CN101270339A - 分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法，其特征在于采用无机盐培养基对重组甲醇营养型酵母进行发酵培养，发酵培养包括酵母菌的生长期和蛋白酶的分泌表达期，在蛋白酶的分泌表达期内根据发酵液溶氧值变化实时控制甲醇的流加补料，用氨水调节发酵液pH值，从而实现蛋白酶的高效表达。与现有技术相比，本发明具有培养成本低廉、反应控制方式简便准确、蛋白酶表达活性高的特点。

Description

分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法

技术领域：

本发明涉及一种分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法。

背景技术：

低聚甘露糖和低聚木糖因其双歧因子效果好而被认为是功能低聚糖中的高端产品。木聚糖酶和甘露聚糖酶是规模化生产这两种低聚糖所必须的生物酶。

为获得高活性的木聚糖酶和甘露聚糖酶，人们尝试了多种方式，特别是应用基因工程手段，获得各种重组菌株，来表达分泌酶蛋白。公开的文献报道中，应用较多的是芽孢杆菌。近年来，有人采用毕赤酵母菌(P.pastoris)表达甘露聚糖酶和木聚糖酶。如文献1应用重组菌P.pastoris GS115-Atx制备木聚糖酶，认为以麸皮、牛肉膏等组成的有机培养基在甲醇诱导并补加0.5％甘油，可以获得最佳效果。文献2、3报道了甘露聚糖酶基因克隆在毕赤酵母中的分泌表达。

众所周知，毕赤酵母(P.pastoris)属于甲醇营养型酵母菌，能以甲醇为碳源生长，且表达异源基因效率高，既具有原核表达系统操作简单、表达高效、易于调控等特点，还具有真核细胞特有的蛋白质修饰功能，在表达真核生物蛋白质方面具有独特优越性，近年来受到广泛的关注。利用这类甲醇营养型酵母菌，特别是引入外源基因的重组甲醇营养型酵母菌，经发酵培养，可以获得多种蛋白酶及多肽的分泌表达，如文献1～6所述的木聚糖酶、α-淀粉酶、藻蓝蛋白、重组人白介素11、重组肠激酶、植酸酶等。

高密度发酵是提高发酵产品、产量的一个非常有效的手段。为提高蛋白酶的分泌表达量和提高蛋白酶活性，人们尝试了多种方式，包括培养基的选择、发酵工艺的改进等。除前述文献外，也有一些酵母菌培养工艺方面的研究报道。如文献4利用甘油做碳源，待酵母菌生长到一定生物量后，再使用甲醇诱导，表达藻蓝蛋白，发酵期间根据甘油浓度、细胞干重、细胞光密度和藻蓝蛋白含量的变化进行调控；文献5在用巴斯德毕赤酵母工程菌Gs115/phyAII发酵制备植酸酶，采用了逐渐增加葡萄糖的补加方式来控制溶氧和还原糖浓度；文献6在毕赤酵母表达重组人白介素(rhIL-11)的发酵过程中研究了间歇法、分批补料法和恒甲醇浓度法，认为通过检测甲醇浓度来控制甲醇补料可以使菌浓和rhIL-11表达浓度达到最大；文献7则认为，在植酸酶发酵过程中，甲醇的变速补料方式为最优；文献8用控制甲醇流加体积为终体积分数1.0％～3.0％的方式实现重组肠激酶在甲醇酵母中的高效表达；而文献9在重组人血清白蛋白(rHSA)P.pastori表达系统中，研究了高密度培养时细胞生长、改变碳源和诱导表达时溶氧的变化和调控规律，提出高密度培养时应通过流加底物速度、搅拌转速、通气量和富氧培养来关联控制发酵液溶氧水平。

另外，文献10提出了一种重组嗜甲醇酵母(特别是巴斯德毕赤酵母)发酵的改进方法，即在重组嗜甲醇酵母外源基因产物的诱导表达阶段，采用短碳链有机酸替代甘油，流加短碳链有机酸-甲醇混合碳源，以促进菌体的生长和诱导外源基因的表达；文献11针对重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶，提出了采用了价格低廉的碳源、氮源以及变pH发酵技术实现植酸酶的高密度表达，其变pH发酵技术通过在发酵前后的两个阶段改变碳源来实现。

研究表明，重组毕赤酵母的高菌体密度发酵过程一般为二个阶段：菌体生长阶段和蛋白酶分泌表达阶段。在菌体生长阶段，酵母菌利用培养基中的碳源生长，待碳源完全消耗后进入蛋白酶的分泌表达阶段，此时，需要流加诱导碳源以诱导外源基因的表达。对于重组甲醇营养型毕赤酵母来说，甲醇既是诱导剂又是碳源。

