EA040259B1 - Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами - Google Patents

Description

Настоящее изобретение относится к вариантам химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами.

Предшествующий уровень техники

Химозин (ЕС 3.4.23.4) и пепсин (ЕС 3.4.23.1), молокосвертывающие ферменты желудка млекопитающих, представляют собой аспарагиновые протеазы, принадлежащие к большому классу пептидаз.

При продуцировании в клетках слизистой желудка химозин и пепсин образуются в виде ферментативно неактивного предшественника прохимозина и предшественника пепсиногена соответственно. При выведении химозина, N-концевой пептидный фрагмент, пре-фрагмент (сигнальный пептид) отщепляется с получением прохимозина, включающего про-фрагмент. Прохимозин является, по существу, неактивной формой фермента, который, однако, активируется в кислых условиях в активный химозин посредством автокаталитического удаления про-фрагмента. Эта активация происходит in vivo в просвете желудка при подходящем рН или in vitro в кислых условиях.

Подробно изучены структурные и функциональные характеристики бычьего, т.е. Bos taurus, препрохимозина, прохимозина и химозина. Предварительная часть молекулы пре-прохимозина быка содержит 16 ак (аминокислотных) остатков и про-часть соответствующего прохимозина имеет длину 42 ак остатков. Активный бычий химозин содержит 323 ак.

Химозин продуцируется естественным образом в таких видах млекопитающих, как крупный рогатый скот, верблюды, козы, буйволы, овцы, свиньи, люди, обезьяны и крысы.

Бычий и верблюжий химозин в течение ряда лет были доступны в продаже для молочной промышленности.

Ферментативная коагуляция молока посредством молокосвертывающих ферментов, таких как химозин и пепсин, является одним из наиболее важных процессов в производстве сыров. Ферментативная коагуляция молока представляет собой двухфазный процесс: первая фаза, где протеолитический фермент, химозин или пепсин, воздействует на к-казеин, что приводит к метастабильному состоянию структуры мицеллы казеина, и вторая фаза, где молоко затем свертывается и образует коагулят (ссылка 1).

в WO02/36752A2 (Chr. Hansen) описано рекомбинантное получение верблюжьего химозина.

в WO2013/174840A1 (Chr. Hansen) описаны мутанты/варианты бычьего и верблюжьего химозина.

в WO2013/164479A2 (DSM) описаны мутанты бычьего химозина.

Ссылки, перечисленные непосредственно ниже, могут в настоящем контексте рассматриваться, как ссылки, описывающие мутанты химозина:

Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;

Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;

van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;

Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Trichoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;

M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;

Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;

Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin В which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;

Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.

Ни одна из указанных выше ссылок на предшествующий уровень техники не описывает прямо и однозначно ни один из вариантов химозина с улучшенной специфической свертывающей активностью и повышенным значением С/Р по сравнению с родительским веществом, из которого этот вариант получен, как описано ниже.

Краткое изложение сущности изобретения

Задача, решаемая настоящим изобретением, состоит в том, чтобы предложить варианты химозина, которые, по сравнению с родительским полипептидом, имеют специфическую свертывающую активность (IMCU Международная молокосвертывающая единица/мг общего белка), которая составляет по меньшей мере 110% специфической свертывающей активности родительского полипептида и/или по меньшей мере 200% соотношения С/Р его родительского полипептида, как показано здесь.

Основываясь на интеллектуальном проектировании и сравнительном анализе различных вариантов авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд положений аминокислот, которые имеют важное значение, поскольку благодаря изменению в одном или более положениях в родительском полипептиде можно получить улучшенный вариант химозина либо с повышенной удельной свертывающей активно- 1 040259 стью, либо с увеличенными соотношениями С/Р, либо с увеличением обоих свойств.

Нумерация аминокислот, используемая здесь для определения варианта, основана на зрелом пептиде. Как известно в данной области, различные полипептидные последовательности натурального химозина дикого типа, полученные из разных видов млекопитающих (такие как, например, коров, верблюдов, овец, свиней или крыс), имеют относительно высокое сходство/идентичность последовательности. На фиг. 1 это представлено выравниванием соответственных различных последовательностей химозина.

В связи с этим относительно близким соответствием последовательностей считается, что трехмерные структуры различных природных химозинов дикого типа также относительно схожи.

В данном контексте - природный химозин дикого типа (такой как бычий или верблюжий химозин) здесь может быть примером родительского полипептида, т.е. родительского полипептида, для которого производится модификация с целью получения варианта по настоящему изобретению.

Не ограничиваясь теорией, считается, что обсуждаемые положения аминокислот химозина имеют существенное значение для любого рассматриваемого здесь, представляющего интерес фермента химозин (например, химозинов коров, верблюдов, овец, свиней, крыс и т.д.), в том смысле, что сделав изменение в одном или более этих положений можно получить улучшенный вариант химозина в целом (например, улучшенный вариант бычьего, верблюжьего, овечьего, свиного или крысиного химозина).

Как рассматривается в настоящем документе, в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты представляющего интерес полипептида родительского химозина (например, верблюда, овцы, быка и т.д.) здесь используют последовательность SEQ ID NO: 2 зрелого химозина общеизвестного Camelius dromedarius. В качестве альтернативы он может быть назван здесь верблюжьим химозином. Последовательность также показана на фиг. 1.

В настоящем контексте считается, что родительский полипептид химозина (например, овец или крыс), который имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), может рассматриваться здесь, как достаточно структурно связанный, например, с бычьим или верблюжьим химозином для того, чтобы быть улучшенным посредством изменения любого положения аминокислоты, как описано здесь.

Воплощения настоящего изобретения описаны ниже.

Определения

Все определения настоящих соответствующих терминов соответствуют тому, что будет понятно специалисту в данной области применительно к соответствующему техническому контексту.

Термин химозин относится к ферменту класса ЕС 3.4.23.4. Химозин обладает высокой специфичностью и преимущественно створаживает молоко посредством расщепления одной связи 104-Ser-Phe-|Met-Ala-107 в κ-цепи казеина. В качестве побочной активности химозин также расщепляет α-казеин в основном между Phe23 и Phe24 и β-казеин в основном между Leu192 и Tyr193 (ссылки 2, 3). Полученные пептиды aS1(l-23) и β(193-209) будут дополнительно расщеплены протеазами из микробных культур, добавленных к созревающему сыру (ссылка 4). Альтернативным названием химозина, используемым в данной области техники, является реннин.

Термин химозиновая активность относится к химозиновой активности фермента химозина, как понятно специалисту в настоящем контексте.

Специалист в данной области знает, как определить соответствующую химозиновую активность.

Как известно в данной области техники, соответствующее так называемое соотношение С/Р определяют путем деления удельной свертывающей активности (С) на протеолитическую активность (Р).

Как известно в данной области техники, более высокое отношение С/Р подразумевает, как правило, что потеря белка во время, например, производства сыра из-за неспецифической деградации белка снижается, что может привести к улучшению выхода сыра.

Термин выделенный вариант означает вариант, который модифицирован действиями человека. В одном аспекте вариант является по меньшей мере на 1% чистым, например, по меньшей мере на 5% чистым, по меньшей мере на 10% чистым, по меньшей мере на 20% чистым, по меньшей мере на 40% чистым, по меньшей мере на 60% чистым, по меньшей мере на 80% чистым и по меньшей мере на 90% чистым, как определено посредством SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).

Термин зрелый полипептид означает пептид в его окончательной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, С-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и т.д. В данном контексте может быть обозначен соответствующий зрелый полипептид химозин, как активная последовательность полипептида химозина, т.е. без пре-части и/или про-части. Соответствующие здесь примеры зрелого полипептида представляют собой, например, зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который расположен от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 последовательности SEQ ID NO: 1 или зрелый полипептид SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который расположен от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 последовательности SEQ ID NO: 2.

Термин родительский или родительский полипептид, имеющий химозиновую активность озна- 2 040259 чает полипептид, в котором осуществлена модификация с получением вариантов фермента по настоящему изобретению. Родительским может быть природный (дикого типа) полипептид или его вариант.

Термин идентичность последовательности относится к сходству двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеотидных последовательностей.

Для целей настоящего изобретения, степень идентичности у двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Возможными используемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа - 10, штраф за продление гэпа - 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версия BLOSUM62). Результат Needle, отмеченный как наиболее длинная идентичность (полученный с использованием опции nobrief) используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом.

(Идентичные остатких100)/(Длина выравнивания - общее количество гэпов при выравнивании)

Для целей настоящего изобретения, степень идентичности у двух дезоксирибонуклеотидных последовательностей определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Возможными используемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа - 10, штраф за продление гэпа - 0,5 и матрица замен EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4). Результат Needle, отмеченный как наиболее длинная идентичность (полученный с использованием опции -nobrief) используют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом.

