CN104388484A - 一种以挥发性脂肪酸为原料发酵生产微生物油脂的方法 - Google Patents

一种以挥发性脂肪酸为原料发酵生产微生物油脂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种以挥发性脂肪酸为原料发酵生产微生物油脂的方法，属于发酵技术领域。本发明以挥发性脂肪酸(VFAs)为原料，利用微生物通过pH耦合流加发酵的方式获得微生物油脂。本发明方法获得的油脂产量和生物量均高，微生物油脂进而可转化为生物柴油，能够有效降低微生物油脂生产的原料成本，易实现规模化生产，可用于废水处理以及甲烷和生物柴油联产，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

一种以挥发性脂肪酸为原料发酵生产微生物油脂的方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体地，涉及一种以挥发性脂肪酸为原料发酵生产微生物油脂的方法。
背景技术
环境污染以及能源匮乏带来的资源危机促使人们加快了寻找石油替代品的脚步。生物柴油是一种绿色可再生资源，生物柴油是新能源的一种，它燃烧性能好，含硫量低，可代替化石燃料，是一种可再生的绿色新能源。生物柴油用于发动机中可大大减少温室气体、粉尘颗粒、多环芳香烃以及硫氧化物的排放，因此近年来引起了人们极大的关注。
目前制备生物柴油的原料主要包括动植物油脂和废油。由于我国人口众多且耕地面积有限,以动植物油脂为原料生产生物柴油会加重食品油市场的供需矛盾；废油存在着成分复杂，质量参差不齐，尚不具备健全的收集系统等问题，因此也不是生物柴油制备的理想油脂原料。
微生物油脂，即单细胞油脂(SCOs),是产油微生物利用碳源、氮源及一些无机盐在胞内合成的油脂，其组成成分以亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸等和C18及C16系脂肪酸为主，与一般植物油相近。利用微生物生产油脂具有周期短、可连续生产、可规模化利用自然界丰富的碳水化合物资源等突出优势。近来人们意识到通过微生物生产油脂及相关脂肪酸代谢衍生物，对生物柴油产业可持续发展和生物质资源利用具有重要意义。
利用微生物进行油脂的生产可通过真菌、藻类和细菌等微生物经发酵过程而实现。目前，关于微生物油脂的研究较多，但微生物油脂并未实现工业化，成本高是微生物油脂生产的制约因素之一。想要大幅度地降低生产成本，必须开发能够作为产油微生物碳源的廉价原料。
挥发性脂肪酸(VFAs)产生于生活、工业废水中的碳水化合物、蛋白质和脂肪的有氧生物降解,它们也是有机物质厌氧生物降解的主要中间降解产物。农作物秸秆及农产品加工剩余物、畜禽养殖剩余物、城市生活垃圾和生活污水、工业有机废弃物和高浓度有机废水等是微生物厌氧发酵产沼气、氢气的主要原料。但在厌氧消化处理过程中,挥发性脂肪酸的积累导致不平衡的微生物菌群的出现而对厌氧过程的运行不利,甚至导致系统的运行失败。若能将此发酵过程中产生的挥发性脂肪酸进一步作能源化、资源化利用，不仅能够使废弃物中的挥发性脂肪酸得到有效利用，还将对工农业垃圾的循环再利用起到一定的推动作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产微生物油脂的方法，以解决现有技术微生物油脂生产成本高、效率低等问题。
本发明提供一种生产微生物油脂的方法，是以挥发性脂肪酸为原料，通过pH耦合流加的方式发酵生产微生物油脂。
具体地，本发明方法包括如下步骤：
(1)将可产生油脂的微生物扩大培养后，接种发酵培养基，所述发酵培养基初始底物含有水溶性的挥发性脂肪酸盐；
(2)发酵过程中以补加料液与pH变化耦合流加的方式进行流加，流加速率随pH变化自动调节，所述料液为挥发性脂肪酸和硫酸铵或挥发性脂肪酸和硝酸钾的混合溶液；
(3)发酵结束后离心菌体，提取微生物油脂。
本发明方法中，所述挥发性脂肪酸选自碳原子数8以下的挥发性脂肪酸。
优选地，所述挥发性脂肪酸选自碳原子数4以下的挥发性脂肪酸。
优选地，所述挥发性脂肪酸选自甲酸、乙酸、丙酸、丁酸。
本发明方法中，所述可产生油脂的微生物选自粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、斯达凯依酵母(Lipomycesstarkeyi)或拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)。
本发明方法中，是将上述可产生油脂的微生物接入种子培养基，25℃-35℃摇瓶培养24－30h，摇床转速150-250r/min，pH5.0-7.0条件下进行扩大培养的。
其中，步骤(1)中将扩大培养后的微生物按照体积比5％-10％接种发酵培养基。优选体积比为10％。
步骤(1)发酵培养基的配方为：挥发性脂肪酸钠盐或钾盐5-30g/L，KNO3 3.8g/L；酵母粉4g/L；KH2PO4 6g/L；Na2HPO4 2g/L；MgSO42g/L；pH6.5-7.5。所述挥发性脂肪酸钠盐优选为甲酸钠、乙酸钠、丙酸钠或丁酸钠；所述挥发性脂肪酸钾盐优选为甲酸钾、乙酸钾、丙酸钾或丁酸钾。
