se ethanol používá jako induktor a také jako zdroj uhlíku nebo část takového zdroje.
- 2. Způsob výroby podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje vsádkovou fázi a vyživovací fázi, přičemž médium pro vyživovací fázi obsahuje zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol a médium vyživovací fáze nádavkem obsahuje induktor.
- 3. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že médium pro vyživovací fázi obsahuje zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol a toto médium pro vyživovací fázi nádavkem obsahuje induktor.
- 4. Způsob výroby podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se t í m , že způsob se provádí ve fermentoru, který se vyživuje médiem takovou rychlostí vyživování, že koncentrace ethanolu ve fermentoru je udržována nižší než 10 % objemových.
- 5. Způsob výroby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který zahrnuje vsádkovou fázi, indukční fázi a fázi vyživování, vyznačující se t í m , že v uvedné fázi vyživovánía) se buňky hub pěstují k dosažení buněčné hustoty alespoň 5 g/l v médiu obsahujícím jakýkoliv zdoj uhlíku, bez specifické volby, a- 27 • 4 4 «« ·4 4« 4444 »•44 4444 44 »4 4 4*44 4« 4 * 444 44 44·· 44 4 44*4 44444444 444 4· ·4 44 44 následně jsou buňky hub pěstovány k dosažení buněčné hustoty větší než 5 g/l, s výhodou od 10 do 90 g/l a ještě lépe od 40 do 60 g/l, za použití média, obsahujícího induktor a zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol;b) se poté, co je dosaženo buněčné hustoty kroku (a), vytvoří podmínky omezeného růstu;c) se poté, co se ustaví tyto omezující podmínky, buňky dále pěstují na médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, jehož 50 až 100 % hmotnostních představuje ethanol.
- 6. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že způsob se provádí jako opakující se vyživivaný vsádkový proces.
- 7. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že induktor se zvolí ze skupiny, zahrnující galaktózu, methanol, teplotu a fosforečnany.
- 8. Způsob výroby podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, vyznačující se tím, že vyživovací médium obsahuje 0,1 až 10 % hmotnostních gaiaktózy.
- 9. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zdroj uhlíku obsahuje 80 až 100 % hmotnostních ethanolu.
- 10. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že houbami jsou kvasinky, s výhodou rodu Saccharomyces cerevisiae.
fr· • · • • frfr • fr v • fr • fr • r • · • · fr • • • • frfr· • « • • • · • · • • * · ···· • •fr • fr ·· ·· • fr - 11. Způsob výroby podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že heterologní protein nebo peptid se zvolí z nemrznoucích peptidů, z protilátek nebo jejich fragmentů a z enzymů.
- 12. Způsob výroby podle nároku 5, vyznačující se tím, že vsádkové médium zahrnuje 1 až 40 % hmotnostních glukózy, vodu, stopové kovové prvky, volitelně protipěnivé činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečnanové soli a síranové soli a vyživovací médium obsahuje 5 až 35 % objemových ethanolu, 0,1 % hmotnostního až 10 % hmotnostních galaktózy, vodu, stopové kovové prvky, volitelně protipěnivé činidlo, kvasničný extrakt, vitamíny, fosforečnanové soli a síranové soli a rychlost vyživování Φ je od 0,25 do 4 g/min v desetilitrovém měřítku.
