ES2247872B1 - Pepsina y pepsinogeno bovinos recombinantes producidos en celulas procariotas y eucariotas. - Google Patents
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Abstract
Pepsina y pepsinógeno bovinos recombinantes producidos en células procariotas y eucariotas. Un sistema para la producción de pepsina bovina recombinante, consistente en la construcción, a partir de diversos cDNAs y de secuencias sintéticas de un cDNA que puede expresarse en células microbianas, procariotas o eucariotas, y en las condiciones para la producción de la misma en microorganismos. Este enzima tendría las aplicaciones del enzima bovino nativo, pero sin el riesgo sanitario asociado al uso de tejidos animales.
Description
Pepsina y pepsinógeno bovinos recombinantes
producidos en células procariotas y eucariotas.
La presente invención se encuadra dentro del
Área Agroalimentaria, en el Sector de Industrias Lácteas, pudiendo
afectar a los subsectores de producción de quesos y de péptidos
bioactivos. La actividad proteolítica de la pepsina obtenida hace
que pueda ser interesante para cualquier aplicación en la que se
necesite una proteasa aspártica extremadamente pura.
La producción de la mayor parte de los quesos,
tanto artesanales como industriales, consta de dos etapas
principales, la elaboración y el curado. En las primeras fases de
la elaboración se persigue la deshidratación de la leche, de tal
manera que la grasa y las caseínas se concentran entre 6 y 12 veces,
según la variedad de que se trate. Esto se consigue en tres etapas,
acidificación, coagulación y desuerado. La acidificación consiste
en la fermentación de la lactosa por parte de bacterias lácticas,
produciéndose ácido láctico. Estas bacterias pueden ser inoculadas
o encontrarse naturalmente en la leche. El descenso de pH producido
durante la fermentación puede por sí mismo provocar la coagulación
de la leche, pero en la mayor parte de las ocasiones el objetivo es
conseguir una coagulación mixta, ácida y enzimática, en la cual,
además del descenso de pH interviene la acción de enzimas
proteolíticas [Cheese: chemistry, physics and microbiology. Ed. P.F.
Fox. Elsevier Applied Science. London, 1987].
La enzima proteolítica más importante utilizada
en la elaboración del queso es la quimosina, que es la enzima más
abundante del cuajo de ternero lactante. Esta proteasa hidroliza
específicamente el enlace F105-M106 de la
K-caseína, que se encuentra en la superficie de las
micelas de caseína y es un factor esencial para su estabilidad
[Fox, P.F. (1993) Exogenous enzymes in dairy technology- A review.
J. Food. Biochem. 17: 173-199]. Como consecuencia de
esta hidrólisis, y de la liberación del extremo
C-terminal del caseín macropéptido, la
p-K-caseína restante sufre una
desestabilización hidrofóbica que provoca la agregación de las
micelas y la coagulación de la leche cuando se dan las condiciones
adecuadas de pH (debido a la fermentación de la lactosa),
temperatura y concentración de calcio.
La cuajada así obtenida se somete a continuación
a los procesos de corte y desuerado, y posteriormente a las de
salado y moldeado. El resultado de todo ello es el queso fresco,
que puede ser comercializado como tal o bien someterse al proceso
de curado, durante el cual se producen una serie de cambios
físico-químicos que influyen sobre las
características del producto final. La mayor parte de estos cambios
son consecuencia de la actividad metabólica de bacterias y, en
algunos quesos, de hongos filamentosos, con notable influencia de
las actividades proteolíticas de la leche, las residuales del cuajo
o las producidas por los microorganismos presentes [Izco, J.M.,
Torre, P., Barcina, Y. (1999) Maduración acelerada de los quesos.
Revisión. Alimentaria. Junio 99: 135-144].
Las principales consecuencias de la proteolisis
en los quesos son la modificación de la textura y del aroma. La
contribución al aroma se debe a la liberación de péptidos y
aminoácidos, que a su vez pueden ser sustrato para otras reacciones
que producen compuestos que influyen sobre el sabor y el aroma,
mediante desaminación, descarboxilación o desulfuración de los
mismos. La extensión deseable de la proteolisis en un queso depende
del tipo del que se trate, y se han puesto a punto diferentes
metodologías con el fin de acelerarla, consiguiendo de esta manera
reducir los tiempos de curado, y consecuentemente los costes de
producción.
La pepsina, al igual que la quimosina, se
secreta en el abomaso de los rumiantes en forma de un zimógeno
inactivo (pepsinógeno y proquimosina, respectivamente). Estos
zimógenos tienen una extensión N-terminal que impide
la actividad enzimática, pero como consecuencia del bajo pH del
ambiente en el que se secretan se produce el procesamiento
proteolítico autocatalítico que libera la proteasa madura [Richter,
C., Tanaka, T., Yada, R.Y. (1998) Mechanism of activation of the
gastric aspartic proteinases: pepsinogen, progastricsin and
prochymosin. Biochem. J. 335: 481-490]. En la
producción comercial de cuajos se suele proceder a una fase de
activación, mediante la modificación del pH con el fin de convertir
todos los zimógenos presentes en las proteasas activas
correspondientes.
