KR20180038569A - 특성이 개선된 키모신 변이체 - Google Patents
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Abstract
αS1-카세인 절단 및 C/P 특성이 개선된 키모신 변이체.
Description
본 발명은 αS1-카세인 및 C/P 절단 특성이 개선된 키모신 (chymosin) 변이체에 관한 것이다.
포유류 위(胃)의 밀크 응고 효소들인 키모신 (EC 3.4.23.4) 및 펩신 (EC 3.4.23.1)은 광범위한 펩티다아제류에 속하는 아스파르틱 단백질 분해 효소이다.
위 점막 세포에서의 생성시, 키모신 및 펩신은 각각 효소 활성이 없는 프리-프로키모신 및 프리-펩시노겐으로서 발생한다. 키모신이 분비될 때, 프리-단편 (신호 펩티드)인 N-말단의 펩티드 단편이 절단되어 프로-단편을 포함하는 프로키모신을 생성한다. 프로키모신은 효소의 실질적인 비활성형 단편이지만, 이는 산성 조건에서 프로-단편의 자가 촉매적 제거에 의해 활성 키모신으로 활성화가 이루어지게 된다. 이러한 활성화는 적절한 pH 조건하의 위 내강의 생체 내 또는 산성 조건하의 시험관 내에서 일어난다.
솟과 동물, 즉 보스 타우루스 (Bos taurus)의 프리-프로키모신, 프로키모신 및 키모신의 구조적 및 기능적 특성들이 집중적으로 연구되어 왔다. 소의 프리-프로키모신 분자의 프리-부분은 16 aa 잔기를 포함하고, 이에 상응하는 프로키모신의 프로-부분은 42 aa 잔기의 길이를 포함한다. 활동적인 소의 키모신은 323 aa를 포함한다.
키모신은 소, 낙타, 염소, 버팔로, 양, 돼지, 사람, 원숭이 및 쥐와 같은 포유류 종에서 자연적으로 생성된다.
소 및 낙타의 키모신은 수년 동안 낙농 산업에 상업적으로 이용 가능해 왔다.
키모신 및 펩신과 같은 밀크-응고 효소에 의한 밀크의 효소 응집은 치즈 제조의 가장 중요한 공정 중의 하나이다. 밀크의 효소 응집은 2 단계 공정, 즉 단백질 분해 효소인 키모신 또는 펩신이 κ-카세인을 공격하여 카세인 미셀 구조가 준안정 상태가 되는 제 1 공정과, 밀크가 순차적으로 응집하고 응고물을 형성하는 제 2 공정이다 (참조 문헌 1). κ-카세인을 분해하여 밀크의 응집을 촉진하는 것 외에도, 키모신은 주로 Phe23 및 Phe24의 사이에서 알파S1-카세인 (αS1-casein)을 절단하여 (Moynihan 등, 2014), αS1(1-23) 펩티드를 형성한다
αS1(1-23) 펩티드의 형성은 치즈 조직의 연화에 기여한다고 설명되어 왔다 (Creamer 및 Olsen, 1982). 두 가지 매개 변수의 상관 관계는 예를 들어 보스 타우루스 (Bos taurus) 및 카멜루스 드로메다리우스 (Camelus dromedarius)의 키모신을 비교하는 것에서 발견된 바 있다. 소의 키모신이 낙타의 키모신에 비하여 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1카세인을 더 신속히 절단하는 반면에 (Creamer 및 Olsen, 1982; Bansal 등, 2009), 이는 더 조직 분해도가 높은 연질 치즈, 예를 들어 체다 (Creamer 및 Olsen, 1982; Bansal 등, 2009) 및 모짜렐라 (Moynihan 등, 2014)를 생성한다.
αS1(1-23) 펩티드 생성도가 다양한 치즈 응집제에 대한 접근은 치즈 제조업자로 하여금 치즈 매트릭스에 상이한 연질도를 부여할 수 있도록 할 수 있다. 따라서, 치즈 제조시 αS1(1-23) 펩티드의 생성이 증가 또는 감소한 키모신 변이체들이 산업상 매우 흥미를 끌고 있다. αS1-카세인 단백질 분해가 미세하게 조정된 응집제는 커드 굳기가 최적인 다양한 종류의 치즈의 제조를 촉진게 될 것이다.
이하에 나열한 참조 문헌들은 키모신의 돌연 변이체를 설명하는 참조 문헌임을 알 수 있다.
- WO02/36752A2 (Chr. Hansen) describes recombinant production of camel chymosin.
- WO2013/174840A1 (Chr. Hansen) describes mutants/variantsof bovine and camel chymosin.
- WO2013/164479A2 (DSM) describes mutantsof bovine chymosin.
- Suzuki 등: Site directed mutagenesisreveals functionalcontribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki 등: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink 등: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts 등: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutantsproduced in Trichoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams 등: Mutagenesis,biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutantsof bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop 등: Engineering enzyme subsitespecificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutatedcalf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Chitpinityol 등: Site-specific mutationsof calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June1998, pages 133-139;
- Zhang 등: Functionalimplications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
위에서 언급한 선행 기술 문헌 중 어느 것도, 후술하는 바와 같이, 상기 변이체가 유래하는 모체에 비하여 αS1-카세인 절단 빈도가 변경되고 및 C/P 값이 증가한 어떠한 키모신 변이체들도 직접적 그리고 분명하게 설명하고 있지 아니하고 있다.
본 발명에 의하여 해결하고자 하는 과제는 모체 폴리펩티드에 비교할 경우, αS1-카세인 절단 빈도가 낮거나 높고, C/P 값이 증가한 키모신 변이체를 제공하고자 하는 것이다.
헌신적인 노력과 다각적인 연구 전략에 의하여, 본 발명자들은 다음과 같은 특징을 가지는 단리된 키모신 폴리펩티드의 설계를 가능하게 하는 단일 돌연변이들뿐만 아니라 돌연변이들의 조합을 발견하기에 이르렀다.
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2 (SEQ ID NO:2)의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
또한, 본 발명자들은 단일 돌연변이뿐만 아니라 돌연변이 조합을 발견하여 다음과 같은 특징을 가지는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 설계를 가능하게 하였다.
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2 (SEQ ID NO:2)의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 이상의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
뿐만 아니라, 본 발명은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(a) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)를 코딩하는 DNA 서열 내 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L 및/또는 V317L 또는 대안적으로 V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q , V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P와 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변형을 행하는 단계.
(b) 단계 (a)의 변형된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계.
관련 측면에서, 본 발명은 또한 모체 폴리펩티드와 비교하여 αS1- 카세인 절단 빈도가 변경된 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(a) 모체 폴리펩티드의 하나 이상의 위치에 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, T239S, R242E, G251D , G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L, V317L, V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 임의의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변형을 행하는 단계.
(b) 단계 (a)의 변형된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계.
그런데 여기에서,
(i) 상기 모체 폴리펩티드의 아미노산 위치는 모체 폴리펩티드와 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)의 정렬에 의해 결정되고,
(ii) 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와의 서열 동일성이 65% 이상 및/또는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열동일성이 65% 이상이다.
뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 구현예에서 아래에 개괄하는 바와 같이 치환의 특정 조합에 관한 것이기도 하다.
본 내용은 또한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 포함하는 식품 또는 사료 제품뿐만 아니라 치즈를 제조하는 과정에서 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도에 관한 것이기도 하다.
도 1:
파란색으로 표시된 αS1-카세인이 결합된 모델의 낙타 키모신 (PDB:4AA9)의 3D 구조. αS1-카세인은 잔기 23 및 24 사이에 잘라지기 쉬운 결합이 있는 키모신 기질 결합 틈에 위치한다. 낙타 키모신 잔기 R266, V51, E83, I263, L253, L105, I96 및 L180은 녹색으로 강조 표시되었다.
도 2:
파란색으로 표시된 αS1-카세인이 결합된 모델의 낙타 키모신 (PDB:4AA9)의 3D 구조. αS1-카세인은 잔기 23 및 24 사이의 잘라지기 쉬운 결합이 있는 키모신 기질 결합 틈에 위치한다. 키모신 잔기 V32, H76, F119, L130, S132, Y190, V221, R242, S273, G289, N292, L295 및 I297은 녹색으로 강조 표시되었다.
도 3:
낙타 키모신 (세부, PDB:4AA9)의 3D 구조. 단백질 N-말단의 잔기 Y11, L12 및 D13 뿐만 아니라 잠재적인 Y11 상호 작용 파트너 D290이 보라색으로 강조 표시되었다.
파란색으로 표시된 αS1-카세인이 결합된 모델의 낙타 키모신 (PDB:4AA9)의 3D 구조. αS1-카세인은 잔기 23 및 24 사이에 잘라지기 쉬운 결합이 있는 키모신 기질 결합 틈에 위치한다. 낙타 키모신 잔기 R266, V51, E83, I263, L253, L105, I96 및 L180은 녹색으로 강조 표시되었다.
도 2:
파란색으로 표시된 αS1-카세인이 결합된 모델의 낙타 키모신 (PDB:4AA9)의 3D 구조. αS1-카세인은 잔기 23 및 24 사이의 잘라지기 쉬운 결합이 있는 키모신 기질 결합 틈에 위치한다. 키모신 잔기 V32, H76, F119, L130, S132, Y190, V221, R242, S273, G289, N292, L295 및 I297은 녹색으로 강조 표시되었다.
도 3:
낙타 키모신 (세부, PDB:4AA9)의 3D 구조. 단백질 N-말단의 잔기 Y11, L12 및 D13 뿐만 아니라 잠재적인 Y11 상호 작용 파트너 D290이 보라색으로 강조 표시되었다.
상이한 변이체 간의 비교 분석에 기초하여 - 본 발명자들은 이들 위치 중 하나 이상의 아미노산 위치에서 변이체를 제조함으로써, αS1-카세인 절단 빈도가 보다 낮거나 높은 및 C/P 값이 증가한 키모신 변이체를 얻을 수 있다는 점에서 본 명세서에서 중요한 다수의 아미노산 위치를 확인하였다.
따라서, 상기 전술한 바와 같이, 본 발명은 다음과 같은 특징을 가지는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 제공한다.
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만 또는 115% 이상의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 한 측면은 다음을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 제공한다.
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
밀접하게 관련된 측면에서, 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 본 발명의 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환, 즉 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L 및/또는 V317L 중 하나 이상을 포함하며, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
상기 특정된 돌연변이는 돌연변이의 조합의 일부를 형성하여 다중 치환을 포함하는 변이체 또는 돌연변이를 생성할 수 있다. 특히, 관련 측면으로서, αS1-카세인 절단 빈도가 감소한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환 조합, 즉
Y21S + H76Q + Y307F + V317L,
R61S + L166V + T239S,
V32L + E294Q + R316L + V317L,
S226T + G244D + I263L + G289S,
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F,
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S,
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E,
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T,
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A,
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I,
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D,
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D,
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I,
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D,
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W,
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T,
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y,
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I,
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y,
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D,
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y,
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L,
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L,
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I,
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V,
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I,
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V,
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L,
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D,
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I,
H76Q + N100Q + N291Q,
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q,
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L,
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I,
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E,
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H.
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I ,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D ,
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I ,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D ,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D ,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I ,
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D 또는
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D
중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 각각의 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
따라서, 본 발명은 또한 다음을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 포함한다.
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 이상의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
밀접하게 관련된 측면에서, 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 이상의 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 본 발명의 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환, 즉 V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 하나 이상을 포함하며, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
또 다른 관련 측면에서, αS1-카세인 절단 빈도가 증가한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환 조합, 즉
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N,
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q,
Y21S + R61S + H146R,
R61S + G163E + M256L + S277N,
D59N + S271P + T284S,
V248I + S226T + E294Q,
S74F + G244D + S271P,
V221K + V248I + S255Y,
V183I + G251W + M256L,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
D98V + G251D + M256L +
V259I,
V183I + V248I + G244D + T284S,
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D,
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L,
H146R + D158S + S273Y,
S74F + V259I + Y268F,
G70N + D98V + V136I,
I96L + M142I + R145Q + H146R,
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
S132A + Q188E + F223V,
I200V + G251D + G289S,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
F223V + G251W + S273Y + D279E,
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S,
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L,
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A,
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T,
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P,
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q
V32L + N100Q + N291Q,
N292H + N100Q + N291Q,
V221K + N100Q + N291Q,
I297A + N100Q + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N,
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H,
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H,
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q,
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q,
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q,
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L,
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q 및/또는
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231N.
중 하나 이상을 포함하고, 각각의 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
본 발명은 또한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법, 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 사용하여 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법, 이들 변이체를 포함하는 식품 및 사료 제품뿐만 아니라 식품 및 사료 제품을 제조하기 위한 상기 변이체의 용도 역시 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 치즈, 예를 들어 파스타 필라타, 체다, 콘티넨탈 타입 치즈, 소프트 치즈 또는 화이트 브라인 치즈의 제조 공정에서의 본 발명의 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도에 관한 것이다.
관심 있는 키모신의 아미노산 위치 결정
변이체를 특정하기 위해 본 명세서에서 사용된 아미노산 넘버링은 성숙 펩티드에 기초한다.
해당 분야에서 잘 알려진 바와 같이 - 상이한 포유류 종 (예를 들어 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐)으로부터 얻은 상이한 천연 야생형 키모신 폴리펩티드 서열은 비교적 높은 서열 유사성/동일성을 가진다. 본 명세서의 문맥에서 - 자연적으로 얻은 야생형 키모신 (소 키모신 또는 낙타 키모신과 같은)은 본 명세서에서 모체 폴리펩티드, 즉 본 발명의 변이체 키모신 폴리펩티드를 생성하기 위해 변형되는 모체 폴리펩티드의 한 예시가 될 수 있다.
본 명세서에서 개괄된 바와 같이 - 관심 있는 모체 키모신 폴리펩티드 (예를 들어 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하기 위한 참조 서열로서 서열 번호 2의 공지된 카멜루스 드로메다리우스 (Camelus dromedarius) 성숙 키모신 서열이 본 명세서에서 사용된다. 본 명세서에서는 낙타 키모신이라 대신 칭한다. 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 서열은 본 명세서에서 서열 번호 4로 예시된다.
대안적으로, 다른 키모신 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 1에 개시된 성숙 폴리펩티드와 정렬될 수 있고, 상기 정렬에 기초하여, 서열 번호 1에 개시된 성숙 폴리펩티드 내의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호는 클러스탈W (ClustalW) 알고리즘을 사용하거나 또는 본 명세서의 작업 실시예 1에서 기술한대로 결정된다.
상기 주지의 컴퓨터 프로그램에 기초하여 - 본 명세서의 관심 있는 관련 키모신 폴리펩티드 (예를 들어 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하는 것은 당업자에게 일상적인 작업이다.
밀크 응고 활성의 결정
밀크 응고 활성은 국제낙농연합회 (International Dairy Federation)가 개발한 표준방법인 REMCAT 방법을 사용하여 결정할 수 있다 (IDF 방법).