(Идентичные дезоксирибонуклеотидых100)/(Длина выравнивания - общее количество разрывов при выравнивании).

Термин вариант означает пептид, обладающий химозиновой активностью и содержащий модификацию, т.е. замену, вставку и/или удаление в одном или более (нескольких) положениях. Замена означает замену аминокислоты, занимающей некоторое положение, другой аминокислотой; удаление означает удаление аминокислоты, занимающей положение; и вставка означает добавление 1-3 аминокислот, примыкающих к аминокислоте, занимающей положение.

Аминокислота может быть природной или не природной аминокислотой, например замена, например, в частном случае D-изомерами (или D-формами), например, D-аланином может быть теоретически возможной.

Термин пептид дикого типа относится к нуклеотидной последовательности или пептидной последовательности, которая встречается в природе, т.е. нуклеотидной последовательности или пептидной последовательности, которые не были подвергнуты целевым мутациям с помощью человека.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - выравнивание соответствующих различных последовательностей химозина.

Как понятно специалисту в настоящем контексте, приведенные здесь соответствующие проценты идентичности последовательности зрелого полипептида химозина, например, овцы, двугорбого верблюда, верблюда, свиньи или крысы со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычьим химозином, т.е. аминокислотной последовательностью от положения 59 до 381 SEQ ID NO: 3) относительно сходны с вышеупомянутыми процентами идентичности последовательностей.

Фиг. 2 - 3D-струkтура верблюжьего химозина (подробно, PDB: 4AA9) с моделью связанного кказеина, показанного зеленым цветом в виде палочковидной структуры, κ-казеин размещен в субстратсвязывающей щели химозина с расщепляемой связью между остатками 105 и 106. Мутации R242E, Y243E, N249D, G251D, N252D, R254E, S273D, Q280E, F282E выделены синим цветом.

Фиг. 3 - 3D-структура бычьего химозина (PDB: 4AA8) с моделью связанного κ-казеина, показанного зеленым цветом в виде палочковидной структуры, κ-казеин размещен в субстратсвязывающей щели химозина с расщепляемой связью между остатками 105 и 106. Положения Н292 и Q294 выделены желтым цветом.

Фиг. 4 - 3D-структура верблюжьего химозина (подробно, PDB: 4AA9). Остатки Y11, L12 и D13 Nконца белка, а также потенциальное взаимодействие Y11 с партнером D290 выделены пурпурным цветом в виде палочковидной структуры.

Подробное описание изобретения

Определение положения аминокислоты интересующего химозина.

Как обсуждалось выше, в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты соответствующего интересующего полипептида химозина (например, верблюдов, овец, быков и т.д.) здесь используют общеизвестную последовательность верблюжьего химозина, раскрытую как SEQ ID NO: 2.

Аминокислотную последовательность другого полипептида химозина выравнивают с полипептидом, раскрытым в SEQ ID NO: 2, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующей любому аминокислотному остатку в полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 2 определяют,

- 3 040259 используя алгоритм ClustalW, как описано в рабочем примере 1 в данном описании изобретения.

Основываясь на вышеуказанных хорошо известных компьютерных программах, квалифицированный специалист легко может определить аминокислотное положение в релевантном здесь интересующем полипептиде химозина (например, верблюдов, овец, быков и т.д.).

На фиг. 1 показан пример выравнивания.

Как пример: на фиг. 1 можно видеть, что здесь используемый бычий эталон SEQ ID NO: 3 имеет G в положении 50 и Camelus_dromedarius (SEQ ID NO: 2 здесь) имеет А в этом положении 50.

Обозначение вариантов.

При описании вариантов настоящего изобретения, обозначения, описанные ниже, предназначены для облегчения сравнения. Используют принятые IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии) однобуквенные или трехбуквенные сокращения аминокислот.

Конкретные варианты, обсуждаемые в этом разделе обозначений ниже, могут не соответствовать релевантным вариантам настоящего изобретения, т.е. этот раздел обозначений предназначен только для описания настоящего соответствующего обозначения как такового.

Замены. Для аминокислотной замены используют следующее обозначение: исходная аминокислота, положение, замещенная аминокислота. Соответственно теоретическое замещение треонина аланином в положении 226 обозначают как Thr226Ala или Т226А. Множественные мутации разделяют добавлением меток (+), например Gly205Arg+Ser411Phe или G205R+S411F, представляющими замены в положениях 205 и 411 глицина (G) аргинином (R) и серина (S) фенилаланином (F) соответственно. Замена, например обозначенная 226А, относится к замещению родительской аминокислоты (например, Т, Q, S или другой родительской аминокислоты) аланином в положении 226.

Удаления. Для удаления аминокислоты используют следующее обозначение: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно удаление глицина в положении 195 обозначают как Gly195* или G195*. Множественные удаления разделяют добавлением меток (+), например Gly195*+Ser411* или G195*+S411*.

Вставки. Для аминокислотной вставки используют следующее обозначение: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно вставку лизина после глицина в положении 195 обозначают Gly195GlyLys или G195GK. Вставка нескольких аминокислот обозначают [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота #1, вставленная аминокислота #2; и т.д.]. Например, вставка лизина и аланина после глицина в положении 195 указывают как Gly195GlyLysAla или G195GKA.

В таких случаях вставленный(е) аминокислотный(е) остаток(и) нумеруют путем добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному(ым) аминокислотному(ым) остатку(ам). В приведенном выше примере последовательность будет выглядеть так:

Родительский:	Вариант:
195	195 195а 195b
G	G - К - А

Множественные модификации. Варианты, содержащие множественные модификации, разделяют путем добавления меток (+), например, Arg170Tyr+Gly195Glu или R170Y+G195E представляют замену тирозина и глутаминовой кислоты аргинином и глицином в положениях 170 и 195 соответственно.

Разные замены. Если в одно положение могут быть введены разные замены, то эти разные замены разделяют запятой, например Arg170Tyr,Glu или R170Y,E представляет замещение аргинина тирозином или глутаминовой кислотой в положении 170. Таким образом, Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala или Y167G,A+R170G,A обозначает следующие варианты:

Tyr167Gly+Arg170Gly, Tyr167Gly+Arg170Ala, Tyr167Ala+Arg170Gly, и Tyr167Ala+Arg170Ala.

Предпочтительный родительский полипептид, имеющий химозиновую активностью.

Предпочтительно родительский полипептид имеет по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычий химозин) и/или SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).

В качестве примера в данном документе подходящий соответствующий родительский полипептид может, например, быть бычьим химозином А, как известно в данной области техники бычий химозин А может иметь только одно аминокислотное различие по сравнению с бычьим химозином В SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном воплощении родительский полипептид имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычий химозин), более предпочтительно родительский полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычий химозин) и еще более предпочтительно родительский полипептид имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычий химозин). Может быть предпочтительным, чтобы родительский полипептид был зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычий химозин).

- 4 040259

Как понятно специалисту в данном контексте соответствующий родительский полипептид, имеющий химозиновую активность, может быть, например, вариантом, например, соответствующего химозина дикого типа.

Например, вариант бычьего химозина, например с 5-10 модификациями (например, заменами) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 бычьего химозина дикого типа может все еще быть родительским полипептидом, который имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 (бычий химозин).

Как понятно специалисту в данном контексте, родительский полипептид может быть полипептидом, который имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюд). В предпочтительном воплощении родительский полипептид имеет по меньшей мере 92% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3, более предпочтительно родительский полипептид имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3 и еще более предпочтительно родительский полипептид имеет по меньшей мере 97% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. Может быть предпочтительным, чтобы родительский полипептид был зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).

Другими словами, в целом, соответствующий здесь выделенный вариант полипептида химозина может содержать модификации (например, замены) в других положениях, чем заявленные здесь положения.

Например, вариант бычьего химозина, например с 5-10 модификациями (например, заменами) по сравнению с полипептидом верблюжьего химозина дикого типа, имеющим SEQ ID NO: 2 может все еще быть родительским полипептидом, который имеет по меньшей мере 95% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2.

Может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 30 аминокислотных модификаций (например, замен) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 20 аминокислотных модификаций (например, замен) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 10 аминокислотных модификаций (например, замен) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 5 аминокислотных модификаций (например, замен) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).

Способ получения выделенных вариантов полипептида химозина.

Как обсуждалось выше, как известно в данной области техники, специалист может на основании общих знаний, обычным способом получать и очищать химозин и варианты химозина.

Другими словами, при наличии у специалиста релевантного здесь родительского полипептида, имеющего интересующую химозиновую активность (например, быков, верблюдов, овец, свиней или крыс) и раскрытого в данном описании изобретения руководства, получение варианта такого родительского интересующего химозина является рутинной работой для специалиста.

Примером подходящего способа получения и выделения химозина (варианта или родительского) может являться, например, хорошо известная технология на основе грибковой рекомбинантной экспрессии/производства, как, например, описано в WO02/36752A2 (Chr. Hansen).