La secuencia de los 110 primeros aminoácidos del
extremo amino terminal del pepsinógeno bovino ha sido determinada
experimentalmente a partir de la proteína purificada de abomaso
bovino [Harboe, M., Foltmann, B., (1973) The
N-terminal amino acid sequence of bovine pepsin (EC
3.4.4.1) and the sequence overlapping the activation fragment. FEBS
Left. 34: 311-314; Harboe, M., Foltmann, B., (1975)
Bobine pepsin: the sequence of the first 65 amino acid residues
(completing the sequence of the first 110 residues of bovine
pepsinogen). FEBS Lett. 35: 1 33-136]. Además, se
han publicado en revistas científicas o en bases de datos varias
secuencias de fragmentos genómicos o de cDNA cuyo análisis sugiere
que se trata de fragmentos del gen del pepsinógeno bovino [Lu, Q.,
Wolfe, K.H., McConnel, D.J. (1988) Molecular cloning of múltiple
bovine aspartyl portease genes. Gene, 71:135-146;
MAGPIE Automated Genomics Project Investigation Environment;
http://magpie.ucalgary.ca/magpie/cattle_ests/private/; Smith,
T.P.L., Grosse, W.M., Freking, B.A., Roberts, A.J., Stone, R.T.,
Casas, E., Way, J.E., White, J., Cho, J., Fahrenkrug, S.C.,
Bennett, G.L., Heaton, M.P., Laegreid, W.W., Rohrer, G.A.,
Chitko-McKown, C.G., Pertea, G., Holt, I.,
Karamycheva, S., Liang, F., Quackenbush, J., Keele, J.W. (2001)
Sequence evaluation of four pooled-tissue
normalized bovine cDNA libraries and construction of a geneindex
for cattle. Genome Research 11:626-630.], pero en
ningún caso se ha publicado la secuencia completa ni se ha
demostrado la actividad del producto génico.
Como ya hemos comentado, la pepsina es una
enzima con propiedades similares pero distintas que la quimosina.
Estas propiedades la hacen adecuada para acelerar la maduración de
los quesos si se utiliza en combinación con la pepsina en
determinadas proporciones. El uso de una preparación de pepsina con
una riqueza del 97% no parece suponer un problema para la
elaboración de queso [Birkkjaer, H., Johnk, P. (1985) Technological
suitability of calf rennet substitutes. International Dairy
Federation Bulletin 194:8-13]. Si bien ambas enzimas
se encuentran en el estómago de los rumiantes, sus proporciones son
claramente distintas entre adultos y lechales, siendo estos
últimos, hasta hace poco, la única fuente de quimosina disponible.
La creciente demanda de coagulantes para la industria quesera llevó
hace ya varios años a una situación en la que la disponibilidad de
cuajos de ternero lactante, ricos en quimosina, era claramente
insuficiente para satisfacer las necesidades del mercado. Entre las
diferentes alternativas que se han puesto en práctica para
solucionar esta carencia están algunas fuentes tradicionales de
enzimas proteolíticas como son los cuajos vegetales, y otras no
tradicionales, como la utilización de enzimas microbianas y la
utilización de quimosina recombinante.
A pesar de algunas reticencias iniciales, la
utilización de quimosina recombinante ha ganado una gran cuota del
mercado de coagulantes en muy poco tiempo, habiéndose demostrado
que es sustancialmente equivalente a la quimosina obtenida a partir
de cuajo de ternera [Ortiz de Apodaca, M.J., Amigo, L., Ramos, M.
(1994) Study of the milk-clotting and proteolytic
activity of calf rennet, fermentation-produced c
hymosin, vegetable and microbial coagulants. Milchwissenschaft
49:13-16]. La producción de quimosina recombinante
comercial se ha llevado a cabo mediante la expresión del cDNA del
gen de la proquimosina bovina en tres microorganismos diferentes:
Escherichia coli, Aspegillus niger y Kluyveromyces
lactis (estas enzimas recombinantes han sido comercializadas
con los nombres de Chy-Max, Chymogen y Maxiren
respectivamente). Antes de su comercialización estos preparados de
proquimosina se purifican y se activan para dar lugar a la quimosina
madura.
La introducción en el mercado de estos cuajos
recombinantes tuvo como principal consecuencia la eliminación de la
dependencia de la industria quesera respecto de la disponibilidad
de cuajos naturales de lechales. Pero además, en el contexto de una
creciente demanda de seguridad alimentaria, y a consecuencia de
crisis de confianza como la ocasionada por la epidemia de la
encefalitis espongiforme bovina (BSE), la obtención de enzimas
recombinantes equivalentes a los coagulantes animales es aún una
alternativa más atractiva. Las enzimas recombinantes tienen además
la ventaja, sobre los de origen animal, de garantizar el
cumplimiento de protocolos religiosos como Halal o Kosher y de
satisfacer la demanda de consumidores vegetarianos [Vegetarian
Society information sheet. http://www.vegsoc.org].
Los péptidos bioactivos son una serie de
moléculas que se han identificado en los últimos años por sus
propiedades beneficiosas para la salud humana a través de una serie
de mecanismos que incluyen actividades antihipertensiva,
antihipercolesterémica, antimicrobiana o prebiótica. Muchos de estos
péptidos se encuentran en los alimentos o son obtenidos a partir de
ellos, como consecuencia de la actividad de determinadas proteasas
sobre proteínas precursoras. En la actualidad hay una tendencia a
tratar de producir y aislar estos péptidos bioactivos como una
forma de revalorizar productos o subproductos de la industria
alimentaria. Una de las fuentes de péptidos bioactivos que más se
ha estudiado es precisamente el casein macropéptido de los sueros
de quesería, un sustrato a partir del que la pepsina bovina es
capaz de liberar péptidos en las condiciones apropiadas [Shameet,
K.M., Brown, R.J., McMahon, D.J. (1992) Proteolitic activity of
proteinases on macropeptide isolated from K-casein.
J. Dairy Sci. 75: 1380-1388].
La pepsina bovina resulta una enzima interesante
para su producción biotecnológica porque forma parte de los cuajos
naturales utilizados tradicionalmente en la elaboración de queso.
