CN114574377A - 一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用，属于基因工程领域。以Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2‑1C为底盘细胞，在过表达腺苷蛋氨酸合酶的基础上，通过代谢通路改造，提高胞内L‑Met供给，促进SAM生产，构建一株产SAM的酿酒酵母工程菌，并对其进行培养基优化，进一步提高其SAM生产水平，最终SAM产量达到1465.4mg/L，具有重要的工业应用前景。

Description

一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用，具体涉及整合过表达酿酒酵母来源的sam2、met6、str2基因和培养基优化，属于基因工程领域。
背景技术
腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)属于体内生理活性分子，在许多生物甲基化中提供甲基，而且是多胺亚精胺和精胺、金属离子螯合化合物烟胺合成前体，在医疗方面具有重要作用。SAM在生物体中以L-蛋氨酸(L-Met)和ATP为直接前体，由腺苷蛋氨酸合酶催化生成。工业大量生产SAM主要是发酵法，因为发酵法相较于其它生产方法，生产成本低，生产过程简单。
酿酒酵母是理想的底盘细胞，因其具有充满带负电的聚磷酸盐的液泡，能够富集带正电的SAM，是目前用于工业生产的常用宿主。L-Met是SAM合成的重要前体，L-Met在胞内的积累量将直接影响SAM的生产，目前工业生产最常用的手段是在发酵培养基中添加L-Met。但是，发酵培养基中过量的L-Met抑制酵母生长，培养基中L-Met超过1％会明显抑制产量。代谢通路改造的方式来提高胞内L-Met的积累，能减少外源添加L-Met对菌株的影响，具有重大应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是通过代谢通路改造，构建高产SAM的酿酒酵母菌株，并对其进行培养基优化，进一步提高其SAM生产水平。
本发明的第一个目的是提供一种高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2。
本发明的另一个目的是提供一种高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，同时过表达腺苷蛋氨酸基因sam2和酶蛋氨酸合酶基因met6。
本发明的另一个目的是提供一种高产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，同时过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2、蛋氨酸合酶基因met6和胱硫醚-γ-合酶基因str2。
在一种实施例中，sam2、met6、str2基因均来源于酿酒酵母。
本发明的另一个目的是提供一种发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，将所述酿酒酵母工程菌接种至发酵培养基中，通过调整碳源和硫源优化发酵过程。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中葡萄糖浓度为50-110g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基中Na2S2O3浓度为0-1g/L。
在一种实施方式中，所述发酵培养基含有：葡萄糖90g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， KH2PO4 4g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Na2S2O3 1g/L，L-Met 1.5g/L。
本发明还要求保护所述酵母工程菌及发酵方法在医疗行业制备肝脏疾病、骨关节炎或神经疾病等药物方面的应用。
有益效果：
本发明首次通过共表达sam2、met6、str2基因，通过提高胞内L-Met的积累，促进SAM 产量提高，所得重组酿酒酵母菌株在发酵24h后L-Met积累量820.0mg/L，SAM产量为1070.8mg/L，比酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 2-1C)C0提高9.83倍，生产强度达到44.6mg/L/h，比酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 2-1C)C0显著提高。
本发明通过发酵培养基优化，使上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK 2-1C) 工程菌胞内L-Met的积累量为1155.1mg/L，SAM产量达到1465.4mg/L,生产强度为61.0 mg/L/h，与优化之前相比，分别提高了40.8％，36.8％和36.7％。
附图说明
图1为菌株C0、C1、C2的发酵特性；
图2为菌株C0、C3、C4的发酵特性；
图3为菌株C0、C2、C6的发酵特性；
图4为菌株C7在不同浓度葡萄糖和Na2S2O3条件下的SAM和L-Met产量；
图5为菌株C6、C7发酵过程中的菌浓(A)、SAM和L-Met产量(B)以及葡萄糖消耗情况。