然而，在已有的技术中，对于甲醇流加补料的控制方式，或者采用分批定量补加、或者采样检测发酵液内补加料的含量、或者根据菌体浓度通过关联搅拌转速和通气量来调节甲醇的流加速度、富氧培养来关联控制发酵液溶氧水平，并且多采用有机培养基。这些方式，在实际发酵运行中，难以做到实时监控，采样和工艺调整之间存在较长时间的延迟，且操作烦琐、运行成本也比较高，难以发挥达到发酵工艺的最佳效果。

而对于木聚糖酶或甘露聚糖酶的低成本高效分泌表达，目前尚缺少相应的技术。

参考文献：

1刘明启，等，重组毕赤酵母产木聚糖酶条件的优化[J]，浙江大学学报(农业与生命科学版)，2006，02

2韦跃华，等，里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达，生物工程学报，2005，11

3谭秀华，等，耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达，微生物学报，2005，8

4励建荣，等，重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究[J]，中国食品学报，2006，05

5叶冰，等，植酸酶毕赤酵母基因工程菌高密度发酵[J]，大连轻工业学院学报，2002，03

6孙瑛，等，甲醇诱导模式对重组人白介素11发酵的影响[J]，生物技术，2006，05

7李洪淼，等，重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达植酸酶[J]，中国生物工程杂志，2005，S1

8谈宁馨，等，重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的培养条件研究[J]，兰州大学学报(自然科学版)，2003，04

9周长林，等，重组Pichia pastori高密度培养和表达过程的溶氧调控[J]，药物生物技术，2006，01

10ZL 03116034.4，一种重组嗜甲醇酵母的发酵方法

发明内容：

本发明基于前述事实，提出了一种分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法，用于重组甲醇营养型毕赤酵母菌发酵制备蛋白酶，特别是甘露聚糖酶和木聚糖酶。

本发明的技术方案是这样实现的：酵母菌的发酵培养基采用无机盐培养基，其中包含有如下离子：Cu²⁺、Na⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co³⁺、K⁺、Ca²⁺、I^-、CL^-、H⁺，和如下基团：SO₄ ^2-、MO₄ ^-、BO₃ ^3-、OH^-、NH₃ ^-、HPO₃ ^2-、H₂PO^3-、PO₃ ^3-，以及葡萄糖、甘油、甲醇和氨水。发酵培养包括酵母菌的生长期和蛋白酶的分泌表达期，两个期分别使用不同的碳源，生长期以葡萄糖或者甘油为碳源，以氨水为氮源，分泌表达期使用甲醇为碳源。在分泌表达期内，根据发酵液溶氧值变化实时控制甲醇的流加补料，当溶氧值升高时流加甲醇，当溶氧值降低时停上流加甲醇，同时用氨水调节发酵液pH值，可以使控制方式简便、准确、即时，从而实现蛋白酶的高效表达。

本发明的优化技术方案是这样的：毕赤酵母菌优化的发酵培养基是基于如下成分与含量：1L发酵液中主要含有硫酸镁1.0～10.0g、硫酸钙0.1～1.0g、硫酸氨1.0～10.0g、硫酸亚铁0.02～0.20g、氢氧化钾2.0～20.0g、磷酸3～30mL、葡萄糖/甘油3.0～30.0g，和硫酸铜0.05～0.50mg、碘化钠0.08～0.80mg、钼酸钠0.15～1.50mg、硫酸锰2.0～20.0mg、氯化钴0.5～5.0mg、硼酸0.02～0.20mg、硫酸锌5.0～50.0mg，浓硫酸0.01～0.05mL、生物素0.2～2.0mg、氨苄青霉素5.0～50.0mg，以及甲醇和氨水。其中，氨水用来调节发酵过程中pH值，甲醇用于分泌表达期的流加补料，流加补料的方式是通过发酵液溶氧值变化来进行实时控制，当溶氧值升高至60％以上时开始流加甲醇，当溶氧值降低至10％以下时停止流加甲醇，此间，搅拌转速、通气量等其它相关的发酵参数不随之做实时调整。在发酵结束前，先停止甲醇流加，并在溶氧值100％的情况下维持2～4h，再结束发酵。

本发明具体操作步骤如下：

(1)菌种培养，配制发酵培养基，接种前准备，接种。

菌种培养过程如下：从YPD上挑2～3个菌落到BMGY的一级种子培养基中培养12～24h，菌体OD₆₀₀达到1.0，得到培养液；再取上述培养液到二级种子培养基BMGY中培养12～24h，菌体OD₆₀₀达到7.0，即得到上罐种子液。

