ES2294033T3 - Fosfatina alcalina de camaron. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID nº 1 o la secuencia complementaria de dicha secuencia, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una fosfatasa alcalina térmicamente inestable.
Description
Fosfatasa alcalina de camarón.
La presente invención se refiere a moléculas de
ácidos que codifican la enzima fosfatasa alcalina.
La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1. 3.1), con los
nombres alternativos fosfomonoesterasa alcalina, fosfomonoesterasa
o glicerofosfatasa, son fosfohidrolasas de monoéster ortofosfórico
con una actividad enzimática óptima en condiciones alcalinas.
Ejemplos de fosfatasa alcalina (ALP - siglas en inglés) son ADN, ARN
y ribo-, así como
desoxirribo-nucleósido-trifosfatos.
La hidrólisis produce un alcohol y un ortofosfato. En otras
palabras, las ALFs desfosforilan ADN, ARN, rNTPs y dNTPs. También
se ha reseñado la desfosforilación de proteínas por parte de
diversas ALPs. Las ALPs están repartidas por la naturaleza,
encontrándose en organismos que oscilan desde bacterias a seres
humanos. Organismos complejos contienen, habitualmente, ALFs tanto
específicas como no específicas para el tejido. Los polipéptidos
difieren en tamaño de 15 a 170 kDa. Algunas de estas proteínas
están unidas o "ancladas" a membranas celulares. Lo más
comúnmente, las enzimas tienen una necesidad por cationes de
metales divalentes tales como Mg^{2+} o Zn^{2+}.
El actual uso de ALPs en biología molecular se
enfoca, pero no se limita a tres aplicaciones principales del
análisis o la preparación de ADN: 1) desfosforilación del ADN vector
tras digestiones de enzimas de restricción para minimizar el
auto-ligamientos del vector de clonación,
favoreciendo así el ligamiento del inserto al vector y creando una
construcción recombinante, 2) desfosforilación de dNTPs después de
amplificaciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), en
uso combinado con una exonucleasa de cadena sencilla que hidroliza
cebadores para dar dNTPs, para omitir la necesidad de una limpieza
adicional antes de la secuenciación directa de ADN de productos de
la PCR, ó 3) desfosforilación de extremos de ADN para el
subsiguiente marcaje con ^{32}P utilizando
[\gamma-^{32}P]NTP y T4 polinucleótido
cinasa. Las reacciones de la enzima ALP descritas son etapas
intermedias en procedimientos de análisis del ADN. Otras importantes
aplicaciones conocidas en la técnica incluyen aquellas en las que
las actividades de la enzima se utilizan como informadores, tal como
en el análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA - siglas en
inglés), en sistemas de fusión de genes o de suministro de genes o
en conjugación con oligonucleótidos utilizados como sondas de
hibridación.
En productos comercialmente disponibles se
utilizan tres ALPs principales:
- i)
- fosfatasa alcalina del intestino de terneros (CIAP - siglas en inglés)
- ii)
- fosfatasa alcalina de camarones (SAP - siglas en inglés) del camarón ártico Pandalus borealis
- iii)
- fosfatasa alcalina bacteriana (BAP - siglas en inglés)
Las enzimas CIAP y SAP animales tienen
actividades específicas similares de 2000-4000
unidades/mg de proteína, en comparación con 50 unidades/mg de
proteína BAP, que hace a las dos enzimas anteriores más atractivas
en calidad de enzimas eficaces. La enzima SAP es inactivada por un
calor moderado tal como se comenta más abajo y, así, se prefiere
para varias aplicaciones en las que la actividad de la enzima
necesita ser eliminada antes de etapas adicionales en los
procedimientos.
Se informó de un mutante de la BAP tratado por
ingeniería genética y sensible a la temperatura [Shandilya, H. y
Chatterjee, D.K., 1995. An engineered thermosensitive alkaline
phosphatase for dephosphorylating DNA. Focus, 17 (3):
93-95], no dándose detalles para describir la
ingeniería. Esta enzima mutante (TsAP), vendida por
LifeTechnologies, Inc., es inactivada (95% o más) por el calor (65ºC
durante 15 min), en presencia solamente de EDTA. La temperatura de
reacción recomendada para el mutante y la enzima de tipo salvaje es
también 65ºC. TsAP tiene una actividad al menos 40 veces mayor que
la BAP de tipo salvaje. Con referencia a la alta actividad
específica, TsAP es casi equiparable a otras ALPs tales como CIAP y
SAP.
Se han purificado y caracterizado dos ALPs
térmicamente lábiles a partir de un microorganismo psicrofílico (de
Prada, P. y Brenchley, J.E., 1997, Purification and characterization
of two extracellular alkaline phosphatases from a psycrophilic
Arthrobacter isolate. Appl. Env. Microbiol., 63(7):
2928-2931]. Las enzimas que variaban con respecto a
las especificidades y propiedades cinéticas del sustrato, exhibían
diferentes inestabilidades térmicas de las cuales la más lábil se
asemeja a la inestabilidad de la enzima SAP. No se informó de
ninguna actividad específica en unidades/mg de proteína ni de
estructuras primarias.
Se aisló y caracterizó una ALP adaptada al frío
de bacalao del Atlántico [Ásgeirsson, B., Hartemink, R. y
Chlebowski, J. F., 1995, Alkaline phosphatase from atlantic cod
(Gadus morhua). Kinetic and structural properties which indicate
adaption to low temperatures. Comp. Biochem. Physiol.,
110B(2): 315-329]. La enzima mostró una
inestabilidad térmica similar a SAP. No se proporcionó ninguna
estructura primaria de la proteína/gen.
Un estudio de isozimas ALP de trucha [Whitmore,
D.H. y Goldberg, E., 1972, Trout intestinal alkaline phosphatases
II. The effect of temperature upon enzymatic activity in
vitro and in vivo. J. Exp. Zool., 182:
59-68] demostró que las temperaturas del entorno
afectan al modelo de isozima y que algunas isoformas son
térmicamente inestables.
Camarones de la región de aguas calientes fuera
de Taiwan contienen varias ALPs [Lee, A.-C. y Chuang, N.-N., 1991,
Characterization of different molecular forms of alkaline
phosphatase in the hepatopancreas fropm shrimp Penaeus
monodon (Crustáceos: Depacoda). Comp. Biochem. Physiol.,
998(4): 845-850], y se sacó la conclusión
que las enzimas eran térmicamente estables. No se proporcionaron
estructuras primarias.
Se encontró que una actividad de fosfatasa
alcalina del hepatopáncreas del camarón del Ártico Pandalus
borealis estaba contenida en las aguas residuales de
procesamiento de la industria de los camarones [Olsen, R.L.,
Johansen, A. y Myrnes, B., 1990, Recovery of enzymes from shrimp
waste. Process Biocehm. 25:67-68], y la enzima fue
purificada más tarde del hepatopáncreas [Olsen, R.L., Øverbø, K. y
Myrnes, B., 1991, Alkaline phosphatase from hepatopancreas of
shrimp (Pandalus borealis): a dimeric enzyme with
catalytically active subunits. Comp. Biochem. Physiol.
99B(4): 755-761]. Esta proteína purificada
tenía un peso molecular aparente de 65 kDa (cada subunidad) y
demostró ser una enzima dimérica con subunidades catalíticamente
activas en contraposición a la mayoría de otras ALPs de animales
que requieren una dimerización para la actividad. De acuerdo con el
informe, la SAP tiene un punto isoeléctrico de 3,7. La enzima de
camarón separa eficazmente el fosfato 5' terminal de cualesquiera
extremos de la cadena de ADN (extremos 5' y 3' colgantes o romos)
producidos por endonucleasas de restricción, a pesar de que los
extremos 5' sobresalientes son más reactivos que los extremos romos
o los extremos 5' recesivos.
Con relación a la CIAP, la enzima SAP tiene un
ligero desplazamiento a temperaturas más bajas para la actividad,
pero no se considera que sea ciertamente activa al frío. Con una
actividad de enzima máxima a aproximadamente 40ºC (45ºC para CIAP),
casi el 40% de la actividad es retenida a 10ºC o a 50ºC, en
comparación con una actividad de 10% y 90%, respectivamente, para
la CIAP. Aunque la temperatura para la actividad máxima es próxima a
40ºC, la enzima SAP comienza a perder actividad cuando se
pre-incuba durante un periodo de 15 min más allá de
37ºC. Después de pre-incubación a 65ºC, la
actividad de la SAP se reduce en un 95% o más, y la actividad es
indetectable después de la pre-incubación a 70ºC.
En comparación, después de tratamientos térmicos similares, la CIAP
retiene un 40% y un 20% de su actividad.
Así, con relación a su competidor comercial, la
enzima SAP es térmicamente inestable y activa al frío, haciéndola
particularmente adecuada para uso en protocolos de laboratorio de
múltiples etapas, en que una simple etapa de calentamiento puede
desactivar la enzima, de modo que no forma parte en etapas
ulteriores del método.