步骤(2)的发酵培养温度为25-35℃，通气量为0.5-2vvm,溶氧控制10％-30％，pH6.5－7.5。
优选地，步骤(2)的发酵培养温度为35℃，通气量为2vvm,溶氧控制20％，pH 7.3。
步骤(2)流加补料时，挥发性脂肪酸的浓度为30-300g/L，硫酸铵的浓度为0.5-5g/L，硝酸钾的浓度为0.5-5g/L。
优选地，流加补料时，挥发性脂肪酸的浓度为300g/L，硫酸铵的浓度为1g/L，硝酸钾的浓度为2g/L。
本发明方法中，流加补料过程中保持发酵液的pH6.5－7.5。
本发明方法的步骤(3)是发酵120-240h后，发酵结束，4℃下，8000-10000r/min离心菌体，提取微生物油脂。
本发明提供一种利用挥发性脂肪酸为原料发酵高产微生物油脂的方法。产油微生物利用甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸(VFAs)为原料转化为微生物油脂，通过挥发性脂肪酸、氮源和pH耦合流加发酵的方式，可在细胞生长的同时即时补加氮源和碳源，以获得较高的生物量和油脂产量，生物量最高可达39.9g/L，油脂产量最高可达18.4g/L，油脂含量最高为59.1％。其中，本发明创造性地应用pH耦合流加发酵的方式是将流加料液直接作为pH调控的料液，这样，随着pH变化，自动调控流加速率。由于微生物油脂是微生物细胞内产物，在发酵过程中细胞生长伴随着酸性物质或碱性物质的产生，因此pH会随着菌体生长而变化。在本发明技术中采用pH耦合流加的方式可使碳源和氮源伴随着微生物的生长得到即时的补充，从而获得较高的生物量和油脂产量；另一方面，流加速率随pH变化自动调节，也简化了调控方式和操作过程，易于实现大规模生产。由于挥发性脂肪酸产生于生活、工业废水中的碳水化合物、蛋白质和脂肪的有氧生物降解，因此本发明方法易实现规模化生产，能够变废为宝，有效降低微生物油脂生产的原料成本，为微生物油脂的制备提供了一条新的原料途径，还可用于废水处理以及甲烷和生物柴油联产。本发明方法获得的微生物油脂可转化为生物柴油，具有较高的经济价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1.菌种：粘红酵母(Rhodotorula Glutinis)，购自中国科学研究院微生物研究所。
2.培养基：
(1)种子培养基
葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH5.5。
(2)发酵培养基：乙酸钠30g/L；KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH7.3。
3.发酵方式：用接种环取一环保藏于4℃斜面培养基的粘红酵母于种子培养基中，种子培养采用有氧培养，500mL摇瓶装液量50mL。培养温度30℃，摇床转速250rpm，种子培养28h。将种子液以10％接种量接入5L发酵罐发酵。发酵罐装液量3L。培养温度35℃，通气量2.0vvm，溶氧控制20％。发酵过程中流加300g/L乙酸和2g/L硝酸钾的混合溶液，同时用该溶液调节pH，使pH维持在7.3。
4.发酵结果：156h发酵完后，其生物量达到31.1g/L，油脂产量达到18.4g/L，油脂含量为59.1％。
实施例2
1.菌种：解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)，购自中国科学研究院微生物研究所。
2.培养基：
(1)固体斜面培养基
酵母粉：10g/L；蛋白胨：20g/L；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L；pH5。
(2)种子培养基
葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH6.0。
(3)发酵培养基
乙酸钠:27.3g/L；KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH7.0。
3.发酵方式：
用接种环取一环保藏于4℃斜面培养基的解脂亚罗酵母于种子培养基中，种子培养采用有氧培养，500mL摇瓶装液量50mL。培养温度25℃，摇床转速150rpm，种子培养30h。将种子液以5％接种量接入5L发酵罐发酵。发酵罐装液量3L。培养温度28℃，通气量2vvm，溶氧控制30％。发酵过程中流加200g/L乙酸和2g/L硫酸铵的混合溶液，同时调节pH，使pH维持在7.0。
4.发酵结果：184h发酵结束，其生物量达到39.9g/L，油脂产量达到14.8g/L，油脂含量为37％。
实施例3
1.菌种：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，购自中国科学研究院微生物研究所。
2.培养基：
(1)固体斜面培养基
酵母粉：10g/L；蛋白胨：20g/L；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L；pH5.0。
