CN108135193A - 具有改善性质的凝乳酶的变体 - Google Patents

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Abstract

具有改善的αS1‑酪蛋白裂解和C/P性质的凝乳酶的变体。

Description

具有改善性质的凝乳酶的变体
技术领域
本发明涉及具有改善的αS1-酪蛋白和C/P裂解性质的凝乳酶的变体。
背景技术
凝乳酶(EC 3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)是哺乳动物胃的乳凝固酶，它们是属于肽酶大类的天冬氨酸蛋白酶。
当在胃粘膜细胞中产生时，凝乳酶和胃蛋白酶分别作为无酶活性的凝乳酶原前体(pre-prochymosin)和胃蛋白酶原前体(pre-pepsinogen)存在。当凝乳酶被分泌时，N端肽片段、即前片段(pre-fragment)(信号肽)被裂解掉，产生包括原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是一种基本无活性形式的酶，然而，它在酸性条件下通过自动催化去除原片段而被活化成活性凝乳酶。这种活化在适当的pH条件下体内发生在胃腔内或在酸性条件下体外发生。
已经广泛研究了牛(bovine)(即牛(Bos taurus))凝乳酶原前体、凝乳酶原和凝乳酶的结构和功能特征。牛凝乳酶原前体分子的前部分(pre-part)包含16个氨基酸残基，并且相应的凝乳酶原的原部分(pro-part)具有42个氨基酸残基的长度。活性牛凝乳酶包含323个氨基酸。
凝乳酶在例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵羊、猪、人、猴子和大鼠的哺乳动物物种中自然产生。
牛和骆驼凝乳酶已经在乳品业中商业化数年之久。
乳凝固酶如凝乳酶和胃蛋白酶对乳的酶促凝结是奶酪制造中最重要的过程之一。酶促乳凝结是一个两阶段过程：第一阶段，其中蛋白水解酶(凝乳酶或胃蛋白酶)攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态，和第二阶段，其中乳随后凝结并形成凝结物(参考文献1)。除了通过裂解κ-酪蛋白而促进乳凝结之外，凝乳酶还主要在Phe23和Phe24之间裂解αS1-酪蛋白(alphaS1-casein/αS1-casein)(Moynihan等人2014)，导致形成αS1(1-23)肽。
已经描述了αS1(1-23)肽的形成有助于软化奶酪质地(Creamer&Olsen,1982)。例如，比较来自牛和单峰驼(Camelus dromedarius)的凝乳酶，已经发现了两个参数的相关性。虽然牛凝乳酶与骆驼凝乳酶相比在Phe23和Phe24之间更快地裂解αS1酪蛋白(Creamer&Olsen,1982；Bansal等人2009)，但是它产生更软的奶酪且奶酪的质地分解(texturebreak-down)更高，例如切达奶酪(cheddar)(Creamer&Olsen,1982；Bansal等人2009)和马苏里拉奶酪(mozzarella)(Moynihan等人2014)。
获得具有不同程度的αS1(1-23)肽形成的奶酪凝结剂可以使奶酪制造商能够对奶酪基质施加不同水平的柔软度。因此，具有增加或减少的αS1(1-23)肽形成的凝乳酶变体在奶酪制造中具有很高的工业利益。具有精细调节的αS1-酪蛋白蛋白水解作用的凝结剂将有助于制造各种具有最佳凝块硬度(curd firmness)的奶酪类型。
下面列出的参考文献在本文中可被看作是描述凝乳酶突变体的参考文献：
-WO02/36752A2(Chr.Hansen)描述了骆驼凝乳酶的重组生产。
-WO2013/174840A1(Chr.Hansen)描述了牛和骆驼凝乳酶的突变体/变体。
-WO2013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突变体。
-Suzuki等人：定点诱变揭示了Thr218、Lys220和Asp304在凝乳酶中的功能贡献(Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218,Lys220and Asp304in chymosin),蛋白质工程(Protein Engineering),第4卷,1990年1月,第69-71页；
-Suzuki等人：定点诱变对凝乳酶的催化性质的改变(Alteration of catalyticproperties of chymosin by site-directed mutagenesis),蛋白质工程(ProteinEngineering),第2卷,1989年5月,第563-569页；
-van den Brink等人：通过糖基化而增加的凝乳酶的产生(Increasedproduction of chymosin by glycosylation),生物技术杂志(Journal ofbiotechnology),第125卷,2006年9月,第304-310页；
-Pitts等人：在里氏木霉中产生的凝乳酶pH最适突变体的表达和表征(Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced inTrichoderma reesei),生物技术杂志(Journal of biotechnology),第28卷,1993年3月,第69-83页；
-M.G.Williams等人：牛凝乳酶的点突变体的诱变、生物化学表征和X射线结构分析(Mutagenesis,biochemical characterization and X-ray structural analysis ofpoint mutants of bovine chymosin),蛋白质工程设计和选择(Protein engineeringdesign and selection),第10卷,1997年9月,第991-997页；
-Strop等人：工程设计酶亚位点特异性：Val111phe位点突变的小牛凝乳酶的制备、动力学表征和在2.0ANG分辨率下的x射线分析(Engineering enzyme subsitespecificity:preparation,kinetic characterization,and x-ray analysis at 2.0ANGresolution of Val111phe site mutated calf chymosin),生物化学(Biochemistry),第29卷,1990年10月,第9863-9871页；
-Chitpinityol等人：影响凝乳活性的小牛凝乳酶B的位点特异性突变(Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clottingactivity),食品化学(Food Chemistry),第62卷,1998年6月,第133-139页；
-Zhang等人：重组凝乳酶原中的二硫键Cys45-Cys50的功能影响(Functionalimplications of disulfide bond,Cys45-Cys50,in recombinant prochymosin),生物化学与生物物理学报(Biochimica et biophysica acta),第1343卷,1997年12月,第278-286页。
以上提到的现有技术参考文献都没有直接、明确地描述如下所述的任何凝乳酶变体，所述凝乳酶变体与衍生其的亲本相比具有改变的αS1-酪蛋白裂解频率和提高的C/P值。
发明内容
本发明要解决的问题是提供凝乳酶变体，其与亲本多肽相比时具有更低或更高的αS1-酪蛋白裂解频率和增加的C/P值。
通过专注的努力并通过应用多维研究策略，诸位发明人发现了允许设计分离的凝乳酶多肽变体的单突变以及突变组合，所述分离的凝乳酶多肽变体的特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
另外，诸位发明人发现了允许设计分离的凝乳酶多肽变体的单突变以及突变组合，所述分离的凝乳酶多肽变体的特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的至少115％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
此外，本发明提供了制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在对应于Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L、或者V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P的至少一个氨基酸位置上的取代、缺失或插入。
(b)：生产和分离步骤(a)的改变的多肽。
在一个相关方面，本发明还涉及一种制备与亲本多肽相比具有改变的αS1-酪蛋白裂解频率的分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)：在亲本多肽中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在对应于以下任何位置的至少一个氨基酸位置上的取代、缺失或插入：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L、V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P，
(b)：生产和分离步骤(a)的改变的多肽，
并且其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置通过亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)的比对而确定；和
(ii)：亲本多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少65％的序列同一性和/或与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少65％的序列同一性。
此外，本发明还涉及如下在本发明的实施方案中概述的取代的特定组合。
本公开还涉及包含分离的凝乳酶多肽变体的食品或饲料产品，以及分离的凝乳酶多肽变体在制造奶酪的工艺中的用途。
具体实施方式
基于不同变体的比较分析，诸位发明人已经鉴定了许多氨基酸位置，就通过在这些位置中的一个或多个位置上制备变体可以获得具有更低或更高的αS1-酪蛋白裂解频率和增加的C/P值的改善的凝乳酶变体这一方面而言，所述氨基酸位置在本文中是重要的。
因此，如上所述，本发明提供了分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的不到80％或至少115％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
更具体地说，本发明的一个方面提供分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
在一个密切相关的方面，本发明的分离的凝乳酶多肽变体(其裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％)包含一个或多个以下的取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L。
以上指定的突变可形成突变组合的一部分以产生包含多个取代的变体或突变体。具体来说，作为一个相关方面，具有降低的αS1-酪蛋白裂解频率的分离的凝乳酶多肽变体可以包含以下取代的组合中的一个或多个，其中每个取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：
Y21S+H76Q+Y307F+V317L、
R61S+L166V+T239S、
V32L+E294Q+R316L+V317L、
S226T+G244D+I263L+G289S、
V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F、
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S、
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E、
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T、
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A、
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I、
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D、
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D、
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I、
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L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W、
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T、
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
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Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
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D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I、
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y、
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D、
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y、
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L、
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L、
K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I、
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V、
I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I、
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V、
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L、
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D、
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I、
H76Q+N100Q+N291Q、
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q、
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L、
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I、
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E、
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D或
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D。
因此，本发明还包括分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的αS1-酪蛋白裂解频率的至少115％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