BIOTEC ASA, Tromsø, Noruega, produce la enzima
SAP comercial a partir de las aguas residuales de la industria de
los camarones. A bordo de los pesqueros de arrastre, los camarones
recién recogidos son congelados en grandes bloques. Al desembarcar,
los camarones son descongelados cuidadosamente mediante agua fría
recirculada. Se utilizan aproximadamente 1000 l de agua para 4000
kg de camarones, Durante el proceso de congelación y
descongelación, el hepatopáncreas de los camarones se parte y el
contenido se liberan al agua. Luego se concentran las aguas
residuales y se utilizan varias etapas cromatográficas para
purificar la enzima SAP.
El productor suministra la SAP para el mercado
mundial a través de compañías bien conocidas tales como USB,
Boehringer-Mannheim o Amersham Pharmacia
Biotech.
Debido a su alta actividad específica, su
"versatilidad" en relación con sus extremos de ADN y su
inestabilidad a la temperatura relativa, la SAP se utiliza
frecuentemente en la desfosforilación de vectores de clonación
antes de reacciones de ligamiento, y en el tratamiento de mezclas de
productos de amplificación por PCR, antes de las reacciones de
secuenciación del ADN, tal como se describe en las patentes de
EE.UU. 5.741.676 y 5.756.285.
La actual producción de la SAP padece de una
calidad variable de las aguas residuales, que de nuevo afecta a la
eficacia de producción. Dos factores provocan esta variación; i)
variación estacional natural de la producción de enzimas en los
camarones; y ii) la manipulación de la fuente de camarones antes de
o durante la congelación y la manipulación de los camarones o del
agua durante o después del proceso de descongelación.
Existe también una preocupación sobre la
disponibilidad futura de las aguas residuales; i) como fuente
natural, no se garantiza que los camarones estén disponibles en
todo momento; y ii) la industria de los camarones busca ahora
posibles nuevas vías para congelar los camarones, es decir
congelación sencilla, en la que se ha sometido a ensayo que las
aguas residuales contienen pequeñas cantidades de enzimas tales como
SAP.
Además de estos problemas prácticos, el mercado
demanda un producto de SAP recombinante, ya que los productos
recombinantes se prefieren con frecuencia en las técnicas de
biología molecular, particularmente en que es una cuestión la
pureza del producto, por ejemplo en la producción de productos
terapéuticos basados en ADN o en la ciencia forense. La SAP tiene
propiedades enzimáticas y fisioquímicas muy ventajosas y es una
enzima preferida para los protocolos de laboratorio en los que es
útil. Por lo tanto, existe una apreciable necesidad de una fuente
sintética o recombinante de SAP, la cual se produce de una manera
uniforme y pura. Sin embargo, no se han dilucidado previamente
secuencias ni de ADN ni de aminoácidos para SAP.
Con el fin de aislar el gen y de clonar y
producir subsiguientemente una SAP recombinante se han realizado
varios intentos para obtener una secuencia
N-terminal de la proteína purificada. No ha tenido
éxito ninguno de estos intentos. Los análisis de la secuencia han
revelado múltiples (cuatro o más) aminoácidos alternativos para
cada posición N-terminal específica. Así, no ha
estado disponible información alguna de la secuencia de la proteína
para uso, incluso con sondas de oligonucleótidos altamente
degeneradas, para buscar el gen de SAP. Solamente se puede
especular sobre la o las razones de los extremos N no homólogos en
una preparación de enzimas aparentemente homogénea. Es posible que
las isoformas de SAP sean producidas por diferentes genes, mediante
corte y empalme alternativo o variando modificaciones
post-traducción de la proteína, o que la SAP sea
atacada por proteasas en el extremo N, sin ninguna reducción
detectable en el peso molecular.
Se ha encontrado por parte de los autores de
esta invención que la homología limitada entre la fosfatasa alcalina
del hepatopáncreas de camarones árticos (Pandalus borealis)
y fosfatasa alcalina de especies que han sido secuenciadas, evita
el aislamiento rutinario de secuencias de ácidos nucleicos que
codifican fosfatasa alcalina de Pandalus borealis.
A pesar de estas dificultades reales para
obtener un consenso coherente de la secuencia de aminoácidos para
la SAP, los autores de esta invención han sido capaces,
sorprendentemente, de aislar un ADNc que codifica SAP a partir de
una genoteca de ADNc de Pandalus borealis y, así, dilucidar
la secuencia codificante de SAP. La invención se refiere a la
provisión de una fuente alternativa de la enzima.
La secuencia de SEQ ID nº 1 corresponde a la
secuencia completa de ADNc de la enzima, menos una pequeña parte en
el extremo 5'. No obstante, se piensa que el producto de expresión
de una molécula de ácido nucleico que comprende esta secuencia
tiene toda la proporción, o al menos una proporción significativa
(es decir, al menos 60%, 70%, 80% o, típicamente, al menos 90%) de
la actividad de la enzima nativa. Los pocos aminoácidos
N-terminales que se apartan de esta secuencia no
contienen sitios de unión para el sustrato o cofactor.
Por lo tanto, una referencia en esta memoria a
SAP o a una fosfatasa alcalina térmicamente inestable se considera
que incluye también moléculas que son más pequeñas que ALPs que se
producen en la naturaleza, pero que tienen la misma o esencialmente
la misma actividad. Ventajosamente, productos de expresión de este
tipo y otras enzimas ALP recombinantes de acuerdo con la invención
pueden tener una actividad mayor que la enzima nativa según se
aísla. Preferiblemente, la actividad específica es mayor que el
valor publicado para SAP de 1900 U mg^{-1}. En esta memoria se
describe un ensayo adecuado para la actividad enzimática [Olsen
et al.].
Así, en un aspecto, la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID nº 1 o la
secuencia complementaria de dicha secuencia, en donde dicha
secuencia de nucleótidos codifica o es complementaria a una
secuencia que codifica una fosfatasa alcalina térmicamente
inestable.
Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención puede, así, ser ADN, ADNc o ARN de cadena sencilla o
doble.
Una molécula de ácido nucleico de la invención
puede ser una molécula de ácido nucleico aislada (en otras
palabras, aislada o separada de los componentes con los que
normalmente se encuentra en la naturaleza) o puede ser una molécula
de ácido nucleico recombinante o sintética.
Se hace referencia en esta memoria a secuencias
que consisten esencialmente en la secuencia de SEQ ID nº 1 y sus
variantes. Así, pueden estar también presentes regiones flanqueantes
en cualquier extremo. En particular, puede estar presente una
región flanqueante 5' de 1 a 81 ó 1-60 nucleótidos,
más particularmente 1-30 nucleótidos, que pueden
incorporar una secuencia de señalización para dirigir el tratamiento
de la forma natural activa de la enzima durante la
transcripción/traducción. Regiones flanqueantes 3' contendrán,
típicamente, 1-60, por ejemplo 1-30
nucleótidos adicionales.
El complemento de una secuencia dada será una
secuencia sencilla precisa que se puede determinar de acuerdo con
las reglas normales del apareamiento de bases.
Una secuencia de nucleótidos que codifica una
fosfatasa alcalina térmicamente inestable puede tener al menos un
65%, más preferiblemente al menos un 75%, por ejemplo al menos un
85% o al menos un 95% de identidad de la secuencia con la SEQ ID nº
1 o su complemento. De igual manera, una secuencia de nucleótidos de
este tipo puede hibridarse preferiblemente bajo condiciones
estrictas a SEQ ID nº 1 o su complemento. La presente invención se
basa en la identificación de la secuencia de aminoácidos y la
secuencia de ADNc para SAP. Se entiende bien en la técnica que
existirán o se pueden generar variantes de estas secuencias, por
ejemplo variantes alélicas y secuencias relacionadas modificadas
por sustitución, adición o deleción de bases, sencilla o múltiple,
que sean funcionalmente equivalentes a las secuencias recientemente
identificadas.
Una fosfatasa alcalina eucariótica térmicamente
inestable es codificada por la molécula de ácido nucleico de la
presente invención. Derivados de esta enzima pueden incorporar
sustituciones conservativas de aminoácidos, debido a que
aminoácidos procedentes de la enzima que se produce de forma natural
pueden ser reemplazados por aminoácidos con características
funcionales similares en términos, por ejemplo, de tamaño,
lipofilicidad y polaridad. Grupos de aminoácidos funcionalmente
relacionados de este tipo son comprendidos por el experto en la
técnica. También pueden estar incluidas adiciones, deleciones o
sustituciones adicionales que no afectan significativamente a la
actividad catalítica de la enzima. Típicamente, los derivados de la
enzima tendrán 1-50, preferiblemente
1-30, por ejemplo 1-15 alteraciones
no conservativas en comparación con la enzima nativa.