Esta enzima también contribuye a la coagulación de la leche por su
acción sobre el mismo enlace (F105-M106) de la
K-caseína sobre el que actúa la quimosina, aunque la
actividad proteolítica de esta enzima es mayor y más inespecífica
que la de la quimosina [Fox, P.F. (1993) Exogenous enzymes in dairy
technology- A review. J. Food. Biochem. 17:
173-199]. De este modo, en los quesos elaborados con
cuajos que contienen pepsina, así como en quesos elaborados con
cuajo recombinante al que se ha añadido pepsina bovina natural, se
observa una mayor actividad proteolítica residual, que se traduce
en índices de maduración más altos cuando se someten estos quesos
al proceso de curado [Zapparoli, G.A., Zanazzi, M., Bertezzolo, C.,
Fantuzzi, U., Bianchi, P.G., Forini, M., Melani, D., Negrini, A.,
de Battisti, A. (1992) Grana cheesemaking trials using Chymogen
coagulant. Latte 17:214-221]. La sustitución en
estas últimas mezclas de la pepsina natural por pepsina
recombinante permitiría elaborar quesos destinados a maduración con
combinaciones enzimáticas idénticas a las naturales, pero sin
necesidad de recurrir a extractos de origen animal, que puedan
plantear dudas en cuanto a su salubridad o su adecuación a las
exigencias de amplios grupos de consumidores.
Otra posible aplicación de la pepsina bovina
recombinante sería la obtención de péptidos bioactivos a partir de
casein macropéptido de sueros de quesería o de algún otro sustrato
proteico. Estudios recientes han demostrado los posibles efectos
beneficiosos para la salud de los péptidos bioactivos derivados de
la leche y del suero de quesería. Estos efectos son múltiples e
incluyen: protección frente a la hipertensión, actividad
antiinflamatoria, disminución de los niveles de colesterol,
inmunomodulación, actividad antimicrobiana, actividad antiviral,
actividad anticancerígena, actividad antitrombótica, actividad
antioxidante, efectos opiáceos y otras [Clare, D.A., Sweisgood,
H.E. (2000) Bioactive milk peptides: a prospectus. J. Dairy Sci.
83:1187-1195; Shah, N.P. (2000) Effects of
milk-derived bioactives: an overview. British J.
Nutr. 84:S3-210; Smacchi, E., Bobbetti, M. (2000)
Bioactive peptides in dairy products: síntesis and interaction with
proteolytic encimes. Food Microbiol. 17:129-141].
Las proteínas del suero que originan péptidos bioactivos después de
su digestión incluyen la \beta-lactobglobulina,
alfa-lactalbúmina, lactoferrina, seralbúmina bovina
y el casein macropéptido. De hecho, el casein macropéptido resulta
hidrolizado por la acción de la pepsina bovina [Shameet, K.M.,
Brown, R.J., McMahon, D.J. (1992) Proteolitic activity of
proteinases on macropeptide isolated from K-casein.
J. Dairy Sci. 75: 1380-1388]. Por ello es una gran
ventaja disponer de la pepsina bovina recombinante pura, puesto que
su utilización permitiría la generación selectiva de secuencias
bioactivas específicas a partir de la leche y de sueros de
quesería. De igual manera, la pepsina bovina recombinante se puede
utilizar sobre cualquier otro sustrato proteico para la obtención
de péptidos bioactivos, como por ejemplo a partir de jalea real
[Matsui, T., Yuliyoshi, A., Doi, S., Sugimoto, H., Yamada, H.,
Matsumoto, K. (2002) Gastrointestinal enzyme production of
bioactive peptides from royal jelly protein and their
anthypertensive ability in SHR. J. Nutricional Biochem.
13:80-86].
La presente invención consiste en el diseño y
realización de un procedimiento para producir pepsinógeno bovino
recombinante en microorganismos como por ejemplo en la bacteria
Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Esta invención permite la obtención de pepsinógeno y
pepsina sin necesidad de utilizar materiales de origen animal,
soslayando así sospechas sobre la salubridad de productos obtenidos
a partir de vísceras de mamíferos o sobre su adecuación a
determinados rituales religiosos, que afectan a grandes grupos de
la población. Las posibles aplicaciones del pepsinógeno y de la
pepsina recombinantes obtenidos incluyen la elaboración de quesos y
la obtención de péptidos bioactivos.
Para la construcción de un cDNA sintético que
codifica una versión completa del pepsinógeno bovino se utilizaron
los plásmidos pBP4B (clon 1Abo04B07 de una genoteca de cDNA de
abomaso bovino de la Universidad de Alberta, Canadá) y pBPl10 (clon
103I10 de la genoteca MARC 3BOV cDNA del Children's Hospital Oakland
Research Institute, MI). El primero carece de la secuencia
correspondiente a los 37 aminoácidos del extremo a mino terminal
del pepsinógeno, mientras que el segundo carece de la secuencia
correspondiente a los cuatro aminoácidos del extremo amino terminal
(SVVK), y además contiene una deleción interna de 118 pb (Figura
1). Mediante PCR se sintetizó, a partir de pBPl10 un fragmento de
DNA de 148 pb que contenía la región que codifica para los
aminoácidos del extremo N-terminal que se hallan
ausentes en pBP4B, además de la secuencia correspondiente a la
región en posición 5' respecto de la deleción y parte de la región
correspondiente a dicha deleción. Este fragmento sirvió para
restaurar la secuencia obtenida experimentalmente obteniéndose
finalmente el plásmido pBP01 (Figura 2). La cepa transformada con
este plásmido se encuentra depositada en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT) con el número de identificación CECT5722, y
protegida de acuerdo con lo estipulado en el Tratado de
Budapest.
A continuación se realizó la construcción de los
plásmido pBP03 (Figura 3) para producir el pepsinógeno bovino en
Escherichia coli DH5\alpha. La cepa productora
transformada con este plásmido pBP03 se encuentra depositada en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de
identificación CECT5723, y protegida de acuerdo con lo estipulado
en el Tratado de Budapest.