在一个密切相关的方面，本发明的凝乳酶多肽变体(其裂解αS1-酪蛋白的频率是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的αS1-酪蛋白裂解频率的至少115％)包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P。
在另一个相关方面，具有增加的αS1-酪蛋白裂解频率的分离的凝乳酶多肽变体包含以下取代的组合中的一个或多个，其中每个取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：
G70D+S74F+D158S+R254S+S277N、
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q、
Y21S+R61S+H146R、
R61S+G163E+M256L+S277N、
D59N+S271P+T284S、
V248I+S226T+E294Q、
S74F+G244D+S271P、
V221K+V248I+S255Y、
V183I+G251W+M256L、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
D98V+G251D+M256L+V259I、
V183I+V248I+G244D+T284S、
N50K+R61S+Y127F+G244D+G251D、
I96L+F223V+G244D+R254S+M256L、
H146R+D158S+S273Y、
S74F+V259I+Y268F、
G70N+D98V+V136I、
I96L+M142I+R145Q+H146R、
V32L+G163E+T186S+Q188E+L295K、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
S132A+Q188E+F223V、
I200V+G251D+G289S、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
F223V+G251W+S273Y+D279E、
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S、
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L、
D59N+L222I+G251W+S154A+V203A、
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T、
D59N+L222I+G251D+V198I+V203A+K321P、
D59N+L222I+G251D+S273Y+T284S+D267Q
V32L+N100Q+N291Q、
N292H+N100Q+N291Q、
V221K+N100Q+N291Q、
I297A+N100Q+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N、
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H、
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H、
L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q、
V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q、
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q、
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L、
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q和/或
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231N。
本发明进一步提供了制备分离的凝乳酶多肽变体的方法、使用分离的凝乳酶多肽变体制备食品或饲料产品的方法、包含这些变体的食品和饲料产品以及所述变体用于制备食品和饲料产品的用途。
此外，本发明涉及本发明的凝乳酶多肽变体在制备例如帕斯塔费拉塔奶酪(pastafilata)、切达奶酪、欧陆式奶酪(Continental type cheese)、软质奶酪(soft cheese)或白卤奶酪(white brine cheese)的奶酪的工艺中的用途。
确定目标凝乳酶的氨基酸位置
本文中用于指定变体的氨基酸编号是基于成熟肽。
如本领域已知的，从不同哺乳动物物种(例如牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠)获得的不同天然野生型凝乳酶多肽序列具有相对高的序列相似性/同一性。在本文中，天然获得的野生型凝乳酶(例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶)在本文中可以是亲本多肽的实例，即经过改变以产生本发明的变体凝乳酶多肽的亲本多肽。
如本文所概述的，作为用于确定目标亲本凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置的参考序列，本文使用公众所知的SEQ ID NO:2的单峰驼成熟凝乳酶序列。它在本文中可以替代地称为骆驼凝乳酶。SEQ ID NO:2的成熟多肽序列在本文中例示为SEQ IDNO:4。
或者，可以将另一种凝乳酶多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽进行比对，并且基于比对，对应于SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号使用ClustalW算法或如本文实施例1中所述来确定。
基于上述众所周知的计算机程序，确定本文相关的目标凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置对于本领域的技术人员而言是常规工作。
凝乳活性的测定
可以使用REMCAT方法测定凝乳活性，REMCAT方法是由国际乳品联合会(International Dairy Federation)开发的标准方法(IDF方法)。
在这种方法中，通过由低热低脂奶粉和0.5g/L的氯化钙溶液(pH≈6.5)制备的标准乳基质(milk substrate)的可见絮凝所需的时间来确定凝乳活性。将粗制凝乳酶(rennet)样品的凝固时间与具有已知的凝乳活性并且根据IDF标准110B与样品具有相同的酶组成的参考标准品的凝固时间进行比较。在相同的化学和物理条件下测量样品和参考标准品。使用84mM乙酸缓冲液(pH 5.5)将变体样品调节至约3IMCU/ml。此后，将200μl酶制剂加入至置于水浴中的玻璃试管中的10ml预热奶(32℃)中，所述水浴在恒定搅拌下能够保持32℃±1℃的恒定温度。或者，如上所述将20μL酶制剂加入至1mL预热奶中。
相对于与样品具有相同酶组成的标准品，根据下式以国际凝乳单位(IMCU)/ml计算粗制凝乳酶的总凝乳活性(强度)：
S标准品：粗制凝乳酶的国际参考标准品的凝乳活性。
T标准品：对于标准品稀释物获得的凝固时间，以秒为单位。
D样品：样品的稀释系数
D标准品：标准品的稀释系数
T样品：针对稀释的粗制凝乳酶样品从添加酶到絮凝时的凝固时间，以秒为单位。
或者，可以使用μIMCU方法代替REMCAT方法。与REMCAT相比，μIMCU测定中凝乳酶变体的絮凝时间通过在UV/VIS读板器中，在800nm，在96孔微量滴定板中的OD测量来确定。在每个板上记录具有已知凝固强度的参考标准品的各种稀释物的标准曲线。通过在84mM乙酸盐缓冲液，0.1％曲拉通(triton)X-100，pH 5.5，中稀释酶来制备样品。通过将250μL含有4％(w/w)低热低脂奶粉和7.5％(w/w)氯化钙(pH≈6.5)的标准乳基质加入到25μL酶样品中来开始32℃的反应。然后，基于相对于标准曲线的样品絮凝时间确定凝乳酶变体的凝乳活性，单位是国际凝乳单位(IMCU)/ml。
总蛋白质含量的测定
优选地，使用来自赛默科技公司(Thermo Scientific)的Pierce BCA蛋白测定试剂盒按照供应商的说明测定总蛋白质含量。
凝固比活性(specific clotting activity)的计算
可以通过将凝固活性(IMCU/ml)除以总蛋白质含量(mg总蛋白质/ml)来确定凝固比活性(IMCU/mg总蛋白质)。
变体的命名法
在描述本发明的变体时，下面描述的命名法经过改写以便于参考。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
在以下的该“命名法”部分中讨论的具体变体在本文中可能与本发明的变体不相关，即该“命名法”部分仅仅描述本文相关的所用命名法的本身。如上所述，用于指定本发明的凝乳酶多肽变体的氨基酸编号是基于成熟凝乳酶多肽序列中氨基酸的位置。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸对苏氨酸进行的理论取代被命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变用加号(“+”)隔开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，表示在位置205和411分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。例如命名为“226A”的取代是指在位置226用丙氨酸取代亲本氨基酸(例如T、Q、S或另外的亲本氨基酸)。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸/、位置、*。因此，位置195处的甘氨酸的缺失被命名为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失用加号(“+”)隔开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被命名为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等等]。举例来说，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被标示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这类情况下，通过向插入的氨基酸残基前面的氨基酸残基的位置编号添加小写字母来对插入的氨基酸残基进行编号。因此，在以上实例中，序列将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个改变.包含多个改变的变体用加号(“+”)隔开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”，其分别表示用酪氨酸和谷氨酸取代位置170和195处的精氨酸和甘氨酸。
不同取代.当可以在某个位置引入不同的取代时，不同的取代用逗号隔开，例如“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”表示在位置170处用酪氨酸或谷氨酸取代精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”或“Y167G,A+R170G,A”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
优选变体：
如本文所概述的，本发明的发明人已经制备了许多优选的凝乳酶多肽变体，其以与相应的亲本多肽不同的期望频率裂解αS1-酪蛋白，同时相比由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶，将变体的C/P值增加至少2倍。
具有降低的αS1-酪蛋白裂解活性的优选变体
本发明的优选的凝乳酶多肽变体包括特征如下的变体：(a)分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的至少200％；和(b)分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
在优选的方面，分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的不到80％、不到50％、不到40％、不到30％或不到20％。本发明的分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的C/P值的至少200％，包括C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的C/P值的至少200％、至少300％、至少500％、至少900％、至少1200％或至少1400％。
亲本多肽可以与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)或SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少80％，例如至少80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
在一个密切相关的方面，分离的凝乳酶多肽变体的特征在于(a)分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的至少200％；和(b)分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量，所述分离的凝乳酶多肽变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L。
另外，上面刚刚描述的具有降低的αS1-酪蛋白裂解活性的分离的凝乳酶多肽可以包含以下取代的组合中的一个或多个，并且其中每个取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：
Y21S+H76Q+Y307F+V317L、
R61S+L166V+T239S、
V32L+E294Q+R316L+V317L、
S226T+G244D+I263L+G289S、
V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F、
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S、
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E、
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T、
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A、
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I、
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D、
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D、
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I、
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D、
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W、
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T、
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y、
H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I、
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y、
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D、
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y、
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L、
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L、
K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I、
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V、