Por "funcionalmente equivalente" se quiere
dar a entender secuencias de ácidos nucleicos que codifican
polipéptidos (o los polipéptidos propiamente dichos) con actividad
de fosfatasa alcalina, preferiblemente con una actividad específica
similar o mayor en comparación con la enzima nativa aislada de las
aguas residuales del procesamiento de Pandalus borealis. En
otras palabras, secuencias de ácidos nucleicos funcionalmente
equivalentes codifican polipéptidos que pueden catalizar la
separación de grupos 5' fosfato terminales a partir de extremos de
las cadenas de ADN (extremos colgantes o romos 5' y 3') producidos,
por ejemplo, por endonucleasas de restricción.
Variaciones en la secuencia de nucleótidos que
codifican fosfatasa alcalina pueden producirse entre diferentes
poblaciones de Pandalus borealis dentro de las especies,
entre poblaciones similares de diferente origen geográfico y
también dentro del mismo organismo.
Para los fines de definir el nivel de severidad,
una severidad media comprende una hibridación y/o un lavado llevado
a cabo en tampón 0,2 x SSC - 2 x SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 42ºC hasta
65ºC, mientras que una severidad elevada comprende una hibridación
y/o un lavado llevado a cabo en tampón 0,1 x SSC - 0,2 x SSC, SDS al
0,1% (p/v) a una temperatura de al menos 55ºC. Las condiciones para
hibridaciones y lavados son bien comprendidos por un experto normal
en la técnica.
Se pueden obtener secuencias de nucleótidos que
se hibridan a SEQ ID nº 1 o su complemento, o a partes de los
mismos (es decir, a sondas de hibridación derivadas de SEQ ID nº 1),
bajo condiciones de alta severidad y que, preferiblemente,
codifican o son complementarios a una secuencia que codifica una
enzima fosfatasa alcalina o parte de la misma. Condiciones de alta
severidad se pueden determinar fácilmente de acuerdo con técnicas
bien conocidas en la técnica según se describe, por ejemplo, en
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª edición. Secuencias hibridantes incluidas dentro del
alcance de la invención son las que se unen bajo condiciones no
estrictas (6 x SSC/formamida al 50% a la temperatura ambiente) y se
lavan en condiciones de alta severidad (por ejemplo 0,1 x SSC,
68ºC), en que SSC = NaCl 0,15 M, citrato de sodio 0,015 M, pH
7,2.
Una sonda de hibridación puede ser una parte de
la secuencia SEQ ID nº 1 (o secuencia complementaria) que tiene una
longitud de bases y una composición suficientes para que funcione
para que se hibride a la muestra o a secuencias de ácido nucleico
de ensayo, para determinar si se produce o no una hibridación bajo
condiciones de alta severidad. Así, la sonda puede tener una
longitud de al menos 15 bases, preferiblemente una longitud de al
menos 30, 40, 50, 75, 100 ó 200 bases. Longitudes representativas de
la sonda incluyen, así, 30-500 bases, por ejemplo
30-300, 50-200,
50-150, 75-100.
La identidad de la secuencia de nucleótidos se
puede determinar utilizando el programa BestFit del paquete de
software de Genetics Computer Group (GCG) versión 10 de la
Universidad de Wisconsin. El programa utiliza el algoritmo de
homología local de Smith y Waterman con los valores por defecto:
penalidad por creación del intervalo = 50, penalidad por extensión
del intervalo = 3, emparejamiento medio = 10.000, mal emparejamiento
medio = -9.000.
Métodos para producir variantes de las
secuencias específicas recogidas en esta memoria, por ejemplo
mediante mutagénesis dirigida al lugar, mutagénesis aleatoria o
escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos son bien
conocidos en la técnica, como lo son métodos para determinar si el
ácido nucleico, así modificado, tiene una homología significativa
con la secuencia sujeto, por ejemplo por hibridación.
Se describe en esta memoria una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica o es complementaria a una
secuencia que codifica una fosfatasa alcalina térmicamente
inestable, comprendiendo dicha fosfatasa alcalina la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID nº 2 o variantes de dicha secuencia de
aminoácidos que son al menos en un 50%, de preferencia al menos en
un 60%, por ejemplo al menos en un 70% u 80% idénticas a ella.
Se describe en esta memoria un ADNc,
preferiblemente derivado de Pandalus borealis, que codifica
una fosfatasa alcalina térmicamente inestable que comprende la
secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID nº 2) o una
variante o fragmento de la misma, que es térmicamente inestable y
que tiene actividad de fosfatasa alcalina.
Se puede obtener un ADNc, de preferencia
derivado de Pandalus borealis que codifica una fosfatasa
alcalina térmicamente inestable que consiste en una secuencia de
aminoácidos de la que uno o más residuos aminoácidos se suprimen,
se sustituyen con o se añaden a la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID nº 2.
Un polipéptido codificado por una molécula de
ácido nucleico de la invención según se define en esta memoria. La
provisión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la
invención permite, así, obtener enzimas fosfatasa alcalina
recombinantes y variantes de las mismas en cantidades y con una
pureza previamente no disponible, permitiendo con ello un
suministro sostenible de la enzima en una forma que puede fabricarse
totalmente bajo condiciones controladas o de acuerdo con
condiciones certificables según se especifica en cada momento.
Se pueden obtener polipéptidos recombinantes que
comprenden (o consisten esencialmente en) una secuencia de
aminoácidos que constituye una enzima fosfatasa alcalina
térmicamente inestable codificada por la secuencia de nucleótidos
tal como se muestra en la figura 1 (SEQ ID nº 1) o una variante
funcionalmente equivalente de la misma.
El término "polipéptido", tal como se
utiliza en esta memoria, incluye tanto proteína de longitud completa
como secuencias de péptidos más cortas.
"Funcionalmente equivalente", tal como se
utiliza antes en relación con las secuencias de aminoácidos de
polipéptidos, define polipéptidos relacionados con o derivados de
las secuencias de polipéptidos antes mencionadas, en que la
secuencia de aminoácidos ha sido modificada por una sustitución,
adición o deleción de aminoácidos sencilla o múltiple, y también
secuencias en que los aminoácidos han sido químicamente modificados,
incluido por glicosilación o desglicosilación, pero que, no
obstante, conservan actividad catalítica. Variantes funcionalmente
equivalentes de este tipo pueden producirse en forma de variaciones
biológicas naturales, o se pueden preparar utilizando técnicas
conocidas, por ejemplo polipéptidos recombinantes funcionalmente
equivalentes se pueden preparar utilizando las técnicas conocidas
de mutagénesis dirigida al lugar, mutagénesis aleatoria o escisión
enzimática y/o ligamiento de aminoácidos.
Los polipéptidos sintéticos se pueden preparar
mediante expresión en una célula hospedante que contiene una
molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de
nucleótidos según se describe antes ampliamente, operativamente
enlazada a una secuencia del control de la expresión, o un vehículo
de clonación o vector de ADN recombinante que contiene una molécula
de ADN recombinante de este tipo, por ejemplo un plásmido, cósmido,
molécula bacteriófaga o cromosoma artificial de levaduras.
Alternativamente, los polipéptidos pueden ser expresados por
inyección directa de una molécula de ADN desnudo de acuerdo con la
invención en una célula hospedante.
El polipéptido sintético, así expresado, puede
ser un polipéptido de fusión que comprende una porción
catalíticamente funcional de una enzima fosfatasa alcalina y un
polipéptido adicional codificado por el ADN de la molécula
recombinante fusionada a ella. Por ejemplo, puede ser deseable
producir una proteína de fusión que comprende una fosfatasa
alcalina sintética u otro polipéptido de acuerdo con la invención
acoplado a una proteína tal como
\beta-galactosidasa, fosfatasa,
glutatión-S-transferasa, ureasa y
similares. La mayoría de las proteínas de fusión se forman mediante
la expresión de un gen recombinante, en el que dos secuencias
codificantes han sido unidas entre sí con marcos de lectura en
fase. También puede ser deseable fusionar péptidos sintéticos de
este tipo a proteínas o péptidos con una función de unión de
ligandos, por ejemplo anticuerpos, para producir, por ejemplo,
anticuerpos informadores enlazados a enzimas, como es bien conocido
en la técnica. Todos los derivados de fusión o híbridos de este
tipo de moléculas de ácidos nucleicos que codifican fosfatasa
alcalina y sus secuencias de aminoácidos respectivas quedan
abarcados por la presente invención. Técnicas de expresión de ADN y
de polipéptidos recombinantes adecuadas de este tipo se describen,
por ejemplo, en Sambrook et al., 1989. Alternativamente, los
polipéptidos se pueden producir por medios químicos, tal como el
proceso de síntesis en fase sólida de Merrifield bien conocida.
Más particularmente, se puede obtener un
polipéptido recombinante que comprende (o consiste esencialmente
en):
(a) la totalidad o parte de una secuencia de
aminoácidos según se muestra en SEQ ID nº 2; o
(b) la totalidad o parte de una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad de la secuencia
con la totalidad o parte de SEQ ID nº 2.