이 방법에서, 밀크 응고 활성은 리터 당 0.5g의 염화칼슘 용액 (pH 
6.5)의 저열량, 저지방 분유로 준비된 표준 밀크 기질을 가시적으로 응집하는데 필요한 시간으로부터 결정된다. 레넷 (rennet) 샘플의 응고 시간과 알려진 밀크 응고 활성 및 IDF 표준 110B에 따른 상기 샘플과 동일한 효소 조성을 가진 참조 표준의 응고 시간을 비교한다. 샘플 및 참조 표준은 동일한 화학적 및 물리적 조건 하에서 측정된다. 변이체 샘플은 pH 5.5의 84 mM 아세트산 완충액을 사용하여 약 3 IMCU/ml로 조정된다. 이후, 일정한 교반 하에서 32℃ ± 1℃의 일정한 온도를 유지할 수 있는 수조에 놓인 유리 시험관에서 예열된 밀크 (32℃) 10ml에 200㎕의 효소 제제가 첨가되었다. 대안적으로, 20㎕의 효소 제제가 위에서 기술한대로 예열된 밀크 1mL에 첨가된다.
레넷의 총 밀크 응고 활성 (강도)은 다음 공식에 따라 상기 샘플과 동일한 효소 조성을 가지는 표준과 관련하여 ml 당 국제 밀크 응고 단위 (IMCU)로 계산된다.
IMCU/ml에서의 강도 = S표준 x T표준 x D샘플
D표준 x T샘플
S표준:
레넷에 대한 국제 참조 표준의 밀크 응고 활성.
T표준:
표준 희석에 대해 얻은 초 단위의 응고 시간.
D샘플:
샘플의 희석 계수
D표준:
표준의 희석 계수
T샘플:
희석된 레넷 샘플에 대해 효소 첨가로부터 침전 시간까지 얻은 초 단위의 응고 시간.
대안적으로, μIMCU 방법은 REMCAT 방법 대신 사용될 수 있다. REMCAT과 비교하였을 때, μIMCU 분석에서 키모신 변이체의 침전 시간은 UV/VIS 플레이트 판독기의 800nm에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 OD 측정에 의해 결정된다. 알려진 응고 강도를 가지는 참조 표준의 다양한 희석의 표준 곡선이 각 플레이트에 기록된다. 샘플은 효소를 84mM 아세테이트 완충액, 0.1% triton X-100, pH 5.5에서 희석하여 준비한다. 32℃에서의 반응은 4% (w/w) 저열량, 저지방 분유 및 7.5% (w/w) 염화칼슘 (pH 
6.5)을 함유한 표준 밀크 기질 250uL를 25uL의 효소 샘플에 추가하는 것으로 시작된다. ml 당 국제 밀크 응고 단위 (IMCU)에서의 키모신 변이체의 밀크 응고 활성은 표준 곡선에 대한 샘플 침전 시간에 기초하여 결정된다.
총 단백질 함량의 결정
바람직하게는, 상기 총 단백질 함량은 제공자의 지시에 따른 써모 싸이언티픽 (Thermo Scientific)의 피어스 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce BCA Protein Assay Kit)를 사용하여 결정된다.
특이적 응고 활성의 계산
특이적 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)은 응고 활성 (IMCU/ml)을 총 단백질 함량 (ml 당 총 단백질의 mg)으로 나눔으로써 결정될 수 있다.
변이체의
명명법
본 발명의 변이체를 기술하는데에 있어서, 아래에서 설명되는 명명법은 참조의 용이성을 위해 채택된다. 허용된 IUPAC 단일 문자 또는 세 문자의 아미노산 약어가 사용된다.
아래의 "명명법" 섹션에서 논의된 특정 변이체는 본 발명의 관련 변이체가 아닐 수 있다 - 즉, 이 "명명법" 섹션은 본 명세서에서 관련되어 사용된 명명법을 설명하기 위한 것이다. 상기 표시된 바와 같이, 본 발명의 키모신 폴리펩티드 변이체를 특정하기 위해 사용된 아미노산 넘버링은 성숙 키모신 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 위치에 기초한다.
치환. 아미노산 치환의 경우, 다음의 명명법이 사용된다. 즉 원래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 226 위치에서 트레오닌을 알라닌으로 이론적 치환하는 것은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로 표시된다. 다중 돌연변이는, 예를 들어, 각각 205 및 411 위치에서 글리신 (G)을 아르기닌 (R)으로 및 세린 (S)을 페닐알라닌 (F)으로 치환하는 것을 나타내는 "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R + S411F"와 같이 첨가 기호 ("+")로 구분된다. 예를 들어 "226A"로 표시된 치환은 226 위치에서 모체 아미노산 (예를 들어 T, Q, S 또는 다른 모체 아미노산)을 알라닌으로 치환하는 것을 뜻한다.
결실. 아미노산 결실의 경우, 다음의 명명법이 사용된다. 즉 원래의 아미노산, 위치, *. 따라서, 195 위치에서 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"로 표시된다. 다중 결실은, 예를 들어, "Gly195* + Ser411*" 또는 "G195* + S411*"와 같이 첨가 기호 ("+")로 구분된다.
삽입. 아미노산 삽입의 경우, 다음의 명명법이 사용된다. 즉 원래의 아미노산, 위치, 원래의 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서, 195 위치에서 글리신 뒤에 리신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 표시된다. 다중 아미노산의 삽입은 [원래 아미노산, 위치, 원래의 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등.]으로 표시된다. 예를 들어, 195 위치에서 글리신 뒤에 리신과 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표시된다.
그러한 경우, 삽입된 아미노산 잔기(들)에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자를 첨가함으로써 삽입된 아미노산 잔기(들)의 번호가 매겨진다. 상기 예시에서, 서열은 다음과 같다.
다중 변형. 다중 변형을 포함하는 변이체는, 예를 들어, 170 및 195 위치에서 각각 아르기닌 및 글리신에 대한 타이로신 및 글루탐산의 치환을 나타내는 "Arg170Tyr + Gly195Glu" 또는 "R170Y + G195E"와 같이 첨가 기호 ("+")로 구분된다.
상이한 치환. 상이한 치환이 한 위치에 도입 될 수 있는 경우, 상이한 치환은 쉼표로 구분되며, 예를 들어, "Arg170Tyr,Glu" 또는 "R170Y,E"는 170 위치에서 타이로신 또는 글루탐산으로 아르기닌을 치환하는 것을 나타낸다. 그러므로, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" 또는 "Y167G,A + R170G,A"는 다음의 변이체를 나타낸다.
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".
바람직한
변이체
본 명세서에서 개괄된 바와 같이, 본 발명의 발명자는 상응하는 모체 폴리펩티드와는 상이한 원하는 빈도로 αS1-카세인을 절단하되 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신과 비교하여 2 이상의 인자만큼 변이체의 C/P 값을 증가시키는 다수의 바람직한 키모신 폴리펩티드 변이체를 제조하였다.
αS1
-카세인 절단
활성이 감소한 바람직한
변이체
본 발명의 바람직한 키모신 폴리펩티드 변이체는 (a) C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체 및 (b) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체인 것을 특징으로 하며, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
바람직한 측면에서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만 또는 20% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단한다. 본 발명의 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리 펩티드 특성이 있는 단리된 된 낙타 키모신 폴리펩티드의 C/P 값의 200% 이상인 C/P 값을 가지며, 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 C/P 값의 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 900% 이상, 1200% 이상 또는 1400% 이상의 C/P 값을 포함한다.
상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신) 또는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다.
밀접하게 관련된 측면에서, (a) C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체 및 (b) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체인 것을 특징으로 하며, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환, 즉 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D , G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L 및/또는 V317L 중 하나 이상을 포함하며, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
또한, 바로 위에 기술된 αS1-카세인 절단 활성이 감소한 단리된 키모신 폴리펩티드는 다음의 치환 조합, 즉
Y21S + H76Q + Y307F + V317L,
R61S + L166V + T239S,
V32L + E294Q + R316L + V317L,
S226T + G244D + I263L + G289S,
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F,
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S,
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E,
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T,
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A,
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I,
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D,
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D,
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I,
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D,
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W,
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T,
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y,
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I,
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y,
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D,
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y,
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L,
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L,
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I,
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V,
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I,
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V,
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L,
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D,
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I,
H76Q + N100Q + N291Q,
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q,
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L,
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I,
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E,
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H.
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I ,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D ,
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D ,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I ,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D ,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D ,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D 또는
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D
중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 각각의 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
αS1
-카세인 절단 활성이 증가한 바람직한
변이체
본 발명의 바람직한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 (a) C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체 및 (b) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 초과의 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체인 것을 특징으로 하며, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다.
바람직한 측면에서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 성숙 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 125% 이상, 130% 이상, 140% 이상, 145% 이상 또는 150% 이상의 빈도로 αS1-카세인을 절단한다. 상기 αS1-카세인 절단 활성이 증가한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 C/P 값의 200% 이상인 C/P 값을 가지며, 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 C/P 값의 200% 이상, 300% 이상, 500% 이상, 900% 이상, 1200% 이상 또는 1400% 이상인 C/P 값을 포함한다. 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신) 또는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다.
밀접하게 관련된 측면에서, (a) C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체 및 (b) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 초과의 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체인 것을 특징으로 하며, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환, 즉 V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 하나 이상을 포함하며, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
또한, 바로 위에 기술된 αS1-카세인 절단 활성이 증가한 단리된 키모신 폴리펩티드는 다음의 치환 조합, 즉
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N,
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q,
Y21S + R61S + H146R,
R61S + G163E + M256L + S277N,
D59N + S271P + T284S,
V248I + S226T + E294Q,
S74F + G244D + S271P,
V221K + V248I + S255Y,
V183I + G251W + M256L,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
D98V + G251D + M256L +
V259I,
V183I + V248I + G244D + T284S,
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D,
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L,
H146R + D158S + S273Y,
S74F + V259I + Y268F,
G70N + D98V + V136I,
I96L + M142I + R145Q + H146R,
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
S132A + Q188E + F223V,
I200V + G251D + G289S,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
F223V + G251W + S273Y + D279E,
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S,
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L,
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A,
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T,
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P,
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q
V32L + N100Q + N291Q,
N292H + N100Q + N291Q,
V221K + N100Q + N291Q,
I297A + N100Q + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N,
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H,
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H,
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q,
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q,
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q,
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L,
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q 및/또는
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231
중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 각각의 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.
본 발명의 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 천연 키모신 폴리펩티드에 대해 전반적으로 높은 서열 동일성을 유지한다. 예를 들어, 본 발명의 상기 폴리펩티드 변이체는 바람직하게는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 85%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상을 포함하여, 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드와의 서열 동일성이 80% 이상이다.
전술한 바와 같이 - 예를 들어, 본 명세서에서 논의된 컴퓨터 서열 정렬 프로그램에 기초하여 - 본 명세서의 관심 있는 관련 키모신 폴리펩티드 (예를 들어 낙타, 양, 소 등)의 관련 아미노산 위치를 결정하는 것은 당업자에게 일상적인 작업이다.
예를 들어, 서열 번호 2의 야생형 낙타 키모신 폴리펩티드와 비교하여 예시적으로 5-10 개의 변형 (예를 들어, 치환)을 가지는 낙타 키모신 변이체는 여전히 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타)와의 서열 동일성이 65% 이상인 모체 폴리펩티드일 것이다.
바꾸어 말하면, 본 명세서에서 관련된 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 본 명세서에서 청구된 위치 이외의 다른 위치에서의 변형 (예를 들어, 치환)을 포함 할 수 있다.
본 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 - 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신 - 즉 서열 번호 1의 아미노산 59 내지 381번 위치)와 예를 들어, 성숙한 양, C.박테리아누스, 낙타, 돼지 또는 쥐의 본 명세서에서 관련된 서열 동일성 퍼센트는 상기 언급된 서열 동일성 퍼센트와 비교적 유사하다.
바람직한 구현예에서 - 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 92% 이상이며, 보다 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 95% 이상이고, 더더욱 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 97% 이상이다. 모체 폴리펩티드가 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)인 것이 바람직할 수 있다.
단리된 낙타 키모신 변이체가 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 비교하여 30개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있거나, 또는 단리된 낙타 키모신 변이체가 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 비교하여 20개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있고, 또는 단리된 낙타 키모신 변이체가 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 비교하여 10개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 또는 단리된 낙타 키모신 변이체가 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 비교하여 5개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
본 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 - "상기 단리된 변이체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 100% 미만이다" 라는 용어는 본 명세서에 기술된 단리된 낙타 키모신 변이체가 서열 번호 2의 공지된 성숙 야생형 낙타 키모신 서열과 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖지 않으리라는 것과 관련이 있다.
하나 이상의 변형은 치환인 것이 바람직할 수 있다 - 즉, 본 명세서에서 관련된 바람직한 구현예는 상기 변형이 본 명세서에서 청구된 임의의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체에 관한 것이다.
바람직하게는, 모체 폴리펩티드는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신) 및/또는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%이다.
하나의 예시로서 - 예를 들어, 소 키모신 A가 될 수 있는 본 명세서의 적합한 관련된 모체 폴리펩티드 - 본 기술 분야에서 공지된 바와 같이 소 키모신 A는 본 명세서의 서열 번호 1의 소 키모신 B와 비교하여 단지 하나의 아미노산 차이만을 가질 수 있다.
본 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 - 본 명세서에서 키모신 활성을 가지는 관련된 모체 폴리펩티드는 이미 일례의 야생형 키모신에 상응하는 일례의 변이체가 될 수 있을 것이다.
예를 들어, 서열 번호 1의 성숙 야생형 소 키모신 폴리펩티드와 비교하여 예시적으로 5-10개의 변형 (예를 들어, 치환)을 가지는 소 키모신 변이체는 여전히 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와의 서열 동일성이 95% 이상인 모체 폴리펩티드일 것이다.
바꾸어 말하면 일반적으로 - 본 명세서에서 관련된 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 본 명세서에서 청구된 위치 이외의 다른 위치에서의 변형 (예를 들어, 치환)을 포함할 수 있다.
본 문맥에서 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 - 단리된 키모신 변이체는 상기 제시된 것 이외의 다른 아미노산 위치에서의 변형 (예를 들어, 치환)을 포함 할 수 있다.
예를 들어, 서열 번호 1의 야생형 소 키모신 폴리펩티드와 비교하여 예시적으로 5-10개의 변형 (예를 들어, 치환)을 가지는 소 키모신 변이체는 여전히 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와의 서열 동일성이 95% 이상인 모체 폴리펩티드일 것이다.
단리된 소 키모신 변이체가 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 비교하여 30개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있거나, 또는 단리된 소 키모신 변이체가 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 비교하여 20개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있고, 또는 단리된 소 키모신 변이체가 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 비교하여 10개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있으며, 또는 단리된 소 키모신 변이체가 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 비교하여 5개 미만의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 것이 바람직할 수 있다.