I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I、
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V、
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L、
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D、
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I、
H76Q+N100Q+N291Q、
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q、
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L、
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I、
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E、
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D或
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D。
具有增加的αS1-酪蛋白裂解活性的优选变体
本发明的优选的分离的凝乳酶多肽变体包括特征如下的变体：(a)分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的至少200％；和(b)分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率超过由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的αS1-酪蛋白裂解频率的115％，其中通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
在优选的方面，分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的成熟骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的至少125％、至少130％、至少140％、至少145％或至少150％。具有增加的αS1-酪蛋白裂解活性的分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的C/P值的至少200％，包括C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的C/P值的至少200％、至少300％、至少500％、至少900％、至少1200％或至少1400％。亲本多肽可以与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)或SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少80％，例如至少80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
在一个密切相关的方面，分离的凝乳酶多肽变体的特征在于(a)分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的至少200％；和(b)分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率超过由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的αS1-酪蛋白裂解频率的115％，其中通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量，所述分离的凝乳酶多肽变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P。
另外，上面刚刚描述的具有增加的αS1-酪蛋白裂解活性的分离的凝乳酶多肽可以包含以下取代的组合中的一个或多个，并且其中每个取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：
G70D+S74F+D158S+R254S+S277N、
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q、
Y21S+R61S+H146R、
R61S+G163E+M256L+S277N、
D59N+S271P+T284S、
V248I+S226T+E294Q、
S74F+G244D+S271P、
V221K+V248I+S255Y、
V183I+G251W+M256L、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
D98V+G251D+M256L+V259I、
V183I+V248I+G244D+T284S、
N50K+R61S+Y127F+G244D+G251D、
I96L+F223V+G244D+R254S+M256L、
H146R+D158S+S273Y、
S74F+V259I+Y268F、
G70N+D98V+V136I、
I96L+M142I+R145Q+H146R、
V32L+G163E+T186S+Q188E+L295K、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
S132A+Q188E+F223V、
I200V+G251D+G289S、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
F223V+G251W+S273Y+D279E、
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S、
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L、
D59N+L222I+G251W+S154A+V203A、
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T、
D59N+L222I+G251D+V198I+V203A+K321P、
D59N+L222I+G251D+S273Y+T284S+D267Q
V32L+N100Q+N291Q、
N292H+N100Q+N291Q、
V221K+N100Q+N291Q、
I297A+N100Q+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N、
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H、
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H、
L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q、
V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q、
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q、
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L、
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q和/或
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231。
本发明的分离的凝乳酶多肽变体与天然凝乳酶多肽保持高度的总体序列同一性。举例来说，本发明的多肽变体优选地与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％的序列同一性，包括与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少85％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
如上所论述，基于例如本文中论述的计算机序列比对程序，确定本文相关的目标凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的本文相关的氨基酸位置对于本领域的技术人员而言是常规工作。
举例来说，与SEQ ID NO:2的野生型骆驼凝乳酶多肽相比具有例如5-10个改变(例如取代)的骆驼凝乳酶变体仍将是与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼)具有至少65％序列同一性的亲本多肽。
换句话说，本文相关的分离的凝乳酶多肽变体可以包含除本文提出的位置之外的其它位置处的改变(例如取代)。如本领域技术人员在本文中所理解的，例如成熟绵羊、双峰驼(C.bactrianus)、骆驼、猪或大鼠凝乳酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶-即SEQ IDNO:1的氨基酸位置59至381)的本文相关的序列同一性百分比和上面提及的序列同一性百分比是相对类似的。
在优选的实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少92％的序列同一性，更优选地亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少95％的序列同一性，甚至更优选地亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少97％的序列同一性。亲本多肽可以优选地为SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)。
与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于30个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的，或者与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于20个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的，或者与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的，或者与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于5个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的。
如本领域技术人员在本文中所理解的，上面的术语“分离的变体多肽与SEQ IDNO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有小于100％的序列同一性”涉及的是，本文所述的分离的骆驼凝乳酶变体不应具有与公众已知的SEQ ID NO:2的成熟野生型骆驼凝乳酶序列100％相同的多肽序列。
至少一个改变是取代可能是优选的，即本文相关的优选实施方案涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变在对应于本文提出的任何位置的至少一个氨基酸位置上包含取代。
优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)和/或SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
仅仅作为一个例子，本文合适的相关亲本多肽可以例如是牛凝乳酶A，如本领域已知的，与本文的SEQ ID NO:1的牛凝乳酶B相比，牛凝乳酶A可仅具有一个氨基酸差异。
如本领域技术人员在本文中所理解的，本文相关的、具有凝乳酶活性的亲本多肽可能已经例如是例如相应的野生型凝乳酶的变体。
举例来说，与SEQ ID NO:1的成熟野生型牛凝乳酶多肽相比具有例如5-10个改变(例如取代)的牛凝乳酶变体仍将是与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少95％序列同一性的亲本多肽。
换句话说，一般而言，本文相关的分离的凝乳酶多肽变体可以包含除本文提出的位置之外的其它位置处的改变(例如取代)。
如本领域技术人员在本文中所理解的，分离的凝乳酶变体可以包含除上面给出的氨基酸位置之外的其它氨基酸位置处的改变(例如取代)。
举例来说，与SEQ ID NO:1的野生型牛凝乳酶多肽相比具有例如5-10个改变(例如取代)的牛凝乳酶变体仍将是与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少95％序列同一性的亲本多肽。
与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于30个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的，或者与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于20个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的，或者与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的，或者与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于5个氨基酸改变(例如取代)可能是优选的。
换句话说，与成熟牛凝乳酶具有至少65％序列同一性的成熟亲本凝乳酶多肽(例如绵羊或猪)被认为与例如牛或骆驼凝乳酶在结构上足够相同，以便是本文相关的，即在本文中，与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％序列同一性的成熟亲本凝乳酶多肽(例如来自例如绵羊或大鼠的成熟亲本凝乳酶多肽)在本文中可以被视为与例如牛或骆驼凝乳酶在结构上足够相关，以便通过在本文所述的任何氨基酸位置上制备变体而得到改进。
SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶多肽与SEQ ID NO:1的牛多肽(即从位置1至381的完整SEQ ID NO:1，其包括前序列和原序列)具有84％的序列同一性。
制备分离的凝乳酶多肽变体的方法
本发明还涉及一种制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述凝乳酶多肽变体的特征在于：(a)分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的至少200％；和(b)分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量，所述方法包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、R242E、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、T239S、G251D、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L；
(b)：生产和分离步骤(a)的改变的多肽。
在一个相关方面，本发明还涉及一种制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述凝乳酶多肽变体的特征在于：(a)分离的凝乳酶多肽变体的C/P值为由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的至少200％；和(b)分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率超过由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的αS1-酪蛋白裂解频率的115％，其中通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量，所述方法包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P；
(b)：生产和分离步骤(a)的改变的多肽。
如上所述，如本领域所知的，本领域技术人员基于其公知常识可以常规地生产和纯化凝乳酶和凝乳酶变体。