El término "recombinante" distingue estas
moléculas de polipéptidos que se producen en la naturaleza y
significa que la molécula ha sido generada utilizando una
"tecnología de ADN recombinante", una frase bien entendida en
la técnica. Se piensa que la enzima con la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID nº 2 es una versión truncada de la enzima que se produce
en la naturaleza en Pandalus borealis y, por lo tanto, si el
correspondiente ácido nucleico se utiliza en la producción
recombinante, entonces la enzima recombinante producida no será, en
cualquier caso, la misma que la molécula no recombinante, producida
de forma natural.
En particular, la secuencia de aminoácidos puede
exhibir al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% de
identidad con el polipéptido de SEQ ID nº 2. Alternativamente, la
secuencia de aminoácidos puede exhibir al menos un 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, 95% ó 98% de similitud con el polipéptido de SEQ ID nº
2.
En particular, se pueden producir variaciones en
el extremo N. Los polipéptidos también pueden incluir
4-20, por ejemplo 5-10 aminoácidos
adicionales en el extremo N. Debe también señalarse que la secuencia
incompleta de ADNc de SEQ ID nº 1 corresponde a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID nº 2, pero comienza solamente en el residuo
7, ácido aspártico. En el polipéptido recombinante pueden producirse
variaciones de aminoácidos, en particular sustituciones en los
primeros 6 aminoácidos en comparación con la secuencia dada en la
fig. 2. Además, el residuo lisina N-terminal de la
fig. 2 puede ser reemplazado por arginina.
Se puede generar una secuencia de ADNc
correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 2, y ésta
se constituye por la SEQ ID nº 1 junto con la secuencia de
nucleótidos derivada en el extremo 5'. Esta región es proporcionada
también, en su mayor parte, por el cebador delantero de SEQ ID nº 7,
derivada ella misma de un fragmento secuenciado de SAP nativa.
Debido a la degeneración del código genético, no es posible
especificar, a partir de los aminoácidos KAYWNK, la secuencia con
mayor precisión que AArGCnTAyTGGAAyAAAr [SEQ ID nº 19], en donde r
= A o G, n = T, C, A o G e y = C o T. A la secuencia completa del
ADNc correspondiente a SEQ ID nº 2, que comprende SEQ ID nº 19 y
SEQ ID nº 1, se alude en esta memoria como SEQ ID nº 20.
Sin embargo, el trabajo de secuenciación llevado
a cabo como parte del Ejemplo 4, ha establecido la secuencia de
ADNc completa para la fosfatasa alcalina de Pandalus
borealis. Así, se han resuelto las incertidumbres discutidas
anteriormente con respecto a SEQ ID nº 19, y el ADNc que codifica
KAYWNK es como sigue: AAAGCATATTG
GAACAAA [SEQ ID nº 21]. Esta secuencia puede reemplazar a SEQ ID nº 19 dentro de SEQ ID nº 15 para producir, junto con la parte de SEQ ID nº 17 que codifica la secuencia de aminoácidos NPITEED, codificando la secuencia de ADNc precisa la enzima recombinante. A esta secuencia completa se alude como SEQ ID nº 22.
GAACAAA [SEQ ID nº 21]. Esta secuencia puede reemplazar a SEQ ID nº 19 dentro de SEQ ID nº 15 para producir, junto con la parte de SEQ ID nº 17 que codifica la secuencia de aminoácidos NPITEED, codificando la secuencia de ADNc precisa la enzima recombinante. A esta secuencia completa se alude como SEQ ID nº 22.
La identidad o similitud de la secuencia de
aminoácidos se puede determinar utilizando el programa BestFit del
paquete de software de Genetics Computer Group (GCG) versión 10 de
la Universidad de Wisconsin. El programa utiliza el algoritmo de
homología local de Smith y Waterman con los valores por defecto:
penalidad por creación del intervalo = 8, penalidad por extensión
del intervalo = 2, emparejamiento medio = 2.912, mal
emparejamiento
medio = -2. 003.
medio = -2. 003.
Una "parte" de la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID nº 2 o sus variantes, según se define antes, puede
comprender al menos 20 aminoácidos contiguos, de preferencia al
menos 30, 40, 50, 70, 100, 150, 200, 300, 400 ó 450 aminoácidos
contiguos. Partes con más de 200, en particular más de 300
aminoácidos pueden considerarse "partes significativas", y
partes de este tipo tendrán típicamente el sitio de actividad
enzimática tal como se identifica en esta memoria y, de
preferencia, el sitio de unión del co-factor.
El polipéptido recombinante es, de preferencia,
funcionalmente activo de acuerdo con las definiciones antes dadas,
por ejemplo es enzimáticamente activo. Alternativamente, puede no
ser por sí mismo funcionalmente activo, pero puede proporcionar
regiones con propiedades funcionales del conjunto, por ejemplo puede
representar el sitio activo o el sitio de unión del
co-factor requerido para la actividad
enzimática.
Como se ha discutido antes, la SEQ ID nº 1 y la
SEQ ID nº 2 no corresponden a la secuencia completa de ADNc o de
aminoácidos de la SAP nativa. Los polipéptidos truncados que exhiben
la misma o esencialmente la misma actividad enzimática que la SAP
nativa y conservan esa inestabilidad térmica de la enzima
constituyen un aspecto adicional de la presente invención. Se
pueden obtener las moléculas de ADNc completas o los polipéptidos
recombinantes que incorporan las secuencias truncadas definidas en
esta memoria o variantes funcionalmente equivalentes de las
mismas.
mismas.
Se puede obtener un polipéptido con la misma o
esencialmente la misma actividad catalítica y propiedades térmicas
que SAP, pero que carece de su región N-terminal.
Preferiblemente, estos polipéptidos carecen del aminoácido
N-terminal y 2-50, de preferencia
5-30, por ejemplo 5-10 aminoácidos
que están adyacentes al mismo en la enzima nativa. Por
"esencialmente la misma actividad catalítica" se quiere dar a
entender que el polipéptido tiene al menos un 75%, preferiblemente
al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90% de la actividad
de SAP nativa. Aparte de estas partes N-terminales
ausentes, los polipéptidos tienen preferiblemente al menos un 60%,
65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% de identidad con el
polipéptido de SEQ ID nº 2.
Una fosfatasa alcalina se puede considerar
térmicamente inestable si su actividad catalítica es indetectable
después de pre-incubación a 65ºC durante 15,
preferiblemente 10 minutos.
Un ensayo adecuado para la actividad catalítica
de enzimas de la invención sigue al de Olsen et al. [R.L.
Olsen, K. Øverbø y B. Myrnes, (1991) Alkaline phosphatase from
hepatopancreas of shrimp (Pandalus borealis): a dimeric
enzyme with catalytically active subunits. Comp. Biochem. Physiol.
998: 755-761]. La actividad de fosfatasa alcalina
se determina incubando la enzima con 6 mM de fosfato de
p-nitrofenol a 37ºC en tampón glicina/NaOH 0,1 M pH
10,4 con 1 mM de MgCl_{2} y 1 mM de ZnCl, en un volumen total de
0,5 ml. Al cabo de 15 min, la reacción se detiene mediante 0,5 ml
de NaOH 2M y la cantidad de p-nitrofenol liberada
se determina midiendo al absorbancia a 405 nm (\varepsilon_{405}
= 18,5 mM^{-1} cm^{-1}). Una unidad de actividad de la enzima
producirá 1 \mumol de p-nitrofenol por min. La SAP
no se ve negativamente afectada por el zinc, y no existe una
demanda significativa de magnesio por encima de una concentración
mínima.
Variantes de SEQ ID nº 1 o SEQ ID nº 2 que
codifican o comprenden proteínas que conservan y exhiben las
propiedades catalíticas de SAP, pero que son térmicamente
inestables - es decir, no padecen una pérdida completa de actividad
después de calentamiento a 70ºC durante 15 min.
También se proporcionan métodos para preparar
moléculas de ácidos nucleicos recombinantes de acuerdo con la
invención, que comprenden insertar las moléculas de ácidos nucleicos
que contienen las secuencias de nucleótidos de la invención en otra
molécula de ácido nucleico, por ejemplo en un ácido nucleico vector,
por ejemplo ADN
vector.
vector.
Así, la invención proporciona, además, un vector
de expresión recombinante, que es un ADN vector que posee un
fragmento de ADN que comprende una cualquiera de las moléculas de
nucleótidos de la invención.
En el vector recombinante, el ADN vector es
capaz de propagación en una célula hospedante tal como
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae o Pichia
pastoris.
Vectores de expresión de la invención pueden
incluir secuencias control apropiadas tales como, por ejemplo,
elementos de control de la traducción (por ejemplo codones de inicio
y detención, sitios de unión ribosomales) y de la transcripción
(por ejemplo regiones de promotor-operador,
secuencias de detención de la terminación), enlazados en un marco
de lectura de emparejamiento con las moléculas de ácidos nucleicos
de la invención.
