KR0128248B1 - 재조합 효모의 개선된 유가식 발효방법 - Google Patents

Abstract

본 밭명은 ADH2/GAODH 프로모터의 조절을 받는 재조합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 효모의 발효에 있어서, 발효 배지내의 포도당 농도가 0이 되는 시점부터 세포의 비성장 속도가 0.13h^-1내지 0.20h^-1범위로 유지되도록, 포도당 첨가속도를 조절하여 재조합 단백질의 발현을 억세시키는 배양 단계와, 배지내의 에탄올 농도가 1% 이하가 되는 시점부터 상기 배양 단계를 발현조건으로 변화시켜 상기 단백질의 발현을 유도하는 발현단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 단백질의 생산성을 높이기 위한 재조합 효모의 유가식 발효 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 효모의 개선된 유가식 발효방법

제1도는 배지첨가 속도를 일정하게 하면서 유가식 배양에서의 hGH의 발현특성을 관찰한 것이며,

제2도는 포도당의 지수적 첨가로 비성장 속도를 조절했을 때 ADH2 /GAPDH프로모터에 의한 hGH의 발현 특성을 나타내며,

제3도는 포도당의 지수적 첨가로 발현을 억제한 후 발효온도를 낮추고 에탄올을 간헐적으로 첨가 할때의 hGH의 발현 특성을 나타내며,

제4도는 발현시기에 온도를 내리고 에탄올을 일정속도로 첨가했을 때의 hGH의 발현특성을 나타낸 것이다.

본 발명은 재조합 효모를 발효시켜 특정 프로모터의 조절을 받아 발현되는 단백질을 생산 하는데 있어서 그 생산성을 향상시킬 수 있는 발효 방법에 관한 것이며, 구체적으로 ADH2/GAPDH(alcohol dehydrogenase 2/glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로코터에 의해 세포내 발현되는 재조합 단백질을 생산하기 위한 효모의 유가식 발효에서 세포가 고농도로 될 때까지 단백질의 발현을 억제함을 특징으로 하여 재조합 단백질의 생산성을 향상시키는 재조합 효모의 유가식 발효방법에 관한 것이다.

일반적으로 재조합 단백질의 발효에 있어서 ADH2/GAPDH와 같은 발현억제 및 유도가 가능한 프로모터를 사용하는 이유는 단백질 발현이 발효초기부터 시작되면 발현된 재조합 단백질이 세포내에 존재하는 시간이 길어져 생산된 단백질이 분해되거나 세포성장이 둔화되며 플라스미드의 안정성이 떨어져 결과적으로 낮은 생산성을 보이기 때문이다.

그렇기 때문에, 이상적인 발효방법은 세포성장과 단백질 발현의 2단계로 나누어서 초기에는 발현이 되지 않은 상태로 세포 농도만 높이고 후반에 발현 조건을 유지하여 가능한 한 빠른 시간내에 재조합 단백질이 세포내에 최대한 축적되도록 하는 것이다.

ADH2/GAPDH 프로모터의 특성은 배지 중에 포도당이 존재하면 발현이 억제되며 포도당이 고갈되면 발현이 유도된다는 것이다. 이와 같이 배지내 포도당 농도의 조절만으로 발현을 조절할 수 있는 ADH2/GAPDH 프로모터의 발현 억제를 위해서는 포도당 농도가 적정 농도이상으로 유지되도록 계속 첨가해 주어야 한다. 보다 자세히 설명하면, 발효 초기의 배지에 존재하던 포도당이 고갈되어 발현이 시작되기 전에 포도당을 기타 영양 성분과 함께 적당한 속도로 첨가하면 세포성장이 계속되며 이때의 포도당 첨가속도는 배지내 포도당과 부산물인 에탄올이 과량 축적되지 않는 범위에서 적절히 조절해 주어야 한다. 포도당이 과량 첨가될 때 발생하는 부산물인 에탄올이 배지 내에 과량 존재하면 발현이 억제될 뿐 아니라 세포의 활성이 저해되며 포도당의 첨가속도가 너무 느리면 세포 성장이 느려져 생산성이 낮아진다(Hanne and C.Soren Biotechnology and Bioengineering 35, 339-348(1990)). 이 두 조건을 피하더라도 첨가속도가 적정 수준보다 느리게 유지되면 배지내 잔존하는 에탄올이 급격히 소모되며 ADH2/GAPDH 프로모터가 작용하여 단백질의 발현이 나타나며 시간이 지남에 따라 발현된 단백질의 단위세포당 발현율이 떨어지는 현상이 발생된다.