配制发酵培养基过程如下：以1L发酵液计算，先称取微量无机盐成分，包括硫酸铜0.05～0.50mg、碘化钠0.08～0.80mg、钢酸钠0.15～1.50mg、硫酸锰2.0～20.0mg、氯化钴0.5～5.0mg、硼酸0.02～0.20mg、硫酸锌5.0～50.0mg，加水溶解后配至100～200mL后加入浓硫酸0.01～0.05mL；再称取主要无机盐成分，包括硫酸镁1.0～10.0g、硫酸钙0.1～1.0g、硫酸氨1.0～10.0g、硫酸亚铁0.02～0.20g、氢氧化钾2.0～20.0g，加水溶解后配至500～600mL后加入磷酸3～30mL；上述两组成分配制液混合后，加入葡萄糖/甘油3.0～30.0g、生物素0.2～2.0mg、氨苄青霉素5.0～50.0mg，加水配至950mL，121℃灭菌20min，冷却待用。

接种前的准备包括：发酵罐系统及相关器械灭菌，连接好消泡剂和待流加的氨水、甲醇，进行pH、溶氧电极校正。校正溶氧值为100％时，搅拌转速、空气流量及罐压均取发酵过程中的最大值参数值。

在火焰圈保护下，接种上罐种子液，接种量为3～10％，控制pH6.0±0.05，调节发酵工艺参数为预定值。

(2)生长期：以葡萄糖或者甘油做为碳源，一次性加入，按照预先设定的条件调整搅拌转速和通气量，培养12～24h。此时，发酵液溶氧值上升至80％以上，直至达到100％，菌浓达到8％(W/V)以上。

(3)分泌表达期：开始流加甲醇，用溶氧值进行实时调控，当发酵液溶氧值低于10％时，停止流加甲醇；当溶氧值回升至60％以上时，开始流加甲醇。如此反复。此间，搅拌转速和通气量等发酵参数可以按照事先的预定和发酵的实际情况进行调整，不随溶氧值调控甲醇流加而变化。

(4)发酵过程中，用氨水调控发酵液pH值，控制为pH5.8～6.0，使用消泡剂对发酵液进行消泡。

(5)下罐：发酵结束前，先停止甲醇流加，在溶氧值100％的情况下维持2～4h，再结束发酵。发酵液用通用的方法分离出菌体后，用常规的纯化方法，即可得到含有目的产物--蛋白酶液。

与现有技术相比，本发明具有培养成本低廉、反应控制方式简便准确、蛋白酶表达活性高的特点。

具体实施例：

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。实施例的具体描述，对本发明的范围不构成任何限制。

实施例1毕赤酵母发酵制备甘露聚糖酶

所用的菌株为P.pastoris GS115/poly-man-B3，由广州伯凯生物技术有限公司构建。

从YPD上挑2-3个菌落到BMGY的一级种子培养基(300mL三角瓶装30mL)中培养16h左右，菌体OD₆₀₀达到1.0，再取2mL上述培养液到BMGY的二级种子培养基(10只500mL三角瓶装50mL)中培养16h，菌体0D₆₀₀达到7.0。

以1L发酵液计算，先称取微量无机盐成分，包括硫酸铜0.08mg、碘化钠0.12mg、钼酸钠0.45mg、硫酸锰8.0mg、氯化钴1.5mg、硼酸0.08mg、硫酸锌10mg，加水溶解后配至150mL后加入浓硫酸0.05mL；再称取主要无机盐成分，包括硫酸镁6.0g、硫酸钙0.6g、硫酸氨4.0g、硫酸亚铁0.10g、氢氧化钾8.0g，加水溶解后配至600mL后加入磷酸10mL；上述两组成分配制液混合后，加入葡萄糖12.0g、生物素0.8mg、氨苄青霉素10.0mg，加水配至950mL，121℃灭菌20min，冷却待用。

装好pH、溶氧及消泡电极，将上述培养基倒入发酵罐中，121℃下灭菌20min，连接好消泡剂和待流加的氨水、甲醇，进行溶氧电极校正。校正溶氧值为100％时，搅拌转速、空气流量及罐压均取发酵过程中的最大值参数值。

在火焰圈保护下，接种上罐种子液，接种量为3～5％，控制pH6.0±0.05，调节发酵工艺参数为预定值：通风量3L/min，搅拌转速330r/min、罐压0.4个大气压、培养温度30℃。

菌体经过一段时间适应期后进入对数生长期，此间，菌体以葡萄糖做为碳源，发酵液pH用流加氨水来自动调控在6.0±0.05，使用消泡剂对发酵液进行消泡。培养18～24h，此时，发酵液溶氧值上升至80％以上，直至达到100％，菌浓达到8％(W/V)以上。