Vectores de acuerdo con la invención pueden
incluir plásmidos y virus (incluidos virus tanto bacteriófagos como
eucarióticos), de acuerdo con técnicas bien conocidas y documentadas
en la técnica, y se pueden expresar en una diversidad de sistemas
de expresión diferentes, también bien conocidos y documentados en la
técnica.
Se conoce una diversidad de técnicas y se pueden
utilizar para introducir vectores de este tipo en células
procarióticas o eucarióticas para la expresión, o en células de la
línea germinal o somáticas para formar animales transgénicos.
Técnicas de transformación o transfección adecuadas se describen
bien en la bibliografía.
Una construcción genética que comprende una
molécula de ácido nucleico de la invención según se define en esta
memoria, operativamente enlazada a una secuencia de promotor,
constituye un aspecto adicional de la presente invención.
La invención incluye también células hospedantes
procarióticas o eucarióticas, transformadas o transfectadas, u
organismos transgénicos no humanos que contienen una molécula de
ácido nucleico recombinante de acuerdo con la invención según se
define antes. Por conveniencia, en esta memoria no se hace
distinción alguna entre transformación y transfección. Células
hospedantes de este tipo pueden incluir, por ejemplo, células
procarióticas tales como E. coli, Streptomyces y
otras bacterias, células eucarióticas tales como levaduras (por
ejemplo, Pichia pastoris) o el sistema de
baculovirus-células de insectos, células de
mamíferos transformadas y animales transgénicos no humanos y
plantas. Se prefieren células hospedantes procarióticas.
Así, la invención proporciona también un
transformante, que es una célula transformada con el vector
recombinante de la invención.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona una célula u organismo recombinante que tiene una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos según se recoge en SEQ ID nº 1, y que expresa o es
capaz de expresar una fosfatasa alcalina térmicamente inestable. La
célula u organismo es "recombinante" debido a que contiene
material genético (en este caso que codifica una fosfatasa alcalina
térmicamente inestable) que no es nativo para ese organismo, así se
excluye el camarón Pandalus borealis, ya que expresa una
fosfatasa alcalina térmicamente inestable, el gen, por lo tanto, se
encuentra de forma natural en esa especie.
Visto de manera alternativa, la célula u
organismo que expresa una fosfatasa alcalina térmicamente inestable
puede considerarse "modificado", en el sentido de que dicha
célula u organismo de ese genotipo o fenotipo no existe en la
naturaleza. Así, la célula u organismo puede también denominarse una
célula u organismo que se produce de forma "no natural",
debido a la presencia en él de material genético no nativo y su
capacidad de producir una proteína (una fosfatasa alcalina
térmicamente inestable) no producida por miembros de esa especie o
tipo de célula que se produce de forma natural.
Las células y organismos antes descritos se
pueden denominar transformantes, debido a que ellos o sus
antepasados han sido transformados por introducción de material
genético que codifica una fosfatasa alcalina térmicamente inestable
tal como se describe en esta memoria.
La invención también proporciona otro
transformante, que es Escherichia coli o Saccharomyces
cerevisiae transformado con el vector recombinante. Cepas de
bacterias, levaduras y otras células cultivadas de expresión,
adecuadas, son conocidas en la técnica.
La invención también proporciona un
procedimiento para producir una fosfatasa alcalina térmicamente
inestable, que comprende cultivar los transformantes de la
invención en un medio de cultivo y aislar la fosfatasa alcalina a
partir del transformante cultivado. Más particularmente, la
invención proporciona un método para la fabricación de una
fosfatasa alcalina térmicamente inestable, que comprende transformar
una célula hospedante con un vector de expresión que comprende una
secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID nº 1 o la
secuencia complementaria de dicha secuencia, mantener la célula en
un medio de cultivo y aislar la fosfatasa alcalina térmicamente
inestable expresada por dicha célula. Métodos para cultivar células
son bien conocidos en la técnica y, típicamente, permitirá una
multiplicación de las células y una expresión, simultánea o
subsiguiente, del gen ALP. El producto génico se puede acumular
intracelular o extracelularmente. Métodos para recolectar y
purificar proteínas generadas de esta manera son bien conocidos en
la técnica.
Se ha realizado un trabajo adicional y se ha
refinado la información precisa de la secuencia. Los cambios en las
secuencias de ADNc y proteína revisadas son mínimos. La secuencia de
ADNc revisada se muestra en la fig. 4 y se llama SEQ ID nº 15. Al
igual que incorpora una secuencia 5' adicional (cuya secuencia de
aminoácidos equivalente estaba siempre presente en SEQ ID nº 2),
carece de 9 nucleótidos tal como se muestra en la comparación de
las secuencias en la figura 7. Según se compara, las secuencias
tienen una identidad de 99,4%.
A nivel de proteína, existe un cambio
ligeramente mayor, ya que las correcciones creaban un cambio en el
marco de lectura en una pequeña parte de la proteína. La secuencia
de aminoácidos revisada se muestra en la figura 5 y se denomina SEQ
ID nº 16. En la figura 8 se muestra una comparación con la secuencia
de aminoácidos original. En comparación, las secuencias son
aproximadamente un 96% idénticas.
\newpage
Así, todas las referencias que figuran antes en
esta memoria a SEQ ID nº 2 pueden ser reemplazadas por SEQ ID nº
16.
Además, se ha dilucidado recientemente una
secuencia para el ADNc completo de SAP y, así, la molécula completa
corresponde a SEQ ID nº 17, seguida de la SEQ ID nº 15, y la
secuencia completa de aminoácidos de SAP (más la secuencia señal)
corresponde a SEQ ID nº 18, seguida de la SEQ ID nº 2 ó 16. Se
piensa que de los 47 aminoácidos de SEQ ID nº 18, los últimos 7
aminoácidos (NPITEED) o algunos de ellos, por ejemplo PITEED o TEED,
se encuentran en el extremo N de la proteína SAP madura. Se cree
que los aminoácidos restantes sean un polipéptido señal. La
fosfatasa alcalina recombinante tiene preferiblemente la secuencia
de aminoácidos NPITEED en su extremo N.
La invención se describirá ahora adicionalmente
en los siguientes ejemplos no limitantes, en que:
figura 1 muestra la secuencia de ADNc que
codifica SAP procedente de Pandalus borealis (menos una
pequeña parte en el extremo 5'). Están subrayadas la secuencia del
codón de detención y la secuencia del ADNc situada más abajo, que
incluyen la cola poliA;
figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
codificada por el ADNc de SAP mostrado en la figura 1 (e incorpora
una región N-terminal adicional). Están subrayadas y
especificadas homologías con los fragmentos de proteínas
secuenciados. La secuencia del sitio activo de la enzima (de acuerdo
con fosfatasas alcalinas conocidas) se muestra en negrillas; y
figura 3 muestra la secuencia de SAP alineada a
sus homólogos de puntuación superior de ALPs no específicas para el
tejido encontradas en la base de datos Swiss-Prot;
ratón (número de acceso P09242), ser humano (n.a. P05186), pollo
(n.a. Q92058) y una ALP del gusano de seda Bombyx mori (n.a.
P29523).
figura 4 muestra la SAP codificadora del ADNc
revisado de Pandalus borealis. Está indicada la cola poliA
(A)_{23}. Cinco posiciones de nucleótidos en la secuencia
5' (minúsculas) están desviadas por el cebador de PCR degenerado
utilizado para la amplificación y secuenciación y, así, las
posiciones no están especificadas.
figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos
codificada por el ADNc de SAP mostrado en la figura 4. Homologías
con los fragmentos de proteína secuenciados están subrayadas y
especificadas. La secuencia del sitio activo de la enzima propuesta
se muestra en negrillas. El residuo lisina
N-terminal (minúsculas) podría ser,
alternativamente, arginina, debido a la desviación del cebador de
PCR degenerado, como se comenta con respecto a la figura 4
anterior.
figura 6 corresponde a la figura 3 anterior,
pero incorpora la secuencia de aminoácidos revisada de la figura
5.
figura 7 muestra una alineación de la secuencia
de ADNc revisada de la figura 4 (parte superior) con la secuencia
original de la figura 1 (que comprende adicionalmente el extremo 5'
que originilamente sólo se presenta en la secuencia de aminoácidos
equivalente de la figura 2). La comparación se efectuó utilizando el
programa de Needle, que utiliza el algoritmo de alineación global
de Needleman-Wunsch, para encontrar la alineación
óptima (incluidos los huecos) de dos secuencias. [Needleman et
al. J. Mol. Biol. (1983) 48, págs. 443-453],
matriz Blosum 62 con penalizaciones de los huecos de Hueco abierto =
10,0 y Hueco extendido = 0,5. El % de identidad global = 99,4%.