상기 한네 등의 문헌에서는 ADH2/GAPDH 프로모터를 이용하여 인간 프로인슐린을 생산하는데 있어서 발현을 억제하기 위해 2-데옥시클루코스 등의 유사물을 첨가해 본 결과 발현이 억제되는 경우도 있지만 효모의 성장에 장애를 주어 생산성이 없는 것으로 나타났다. 또한 포도당을 일정속도로 첨가하면 포도당이 배지에서 고갈되더라도 첨가되는 포도당에 의해 발현이 부분적으로 억제되어 발현시점이 느려짐을 발견하였고 에탄올의 첨가와 발효온도를 26℃ 내림으로써 좋은 결과를 얻었다. 이들이 제한한 최적의 첨가속도는 1.5g∼포도당/L/hr이며, 그 이하로의 속도에서는 발현이 일찍 시작되며 그 이상에서는 에탄올이 과량 발생하여 세포성장에 장애가 오기 쉽다. 이들의 방법은 발현시기를 어느 정도 늦출 수 있었지만 배지내 포도당이 없고 발현이 억제된 상태를 유지하여 세포농도를 높이는데는 한계가 있었다.

이에 본 발명자들은 포도당 첨가로 높은 세포농도까지 발현을 억제하는 방법을 연구하게 되었고, 세포성장과 비례하여 포도당을 첨가하는 유가식 배양을 행하여 좋은 결과를 얻게 되었다. 즉, 배지내 포도당이 없는 상태로 유지되더라도 포도당 첨가속도를 적절히 조절하여 세포의 비성장속도(μ)를 빠르게 유지시키면(약 0.13h^-1이상)세포농도가 높아질 때까지 계속 단백질의 발현이 억제되는 것을 발견하였다. 이는 세포내의 포도당이 충분히 존재하여 비록 배지에서 검출되지 않더라도 포도당에 의해 ADH2/ GAPDH 프로모터가 저해받기 때문이며 본 발명에서 사용한 비성장 속도조절이 세포내 포도당 농도의 조절에 유효했던 것으로 생각된다.

또한, 재조합 효모의 일반적인 발효온도는 약 30℃로, 이 온도에서 세포의 성장이 가장 빠르다. 반면 세포내 단백질 분해 효소도 이 온도에서 활성이 높기 때문에 단백질 발현 단계에서는 발현은 계속되면서 분해현상이 적은 조건으로 유지하는 것이 바람직하며 그러한 방법으로 발효 온도를 낮추는 저온 발효가 적용될 수 있으나 온도가 너무 낮으면 세포 활성의 둔화로 생산성이 없기 때문에 온도를 15℃ 내지 25℃정도로 유지하는 것이 바람직하며, 20℃ 내지 25℃가 가장 바람직하다.

따라서 발현이 억제된 상태로 세포농도가 적절히 높아졌을 때, 발효온도를 낮춤과 동시에 ADH2/GAPDH 프로모터를 억제하지 않고 발현을 유지하는 탄소원인 에탄올를 타영양성분과 함께 적절한 수준으로 첨가하면 일정시간 지난 후 발현이 시작되며 그 발현량이 점차 증가하고 세포당 발현이 최고에 달하게 된다.

이에, 본 발명자는 ADH2/GAPDH 프로모터 조절하에 효모에서 발현되는 재조합 단백질을 생산할 때 그 생산성을 높이는 유가식 발효방법을 개발하게 됨으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 재조합 효모를 사용하여 특정단백질을 생산함에 있어서 발현 프로모터의 특성을 적절히 이용하는 효과적인 발효방법을 찾아 그 생산성을 높이는 것이다.

이에 따라 본 발명은 효모의 유가식 발효에서 세포가 고농도로 될 때까지 단백질이 발현을 억제함을 특징으로 하여 재조합 단백질의 생산성을 향상시키는 효모의 유가식 발효방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 ADH2/GAPDH 프로모터의 조절을 받는 재조합 단백질을 효모세포내에서 발현시키는 재조합 효모의 발효에 있어서, 발효배지내의 포도당 농도가 0이 되는 시점부터 세포의 비성장속도가 0.13h^-1내지 0.20h^-1범위에서 유지되도록 포도당 첨가속도를 조절하여 재조합 단백질의 발현을 억제시킨 후, 배지내의 에탄올 농도가 1% 이하가 되는 시점부터 배양조건을 발현조건으로 변화시킴을 특징으로 하는 재조합 효모의 유가식 발효방법을 제공한다.