Finalmente se construyó el plásmido pBP05 para
producir el pepsinógeno bovino en Saccharomyces cerevisiae,
cepa BY4741 (Figura 4). Este plásmido ha sido diseñado para
permitir la secreción del pepsinógeno bovino por parte de las
células de levadura. La cepa productora transformada con este
plásmido se encuentra depositada en la Colección Española de
Cultivos Tipo (CECT) con el número de identificación CECT11778, y
protegida de acuerdo con lo estipulado en el Tratado de
Budapest.
Para demostrar la producción de pepsinógeno en
estos dos microorganismos recombinantes se procedió a su cultivo en
condiciones de inducción de la producción, con IPTG o galactosa
según el caso, determinándose la cantidad de pepsinógeno obtenido
mediante un ensayo de actividad proteolítica.
A continuación se describen con más detalle las
diferentes etapas necesarias y los métodos empleados en el
desarrollo de la invención.
desarrollo de la invención.
Para la construcción de un cDNA sintético que
codifica una versión completa del pepsinógeno bovino se utilizaron
los plásmidos pBP4B (clon 1Abo04B07 de una genoteca de cDNA de
abomaso bovino de la Universidad de Alberta, Canadá) [MAGPIE
Automated Genomics Project Investigation Environment;
http://magpie.ucalgary.ca/magpie/
cattle_ests/private/] y pBPl10 (clon 103I10 de la genoteca MARC 3BOV cDNA, en el vector pCMV\cdotSPORT6, del Children's Hospital Oakland Research Institute MI) [Smith, T.P.L., Grosse, W.M., Freking, B.A., Roberts, A.J., Stone, R.T., Casas, E., Way, J.E., White, J., Cho, J., Fahrenkrug, S.C., Bennett, G.L., Heaton, M.P., Laegreid, W.W., Rohrer, G.A., Chitko-McKown, C.G., Pertea, G., Holt, I., Karamycheva, S., Liang, F., Quackenbush, J., Keele, J.W. (2001) Sequence evaluation of four pooled-tissue normalized bovine cDNA libraries and construction of a geneindex for cattle. Genome Research 11:626-630.] (Figura 2). El primero carece de la secuencia correspondiente a los 37 aminoácidos del extremo amino terminal del pepsinógeno, mientras que el segundo carece de la secuencia correspondiente a los cuatro aminoácidos del extremo N-terminal (SWK), y además contiene una deleción interna de 118 pb.
cattle_ests/private/] y pBPl10 (clon 103I10 de la genoteca MARC 3BOV cDNA, en el vector pCMV\cdotSPORT6, del Children's Hospital Oakland Research Institute MI) [Smith, T.P.L., Grosse, W.M., Freking, B.A., Roberts, A.J., Stone, R.T., Casas, E., Way, J.E., White, J., Cho, J., Fahrenkrug, S.C., Bennett, G.L., Heaton, M.P., Laegreid, W.W., Rohrer, G.A., Chitko-McKown, C.G., Pertea, G., Holt, I., Karamycheva, S., Liang, F., Quackenbush, J., Keele, J.W. (2001) Sequence evaluation of four pooled-tissue normalized bovine cDNA libraries and construction of a geneindex for cattle. Genome Research 11:626-630.] (Figura 2). El primero carece de la secuencia correspondiente a los 37 aminoácidos del extremo amino terminal del pepsinógeno, mientras que el segundo carece de la secuencia correspondiente a los cuatro aminoácidos del extremo N-terminal (SWK), y además contiene una deleción interna de 118 pb.
En primer lugar, utilizando como molde el
plásmido pBPl10 se sintetizó, mediante PCR, un fragmento de DNA que
contenía todos los elementos necesarios para obtener un cDNA
completo del pepsinógeno que estaban ausentes en el plásmido pBP4B.
En sentido 5'-3' el cebador
cDNA-PBP3 (ver Tabla 1) contenía los siguientes
elementos: secuencias idénticas al sitio múltiple de clonación
(MCS) del plásmido pBlueScript SK-, que flanquean el extremo 5' del
cDNA parcial del pepsinógeno que se encuentra en el plásmido
pBPI10; una secuencia sintética que codifica los cuatro aminoácidos
del extremo N-terminal del pepsinógeno ausentes en
la construcción pBP4B [Harboe, M., Foltmann, B., (1973) The
N-terminal amino acid sequence of bovine pepsin (EC
3.4.4.1) and the sequence overlapping the activation fragment. FEBS
Lett. 34: 311-314; Harboe, M., Foltmann, B., (1975)
Bobine pepsin: the sequence of the first 65 amino acid residues
(completing the sequence of the first 110 residues of pepsinógeno,
bovine pepsinogen] además de un codón ATG (metionina) que sirve
como inicio de traducción; y para terminar secuencias idénticas del
extremo 5' del cDNA parcial del pepsinógeno presente en dicha
construcción. El cebador cDNA-PB2 (ver Tabla 1)
contenía secuencias complementarias al flanco 5' de la deleción
interna del cDNA del pepsinógeno que se encuentra en la
construcción pBPI10 (ver Tabla 1). La mezcla de reacción contenía
los siguientes componentes en un volumen final de 50 \mul:
plásmido molde (pBPl10) 0,5 \mug, Pfu TURBO (Stratagene)
2,5 unidades, tampón para Pfu TURBO (Stratagene) IX, dATP 0,1 mM,
dTTP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM, dCTP 0,1 mM, cebadores 400 nM cada uno y
agua c.s.p. Esta mezcla de reacción se introdujo en el
termociclador programado de la siguiente manera: una etapa inicial
a 95ºC durante 1 minuto y medio, 20 ciclos de tres etapas: 95ºC 30
segundos, 55ºC 1 minuto y 68ºC 1 minuto, y una etapa final de 15
minutos a 68ºC. Seguidamente se añadieron 10 unidades de
DpnI y se incubó la mezcla a 37ºC durante 3 horas. Después de
inactivar la enzima a 80ºC durante 20 minutos se purificó el
producto de 148 pb de un gel de agarosa al 2% mediante el uso de un
kit comercial de QUIAGEN.