바꾸어 말하면 - 성숙한 소 키모신과의 서열 동일성이 65% 이상인 성숙한 모체 키모신 폴리펩티드 (예를 들어, 양 또는 돼지)는 본 발명과 연관되는데 있어, 예를 들어 소 또는 낙타 키모신과 충분한 구조적 동일성을 가진다고 믿어진다 - 즉, 본 문맥에서 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상인 성숙한 모체 키모신 폴리펩티드 (예의 예를 들어, 양 또는 쥐)는 본 명세서에서 기술된 임의의 아미노산 위치에서 변이체를 만듦으로써 개선되기 위해, 본 명세서의 예를 들어 소 또는 낙타 키모신과 충분한 구조적 동일성으로 가진다고 간주될 수 있다.
서열 번호 2의 낙타 키모신 폴리펩티드는 서열 번호 1의 소 폴리펩티드와의 서열 동일성이 84%이다 (즉, 프리 및 프로 서열을 포함하는 1 내지 381 위치의 완전한 서열 번호 1).
단리된 키모신 폴리펩티드
변이체의 제조 방법
본 발명은 또한 (a) C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체 및 (b) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체인 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(a): 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 내 하나 이상의 위치에서 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 치환, 즉 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, R242E, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, T239S, G251D, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L, V317L 중 하나 이상을 포함하는 변형을 행하는 단계.
(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계.
관련된 측면에서, 본 발명은 또한 (a) C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체 및 (b) 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 초과의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인을 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체인 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(a): 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 내 하나 이상의 위치에서 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 치환, 즉 V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 하나 이상을 포함하는 변형을 행하는 단계.
(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계.
위에서 논의된 바와 같이 - 본 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 당업자는 그의 통상의 일반적인 지식에 기초하여, 키모신 및 키모신 변이체를 일상적으로 생성 및 정제할 수 있을 것이다.
바꿔 말하면, 당업자가 관심 있는 키모신의 활성 (예를 들어 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐에게서 유래한)을 가지는 본 명세서의 관련된 모체 폴리펩티드 및 본 명세서에서 개시된 지침을 얻는다면, 당업자가 관심 있는 모체 키모신의 변이체를 제조하는 것은 일상적인 작업일 것이다.
키모신 (변이체 또는 모체)를 생성 및 분리하기 위한 적합한 방법의 예로는 잘 알려진, 예를 들어 WO02/36752A2 (Chr. Hansen)에 기술된 곰팡이 재조합 발현/생산 기반 기술 (fungal recombinant expression/production based technology)을 들 수 있다.
당업자가 키모신 활성을 가지는 모체 폴리펩티드의 하나 이상의 위치에서 변형을 행하는 것 역시 일상적인 작업이며, 상기 변형은 본 명세서에 개시된 바와 같은 적어도 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 이는 소위 부위 지정 돌연변이 유도 (site directed mutagenesis) 및 재조합 발현/생산 기반 기술로 수행할 수 있다.
당업자가 본 명세서에서 관련된 모체 폴리펩티드 (예를 들어, 낙타 또는 소 야생형 키모신) 및/또는 본 명세서에서 관련된 변이체가 키모신 활성을 가지는지 여부를 결정하는 것 역시 일상적인 작업이다.
본 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 키모신 특이성은 특이적 응고 활성 (C)을 단백질 분해 활성 (P)으로 나누어 결정하는, 소위 C/P 값에 의해 결정될 수 있다. 본 기술 분야에서 공지된 바와 같이, 보다 높은 C/P 값은 일반적으로 예를 들어, 비특이적 단백질 분해로 인한 치즈 제조 공정에서 단백질 손실이 감소한다는 것, 즉 치즈의 수율이 향상된다는 것을 암시한다.
또한 본 기술 분야에서 공지된 바와 같이, αS1-카세인 절단 및 αS1-카세인 (αS1(1-23)을 포함하는) 형성은 본 기술 분야의 당업자가 이용 가능한 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
실시예에서 추가적인 방법이 제공된다.
밀크 기반 제품의 제조 방법
위에서 논의된 바와 같이 - 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 본 기술 분야에 따라 - 예를 들어, 관심 있는 밀크 기반 제품 (예를 들어 치즈 제품)을 제조 하는 데에 사용될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이 - 본 발명의 한 측면은 식품 또는 사료 성분(들)에 본 명세서에 기술된 바와 같은 유효량의 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 첨가하는 단계 및 상기 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 추가의 제조 단계를 수행하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 식품 또는 사료 제품은 밀크 기반 제품이고, 상기 방법은 밀크에 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 첨가하는 단계 및 추가의 제조 단계를 수행하여 밀크 기반 제품을 얻는 단계를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 키모신 폴리펩티드 변이체는 밀크의 발효 후 밀크 기반 제품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 키모신 폴리펩티드 변이체는 치즈를 생산하는 방법의 한 부분으로서 발효유 제품의 응집을 위해 첨가된다.
상기 밀크는 예를 들어 두유, 양 젖, 염소 젖, 버팔로 젖, 야크 젖, 라마 젖, 낙타 젖 또는 암소 젖일 수 있다.
상기 밀크 기반 제품은 예를 들어 쿠아르크(quark) 또는 치즈와 같은 발효유 제품일 수 있다.
식품 및 사료 제품
본 발명은 또한 본 발명의 키모신 폴리펩티드 변이체 또는 본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 키모신 폴리펩티드 변이체를 포함하는 식품 및 사료 제품을 제공한다. 상기 식품 및 사료 제품은 바람직하게는 치즈 및 쿠아르크를 포함하는, 발효유 제품과 같은 발효 식품이다.
대안적으로, 그러나 관련 측면에서, 상기 발명은 아래에 열거된 항목들에 관한 것이다.
항목 1. 모체 폴리펩티드와 비교하여 αS1-카세인 절단 빈도가 변경된 분리 된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(a): 모체 폴리펩티드의 위치 Y11I, Y11V, L12M, K19T, Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, T239S, R242E, G251D, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L, V317L, V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 어느 하나에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변형을 행하는 단계.
(b): 단계 (a)의 변경된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계,
그런데 여기에서,
(i): 상기 모체 폴리펩티드의 아미노산 위치는 모체 폴리펩티드와 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)의 정렬에 의해 결정되고,
(ii): 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와의 서열 동일성이 65% 이상 및/또는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 65% 이상이다.
항목 2. 항목 1에 있어서, 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드를 포함하는 소 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도와 비교하여 낮은 αS1-카세인 절단 빈도를 제공하는 키모신 활성 및/또는
- 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하는 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도와 비교하여 낮은 αS1-카세인 절단 빈도를 제공하는 키모신 활성.
항목 3. 항목 2에 따른 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법으로서, 상기 변형은 다음의 치환, 즉 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, T239S, R242E, G251D , G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L 및/또는 V317L 중 하나 이상의 치환인 것을 특징으로 하는 방법.
항목 4. 항목 2 및 3 중 어느 하나의 항목에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 위치 조합, 즉
Y21S + H76Q + Y307F + V317L,
R61S + L166V + T239S,
V32L + E294Q + R316L + V317L,
S226T + G244D + I263L + G289S,
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F,
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S,
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E,
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T,
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A,
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I,
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D,
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D,
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I,
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D,
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W,
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T,
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y,
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I,
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y,
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D,
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y,
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L,
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L,
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I,
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V,
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I,
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V,
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L,
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D,
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I,
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q,
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L,
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I,
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E,
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H,
H76Q + N100Q + N291Q,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I ,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D ,
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D ,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I ,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D 또는
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D
과 상응하는 하나 이상의 위치 조합에서의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
항목 5. 항목 1에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드를 포함하는 소 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도와 비교하여 높은 αS1-카세인 절단 빈도를 제공하는 키모신 활성 및/또는
- 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하는 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도와 비교하여 높은 αS1-카세인 절단 빈도를 제공하는 키모신 활성.
항목 6. 항목 5에 있어서, 상기 변형은 다음의 치환, 즉 V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 하나 이상의 치환인 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법.
항목 7. 항목 5 및 6 중 어느 하나의 항목에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 위치 조합, 즉
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N,
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q,
Y21S + R61S + H146R,
R61S + G163E + M256L + S277N,
D59N + S271P + T284S,
V248I + S226T + E294Q,
S74F + G244D + S271P,
V221K + V248I + S255Y,
V183I + G251W + M256L,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
D98V + G251D + M256L +
V259I,
V183I + V248I + G244D + T284S,
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D,
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L,
H146R + D158S + S273Y,
S74F + V259I + Y268F,
G70N + D98V + V136I,
I96L + M142I + R145Q + H146R,
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
S132A + Q188E + F223V,
I200V + G251D + G289S,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
F223V + G251W + S273Y + D279E,
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S,
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L,
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A,
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T,
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P,
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q,
V32L + N100Q + N291Q,
N292H + N100Q + N291Q,
V221K + N100Q + N291Q,
I297A + N100Q + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N,
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H,
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H,
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q,
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q,
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q,
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L,
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q 및/또는
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231
과 상응하는 위치를 포함하는 하나 이상의 위치 조합에서의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나의 항목에 있어서, 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 95% 이상인 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법.
항목 9. 키모신 활성을 가지는 모체 폴리펩티드와 비교하여 위치 Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, T239S, R242E, G251D , G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L 및/또는 V317L 중 임의의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체로, 여기에서
(i): 상기 모체 폴리펩티드의 아미노산 위치는 모체 폴리펩티드와 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)의 정렬에 의해 결정되고,
(ii): 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 65% 이상이고,
상응하는 모체 폴리펩티드보다 낮은 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
항목 10. 항목 9에 있어서, 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상인 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
항목 11. 항목 9 내지 10 중 어느 하나의 항목에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 위치 조합, 즉
Y21S + H76Q + Y307F + V317L,
R61S + L166V + T239S,
V32L + E294Q + R316L + V317L,
S226T + G244D + I263L + G289S,
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F,
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S,
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E,
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T,
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A,
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I,
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D,
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D,
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I,
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D,
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W,
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T,
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y,
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I,
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y,
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D,
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y,
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L,
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L,
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I,
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V,
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I,
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V,
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L,
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D,
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I,
H76Q + N100Q + N291Q,
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q,
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L,
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I,
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E,
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H.
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D 또는
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D
과 상응하는 하나 이상의 위치 조합에서의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
항목 12. 키모신 활성을 가지는 모체 폴리펩티드와 비교하여 위치 V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P 중 임의의 위치에 상응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체로, 여기에서
(i): 상기 모체 폴리펩티드의 아미노산 위치는 모체 폴리펩티드와 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)의 정렬에 의해 결정되고,
(ii): 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 65% 이상이고,
상응하는 모체 폴리펩티드보다 높은 빈도로 αS1-카세인을 절단하는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
항목 13. 항목 12에 있어서, 상기 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상인 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
항목 14. 항목 9 내지 10 중 어느 하나의 항목에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 위치 조합, 즉
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N,
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q,
Y21S + R61S + H146R,
R61S + G163E + M256L + S277N,
D59N + S271P + T284S,
V248I + S226T + E294Q,
S74F + G244D + S271P,
V221K + V248I + S255Y,
V183I + G251W + M256L,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
D98V + G251D + M256L +
V259I,
V183I + V248I + G244D + T284S,
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D,
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L,
H146R + D158S + S273Y,
S74F + V259I + Y268F,
G70N + D98V + V136I,
I96L + M142I + R145Q + H146R,
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
S132A + Q188E + F223V,
I200V + G251D + G289S,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
F223V + G251W + S273Y + D279E,
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S,
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L,
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A,
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T,
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P,
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q,
V32L + N100Q + N291Q,
N292H + N100Q + N291Q,
V221K + N100Q + N291Q,
I297A + N100Q + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N,
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H,
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H,
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q,
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q,
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q,
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L,
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q 및/또는
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231.
과 상응하는 하나 이상의 위치 조합에서의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
항목 15. 항목 9 내지 14 중 어느 하나의 항목에 있어서, 유효량의 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체를 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하는 단계 및 상기 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 추가의 제조 단계를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법.
항목 16. 항목 15에 있어서, 상기 식품 또는 사료 제품은 밀크 기반 제품인 것을 특징으로 하는 방법
항목 17. 치즈 제조 공정에서의, 항목 9 내지 12 중 어느 하나의 항목에 따른 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도.
항목 18. 파스타 필라타, 체다 및 콘티넨탈 타입 치즈 제조 공정에서의, 항목 9 내지 14 중 어느 하나의 항목에 따른 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도.
항목 19. 소프트 치즈 또는 화이트 브라인 치즈 제조 공정에서의, 항목 9 내지 14 중 어느 하나의 항목에 따른 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도.
본 발명의 또 다른 관련 측면은 본 명세서에 기술된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하는 단계 및 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 추가의 제조 단계를 수행하는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법에 관한 것으로, 특히 상기 식품 또는 사료 제품은 밀크 기반 제품인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이 치즈를 제조하는 공정에서의 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도 역시 본 발명에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 용도는 파스타 필라타, 체다 및 콘티넨탈 타입 치즈를 제조하는 공정에서의 상응하는 모체 펩티드보다 αS1-카세인 절단 빈도가 낮은 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도 및/또는 소프트 치즈, 화이트 브라인 및 장기 숙성 고우다 치즈를 제조하는 공정에서의 상응하는 모체 펩티드보다 αS1-카세인 절단 빈도가 높은 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도인 것을 특징으로 한다.
용어의 정의
본 명세서에서 관련된 용어의 모든 정의는 본 명세서의 관련된 기술 문맥에 관하여 당업자가 이해할 수 있는 내용에 따른다.
"αS1-절단" 또는 "αS1-카세인의 절단"이란 용어는 αS1-카세인의 효소적 절단을 의미한다. 예를 들어, Phe23 및 Phe24 사이의 절단은 αS1(1-23) 펩티드의 형성을 초래한다.
한 측면에서, αS1-절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-절단 펩티드 1-23을 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q- TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC에 의해 수행된다. αS1-카세인 절단을 결정하는 바람직한 방법에 대한 자세한 내용은 실시예에 기술되어 있다.
"키모신"이란 용어는 EC 3.4.23.4 클래스의 효소에 관한 것이다. 키모신은 높은 특이성을 가지고 있으며 주로 카세인의 κ-사슬에서 단일 104-Ser-Phe-|-Met-Ala-107 결합의 절단에 의해 밀크를 응고시킨다. 부작용으로, 키모신은 또한 주로 Phe23 및 Phe24 사이의 α-카세인을 절단한다 (참조 문헌 2,3). 형성 된 펩티드 αS1(1-23)은 숙성 치즈 (참조 문헌 4)에 첨가된 미생물 배양체로부터 단백질 분해 효소에 의해 분해될 것이다. 본 기술 분야에서 사용되는 키모신의 다른 이름은 렌닌 (rennin)이다.
"키모신 활성"이란 용어는 본 문맥에서 당업자가 이해하는 키모신 효소의 키모신 활성에 관한 것이다.
당업자는 본 명세서의 관련된 키모신 활성을 결정하는 방법을 알고 있다.