이하, ADH2/GAPDH 프로모터의 조절하에, hGH(인간 성장 호르몬)의 유전자가 형질전환된 효모균주를 사용하여 hGH를 생산하는 경우를 예를들어 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

그러나, 본 발명은 이에 국한되지 않고 전술한 바와같이 ADH2/GAPDH 프로모터하에 발현이 조절되는 단백질 유전자를 가지는 재조합 효모로 부터 상기 단백질을 생산하는 경우에 모두 적용될 수 있음을 밝혀둔다.

본 발명에 따른 상기의 목적을 달성하기 위해서는 배지내의 포도당이 고갈되어 발현이 시작되기 직전부터 포도당의 첨가속도를 표모의 시성장속도가 적정수준(0.13-0.20hr^-1)으로 유지되도록 지수적으로 조절해야 하며 이때 첨가되는 포도당은 완전히 이용되어 배지내에 포도당의 축적이 없어야 한다.

적절한 포도당 첨가속도의 조절을 해서는 아래의 계산식이 사용되며 이는 세포의 비성장속도 조절을 위해 흔히 사용되는 방법(Gregory M.O'Connor, Fernando Sa-nchez-Riera and Charles L. Cooney, Biotechnology and Bioengineering, 39, 30 4(1992))중에서 가장 간단한 지수조절 첨가(exponentially scheduled feeding)방법에서 변형된 것으로 배지 첨가 속도의 변화가 연속적이지 않고 임의의 시간(dt)마다 조절된다는 것을 감안한 것이다.

FR : 배지첨가속도(L/hr),μ : : 비성장속도[hr^-l], X : 세포농도[OD], V : 발효부피[L], Y : 포도당 소모에 대한 효모의 수율[1.3OD/(g포도당/L)], dt : 첨가속도 조절간격[1/60hr]

위의 식은 첨가되는 포도당이 전부 세포의 성장에 이용되며 포도당 이외의 다른 탄소원은 존재하지 않을 때 더욱 정확하다. 만약, 배지내의 에탄올이 탄소원으로 이용된다면 실제의 세포성장 속도는 설정치보다 빠르게 유지될 수도 있다.

참고로 비성장속도란, 아래의 식으로 표현되며 세포는 기하급수적으로 성장하기 때문에 세포의 성장속도는 단위세포당 성장속도로 표현되어야 함이 반영된 것이다.

본 발명의 발효는 호기적 조건에서 수행하고 세포성장 단계에는 배양온도를 약 30℃로 조절하며 단백질 발현의 단계에서는 15 내지 25℃로 조절한다. 배양액의 pH는 암모니아수나 가성소다 용액을 이용하여 4.5 내지 5.5으로 조절한다. 단백질 발현의 단계에서 배지중의 에탄올 농도는 0.1∼1%로 유지시키는 것이 바람직하다.

배양액중의 에탄올 농도는 가스 크로마토그래피(FID, HEWLETT PACHARD, 미국)를 사용하여 측정하였고 포도당 농도는 글루코스콧 스트립(Kyoto Daiichi Kagaku Co.,GLUCOSCOT, 일본)을 사용하여 측정했다. 배지첨가를 위해서는 컴퓨터로 조절이 가능한 연동펌프(ISMATE REGSO100)가 사용되었다.

이하 참고 실시예 및 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만 이로써 본 발명이 제한되는 것이다.

하기 실시예에서 사용된 hGH의 생산균주는 효모 (Saccharomyces cerevisiae DC04)로서 발현 프로모터(ADH2/GAPDH)및 hGH 유전자를 포함하도록 형질전환된 균주이다(균주기탁 번호 : KFCC-10669, 균주 기탁일 1988. 12. 27 : 대한민국 특허공고 제91-459호 참조).