Также для специалиста в данной области рутинной работой является модификация одного или более положений родительского полипептида, имеющего химозиновую активность, где модификация включает замену, удаление или вставку по меньшей мере в одном аминокислотном положении, как описано в данном описании.

Как известно специалисту в данной области, это может быть получено, например, посредством так называемого сайт-направленного мутагенеза и технологии на основе рекомбинантной экспрессии/продуцирования.

Для квалифицированного специалиста также является рутинной работой определение наличия или отсутствия химозиновой активности у релевантного здесь родительского полипептида (например, верблюжьего или бычьего химозина дикого типа) и/или у релевантного здесь варианта химозина.

Как известно в данной области, специфичность химозина может быть определена по так называемому соотношению С/Р, которое определяют путем деления удельной свертывающей активности (С) на протеолитическую активность (Р). Как известно в данной области техники, более высокое соотношение С/Р подразумевает, как правило, что потеря белка во время, например, производства сыра из-за снижения неспецифического разрушения белка понижена, т.е. выход сыра улучшен.

Определение молокосвертывающей активности молока.

Молокосвертывающая активность может быть определена с использованием метода REMCAT, который является стандартным методом, разработанным Международной федерацией молочных продуктов (метод IDF).

Молокосвертывающую активность определяют исходя из времени, необходимого для видимой

- 5 040259 флокуляции стандартного молочного субстрата, полученного из сухого обезжиренного молока низкотемпературного сгущения и распылительной сушки с 0,5 г на литр раствора хлорида кальция (рН-6,5). Время свертывания образца сычужного фермента сравнивают со временем свертывания эталонного стандарта, имеющего известную молокосвертывающую активность и имеющего такой же ферментный состав по IDF Standard 110В, в качестве образца. Образцы и эталонные стандарты измеряют в одинаковых химических и физических условиях. Образцы вариантов доводят до концентрации примерно 3 IMCU (Международная молокосвертывающая единица)/мл, используя 84 мМ уксуснокислый буфер, рН 5,5. Затем 20 мкл ферментного препарата добавляют к 1 мл предварительно нагретого молока (32°С) в стеклянной пробирке, помещенной на водяную баню, способной поддерживать постоянную температуру 32±1°С при постоянном помешивании.

Общую молокосвертывающую активность (эффективность) сычужного фермента рассчитывают в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на мл относительно стандарта, имеющего такой же ферментный состав, что и образец, в соответствии с формулой:

Sstandart х Tstundurt х Dsumple

Активность В IMCU/мл = ----------:----------:-----Dstundurt х Tsumple

Sstandard: молокосвертывающая активность молока международного эталона для сычужного фермента.

Tstandard: время свертывания в секундах, полученное для стандартного разбавления.

Dsample: коэффициент разбавления для образца.

Dstandard: коэффициент разбавления для стандарта.

Tsample: время свертывания в секундах, полученное для разбавленного образца сычужного ферментного, от момента добавления фермента до времени флокуляции.

Для определения молокосвертывающей активности может быть использован метод μIMCU вместо метода REMCAT. По сравнению с REMCAT, время флокуляции для вариантов химозина в анализе μIMCU определяют путем измерения OD (оптической плотности) в 96-луночных планшетах для микротитрования при 800 нм в УФ/VIS(видимая область спектра) планшет-ридере. Стандартную кривую для различных разведений эталонного стандарта с известной эффективностью свертывания регистрируют для каждого планшета. Образцы получают путем разбавления фермента в 84 мМ ацетатном буфере, 0,1% тритона Х-100, рН 5,5. Реакцию при 32°С начинают путем добавления 250 мкл стандартного молочного субстрата, содержащего 4% (мас./мас.) сухого обезжиренного молока низкотемпературного сгущения и распылительной сушки и 7,5% (мас./мас.) хлорида кальция (рН®6,5), к 25 мкл образца фермента. Затем определяют молокосвертывающую активность вариантов химозина в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на мл на основании времени флокуляции относительно стандартной кривой.

Определение общего содержания белка.

Предпочтительно, общее содержание белка может быть определено с использованием набора Pierce BCA Protein Assay Kit от Thermo Scientific в соответствии с инструкциями поставщиков.

Расчет удельной свертывающей активности.

Удельную активность свертывания (IMCU/мг общего белка) определяли путем деления свертывающей активности (IMCU/мл) на общее содержание белка (мг общего белка на мл).

Определение протеолитической активности.

Предпочтительно, общая протеолитическая активность может быть измерена с использованием флуоресцентно меченного Bodipy-FL казеина в качестве субстрата (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Производные казеина, интенсивно меченные не чувствительным к рН зеленым флуоресцентным Bodipy-FL, вызывают гашение флуоресценции конъюгата. Катализируемый протеазой гидролиз высвобождает флуоресцентный Bodipy-FL. Этот способ является очень чувствительным, что является необходимым для этого эксперимента, поскольку эталон имеет самую низкую общую протеолитическую активность из всех известных коагулянтов. Раствор субстрата 0,04 мг/мл готовят в 0,2 М фосфатном буфере, рН 6,5, содержащем 100 мМ NaCl, 5% глицерина и 0,1% Бридж. Варианты химозина растворяют в 20 мМ малонатном буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 5% глицерина и 0,1% Бридж. По 20 мкл раствора эталона и варианта химозина смешивают в черном 384-луночном плоскодонном полистироловом планшете Corning и непрерывно определяют флуоресценцию в флуориметре при 32С в течение 10 ч. Наклоны линейной части кривой изменения флуоресценции используют для определения общей протеолитической активности.

Определение отношения С/Р.

Отношение С/Р рассчитывают путем деления свертывающей активности (С) на протеолитическую активность (Р).

Статистический анализ эффектов положения и мутации на удельную свертывающую активность и отношение С/Р.

Предпочтительно может быть использован статистический подход с машинным обучением анализа и РСА-анализ для определения влияния одиночных мутаций, присутствующих в вариантах с несколькими заменами, например на удельную молокосвертывающую активность, а также на соотношение свёрты

- 6 040259 вающей и общей протеолитической активности (С/Р).

Предпочтительные воплощения изобретения.

Как указано выше и проиллюстрировано в приведенных ниже примерах, авторы настоящего изобретения сделали ряд предпочтительных вариантов полипептида химозина с улучшенной свертывающей активностью и/или отношением С/Р по сравнению с соответствующим родительским полипептидом в сопоставимых условиях.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к выделенному варианту полипептида химозина, отличающемуся тем, что:

(а) выделенный вариант полипептида химозина имеет удельную молокосвертывающую активность (IMCU/мг общего белка), которая составляет по меньшей мере 110% удельной молокосвертывающей активности его родительского полипептида и/или (б) выделенный вариант полипептида химозина имеет соотношение С/Р, которое составляет по меньшей мере 200% соотношения С/Р его родительского полипептида.

Родительский полипептид может иметь по меньшей мере 80%, такой как по меньшей мере, например, 80, 85, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичность последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).

Предпочтительный выделенный вариант полипептида химозина может иметь удельную молокосвертывающую активность (IMCU/мг общего белка), составляющую по меньшей мере 110% удельной молокосвертывающей активности родительского пептида и содержит замену в одном или более (нескольких) из следующих положений, указанных в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

R242, L222, D59, S273,

К19, V309, S132, N249, 196, L166, Н76, G251, Q280, Q56, М157, К231, М256, N291, более конкретно, заменой могут быть R242E, L222I, D59N, S273Y, К19Т, V309I, S132A, N249D,

I96L, N249E, L166V, H76Q, N249D, G251D, Q280E, Q56H, M157L, K231N, M256L, N291Q.

Возможно, выделенный вариант полипептида химозина может дополнительно содержать замены, которые изменяют картину гликозилирования, такие как, например, замены в одном или более положениях N100, N252 и/или N291, более конкретно N100Q, N252Q и/или N291Q.

Предпочтительный вариант может содержать одну или более из следующих комбинаций замен, где каждое замещение определено в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

- 7 040259

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I:

Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;

Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, LI66V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S132A, S164G, LI66V, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;

H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, S164G, L166V, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273;

K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

N249D, N100Q, N291Q;

R242E, N100Q, N291Q;

R242E, G251D, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, N252D, N100Q, N291Q;

R242E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

N252D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

G251D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

Y243E, Q280E, N100Q, N291Q;

Q56H, N252Q, N291Q;

R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

R67Q, I96L, LI301, M157L, K231N, R242E;

R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;

R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N;

R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q или

R67Q, L130I, M157L, R242E, M256L, N292H.

- 8 040259

В соответствующем воплощении предпочтительный выделенный вариант полипептида химозина по настоящему изобретению имеет соотношение С/Р, составляющее по меньшей мере 200% соотношения

С/Р его родительского полипептида и содержит замену в одном или более из следующих положений, указанных в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

R242, 196, Н76, SI64, S273, G251,

Yll, L222, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136,

L222, K231, N291, более конкретно R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I,

R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E,

L295K, N252D, R254E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q.