figura 8 muestra una secuencia de alineación de
la secuencia de aminoácidos revisada de la figura 5 (parte
superior) con la secuencia original de la figura 2. La comparación
se efectuó utilizando el programa de Needle antes descrito, matriz
Blosum 62 con penalizaciones de los huecos de Hueco abierto = 10,0 y
Hueco extendido = 0,5. El % de identidad global = 96,03%.
figura 9 da la secuencia de ADNc [SEQ ID nº 17]
y de aminoácidos [SEQ ID nº 18] de la secuencia señal propuesta y
la región N-terminal de fosfatasa alcalina de
Pandalus borealis. La secuencia de aminoácidos de SAP
continúa entonces con KAYWNK....., según se describe en las figuras
2 y 4.
figura 10 es una foto de una
SDS-PAGE de extractos de proteínas de células
totales procedentes de los cultivos de expresión del Ejemplo 4, en
que: pistas 1 y 10: patrón de proteínas de intervalo amplio, pistas
2 y 9: SAP 1,5 \mug, pista 3: cultivo control negativo, no
inducido, pista 4: cultivo control negativo, inducido, pista 5:
cultivo 1 de SAP, no inducido, pista 6: cultivo 1 de SAP, inducido,
pista 7: cultivo 2 de SAP, no inducido, pista 8: cultivo 2 de SAP,
inducido. Las proteínas en el patrón de proteínas de intervalo
amplio son: miosina (200 kD), \beta-galactosidasa
(116 kD), fosforilasa b (97,4 kD), albúmina de suero (66 kD),
ovoalbúmina (45 kD), anhidrasa carbónica (31 kD), inhibidor de
tripsina (21,5 kD), lisozima (14,4 kD) y aprotinina (6,5 kD).
figura 11 es una foto de un inmunoborrón de
extractos de proteínas de células totales procedentes de los
cultivos de expresión del Ejemplo 4, en que: pistas 1 y 8: SAP 50
ng, pista 2: cultivo control negativo, no inducido, pista 3:
cultivo control negativo, inducido, pista 4: cultivo 1 de SAP, no
inducido, pista 5: cultivo 1 de SAP, inducido, pista 6: cultivo 2
de SAP, no inducido, pista 7: cultivo 2 de SAP, inducido.
Fosfatasa alcalina de camarón (SAP) se purificó
hasta una homogeneidad aparente según se describe [R. Olsen et
al., 1991]. Una banda de proteína sencilla de aproximadamente 55
kDa se detectó mediante tinción con coomassie, así como tinción de
plata tras electroforesis en un sistema de gel
Bis-Tros NuPAGE al 10% (Novex), utilizando un
tampón de desplazamiento de ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico 50 mM que
contenía SDS al 0,1%.
Se liofilizó 1 mg de proteína y se sometió a un
servicio de análisis comercial de la secuencia (Innovagen, Suecia),
en que la proteína se fragmentó mediante tripsina y los fragmentos
se separaron mediante HPLC de fase inversa. Se produjeron más de 30
fragmentos, y 4 fragmentos se seleccionaron para el análisis
adicional. El análisis de la secuencia, mediado por espectrometría
de masas, de los fragmentos seleccionados (H23:18, H23:30,
5ReRP6:26, 5ReRP6:17) produjo 12, 10, 8 y 5 aminoácidos en
secuencia, respectivamente.
Basándose en las secuencias de aminoácidos se
predijeron codones estándares y subsiguientemente se hicieron a
medida desoxirribonucleótidos degenerados de secuencias
complementarias delanteras e inversas (Eurogentec, Bélgica).
Se diseccionaron camarones de P. borealis
recién recogidos y los hepatopáncreas individuales se almacenaron
en nitrógeno líquido hasta su uso. Se aisló ARNm de un
hepatopáncreas sencillo mediante el uso del sistema PolyATract®
1000 (Promega). Se utilizó ARNm aislado para la síntesis de la
primera cadena de ADNc, antes de efectuar la síntesis de la segunda
cadena y la amplificación de ADNc, siguiendo las instrucciones dadas
en el kit de síntesis de ADNc por PCR Smart^{TM} (Clontech) y el
kit de PCR para ADNc Advantage (Clontech).
Se utilizó una pequeña parte alícuota del ADNc
sintetizado como molde en PCRs cebadas mediante combinaciones por
pares (direcciones delantera e inversa) de los oligonucleótidos
derivados de proteínas. Las reacciones de amplificación, con
composiciones estándares de mezcla, se efectuaron en un
termiciclador de gradiente de Eppendorf. Los productos de la PCR se
detectaron después de electroforesis en gel de agarosa. La
combinación de cebadores de los oligonucleótidos 17F y 26R dieron
un producto de amplificación distinto de aproximadamente 600 pe, el
cual se secuenció utilizando el kit de secuenciación del ciclo
terminador radio marcado Termo Sequenase (Amersham), explotando los
mismos cebadores de la PCR para la secuenciación.
Basándose en la secuencia de ADN encontrada en
el producto de PCR, se sintetizaron nuevos cebadores delantero e
inverso para las reacciones de RACE 5' y 3', según se describe para
el uso con el kit de amplificación de ADNc Maratón^{TM}
(Clontech) en la amplificación a partir del molde de ADNc.
Mediante el uso del cebador delantero MalpF,
específico para el gen SAP, en combinación con el cebador APl
contenido en el kit, que tenía una identidad de la secuencia con
respecto al adaptador ligado, se produjo un fragmento
3'-RACE de 1,4 kb. De manera similar, el cebador
MalpR, específico para el gen inverso, dio origen a un producto
5'-RACE de 0,5 kb. El análisis de la secuencia de
ADN del producto 3'-RACE confirmó que el producto
RACE solapaba al producto de la PCR de 600 pb. El producto
3'-RACE se subclonó en el vector
pCR-Script (Stratagene) para producir el plásmido
pMalpF para la secuenciación ulterior del gen ADNc situado más abajo
de la región de la secuencia contenida en el producto de PCR de 600
pb.
El producto de PCR de 600 pb y el inserto pMalpF
se secuenciaron varias veces en ambas direcciones utilizando nuevos
cebadores específicos para genes.
Se realizó una reacción PCR final utilizando los
cebadores SapF y SapR y la Pfu polimerasa (Stratagene) y ADNc como
molde para un producto de amplificación del gen de ADNc de SAP de
1,5 kb para la confirmación de la secuencia obtenida. Se encontró
que el gen de ADNc contenía un marco de lectura abierto que codifica
un polipéptido de 478 aminoácidos y una secuencia 3' que incluye
una señal putativa para la poliadenilación del transcrito - véanse
las figuras 1 y 2.
Se utilizaron los siguientes perfiles de
ciclación para reacciones de amplificación:
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimó originalmente que la subunidad de
proteína SAP tenía una masa molecular de 65 kDa. La hoja de producto
USB describe una proteína SAP de 59 kDa, y en el sistema
SDS-PAGE de los inventores, la SAP migra de una
manera similar a una proteína de 55 kDa de peso molecular estándar.
Las discrepancias se explican probablemente por variaciones en
sistemas tampón y en las cualidades del gel utilizadas.
El ADNc aislado codifica un polipéptido con
identidades de secuencia a los fragmentos analizados de la proteína
SAP - véase la figura 2.
La secuencia de la proteína SAP se utilizó como
secuencia de consulta en búsquedas de homología en bases de datos
disponibles al público. Los programas de software BLAST y ClustalW
se utilizaron para la búsqueda de homología y alineaciones de
múltiples secuencias, respectivamente. La secuencia de SAP se alineó
a sus homólogos de puntuación superior de ALPs no específicas para
el tejido encontradas en ratón (número de acceso P09242), ser
humano (n.a. P05186), pollo (n.a. Q92058) y una ALP del gusano de
seda Bombyx mori (n.a. P29523). La alineación se muestra en
la figura 3. No se encuentra ningún equivalente de secuencia del
ADNc mediante búsquedas de homología en bases de datos disponibles
al público. Sin embargo, la puntuación de la secuencia de proteína
derivada es relativamente elevada con un cierto número de ALPs
conocidas con una identidad del 44% y una similitud del 60% en las
secuencias de aminoácidos. Las homologías de las proteínas se
investigaron en la base de datos SWALL (base de datos de secuencias
de proteínas no redundante; Swissprot+Trembl+TremblNew) que operan
con el programa Fasta3 con parámetros por defecto (matriz blosum 62
penalización de hueco abierto = -12 y penalización de la extensión
del hueco = -2, y
KTUP = 2), utilizando el servidor de internet del European Bioinformatics Institute. [W.R. Pearson y D.J. Lipman (1988), "Improved tools for biological sequence analysis", PNAS 85: 2444-2448; W.R. Pearson, (1990), "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98].
KTUP = 2), utilizando el servidor de internet del European Bioinformatics Institute. [W.R. Pearson y D.J. Lipman (1988), "Improved tools for biological sequence analysis", PNAS 85: 2444-2448; W.R. Pearson, (1990), "Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98].