此时，开始流加甲醇，用溶氧值进行实时调控，设定调控范围为：当发酵液溶氧值低于10％时，停止流加甲醇；当溶氧值回升至60％以上时，开始流加甲醇。如此反复。此间，搅拌转速、通气量、温度及罐压按照事先的预定和发酵的实际情况进行调整，不随溶氧值调控甲醇流加而变化，发酵液pH值用氨水自动调控在6.0±0.05。

发酵进行96～120h后，可以结束。结束前，先停止甲醇流加，在溶氧值100％的情况下维持2h，再结束发酵。

下罐后的发酵液分离出菌体，检测清液中的甘露聚糖酶活性，酶活达到18000U/mL。

每分钟生成1μmoL D-甘露糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。

实施例2毕赤酵母发酵制备木聚糖酶

所用的菌株为P.pastoris GS115/poly-xyl-B5，由广州伯凯生物技术有限公司构建。

用BMGY的培养基完成种子培养后，按照3～5％的接种量接种发酵罐。发酵培养基同前。灭菌，连接好消泡剂和待流加的氨水、甲醇，进行溶氧电极校正。在3L/min，330r/min、30℃下发酵。生长期内，菌体以葡萄糖做为碳源。培养18～24h后，发酵液溶氧值上升至80％以上，此时，开始流加甲醇，用溶氧值进行实时调控，设定调控范围为：当发酵液溶氧值低于10％时，停止流加甲醇；当溶氧值回升至60％以上时，开始流加甲醇。发酵液pH值用氨水自动调控在6.0±0.05。发酵进行96h后，先停止甲醇流加，在溶氧值100％的情况下维持2h，再下罐，分离出菌体后，检测清液中的木聚糖酶活性，酶活达到12000U/mL。每分钟生成1μmoL木糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。

Claims (9)

1. 一种分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法：其特征在于采用无机盐培养基对甲醇营养型酵母进行发酵培养，发酵培养包括酵母菌的生长期和蛋白酶的分泌表达期，在蛋白酶的分泌表达期内根据发酵液溶氧值变化实时控制甲醇的流加补料，用氨水调节发酵液pH值，从而实现白酶的高效表达。

2. 如权利要求1所述，其特征在于所述无机盐培养基中包含有如下离子：Cu²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co³⁺、K⁺、Ca²⁺、I^-、CL^-、H⁺，和如下基团：SO₄ ^2-、MO₄ ^-、BO₃ ^3-、OH^-、NH₃ ⁺、HPO₃ ^2-、H₂PO₃ ^-、PO₃ ^3-，以及葡萄糖、甘油、甲醇和氨水。

3. 如权利要求1所述，其特征在于所述的发酵培养的两个期使用不同的碳源，酵母菌的生长期使用的碳源是葡萄糖或者甘油或者是两种的混合物，蛋白酶的分泌表达期使用的碳源是甲醇。

4. 如权利要求1所述，其特征在于所述的甲醇流加补料方式是根据发酵液溶氧值变化来进行实时控制，当溶氧值升高时流加甲醇，当溶氧值降低时停止流加甲醇。

5. 如权利要求1和2所述，其特征在于所述的无机盐培养基以氨水为氮源、并以氨水来调节发酵液的pH值，以葡萄糖、甘油和甲醇为碳源。

6. 如权利要求1和2所述，其特征在于所述的优化的培养基是基于如下成分与含量：1L发酵液中主要含有硫酸镁1.0～10.0g、硫酸钙0.1～1.0g、硫酸氨1.0～10.0g、硫酸亚铁0.02～0.20g、氢氧化钾2.0～20.0g、磷酸3～30mL、葡萄糖/甘油3.0～30.0g，和硫酸铜0.05～0.50mg、碘化钠0.08～0.80mg、钼酸钠0.15～1.50mg、硫酸锰2.0～20.0mg、氯化钴0.5～5.0mg、硼酸0.02～0.20mg、硫酸锌5.0～50.0mg，浓硫酸0.01～0.05mL、生物素0.2～2.0mg、氨苄青霉素5.0～50.0mg，以及甲醇和氨水。

7. 如权利要求1和4所述，其特征在于所述的甲醇流加补料方式是根据发酵液溶氧值变化来进行实时控制，当溶氧值升高至60％以上时开始流加甲醇，当溶氧值降低至10％以下时停止流加甲醇。

8. 如权利要求1，其特征在于所述的优化的甲醇营养型酵母菌为毕赤酵母菌，可以是野生型的，也可以是重组型的。

9. 如权利要求1，其特征在于所述的培养方法，可以用于蛋白酶的分泌表达，特别是木聚糖酶和甘露聚糖酶的分泌表达。