换句话说，一旦本领域技术人员拥有具有目标凝乳酶活性的本文相关的亲本多肽(例如来自牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠的亲本多肽)和本文公开的教导，制备此类目标亲本凝乳酶的变体对于本领域技术人员来说是常规工作。
生产和分离凝乳酶(变体或亲本)的合适方法的实例可以是众所周知的，例如基于真菌重组表达/生产的技术，例如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中描述的。
对于本领域技术人员来说，在具有凝乳酶活性的亲本多肽的一个或多个位置处进行改变也是常规工作，其中所述改变包括在本文公开的至少一个氨基酸位置上的取代、缺失或插入。如本领域技术人员已知的，这可以例如通过所谓的定点诱变和基于重组表达/生产的技术完成。
对于本领域技术人员来说，确定本文相关的亲本多肽(例如骆驼或牛野生型凝乳酶)和/或本文相关的变体是否具有凝乳酶活性也是常规工作。
如本领域已知的，凝乳酶特异性可以通过所谓的C/P值来确定，所述C/P值通过用凝固比活性(C)除以蛋白水解活性(P)来确定。如本领域中已知的，较高的C/P值通常意味着在例如奶酪制造过程中由于非特异性蛋白质降解导致的蛋白质损失有所减少，即奶酪的产量得到提高。
也如本领域已知的，可以使用本领域技术人员可用的标准方法测定αS1-酪蛋白裂解和αS1-酪蛋白(包括αS1(1-23))形成。
实施例中提供了另外的方法。
制造乳基产品的方法
如上所述，根据本领域可以使用如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体，以例如制造目标乳基产品(例如奶酪产品)。
如上所述，本发明的一方面涉及一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括将有效量的如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体加入到食物或饲料成分中并执行本发明的进一步制造步骤以获得所述食品或饲料产品。
优选地，所述食品或饲料产品是乳基产品，并且其中所述方法包括将有效量的如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体加入到乳中并执行本发明的进一步制造步骤以获得所述乳基产品。
举例来说，本发明的凝乳酶多肽变体可以在乳发酵后加入到乳基产品中。在一个方面，作为生产奶酪的方法的一部分，加入本发明的凝乳酶多肽变体以凝结发酵乳制品。
乳可以例如是豆乳、绵羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊驼(lama)乳、骆驼乳或牛乳。
乳基产品可以例如是发酵乳制品，如夸克(quark)或奶酪。
食品和饲料产品
本发明还提供包含本发明的凝乳酶多肽变体或根据本发明的方法可获得的凝乳酶多肽变体的食品和饲料产品。食品和饲料产品优选地是发酵食物产品，例如发酵乳制品，包括奶酪和夸克。
在另一个可选的相关的方面，本发明涉及以下列出的项目：
第1项.一种制备与亲本多肽相比具有改变的αS1-酪蛋白裂解频率的分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)：在亲本多肽中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在对应于以下任何位置的至少一个氨基酸位置上的取代、缺失或插入：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L、V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P，
(b)：生产和分离步骤(a)的改变的多肽，
并且其中：
(i)：通过亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)的比对确定亲本多肽的氨基酸位置；和
(ii)：亲本多肽与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)具有至少65％的序列同一性和/或与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少65％的序列同一性。
第2项.根据第1项的方法，其中分离的凝乳酶多肽变体具有：
-与包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率相比，产生较低的αS1-酪蛋白裂解频率的凝乳酶活性，和/或
-与包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率相比，产生较低的αS1-酪蛋白裂解频率的凝乳酶活性。
第3项.制备第2项的分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变是一个或多个以下取代：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L。
第4项.根据第2项和第3项中任一项的方法，其中所述分离的凝乳酶多肽变体包含位置组合中的一个或多个中的改变，所述位置组合包括对应于以下的位置：
Y21S+H76Q+Y307F+V317L、
R61S+L166V+T239S、
V32L+E294Q+R316L+V317L、
S226T+G244D+I263L+G289S、
V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F、
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S、
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E、
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T、
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A、
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I、
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D、
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D、
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I、
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D、
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W、
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T、
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y、
H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I、
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y、
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D、
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y、
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L、
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L、
K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I、
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V、
I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I、
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V、
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L、
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D、
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I、
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q、
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L、
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I、
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E、
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H、
H76Q+N100Q+N291Q、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D或
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D。
第5项.根据第1项的方法，其中所述分离的凝乳酶多肽变体具有：
-与包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率相比，产生较高的αS1-酪蛋白裂解频率的凝乳酶活性，和/或
-与包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率相比，产生较高的αS1-酪蛋白裂解频率的凝乳酶活性。
第6项.制备第5项的分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变是一个或多个以下取代：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P。
第7项.根据第5项和第6项中任一项的方法，其中所述分离的凝乳酶多肽变体包含位置组合中的一个或多个中的改变，所述位置组合包括对应于以下的位置：
G70D+S74F+D158S+R254S+S277N、
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q、
Y21S+R61S+H146R、
R61S+G163E+M256L+S277N、
D59N+S271P+T284S、
V248I+S226T+E294Q、
S74F+G244D+S271P、
V221K+V248I+S255Y、
V183I+G251W+M256L、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
D98V+G251D+M256L+V259I、
V183I+V248I+G244D+T284S、
N50K+R61S+Y127F+G244D+G251D、
I96L+F223V+G244D+R254S+M256L、
H146R+D158S+S273Y、
S74F+V259I+Y268F、
G70N+D98V+V136I、
I96L+M142I+R145Q+H146R、
V32L+G163E+T186S+Q188E+L295K、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
S132A+Q188E+F223V、
I200V+G251D+G289S、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
F223V+G251W+S273Y+D279E、
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S、
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L、
D59N+L222I+G251W+S154A+V203A、
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T、
D59N+L222I+G251D+V198I+V203A+K321P、
D59N+L222I+G251D+S273Y+T284S+D267Q、
V32L+N100Q+N291Q、
N292H+N100Q+N291Q、
V221K+N100Q+N291Q、
I297A+N100Q+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N、
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H、
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H、
L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q、
V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q、
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q、
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L、
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q和/或
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231。
第8项.制备第1项至第7项中任一项的分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少95％的序列同一性。
第9项.一种分离的凝乳酶多肽变体，其与具有凝乳酶活性的亲本多肽相比包括一个或多个位置处的改变，其中所述改变包括在对应于以下任意位置的至少一个氨基酸位置上的取代：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L，其中
(i)：通过亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)的比对确定亲本多肽的氨基酸位置；和
(ii)：亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少65％的序列同一性；
其中分离的凝乳酶多肽变体以比相应的亲本多肽低的频率裂解αS1-酪蛋白。
第10项.第9项的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
第11项.根据第9项至第10项中任一项的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述分离的凝乳酶多肽变体包含位置组合中的一个或多个中的改变，所述位置组合包括对应于以下的位置：
Y21S+H76Q+Y307F+V317L、
R61S+L166V+T239S、
V32L+E294Q+R316L+V317L、
S226T+G244D+I263L+G289S、
V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F、
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S、
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E、
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T、
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A、
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I、
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D、
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D、
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I、
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D、