También, la proteína codificada por el ADNc
tiene el motivo VTDSAASAT, que corresponde al patrón de sitio
activo de ALP definido por Prosite PSOO 123, contenido en su
secuencia. Así, el ADNc aislado de un transcrito de ARNm procedente
del hepatopáncreas de camarón representa el gen para SAP de P.
borealis.
Existe una discrepancia de un aminoácido entre
el fragmento de proteína secuenciado 5ReRP6:26 y la
correspondiente secuencia derivada de ADNc. Esto podría explicarse
por variaciones alélicas en el gen para SAP o por un error en el
análisis de la secuencia de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se ha repetido el Ejemplo 1 y se ha refinado la
información de la secuencia. Tal como se refleja en las figuras 4 y
5, se encontró que el gen para ADNc contenía un marco de lectura
abierto que codifica una proteína de 475 aminoácidos. El ADNc de la
fig. 4 tiene una masa molecular teórica de 53 kDa en comparación con
una estimación de la masa de la SAP nativa purificada basada en
SDS-PAGE de 54-55 kDa. A partir de
las alineaciones de múltiples secuencias, se piensa que la SAP
contiene 5-10 aminoácidos adicionales en su extremo
N, llevando la masa molecular próxima a 54 kDa. Como se ha
comentado antes, se piensa que esta región
N-terminal comprende algo o la totalidad del
heptapéptido NPITEED, véase también el Ejemplo 4.
Proteína SAP liofilizada se disolvió en HCl 6 M
y se hidrolizó a 110ºC durante 24 h. Después de la evaporación de
HCl, la muestra se resuspendió en tampón citrato de sodio 0,2 M y se
sometió a cromatografía HPLC para la identificación y la
determinación del porcentaje molar de los aminoácidos en el producto
hidrolizado.
Nota: este sistema no diferencia entre aspartato
y asparagina o entre glutamato y glutamina. Así, se combinan las
cifras para estos aminoácidos se combinan en la proteína SAP nativa.
También, los números de residuos cisteína están supuestamente
subestimados, ya que la proteína no se oxidó.
Conclusión: para la mayoría de los aminoácidos
las relaciones molares de cada aminoácido en la secuencia de
proteínas derivada de ADNc son próximas a las relaciones encontradas
en la proteína nativa purificada. Los aparentemente pequeños
desacuerdos se comentan arriba.
Así, en comparación con la proteína SAP, el ADNc
aislado codifica una proteína con una composición de aminoácidos muy
similar o idéntica.
Este Ejemplo y el análisis se han repetido para
la secuencia de ADNc revisada y los resultados se presentan más
abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
La SAP que codifica ADNc se utiliza para
expresar el carácter heterólogo de la enzima en un microorganismo
adecuado para la producción de enzima recombinante mediante
fermentación. Están disponibles varios sistemas de expresión y se
prefieren sistemas de expresión eucarióticos, ya que éstos pueden
expresar la enzima a niveles razonables en su estado nativo.
Un sistema de este tipo es la levadura
metilotrófica Pichia pastoris (Invitrogen), de la que se ha
informado que expresa proteínas recombinantes a niveles de hasta 12
g/L mediante expresión intracelular [Clare, J.J., Raiyment, F.B.,
Ballantine, S.P., Sreekrishna, K. y Romanos, M.A. (1991):
High-level expression of tetanus toxin fragment c
in Pichia pastoris strains containing multiple tandem
integrations of the gene. Blo/Technology 9,
455-460] y hasta 2,6 g/L son secretados al medio.
[Paifer, E., Margolles, E., Cremata, J., Montesino, R., Herrera, L.
y Delgado, JM. (1994): Efficient expression and secretion of
recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two
different signal sequences. Yeast 10.
1416-1419].
El gen insertado es regulado por el promotor
AOX1 (alcohol oxidasa), de manera que la expresión puede ser
inducida por metanol.
El ADNc de SAP es insertado en el vector pPIC9K
comercialmente disponible. Después, la SAP recombinante puede ser
expresada como un producto secretado mediante fusión a la secuencia
de péptido señal derivada del factor \alpha de S.
cerevisiae contenido en el vector. Cuando se integra en una cepa
his (KM7l o GS115), las cepas se seleccionan en cuanto a
recombinantes mediante selección de clones his + en un medio
exento de histidina, ya que el genotipo his es complementado
por el inserto del vector. Además, se rastrean recombinantes en
cuanto múltiples insertos de genes mediante la resistencia a
concentraciones incrementadas de geneticina (G418, Invitrogen),
adquirida por el gen de resistencia a la kanamicina portado por el
plásmido.
En detalle, el ADNc de SAP generado por PCR se
utiliza como un molde en una nueva reacción de PCR, con el fin de
generar un nuevo producto de PCR que contiene sitios de restricción
apropiados para la integración en el vector pPIC9K en marco con la
secuencia señal de factor \alpha. En calidad de cebador delantero
para la reacción PCR se utiliza un cebador "17F" modificado
[SEQ ID nº 13], que reemplaza al codón ATG (Met) por un codón
lisina (AAG), con el fin de reconstruir un residuo lisina putativo
escindido por tripsina. Se construye el cebador inverso [SEQ ID nº
14] con el fin de fijar un sitio de restricción NotI en la
posición 3' con respecto al codón de detención de la secuencia de
ADNc de SAP.
El producto de PCR resultante se corta con
NotI y se liga en un vector pPIC9K previamente cortado con
SnaBI y NotI (dando como resultado el plásmido
pPIC9K-SAP). Dado que el vector termina en extremos
romos por SnaBI en el sitio de unión 5' y los dos extremos
están en el marco de lectura, no es necesaria ninguna modificación
adicionalen el extremo 5' del ADNc modificado.
El vector se propaga luego mediante
transformación de una cepa de E. coli competente, tal como
TOP10F' (Invitrogen) o equivalente, y los recombinantes se
seleccionan por su resistencia a ampicilina. El plásmido
pP109K-SAP aislado puede ser luego linearizado
mediante corte de restricción con SocI con el fin de crear
una casete de vector a insertar en el gen AOXI de Pichia
pastoris. Después de la transformación de células de Pichia
pastoris (cepas GS115 o KM7l) con una construcción
pPIC9K-SAP linearizada, se seleccionan recombinantes
a partir de mutantes his + de acuerdo con el protocolo del
fabricante.
Colonias aisladas se testan en cuanto a la
expresión de SAP recombinante en el medio mediante células en
desarrollo en presencia de metanol de acuerdo con el método
recomendado por el fabricante. Si se desea, se consiguen aumentos
adicionales en los niveles de expresión mediante el rastreo de cepas
recombinantes en cuanto a clones que contienen múltiples copias del
gen recombinante. Esto se hace cultivando mutantes his + en
presencia de niveles incrementados del antibiótico G418
(Invitrogen). Es probable que clones que se desarrollan a altos
niveles de G418 contengan múltiples copias del gen.
Todos los métodos de cultivo, transformación y
selección se describen en detalle en protocolos disponibles del
suministrador del sistema de Pichia pastoris (Invitrogen,
Holanda).
La construcción de SAP modificada proporciona un
producto recombinante en el que se añaden 5 aminoácidos (EAEAY) a
partir de la secuencia de reconocimiento de la señal restante de la
peptidasa KEX2 señal de Pichia pastoris. Esta secuencia
N-terminal resulta en un producto final que está
ligeramente truncado, pero en un consenso razonable con otras
fosfatasas alcalinas, que todavía contienen una secuencia de
reconocimiento para la peptidasa señal de Pichia
pastoris.
- AAGGCITAAYTGGAAYAAR
- [SEQ ID nº 13]
en que
- I = Inosina
- R = A + G
- Y = C + T
\vskip1.000000\baselineskip
- TACAGCGGCCGCCATCTOAI11TTCG
- [SEQ ID nº 14]
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia señal N-terminal de
SAP se determinó mediante 5'-RACE, utilizando un
ADNc como molde. ARNm se aisló a partir de 100 mg de hepatopáncreas
de camarones (Pandalus borealis), utilizando el Mini Kit de
ARNm Oligotex Direct (Qiagen), según se describe por el fabricante.