具体实施方式
YPD培养基：蛋白胨20g/L，醇母粉10g/L，葡萄糖20g/L(固体培养基添加20g/L琼脂粉)。
LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
HPLC分析腺苷蛋氨酸产量：色谱柱为Hypercil GOLDTM aQ C18(4.6mm×250mm)，流动相为：0.01mol·L-1甲酸铵和3％(v/v)的甲醇水溶液，用甲酸调节pH为3.0，流速1.0mL·min-1，检测波长254nm，进样量为10μL。采用外标法，根据不同浓度的SAM标准品所对应峰面积所作标准曲线定量样品SAM的含量。
HPLC分析L-蛋氨酸产量：色谱柱为Hypercil GOLDTM aQ C18(4.6mm×250mm)，流动相为：10％(v/v)的甲醇水溶液，流速1.0mL·min-1，检测波长210nm，进样量为10μL。采用外标法，根据不同浓度的L-Met标准品所对应峰面积所作标准曲线定量样品L-Met的含量。
生物量检测：取适量检测点的样品稀释至OD600值为0.2-0.8，于600nm处测取吸光度。
葡萄糖检测：离心后的上清液稀释50倍，使用西尔曼生物传感器测葡萄糖含量。
实施例1构建含腺苷蛋氨酸合酶、蛋氨酸合酶、胱硫醚-γ-合酶的重组质粒
一、重组表达载体的构建
(1)酿酒酵母来源腺苷蛋氨酸合酶基因表达质粒的构建
以sam2F和sam2R为引物，扩增出基因组上的sam2片段，采用BamHI和HindIII双酶切pRS306质粒和扩增片段sam2，采用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，获得pRS306-sam2。
(2)酿酒酵母来源蛋氨酸合酶基因表达质粒的构建
以met6F和met6R为引物扩增得到met6片段，采用SalI酶切线性化pRS305质粒，后采用诺唯赞C112单片段同源重组连接试剂盒获得pRS305-met6。
(3)酿酒酵母来源胱硫醚-γ-合酶基因表达质粒的构建
以str2F和str2R为引物扩增得到str2片段，采用SalI酶切线性化pRS305质粒，后采用诺唯赞C112单片段同源重组连接试剂盒获得pRS305-str2。以Tstr2CF和Tstr2CR为引物扩增得到str2表达框，以引物305F和305R反向PCR线性化pRS305-met6，后采用诺唯赞C112 单片段同源重组连接试剂盒获得pRS305-met6str2。
(4)引物设计如表1，序列自上而下分别命名为SEQIDNO.1-16。
表1质粒构建所用引物
Figure RE-GDA0003577280320000031
Figure RE-GDA0003577280320000041
(5)PCR反应体系为：引物各1μL，模板1μL，2×PrimeStar 25μL、ddH2O 22μL。反应条件为预变性：95℃，3min；变性：95℃，30s；退火：视引物Tm值而定，30s；延伸： 72℃，视基因长度而定，34个循环，72℃，5min。PCR反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用胶回收试剂盒进行产物回收纯化。
(6)酶切体系及条件如表2所示，反应结束将产物进行电泳验证回收。
表2酶切反应体系与反应条件
Figure RE-GDA0003577280320000042
(7)大肠转化条件：将同源重组产物转化至E.coli JM109感受态细胞中，涂布带有Amp 抗生素的LB固体培养基，于恒温箱倒置培养8-12h长出转化子。挑取转化子，采用yz1和yz2引物进行菌落PCR验证。将菌落PCR验证阳性的转化子挑取至含Amp抗性的LB培养基中培养8-12h，提取质粒后进一步进行测序验证。
实施例2在酿酒酵母中过表达sam2
将pRS306、pRS306-sam2质粒线性化后转化至酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae CEN.PK 2-1C)C0中，将其命名为C1、C2。对C0、C1、C2在发酵培养基中进行摇瓶发酵，结果如图1所示。从菌株生长来看，C1、C2在24h进入稳定期，C0在36h进入稳定期；同时，葡萄糖也随着进入稳定期消耗殆尽。工程菌C1、C2的最高生物量是C0的2.71、2.53倍，可能的原因是质粒的整合弥补了C0尿嘧啶缺陷的影响。工程菌C2在发酵24h后SAM产量达到623.9mg/L，相较于C0的产量108.9mg/L提高了5.72倍，此时，C2工程菌株SAM的生产强度达到25.9mg/L/h。
实施例3在酿酒酵母中单独过表达met6及同时过表达sam2 met6
(1)在酿酒酵母中单独过表达met6
本文将pRS305、pRS305-met6质粒线性化后转化至C0中，将其命名为C3、C4。对C3、C4在发酵培养基中进行摇瓶发酵，结果如图2所示。从菌株生长来看，C3、C4在36h进入稳定期。工程菌C3、C4的生物量与C0相差不大，met6基因的过表达对菌株生长没有造成负担。工程菌C4在发酵24h后SAM产量为102.9mg/L，相较于C0并无明显变化。C4的 L-Met胞内含量明显高于C0，提高22.7％。
(2)在酿酒酵母中同时过表达sam2和met6