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W、
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T、
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y、
H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I、
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y、
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D、
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y、
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L、
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L、
K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I、
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V、
I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I、
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V、
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L、
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D、
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I、
H76Q+N100Q+N291Q、
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q、
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L、
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I、
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E、
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D或
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D。
第12项.一种与具有凝乳酶活性的亲本多肽相比包含一个或多个位置上的改变的、分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包括在对应于以下任意位置的至少一个氨基酸位置上的取代：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K和/或K321P，其中
(i)：通过亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)的比对确定亲本多肽的氨基酸位置；和
(ii)：亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少65％的序列同一性；
其中分离的凝乳酶多肽变体以比相应的亲本多肽高的频率裂解αS1-酪蛋白。
第13项.第12项的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
第14项.根据第12项至第13项中任一项的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述分离的凝乳酶多肽变体包含位置组合中的一个或多个中的改变，所述位置组合包括对应于以下的位置：
G70D+S74F+D158S+R254S+S277N、
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q、
Y21S+R61S+H146R、
R61S+G163E+M256L+S277N、
D59N+S271P+T284S、
V248I+S226T+E294Q、
S74F+G244D+S271P、
V221K+V248I+S255Y、
V183I+G251W+M256L、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
D98V+G251D+M256L+V259I、
V183I+V248I+G244D+T284S、
N50K+R61S+Y127F+G244D+G251D、
I96L+F223V+G244D+R254S+M256L、
H146R+D158S+S273Y、
S74F+V259I+Y268F、
G70N+D98V+V136I、
I96L+M142I+R145Q+H146R、
V32L+G163E+T186S+Q188E+L295K、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
S132A+Q188E+F223V、
I200V+G251D+G289S、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
F223V+G251W+S273Y+D279E、
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S、
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L、
D59N+L222I+G251W+S154A+V203A、
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T、
D59N+L222I+G251D+V198I+V203A+K321P、
D59N+L222I+G251D+S273Y+T284S+D267Q、
V32L+N100Q+N291Q、
N292H+N100Q+N291Q、
V221K+N100Q+N291Q、
I297A+N100Q+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N、
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H、
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H、
L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q、
V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q、
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q、
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L、
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q和/或
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231。
第15项.一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括将有效量的根据第9项至第14项中任一项的分离的凝乳酶多肽变体加入到食物或饲料成分中并执行本发明的进一步的制造步骤以获得所述食品或饲料产品。
第16项.根据权利要求15所述的方法，其中所述食品或饲料产品是乳基产品。
第17项.根据第9项至第12项中任一项的凝乳酶多肽变体在制备奶酪的工艺中的用途。
第18项.根据第9项至第14项中任一项的凝乳酶多肽变体在制备帕斯塔费拉塔奶酪、切达奶酪和欧陆式奶酪的工艺中的用途。
第19项.根据第9项至第14项中任一项的凝乳酶多肽变体在制备软质奶酪或白卤奶酪的工艺中的用途。
本发明的另一个相关方面涉及一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括将有效量的如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体加入到食物或饲料成分中并执行本发明的进一步制造步骤以获得所述食品或饲料产品，具体来说其中所述食品或饲料产品是乳基产品。
本发明还包括本文所述的凝乳酶多肽变体在用于制备奶酪的工艺中的用途。更具体地说，凝乳酶多肽变体(其αS1-酪蛋白裂解频率低于其对应亲本肽的αS1-酪蛋白裂解频率)在用于制造帕斯塔费拉塔奶酪、切达奶酪和欧陆式奶酪的工艺中的用途，和/或凝乳酶多肽变体(其αS1-酪蛋白裂解频率高于其对应亲本肽的αS1-酪蛋白裂解频率)在用于制造软质奶酪、白卤奶酪和长熟成高达(long ripening Gouda)奶酪的工艺中的用途。
定义
本文相关术语的所有定义都与本领域技术人员关于本文相关技术背景理解的内容一致。
术语“αS1-裂解”或“αS1-酪蛋白的裂解”意指αS1-酪蛋白的任何酶促裂解。例如，在Phe23和Phe24之间裂解，导致形成αS1(1-23)肽。
在一个方面，通过定量通过将脱脂乳与凝乳酶变体或骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1裂解肽1-23来确定αS1裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC来进行定量。实施例中描述了确定αS1-酪蛋白裂解的优选方法的全部细节。
术语“凝乳酶”涉及EC 3.4.23.4类的酶。凝乳酶具有高特异性，并且主要通过裂解酪蛋白的κ-链中的单个104-Ser-Phe-|-Met-Ala-107键来凝结乳。作为次要活动，凝乳酶还主要在Phe23和Phe24之间裂解α-酪蛋白(参考文献2，3)。得到的肽αS1(1-23)被来自添加到熟成奶酪中的微生物培养物的蛋白酶进一步降解(参考文献4)。本领域使用的凝乳酶的替代名称是凝乳酶(rennin)。
如本领域技术人员在本文中所理解的，术语“凝乳酶活性”涉及凝乳酶的凝乳酶活性。
本领域技术人员知道如何确定本文相关的凝乳酶活性。
术语“凝固比活性”描述了凝乳酶多肽的凝乳活性，并且可以根据本领域中众所周知的分析法来确定。根据IMCU/mg蛋白质确定凝固比活性的优选方法是由国际乳品联合会开发的标准方法(IDF方法)，其包括以下步骤，其中由乳基质的可见絮凝所需的时间来确定凝乳活性，并将样品的凝固时间与具有已知的凝乳活性并且根据IDF标准110B与样品具有相同的酶组成的参考标准品的凝固时间进行比较。在相同的化学和物理条件下测量样品和参考标准品。实施例中描述IDF方法的全部细节。
如本领域已知的，本文相关的所谓的C/P值通过将凝固比活性(C)除以蛋白水解活性(P)来确定。
如本领域中已知的，较高的C/P值通常意味着在例如奶酪制造过程中由于非特异性蛋白质降解导致的蛋白质损失有所减少，即奶酪的产量得到提高。C/P值的差异可以根据百分比来定义。例如，C/P值20对应于C/P值40的50％。
术语“分离的变体”意指通过人类行为而修饰的变体。在一个方面，如通过SDSPAGE确定的，所述变体是至少1％纯的，例如至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯和至少90％纯的。
本文中用于指定本发明的凝乳酶多肽变体的氨基酸编号是在成熟肽编号上进行的。在和本申请一起提供的序列表中：
SEQ ID NO:1代表牛凝乳酶原前体的完整多肽序列；
SEQ ID NO:2代表骆驼凝乳酶原前体的完整多肽序列；
SEQ ID NO:3代表成熟牛凝乳酶的多肽序列；
SEQ ID NO:4代表成熟骆驼凝乳酶的多肽序列。
换句话说，SEQ ID NO:3和4分别对应于SEQ ID NO:1和2的氨基酸59至381。本文鉴定的所有特定取代都是相对于成熟凝乳酶序列的位置(即，相对于SEQ ID NO:3或4的氨基酸编号)而鉴定的。在相对于SEQ ID NO:1或2的氨基酸编号鉴定位置的范围内，必须添加58个残基以鉴定SEQ ID NO:1或2中的位置。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后的处于其最终形式的肽。在本文中，本文相关的成熟凝乳酶多肽可被看作活性凝乳酶多肽序列，即没有前部分和/或原部分序列。成熟多肽的本文相关的实例是例如SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶)，其来自SEQ ID NO:1的氨基酸位置59至氨基酸位置381；或SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)，其来自SEQ ID NO:2的氨基酸位置59至氨基酸位置381。
术语“亲本”或“具有凝乳酶活性的亲本多肽”意指进行改变以产生本发明的酶变体的多肽。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。
术语“序列同一性”涉及两条氨基酸序列之间或两条核苷酸序列之间的相关性。
为了本发明的目的，可以使用EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包(The European Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,遗传学趋势(Trends Genet).16:276-277)的Needle程序(优选3.0.0版本或更新版本)中所实施的尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)，来确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度。使用的任选参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle的输出用作同一性百分比，其如下计算：
(一致的残基×100)/(比对长度–比对中的缺口总数)
为了本发明的目的，使用EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件包(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite),Rice等人,2000,同上)的Needle程序(优选3.0.0版本或更新版本)中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)，来确定两条脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性的程度。使用的任选参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的Needle的输出用作同一性百分比，其如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度–比对中的缺口总数)。
术语“变体”意指包含一个或多个(数个)位置处的改变(即取代、插入和/或缺失)的、具有凝乳酶活性的肽。取代意指用不同的氨基酸替换占据某个位置的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指在占据某个位置的氨基酸附近添加1-3个氨基酸。
氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸，例如用特别是例如D-丙氨酸的D-异构体(或D型)进行取代在理论上是可能的。
术语“野生型”肽是指如天然存在那样的核苷酸序列或肽序列，即未经历人类行为所造成的靶向突变的核苷酸序列或肽序列。
附图说明
图1：
骆驼凝乳酶(PDB:4AA9)的3D结构，其中结合的αS1-酪蛋白的模型以蓝色显示。αS1-酪蛋白被放置于在残基23和24之间具有易切断键的凝乳酶底物结合槽(cleft)中。骆驼凝乳酶残基R266、V51、E83、I263、L253、L105、I96和L180以绿色突出显示。
图2：
骆驼凝乳酶(PDB:4AA9)的3D结构，其中结合的αS1-酪蛋白的模型以蓝色显示。αS1-酪蛋白被放置于在残基23和24之间具有易切断键的凝乳酶底物结合槽中。骆驼凝乳酶残基V32、H76、F119、L130、S132、Y190、V221、R242、S273、G289、N292、L295和I297以绿色突出显示。
图3：
骆驼凝乳酶的3D结构(细节，PDB:4AA9)。蛋白质N端的残基Y11、L12和D13以及潜在的Y11相互作用伴侣D290以紫色突出显示。
实施例
实施例1：凝乳酶蛋白质序列和变体序列的比对和编号