Предпочтительный выделенный вариант полипептида химозина по настоящему изобретению также может содержать одну или более из следующих комбинаций замен и при том, что каждая замена указана в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

Y11V, К19Т, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, R242E, G251D;

H76Q, S164G, L166V, L222I, S226T, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S164G, L222I, R242E, S273Y, V309I;

H76Q, I96L, S164G, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S132A, S164G, LI66V, S273Y;

D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;

D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

K19T, D59N, S164G, L166V, L222I, S226T, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;

K19T, Y21S, D59N, H76Q, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, L130I, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y, V309I;

K19T, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, L130I, S164G, G251D, V309I;

K19T, Y21S, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;

Y21S, D59N, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, S226T, R242E, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;

K19T, Y21S, H76Q, S164G, L222I, G251D, S273Y;

- 9 040259

K19T, D59N, H76Q, I96L, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, S164G, LI66V, N249D, G251D, S273Y;

Y11I, K19T, I96L, S164G, L222V, R242E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;

Y11V, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, L253I, I263L;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

Y11V, K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, I263L;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, I263V;

K19T, I96L, S164G, R242E, L253I;

Y11V, K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;

D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;

K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242D, G251D, I263V;

I96L, S164G, LI66V, L222I, R242E, N249D, I263L;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D, L253I;

D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

K19T, D59N, I96V, S164G, L166V, L222I, R242E, I263L;

Y11I, K19T, D59N, S164G, L222I, G251D, 1263 V;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L;

Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I, I263L;

K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;

K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V;

Y11V, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D, L253V;

Y11I, K19T, D59N, I96V, L222I, R242D, G251D;

K19T, E83T, I96L, S164G, L222I, R242E, L253V;

K19S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;

- 10 040259

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

K19T, I96L, S164N, L222I, R242E, I263L;

K19T, D59N, E83T, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D;

K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I;

Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;

K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, N249D, I263L;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, G251D, L253V;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164N, L166I, L222I, G251D;

R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, N252D, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

V32L, R67Q, L130I, M157L, K231N, M256L;

R67Q, L13OI, M157L, D158S, R242E, N291Q;

R67Q, V136I, M157L, L222I, V248I;

Y11V, R67Q, L130I, M157L, L222I, R242E;

R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;

R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q;

R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

R67Q, L13OI, L222I, R242E, M256L;

R67Q, G70D, M157L, R242E, V248I;

R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;

R67Q, I96L, N100Q, L130I, M157L, N292H;

I45V, L130I, M157L, K231N, R242E или

R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N.

Предпочтительные способы получения выделенных вариантов полипептида химозина Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения выделенного полипептида в соответствии с настоящим изобретением.

Указанные предпочтительные способы могут включать следующие стадии:

(а) модификацию в одном или более положениях последовательности ДНК, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, где модификация включает замену, удаление или вставку по меньшей мере в одном аминокислотном положении;

(б) получение и выделение варианта полипептида со стадии (а).

Родительский полипептид может иметь по меньшей мере 85, 95, 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).

В другом предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения выделенного полипептида химозина, при этом вариант содержит одну или более следующих заме, указанных в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

D59, V309, S132, N249, L166, N249, Q56, М157, М256, R242,196, Н76, S164, S273, G251, Yll, L166, К19, Y21, S74, Y243, N249, S273, Q280, F282, L295, N252, R254, Q294, G70, V136, L222, К231, N291 таких как, например, D59N, V309I, S132A, N249E, L166V, N249D, Q56H, M157L, M256L, R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, К19Т, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, Q294E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q.

В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения выделенного варианта полипептида химозина, где:

(а) вариант содержит одну или более комбинаций из следующих замен и где каждая замена указана в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

- 11 040259

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;

Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, LI66V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S132A, S164G, LI 66V, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;

H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, I96L, LI66V, L222I, R242E, G251D;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

R242E, N252D, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;

R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;

R67Q, I96L, M157L, L222I, K23 IN или

R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q.

Другой соответствующий аспект настоящего изобретения касается способа получения пищевого или кормового продукта, включающего добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано здесь, к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам) и выполнение дополнительных стадий производства для получения пищевого или кормового продукта, в частности, при том, что пищевой или кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока или пищевой или кормовой продукт, содержащий полипептид химозина по настоящему изобретению.

Другой соответствующий аспект настоящего изобретения относится к варианту полипептида химозина по настоящему изобретению в способе получения продукта на основе молока, такого как, например, сыр, такой как, например, вытяжной сыр, чеддер, сыры континентального типа, мягкий сыр или белый рассольный сыр.

Как обсуждалось выше, выделенный вариант полипептида химозина, как описано здесь, можно использовать в соответствии с уровнем техники, например для получения интересующего продукта на основе молока (такого как, например, сырный продукт).

- 12 040259

Как обсуждалось выше, один аспект изобретения относится к способу получения пищевого или кормового продукта, включающему добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в данном описании изобретения, к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам) и осуществление дальнейших стадий получения пищевого или кормового продукта.

Предпочтительно, пищевой или кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока, и способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано здесь, в молоко и осуществление дальнейших стадий производства с получением продукта на основе молока.

Молоко может представлять собой, например, соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.

Продукт на основе молока может, например, представлять собой ферментированный молочный продукт, такой как творог кварк или сыр.

Как известно в данной области техники, рост, очистка, тестирование и обработка могут влиять на активность ферментов, а следовательно, и на фермент по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к вариантам полипептида химозина, способам их получения и получения продуктов, содержащих их, где вариант полипептида химозина имеет улучшенную свертывающую активность и/или соотношение С/Р по сравнению с соответствующим родительским полипептидом при сопоставимых условиях и предпочтительно после получения или обработки иным способом в сопоставимых условиях.

Примеры

Пример 1. Выравнивание и нумерация в белковых последовательностях химозина и последовательностях вариантов.

Последовательности белка химозина выравнивали, используя алгоритм ClustalW, представленный EBI (EBI, инструменты, множественное выравнивание последовательностей, CLUSTALW, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) и, как описано в Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948.

Установки ClustalW2 для множественного выравнивания последовательностей были следующими: матрица сравнения аминокислот=BLOSUM, открытие гэпа=10, удлинение гэпа=0,5, расстояние между гэпами=8, бесконечные гэпы, итерация=нет, максимальное количество итераций=1, группировка=NJ.

В качестве эталонной последовательности использовали бычий химозин В препрохимозин (Genbank регистрационный номер Р00794 - раскрытый в данном описании изобретения как SEQ ID NO: 1), где N-концевой метионин имеет номер 1 (MRCL......) и С-концевой изолейцин (в белковой последовательности ...LAKAI) имеет номер 381. Варианты выравнивали относительно бычьего В пре-прохимозина и остатки пронумеровывали согласно соответствующему остатку бычьего химозина.

Пример 2. Конструкция вариантов химозина.

Варианты химозина конструировали с использованием различных стратегий.

Когда упоминается верблюжий химозин, речь в данном документе идет о верблюжьем химозине, содержащем полипептид с SEQ ID NO: 2.

Верблюжий химозин с SEQ ID NO: 2 можно рассматривать как релевантный здесь родительский полипептид, имеющий химозиновую активность и используемый для получения вариантов верблюжьего химозина.

Когда упоминается бычий химозин, речь в данном документе идет о бычьем химозине, содержащем полипептид с SEQ ID NO: 1.

Бычий химозин с SEQ ID NO: 1 можно рассматривать, как релевантный здесь родительский полипептид, имеющий химозиновую активность и используемый для получения вариантов бычьего химозина.

Варианты 180-269 и 367-461 верблюжьего химозина были сконструированы на основе выравнивания большой совокупности общеизвестных аспарагиновых протеазных последовательностей, имеющих идентичность 25% или более по сравнению с бычьим химозином В.

Вариации обычно вводили в области с высоким уровнем вариации аминокислот между видами, в то время как консервативные области не изменяли. Аминокислотные замены выбирали на основе филогенетической, структурной и экспериментальной информации для идентификации изменений с высокой вероятностью для демонстрации положительных эффектов на удельную свертывающую активность и соотношение С/Р. В каждую вариантную конструкцию были введены множественные вариации, гарантирующие присутствие каждой одиночной мутации в нескольких вариантных конструкциях, чтобы минимизировать эффект ковариации между различными заменами.

Использовали машинное обучение и статистический анализ для определения относительных вкладов аминокислотных замен на измеряемые характеристики коагуляции для вариантов химозина (ссылки 14, 15).