"특이적 응고 활성"이란 용어는 키모신 폴리펩티드의 밀크 응고 활성을 말하며, 본 기술 분야에 공지된 분석에 따라 결정될 수 있다. 단백질의 IMCU/㎎ 으로 특이적 응고 활성을 결정하는 바람직한 방법은 국제낙농연합회 (International Dairy Federation, IDF 방법)에 의해 개발된 표준 방법이고, 이는 밀크 응고 활성이 밀크 기질이 가시적으로 응집하는데 필요한 시간으로부터 결정되는 단계 및 샘플의 응고 시간과 알려진 밀크 응고 활성 및 IDF 표준 110B에 따른 상기 샘플과 동일한 효소 조성을 가진 참조 표준의 응고 시간을 비교하는 단계를 포함한다. 샘플 및 참조 표준은 동일한 화학적 및 물리적 조건 하에서 측정된다. 상기 IDF 방법에 대한 자세한 내용은 실시예에 기술되어 있다.
본 기술 분야에서 공지된 바와 같이 - 본 명세서에 관련된 소위 C/P 값은 특이적 응고 활성 (C)를 단백질 분해 활성 (P)으로 나누어 결정된다.
본 기술 분야에서 공지된 바와 같이 - 보다 높은 C/P 값은 일반적으로 예를 들어, 치즈 제조 중의 비특이적 단백질 분해에 의한 단백질 손실이 감소되고, 즉 치즈의 수율이 향상됨을 암시한다. C/P 값의 차이는 백분율로 정의할 수 있다. 예를 들어, C/P 값 20은 C/P 값 40의 50%에 해당할 것이다.
"단리된 변이체"란 용어는 사람의 행위로 조작된 변이체를 의미한다. 한 측면에서, 상기 변이체는 SDS PAGE에 의해 결정되는 바에 따라 1% 이상 순수, 예를 들어, 5% 이상 순수, 10% 이상 순수, 20% 이상 순수, 40% 이상 순수, 60% 이상 순수, 80% 이상 순수 및 90% 이상 순수하다.
본 발명의 키모신 폴리펩티드 변이체를 특정하기 위해 본 명세서에서 사용된 아미노산 넘버링은 성숙 펩티드 넘버링에 기초한다. 본 출원과 함께 제공된 서열 목록에서,
서열 번호 1은 소 프리-프로키모신의 완전한 폴리펩티드 서열을 나타내고,
서열 번호 2는 낙타 프리-프로키모신의 완전한 폴리펩티드 서열을 나타내고,
서열 번호 3은 성숙한 소 키모신의 폴리펩티드 서열을 나타내고,
서열 번호 4는 성숙한 낙타 키모신의 폴리펩티드 서열을 나타낸다.
바꿔 말하면, 서열 번호 3 및 4는 각각 서열 번호 1 및 2의 아미노산 59 내지 381에 상응한다. 본 명세서에서 확인된 모든 특정 치환은 성숙 키모신 서열의 위치, 즉 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 넘버링과 관련하여 확인된다. 서열 번호 1 또는 2의 아미노산 넘버링과 관련하여 상기 위치가 확인되는 한, 서열 번호 1 또는 2의 상기 위치를 확인하기 위해 58 잔기를 첨가해야 한다.
"성숙 폴리펩티드"란 용어는 N-말단 프로세싱, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등과 같은 번역 및 임의의 번역 후 변형에 따르는 최종 형태의 펩티드를 의미한다. 본 문맥에서, 본 명세서에 관련된 성숙 키모신 폴리펩티드는 활성 키모신 폴리펩티드 서열 - 즉, 프리-부분 및/또는 프로-부분 서열이 없는 것으로 간주된다. 본 명세서에서 성숙 폴리펩티드의 관련된 실시예는 예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래된 서열 번호 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신) 또는 서열 번호 2의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래된 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)이다.
"모체" 또는 "키모신 활성을 가지는 모체 폴리펩티드"란 용어는 본 발명의 효소 변이체를 생성하기 위해 변형이 가해진 폴리펩티드를 의미한다. 상기 모체는 자연 발생 (야생형) 폴리펩티드 또는 이의 변이체일 수 있다.
"서열 동일성"이란 용어는 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS : European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등., 2000, Trends Genet. 16 : 276-277)의 Needle 프로그램에서 실행된 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 : 443-453), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상을 사용하여 결정될 수 있다. 사용된 선택적 매개 변수는 갭 오픈 패널티가 10, 갭 확장 패널티가 0.5 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. "가장 긴 아이덴티티" (-nobrief 옵션을 사용하여 얻은)라고 표시된 Needle의 출력은 백분율로 사용되며 다음과 같이 계산된다.
(동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬에서의 총 갭 수).
본 발명의 목적을 위해, 2개의 디옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등, 2000, 상기 참조)의 Needle 프로그램에서 실행된 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, 상기 참조), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상을 사용하여 결정된다. 선택적 매개 변수는 갭 오픈 패널티가 10, 갭 확장 패널티가 0.5 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 행렬이다. "가장 긴 아이덴티티" (-nobrief 옵션을 사용하여 얻은)라고 표시된 Needle의 출력은 백분율로 사용되며 다음과 같이 계산된다.
(동일한 디옥시리보뉴클레오티드 × 100)/(정렬 길이 - 정렬에서의 총 갭 수).
"변이체"란 용어는 하나 이상의 (수 개의) 위치에서의 변형, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 키모신 활성을 가지는 펩티드를 의미한다. 치환은 위치를 차지하는 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미하고, 결실은 위치를 차지하는 아미노산의 제거를 의미하며, 그리고 삽입은 위치를 차지하는 아미노산에 인접하여 1-3 개의 아미노산을 첨가하는 것을 의미한다.
아미노산은 천연 또는 비 천연 아미노산일 수 있다 - 예를 들어, 일례로 D-알라닌의 특정한 D-이성질체 (또는 D-형태)와의 치환이 이론적으로 가능할 수 있다.
"야생형"이란 용어는 자연에서 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 펩티드 서열, 즉 사람의 행위에 의한 표적 돌연변이의 대상이 되지 않은 뉴클레오티드 서열 또는 펩티드 서열을 의미한다.
실시예
실시예
1: 키모신 단백질 서열 및
변이체
서열의 정렬 및
넘버링
키모신 단백질 서열은 EBI (EBI, 도구, 다중 서열 정렬, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)에 의해 제공되고, Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG(2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948에 기술된 ClustalW 알고리즘을 사용하여 정렬되었다.
다중 서열 정렬에 대한 ClustalW2 설정은 단백질 가중 행렬 = BLOSUM, 갭 오픈 = 10, 갭 확장 = 0,05, 갭 간격 = 8, 갭의 끝 없음, ITERATION = 없음, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ 이다.
참고 서열로서, N-말단 메티오닌이 번호 1 (MRCL......)을 가지며 C-말단 이소류신 (단백질 서열 ....LAKAI에서)이 번호 381을 가지는 소 키모신 B 프리프로키 모신이 사용되었다 (Genbank 수탁 번호 P00794 - 본 명세서에서 서열 번호 1로 개시되었다).
실시예
2: 키모신
변이체의
설계
키모신 변이체는 다른 전략을 사용하여 설계되었다.
본 명세서에서 낙타 키모신에 관해 언급될 때, 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하는 낙타 키모신이 언급된다.
서열 번호 2의 낙타 키모신은 그의 낙타 키모신 변이체를 제조하는데 사용되는 키모신 활성을 가지는 본 명세서에 관련된 모체 폴리펩티드로 간주될 수 있다.
본 명세서에서 소 키모신에 대해 언급될 때, 서열 번호 1의 폴리펩티드를 포함하는 소 키모신이 언급된다.
서열 번호 1의 소 키모신은 그의 소 키모신 변이체를 제조하는데 사용되는 키모신 활성을 가지는 관련된 모체 폴리펩티드로 간주될 수 있다.
낙타 키모신의 변이체 1 내지 269 및 367 내지 461은 소 키모신 B와 비교하여 25% 이상의 동일성을 가지는 공지된 아스파르틱 단백질 분해 효소 서열의 많은 세트의 정렬에 기초하여 설계되었다.
변이는 일반적으로 종 간의 아미노산 변이 수준이 높은 지역에서 도입되었지만, 보존된 지역은 변하지 않았다. 아미노산 치환은 알파 카세인 절단에 유익한 효과를 나타내는 높은 확률의 변화를 확인하기 위해 계통발생학적, 구조적 및 실험적 정보에 기초하여 선택되었다. 다중 변이가 각 단일 돌연변이가 다양한 치환 사이의 공변량의 영향을 최소화하기 위해 다중 변이체 구조에 존재하도록 하며, 각 변이체 구조에 도입되었다. 기계 학습 및 실험적 데이터의 통계 분석은 키모신 변이체의 측정된 응고 성능에 대한 아미노산 치환의 상대적인 기여를 결정하는데 사용되었다 (참조 문헌 14, 15).
변이체 270 내지 366은 소 키모신 (PDB 코드:4AA8) 및 낙타 키모신 (PDB 코드:4AA9)의 상세한 구조적 분석에 기초하여 설계되었다. 변이는 각각의 아미노산 곁사슬의 화학적 성질 및 카세인 기질 결합 또는 일반적인 효소 특성에 대한 예상되는 영향에 기초하여 선택되었다. 변이체 270 내지 346에서의 아미노산 치환의 대부분은 기질 결합 틈 내 또는 구조적으로 아주 근접한, 또는 결합된 카세인 기질과 접촉하는 2차 구조 요소에서의 서열 위치에서 만들어졌다. 뿐만 아니라, 변화가 이러한 영역 (참조 문헌 5)의 전하 프로파일을 변경하는 단백질 표면상의 위치에서 만들어졌고 따라서 효소 성능에 영향을 줄 것으로 예상된다. 변이체 347 내지 366은 소 및 낙타 키모신의 N-말단 서열의 다른 구조적 형태에 기반하여 만들어졌다. 아미노산 치환은 낙타 키모신의 N-말단과 상호 작용하는 기질 결합 틈 내의 위치에서 만들어졌다.
실시예
3: 키모신
변이체
효소 물질의 제조
모든 키모신 변이체는 합성 유전자로 합성되었고, 예를 들어 pGAMpR-C (WO02/36752A2에 기술된)와 같은 곰팡이 발현 벡터에 클로닝되었다.
상기 벡터는 대장균 (E. coli)으로 형질 전환되었고 플라스미드 DNA는 본 기술 분야의 당업자에게 공지된 표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 정제되었다.
상기 변이체 플라스미드는 개별적으로 검정곰팡이 (Aspergillus niger) 또는 위소성국균 (Aspergillus nidulans) 균주로 형질 전환되었고 단백질은 WO02/36752A2에 기술된 바와 같이 본질적으로 제조되고 표준 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제되었다.
본 기술 분야에 공지된 바와 같이 - 당업자는 그의 통상의 일반적인 지식에 기초하여, 본 명세서에서 소 및 낙타 키모신 변이체로 기술된 바와 같은 키모신 및 키모신 변이체를 생성 및 정제 할 수 있을 것이다.
실시예
4: 특이적 키모신 활성의 결정
4.1 밀크 응고 활성의 결정
밀크 응고 활성은 국제낙농연합회 (International Dairy Federation, IDF method)에 의해 개발된 표준 방법인 REMCAT 방법을 사용하여 결정되었다.
밀크 응고 활성은 리터 당 0.5g의 염화칼슘 용액 (pH 
6.5)의 저열량, 저지방 분유로 준비된 표준 밀크 기질을 가시적으로 응집하는데 필요한 시간으로부터 결정된다. 레넷 (rennet) 샘플의 응고 시간과 알려진 밀크 응고 활성 및 IDF 표준 110B에 따른 상기 샘플과 동일한 효소 조성을 가진 참조 표준의 응고 시간을 비교한다. 샘플 및 참조 표준은 동일한 화학적 및 물리적 조건 하에서 측정되었다. 변이체 샘플은 pH 5.5의 84 mM 아세트산 완충액을 사용하여 약 3 IMCU/ml로 조정되었다. 이후, 일정한 교반 하에서 32℃ ± 1℃의 일정한 온도를 유지할 수 있는 수조에 놓인 유리 시험관에서 예열 된 밀크 (32℃) 10ml에 200μl의 효소 제제가 첨가되었다. 대안적으로, 20㎕의 효소 제제가 위에서 기술한대로 예열된 밀크 1㎖에 첨가되었다.
레넷의 총 밀크 응고 활성 (강도)은 다음 공식에 따라 상기 샘플과 동일한 효소 조성을 가지는 표준과 관련하여 ml 당 국제 밀크 응고 단위 (IMCU)로 계산되었다.
IMCU/ml에서의 강도 = S표준 x T표준 x D샘플
D표준 x T샘플
S표준:
레넷에 대한 국제 참조 표준의 밀크 응고 활성.
T표준:
표준 희석에 대해 얻은 초 단위의 응고 시간.
D샘플:
샘플의 희석 계수
D표준:
표준의 희석 계수
T샘플:
희석된 레넷 샘플에 대해 효소 첨가로부터 침전 시간까지 얻은 초 단위의 응고 시간.
다중 치환 라이브러리 1, 3, 4 및 6 뿐만 아니라 변이체 270 내지 366의 응고 활성 결정을 위해, REMCAT 방법 대신 μIMCU 방법이 사용되었다. REMCAT과 비교하여, μIMCU 분석에서 키모신 변이체의 침전 시간은 UV/VIS 플레이트 판독기의 800nm에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 OD 측정에 의해 결정되었다. 알려진 응고 강도를 가지는 참조 표준의 다양한 희석의 표준 곡선이 각 플레이트에 기록되었다. 샘플은 효소를 84mM 아세테이트 완충액, 0.1% triton X-100, pH5.5에서 희석하여 준비하였다. 32℃에서의 반응은 4% (w/w) 저열량, 저지방 분유 및 7.5% (w/w) 염화칼슘 (pH 
6.5)을 함유한 표준 밀크 기질 250uL를 25uL의 효소 샘플에 추가하는 것으로 시작되었다. ml 당 국제 밀크 응고 단위 (IMCU)에서의 키모신 변이체의 밀크 응고 활성은 표준 곡선에 대한 샘플 침전 시간에 기초하여 결정되었다.
4.2 총 단백질 함량의 결정
총 단백질 함량은 제공자의 지시에 따른 써모 싸이언티픽 (Thermo Scientific)의 피어스 BCA 단백질 분석 키트 (Pierce BCA Protein Assay Kit)를 사용하여 결정되었다.
4.3 특이적 응고 활성의 계산
특이적 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)은 응고 활성 (IMCU/ml)을 총 단백질 함량 (ml 당 총 단백질의 mg)으로 나눔으로써 결정되었다.