使用由EBI(EBI，工具，多序列比对，CLUSTALW”，http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)提供的并且如Larkin MA,Blackshields G,Brown NP,Chenna R,McGettigan PA,McWilliam H,Valentin F,Wallace IM,Wilm A,Lopez R,Thompson JD,Gibson TJ,Higgins DG(2007).生物信息学(Bioinformatics)23(21),2947-2948中所述的ClustalW算法比对凝乳酶蛋白质序列。
用于多序列比对的ClustalW2设定是蛋白质权重矩阵(Protein weight Matrix)＝BLOSUM，缺口开放(GAP open)＝10，缺口延伸(GAP EXTENSION)＝0,05，缺口距离(GAPDISTANCES)＝8，无末端缺口(No End Gap)，迭代(ITERATION)＝无，NUMITER＝1，聚类(CLUSTERING)＝NJ
作为参考序列，使用牛凝乳酶B凝乳酶原前体(Genbank登录号P00794——在本文中公开为SEQ ID NO:1)，其中N端甲硫氨酸具有编号1(MRCL……)并且C端异亮氨酸(在蛋白质序列…LAKAI中)具有编号381。
实施例2：凝乳酶变体的设计
使用不同策略设计了凝乳酶变体。
当提及骆驼凝乳酶时，指的是包含本文中的SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶。
SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶可被看作用于制备其骆驼凝乳酶变体的、具有凝乳酶活性的本文相关的亲本多肽。
当提及牛凝乳酶时，指的是包含本文中的SEQ ID NO:1的多肽的牛凝乳酶。
SEQ ID NO:1的牛凝乳酶可被看作用于制备其牛凝乳酶变体的、具有凝乳酶活性的本文相关的亲本多肽。
基于与牛凝乳酶B相比具有25％或更高同一性的大量公众已知的天冬氨酸蛋白酶序列的比对，设计了骆驼凝乳酶的变体1至269和367至461。
通常在物种之间氨基酸变异水平高的区域中引入变异，而保守区域则不变。基于系统发育、结构和实验信息选择氨基酸取代，以鉴定具有对α酪蛋白裂解显示有益作用的高概率的变化。在每个变体构建体中引入多个变异，确保每个单突变存在于多个变体构建体中，以最小化各种取代之间的相关变异效应。使用实验数据的机器学习和统计分析来确定氨基酸取代对凝血酶变体的测量的凝结性能的相对贡献(参考文献14，15)。
基于对牛凝乳酶(PDB编码：4AA8)和骆驼凝乳酶(PDB编码：4AA9)的详细结构分析来设计变体270至366。基于相应氨基酸侧链的化学性质及其对酪蛋白底物结合或一般酶性质的预期影响来选择变异。在变体270至346中的大多数氨基酸取代是在底物结合槽内部的序列位置上或在与底物结合槽在结构上紧密接近的序列位置上进行的，或在与结合的酪蛋白底物接触的次级结构元件中进行的。此外，在蛋白质表面上的位置处进行变化，所述变化改变这些区域的电荷分布(profile)(参考文献5)，因此预期会对酶性能造成影响。基于牛和骆驼凝乳酶中N端序列的不同结构构象制备变体347至366。在底物结合槽内的与骆驼凝乳酶中的N端相互作用的位置上进行氨基酸取代。
实施例3：凝乳酶变体酶材料的制备
将所有的凝乳酶变体作为合成基因合成，并将其克隆到真菌表达载体，例如pGAMpR-C(在WO02/36752A2中描述)中。
使用本领域技术人员已知的标准分子生物学方案将载体转化到大肠杆菌中，并纯化质粒DNA。
将变体质粒单独地转化到黑曲霉(Aspergillus niger)或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)菌株中，并基本上如WO02/36752A2所述生产蛋白质并使用标准色谱技术纯化蛋白质。
如本领域所知的，本领域技术人员基于其公知常识可以生产和纯化凝乳酶和凝乳酶变体，例如本文描述的牛凝乳酶变体和骆驼凝乳酶变体。
实施例4：凝乳酶比活性的测定
4.1凝乳活性的测定
使用REMCAT方法测定凝乳活性，所述REMCAT方法是由国际乳品联合会开发的标准方法(IDF方法)。
通过由低热低脂奶粉和0.5g/L的氯化钙溶液(pH≈6.5)制备的标准乳基质的可见絮凝所需的时间来确定凝乳活性。将粗制凝乳酶样品的凝固时间与具有已知的凝乳活性并且根据IDF标准110B与样品具有相同的酶组成的参考标准品的凝固时间进行比较。在相同的化学和物理条件下测量样品和参考标准品。使用84mM乙酸缓冲液(pH 5.5)将变体样品调节至约3IMCU/ml。此后，将200μl酶制剂加入到置于水浴中的玻璃试管中的10ml预热奶(32℃)中，所述水浴在恒定搅拌下能够保持32℃±1℃的恒定温度。或者，如上所述将20μL酶制剂加入到1mL预热奶中。
相对于与样品具有相同的酶组成的标准品，根据下式以国际凝乳单位(IMCU)/ml计算粗制凝乳酶的总凝乳活性(强度)：
S标准品：粗制凝乳酶的国际参考标准品的凝乳活性。
T标准品：对于标准品稀释物获得的凝固时间，以秒为单位。
D样品：样品的稀释系数
D标准品：标准品的稀释系数
T样品：稀释的粗制凝乳酶样品从添加酶到絮凝时的凝固时间，以秒为单位。
为了测定多重取代文库1、3、4和6以及变体270至366的凝固活性，使用μIMCU方法代替REMCAT方法。与REMCAT相比，μIMCU测定中凝乳酶变体的絮凝时间通过在UV/VIS读板器中，在800nm，在96孔微量滴定板中的OD测量来确定。在每个板上记录具有已知凝固强度的参考标准品的各种稀释物的标准曲线。通过在84mM乙酸盐缓冲液，0.1％曲拉通X-100，pH5.5，中稀释酶来制备样品。通过将250μL含有4％(w/w)低热低脂奶粉和7.5％(w/w)氯化钙(pH≈6.5)的标准乳基质加入到25μL酶样品中来开始32℃的反应。基于相对于标准曲线的样品絮凝时间确定凝乳酶变体的凝乳活性，单位是国际凝乳单位(IMCU)/ml。
4.2总蛋白质含量的测定
使用来自赛默科技公司的Pierce BCA蛋白测定试剂盒按照供应商的说明测定总蛋白质含量。
4.3凝固比活性的计算
通过将凝固活性(IMCU/ml)除以总蛋白质含量(mg总蛋白质/ml)来确定凝固比活性(IMCU/mg总蛋白质)。
实施例5：αS1-酪蛋白裂解的测定
αS1-酪蛋白水解活性的测定
通过测定在pH 4.6提取的水溶性肽的概况(profile)来表征由凝乳酶介导的乳蛋白质的蛋白水解。在96孔板中制备的无培养物(culture free)奶酪模型用于研究。简言之，将添加葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)和氯化钙的来自丹麦的750μl脱脂乳等分到96深孔板的孔中。将GDL加入乳中10分钟后，将凝乳酶变体加入到板的各个孔中，至最终活性为0.05IMCU/ml。在添加粗制凝乳酶30分钟后，通过用移液管尖端彻底搅拌凝结物来切割形成的凝结物；对每个孔使用新的尖端。随后，在凝乳之前将板另外静置60分钟，然后通过将板在2500g离心10分钟来分离乳清。在凝乳、切割和凝缩期间，将乳保持在30℃。最后，从板中倾析乳清，并且留在板中的凝固乳酪的颗粒在室温储存4天。通过向每个孔中加入500μl的0.5M柠檬酸三钠并在37℃轻轻摇动板24小时来提取肽。然后，通过加入盐酸，达到4.4-4.5的最终pH，来沉淀此时完全溶解的凝固乳酪。使板在离心机中旋转沉淀，然后回收上清液以进一步分析pH 4.5可溶性肽。
使用与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC测定pH 4.5可溶性肽的概况。通过使用与质谱仪(G6540A Q-TOF,美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技股份有限公司(AgilentTechnologies A/S))偶联的液相色谱系统(Agilent 1290 infinity,美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技股份有限公司)进行分析。LC系统中的柱为Ascentis ExpressPeptide ES-C18m，2.7μm，100x 2.1mm(Supelco,美国圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。流动相由洗脱液A(0.1％甲酸水溶液)和洗脱液B(乙腈:0.1％甲酸水溶液，9:1)组成。用2％B平衡柱后，注入10μL的样品体积。通过在15个柱体积上将洗脱液B从2％增加到50％产生的梯度洗脱来分离肽。流速为0.44mL/min。通过连续测量在214nm的UV吸光度来检测肽。通过运行从100m/z到2000m/z的MS扫描，收集质谱。对来自每次扫描的两个最强离子进行MS/MS分析。制备由等体积的所有分析样品组成的混合样品，并对每12个样品分析该样品。使用MSConvert版本3.0.6618将MS数据从Agilent.d格式转换为.mzml文件。使用R 3.1.3进行所有进一步的数据分析。使用R软件包′MSGFplus′版本1.05从MS/MS谱鉴定肽。用于肽鉴定的搜索数据库限于牛乳蛋白：αs1-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳过氧化物酶和乳铁蛋白。丝氨酸磷酸化和甲硫氨酸氧化作为可变修饰被包括在内。根据Smith等人(2006)，使用R软件包′xcms′版本1.42.0对样品组中的样品的峰进行检测和分组。峰检测使用Massifquant法，并且峰的分组基于密度法。将同一性分配到分组的峰，从而产生大约200个鉴定的肽(包括αS1-酪蛋白(1-23))的定量表。
对于αS1-酪蛋白裂解的位置影响和突变影响的统计分析
使用统计机器学习方法和基于PCA的分析来确定存在于多重取代文库1-3、4、5、6和7的变体中的所有单突变对αS1-酪蛋白的氨基酸Phe23和Phe24之间的裂解的影响。
结果
多重取代文库1
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)一致的氨基酸序列。牛凝乳酶和骆驼凝乳酶两者被包括在内作为参考。
使用μIMCU方法测定凝固活性。
表1：骆驼凝乳酶变体1-95在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
在表1中显示具有在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的相关数据的骆驼凝乳酶变体。因为所有酶变体在实验中均以0.05IMCU/mL的标准化浓度被使用，所以减少的αS1-酪蛋白裂解表明，相对于在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白的裂解，相应变体对于Phe105和Met106之间的κ-酪蛋白的裂解的特异性有所增加，而不是一般酶活性降低。反之亦然，增加的αS1-酪蛋白裂解表明，相对于在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白的裂解，相应变体对于Phe105和Met106之间的κ-酪蛋白的裂解的特异性有所降低，而不是一般酶活性增加。
多重取代文库2
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的另一组骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体具有与骆驼凝乳酶一致的氨基酸序列。牛凝乳酶和骆驼凝乳酶二者均被包括在内作为参考。使用REMCAT方法测定凝固活性。
表2：骆驼凝乳酶变体96-143在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
在表2中显示具有在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的相关数据的骆驼凝乳酶变体。因为所有酶变体在实验中均以0.05IMCU/mL的标准化浓度被使用，所以减少的αS1-酪蛋白裂解表明，相对于在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白的裂解，相应变体对于Phe105和Met106之间的κ-酪蛋白的裂解的特异性有所增加，而不是一般酶活性降低。反之亦然，增加的αS1-酪蛋白裂解表明，相对于在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白的裂解，相应变体对于Phe105和Met106之间的κ-酪蛋白的裂解的特异性有所降低，而不是一般酶活性增加。
多重取代文库3
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的第三组骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体均具有与骆驼凝乳酶一致的氨基酸序列。牛凝乳酶和骆驼凝乳酶二者被包括在内作为参考。使用μIMCU方法测定凝固活性。
表3：骆驼凝乳酶变体144-179在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
在表3中显示具有在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的相关数据的骆驼凝乳酶变体。因为所有酶变体在实验中均以0.05IMCU/mL的标准化浓度被使用，所以减少的αS1-酪蛋白裂解表明，相比在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白的裂解，相应变体对于Phe105和Met106之间的κ-酪蛋白的裂解的特异性有所增加，而不是一般酶活性降低。反之亦然，增加的αS1-酪蛋白裂解表明，相比在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白的裂解，相应变体对于Phe105和Met106之间的κ-酪蛋白的裂解的特异性有所降低，而不是一般酶活性增加。
多重取代文库1-3的突变分析
基于文库1-3的蛋白水解数据，针对对于αS1-酪蛋白裂解αS1-酪蛋白裂解的位置影响和突变影响进行统计分析。表4中显示了对于减少的αS1-酪蛋白裂解来说最有益的突变。
表4：基于统计分析，对于减少的αS1-酪蛋白裂解的突变贡献(平均值)和标准偏差(sd)。
突变 平均值 sd
R266V 1.78E-01 5.51E-02
V51L 1.60E-01 2.97E-02
E83S 1.46E-01 4.67E-02
I263L 1.33E-01 2.76E-02
L253I 1.24E-01 3.64E-02
L105E 1.23E-01 3.15E-02
I96L 1.12E-01 3.58E-02
L180I 1.00E-01 5.44E-02
H76Q 8.19E-02 1.81E-02
V309I 7.79E-02 3.92E-02
S226T 7.74E-02 3.48E-02
S273Y 7.48E-02 2.77E-02
E294Q 7.13E-02 3.93E-02
R316L 6.77E-02 4.10E-02
S255Y 5.91E-02 2.50E-02
V203A 5.09E-02 2.13E-02
Y307F 4.99E-02 2.20E-02
Q188E 4.97E-02 2.05E-02
V260T 4.91E-02 2.97E-02
基于所得结果得出这样的结论：表4所示的突变揭示了对于Phe23与Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的抑制作用。由于表4中所示的突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中较少软化奶酪凝块。工业相关的实例包括帕斯塔费拉塔奶酪、切达奶酪和欧陆式奶酪，其具有用于优化的切片和切碎工艺的改善的凝块硬度。
对Phe23和Phe24(R266V、V51L、E83S、I263L、L253I、L105E、I96L、L180I)之间αS1-酪蛋白裂解的抑制作用最强的8个突变的位置远离骆驼凝乳酶的底物结合槽(图1)。因此可以推断这些突变对αS1-酪蛋白裂解的间接影响。
表5中显示了对于增加的αS1-酪蛋白裂解来说最有益的突变。
表5：基于统计分析，对于增加的αS1-酪蛋白裂解的突变贡献(平均值)和标准偏差(sd)。
基于所得结果得出结论，表5中显示的突变导致Phe23和Phe24之间αS1-酪蛋白的更高裂解。由于表5中所示的突变导致较多αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。工业相关的实例包括软质奶酪和白卤奶酪。