- 13. Heteroiogní protein, vyznačující se tím, že je získatelný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00311095 | 2000-12-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031659A3 true CZ20031659A3 (cs) | 2003-11-12 |
| CZ303983B6 CZ303983B6 (cs) | 2013-07-31 |
Family
ID=8173440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20031659A CZ303983B6 (cs) | 2000-12-13 | 2001-11-16 | Zpusob výroby heterologního proteinu |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7560249B2 (cs) |
| EP (1) | EP1349945B1 (cs) |
| JP (1) | JP4494716B2 (cs) |
| CN (1) | CN1481439A (cs) |
| AT (1) | ATE351911T1 (cs) |
| AU (2) | AU1604902A (cs) |
| BR (1) | BR0116675A (cs) |
| CA (1) | CA2427665C (cs) |
| CZ (1) | CZ303983B6 (cs) |
| DE (1) | DE60126148T2 (cs) |
| ES (1) | ES2278681T3 (cs) |
| HU (1) | HU228689B1 (cs) |
| IL (1) | IL156438A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03005358A (cs) |
| PL (1) | PL204737B1 (cs) |
| SK (1) | SK287621B6 (cs) |
| WO (1) | WO2002048382A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200303353B (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2121916A1 (en) * | 2006-12-20 | 2009-11-25 | Danisco US, INC., Genencor Division | Assays for improved fungal strains |
| US11214610B2 (en) | 2010-12-01 | 2022-01-04 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| AU2016273912B2 (en) * | 2011-05-20 | 2018-08-02 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| CA2837000C (en) * | 2011-05-20 | 2021-09-14 | Alderbio Holdings Llc | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris |
| US10150968B2 (en) | 2011-08-19 | 2018-12-11 | Alderbio Holdings Llc | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris |
| WO2014152145A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for producing antibodies |
| US20160230141A1 (en) * | 2013-09-19 | 2016-08-11 | Research Foundation Of The City University Of New York | Process for increased yeast biomass |
| DK4089113T3 (da) | 2015-03-31 | 2024-02-05 | Sorriso Pharmaceuticals Inc | Polypeptider |
| AU2016239949A1 (en) | 2015-03-31 | 2017-09-07 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Peptide construct having a protease-cleavable linker |
| WO2016156474A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Vhsquared Limited | Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin a |
| WO2016156475A1 (en) | 2015-03-31 | 2016-10-06 | Vhsquared Limited | Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b |
| WO2018060453A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Vhsquared Limited | Compositions |
| EP3986570A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-04-27 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Compositions |
| US20230056445A1 (en) | 2019-06-21 | 2023-02-23 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides |
| US20220242945A1 (en) | 2019-06-21 | 2022-08-04 | Sorriso Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2109238T3 (es) | 1989-07-07 | 1998-01-16 | Unilever Nv | Procedimiento para la preparacion de una proteina mediante un hongo transformado por integracion multicopia de un vector de expresion. |
| CZ698A3 (cs) | 1995-07-05 | 1998-05-13 | Unilever N. V. | Exprese peptidu mořských ryb chránící proti zmrznutí v organizmu vhodném pro potravinářský průmysl a aplikace těchto peptidů v potravinářských produktech |
| EP1134231B1 (en) | 2000-03-14 | 2009-04-15 | Unilever N.V. | Antibody heavy chain variable domains against human dietary lipases, and their uses |
-
2001
- 2001-11-16 WO PCT/EP2001/013457 patent/WO2002048382A2/en active IP Right Grant
- 2001-11-16 JP JP2002550097A patent/JP4494716B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 CN CNA018205372A patent/CN1481439A/zh active Pending
- 2001-11-16 ZA ZA200303353A patent/ZA200303353B/en unknown
- 2001-11-16 US US10/450,211 patent/US7560249B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 SK SK740-2003A patent/SK287621B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 ES ES01270616T patent/ES2278681T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 PL PL362773A patent/PL204737B1/pl unknown
- 2001-11-16 IL IL15643801A patent/IL156438A0/xx active IP Right Grant