Este producto se utilizó como cebador para una
reacción de polimerización en un termociclador con el plásmido
pBP4B como molde. La mezcla de reacción contenía los siguientes
componentes en un volumen final de 50 \mul: plásmido molde 0,5
\mug, Pfu TURBO (Stratagene) 2,5 unidades, tampón para
Pfu TURBO (Stratagene) 1X, dATP 0,1 mM, dTTP 0,1 mM, dGTP
0,1 mM, dCTP 0,1 mM, 1/5 del producto recuperado de la PCR anterior
y agua c.s.p. Esta mezcla de reacción se introdujo en el
termociclador programado de la siguiente manera: una etapa inicial
a 95ºC durante 1 minuto y medio, 30 ciclos de tres etapas: 95ºC 30
segundos, 55ºC 1 minuto y 68ºC 10 minutos, y una etapa final de 15
minutos a 68ºC. Seguidamente se añadieron 10 unidades de
DpnI y se incubó la mezcla a 37ºC durante 3 horas, antes de
utilizar 10 \mul de la mezcla para transformar células
competentes de E. coli DH5a [Sambrook, J., Fritsch, E.F.,
Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor]. De esta manera
se recuperó una cepa de E. coli que contenía el plásmido
pBP01, que contiene una copia completa del cDNA que codifica el
pepsinógeno bovino precedida de un codón ATG, clonada en el vector
pBlueScript SK-. El inserto presente en este plásmido se secuenció
completamente para verificar que el cDNA sintético que codifica el
metionil-pepsinógeno estaba completo y que no tenía
mutaciones. La cepa transformada con este plásmido se encuentra
depositada en la CECT con el número de identificación CECT5722, y
protegida de acuerdo con lo estipulado en el Tratado de
Budapest.
El inserto de cDNA de 1,15 kb de pBP01 que
contiene la secuencia codificante del pepsinógeno bovino se c lona
en E. coli utilizando el vector de expresión
pIN-III(Ipp^{p}-5)-A3
de 7,4 kb, con el fin de proporcionar al cDNA del pepsinógeno
bovino los elementos necesarios para su expresión controlada en
E. coli. Para amplificar el inserto a partir de pBP01 se
utilizó el cebador Xba-PB (ver Tabla 1), que
contiene una diana de restricción XbaI que contiene parte
del sitio de unión a ribosomas y facilita la ligación posterior con
el vector
pIN-III(Ipp^{p}-5)-A3,
seguida de la secuencia del pepsinógeno pero cambiando algunos
nucleótidos de los 5 primeros aminoácidos según el uso de codones
más utilizado en E. coli, y el cebador
Hind-PB (ver Tabla 1), que contiene secuencias
complementarias a los últimos codones del cDNA del pepsinógeno
además de varios codones adicionales de terminación en cada una de
las fases de lectura y de una diana de restricción HindIII
(ver Tabla 1). La mezcla de reacción contenía los siguientes
componentes en un volumen final de 50 \mul: plásmido molde 0,5
\mug, Pfu TURBO (Stratagene) 2,5 unidades, tampón para Pfu
TURBO (stratagene) 1X, dATP 0,1 mM, dTTP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM, dCTP
0,1 mM, cebadores 400 nM cada uno y agua c.s.p. Esta mezcla de
reacción se introdujo en el termociclador programado de la
siguiente manera: una etapa inicial a 95°C durante 1 minuto y
medio, 20 ciclos de tres etapas: 95ºC 30 segundos, 55°C 1 minuto y
68ºC 3,5 minutos, y una etapa final de 15 minutos a 68ºC. El
producto amplificado se cortó con HindIII y XbaI, al
igual que el vector
pIN-III(Ipp^{p}-5)-A3.
Se purificaron ambos fragmentos, se ligaron y la mezcla de ligación
s e utilizó para transformar células competentes de E. coli
DH5\alpha. Se seleccionó un clon recombinante que contiene el
plásmido pBP03 (Figura 3). Se muestra la secuencia completa del
inserto presente en pBP03 (SEQ ID 1), junto con su traducción
conceptual (SEQ ID 2). La cepa productora transformada con este
plásmido se encuentra depositada en la CECT con el número de
identificación CECT5723, y protegida de acuerdo con lo estipulado
en el Tratado de Budapest.
El inserto de cDNA de 1,15 kb de pBP01 que
contiene la secuencia codificante del pepsinógeno bovino se clonó
en Saccharomyces cerevisiae utilizando el vector de
expresión pYES2 (Invitrogen) de 5,9 kb. Para ello se digirieron
tanto el plásmido pBP01 como el vector pYES2 con las enzimas de
restricción XhoI y SacI y se purificaron a partir de
un gel de agarosa, utilizando un kit comercial de QUIAGEN las
bandas correspondientes al vector digerido y al inserto de 1,3 kb
de pBP01. Estos fragmentos de DNA se ligaron y la mezcla de ligación
se utilizó para transformar células competentes de E. coli
DH5\alpha. Se seleccionó un clon recombinante que contiene el
plásmido pBP04 (Figura 4). De esta manera el cDNA del pepsinógeno
bovino está bajo el control de un promotor de levadura que se
induce por galactosa y se reprime por glucosa, en un vector que se
replica y contiene un marcador de selección para S.
cerevisiae. Con el fin de asegurar la expresión del pepsinógeno
en la levadura, el plásmido pBP04 se utilizó como base para
construir el plásmido pBP05, que contiene una fusión
transcripcional en la que el pepsinógeno está precedido de un
péptido señal para la secreción del factor alfa de S.
cerevisiae. En primer lugar se utilizó DNA genómico de S.