对Phe23和Phe24之间增加的αS1-酪蛋白裂解影响最大的5个突变中的4个突变位于骆驼凝乳酶的结合槽中(V221K、F223V、V32L、L295K；图2)，因此可能对奶酪熟成期间的αS1-酪蛋白结合具有直接影响。这些突变中的三个(V221K、F223V、V32L)在各自的位置引入牛凝乳酶(CHY-MAX)的氨基酸，与骆驼凝乳酶(CHY-MAX M；表1-3)相比，其显示出αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加。
多重取代文库4
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的另一组骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)一致的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)被包括在内作为参考。
使用μIMCU方法测定凝固活性。
表6：骆驼凝乳酶变体179-222在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
在表6中显示具有在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的相关数据的骆驼凝乳酶变体。与野生型骆驼凝乳酶相比，所有变体都揭示了降低11％至65％的蛋白水解活性。
多重取代文库4的突变分析
基于文库4变体的蛋白水解数据，针对对于αS1-酪蛋白裂解的位置和突变影响进行统计分析。表7中显示了对于增加的或减少的αS1-酪蛋白裂解来说最有益的突变。
表7：基于统计分析，对于改变的αS1-酪蛋白裂解的突变贡献(平均值)和标准偏差(sd)。正平均值代表αS1-酪蛋白裂解减少。负平均值代表αS1-酪蛋白裂解增加。
基于表7中显示的结果，推断突变K19T、H76Q、I96L、S164G、L166V、L222I和R242E导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。突变Y21S、D59N和S132A导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加。由于这些突变导致较多αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。
多重取代文库5
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的另一组骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)一致的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)被包括在内作为参考。
使用REMCAT方法测定凝固活性。
表8：骆驼凝乳酶变体223-269在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
在表8中显示具有在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的相关数据的骆驼凝乳酶变体。与野生型骆驼凝乳酶相比，47个文库变体中的44个揭示了降低11％至60％的蛋白水解活性。
多重取代文库5的突变分析
基于文库5变体的蛋白水解数据，针对对于αS1-酪蛋白裂解的位置和突变影响进行统计分析。表9中显示了对于增加的或减少的αS1-酪蛋白裂解来说最有益的突变。
表9：基于统计分析，对于改变的αS1-酪蛋白裂解的突变贡献(平均值)和标准偏差(sd)。正平均值代表αS1-酪蛋白裂解减少。负平均值代表αS1-酪蛋白裂解增加。
基于表9所示的结果，推断突变Y11I、Y11V、K19S、H76Q、I96L、S164G、S164N、L166V、L222I、L222V、R242E、I263L和S273Y导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。突变L253V和G251D导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加。由于这些突变导致较多αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。
骆驼凝乳酶的基于结构的变异
利用通过蛋白质结构分析确定的位置上的氨基酸变化制备骆驼凝乳酶(SEQ IDNO:2)的变体(表10)。将突变N100Q和N291Q引入到这些变体和参考骆驼凝乳酶(CamUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的均质蛋白质样品。
使用μIMCU方法测定凝固活性。
表10：骆驼凝乳酶变体270-308在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CamUGly)的裂解％给出。
基于表10中显示的结果，推断突变K19T、H76Q、F119Y、Y190A、R242E、R242Q、S273Y和G289S使αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少超过10％。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。V32L、L130I、S132A、V221K、N292H、L295K和I297A使αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加至少10％。由于这些突变导致较多αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。突变H76Q、S273Y、R242E和V32L、S132A、V221K、L295K分别对减少的和增加的αS1-酪蛋白裂解的相似作用通过多重取代文库1-6的突变分析来确定(表5、7、9)。
表10中的15个变体显示αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少或增加超过10％，其中14个变体在底物结合槽内或在接近于底物结合槽的结构中具有突变(H76Q、F119Y、Y190A、R242E、R242Q、S273Y、G289S、V32L、L130I、S132A、V221K、N292H、L295K、I297A)(图2)，表明这些突变对β-酪蛋白结合的直接影响。
牛凝乳酶的基于结构的变异
利用通过蛋白质结构分析确定的位置上的氨基酸变化制备牛凝乳酶(SEQ ID NO:1)的变体(表11)。将突变N252Q和N291Q引入到这些变体和参考牛凝乳酶(BovUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的均质蛋白质样品。
使用μIMCU方法测定凝固活性。
表11：牛凝乳酶变体326-346在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型牛凝乳酶(BovUGly)的裂解％给出。
如表11所示，突变K71E、V113F和A117使αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少超过10％。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。突变Q83T和E133S使αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加至少10％。由于这些突变导致较多αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。
骆驼凝乳酶N端的变异
利用通过底物结合槽内的N端序列Y11-D13的分子相互作用的蛋白质结构分析而确定的位置上的氨基酸变化制备骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)的变体(表12)。将突变N100Q和N291Q引入这些变体和参考骆驼凝乳酶(CamUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的均质蛋白质样品。
使用μIMCU方法测定凝固活性。
表12：骆驼凝乳酶变体347-366在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CamUGly)的裂解％给出。
对骆驼凝乳酶结构的分析指导N端序列Y11-D13中以及位置D290(Y11的潜在相互作用伴侣)中的变异(图3)。由于酪蛋白底物与N端凝乳酶序列在结合槽内竞争结合，因此预期改变结合槽与基序Y11-D13之间相互作用的氨基酸取代会影响对各种酪蛋白底物的酶活性，并因此影响αS1-酪蛋白的裂解。如表12所示，突变Y11I和Y11V以及Y11R和D290E的组合使αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少超过10％。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。由于Y11R(变体349，表12)和D290E(变体272，表10)单独都不显示对αS1-酪蛋白裂解的显著影响，因此变体351的改变的蛋白水解活性很可能由两种突变的协同作用引起。
突变L12M、D13N、D13S、D13T和D13V使αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加至少10％。由于这些突变导致较多αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。
多重取代文库6
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的另一组骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)一致的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)被包括在内作为参考。
使用μIMCU方法测定凝固活性。
表13：骆驼凝乳酶变体367-416在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
在表13中显示具有在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解的相关数据的骆驼凝乳酶变体。与野生型骆驼凝乳酶相比，50个文库变体中的10个揭示了降低12％至48％的蛋白水解活性。与野生型骆驼凝乳酶相比，另外18个变体揭示了增加11％至48％的蛋白水解活性。
多重取代文库6的突变分析
基于文库6变体的蛋白水解数据，针对对于αS1-酪蛋白裂解的位置和突变影响进行统计分析。表14中显示了对于增加的或减少的αS1-酪蛋白裂解来说最有益的突变。
表14：基于统计分析，对于改变的αS1-酪蛋白裂解的突变贡献(平均值)和标准偏差(sd)。正平均值代表αS1-酪蛋白裂解减少。负平均值代表αS1-酪蛋白裂解增加。
基于表14中显示的结果，推断突变Y11V、R242E、G70D、R67Q和L222I导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。突变N100Q、N291Q、V32L、L130I、V136I、K231N、V248I和M256L导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解增加。由于这些突变导致较高αS1(1-23)的产生，所以它们代表用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较多软化。
多重取代文库7
如上所述产生并分析与野生型相比各自具有多个取代的另一组骆驼凝乳酶变体。除了表中提到的变异之外，所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)一致的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)被包括在内作为参考。
使用REMCAT方法测定凝固活性。
表15：骆驼凝乳酶变体417-461在氨基酸Phe23和Phe24之间对αS1-酪蛋白的裂解(产生N端肽αS1N)、以及凝固比活性(C)、一般蛋白水解活性(P)和C/P值。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的裂解％给出。
表15中显示具有关于在Phe23和Phe24之间的αS1-酪蛋白裂解、以及凝固比活性(C)、一般蛋白水解活性(P)和C/P值的数据的骆驼凝乳酶变体。所有变体均揭示减少33％至82％的αS1-酪蛋白裂解。
多重取代文库7的突变分析
基于文库7变体的蛋白水解数据，针对对于αS1-酪蛋白裂解的位置和突变影响进行统计分析。表16中显示了对于减少的αS1-酪蛋白裂解来说最有益的突变。
表16：基于统计分析，对于改变的αS1-酪蛋白裂解的突变贡献(平均值)和标准偏差(sd)。正平均值代表αS1-酪蛋白裂解减少。
基于表16中显示的结果，推断突变I96L、L166V、R242E、Y11I、L222I、L222V、S164G、L166I、L253I和Y11V导致αS1-酪蛋白在Phe23和Phe24之间的裂解减少。由于这些突变导致较少αS1(1-23)的产生，所以它们代表了用于奶酪制造工艺的凝乳酶变体中的优选突变，所述奶酪制造工艺要求在熟成过程中奶酪凝块的较少软化。
参考文献
1.A.Kumar,S.Grover,J.Sharma,V.K.Batish,Crit.Rev.Biotechnol.2010,30,243-258.
2.M.W.K.B.Qvist,M.Rasmussen,J.F.K.Vogensen,Y.Dairy Sci.2012,92,593-612.
3.K.KastbergF.P.Rattray,Y.J.Agric.Food Chem.2012,60,11421-11432.
4.P.L.H.McSweeney,Int.J.Dairy Technol.2004,57,127-144.
5.J.Langholm Jensen,A.J.-C.Navarro Poulsen,M.K.Harboe,J.B.Simonsen,A.M.Lorentzen,K.J.M.van den Brink,K.B.Qvist,S.Larsen,ActaCryst.2013,D69,901-913.
6.S.Chitpinityol,D.Goode,M.J.C.Crabbe,Food Chem.1998,62,133-139.
7.G.L.Gilliland,E.L.Winborne,J.Nachman,A.Wlodawer,Proteins 1990,8,82-101.
8.D.S.Palmer,A.U.Christensen,J.L.Celik,K.Bruun Qvist,B.Biochemistry 2010,49,2563-2573.
9.J.D.S.Palmer,B.J.Agric.Food Chem.2013,61,7949-7959.
10.I.Schechter,A.Berger,Biochem.Biophys.Res.Commun.1967,425,497-502.
11.L.K.Creamer,N.F.Olsen,J.Food Sci.1982,47:631-636
12.N.Bansal,M.A.Drake,P.Piraino,M.L.Broe,M.Harboe,P.F.Fox,P.L.H.McSweeney,Int.Dairy J.2009,19:510-517.
13.A.C.Moynihan,S.Govindasamy-Lucey,J.J.Jaeggi,M.E.Johnson,J.A.Lucey,P.L.H.McSweeney,J.Dairy Sci.2014,97:85-96.
14.J.Ehren,S.Govindarajan,B.Moron,J.Minshull,C.Khosla,Prot.Eng.Des.Sel.2008,21,699-707.
15.S.Govindarajan,B.Mannervik,J.A.Silverman,K.Wright,D.Regitsky,U.Hegazy,T.J.Purcell,M.Welch,J.Minshull,C.Gustafsson,ACS Synth.Biol.2015,4,221-227.
16.M.Newman,M.Safro,C.Frazao,G.Khan,A.Zdanov,I.J.Tickle,T.L.Blundell,N.Andreeva,J.Mol.Biol.1991,221,1295-1309.
17.E.Gustchina,L.Rumsh,L.Ginodman,P.Majer,N.Andreeva,FEBS Lett.1996,379,60-62.
18.S.Visser,C.J.Slangen,P.J.van Rooijen,Biochem.J.1987,244,553-558.