(2)种子培养基
葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH5.0。
(3)发酵培养基
丙酸钠:20g/L；KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH7.5。
3.发酵方式：
用接种环取一环保藏于4℃斜面培养基的圆红冬孢酵母于种子培养基中，种子培养采用有氧培养，500mL摇瓶装液量50mL。培养温度35℃，摇床转速200rpm，种子培养24h。将种子液以5％接种量接入5L发酵罐发酵。发酵罐装液量3L。培养温度25℃，通气量0.5vvm，溶氧控制15％。发酵过程中流加100g/L丙酸和4g/L硫酸铵的混合溶液，并利用该混合溶液调节pH，使pH维持在7.5。
4.发酵结果：192h发酵完后，其生物量达到33.8g/L，油脂产量达到10.7g/L，油脂含量为31.6％。
实施例4
1.菌种：粘红酵母，购自中国科学研究院微生物研究所。
2.培养基：
(1)固体斜面培养基
酵母粉：10g/L；蛋白胨：20g/L；葡萄糖：20g/L；琼脂：20g/L；pH5.0。
(2)种子培养基
葡萄糖：15g/L；(NH4)2SO4：2g/L；酵母粉：1g/L；KH2PO4：7g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：1.5g/L；pH5.5。
(3)发酵培养基
丁酸钠:5g/L；KNO3：3.8g/L；酵母粉：4g/L；KH2PO4：6g/L；Na2HPO4：2g/L；MgSO4：2g/L；pH6.5。
3.发酵方式：
用接种环取一环保藏于4℃斜面培养基的粘红酵母于种子培养基中，种子培养采用有氧培养，500mL摇瓶装液量50mL。培养温度28℃，摇床转速200rpm，种子培养28h。将种子液以10％接种量接入5L发酵罐发酵。发酵罐装液量3L。培养温度28℃，通气量1.0vvm，溶氧控制20％。发酵过程中流加30g/L丁酸和5g/L硝酸钾的混合溶液，并利用该混合溶液调节pH，使pH维持在6.5。
4.发酵结果：
198h发酵完后，其生物量达到18.5g/L，油脂产量达到4.0g/L，油脂含量为20.6％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种生产微生物油脂的方法，其特征在于，以挥发性脂肪酸为原料通过pH耦合流加的方式发酵生产微生物油脂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将可产生油脂的微生物扩大培养后，接种发酵培养基，所述发酵培养基初始底物含有水溶性挥发性脂肪酸盐；
(2)发酵过程中以补加料液与pH变化耦合流加的方式进行流加，流加速率随pH变化自动调节；所述料液为挥发性脂肪酸和硫酸铵或挥发性脂肪酸和硝酸钾的混合溶液；
(3)发酵结束后离心菌体，提取微生物油脂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述挥发性脂肪酸选自碳原子数8以下的挥发性脂肪酸。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述可产生油脂的微生物选自粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、斯达凯依酵母(Lipomycesstarkeyi)或拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将扩大培养后的微生物按照体积比5％-10％接种发酵培养基。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养基的配方为：挥发性脂肪酸的钠盐或钾盐5-30g/L，KNO33.8g/L；酵母粉4g/L；KH2PO46g/L；Na2HPO42g/L；MgSO42g/L；pH6.5-7.5。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的发酵培养温度为25-35℃，通气量为0.5-2vvm,溶氧控制10％-30％，pH6.5－7.5。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的发酵培养温度为35℃，通气量为2vvm,溶氧控制20％，pH7.3。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)流加补料时，挥发性脂肪酸的浓度为30-300g/L，硫酸铵的浓度为0.5-5g/L，硝酸钾的浓度为0.5-5g/L。
10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵120-240h后，发酵结束，4℃下，8000-10000r/min离心菌体，提取微生物油脂。
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