cerevisiae BY4741 como molde para obtener un producto de PCR
que codifica un péptido señal, utilizando los cebadores BP05A y
BPO5B (ver Tabla 1). BP05A contiene, en sentido
5'-3', secuencias idénticas al sitio múltiple de
clonación (MCS) del plásmido pYES2, que flanquean el extremo 5' del
cDNA del pepsinógeno que se encuentra en el plásmido pBP04, una
secuencia sintética con las dianas de restricción SacI y
EcoRI y secuencias idénticas al extremo 5' del gen que
codifica la feromona alfa de S. cerevisiae. BPO5B contiene,
también en sentido 5'-3', secuencias
complementarias al extremo N-terminal del cDNA
reconstruido del pepsinógeno bovino, en fusión con secuencias
complementarias al extremo C-terminal del péptido
señal del factor alfa (ver Tabla 1). La mezcla de reacción contenía
los siguientes componentes en un volumen final de 50 \mul: DNA
genómico 1 \mug, Pfu TURBO (Stratagene) 2,5 unidades, tampón para
Pfu TURBO (Stratagene) IX, dATP 0,1 mM, dTTP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM,
dCTP 0,1 mM, cebadores 400 nM cada uno y agua c.s.p. Esta mezcla de
reacción se introdujo en el termociclador programado de la
siguiente manera: una etapa inicial a 95ºC durante 1 minuto y
medio, 25 ciclos de tres etapas: 95ºC 30 segundos, 55ºC 1 minuto y
68ºC 1 minuto, y una etapa final de 15 minutos a 68ºC. Seguidamente
se añadieron 10 unidades de DpnI y se incubó la mezcla a
37ºC durante 3 horas. Después de inactivar la enzima a 80ºC durante
20 minutos se purificó el producto de 320 pb de un gel de agarosa
al 1% mediante el uso de una kit comercial de QUIAGEN.
Este producto se utilizó como cebador para una
reacción polimerización con el plásmido pBP04 como molde. La mezcla
de reacción contenía los siguientes componentes en un volumen final
de 50 \mul: plásmido molde 0,5 \mug, Pfu TURBO
(Stratagene) 2,5 unidades, tampón para Pfu TURBO (stratagene)
IX, dATP 0,1 mM, dTTP 0,1 mM, dGTP 0,1 mM, dCTP 0,1 mM, 1/5 del
producto recuperado de la PCR anterior y agua c.s.p. Esta mezcla de
reacción se introdujo en el termociclador programado de la
siguiente manera: una etapa inicial a 95ºC durante 1 minuto y
medio, 30 ciclos de tres etapas: 95ºC 30 segundos, 55ºC 1 minuto y
68ºC 25 minutos, y una etapa final de 15 minutos a 68ºC.
Seguidamente se añadieron 10 unidades de DpnI y se incubó la
mezcla a 37ºC durante 3 horas, antes de utilizar 10 \mul de la
mezcla para transformar células competentes de E. coli
DH5\alpha. De esta manera se recuperó una cepa de E. coli
que contenía el plásmido pBP05 (Figura 4).
El plásmido pBP05 se purificó a partir de la
cepa de E. coli DH5\alpha (pBP05) mediante un kit
comercial de
PROMEGA (Wizard miniprep) y se utilizó para transformar células de S. cerevisiae BY4741 mediante el método de acetato de litio [The LiAc TRAFO Method Page. http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/
method.html]. La cepa transformante que expresa la fusión traduccional del pepsinógeno bovino con el péptido señal del factor alfa bajo el control del promotor del gen GAL1 se encuentra depositada en la CECT con el número de identificación CECT11778, y protegida de acuerdo con lo estipulado en el Tratado de Budapest.
PROMEGA (Wizard miniprep) y se utilizó para transformar células de S. cerevisiae BY4741 mediante el método de acetato de litio [The LiAc TRAFO Method Page. http://www.umanitoba.ca/faculties/medicine/biochem/gietz/
method.html]. La cepa transformante que expresa la fusión traduccional del pepsinógeno bovino con el péptido señal del factor alfa bajo el control del promotor del gen GAL1 se encuentra depositada en la CECT con el número de identificación CECT11778, y protegida de acuerdo con lo estipulado en el Tratado de Budapest.
Células de E. coli DH5\alpha
transformadas con el plásmido pBP03 (cepa CECT5723), que contiene
el Met-cDNA del pepsinógeno bovino bajo el control
de un promotor inducible por IPTG, se incubaron en medio LB
suplementado con ampicilina 50 \mug/ml, a 37ºC y 220 rpm. Como
control se utilizaron células transformadas con el vector
pIN-III-A3. Estos cultivos se
utilizaron para inocular medio el mismo medio fresco e incubarlo en
las mismas condiciones. Cuando los cultivos alcanzaron una D.O. 600
nm de 0,7-1,0 se repartieron en dos matraces y a
uno de ellos se le añadió
isopropil-\beta-D-thiogalactosido
(IPTG) a una concentración final de 400 \muM para inducir la
expresión. Los cultivos se incubaron entonces a 30°C durante 4
horas. Pasado este tiempo las células se centrifugaron, se lavaron
en solución salina (NaCl 0,9%) se resuspendieron en 1/5 del volumen
inicial en 50 mM de Tris-fosfato, pH 7,0 a 4°C. A
continuación se sonicaron 3 x 6 seg a 4°C, dando lugar al
"extracto total", o bien se centrifugaron a 13.000 rpm x 10
min, en una microcentrífuga de mesa y el sobrenadante da lugar al
"extracto soluble" que contiene el pepsinógeno bovino. La
actividad proteolítica frente a hemoglobina del pepsinógeno
presente en los extractos obtenidos tal como se describe
anteriormente se determinó siguiendo el procedimiento descrito por
[Kassell, B., Meitner, P.A. (1970) Bovine pepsinogen and pepsin.