실시예
5:
αS1
-카세인 절단의 결정
αS1
-카세인 가수분해 활성의 결정
밀크 단백질의 키모신 매개 단백질 분해는 pH4.6에서 추출된 수용성 펩티드의 프로파일을 결정함으로써 특징지어졌다. 본 연구를 위해 96 웰 플레이트로 제조된 컬쳐 프리 치즈 모델이 사용되었다. 간단히 말해, 글루코노-델타-락톤 (GDL) 및 염화칼슘이 첨가된 덴마크의 Øllingegard에서 유래한 탈지유 750μl가 96 딥 웰 플레이트의 웰에 소분되었다. 밀크에 GDL을 첨가한 지 10분 후, 키모신의 변이체가 플레이트의 개별 웰에 0.05 IMCU/ml의 최종 활성으로 첨가되었다. 형성된 응고물은 응고물을 파이펫 팁으로 완전히 교반하여 레넷을 첨가한 후 30분 후에 절단되었고, 각 웰마다 새로운 팁이 사용되었다. 이어서, 커드 및 유청이 2500g에서 10분간 원심분리하여 분리되기 전 추가로 60분 동안 방치되었다. 상기 밀크는 레넷팅, 절단 및 젤수축 동안 30℃에서 보관되었다. 마지막으로, 유청을 플레이트에서 붓고 플레이트에 남아 있는 레넷 커드의 펠렛을 실온에서 4일 동안 저장하였다. 펩티드가 0.5M tri-sodium citrate 500㎕를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 24시간 동안 부드럽게 쉐이킹하여 추출되었다. 이제 완전히 용해된 레넷 커드는 최종 pH 4.4-4.5까지 염산 (hydrochloric acid)을 첨가하여 석출되었다. 상기 플레이트를 원심 분리기에서 회전시키고, 상층액은 pH 4.5 가용성 펩티드의 추가적인 분석을 위해 회수되었다.
pH 4.5 가용성 펩티드의 프로파일이 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC를 사용하여 결정되었다. 상기 분석은 질량 분석계 (G6540A Q-TOF, Agilent Technologies A/S, Santa Clara, California, USA)에 결합된 액체 크로마토그래피 시스템 (Agilent 1290 Infinity, Agilent Technologies A/S, Santa Clara, California, USA)를 사용하여 수행되었다. LC 시스템의 칼럼은 Ascentis Express Peptide ES-C18m, 2.7 m, 100x2.1mm (Supelco, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 이었다. 이동상은 용리액 A (0.1% 포름산 수용액) 및 용리액 B (아세토나이트릴: 0.1% 포름산 수용액, 9:1)로 구성되었다. 2%B로 칼럼을 평형시킨 후, 10μL 부피의 샘플이 주입되었다. 상기 펩티드는 용리액 B를 15 칼럼 부피 이상으로 2%에서 50%로 증가시켜 생성된 경사도 용리로 분리되었다. 유속은 0.44 mL/min이었다. 펩티드는 214nm에서 UV 흡광도의 연속 측정으로 검출되었다. MS 스캔을 100에서 2000m/z로 실행하여 질량 스펙트럼을 수집했다. MS/MS 분석은 각 스캔으로부터 2개의 가장 강한 이온에 대해 수행되었다. 분석된 모든 샘플의 동량으로 구성된 MIX 샘플을 제조되었고 이 샘플은 각 12개의 샘플에 대해 분석되었다. MS 데이터는 MSConvert 버전 3.0.6618.을 사용하여 Agilent .d 형식에서 .mzml 파일로 변환되었다. 모든 추가적인 데이터 분석은 R 3.1.3을 사용하여 수행되었다. 펩티드는 R 패키지 'MSGFplus'버전 1.05.를 사용하여 MS/MS 스펙트럼으로부터 확인되었다. 펩티드 확인을 위한 데이터베이스 검색은 소 밀크 단백질: αs1-카세인, αs1-카세인, β-카세인, κ-카세인, β-락토글로불린, α-락트알부민, 락토퍼옥시다제 및 락토페린으로 제한되었다. 세린 인산화 및 메티오닌 산화가 가변 조작으로 포함되었다. R 패키지 'xcms' v. 1.42.0은 Smith 등.(2006)에 따라 샘플 세트의 샘플에서 피크를 검출 및 그룹화하는 데 사용되었다. Massifquant 방법이 피크 검출에 사용되었고, 피크의 그룹화는 밀도 방법에 기초하였다. 아이덴티티는 그룹화된 봉우리에 할당되어 αS1-카세인(1-23)을 포함하여 약 200개의 확인된 펩티드의 정량표를 만들었다.
αS1
-카세인 절단에 대한 위치상 및 돌연변이 효과의 통계적 분석
통계적 기계 학습 접근법 및 PCA 기반 분석이 다중 치환 라이브러리 1-3, 4, 5, 6 및 7의 변이체에 존재하는 모든 단일 돌연변이가 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 미치는 영향을 결정하기 위해 사용되었다.
실험 결과
다중 치환 라이브러리 1
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 낙타 키모신의 변이체가 위에서 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신 (서열 번호2)과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 소 및 낙타 키모신 모두 참조로 포함되었다.
응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 1: 낙타 키모신 변이체 1-95에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | ||||
| CHY-MAX | 138 | |||||
| CHY-MAX M | 100 | |||||
| 1 | I96L | G163E | V221M | 88 | ||
| 2 | Y127F | R145Q | Q188E | 97 | ||
| 3 | Y21S | L166V | L253I | 89 | ||
| 4 | N50K | T186S | Y307F | 113 | ||
| 5 | G70N | S277N | R316L | 104 | ||
| 6 | I200V | Y268F | S271P | R316L | 113 | |
| 7 | M157L | T186S | I200V | S273Y | 146 | |
| 8 | D98V | G251D | M256L | V259I | 125 | |
| 9 | R67Q | H76Q | S132A | V248I | S271P | 119 |
| 10 | Y21S | D98V | V221K | T239S | R316L | 146 |
| 11 | V136I | T186S | V221K | I263L | S277N | 139 |
| 12 | N50K | L222I | S255Y | 135 | ||
| 14 | R67Q | V221M | M256L | 117 | ||
| 15 | G70D | L166V | V317L | 171 | ||
| 16 | R67Q | L130I | M157L | 140 | ||
| 17 | Y21S | R61S | H146R | 121 | ||
| 18 | V136I | V221M | L222I | S226T | 101 | |
| 19 | S132A | R254S | V259I | Y307F | 107 | |
| 20 | Y21S | H76Q | Y307F | V317L | 78 | |
| 21 | D158S | L166V | V248I | F223V | G251D | 132 |
| 22 | G70D | S74F | D158S | R254S | S277N | 120 |
| 23 | N50K | D59N | M157L | M256L | G289S | 152 |
| 24 | M142I | V221K | T284S | 153 | ||
| 25 | R61S | R67Q | K231N | 114 | ||
| 26 | V32L | I96L | S277N | 133 | ||
| 27 | V183I | G251W | M256L | 124 | ||
| 28 | M157L | T239S | D279E | 132 | ||
| 29 | V248I | S226T | E294Q | 122 | ||
| 30 | S74F | L166V | T186S | V203A | 89 | |
| 32 | R67Q | Y127F | V221K | G251W | 130 | |
| 33 | L130I | M142I | I200V | V259I | E294Q | 120 |
| 34 | G70D | I96L | I200V | D267M | D279E | 108 |
| 35 | G70N | K231N | S273Y | T284S | G289S | 133 |
| 36 | V32L | G70N | M142I | 164 | ||
| 37 | V203A | S273Y | L295K | 103 | ||
| 38 | S74F | G244D | S271P | 122 | ||
| 39 | L130I | G163E | Y307F | 112 | ||
| 40 | R61S | L166V | T239S | 79 | ||
| 41 | R254S | D279E | L295K | 159 | ||
| 42 | L130I | T239S | S277N | L295K | 128 | |
| 43 | G70D | V183I | Q188E | G289S | 106 | |
| 44 | R61S | G163E | M256L | S277N | 121 | |
| 46 | D98V | H146R | V203A | I263L | S271P | 96 |
| 47 | S132A | V221M | S255Y | S273Y | V317L | 81 |
| 48 | H76Q | L222I | G251W | 94 | ||
| 49 | V221K | V248I | S255Y | 122 | ||
| 50 | H76Q | K231N | G244D | 110 | ||
| 51 | Y127F | S132A | D158S | 104 | ||
| 52 | D59N | S271P | T284S | 121 | ||
| 53 | G70D | T186S | L253I | 94 | ||
| 54 | R61Q | V221K | K231N | D267M | 134 | |
| 55 | V221M | V248I | L253I | L295K | 115 | |
| 56 | V183I | V248I | G244D | T284S | 126 | |
| 57 | D59N | Y127F | L166V | V183I | S255Y | 82 |
| 58 | N50K | R61S | Y127F | G244D | G251D | 147 |
| 59 | I96L | F223V | G244D | R254S | M256L | 153 |
| 60 | V32L | R61Q | H146R | 119 | ||
| 61 | H146R | D158S | S273Y | 148 | ||
| 62 | R61Q | M142I | G289S | 105 | ||
| 63 | S74F | V259I | Y268F | 146 | ||
| 64 | G70N | D98V | V136I | 143 | ||
| 65 | D59N | V203A | R254S | 106 | ||
| 66 | T239S | I263L | D267M | T284S | 100 | |
| 67 | I96L | M142I | R145Q | H146R | 130 | |
| 68 | V32L | E294Q | R316L | V317L | 78 | |
| 69 | V32L | G163E | T186S | Q188E | L295K | 131 |
| 70 | R61Q | V136I | Y268F | T284S | Y307F | 124 |
| 71 | S132A | Q188E | F223V | 126 | ||
| 72 | H76Q | I96L | D158S | 82 | ||
| 73 | V136I | R145Q | G251D | 98 | ||
| 74 | R61Q | D98V | V317L | 98 | ||
| 75 | Y21S | D59N | I263L | 88 | ||
| 76 | I200V | G251D | G289S | 128 | ||
| 77 | D98V | M157L | V183I | 102 | ||
| 78 | S226T | G244D | I263L | G289S | 72 | |
| 79 | Q188E | G251D | S271P | D279E | 97 | |
| 80 | N50K | D158S | V203A | E294Q | 124 | |
| 81 | V203A | V248I | G251W | L253I | Y268F | 64 |
| 82 | R61S | V183I | L222I | L253I | D267M | 89 |
| 84 | G70D | L130I | Y268F | 87 | ||
| 85 | Y127F | D267M | E294Q | 84 | ||
| 88 | F223V | V248I | I263L | 107 | ||
| 89 | G70N | R254S | S255Y | Y268F | 93 | |
| 90 | D59N | V248I | L222I | V248I | 98 | |
| 91 | F223V | G251W | S273Y | D279E | 128 | |
| 92 | R67Q | G70N | H146R | Q188E | S226T | 100 |
| 93 | S74F | H76Q | M142I | M157L | G163E | 104 |
| 94 | R61Q | S226T | T239S | V248I | G251W | 93 |
| 95 | V32L | L130I | R145Q | L222I | D279E | 119 |
표 1에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 모든 효소 변이체가 실험에서 0.05 IMCU/mL의 표준화 농도로 사용되었기 때문에, 감소한 αS1-카세인 절단은 감소한 일반적인 효소적 활성이라기보다는, Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 Phe105 및 Met106 사이의 κ-카세인 절단에 대한 각 변이체의 증가한 특이성을 나타낸다. 역으로, 증가한 αS1-카세인 절단은 증가한 일반적인 효소적 활성이라기보다는, Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 Phe105 및 Met106 사이의 κ-카세인 절단에 대한 각 변이체의 감소한 특이성을 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 2
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 또다른 세트의 낙타 키모신의 변이체가 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 소 및 낙타 키모신 모두 참조로 포함되었다. 응고 활성은 REMCAT 방법을 사용하여 결정되었다.