- 2001-11-16 AU AU1604902A patent/AU1604902A/xx active Pending
- 2001-11-16 AT AT01270616T patent/ATE351911T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-11-16 EP EP01270616A patent/EP1349945B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 DE DE60126148T patent/DE60126148T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 BR BR0116675-1A patent/BR0116675A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-11-16 MX MXPA03005358A patent/MXPA03005358A/es active IP Right Grant
- 2001-11-16 AU AU2002216049A patent/AU2002216049B2/en not_active Expired
- 2001-11-16 HU HU0302655A patent/HU228689B1/hu unknown
- 2001-11-16 CA CA2427665A patent/CA2427665C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-16 CZ CZ20031659A patent/CZ303983B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2427665A1 (en) | 2002-06-20 |
| US20040077069A1 (en) | 2004-04-22 |
| DE60126148T2 (de) | 2007-05-31 |
| CN1481439A (zh) | 2004-03-10 |
| SK7402003A3 (en) | 2003-09-11 |
| EP1349945B1 (en) | 2007-01-17 |
| PL362773A1 (en) | 2004-11-02 |
| JP4494716B2 (ja) | 2010-06-30 |
| US7560249B2 (en) | 2009-07-14 |
| WO2002048382A2 (en) | 2002-06-20 |
| BR0116675A (pt) | 2003-11-04 |
| EP1349945A2 (en) | 2003-10-08 |
| AU1604902A (en) | 2002-06-24 |
| HUP0302655A3 (en) | 2004-10-28 |
| PL204737B1 (pl) | 2010-02-26 |
| DE60126148D1 (de) | 2007-03-08 |
| WO2002048382A3 (en) | 2003-01-30 |
| ATE351911T1 (de) | 2007-02-15 |
| IL156438A0 (en) | 2004-01-04 |
| HUP0302655A2 (hu) | 2003-11-28 |
| MXPA03005358A (es) | 2003-10-06 |
| JP2004515249A (ja) | 2004-05-27 |
| AU2002216049B2 (en) | 2005-11-24 |
| ZA200303353B (en) | 2004-04-30 |
| SK287621B6 (sk) | 2011-04-05 |
| HU228689B1 (hu) | 2013-05-28 |
| CA2427665C (en) | 2011-10-11 |
| CZ303983B6 (cs) | 2013-07-31 |
| ES2278681T3 (es) | 2007-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20031659A3 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu | |
| Kiers et al. | Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359 | |
| Boze et al. | Production of food and fodder yeasts | |
| Eggeling et al. | Derepression and partial insensitivity to carbon catabolite repression of the methanol dissimilating enzymes in Hansenula polymorpha | |
| CN101983242A (zh) | 含有尿素类氮源的发酵培养基及其用于生产次级代谢产物、酶和重组蛋白的用途 | |
| CN112626143B (zh) | 一种l-赖氨酸的发酵方法 | |
| US4877731A (en) | Fermentation process for carboxylic acids | |
| CN112940945A (zh) | 一种中国被毛孢发酵的方法 | |
| RU2713124C2 (ru) | Способ повышения продукции изолимонной кислоты у дрожжей Yarrowia lipolytica, дрожжи вида Yarrowia lipolytica, обладающие способностью к продукции изолимонной кислоты | |
| CA2662402C (en) | Process for producing erythritol using moniliella tomentosa strains in the presence of neutral inorganic nitrates, such as potassium nitrate, ammonium nitrate or sodium nitrate, as nitrogen source | |
| CN101270339A (zh) | 分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法 | |
| Harvey et al. | Liquid fermentation systems and product recovery of Aspergillus | |
| US6750045B2 (en) | Fermentation medium and method | |
| US5702943A (en) | Process for preparing a biomass on a cereal medium, use of the products so prepared and panification ferment | |
| CN101709318A (zh) | 一种产朊假丝酵母流加发酵制备谷胱甘肽的方法 | |
| RU2785901C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
| US4237233A (en) | Method for cultivating Basidiomycetes | |
| RU2757603C1 (ru) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий изолимонную кислоту | |
| Wongso | Optimisation of industrial whey ethanol fermentation process: a thesis presented in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Biotechnology at Massey University | |
| CN114807259B (zh) | 一种用于发酵生产谷氨酸的种子培养基和发酵培养基 | |
| US6303351B1 (en) | Process for the continuous production of citric acid by fermentation | |
| EP1363992A1 (en) | Method for increasing the intracellular glutamate concentration in yeast | |
| Liu et al. | Improvement of glycerol production by Candida krusei in batch and continuous cultures using corn steep liquor | |
| KR0177321B1 (ko) | 재조합 효모로부터 인간 알파 인터페론의 대량 생산 방법 | |
| CN116286584A (zh) | 一种耐高渗透压菌种筛选方法及在谷氨酸发酵中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20211116 |