Варианты 271-366 были сконструированы на основании детального структурного анализа бычьего химозина (код PDB: 4AA8) и верблюжьего химозина (код PDB: 4AA9). Вариации выбирали, исходя из

- 13 040259 химической природы соответствующих боковых цепей аминокислот и их ожидаемого воздействия либо на связывание казеинового субстрата, либо на общие ферментные свойства. Большинство аминокислотных замен в вариантах 271-346 осуществляли в положениях последовательности либо внутри, либо в непосредственной структурной близости к субстратсвязывающей щели, или во вторичных структурных элементах, которые контактируют со связанным казеиновым субстратом. Кроме того, изменения были осуществлены в положениях на поверхности белка, которые изменяют профиль заряда этих областей (ссылка 5) и поэтому, как ожидается, оказывают влияние на характеристики фермента. Варианты 347-366 были сделаны на основе другой структурной конформации N-концевой последовательности в бычьем и верблюжьем химозине. Аминокислотные замены были сделаны в положениях в субстратсвязывающей щели, которые взаимодействуют с N-концом верблюжьего химозина.

Пример 3. Получение ферментного вещества варианта химозина.

Все варианты химозина синтезировали как синтетические гены и клонировали в грибной экспрессионный вектор, такой как, например, pGAMpR-C (описанный в WO 02/36752А2).

Векторы трансформировали в Е. coli, и плазмидную ДНК очищали, используя стандартные протоколы молекулярной биологии, известные специалисту в данной области.

Варианты плазмид индивидуально трансформировали в штамм Aspergillus niger или Aspergillus nidulans, и белок продуцировали, по существу, так, как описано в WO 02/36752А2, и очищали, используя стандартные хроматографические методы. Для скрининга библиотеки ферментов все варианты химозина получали в ферментациях 20-60 мл. Для более детальной характеристики вариантов 433, 436, 453 и 457 соответствующие ферменты еще раз ферментировали в масштабе 70 л.

Как известно в данной области, специалист может, на основе своих общих знаний, получать и очищать химозин и варианты химозина, такие как описанные в данном описании изобретения варианты бычьего и верблюжьего химозина.

Пример 4. Определение удельной химозиновой активности.

4.1. Определение молокосвертывающей активности.

Молокосвертывающую активность определяли, используя метод REMCAT, который представляет собой стандартный метод, разработанный Международной федерацией по молочному животноводству (метод IDF).

Молокосвертывающую активность определяли, исходя из времени, необходимого для видимой флокуляции стандартного молочного субстрата, полученного из сухого обезжиренного молока низкотемпературного сгущения и распылительной сушки с раствором хлорида кальция 0,5 г на литр (рН«6,5). Время свертывания для образца сычужного фермента сравнивали со временем свертывания эталонного стандарта, имеющего известную молокосвертирующую активность и имеющего такой же ферментный состав согласно стандарту IDF НОВ в качестве образца. Образцы и эталонные стандарты измеряли в одинаковых химических и физических условиях. Образцы вариантов доводили до примерно 3 IMCU/мл, используя 84 мМ уксуснокислый буфер, рН 5,5. Затем 20 мкл ферментного препарата добавляли к 1 мл предварительно нагретого молока (32°С) в стеклянной аналитической пробирке, помещенной на водяную баню, способную поддерживать постоянную температуру 32±1°С, при постоянном перемешивании.

Общую молокосвертывающую активность (эффективность) сычужного фермента рассчитывали в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на мл по сравнению со стандартом, содержащим такой же ферментный состав, что и образец, согласно формуле:

Sstandart х Tstandart х Dsample

Активность В IMCU/мл = ----------:----------:-----Dstandart х Tsample

Sstandard: молокосвертывающая активность молока международного эталонного стандарта для сычужного фермента.

Tstandard: время свертывания в секундах, полученное для стандартного разбавления.

Dsample: коэффициент разбавления для образца.

Dstandard: коэффициент разбавления для стандарта.

Tsample: время свертывания в секундах, полученное для разбавленного образца сычужного ферменты с момента добавления фермента до момента флокуляции.

Для определения свертывающей активности библиотек вариантов 1 и 3, а также сконструированных вариантов, использовали метод pIMCU вместо метода REMCAT. По сравнению с REMCAT, время флокуляции для вариантов химозина в анализе pIMCU определяли посредством измерения OD (оптической плотности) в 96-луночных планшетах при 800 нм в УФ/VIS планшет-ридере. Стандартная кривая различных разведений эталонного стандарта с известной активностью свертывания была зафиксирована для каждого планшета. Образцы готовили путем разбавления фермента 84 мМ ацетатным буфером, 0,1% тритона Х-100, рН 5,5 Взаимодействие при 32°С начиналось при добавлении 250 мкл стандартного молочного субстрата, содержащего 4% (мас./мас.) сухого обезжиренного молоко низкотемпературного сгущения и распылительной сушки и 7,5% (мас./мас.) хлорида кальция (рН«6,5) до 25 мкл образца фермента. Молокосвертывающую активность вариантов химозина в Международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на мл определяли на основании времени флокуляции для образца по сравнению со стандартной кривой.

- 14 040259

4.2. Определение общего содержания белка.

Общее содержание белка определяли с использованием набора Pierce BCA Protein Assay Kit от

Thermo Scientific в соответствии с инструкциями поставщиков.

4.3. Расчет удельной свертывающей активности.

Удельную свертывающую активность (IMCU/мг общего белка) определяли путем деления свертывающей активности (IMCU/мл) на общее содержания белка (мг общего белка на мл).

Пример 5. Определение протеолитической активности.

Общую протеолитическую активность измеряли, используя флуоресцентно меченного Bodipy-FL казеин в качестве субстрата (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Производные казеина, интенсивно меченные не чувствительным к рН зеленым флуоресцентным Bodipy-FL, вызывают гашение флуоресценции конъюгата. Катализируемый протеазой гидролиз высвобождает флуоресцентный Bodipy-FL. Этот способ является очень чувствительным, что было необходимо для этого эксперимента, поскольку CHYMAX М имеет самую низкую общую протеолитическую активность всех коагулянтов, известных на сегодняшний день.

Раствор субстрата 0,04 мг/мл готовили в 0,2 М фосфатном буфере, рН 6,5, содержащем 100 мМ NaCl, 5% глицерина и 0,1% Бридж. Варианты химозина растворяли в 20 мМ малонатном буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 5% глицерина и 0,1% Бридж. По 20 мкл раствора субстрата и варианта химозина смешивали в черном 384-луночном плоскодонном полистироловом планшете Corning и непрерывно определяли флуоресценцию в флуориметре при 32С в течение 10 ч. Наклоны линейной части кривой изменения флуоресценции использовали для определения общей протеолитической активности.

Пример 6. Статистический анализ эффектов положения и мутации на удельную свертывающую активность и отношение С/Р.

Для определения влияния одиночных мутаций, присутствующих в вариантах библиотек 1-3 с множественными заменами, на расщепление к-казеина между положениями Phe105 и Met106, т.е. удельную молокосвертывающую активность, а также на соотношение свертывающей и общей протеолитической активности (С/Р), использовали статистической подход с машинным обучением анализа и РСА-анализ.

Результаты.

Библиотека 1 множественных замен.

Получали варианты верблюжьего химозина, каждый из которых имел множественные замены по сравнению с диким типом, и анализировали, как описано выше. Все варианты имеют аминокислотную последовательность, идентичную верблюжьему химозину (SEQ ID NO: 2), за исключением вариаций, указанных в таблице. Верблюжий химозин (CHY-MAX М) включен в качестве эталона.

Активности свертывания определяли, используя метод μIMCU.

Таблица 1. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина

180-222. Значения приведены, как % расщепления верблюжьим химозином дикого типа (CHY-MAX М)

вариант CHY-МАХ М	мутации	Сверт.(С)1 100	Протеол.(Р) 1 100	С/Р 100
180	H76Q S132A S164G L222I N249D G251D	72	37	194
181	Y21S D59N H76Q S164G L166V N249D G251D S273Y	77	37	210
182	D59N H76Q S164G L222I R242E S273Y V309I	96	21	449
183	D59N H76Q L130I L166V L222I N249D G251D S273Y	84	55	152
184	Y21S D59N S164G L222I R242E G251D S273Y V309I	102	35	287
185	K19T Y21S D59N H76Q S132A S164G L222I G251D S273Y	97	29	334
186	D59N H76Q I96L L130I S164G L222I R242E G251D	85	16	524
187	H76Q S164G L166V L222I S226T S273Y	103	21	504
188	K19T D59N I96L S164G L222I G251D	126	31	403
189	Y21S H76Q S164G L222I R242E G251D S273Y	138	14	975
190	H76Q I96L S164G L222I R242E G251D S273Y	153	10	1479
191	H76Q S164G L222I N249D G251D S273Y V309I	112	19	606
192	K19T D59N H76Q S164G L222I N249D S273Y	152	42	363
193	Y21S D59N H76Q S164G L222I S226T G251D S273Y V309I	107	32	340
194	H76Q S164G L166V L222I R242E G251D S273Y	132	14	949
195	D59N H76Q I96L S164G L222I S226T N249D G251D S273Y	96	19	498
196	D59N H76Q L130I S164G L166V L222I G251D S273Y V309I	76	24	316
197	D59N S132A S164G L222I R242E N249D G251D S273Y	138	38	365
198	H76Q I96L S164G G251D S273Y V309I	71	16	443
199	D59N H76Q L130I S164G G251D V309I	54	18	309