표 2: 낙타 키모신 변이체 96-143에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | |||||
| CHY-MAX | 161 | ||||||
| CHY-MAX M | 100 | ||||||
| 96 | D59N | L222I | G251D | E83S | Q162S | 76 | |
| 97 | D59N | L222I | G251W | F17Y | Y21S | 116 | |
| 98 | D59N | L222I | G251D | H76Q | S164G | 81 | |
| 99 | D59N | L222I | G251D | K62Q | M165E | 102 | |
| 100 | D59N | L222I | G251D | Q162S | V155F | 106 | |
| 101 | D59N | L222I | G251D | H76Q | V155F | 112 | |
| 102 | D59N | L222I | G251D | S273Y | L166V | 81 | |
| 103 | D59N | L222I | G251D | Y268F | V198I | 113 | |
| 104 | D59N | L222I | G251D | S273Y | F66Y | 109 | |
| 105 | D59N | L222I | G251D | M165E | L166V | 101 | |
| 106 | D59N | L222I | G251D | H76Q | M165E | 118 | |
| 107 | D59N | L222I | G251D | F17Y | S273Y | 106 | |
| 108 | D59N | L222I | G251D | L166V | I45V | 85 | |
| 109 | D59N | L222I | G251W | L180I | T284S | 114 | |
| 110 | D59N | L222I | G251D | V32L | L12M | T284S | 162 |
| 111 | D59N | L222I | G251D | Y21S | L166V | 86 | |
| 112 | D59N | L222I | G251D | V155F | E262T | V32L | 144 |
| 113 | D59N | L222I | G251D | L105E | S164G | 80 | |
| 114 | D59N | L222I | G251W | S154A | V203A | 123 | |
| 115 | D59N | L222I | G251D | Q162S | L166V | 92 | |
| 116 | D59N | L222I | G251W | K19T | R266I | 107 | |
| 117 | D59N | L222I | G251W | I303L | I45V | 110 | |
| 119 | D59N | L222I | G251D | Y21S | L215V | L105E | 79 |
| 120 | D59N | L222I | G251D | I96L | T177S | K321P | 90 |
| 121 | D59N | L222I | G251D | F17Y | T284S | V203A | 116 |
| 122 | D59N | L222I | G251D | V32L | K321P | V260T | 125 |
| 123 | D59N | L222I | G251D | V198I | V32L | E83S | 117 |
| 124 | D59N | L222I | G251D | I96L | V203A | V309I | 81 |
| 125 | D59N | L222I | G251D | Y268F | L215V | V32L | 119 |
| 126 | D59N | L222I | G251D | H76Q | L105E | V260T | 60 |
| 127 | D59N | L222I | G251D | Y21S | H76Q | Y268F | 97 |
| 128 | D59N | L222I | G251D | Y21S | I45V | F223A | 111 |
| 129 | D59N | L222I | G251D | V198I | V203A | K321P | 122 |
| 131 | D59N | L222I | G251D | S164G | R266V | I96L | 80 |
| 132 | D59N | L222I | G251D | H181N | F66Y | V32L | 114 |
| 133 | D59N | L222I | G251D | H181N | R266I | D267Q | 97 |
| 134 | D59N | L222I | G251W | K62Q | V309I | 99 | |
| 135 | D59N | L222I | G251D | Y268F | L12M | D267Q | 116 |
| 136 | D59N | L222I | G251D | L166V | E262T | T177S | 90 |
| 137 | D59N | L222I | G251D | S273Y | T284S | D267Q | 122 |
| 138 | D59N | L222I | G251D | F66Y | Q288E | I96L | 85 |
| 139 | D59N | L222I | G251D | V203A | R266V | F223A | 63 |
| 140 | D59N | L222I | G251D | I303L | S154A | V260T | 96 |
| 141 | D59N | L222I | G251D | Y21S | T284S | I96L | 82 |
| 142 | D59N | L222I | G251D | Q288E | K19T | T177S | 91 |
| 143 | D59N | L222I | G251D | K62Q | Y268F | K19T | 96 |
표 2에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 모든 효소 변이체가 실험에서 0.05 IMCU/mL의 표준화 농도로 사용되었기 때문에, 감소한 αS1-카세인 절단은 감소한 일반적인 효소적 활성이라기보다는, Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 Phe105 및 Met106 사이의 κ-카세인 절단에 대한 각 변이체의 증가한 특이성을 나타낸다. 역으로, 증가한 αS1-카세인 절단은 증가한 일반적인 효소적 활성이라기보다는, Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 Phe105 및 Met106 사이의 κ-카세인 절단에 대한 각 변이체의 감소한 특이성을 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 3
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 세 번째 세트의 낙타 키모신의 변이체가 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 소 및 낙타 키모신 모두 참조로 포함되었다. 응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 3: 낙타 키모신 변이체 144-179에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | |||||||||
| CHY-MAX | 161 | ||||||||||
| CHY-MAX M | 100 | ||||||||||
| 144 | L12M | Y21S | D59N | H76Q | M165E | V198I | L222I | G251D | Q288E | 83 | |
| 146 | L12M | Y21S | D59N | H76Q | M165E | L222I | G251W | S273Y | 80 | ||
| 147 | L12M | D59N | H76Q | M165E | V198I | L222I | G251D | S273Y | K321P | 84 | |
| 148 | L12M | D59N | H76Q | S154A | M165E | V203A | L222I | G251D | V309I | 79 | |
| 149 | L12M | D59N | H76Q | D98V | L222I | 86 | |||||
| 150 | L12M | K19T | V32L | D59N | H76Q | D144Q | M165E | L222I | G251D | 90 | |
| 151 | L12M | Y21S | D59N | H76Q | M165E | V203A | L222I | G251D | E262T | 84 | |
| 152 | L12M | V51L | H76Q | M165E | G251D | 68 | |||||
| 153 | L12M | D59N | F66Y | H76Q | M165E | L180I | L222I | G251D | V309I | 84 | |
| 154 | L12M | D59N | H76Q | S154A | M165E | L222I | G251W | Q288E | 88 | ||
| 155 | L12M | D59N | H76Q | D98V | M165E | L222I | G251D | E262T | Q288E | 81 | |
| 156 | L12M | V51L | D59N | H76Q | L166V | L222I | G251D | 58 | |||
| 157 | L12M | D59N | H76Q | D144Q | M165E | V203A | L222I | 79 | |||
| 158 | L12M | D59N | D144Q | M165E | L166V | L222I | G251D | 86 | |||
| 159 | L12M | K19T | D59N | H76Q | S154A | M165E | V198I | L222I | G251D | 71 | |
| 160 | L12M | H76Q | D98V | M165E | L222I | G251W | 94 | ||||
| 161 | L12M | V32L | D59N | H76Q | M165E | L180I | V198I | L222I | G251D | 113 | |
| 162 | L12M | D59N | H76Q | S154A | M165E | S273Y | 80 | ||||
| 164 | L12M | V51L | D59N | F66Y | H76Q | M165E | V203A | L222I | G251W | 65 | |
| 165 | L12M | V32L | H76Q | M165E | L222I | E262T | 106 | ||||
| 166 | L12M | N50D | D59N | H76Q | M165E | G251W | E262T | 91 | |||
| 168 | V51L | D59N | H76Q | M165E | L180I | L222I | G251D | E262T | 68 | ||
| 169 | L12M | D59N | H76Q | M165E | G251D | Q288E | V309I | K321P | 59 | ||
| 172 | L12M | N50D | D59N | V203A | L222I | G251D | 96 | ||||
| 173 | L12M | D59N | H76Q | L180I | L222I | G251W | K321P | 88 | |||
| 174 | L12M | Y21S | D59N | M165E | L222I | K321P | 99 | ||||
| 176 | D59N | H76Q | M165E | L166V | V198I | L222I | 95 | ||||
| 178 | L12M | K19T | N50D | D59N | H76Q | M165E | L222I | Q288E | 98 | ||
| 179 | L12M | Y21S | N50D | D59N | F66Y | H76Q | D144Q | M165E | L222I | G251D | 97 |
표 3에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 모든 효소 변이체가 실험에서 0.05 IMCU/mL의 표준화 농도로 사용되었기 때문에, 감소한 αS1-카세인 절단은 감소한 일반적인 효소적 활성이라기보다는, Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 Phe105 및 Met106 사이의 κ-카세인 절단에 대한 각 변이체의 증가한 특이성을 나타낸다. 역으로, 증가한 αS1-카세인 절단은 증가한 일반적인 효소적 활성이라기보다는, Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 Phe105 및 Met106 사이의 κ-카세인 절단에 대한 각 변이체의 감소한 특이성을 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 1-3의 돌연변이 분석
αS1-카세인 절단에 대한 위치상 및 돌연변이 효과의 통계적 분석은 라이브러리 1-3의 단백질 분해 데이터를 기반으로 수행되었다. 감소한 αS1-카세인 절단에 대한 가장 유익한 돌연변이가 표 4에 나타나 있다.
표 4:
통계적 분석에 기초한
감소한
α1-카세인 절단 및 표준 편차 (sd)에 대한 돌연변이 기여 (평균).
얻어진 결과에 기반하여 표 4에 나타난 돌연변이가 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대해 억제 효과를 나타내는 것으로 결론 내려졌다. 표 4에 나타난 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 산업 관련 예시로는 최적화된 슬라이스 및 파쇄 공정을 위한 개선된 커드 굳기를 가지는 파스타 필라타, 체다, 콘티넨탈 타입 치즈가 있다.
Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대해 가장 강한 억제 효과를 가지는 8가지 돌연변이 (R266V, V51L, E83S, I263L, L253I, L105E, I96L, L180I)는 낙타 키모신의 기질 결합 틈으로부터 떨어져 위치한다 (도 1). 따라서 이러한 αS1-카세인 절단에 대한 돌연변이의 간접적인 영향이 결론 내려질 수 있다.
증가한 αS1-카세인 절단에 대한 가장 유익한 돌연변이가 표 5에 나타나 있다.
표 5:
통계적 분석에 기초한
증가한
α1-카세인 절단 및 표준 편차 (sd)에 대한 돌연변이 기여 (평균).
| mutation | mean | sd |
| V221K | 1.38E-01 | 2.30E-02 |
| N50K | 1.29E-01 | 2.90E-02 |
| F223V | 1.16E-01 | 2.51E-02 |
| V32L | 1.05E-01 | 2.07E-02 |
| L295K | 9.47E-02 | 2.40E-02 |
| I200V | 9.28E-02 | 2.70E-02 |
| T284S | 8.48E-02 | 2.27E-02 |
| M256L | 8.30E-02 | 1.86E-02 |
| H146R | 7.32E-02 | 3.11E-02 |
| V155F | 7.27E-02 | 2.96E-02 |
| V198I | 7.24E-02 | 2.46E-02 |
| M157L | 7.08E-02 | 2.38E-02 |
| F17Y | 6.58E-02 | 1.80E-02 |
| D158S | 6.04E-02 | 2.95E-02 |
| M142I | 5.86E-02 | 2.60E-02 |
| V136I | 5.83E-02 | 2.44E-02 |
| D267Q | 5.74E-02 | 2.36E-02 |
| F66Y | 4.89E-02 | 2.95E-02 |
| N50D | 4.72E-02 | 1.84E-02 |
| K231N | 4.71E-02 | 1.81E-02 |
| V259I | 4.71E-02 | 2.88E-02 |
| G244D | 4.52E-02 | 3.03E-02 |
얻어진 결과에 기반하여 표 5에 나타난 돌연변이가 더 높은 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 일으킨다고 결론 내려졌다. 표 5에 나타난 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 산업 관련 예시로는 소프트 치즈 및 화이트 브라인 치즈가 있다.
Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 증가에 대해 가장 큰 영향을 미치는 5가지 돌연변이 중 4가지 (V221K, F223V, V32L, L295K; 도 2)는 낙타 키모신의 결합 틈에 위치하고 있으며, 따라서 치즈 숙성 과정에서 αS1-카세인 결합에 직접적인 영향을 미친다. 여기서 세 가지 돌연변이 (V221K, F223V, V32L)는 상기 각 위치에 소 키모신 (CHY-MAX)의 아미노산을 도입하여 낙타 키모신 (CHY-MAX M; 표 1-3)과 비교하여 증가한 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 4
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 또다른 세트의 낙타 키모신의 변이체가 위에서 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신 (서열 번호 2)과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 낙타 키모신 (CHY-MAX M)은 참조로 포함되었다.
응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 6: 낙타 키모신 변이체 179-222에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 ( CHY -MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
표 6에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 모든 변이체는 야생형 낙타 키모신과 비교하여 단백질 분해 활성이 11%와 65% 사이에서 감소한 것으로 나타났다.
다중 치환 라이브러리 4의 돌연변이 분석
αS1-카세인 절단에 대한 위치상 및 돌연변이 효과에 대한 통계적 분석은 라이브러리 4 변이체의 단백질 분해 데이터를 기반으로 수행되었다. 증가한 또는 감소한 αS1-카세인 절단에 대한 가장 유익한 돌연변이가 표 7에 나타나 있다.
표 7:
통계적 분석에 기초한 변형된 α1-카세인 절단 및 표준 편차 (sd)에 대한 돌연변이 기여 (평균).
양성
평균값은
감소한
α1-카세인 절단을 나타낸다. 음성 평균값은
증가한
α1-카세인 절단을 나타낸다.
| mutation | mean | sd |
| S164G | 5.65E-01 | 5.10E-02 |
| H76Q | 4.33E-01 | 2.63E-02 |
| I96L | 4.21E-01 | 4.03E-02 |
| R242E | 3.50E-01 | 3.99E-02 |
| L166V | 2.32E-01 | 3.82E-02 |
| L222I | 2.00E-01 | 4.90E-02 |
| K19T | 1.94E-01 | 2.99E-02 |
| Y21S | -1.13E-01 | 2.99E-02 |
| D59N | -1.34E-01 | 3.41E-02 |
| S132A | -1.75E-01 | 3.18E-02 |
표 7에 나타난 결과에 기반하여 돌연변이 K19T , H76Q , I96L , S164G , L166V , L222I 및 R242E가 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 감소시킨다고 결론 내려졌다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이 Y21S , D59N 및 S132A는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 증가시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 5
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 또다른 세트의 낙타 키모신의 변이체가 위에서 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신 (서열 번호 2)과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 낙타 키모신 (CHY-MAX M)은 참조로 포함되었다.
응고 활성은 REMCAT 방법을 사용하여 결정되었다.
표 8: 낙타 키모신 변이체 223-269에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 ( CHY -MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
표 8에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 47개의 라이브러리 변이체 중, 44개가 야생형 낙타 키모신과 비교하여 단백질 분해 활성이 11%와 60% 사이에서 감소한 것으로 나타났다.
다중 치환 라이브러리 5의 돌연변이 분석
αS1-카세인 절단에 대한 위치상 및 돌연변이 효과에 대한 통계적 분석은 라이브러리 5 변이체의 단백질 분해 데이터를 기반으로 수행되었다. 증가한 또는 감소한 αS1-카세인 절단에 대한 가장 유익한 돌연변이가 표 9에 나타나 있다.
표 9:
통계적 분석에 기초한 변형된 α1-카세인 절단 및 표준 편차 (sd)에 대한 돌연변이 기여 (평균).
양성
평균값은
감소한
α1-카세인 절단을 나타낸다. 음성 평균값은
증가한
α1-카세인 절단을 나타낸다.
| mutation | mean | sd |
| Y11I | 7.41E-01 | 9.83E-02 |
| Y11V | 6.79E-01 | 4.09E-02 |
| S164G | 4.73E-01 | 3.77E-02 |
| H76Q | 3.59E-01 | 6.78E-02 |
| L222V | 2.34E-01 | 5.61E-02 |
| I96L | 1.79E-01 | 5.29E-02 |
| K19S | 1.73E-01 | 8.05E-02 |
| L222I | 1.71E-01 | 3.20E-02 |
| I263L | 1.54E-01 | 4.94E-02 |
| L166V | 1.54E-01 | 3.65E-02 |
| S273Y | 1.17E-01 | 7.37E-02 |
| R242E | 1.11E-01 | 5.68E-02 |
| S164N | 9.78E-02 | 6.20E-02 |
| G251D | -1.64E-01 | 4.79E-02 |
| L253V | -2.11E-01 | 3.87E-02 |
표 9에 나타난 결과에 기반하여 돌연변이 Y11I, Y11V, K19S, H76Q, I96L, S164G, S164N, L166V, L222I, L222V, R242E, I263L 및 S273Y가 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 감소시킨다고 결론 내려졌다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이 L253V 및 G251D는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 증가시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다.
낙타 키모신의 구조-기반 변형
단백질 구조적 분석 (표 10)에 의해 결정된 위치에서 아미노산을 변형시킨 낙타 키모신의 변이체 (서열 번호 2)가 제조되었다. 돌연변이 N100Q 및 N291Q가 이들 변이체의 N-글리코실화 부위 및 상기 참조 낙타 키모신 (CamUGly) 모두에 도입되어 비-글리코실화되고 균질한 단백질 샘플을 산출하였다.
응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 10: 낙타 키모신 변이체 270-308에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CamUGly)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | ||
| CamUGly | N100Q | N291Q | 100 | |
| 270 | V32L | N100Q | N291Q | 120 |
| 271 | V221K | N100Q | N291Q | 130 |
| 272 | D290E | N100Q | N291Q | 100 |
| 273 | V136I | N100Q | N291Q | 105 |
| 274 | E240Q | N100Q | N291Q | 97 |
| 275 | R242Q | N100Q | N291Q | 86 |
| 276 | G289S | N100Q | N291Q | 81 |
| 277 | N292H | N100Q | N291Q | 127 |
| 278 | L295K | N100Q | N291Q | 113 |
| 279 | V136E | N100Q | N291Q | 100 |
| 280 | D290L | N100Q | N291Q | 106 |
| 281 | F119Y | N100Q | N291Q | 83 |
| 282 | Q280E | N100Q | N291Q | 94 |
| 283 | F282E | N100Q | N291Q | 99 |
| 284 | N249D | N100Q | N291Q | 98 |
| 285 | R254S | N100Q | N291Q | 95 |
| 286 | R242E | N100Q | N291Q | 86 |
| 287 | N252D | N100Q | N291Q | 93 |
| 288 | V203R | N100Q | N291Q | 107 |
| 289 | N249R | N100Q | N291Q | 95 |
| 290 | H56K | N100Q | N291Q | 106 |
| 291 | S74D | N100Q | N291Q | 93 |
| 292 | A131D | N100Q | N291Q | 101 |
| 293 | Y190A | N100Q | N291Q | 87 |
| 294 | I297A | N100Q | N291Q | 149 |
| 295 | H76Q | N100Q | N291Q | 73 |
| 296 | S273Y | N100Q | N291Q | 89 |
| 297 | K19T | N100Q | N291Q | 89 |
| 299 | L222I | N100Q | N291Q | 92 |
| 300 | V309I | N100Q | N291Q | 96 |
| 302 | Y21S | N100Q | N291Q | 108 |
| 303 | L130I | N100Q | N291Q | 110 |
| 304 | S132A | N100Q | N291Q | 112 |
| 305 | S226T | N100Q | N291Q | 94 |
| 306 | G251D | N100Q | N291Q | 105 |
| 307 | Y243E | N100Q | N291Q | 98 |
| 308 | S273D | N100Q | N291Q | 99 |
표 10에 나타난 결과에 기반하여 돌연변이 K19T, H76Q, F119Y, Y190A, R242E, R242Q, S273Y 및 G289S가 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 10% 초과로 감소시킨다고 결론 내려졌다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. V32L, L130I, S132A, V221K, N292H, L295K 및 I297A는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 10% 이상 증가시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 감소한 및 증가한 αS1-카세인 절단에 대한 돌연변이 H76Q , S273Y , R242E 및 V32L , S132A , V221K , L295K의 유사한 효과는 다중 치환 라이브러리 1-6의 돌연변이 분석에 의해 결정되었다 (표 5, 7, 9).