Se preparó ADNc de hepatopáncreas de camarones utilizando el kit de
síntesis de ADNc por PCR SMART (Clontech), siguiendo el protocolo
descrito por el fabricante. El ADNc era de extremos romos y se
purificó añadiendo 40 \mug de proteinasa K a 50 \mul del ADNc y
se incubó a 45ºC durante 45 min y a 90ºC durante 8 min, y luego se
añadieron 15 U de T4-ADN polimerasa (Promega) y se
incubaron a 16ºC durante 30 min y a 72ºC durante 10 min. Finalmente,
el ADNc se extrajo dos veces en fenol/cloroformo y precipitó
etanol. Los adaptadores de RACE se ligaron al ADNc según se describe
en el kit de amplificación de ADNc Marathon (Clontech. La reacción
5'-RACE se efectuó en un volumen final de 50 \mul,
utilizando la mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech) y un
cebador AP1 (suministrado con el kit de amplificación de ADNc
Marathon) y un cebador específico para SAP (5'-GCG
TGG TGC ATA TGG TCA ATC CGT CC-3') y 5 \mul de
ADNc ligado a adaptador 50 veces diluido como molde. La reacción PCR
de RACE se realizó en un termociclador Biometra TGradient con una
etapa de desnaturalización inicial de 94ºC durante 30 segundos,
seguida de 5 ciclos de 94ºC durante 5 s y 72ºC durante 3 min, 5
ciclos de 94ºC durante 5 s y 70ºC durante 3 min y 30 ciclos de 94ºC
durante 5 s y 68ºC durante 3 min. El fragmento de SAP de 1200 pb
generado se purificó a partir del gel de agarosa, se
re-amplificó utilizando una PCR y se secuenció.
Para clonar el gen para SAP en el vector
pBAD/gIII A, el gen para SAP se amplificó por PCR con dos cebadores
que contenían un sitio SacI y HindIII, respectivamente (subrayados).
Basándose en la secuencia de SAP de longitud completa (secuencia
señal más de la secuencia principal), los cebadores se diseñaron
para amplificar el gen SAP con los aminoácidos NPITEEDKAYWNK......
como extremo N. Además, se cambiaron tres bases en el cebador 1
(de C a A, de A a C y de A a C), con el fin de optimizar a tres de
los codones N-terminales (representados con letras
minúsculas en la secuencia del cebador) (cebador 1:
5'-ATG GAG CTC AAC CCa ATc ACc GAA GAA GAC
AA-3' cebador 2: 5'-ATG AAG CTT
TCA TTT TTC GTC ACA GAA AGT G-3'). La PCR se llevó a
cabo en un volumen final de 50 \mul que contenía 10 \muM de
cada uno de los dos cebadores, 1,5 U de
Pfu-polimerasa (Promega) y tampón suministrado,
dNTP 0,2 mM y 10 ng de ADNc de hepatopáncreas de camarones como
molde. La PCR se hizo con una etapa de desnaturalización inicial de
94ºC durante 30 s, seguida de 30 ciclos de 94ºC durante 15 s, 55ºC
durante 1 min y 72ºC durante 3 min. El producto de PCR se purificó
con el kit de purificación por PCR Qiaquick
(Qiagen).
(Qiagen).
Tanto el vector pBAD/gIII A como el producto de
PCR de SAP se trataron con 5 U de enzimas de restricción SacI y
HindIII, respectivamente. El producto de PCR de SAP se ligó en el
vector en una reacción de 10 \mul utilizando 1 U de
T4-ADN ligasa (USB) y aproximadamente 1 mg tanto del
plásmido como del producto de PCR. La mezcla de reacción se incubó
a 16ºC durante 16 h. La mezcla de ligamiento se utilizó luego para
transformar células TOP10 de E. coli, añadiendo la mezcla de
ligamiento a 40 \mul de células TOP10 de E. coli
electrocompetentes y se electroporaron a 1800 V. Inmediatamente
después de la electroporación, se añadió 1 ml de medio SOC y se
incubó a 37ºC durante 1 h. Las células se extendieron luego en
placas LB que contenían 100 mg/ml de ampicilina para la selección
de células transformadas.
Para la expresión se seleccionaron dos colonias
TOP10 de E. coli que contenían el vector pBAD/gIII A
recombinante que contenía el gen para SAP. Como control negativo se
utilizó una cepa TOP10 de E. coli que contenía un vector
pBAD/gIII A vacío.
Tres matraces Erlenmeyer que contengan 50 ml de
medio LB se inocularon con 2,5 ml de cultivos de una noche en medio
LB suministrado con 100 \mug/ml de ampicilina. Las células se
dejaron desarrollar a 30ºC con sacudimiento hasta que las células
alcanzaron una densidad de DO_{600} = 0,5. Cada uno de los tres
cultivos se escindieron luego en dos (2 x 25 ml), en que se indujo
uno de los dos cultivos añadiendo L-arabinosa hasta
una concentración final de 0,05% (p/v). Todos los cultivos de
células se hicieron desarrollar luego a 30ºC con sacudimiento
durante 3 h antes de recolectar las células.
De cada uno de los cultivos de expresión se
centrifugó una muestra de 200 \mul y los sobrenadantes se
separaron. A los sedimentos de las células se añadieron 100 \mul
de tampón de muestra 1X SDS-PAGE y se incubaron a
100ºC durante 3 min y se centrifugaron a 18.000 g durante 3 min. Los
lisados de células se aplicaron luego directamente y se analizaron
en un gel de SDS-PAGE. Se electromanchó
ulteriormente un gel de SDS-PAGE adicional para
transferir las proteínas a una membrana de manchado con
nitrocelulosa (0,45 um, Bio-Rad) y se
inmuno-tiñó utilizando un anticuerpo dirigido
contra SAP purificada a partir del agua de tratamiento de camarones
y conjugado de IgG anti-conejo de cabra (H + L)
(IgG humana adsorbida) y peroxidasa de rábano picante
(Bio-Rad). Se siguieron protocolos estándares para
SDS-PAGE, electromanchado e
inmuno-tinción.
Como se muestra en las figuras 10 y 11, SAP
recombinante se expresa utilizando el vector pBAD/gIII A y células
TOP10 de E. coli como hospedante. Las dos cepas de E.
coli recombinantes que contenían vectores pBAD/gIII A
recombinantes producen SAP recombinante, mientras que el control
negativo no daba ninguna señal en la transferencia western (figura
11).
<110> Norwegian Institute of Fisheries and
Aquaculture
\hskip1cm Nilsen, Inge
\hskip1cm Overbo, Kersti
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fosfatasa Alcalina de Camarón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 71985001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB01/04509
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-10-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1481
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc de SAP truncado en 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 478
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Producto de traducción de la SEQ. ID
NO. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(88)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de proteína de SAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ile Asn Phe Arg Tyr Ala Ser Ala Ala Pro
Val Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de proteína de SAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Leu Ile Thr Asp Trp Leu Asp Asp
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de proteína de SAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Met Gly Gly Glu Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de proteína de SAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Tyr Trp Asn Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcntaytgga ayaar
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipckytcnccnc ccatdatnac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttcgtggg aagaattcga ctttgc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgccag cctcctggaa cca
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t, a, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaargcntayt ggaayaarga t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggtaatc atctacatct ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaggcntayt ggaayaar
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacagcggcc gccatctcat ttttcg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1490
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc de SAP
revisada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t, a, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 475
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Producto de traducción de la SEQ ID
NO. 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> ACT_SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(88)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADNc que codifica el extremo N y
péptido señal de SAP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Producto de traducción de la SEQ ID
NO. 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SEÑAL
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (91)..(47)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t, a, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaargcntayt ggaayaar
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1499
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia recombinante de la SEQ ID
NO. 19 y la SEQ ID NO. 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> t, a g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pandalus borealis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de
N-terminal de SAP que codifica el péptido KAYWNK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcatatt ggaacaaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1511
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc recombinante del
péptido señal y la SEQ ID NO. 21 que sustituye a la SEQ ID NO. 19 en
la SEQ ID NO. 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtggtgca tatggtcaat ccgtcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggagctca acccaatcac cgaagaagac aa
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaagcttt catttttcgt cacagaaagt
\hfill30
Claims (11)
1. Una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos según se recoge en SEQ ID nº
1 o la secuencia complementaria de dicha secuencia, en donde dicha
secuencia de nucleótidos codifica o es complementaria a una
secuencia que codifica una fosfatasa alcalina térmicamente
inestable.
2. Una construcción genética que comprende una
molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, operativamente
enlazada a una secuencia de promotor.
3. Un vector de expresión recombinante que
comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1,
y que es capaz de propagación en una célula hospedante.
4. Un vector según la reivindicación 3, que es
un plásmido o vector viral.
5. Una célula transformada con una
construcción o vector según una cualquiera de las reivindicaciones 2
a 4.
6. Una célula según la reivindicación 5, que
es una célula procariótica.
7. Una célula según la reivindicación 5, que
es parte de un cultivo de células eucarióticas.
8. Una célula recombinante u organismo no
humano con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende
una secuencia de nucleótidos según se define en la reivindicación
1.
9. Una célula recombinante u organismo de
acuerdo con la reivindicación 8 que es capaz de expresar una
fosfatasa alcalina térmicamente inestable, que comprende la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID nº 2.
10. Un método para la fabricación de fosfatasa
alcalina térmicamente inestable, que comprende transformar una
célula hospedante con un vector de expresión según la reivindicación
3 ó 4, manteniendo la célula en un medio de cultivo y aislando la
fosfatasa alcalina térmicamente inestable expresada por dicha
célula.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que la célula hospedante es Pichia pastoris.
Applications Claiming Priority (2)
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