- 15 040259

200	К19Т D59N S164G L166V L222I S226T G251D S273Y	107	31	342
201	D59N H76Q I96L S132A S164G L222I S226T G251D S273Y	96	23	426
202	К19Т D59N H76Q I96L S164G L166V L222I G251D S273Y	90	41	218
203	К19Т D59N H76Q L130I S164G L222I S226T G251D S273Y	64	21	309
204	К19Т D59N H76Q S132A L222I G251D S273Y V309I	141	48	294
205	H76Q L130I L222I S226T G251D S273Y	124	38	322
206	К19Т Y21S D59N H76Q L130I S164G L222I S273Y	75	25	295
207	Y21S D59N H76Q I96L S164G L222I N249D G251D S273Y	129	17	762
208	К19Т D59N H76Q S164G R242E N249D G251D S273Y	129	15	879
209	D59N H76Q S164G L222I S226T R242E	124	30	417
210	D59N H76Q I96L S132A S164G L166V L222I G251D S273Y	136	21	657
211	D59N H76Q S132A S164G L166V S273Y	131	31	423
212	Y21S D59N S164G L222I S226T N249D G251D S273Y	92	48	190
213	D59N H76Q L130I S132A S164G L222I R242E G251D S273Y	108	24	441
214	D59N H76Q S164G L166V L222I N249D G251D S273Y V309I	111	65	171
215	D59N H76Q I96L S164G L222I S226T G251D S273Y V309I	87	24	369
216	К19Т D59N H76Q L166V L222I R242E G251D S273Y	146	30	494
217	Y21S D59N H76Q I96L L222I S273Y	118	52	228
218	D59N H76Q I96L L130I S164G L222I N249D G251D S273Y	75	23	323
219	L130I S164G L222I S273Y	46	38	121
220	К19Т Y21S H76Q S164G L222I G251D S273Y	65	28	228
221	Y21S D59N H76Q L130I S132A S164G L222I G251D S273Y	65	31	213
222	D59N H76Q S226T R242E G251D S273Y	102	37	273

В табл. 1 представлены варианты верблюжьего химозина с данными по удельной свертывающей активности (С), неспецифической протеолитической активности (Р) и соотношения С/Р. Из 43 вариантов 17 обнаружили увеличенную на 10-50% удельную свертывающую активность по сравнению с верблюжьим химозином дикого (CHY-MAX М). Все варианты имеют значительно увеличенное соотношение С/Р, с лучшим вариантом является 190, который демонстрирует приблизительно 15-кратное улучшение по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа.

Мутационный анализ библиотеки 1 с множественными заменами.

Статистический анализ позиционного и мутационного воздействий на удельную свертывающую активность и отношение С/Р проводили на основе протеолитических данных для библиотеки 1. Наиболее полезные мутации для увеличения удельного свертывания и С/Р показаны в табл. 2 и 3 соответственно.

Таблица 2. Мутационный вклад (среднее) в увеличение удельной свертывающей активности и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
R242E	1.98Е-01	2.47Е-02
L222I	1.09Е-01	3.35Е-02
D59N	6.06Е-02	3.12Е-02
S273Y	6.06Е-02	3.47Е-02
К19Т	5.13Е-02	2.65Е-02
V309I	4.37Е-02	2.92Е-02
S132A	4.18Е-02	2.46Е-02
N249D	3.85Е-02	2.54Е-02
I96L	3.38Е-02	2.59Е-02

На основании результатов, приведенных в табл. 2, был сделан вывод, что мутации К19Т, D59N, I96L, S132A, L222I, R242E, N249D, S273Y и V309I увеличивают удельную свертывающую активность химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации позволяют снизить дозу химозина в производстве сыра.

- 16040259

Таблица 3. Мутационный вклад (среднее) в увеличение соотношения С/Р и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
R242E	2.12Е-01	2.82Е-02
I96L	1.20Е-01	2.81Е-02
H76Q	9.10Е-02	2.16Е-02
S164G	8.59Е-02	2.19Е-02
S273Y	7.77Е-02	2.01Е-02
G251D	3.59Е-02	1.99Е-02

На основании результатов, приведенных в табл. 3, был сделан вывод, что мутации H76Q, I96L, S164G, R242E, G251D и S273Y увеличивают соотношение С/Р химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации приводят к повышенному выходу при производстве сыра с использованием соответствующих вариантов химозина.

Библиотека 2 с множественными заменами.

Другой набор вариантов верблюжьего химозина, каждый из которых имел множественные замены по сравнению с диким типом, был получен и проанализирован, как описано выше. Все варианты имеют аминокислотную последовательность, идентичную верблюжьему химозину (SEQ ID NO: 2), за исключением вариаций, указанных в таблице. Верблюжий химозин (CHY-MAX М) включен в качестве эталона.

Активности свертывания определяли, используя метод REMCAT.

Таблица 4. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина 223-269. Значения приведены, как % расщепления верблюжьего химозина дикого muna(CHY-MAX М)

вариант CHY-МАХ М	мутации	Сверт (С) 100	Протеол (Р) 1 100	с/Р 100
223	К19Т D59N I96L S164G L222I G251D	89	37	242
224	Ylll К19Т D59N 196V L222I R242D G251D	82	31	262
225	K19S D59N 196V S164G G251D	72	40	182

- 17 040259

226

K19S

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

91

38

242

227

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222I

R242D

G251D

L253I

92

24

378

228

D59N

I96L

S164G

L222I

R242E

L253I

I263L

108

23

467

229

К19Т

D59N

Е83Т

I96L

L222I

G251D

I263L

99

106

93

230

Y11I

К19Т

D59N

S164G

L222I

G251D

I263V

54

16

343

231

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

G251D

L253V

63

30

206

232

К19Т

I96V

S164G

L222I

N249D

G251D

L253I

56

29

193

233

К19Т

I96L

L222I

R242E

L253I

125

57

220

234

К19Т

E83S

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

L253I

83

35

235

235

D59N

Е83Т

I96L

S164N

L222V

G251D

42

53

80

236

K19S

D59N

I96L

S164G

L222I

R242E

N249E

G251D

130

28

459

237

К19Т

I96L

S164G

L166V

L222I

N249D

I263L

65

30

217

238

D59N

I96L

L166V

L222I

R242E

G251D

178

51

347

239

К19Т

D59N

Е83Т

S164G

L166V

L222I

R242D

G251D

101

43

235

240

Y11I

К19Т

D59N

E83S

I96L

S164G

L222I

N249D

53

60

87

241

К19Т

Е83Т

I96L

S164G

L222I

R242E

L253V

97

37

261

242

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222I

R242E

N249D

129

21

623

243

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

G251D L253I

130

17

759

244

К19Т

I96L

S164N

L222I

R242E

I263L

51

22

236

245

Y11V

D59N

I96L

S164G

L222I

G251D

L253V

63

24

265

246

К19Т

D59N

I96V

S164G

L166V

L222I

R242E

I263L

98

28

347

247

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164N

L166I

L222I

G251D

32

16

202

248

К19Т

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

N249D

G251D

I263V

105

19

566

249

К19Т

I96L

S164G

R242E

L253I

73

14

516

250

K19S

D59N

E83S

I96L

S164N

L222I

G251D

47

64

74

251

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222V

N249E

G251D

I263V

79

27

293

252

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222I

N249E

G251D

L253V

I263L

69

21

332

253

Y11I

К19Т

I96L

S164G

L222V

R242E

G251D

58

2

3265

254

I96L

S164G

L222I

R242E

N249D

G251D

I263L

82

14

601

255

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222I

R242D

G251D

I263V

108

25

427

256

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222V

R242E

N249D

L253I

111

19

574

257

H76Q

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

S273Y

128

8

1597

258

К19Т

E83S

I96L

S164G

L222I

R242E

N249D

G251D

L253I

95

30

315

259

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

N249D

I263L

104

26

405

260

Y11V

К19Т

E83S

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

G251D

97

14

676

261

Y11V

К19Т

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

94

19

491

262

Y11V

E83S

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

L253I

I263L

61

18

332

263

Y11V

I96L

S164G

L222I

R242E

N249D

L253I

I263L

67

7

961

264

К19Т

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

N249D

I263L

75

50

149

265

Y11V

E83S

I96L

S164G

L222I

R242E

L253I

I263L

62

28

222

266

К19Т

E83S

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

N249D

G251D L253I

97

32

302

267

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

S274Y

110

19

569

268

H76Q

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

102

10

1054

269

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

101

22

465

В табл. 4 представлены варианты верблюжьего химозина с данными по удельной свертывающей активности (С), неспецифической протеолитической активности (Р) и соотношения С/Р. Из 47 вариантов было выявлено 8 с увеличенной от 10 до 78% удельной свертывающей активностью по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-MAX М). В то время как 43 варианта имеют значительно увеличенные соотношения С/Р, лучшим вариантом является 253, который демонстрирует приблизительно 33-кратное улучшение по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа.