발효기내의 세포농도는 발효액을 소량 취하여 적당히 희석한후 분광광도계(Milton Roy Spectronic 501, 미국)를 이용하여 600nm의 파장에서 0D(흡광도)를 측정했으며 흡광도 0D 1은 약 0.5g/L의 건조 세포농도로 환산될 수 있다. 발현된 단백질의 농도를 측정하는 방법으로 채취한 발효액중의 세포를 일정량(0D 5일때 1ml, 0D 10이면 0.5ml)원심분리하여 취하고 -20℃에서 냉동보관 후 발효가 끝난 다음 각 샘플을 세포파쇄(bead beater)후 정량된 각각의 표준단백질과 같이 전기영동(SDS-PAGE)하여 쿠마씨(coomassie)염색한 후 덴시토미터(BIO-RAD Mode1 620, 미국)를 사용하였다.

참고 실시예 1) 10리터 회분식 발효

형질전환되어 발현이 확인된 종균 1mL을 500mL의 루이신 결핍 최소 배지에 접종하여 21L 용량의 배플달린 플라스크에서 30℃로 24시간 진탕배양(종배양)한 후 이 배양액을 YREPD 2%(효모 추출물 1%, 박토-펩톤 2%, 포도당 2%) 배지 10리터(14리터 발효기, Chemap, 스위스)에 접종하여 30℃로 호기적 조건하에 약 36시간 배양하며 배니내의 에탄올이 고갈되기 직전에 수확하여 발현량을 전기영동하여 확인한 결과 최종 세포농도는 20(0D)이었으며 단위 세포당 발현된 hGH의 농도는 약 10mg/L/OD이었다.

참고 실시예 2) 10리터 2단계 회분식 발효

참고 실시예 1)과 같은 방법으로 발효를 진행하였고 배지내의 포도당 농도가 0이 되는 시점에서 발효온도를 내렸을 때 단백질의 발현량이 증가함을 확인하기 위해 발효 온도를 15℃로 조절했으며 그 결과 세포 농도는 앞의 실험과 유사했지만 발현된 hGH의 농도는 약 12mg/L/OD이었다.

실시예 1) 10리터 유가식 발효1

종배양액 500ml을 하기 표1의 조성을 갖는 발효시작 배지 7.5리터에 접종한 후 첨가배지 1리터(포도당 300g, 아데닌 2g, MgCl₂6H₂O 30g)를 일정속도(45mL/hr)로 첨가하며 발효를 시작했으며 첨가배지가 모두 소모되었을 때 첨가배지 1.75리터(효모 추출물 500g, 에탄올 350mL)로 교체하여 같은 속도로 첨가하다가 배지내 에탄올이 고갈되는 시점에서 그 첨가속도를 90mL/hr로 올려 주었고 다시 에탄올이 고갈되었을 때 270mL/hr로 올려 주었다. 발효온도는 30℃이었고 pH는 암모니아수를 사용하여 5이상으로 유지시켰으며 배지내 용존산소(pO₂)는 교반속도, 통기량, 발효기내의 압력조절을 통하여 30% 이상으로 유지시켰다. 이때의 발효특성은 제1도에 나타내었으며 hGH의 단위 세포당 발현양이 약 10mg/L/OD에서 점차 떨어지는 것이 관찰되었다.

[표 1] 회분식 발효 배지 조성

[표 2] 금속 용액 조성 (/L)

실시예 2) 유가식 발효 2

종배양액 500m1을 포도당 140g과 MgCl₂·6H₂O 5g이 추가된 발효시작 배지 6.5리터에 접종한 후 발효를 시작하였고 포도당 농도가 0이 될 때 0D를 측정한 후 μ를 0.13h^-1으로 하여 전술한 계산식을 이용해 효모추출물 300g, 효모펩톤 300g 및 포도당 600g이 포함된 3리터의 배지를 첨가하였다. 이때의 발효온도는 25℃이었다.

이때의 발효특성을 제2도에 나타냈고 배지내에 포도당의 통도가 0인 시점부터 14시간동안 발현이 되지 않았으며 발현이 억제된 상태로 0D 70이상까지 세포농도를 높일 수 있었다. 이때의 실제 비성장속도를 계산해 보면 배지내 존재하던 에탄올이 탄소원으로 이용되어 0.15h^-1이상이었다. 이후, 에탄올이 고갈되고 시레 비성장 속도가 0.12h^-1로 떨어지면서 발현이 됨을 관찰하였고 또한 시간이 지남에 따라 단위세포당 hGH 농도가 감소함을 관찰했다. 따라서 세포가 단백질 발현없이 성장을 계속 유지하기 위해서는 실제 비성장 속도가 0.13h^-1이상이어야 함을 확인하있다.