Phe23 및 Phe24 사이의 10% 초과로 감소한 또는 증가한 αS1-카세인의 절단을 나타낸 표 10의 15개의 변이체 중 14개가 기질 결합 틈 (도 2) 내 또는 구조적으로 아주 근접하여 돌연변이 (H76Q, F119Y, Y190A, R242E, R242Q, S273Y, G289S, V32L, L130I, S132A, P303A)를 발생시키고, 이는 β-카세인 결합에 대해 이러한 돌연변이의 직접적인 영향을 암시한다.
소 키모신의 구조-기반 변형
단백질 구조적 분석 (표 11)에 의해 결정된 위치에서 아미노산을 변형시킨 소 키모신의 변이체 (서열 번호 1)가 제조되었다. 돌연변이 N252Q 및 N291Q가 이들 변이체의 N-글리코실화 부위 및 상기 참조 소 키모신 (BovUGly) 모두에 도입되어 비-글리코실화되고 균질한 단백질 샘플을 산출하였다.
응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 11: 소 키모신 변이체 326-346에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 소 키모신 (BovUGly)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | ||
| BovUGly | N252Q | N291Q | 100 | |
| 326 | E290D | N252Q | N291Q | 95 |
| 327 | A117S | N252Q | N291Q | 87 |
| 328 | I136V | N252Q | N291Q | 95 |
| 330 | Q278K | N252Q | N291Q | 97 |
| 332 | H292N | N252Q | N291Q | 90 |
| 334 | K295L | N252Q | N291Q | 94 |
| 338 | Q56H | N252Q | N291Q | 103 |
| 339 | L32I | N252Q | N291Q | 93 |
| 340 | K71E | N252Q | N291Q | 67 |
| 341 | P72T | N252Q | N291Q | 103 |
| 342 | Q83T | N252Q | N291Q | 110 |
| 343 | V113F | N252Q | N291Q | 72 |
| 344 | E133S | N252Q | N291Q | 114 |
| 345 | Y134G | N252Q | N291Q | 102 |
| 346 | K71A | N252Q | N291Q | 96 |
표 11에 나타난 바와 같이 돌연변이 K71E , V113F 및 A117은 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 10% 초과로 감소시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이 Q83T 및 E133S는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 10% 이상 증가시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다.
낙타 키모신 N-말단의 변형
기질 결합 틈 내의 N-말단 서열 Y11-D13의 분자적 상호작용의 단백질 구조적 분석에 의해 결정된 위치에서 아미노산을 변형시킨 낙타 키모신의 변이체 (서열 번호 2)가 제조되었다 (표 12). 돌연변이 N100Q 및 N291Q가 이들 변이체의 N-글리코실화 부위 및 상기 참조 낙타 키모신 (CamUGly) 모두에 도입되어 비-글리코실화되고 균질한 단백질 샘플을 산출하였다.
응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 12: 낙타 키모신 변이체 347-366에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CamUGly)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | |||
| CamUGly | N100Q | N291Q | 100 | ||
| 347 | Y11H | N100Q | N291Q | 96 | |
| 348 | Y11K | N100Q | N291Q | 100 | |
| 349 | Y11R | N100Q | N291Q | 97 | |
| 350 | Y11H | D290E | N100Q | N291Q | 94 |
| 351 | Y11R | D290E | N100Q | N291Q | 81 |
| 352 | Y11F | N100Q | N291Q | 100 | |
| 353 | Y11I | N100Q | N291Q | 89 | |
| 354 | Y11L | N100Q | N291Q | 89 | |
| 355 | Y11V | N100Q | N291Q | 95 | |
| 356 | L12F | N100Q | N291Q | 102 | |
| 357 | L12I | N100Q | N291Q | 104 | |
| 358 | L12M | N100Q | N291Q | 123 | |
| 359 | D13N | N100Q | N291Q | 119 | |
| 360 | D13Q | N100Q | N291Q | 109 | |
| 361 | D13S | N100Q | N291Q | 114 | |
| 362 | D13T | N100Q | N291Q | 119 | |
| 363 | D13F | N100Q | N291Q | 106 | |
| 364 | D13L | N100Q | N291Q | 109 | |
| 365 | D13V | N100Q | N291Q | 120 | |
| 366 | D13Y | N100Q | N291Q | 107 | |
낙타 키모신 구조의 분석은 N-말단 서열 Y11-D13 뿐만 아니라 Y11의 잠재적 상호 작용 파트너인 위치 D290에서의 변형을 유도하였다 (도 3). 카세인 기질이 결합 틈 내에 결합하기 위해 N-말단 키모신 서열과 경쟁하기 때문에, 결합 틈과 모티프 Y11-D13 사이의 상호 작용을 변화시키는 아미노산 치환은 다양한 카세인 기질에 대한 효소적 활성 및, 이에 따라, αS1-카세인 절단에 영향을 미칠 것이라고 예상된다. 돌연변이 Y11I 및 Y11V 뿐만 아니라 Y11R 및 D290E의 조합은 표 12에 나타난 바와 같이 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 10% 초과로 감소시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. Y11R (변이체 349, 표 12)도 D290E (변이체 272, 표 10)도 αS1-카세인 단독의 절단에 대한 유의한 영향을 나타내지 않기 때문에, 변이체 351의 변화된 단백질 분해 활성은 두 돌연변이의 상승 효과에 기인한 것으로 보인다.
돌연변이 L12M , D13N , D13S , D13T 및 D13V는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 10% 이상 증가시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 6
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 또다른 세트의 낙타 키모신의 변이체가 위에서 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신 (서열 번호 2)과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 낙타 키모신 (CHY-MAX M)은 참조로 포함되었다.
응고 활성은 μIMCU 방법을 사용하여 결정되었다.
표 13: 낙타 키모신 변이체 367-416에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
| variant | mutations | αS1N | |||||
| CHY-MAX M | 100 | ||||||
| 367 | R67Q | N100Q | L130I | M157L | V248I | N291Q | 145 |
| 368 | N100Q | L130I | S132A | M157L | K231N | 148 | |
| 369 | R67Q | I96L | L130I | M157L | L222I | M256L | 106 |
| 370 | R67Q | L130I | S132A | M157L | R242E | V248I | 98 |
| 371 | R67Q | N100Q | M157L | R242E | M256L | 99 | |
| 372 | R67Q | G70D | M157L | R242E | V248I | 84 | |
| 373 | V32L | R67Q | M157L | L222I | R242E | 97 | |
| 374 | Y11V | R67Q | M157L | V248I | M256L | 88 | |
| 375 | R67Q | V136I | M157L | L222I | V248I | 64 | |
| 376 | L130I | M157L | V248I | M256L | N291Q | 127 | |
| 377 | R67Q | I96L | L130I | M157L | K231N | R242E | 92 |
| 378 | V32L | R67Q | L130I | M157L | L222I | K231N | 113 |
| 379 | L130I | V136I | M157L | L222I | N292H | 111 | |
| 380 | R67Q | G70D | M157L | L222I | N291Q | 106 | |
| 381 | V32L | R67Q | L130I | K231N | N292H | 125 | |
| 382 | Y11V | R67Q | N100Q | L130I | V136I | M157L | 107 |
| 383 | R67Q | L130I | L222I | R242E | M256L | 87 | |
| 384 | R67Q | M157L | L222I | V248I | N292H | 96 | |
| 385 | V32L | R67Q | M157L | M256L | N291Q | 117 | |
| 386 | R67Q | L130I | S132A | M157L | L222I | N292H | 97 |
| 387 | R67Q | N100Q | L130I | M157L | K231N | N291Q | 139 |
| 388 | R67Q | L130I | K231N | V248I | N291Q | 131 | |
| 389 | Y11V | R67Q | L130I | M157L | L222I | K231N | 82 |
| 390 | I45V | L130I | M157L | K231N | R242E | 91 | |
| 391 | V32L | R67Q | V136I | M157L | N291Q | 128 | |
| 392 | R67Q | N100Q | L130I | D158S | V248I | 134 | |
| 393 | I45V | R67Q | L130I | M157L | L222I | K231N | 106 |
| 394 | V32L | R67Q | L130I | S132A | M157L | V248I | 117 |
| 395 | Y11V | R67Q | L130I | M157L | N291Q | N292H | 91 |
| 396 | R67Q | N100Q | L130I | M157L | L222I | K231N | 120 |
| 397 | I45V | R67Q | G70D | L130I | S132A | 98 | |
| 398 | I45V | R67Q | L130I | V248I | N292H | 108 | |
| 399 | Y11V | R67Q | L130I | M157L | L222I | R242E | 73 |
| 400 | R67Q | N100Q | D158S | L130I | M157L | L222I | 116 |
| 401 | R67Q | L130I | V136I | M157L | K231N | V248I | 109 |
| 402 | I45V | R67Q | L130I | L222I | N291Q | 118 | |
| 403 | R67Q | G70D | L130I | M157L | K231N | M256L | 107 |
| 404 | V32L | R67Q | L130I | M157L | D158S | V248I | 112 |
| 405 | R67Q | L130I | M157L | D158S | R242E | N291Q | 62 |
| 406 | R67Q | L130I | M157L | D158S | K231N | N292H | 103 |
| 407 | R67Q | L130I | V248I | M256L | N292H | 120 | |
| 408 | V32L | R67Q | I96L | L130I | M157L | V248I | 108 |
| 409 | R67Q | I96L | N100Q | L130I | M157L | N292H | 73 |
| 410 | V32L | R67Q | G70D | N100Q | M157L | 132 | |
| 411 | V32L | R67Q | L130I | M157L | K231N | M256L | 63 |
| 412 | R67Q | I96L | M157L | L222I | K231N | 105 | |
| 413 | R67Q | M157L | L222I | K231N | V248I | 108 | |
| 414 | R67Q | L130I | M157L | R242E | M256L | N292H | 95 |
| 415 | R67Q | L222I | K231N | V248I | 106 | ||
| 416 | R67Q | S132A | L222I | K231N | R242E | V248I | 88 |
표 13에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 50개의 라이브러리 변이체 중, 10개가 야생형 낙타 키모신과 비교하여 단백질 분해 활성이 12%와 48% 사이에서 감소한 것으로 나타났다. 또다른 18개 변이체는 야생형 낙타 키모신과 비교하여 단백질 분해 활성이 11%와 48% 사이에서 증가한 것으로 나타났다.
다중 치환 라이브러리 6의 돌연변이 분석
αS1-카세인 절단에 대한 위치상 및 돌연변이 효과에 대한 통계적 분석은 라이브러리 6 변이체의 단백질 분해 데이터를 기반으로 수행되었다. 증가한 또는 감소한 αS1-카세인 절단에 대한 가장 유익한 돌연변이가 표 14에 나타나 있다.
표 14:
통계적 분석에 기초한 변형된 α1-카세인 절단 및 표준 편차 (sd)에 대한 돌연변이 기여 (평균).
양성
평균값은
감소한
α1-카세인 절단을 나타낸다. 음성 평균값은
증가한
α1-카세인 절단을 나타낸다.
| mutation | mean | sd |
| Y11V | 5.14E-01 | 2.20E-02 |
| R242E | 3.82E-01 | 1.98E-02 |
| G70D | 8.96E-02 | 2.13E-02 |
| R67Q | 7.87E-02 | 2.85E-02 |
| L222I | 7.48E-02 | 1.56E-02 |
| M256L | -3.63E-02 | 1.73E-02 |
| V248I | -4.27E-02 | 1.94E-02 |
| K231N | -5.17E-02 | 1.67E-02 |
| V136I | -8.22E-02 | 2.13E-02 |
| L130I | -9.71E-02 | 1.78E-02 |
| V32L | -1.75E-01 | 2.07E-02 |
| N291Q | -1.99E-01 | 1.65E-02 |
| N100Q | -3.72E-01 | 1.79E-02 |
표 14에 나타난 결과에 기반하여 돌연변이 Y11V , R242E , G70D , R67Q 및 L222I가 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 감소시킨다고 결론 내려졌다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다. 돌연변이 N100Q, N291Q, V32L, L130I, V136I, K231N, V248I 및 M256L는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 증가시켰다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 높은 발생을 일으키기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화가 보다 많이 필요한 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다.
다중 치환 라이브러리 7
야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 가지는 또다른 세트의 낙타 키모신의 변이체가 위에서 기술된 바와 같이 발생 및 분석되었다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이체를 제외하고 낙타 키모신 (서열 번호 2)과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 낙타 키모신 (CHY-MAX M)은 참조로 포함되었다.
응고 활성은 REMCAT 방법을 사용하여 결정되었다.
표 15: 낙타 키모신 변이체 417-461에 의한 아미노산 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 (N-말단 펩티드 αS1N 산출). 숫자는 야생형 낙타 키모신 ( CHY -MAX M)의 % 절단으로 주어진다.
표 15에는 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단 뿐만 아니라, 특이적 응고 활성 (C), 일반적인 단백질 분해 활성 (P) 및 C/P 값에 대한 데이터가 있는 낙타 키모신 변이체가 나타나 있다. 모든 변이체가 33%와 82% 사이에서 감소한 αS1-카세인 절단을 나타냈다.
다중 치환 라이브러리 7의 돌연변이 분석
αS1-카세인 절단에 대한 위치상 및 돌연변이 효과에 대한 통계적 분석은 라이브러리 7 변이체의 단백질 분해 데이터를 기반으로 수행되었다. 감소한 αS1-카세인 절단에 대한 가장 유익한 돌연변이가 표 16에 나타나 있다.
표 16:
통계적 분석에 기초한 변형된 α1-카세인 절단 및 표준 편차 (sd)에 대한 돌연변이 기여 (평균).