Methods Enzymol. 19:337-347], con algunas
modificaciones. En primer lugar se calculó la cantidad de HCl 0,3M
necesaria para llevar cada muestra a pH 2,0. Cada ensayo contenía
350 \mul de extracto diluido 1/10 en tampón 1 (HCl 0,01 M, NaCl
0,1 M, pH 2,0) y 350 \mul de hemoglobina, más la cantidad de HCl
0,3 M calculada anteriormente. Las reacciones se incubaron durante
24 horas a 37°C y se pararon mediante la adición de 700 \mul de
TCA 5%. Después de incubar 10 minutos en hielo se centrifugaron a
13.000 rpm durante 10 minutos en una microcentrífuga de mesa y se
midió la D.O. a 280 nm de los sobrenadantes, con el fin de estimar
la cantidad de hemoglobina hidrolizada durante el tiempo del ensayo.
Los controles de la D.O. a 280 nm de las mezclas de reacción previa
a la hidrólisis se prepararon invirtiendo el orden de adición del
sustrato y el TCA, de modo que no hubiese tiempo para la
hidrólisis. Para calcular la actividad se tuvo en cuenta la
diferencia de D.O. a 280 nm entre el ensayo a tiempo 0 y a 24 horas.
La tabla 2 muestra la actividad de los extractos total y soluble de
la cepa CECT5723, expresada como equivalentes en peso de pepsina
porcina comercial en las mismas condiciones de ensayo. Como se
puede apreciar se ha conseguido la producción de pepsinógeno bovino
recombinante por parte de E. coli DH5\alpha.
| Muestra/equivalentes | Extracto total | Extracto total | Extracto Soluble | Extracto Soluble |
| pepsina (ng/ml) | ||||
| Sin inducir | Inducido | Sin inducir | Inducido | |
| E. coli (pIN-IIIA3) | <15 | <15 | <15 | <15 |
| E. coli CECT5723 | 277 | 317 | 297 | 309 |
Células de S. cerevisiae BY4741
transformadas con el plásmido pBP05 (cepa CECT11778), que contiene
el Met-cDNA del pepsinógeno bovino bajo el control
de un promotor inducible por galactosa, se incubaron durante toda la
noche en medio mínimo sin uridina ni uracilo, con glucosa como
fuente de carbono a 30°C y 200 rpm. Como control se utilizaron
células transformadas con el vector pYES2. Estos cultivos se
utilizaron para inocular medio mínimo sin uridina ni uracilo, con
galactosa como fuente de carbono a una D.O. 600 nm de 0,4 y se
incubaron durante 24 horas en las condiciones anteriores. Los
cultivos se centrifugaron, utilizándose el sobrenadante para medir
la actividad del pepsinógeno extracelular. Las células se lavaron
en solución salina y se resuspendieron en 1/10 del volumen inicial
en 50 mM de Tris-fosfato, pH 7,0. Se añadieron 0,5
g de perlas de vidrio y se agitaron en un agitador de tubos durante
5 minutos para obtener el extracto celular total. Estas muestras se
utilizaron para llevar a cabo un ensayo de actividad proteolítica
frente a hemoglobina del mismo modo que en el ejemplo 1. En primer
lugar se calculó la cantidad de HCl 0,3 M necesaria para llevar
cada muestra a pH 2,0. Cada ensayo contenía 350 \mul
sobrenadante, o bien de extracto diluido 1/10 en tampón 1 (HCl 0,01
M, NaCl 0,1 M, pH 2,0), y 350 \mul de hemoglobina, más la
cantidad de HCl 0,3 M calculada anteriormente. Las reacciones se
incubaron durante 24 horas a 37°C y se pararon mediante la adición
de 700 \mul de TCA 5%. Después de incubar 10 minutos en hielo se
centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 minutos en una
microcentrifuga de mesa y se midió la D.O. a 280 nm de los
sobrenadantes, con el fin de estimar la cantidad de hemoglobina
hidrolizada durante el tiempo del ensayo. Los controles de la D.O.
a 280 nm de las mezclas de reacción previa a la hidrólisis se
prepararon invirtiendo el orden de adición del sustrato y el TCA,
de modo que no hubiese tiempo para la hidrólisis. Para calcular la
actividad se tuvo en cuenta la diferencia de D.O. a 280 nm entre el
ensayo a tiempo 0 y a 24 horas. La tabla 3 muestra la actividad de
los extractos total y soluble de la cepa CECT11778, expresada como
equivalentes en peso de pepsina porcina comercial en las mismas
condiciones de ensayo. Como se puede apreciar se ha conseguido la
producción y secreción parcial de pepsinógeno bovino recombinante
por parte de S. cerevisiae BY4741.
| Muestra/equivalentes pepsina (ng/ml) | Extracto celular | Sobrenadante medio de cultivo |
| S. cerevisiae (pYES2) | <15 | <15 |
| S. cerevisiae CECT11778 | 357 | 100 |
Figura 1. Alineamiento de la secuencia amino
terminal del pepsinógeno, determinada experimentalmente, con la
traducción conceptual de los insertos contenidos en los plásmidos
pBP4B y pBPl10. En el segundo caso ha sido necesario cambiar de
fase de lectura para obtener una secuencia idéntica al pepsinógeno
a partir del flanco 3' de la deleción de 118 pb.
Figura 2. Esquema de la construcción del
plásmido pBP01. Las secuencias correspondientes a los vectores
pCMV-SPORT6 y pBlueScript S K- aparecen en colores
gris y negro respectivamente. La secuencia de cDNA del gen de la
pepsina bovina aparece en blanco o a rayas, dependiendo del clon
original del que se haya obtenido. La deleción en el cDNA del clon
pBPl10 se representa por una línea de puntos.