실시예 3) 3단계 유가식 발효 1

실시예 2)와 같이 발효를 시작하고 포도당 농도가 0이 될 때 OD를 측정한 후 μ를 0.15h^-1으로 하여 전술한 계산식을 이용해 효모추출물 300g, 효모 펩톤 300g, 포도당 250g이 포함된 3리터의 배지를 첨가하였다. 배지내 에탄올의 농도가 0이 되었을 때 발효온도를 15℃로 낮추고 에탄올을 약 l% 첨가하였고 에탄올 농도가 0이 되지 않도록 간헐적으로 첨가하였다.

이때의 발효특성을 제3도에 나타내었고 배지내의 포도당의 농도가 0인 시점부터 13시간 동안 발현이 되지 않았으며 발현이 억제된 상태로 OD 50이상까지 세포농도를 높일 수 있다. 이후, 추가된 에탄올이 소모되면서 발현이 증가됨을 관찰하였고 또한 시간이 지남에 따라 단위 세포당 hGH 농도가 감소하지 않음을 관찰했으며 최종 발현량은 약 13mg hGH/OD이었다.

이 결과로 발현시기의 온도는 15℃가 유리함을 관찰하였고 에탄올을 계속 첨가하면 발현이 유지된다는 것을 알게 되었다.

실시예 4) 2단계 유가식 발효 2

종배양액 500ml을 포도당 120g, 효모 추출물 60g및 효모펩톤 120g으로 조성된 발효 배지 6리터에 접종한 후 발효를 시작하였고 포도당 농도가 0이 될때 OD를 측정한 후 μ를 0.15h^-l으로 하여 전술한 계산식을 이용해 효모추출물 150g, 효모펩톤 300g 및 포도당 300g 이 포함된 3.85리터의 배지를 첨가하였다. 배지가 모두 첨가된 후 발효온도를 15℃로 내리고 효모 추출물 150g, 효모펩톤 300g 및 에탄올180mL이 포함된 1.95리터의 배지를 약 7mL/hr의 일정속도로 첨가하였다.

이 실험은 실시예 3)의 재연성과 에탄올의 연속적 첨가에 대한 효과를 보기 위한 것으로 이때의 발효특성을 제4도에 나타내었고 배지내에 포도당의 노도가 0인 시점부터 20시간동안 발현이 되지 않았으며 발현이 억제된 상태로 OD 70이상까지 세포농도를 높일 수 있었다. 이후, 첨가되는 에탄올을 소모하면서 발현이 증가됨을 관찰하였고 단위세포당 hGH농도가 감소하지 않음을 관찰했으며 최종 발현량이 약 14mg hGH /L/OD로 최고의 생산성을 나타내었다.

상기 참고실시예 1및 2및 실시예 1,2,3 및 4에서 본 발명의 유가식 발효방법이 ADH2/GAPDH 프로모터의 개폐시기를 조절할 수 있음을 알 수 있으며 세포성장과 발현의 두단계로 나누어 발효함으로써 종래의 회분식 발효법 및 발현시기를 조절하지 않았을 때의 유가식 발효법 보다 재조합 단백질의 생산효율이 현저히 높아짐을 알 수 있다.

Claims (4)

1. ADH2/GAPDH프로모터의 조절을 받는 재조합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 효모의 발효에 있어서, 발효 배지내의 포도당 농도가 0이 되는 시점부터 세포의 비성장 속도가 0.13h^-1내지 0.20h^-l범위로 유지되도록 포도당 첨가속도를 조절하여 재조합 단백질의 발현을 억제시키는 배양 단계와, 배지내의 에탄올 농도가 1%이하가 되는 시점부터 상기 배양 단계를 발현조건으로 변화시켜 상기 단백질의 발현을 유도하는 발현단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 단백질의 생산성을 높이기 위한 재조합 효모의 유가식 발효 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 배양단계의 배양온도가 약 30℃이고 상기 발현 단계에서의 배양 온도가 15∼25℃인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 발현 단계에서의 배양시 배지내의 에탄올 농도를 0.1∼1%로 유지시킴을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 발현 단계에서의 배양시 포도당이 없고 에탄올이 첨가된 배지를 공급함을 특징으로 하는 방법.