将pRS305、pRS305-met6质粒线性化后转化至C2中，将其命名为C5、C6。在发酵培养基中对C5、C6进行摇瓶发酵，结果如图3所示。C5、C6在24h进入稳定期，同时，葡萄也随着进入稳定期消耗殆尽，且sam2和met6基因的共表达并未对菌株造成代谢压力，菌株生长状态未见明显影响。工程菌C6在发酵24h后SAM产量为837.2mg/L，与单独表达sam2 相比提高了34.1％，生产强度为34.8mg/L/h，与单独表达sam2相比提高了34.3％。同时，比较了C2和C6的胞内L-Met积累量，从发酵时间来看，L-Met的最高产量均出现在SAM最高产量之前，随着SAM产量的提高胞内浓度下降，随后维持在一定水平；C6的L-Met的最高浓度528.5mg/L明显高于C2，前者是后者的1.33倍，说明表达met6确实有利于提高胞内 L-Met的浓度，从而提高SAM产量。
实施例4在酿酒酵母中进一步过表达str2
将pRS305-met6str2质粒线性化后转化至C2中，将其命名为C7。对C7在发酵培养基中进行摇瓶发酵，结果如图4所示。从菌株生长来看，C7在24h达到稳定期，葡萄糖随着进入稳定期消耗殆尽，且进一步过表达str2基因对菌株生长未造成明显影响。工程菌C7在发酵24h后SAM产量为1070.8mg/L，生产强度达到44.6mg/L/h，与C6相比，SAM产量提高27.0％，生产强度提高28.1％；与C2相比SAM产量提高了71.6％，生产强度提高72.2％，str2 基因对SAM生产的影响显著。同时，如图4所示，我们发现C7相较于C6，胞内L-Met的积累量明显提高了55.0％，证实了str2在L-Met合成的重要作用，能够大幅提高胞内L-Met 的供给，为SAM的合成提供更多的前体L-Met。
实施例5对酿酒酵母工程菌产腺苷蛋氨酸培养基条件优化
对实施例4中SAM生产水平提高最多的工程菌C7进行进一步发酵条件优化。
(1)碳源对工程菌C7的影响
对葡萄糖的浓度进行了提高，如图5所示，随着葡萄糖浓度的提高，前体L-Met的浓度在不断提高，SAM的产量也随之提高。当葡萄糖浓度90g/L时，发酵24h，SAM产量达到1302.0mg/L，较葡萄糖浓度50g/L时提高了21.5％，此时，L-Met积累量由820.0mg/L提升至1105.1mg/L，说明碳源是SAM合成的限制因素，在对SAM合成途径进行代谢改造之后，应考虑菌株生长对碳源需求的变化。
(2)硫源对工程菌C7的影响
进行了Na2S2O3的添加实验，如图5所示，在Na2S2O3的浓度从0g/L提高到1g/L使， L-Met积累量由1102.6mg/L增加到1155.1mg/L，变化不大，SAM产量达到1465.4mg/L，较不添加时提高了12.5％，生产强度为61.0mg/L/h，说明硫源是影响SAM合成的因素，在合成此类含硫氨基酸时，应充分考虑菌株生长对硫源的需求。当Na2S2O3的添加量超过1g/L时，会使菌株的生长缓慢，发酵周期变长，使生产效率降低。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌及其应用
<130> BAA220042A
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<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caaggcgatt aagttgggta acg 23

Claims (10)

1.一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2。
2.一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于同时过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2和酶蛋氨酸合酶基因met6。
3.一株产腺苷蛋氨酸的酿酒酵母工程菌，其特征在于同时过表达腺苷蛋氨酸合酶基因sam2、蛋氨酸合酶基因met6和胱硫醚-γ-合酶基因str2。
4.权利要求1-3任一所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述腺苷蛋氨酸合酶基因sam2、蛋氨酸合酶基因met6和胱硫醚-γ-合酶基因str2均来源于酿酒酵母。
5.应用权利要求4所述酿酒酵母工程菌发酵生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于将所述酿酒酵母工程菌接种至发酵培养基中，通过调整碳源和硫源优化发酵过程。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为50-110g/L。
7.权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中Na2S2O3的浓度为0-1g/L。
8.权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于所述发酵培养基含有：葡萄糖90g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Na2S2O3 1g/L，L-Met1.5g/L。
9.权利要求1-3任一所述酿酒酵母工程菌应用于制备肝脏疾病、骨关节炎相关药物。
10.权利要求1-3任一所述酿酒酵母工程菌应用于制备神经疾病类药物。
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