양성
평균값은
감소한
α1-카세인 절단을 나타낸다.
| mutation | mean | sd |
| I96L | 2.61E-01 | 1.79E-02 |
| L166V | 2.25E-01 | 1.45E-02 |
| R242E | 2.03E-01 | 5.96E-02 |
| Y11I | 1.51E-01 | 3.31E-02 |
| L222I | 1.43E-01 | 2.15E-02 |
| L222V | 1.39E-01 | 1.62E-02 |
| S164G | 1.18E-01 | 2.22E-02 |
| L166I | 9.00E-02 | 1.76E-02 |
| L253I | 5.86E-02 | 1.90E-02 |
| Y11V | 5.28E-02 | 2.75E-02 |
표 16에 나타난 결과에 기반하여 돌연변이 I96L, L166V, R242E, Y11I, L222I, L222V, S164G, L166I, L253I 및 Y11V가 Phe23 및 Phe24 사이의 αS1-카세인 절단을 감소시킨다고 결론 내려졌다. 이러한 돌연변이가 αS1(1-23)의 발생을 줄이기 때문에, 숙성 과정에서 치즈 커드의 연화를 덜 필요로 하는 치즈 제조 공정에 대한 키모신 변이체의 바람직한 돌연변이를 나타낸다.
참조 문헌
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SEQUENCE LISTING
<110> Chr. Hansen A/S
<120> Variants of chymosins with improved proerties
<130> P5946PC00
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 381
<212> PRT
<213> Bos
<400> 1
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Val Phe Ala Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Ala Glu Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr Lys Gly Lys Ser Leu Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Lys Glu His Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Lys Gln Gln
35 40 45
Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Tyr Ser Gly Phe Gly Glu Val Ala Ser Val
50 55 60
Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Ala Cys Lys Asn
100 105 110
His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Gln Asn Leu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Gln Gly Ile Leu
130 135 140
Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Ile Gln Gln Thr
145 150 155 160
Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp Val Phe Thr Tyr Ala Glu
165 170 175
Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr
180 185 190
Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn Arg His Leu Val Ala Gln
195 200 205
Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Glu Ser Met Leu
210 215 220
Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp
225 230 235 240
Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val
245 250 255
Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu Gly Gly Cys Gln Ala Ile
260 265 270
Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu
275 280 285
Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln Asn Gln Tyr Gly Glu Phe
290 295 300
Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met Pro Thr Val Val Phe Glu
305 310 315 320
Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Gln
325 330 335
Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Ser Glu Asn His Ser Gln
340 345 350
Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe
355 360 365
Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile
370 375 380
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> Camelus
<400> 2
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Gln Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Thr Arg Ile Pro Leu His Lys Gly Lys Thr Leu Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Arg Gln Gln
35 40 45
Tyr Ala Val Ser Ser Lys Tyr Ser Ser Leu Gly Lys Val Ala Arg Glu
50 55 60
Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Ile
65 70 75 80
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Val Cys Lys Asn
100 105 110
His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Arg Asn Leu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Glu Gly Phe Leu
130 135 140
Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Pro Asn Gln Thr
145 150 155 160
Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu Val Phe Thr Tyr Ser Glu
165 170 175
Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr
180 185 190
Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp Arg His Leu Val Ala Arg
195 200 205
Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Gly Ser Met Leu
210 215 220
Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp
225 230 235 240
Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val
245 250 255
Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val Gly Gly Cys Gln Ala Ile
260 265 270
Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu
275 280 285
Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu Asn Arg Tyr Gly Glu Phe
290 295 300
Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met Pro Thr Val Val Phe Glu
305 310 315 320
Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Lys
325 330 335
Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Gly Asp Asn Asn Ser Glu
340 345 350
Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe
355 360 365
Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile
370 375 380
<210> 3
<211> 323
<212> PRT
<213> Bos
<400> 3
Gly Glu Val Ala Ser Val Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ile Tyr Leu Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu
20 25 30
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys
35 40 45
Ser Asn Ala Cys Lys Asn His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser
50 55 60
Thr Phe Gln Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ser Met Gln Gly Ile Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile
85 90 95
Val Asp Ile Gln Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp
100 105 110
Val Phe Thr Tyr Ala Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro
115 120 125
Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn
130 135 140
Arg His Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gln Glu Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr
165 170 175
Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln
180 185 190
Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu
195 200 205
Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Ile Leu Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln
225 230 235 240
Asn Gln Tyr Gly Glu Phe Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met
245 250 255
Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro
260 265 270
Ser Ala Tyr Thr Ser Gln Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln
275 280 285
Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg
290 295 300
Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ile
<210> 4
<211> 323
<212> PRT
<213> Camelus
<400> 4
Gly Lys Val Ala Arg Glu Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val
20 25 30
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys
35 40 45
Ser Asn Val Cys Lys Asn His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser
50 55 60
Thr Phe Arg Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ser Met Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile
85 90 95
Val Asp Pro Asn Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu
100 105 110
Val Phe Thr Tyr Ser Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro
115 120 125
Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp
130 135 140
Arg His Leu Val Ala Arg Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gly Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr
165 170 175
Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln
180 185 190
Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val
195 200 205
Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Ile Leu Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu
225 230 235 240
Asn Arg Tyr Gly Glu Phe Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met
245 250 255
Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro
260 265 270
Ser Ala Tyr Thr Ser Lys Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln
275 280 285
Gly Asp Asn Asn Ser Glu Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg
290 295 300
Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ile
Claims (17)
- 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체로서,
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 αS1-카세인 절단 빈도의 80% 미만의 빈도로 αS1-카세인을 절단하되, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC로 수행되는 것임
을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체. - 제1항에 있어서, 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이체는 다음의 치환, 즉
Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L221I, S226T, T239S, R242E, G251D , G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L 및/또는 V317L
중 하나 이상을 포함하고, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환 조합, 즉
Y21S + H76Q + Y307F + V317L,
R61S + L166V + T239S,
V32L + E294Q + R316L + V317L,
S226T + G244D + I263L + G289S,
V203A + V248I + G251W + L253I + Y268F,
D59N + L222I + G251D + E83S + Q162S,
D59N + L222I + G251D + Y21S + L215V + L105E,
D59N + L222I + G251D + H76Q + L105E + V260T,
D59N + L222I + G251D + V203A + R266V + F223A,
L12M + D59N + H76Q + S154A + M165E + V203A + L222I + G251D + V309I,
L12M + V51L + H76Q + M165E + G251D,
L12M + V51L + D59N + H76Q + L166V + L222I + G251D,
L12M + D59N + H76Q + D144Q + M165E + V203A + L222I,
L12M + K19T + D59N + H76Q + S154A + M165E + V198I + L222I + G251D,
L12M + V51L + D59N + F66Y + H76Q + M165E + V203A + L222I + G251W,
V51L + D59N + H76Q + M165E + L180I + L222I + G251D + E262T,
L12M + D59N + H76Q + M165E + G251D + Q288E + V309I + K321P,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + R242E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + I96L + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y21S + H76Q + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + S132A + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S164G + L222I + N249D + S273Y,
H76Q + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + I96L + S164G + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + S164G + R242E + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S164G + L166V + L222I + S226T + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S164G + L166V + L222I + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + S164G + L222I + S226T + R242E,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y + V309I,
D59N + H76Q + L130I + S164G + G251D + V309I,
D59N + H76Q + L130I + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + L130I + S132A + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + Y21S + H76Q + S164G + L222I + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L222I + R242E + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + S132A + S164G + L222I + G251D + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S226T + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + S164G + L166V + L222I + N249D + G251D + S273Y + V309I,
K19T + Y21S + D59N + H76Q + L130I + S164G + L222I + S273Y,
Y21S + D59N + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y + V309I,
K19T + D59N + H76Q + L166V + L222I + R242E + G251D + S273Y,
D59N + S132A + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + S273Y,
D59N + H76Q + I96L + L130I + S164G + L222I + N249D + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + S164G + L166V + N249D + G251D + S273Y,
H76Q + S132A + S164G + L222I + N249D + G251D,
D59N + H76Q + S132A + S164G + L166V + S273Y,
K19T + D59N + H76Q + S132A + L222I + G251D + S273Y + V309I,
H76Q + L130I + L222I + S226T + G251D + S273Y,
Y21S + D59N + H76Q + I96L + L222I + S273Y,
Y11I + K19T + D59N + E83S + I96L + S164G + L222I + N249D,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I + I263L,
Y11V + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + L253I + I263L,
K19S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164N + L166I + L222I + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
Y11V + K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11V + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + G251D + L253I,
K19T + D59N + I96V + S164G + L166V + L222I + R242E + I263L,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D + L253V,
I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + I263L,
K19S + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
H76Q + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L222I + G251D + I263V,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + I263V,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D + L253I,
D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + L253I + I263L,
K19T + I96L + S164G + L166V + L222I + N249D + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242D + G251D + I263V,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249D + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249D,
K19T + E83S + I96L + S164G + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D + S273Y,
K19T + E83T + I96L + S164G + L222I + R242E + L253V,
K19T + I96L + S164G + R242E + L253I,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + N249E + G251D + L253V + I263L,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + N249E + G251D + I263V,
I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
K19T + I96L + S164N + L222I + R242E + I263L,
K19T + E83S + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249D + G251D + L253I,
K19T + D59N + E83T + S164G + L166V + L222I + R242D + G251D,
K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + G251D,
D59N + I96L + L166V + L222I + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96V + L222I + R242D + G251D,
K19T + I96V + S164G + L222I + N249D + G251D + L253I,
H76Q + N100Q + N291Q,
R67Q + L130I + M157L + D158S + R242E + N291Q,
V32L + R67Q + L130I + M157L + K231N + M256L,
R67Q + V136I + M157L + L222I + V248I,
Y11V + R67Q + L130I + M157L + L222I + R242E,
R67Q + I96L + N100Q + L130I + M157L + N292H.
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + I96L + S164G + L166V + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + I96L + S164G + L166V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + I96L + S164G + L222I + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D + L253I,
Y11I + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11I + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + S164G + L166I + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166V + R242E,
Y11I + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11I + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11I + K19T + D59N + S164G + L166I + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + S164G + L222V + R242E + N249E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + I96L + L222V + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + S164G + L166I + L222I + R242E + G251D,
Y11V + K19T + D59N + L166V + L222I + R242E + N249E + G251D + L253I,
Y11V + K19T + I96L + L222V + R242E + N249E + G251D 또는
Y11I + K19T + L222V + R242E + N249E + G251D
중 하나 이상을 포함하고, 상기 각 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체. - 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체로서,
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 C/P 값이 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신의 C/P 값의 200% 이상이고,
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 특성이 있는 단리된 낙타 키모신 폴리펩티드의 αS1-카세인 절단 빈도의 115% 이상의 빈도로 αS1-카세인을 절단하고, 상기 αS1-카세인 절단은 탈지유를 상기 키모신 변이체 또는 낙타 키모신과 함께 배양하여 얻은 αS1-카세인 펩티드를 정량화에 의하여 결정되고, 상기 정량화는 ESI-Q-TOF 질량 분석계에 결합된 RP-HPLC로 수행되는 것
을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체. - 제5항에 있어서, 모체 폴리펩티드는 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와의 서열 동일성이 80% 이상, 예를 들어 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 이상인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 변이체는 다음의 치환, 즉
V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K 및/또는 K321P
중 하나 이상을 포함하고, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체. - 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 다음의 치환 조합, 즉
G70D + S74F + D158S + R254S + S277N,
L130I + M142I + I200V + V259I + E294Q,
Y21S + R61S + H146R,
R61S + G163E + M256L + S277N,
D59N + S271P + T284S,
V248I + S226T + E294Q,
S74F + G244D + S271P,
V221K + V248I + S255Y,
V183I + G251W + M256L,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
D98V + G251D + M256L + V259I,
V183I + V248I + G244D + T284S,
N50K + R61S + Y127F + G244D + G251D,
I96L + F223V + G244D + R254S + M256L,
H146R + D158S + S273Y,
S74F + V259I + Y268F,
G70N + D98V + V136I,
I96L + M142I + R145Q + H146R,
V32L + G163E + T186S + Q188E + L295K,
R61Q + V136I + Y268F + T284S + Y307F,
S132A + Q188E + F223V,
I200V + G251D + G289S,
N50K + D158S + V203A + E294Q,
F223V + G251W + S273Y + D279E,
D59N + L222I + G251D + V32L + L12M + T284S,
D59N + L222I + G251D + V155F + E262T + V32L,
D59N + L222I + G251W + S154A + V203A,
D59N + L222I + G251D + V32L + K321P + V260T,
D59N + L222I + G251D + V198I + V203A + K321P,
D59N + L222I + G251D + S273Y + T284S + D267Q
V32L + N100Q + N291Q,
N292H + N100Q + N291Q,
V221K + N100Q + N291Q,
I297A + N100Q + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + L222I + K231N,
R67Q + L130I + V248I + M256L + N292H,
V32L + R67Q + L130I + K231N + N292H,
L130I + M157L + V248I + M256L + N291Q,
V32L + R67Q + V136I + M157L + N291Q,
R67Q + L130I + K231N + V248I + N291Q,
V32L + R67Q + G70D + N100Q + M157L,
R67Q + N100Q + L130I + D158S + V248I,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + K231N + N291Q,
R67Q + N100Q + L130I + M157L + V248I + N291Q 및/또는
N100Q + L130I + S132A + M157L + K231
중 하나 이상을 포함하고, 상기 각 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체. - 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 따른 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법으로서,
(a): 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 내 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변형을 행하는 단계와,
(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
(a) 상기 변이체는 다음의 치환, 즉
Y11I, Y11V, L12M, K19T, V51L, R61S, H76Q, E83S, I96L, L105E, D144Q, Q162S, S164G, M165E, L166V, L180I, V203A, L222I, S226T, R242E, G251W, L253I, V260T, I263L, R266V, S273Y, T239S, G251D, Q288E, G289S, E294Q, Y307F, V309I, R316L, V317L
중 하나 이상을 포함하고, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법. - 제5항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법으로서,
(a): 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열 내의 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변형을 행하는 단계와,
(b): 단계 (a)의 변형된 폴리펩티드를 생성 및 분리하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제11항에 있어서, 상기 변이체는 다음의 치환, 즉
V32L, I45V, N50K, G70D, G70N, D98V, N100Q, V136I, M142I, H146R, S154A, V155F, M157L, D158S, V198I, I200V, F223V, K231N, G244D, V248I, R254S, M256L, V259I, E262T, D267Q, D279E, T284S, N291Q N292H, L295K, K321P
중 하나 이상을 포함하고, 상기 치환은 서열 번호 2의 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하는 단계와, 추가의 제조 단계를 수행하여 식품 또는 사료 제품을 얻는 단계를 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 식품 또는 사료 제품은 밀크 기반 제품인 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 키모신 폴리펩티드 변이체를 포함하는 것인 식품 또는 사료 제품.
- 치즈 제조 공정에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도.
- 제16항에 있어서, 파스타 필라타, 체다, 콘티넨탈 타입 치즈, 소프트 치즈 또는 화이트 브라인 치즈의 제조 공정에서의 키모신 폴리펩티드 변이체의 용도.
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