Figura 3. Esquema de la construcción del
plásmido pBP03. Las secuencias correspondientes a los vectores
pIN-III(Ippp-5)A3 y
pBlueScript SK- aparecen en colores gris y negro respectivamente.
La punta de flecha indica el sentido de transcripción a partir del
promotor en el plásmido
pIN-III(Ippp-5)A3. La
secuencia de cDNA sintético que codifica el
metionil-pepsinógeno aparece como una flecha
blanca.
Figura 4. Esquema de la construcción de los
plásmidos pBP04y pBP05. Las secuencias correspondientes a los
vectores pYES2 y pBlueScript SK- aparecen en colores gris y negro
respectivamente. La punta de flecha indica el sentido de
transcripción a partir del promotor GAL1 en el plásmido
pYES2. La secuencia de cDNA sintético que codifica el
metionil-pepsinógeno aparece como una flecha
blanca. La secuencia que codifica el péptido señal del factor alfa
aparece como un rectángulo rayado.
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
\hskip1cmGonzález García, Ramón
\hskip1cmGarcía López, José Luis
\hskip1cmMuñoz Moreno, Rosario
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PEPSINA Y PEPSINÓGENO BOVINOS
RECOMBINANTES PRODUCIDOS EN CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> pepsina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus (synthetic)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> polyA_signal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1285)..(1290)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (139)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pepsin
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1116)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pepsinogen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus (synthetic)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 372
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus (synthetic)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pepsin
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cDNA-PB3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Multiple cloning site of the plasmid
BlueScript SK-
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgggctgc agaattcatg tctgttgtca agatcccact cgtcaaaaag aagtcc
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cDNA-PB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggcggcct cccggatg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xba-PB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagagg gtattaataa tgagcgtcgt caaaatccca ctcg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hind-PB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaagctta gttagctatt aggccacggg agccaggccg
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BP05A
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Multiple cloning site of the plasmid
YES2 (Invitrogen)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N-terminal of the
signal peptide of alpha factor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaatattaa gcttggtacc gagctcgaat tcatgagatt tccttcaatt tttactgc
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> BP05B
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> N_region
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N-t of
pepsinogen
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19) .. (40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> C-terminal of the
signal peptide of alpha factor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcttgaca acagacatag cttcagcctc tcttttatcc
\hfill40
Claims (15)
1. Un ácido nucleico aislado cuya secuencia de
nucleótidos se selecciona entre:
- a)
- la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1; que codifica para pepsina bovina.
- b)
- una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos comprendida entre el nucleótido 139 y el nucleótido 1.119 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1, que codifica la pepsina bovina madura cuya secuencia de aminoácidos está comprendida entre el aminoácido +1 y el aminoácido +326 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2;
- c)
- una secuencia de nucleótidos como la definida en a) que comprende unos cambios conservativos en dicha secuencia, en donde dichos cambios consisten en mutaciones, inserciones o deleciones introducidas en dicha secuencia definida en a), conservando la secuencia resultante la funcionalidad de codificar la pepsina bovina madura; y
- d)
- una secuencia de nucleótidos como la definida en b) que comprende unos cambios conservativos en dicha secuencia, en donde dichos cambios consisten en mutaciones o inserciones introducidas en dicha secuencia definida en b), conservando la secuencia resultante la funcionalidad de dicha secuencia de nucleótidos definida en b) de codificar la pepsina bovina madura.
2. Un vector que comprende un ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 1.
3. Vector según la reivindicación 2,
caracterizado porque es el plásmido pBP01 depositado en la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con el número de acceso
CECT 5722.
4. Vector según la reivindicación 2,
caracterizado porque es un vector de expresión.
5. Vector según la reivindicación 4,
seleccionado entre el plásmido pBP03 depositado en la CECT con el
número de acceso CECT 5723 y el plásmido pBP05 depositado en la
CECT con el número de acceso CECT 11778.
6. Una célula transformada con un vector según
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
7. Célula según la reivindicación 6,
transformada con un vector según cualquiera de las reivindicaciones
4 ó 5.
8. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ú 7, seleccionada entre células de bacteria y
células de levadura.
9. Célula según la reivindicación 8,
seleccionada entre células de Escherichia coli y células de
Saccharomyces cerevisiae.
10. Un procedimiento para la producción de
pepsinógeno bovino recombinante que comprende cultivar una célula
transformada según la reivindicación 7 bajo condiciones que
permiten la producción de pepsinógeno bovino.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha célula transformada es una célula de Escherichia
coli transformada con el plásmido pBP03 depositado en la CECT
con el número de acceso CECT 5723.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicha célula transformada es una célula de Saccharomyces
cerevisiae transformada con el plásmido pBP05 depositado en la
CECT con el número de acceso CECT 11778.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12 que comprende, además, el procesamiento
del pepsinógeno bovino recombinante obtenido para obtener pepsina
bovina recombinante.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que dicho procesamiento comprende la acidificación de una
solución que contiene pepsinógeno bovino recombinante.
15. Una proteína recombinante, seleccionada
entre
- a)
- pepsinógeno bovino recombinante cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ. ID. NO: 2,
- b)
- pepsina bovina madura recombinante cuya secuencia de aminoácidos está comprendida entre el aminoácido +1 y el aminoácido +326 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 2, y
- c)
- una proteína como la definida en a) o en b) que comprende, al menos, la secuencia de aminoácidos de la pepsina bovina madura o cambios conservativos en dicha secuencia que conserven su funcionalidad, en donde dichos cambios consisten en mutaciones, inserciones o deleciones,
obtenida según el procedimiento de cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 14.
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| ES200300179A ES2247872B1 (es) | 2003-01-24 | 2003-01-24 | Pepsina y pepsinogeno bovinos recombinantes producidos en celulas procariotas y eucariotas. |
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