Мутационный анализ библиотеки 2 с множественными заменами Статистический анализ позиционного и мутационного воздействия на удельную свертывающую активность и отношение С/Р проводили на основе протеолитических данных для библиотеки 2. Наиболее полезные мутации для увеличения удельного свертывания и С/Р показаны в табл. 5 и 6 соответственно.

Таблица 5. Мутационный вклад (среднее) в увеличение удельной свертывающей активности и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
R242E	4.00Е-01	3.19Е-02
D59N	2.94Е-01	2.26Е-02
N249E	1.47Е-01	3.22Е-02
L166V	1.27Е-01	2.70Е-02
S273Y	1.23Е-01	2.94Е-02
L222I	1.07Е-01	3.53Е-02
H76Q	5.93Е-02	2.94Е-02
N249D	4.26Е-02	2.38Е-02

На основании результатов, приведенных в табл. 5, был сделан вывод, что мутации D59N, H76Q,

- 18 040259

L166V, L222I, R242E, N249D, N249E и S273Y увеличивают удельную свертывающую активность химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации позволяют снизить дозу химозина в производстве сыра.

Таблица 6. Мутационный вклад (среднее) в увеличение соотношения С/Р и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
R242E	4.13Е-01	2.20Е-02
H76Q	2.50Е-01	3.24Е-02
Y11I	2.49Е-01	6.43Е-02
S164G	2.27Е-01	2.07Е-02
G251D	2.10Е-01	2.65Е-02
R242D	1.85Е-01	2.69Е-02
L222V	1.75Е-01	4.53Е-02
Y11V	1.75Е-01	2.83Е-02
S273Y	8.29Е-02	3.35Е-02
L166I	7.64Е-02	2.91Е-02
I96L	3.85Е-02	2.59Е-02
К19Т	3.85Е-02	2.43Е-02

На основании результатов, приведенных в табл. 6, был сделан вывод, что мутации Y11I, Y11V, К19Т, H76Q, I96L, S164G, L166I, L222V, R242D, R242E, G251D и S273Y увеличивают соотношение С/Р химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации приведут к повышенному выходу при производстве сыра с использованием соответствующих вариантов химозина.

Структурные изменения в верблюжьем химозине.

Варианты верблюжьего химозина (SEQ ID NO: 2) получали посредством замены аминокислот в положениях, определенных посредством структурного анализа белка (табл. 10). Мутации N100Q и N291Q были введены в оба сайта N-гликозилирования этих вариантов и эталонного верблюжьего химозина (CamUGly) с получением негликозилированных, гомогенных образцов белка.

Активности свертывания определяли, используя метод μIMCU.

Таблица 7. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина 271-308. Значения приведены, как % расщепления негликозилированного верблюжьего химозина (CamUGly) CamBov

вариант CamUGly	мутации	Сверт (С) 100	Протеол (Р) 100	С/Р 100
N100Q.	N291Q.
271	V221K	N100Q.	N291Q.	47	61	77
272	D290E	N100Q.	N291Q.	92	100	92
273	V136I	N100Q.	N291Q.	80	90	89
274	E240Q.	N100Q.	N291Q.	84	144	58
276	G289S	N100Q.	N291Q.	93	107	86
ТП	N292H	N100Q.	N291Q.	95	93	100
278	L295K	N100Q.	N291Q.	102	70	146
279	V136E	N100Q.	N291Q.	102	102	100
280	D290L	N100Q.	N291Q.	44	198	22
281	F119Y	N100Q.	N291Q.	8	45	18
282	Q.280E	N100Q.	N291Q.	79	72	110
283	F282E	N100Q.	N291Q.	93	80	116
284	N249D	N100Q.	N291Q.	118	84	140
285	R254S	N100Q.	N291Q.	47	94	50
286	R242E	N1OOQ.	N291Q.	114	67	170
288	V203R	N100Q.	N291Q.	99	113	88
289	N249R	N100Q.	N291Q.	76	108	70
290	Н56К	N100Q.	N291Q.	99	133	74
291	S74D	N100Q.	N291Q.	94	87	108
292	A131D	N100Q.	N291Q.	17	39	44
293	Y190A	N100Q.	N291Q.	3	33	9
294	I297A	N100Q.	N291Q.	26	37	70
302	Y21S	N100Q.	N291Q.	97	87	111

- 19 040259

303	L130I	N100Q.	N291Q	77	82	95
306	G251D	N100Q.	N291Q.	100	81	123
307	Y243E	N100Q.	N291Q.	86	58	149
308	S273D	N100Q	N291Q	102	98	104

На основании результатов, приведенных в табл. 7, был сделан вывод, что мутации Y21S, S74D, R242E, Y243E, N249D, G251D, S273D, Q280E, F282E и L295K увеличивают соотношение С/Р химозина. Мутации R242E и N249D также приводят к увеличенной удельной свертывающей активности. Семь из десяти вариантов с увеличенными соотношениями С/Р, показанные в табл. 7, несут мутации (R242E, N249D, G251D, Y243E, S273D, Q280E, F282E) в отдельной области на поверхности белка, которая расположена вблизи связывающей щели, как видно на фиг. 2. Предполагается, что эта область поддерживает связывание κ-казеин-субстрата посредством взаимодействия положительно заряженной последовательности Arg96 с His102 (ссылки 5, 16-18) в положениях Р10-Р4 (ссылка 10). Отрицательные заряды, вводимые с мутациями, могут усилить эти взаимодействия, что приводит к повышенной специфичности для κказеина (С/Р). Результаты показывают, что отдельные аминокислотные замены в этой области могут значительно увеличить С/Р.

Отрицательные комбинации зарядов в верблюжьем химозине.

Дополнительные варианты верблюжьего химозина (SEQ ID NO: 2) были сделаны с комбинациями мутаций, которые вводят отрицательные заряды в описанную выше область поверхности (R242E, Y243E, G251D, N252D, R254E, S273D, Q280E). Мутации N100Q и N291Q были введены в оба участка Nгликозилирования этих вариантов и эталона верблюжьего химозина (CamUGly) для получения негликозилированных гомогенных образцов белка (табл. 8).

Активности связывания определяли с использованием метода μIMCU.

Таблица 8. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина 309-323. Значения приведены, как % расщепления негликозилированного верблюжьего химозина (CamUGly)

вариант CamUGly	мутации	N100Q	N291Q	Сверт (С) 100	|Протеол.(Р) |	С/Р 100
100
309	R242E	Q.280E			N100Q	N291Q	133	59	225
310	R242E	N252D			N100Q	N291Q	136	63	216
311	N252D	Q.280E			N100Q	N291Q	108	96	112
312	Y243E	Q.280E			N100Q	N291Q	112	71	158
313	Y243E	N252D			N100Q	N291Q	91	77	117
314	R254E	Q.280E			N100Q	N291Q	106	84	127
315	S273D	Q.280E			N100Q	N291Q	77	51	150
316	R242E	G251D			N100Q	N291Q	107	72	148
317	R242E	G251D	Q.280E		N100Q	N291Q	138	84	164
318	R242E	S273D	Q.280E		N100Q	N291Q	136	98	139
319	N252D	S273D	Q.280E		N100Q	N291Q	115	67	171
320	G251D	S273D	Q.280E		N100Q	N291Q	114	64	176
321	R242E	R254E	Q280E		N100Q	N291Q	134	66	202
322	R242E	R254E	S273D	Q.280E	N100Q	N291Q	126	60	211
323	Y243E	R254E	S273D		N100Q	N291Q	103	71	144

Все варианты, представленные в табл. 8, показывают увеличение отношения С/Р по сравнению с негликозилированным верблюжьим химозином. Некоторые из этих вариантов (309, 310, 321, 322, 323) имеют даже более высокий С/Р, чем лучший вариант с одиночной отрицательной мутацией заряда (286). Был сделан вывод о том, что эффект увеличения С/Р, вызванный введением отрицательных зарядов в область взаимодействия Р10-Р4 в структуре химозина, может быть дополнительно усилен комбинациями соответствующих мутаций.

Структурные вариации в бычьем химозине.