序列表
<110> 科.汉森有限公司
<120> 具有改善性质的凝乳酶的变体
<130> P5946PC00
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 381
<212> PRT
<213> 牛
<400> 1
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Val Phe Ala Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
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Ala Leu Lys Glu His Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Lys Gln Gln
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Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Tyr Ser Gly Phe Gly Glu Val Ala Ser Val
50 55 60
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<213> 骆驼
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Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly
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Pro Ser Ser Asp Ile Leu Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln
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Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro
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Ser Ala Tyr Thr Ser Gln Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln
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Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg
290 295 300
Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ile
<210> 4
<211> 323
<212> PRT
<213> 骆驼
<400> 4
Gly Lys Val Ala Arg Glu Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val
20 25 30
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys
35 40 45
Ser Asn Val Cys Lys Asn His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser
50 55 60
Thr Phe Arg Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ser Met Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile
85 90 95
Val Asp Pro Asn Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu
100 105 110
Val Phe Thr Tyr Ser Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro
115 120 125
Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp
130 135 140
Arg His Leu Val Ala Arg Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gly Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr
165 170 175
Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln
180 185 190
Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val
195 200 205
Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Ile Leu Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu
225 230 235 240
Asn Arg Tyr Gly Glu Phe Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met
245 250 255
Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro
260 265 270
Ser Ala Tyr Thr Ser Lys Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln
275 280 285
Gly Asp Asn Asn Ser Glu Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg
290 295 300
Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ile

Claims (17)

1.一种分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率低于由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的αS1-酪蛋白裂解频率的80％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
2.根据权利要求1所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中亲本多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少例如80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L221I、S226T、T239S、R242E、G251D、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L和/或V317L。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含以下取代的组合中的一个或多个，并且其中每个取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：
Y21S+H76Q+Y307F+V317L、
R61S+L166V+T239S、
V32L+E294Q+R316L+V317L、
S226T+G244D+I263L+G289S、
V203A+V248I+G251W+L253I+Y268F、
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S、
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E、
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T、
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A、
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I、
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D、
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D、
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I、
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D、
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W、
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T、
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y、
H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I、
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I、
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I、
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y、
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I、
K19T+D59N+H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y、
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y、
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y、
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D、
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y、
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I、
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y、
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y、
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L、
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L、
K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I、
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V、
I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L、
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I、
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L、
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D、
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y、
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V、
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V、
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L、
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I、
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D、
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D、
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D、
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I、
H76Q+N100Q+N291Q、
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q、
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L、
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I、
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E、
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I、
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E、
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D、
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I、
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D或
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D。
5.一种分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的C/P值至少是由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶的C/P值的200％；和
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体裂解αS1-酪蛋白的频率超过由SEQ ID NO:2的成熟多肽表征的分离的骆驼凝乳酶多肽的αS1-酪蛋白裂解频率的115％，其中通过定量通过将脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶一起孵育而获得的αS1-酪蛋白肽来确定αS1-酪蛋白裂解，其中通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行定量。
6.根据权利要求5所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中亲本多肽与SEQ IDNO:2的成熟多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少例如80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
7.根据权利要求5或6所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291QN292H、L295K和/或K321P。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含以下取代的组合中的一个或多个，并且其中每个取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：
G70D+S74F+D158S+R254S+S277N、
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q、
Y21S+R61S+H146R、
R61S+G163E+M256L+S277N、
D59N+S271P+T284S、
V248I+S226T+E294Q、
S74F+G244D+S271P、
V221K+V248I+S255Y、
V183I+G251W+M256L、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
D98V+G251D+M256L+V259I、
V183I+V248I+G244D+T284S、
N50K+R61S+Y127F+G244D+G251D、
I96L+F223V+G244D+R254S+M256L、
H146R+D158S+S273Y、
S74F+V259I+Y268F、
G70N+D98V+V136I、
I96L+M142I+R145Q+H146R、
V32L+G163E+T186S+Q188E+L295K、
R61Q+V136I+Y268F+T284S+Y307F、
S132A+Q188E+F223V、
I200V+G251D+G289S、
N50K+D158S+V203A+E294Q、
F223V+G251W+S273Y+D279E、
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S、
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L、
D59N+L222I+G251W+S154A+V203A、
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T、
D59N+L222I+G251D+V198I+V203A+K321P、
D59N+L222I+G251D+S273Y+T284S+D267Q
V32L+N100Q+N291Q、
N292H+N100Q+N291Q、
V221K+N100Q+N291Q、
I297A+N100Q+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N、
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H、
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H、
L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q、
V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q、
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q、
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L、
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q、
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q和/或
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231。
9.一种制备根据权利要求1至4中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在至少一个氨基酸位置处的取代、缺失或插入；
(b)：生产和分离步骤(a)的所改变的多肽。
10.根据权利要求9所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中：
(a)所述变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：Y11I、Y11V、L12M、K19T、V51L、R61S、H76Q、E83S、I96L、L105E、D144Q、Q162S、S164G、M165E、L166V、L180I、V203A、L222I、S226T、R242E、G251W、L253I、V260T、I263L、R266V、S273Y、T239S、G251D、Q288E、G289S、E294Q、Y307F、V309I、R316L、V317L。
11.一种制备根据权利要求5至8中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在至少一个氨基酸位置处的取代、缺失或插入；
(b)：生产和分离步骤(a)的所改变的多肽。
12.根据权利要求11所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述变体包含一个或多个以下取代，其中所述取代相对于SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸序列被指定：V32L、I45V、N50K、G70D、G70N、D98V、N100Q、V136I、M142I、H146R、S154A、V155F、M157L、D158S、V198I、I200V、F223V、K231N、G244D、V248I、R254S、M256L、V259I、E262T、D267Q、D279E、T284S、N291Q N292H、L295K、K321P。
13.一种制备食品或饲料产品的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1至8中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体加入到食物或饲料成分中并执行本发明的进一步制造步骤以获得所述食品或饲料产品。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述食品或饲料产品是乳基产品。
15.一种食品或饲料产品，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的凝乳酶多肽变体。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的凝乳酶多肽变体在制备奶酪的工艺中的用途。
17.根据权利要求16所述的凝乳酶多肽变体在制备帕斯塔费拉塔奶酪、切达奶酪、欧陆式奶酪、软质奶酪或白卤奶酪的工艺中的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109688825A (zh) * 2016-05-19 2019-04-26 科·汉森有限公司 具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2855674B2 (en) 2012-05-25 2022-11-02 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
EP3110948A1 (en) 2014-02-26 2017-01-04 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
US11174473B2 (en) 2015-06-22 2021-11-16 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved properties
CA2995755A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved properties
EA201892531A1 (ru) * 2016-05-19 2019-06-28 Кхр. Хансен А/С Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами
WO2023194285A2 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Chr. Hansen A/S Aspartic protease, methods and uses thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002036752A2 (en) * 2000-11-06 2002-05-10 Chr. Hansen A/S Method of producing non-bovine chymosin and use thereof
WO2013164481A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Dsm Ip Assets B.V. Improved enzyme variants
WO2013174840A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
CN103484488A (zh) * 2013-09-16 2014-01-01 中国农业科学院生物技术研究所 优化的牛凝乳酶原基因及其分泌表达方法和应用
WO2015128417A1 (en) * 2014-02-26 2015-09-03 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
CN107849550A (zh) * 2015-06-22 2018-03-27 科.汉森有限公司 具有改善的性质的凝乳酶变体

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0123928A3 (en) 1983-03-31 1986-02-05 Codon Genetic Engineering Laboratories Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity
US7390936B1 (en) 1999-08-23 2008-06-24 Sembiosys Genetics Inc. Commercial production of chymosin in plants
RU2192137C2 (ru) 2000-08-07 2002-11-10 Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" Способ производства сыра
CN104630192A (zh) 2002-10-02 2015-05-20 催化剂生物科学有限公司 制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
RU2005140664A (ru) 2003-06-27 2007-08-27 Байорен, Инк. (Us) Просматривающий мутагенез
EP1745068A4 (en) 2004-03-30 2009-11-04 Sudershan Biotech Ltd RECOMBINANT CALM CHYMOSIN AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
EP2117331A1 (en) 2007-02-13 2009-11-18 Chr. Hansen A/S Coagulation of milk
JP2010046034A (ja) 2008-08-22 2010-03-04 Toyota Central R&D Labs Inc 変異体のスクリーニング方法
US8609389B2 (en) 2009-03-24 2013-12-17 Meito Sangyo Co., Ltd. Milk-clotting protease derived from a microorganism
WO2016128476A1 (en) 2015-02-10 2016-08-18 Chr. Hansen A/S Blends of chymosins with improved milk-clotting properties
CA2995755A1 (en) 2015-08-31 2017-03-09 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved properties

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002036752A2 (en) * 2000-11-06 2002-05-10 Chr. Hansen A/S Method of producing non-bovine chymosin and use thereof
WO2013164481A1 (en) * 2012-05-03 2013-11-07 Dsm Ip Assets B.V. Improved enzyme variants
US20150118356A1 (en) * 2012-05-03 2015-04-30 Dsm Ip Assets B.V. Chymosine enzyme variants
WO2013174840A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
CN104487572A (zh) * 2012-05-25 2015-04-01 科.汉森有限公司 具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体
CN103484488A (zh) * 2013-09-16 2014-01-01 中国农业科学院生物技术研究所 优化的牛凝乳酶原基因及其分泌表达方法和应用
WO2015128417A1 (en) * 2014-02-26 2015-09-03 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
CN107849550A (zh) * 2015-06-22 2018-03-27 科.汉森有限公司 具有改善的性质的凝乳酶变体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEFAN R. KAPPELER等: "Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
杨宝进等: "凝乳酶蛋白质工程的研究", 《中国乳品工业》 *
杨艺等: "骆驼凝乳酶凝乳特性的研究进展", 《中国乳业》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109688825A (zh) * 2016-05-19 2019-04-26 科·汉森有限公司 具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体

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RU2018109375A (ru) 2019-10-03

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