Варианты бычьего химозина (SEQ ID NO: 1) получали с помощью замен аминокислот в положениях, определенных посредством структурного анализа белка (табл. 9). Мутации N252Q и N291Q вводили в оба сайта N-гликозилирования этих вариантов и эталонного бычьего химозина (BovUGly) с получением негликозилированных, гомогенных образцов белка.

Активности свертывания определяли, используя метод μIMCU.

- 20 040259

Таблица 9. Ферментативная активность вариантов бычьего химозина 325-346. Значения приведены, как % расщепления негликозилированного бычьего химозина (BovUGly)

вариант BovUGly	мутации N252Q	N291Q	Сверт. (С) 100	Протеол (Р) 100	С/Р 100
325	V223F	N252Q	N291Q	54	130	41
327	A117S	N252Q	N291Q	75	76	96
329	Q242R	N252Q	N291Q	76	166	45
330	Q278K	N252Q	N291Q	94	112	83
332	H292N	N252Q	N291Q	96	71	133
333	Q294E	N252Q	N291Q	99	79	123
334	K295L	N252Q	N291Q	106	182	58
335	D249N	N252Q	N291Q	89	129	68
337	G244D	N252Q	N291Q	100	106	93
338	Q56H	N252Q	N291Q	110	140	77
339	L32I	N252Q	N291Q	86	124	69
340	К71Е	N252Q	N291Q	44	50	86
341	Р72Т	N252Q	N291Q	103	172	59
342	Q83T	N252Q	N291Q	92	103	88
343	V113F	N252Q	N291Q	42	44	95
344	E133S	N252Q	N291Q	93	199	46
345	Y134G	N252Q	N291Q	106	115	91
346	К71А	N252Q	N291Q	79	131	60

Данные в табл. 9 демонстрируют, что вариации Q56H, Y134G и K295L приводят к увеличенной удельной свертывающей активности и вариации H292N и Q294E приводят к повышенным соотношениям С/Р. Оба Н292 и Q294 расположены в петле, частично покрывающую субстратсвязывающую щель (фиг. 3), что объясняет наблюдаемое воздействие соответствующих мутаций в этих положениях на специфичность казеинового субстрата (С/Р). В частности, в то время как замены H292N увеличивали С/Р и D249N, а также K295L уменьшали С/Р бычьего химозина, обратные эффекты на С/Р наблюдали соответствующих обратных мутаций N292H, N249D и L295K в верблюжьем химозине (табл. 7). Это демонстрирует, что эти изменения аминокислот оказывают сходное влияние на специфичность химозина среди видов.

Вариации N-конца верблюжьего химозина.

Варианты верблюжьего химозина (SEQ ID NO: 2) получали путем замены аминокислот в положениях, определенных посредством белкового структурного анализа молекулярных взаимодействий Nконцевой последовательности Y11-D13 в субстратсвязывающей щели (табл. 10). Мутации N100Q и N291Q вводили в оба сайта N-гликозилирования этих вариантов и эталонного верблюжьего химозина (CamUGly) с получением негликозилированных, гомогенных образцов белка.

Активности свертывания определяли, используя метод pIMCU.

Таблица 10. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина 347-366. Значения приведены, как % расщепления негликозилированного верблюжьего химозина (CamUGly)

вариант CamUGly	мутации	Сверт. (С) 100	Протеол (Р) 100	С/Р 100
N100Q	N291Q
347	Y11H		N100Q	N291Q	76	131	58
348	УПК		N100Q	N291Q	63	82	76
349	Y11R		N100Q	N291Q	55	277	20
350	Y11H	D290E	N100Q	N291Q	74	105	71
351	Y11R	D290E	N100Q	N291Q	62	101	62
352	Y11F		N100Q	N291Q	91	146	62
353	Y11I		N100Q	N291Q	96	83	116
354	Y11L		N100Q	N291Q	79	108	74
355	Y11V		N100Q	N291Q	101	64	157
356	L12F		N100Q	N291Q	96	147	66
357	L12I		N100Q	N291Q	83	91	91
359	D13N		N100Q	N291Q	88	131	67
360	D13Q		N100Q	N291Q	100	169	59
361	D13S		N100Q	N291Q	88	164	54
362	D13T		N100Q	N291Q	62	89	70
363	D13F		N100Q	N291Q	73	155	48
364	D13L		N100Q	N291Q	82	196	42
365	D13V		N100Q	N291Q	49	86	57
366	D13Y		N100Q	N291Q	74	99	75

Анализ структуры верблюжьего химозина сопровождал вариации в N-концевой последовательно-21 040259 сти Y11-D13, а также в положении D290, потенциального партнера взаимодействия Y11 (фиг. 4). Поскольку казеиновые субстраты конкурируют с N-концевой последовательностью химозина за связывание в связывающей щели, замены аминокислот, которые изменяют взаимодействия между связывающей щелью и мотивом Y11-D13, как ожидается, оказывают влияние на ферментативную активность в отношении различных казеиновых субстратов и, таким образом, на соотношение С/Р. Результаты соответствующих вариантов 347-366 показывают сильное изменение как удельной свертывающей активности, так и С/Р. В частности, варианты 353 и 355 обнаруживают увеличенные соотношения С/Р. Поэтому был сделан вывод, что аминокислотные замены Y11I и Y11V приводят к увеличенному соотношению С/Р. Поскольку связывающая щель химозина состоит, главным образом, из гидрофобных аминокислот (ссылка 9), обе мутации могут усилить связывание N-конца в связывающей щели посредством улучшенных гидрофобных взаимодействий и, таким образом, ингибировать неспецифическое связывание и гидролиз казеина (Р).

Библиотека 3 множественных замен.

Другой набор вариантов верблюжьего химозина, каждый из которых имел множественные замены по сравнению с диким типом, был получен и проанализирован, как описано выше. Все варианты имеют аминокислотную последовательность, идентичную верблюжьему химозину (SEQ ID NO: 2), за исключением вариаций, указанных в таблице. Верблюжий химозин (CHY-MAX М) включен в качестве эталона.

Активности свертывания определяли, используя метод μIMCU.

Таблица 11. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина 367-416. Значения приведены, как % расщепления верблюжьего химозина дикого muna(CHY-MAX М)

вариант CHY-МАХ М	мутации	Сверт.(С) I 100	Протеол (Р) I 100	С/Р 100
367	R67Q	N100Q	L130I	M157L	V248I	N291Q	46	64	72
368	N100Q	L130I	S132A	M157L	K231N		87	104	83
369	R67Q	I96L	L130I	M157L	L222I	M256L	49	56	88
370	R67Q	L130I	S132A	M157L	R242E	V248I	23	32	70
371	R67Q	N100Q	M157L	R242E	M256L		100	62	162
372	R67Q	G70D	M157L	R242E	V248I		89	32	276
373	V32L	R67Q	M157L	L222I	R242E		64	63	102
374	Y11V	R67Q.	M157L	V248I	M256L		71	45	158
375	R67Q	V136I	M157L	L222I	V248I		88	20	449
376	L130I	M157L	V248I	M256L	N291Q		90	80	112
377	R67Q	I96L	L130I	M157L	K231N	R242E	124	37	339
378	V32L	R67Q	L130I	M157L	L222I	K231N	52	103	51
379	L130I	V136I	M157L	L222I	N292H		55	47	118
380	R67Q	G70D	M157L	L222I	N291Q		117	34	339
381	V32L	R67Q	L130I	K231N	N292H		58	66	87
382	Y11V	R67Q	N100Q	L130I	V136I	M157L	60	55	109
383	R67Q	L130I	L222I	R242E	M256L		78	27	290
384	R67Q	M157L	L222I	V248I	N292H		83	97	86
385	V32L	R67Q	M157L	M256L	N291Q		85	143	60
386	R67Q	L130I	S132A	M157L	L222I	N292H	78	133	58
387	R67Q	N100Q	L130I	M157L	K231N	N291Q	59	70	84
388	R67Q	L130I	K231N	V248I	N291Q		91	87	105
389	Y11V	R67Q	L130I	M157L	L222I	K231N	63	47	134
390	I45V	L130I	M157L	K231N	R242E		108	43	253
391	V32L	R67Q	V136I	M157L	N291Q		104	84	124
392	R67Q	N100Q	L130I	D158S	V248I		70	67	105
393	I45V	R67Q	L130I	M157L	L222I	K231N	79	54	147
394	V32L	R67Q	L130I	S132A	M157L	V248I	74	130	57
395	Y11V	R67Q	L130I	M157L	N291Q	N292H	74	83	90
396	R67Q	N100Q	L130I	M157L	L222I	K231N	60	81	74
397	I45V	R67Q	G70D	L130I	S132A		68	75	90
398	I45V	R67Q	L130I	V248I	N292H		53	81	66
399	Y11V	R67Q	L130I	M157L	L222I	R242E	106	28	373
400	R67Q	N100Q	D158S	L130I	M157L	L222I	57	58	98
401	R67Q	L130I	V136I	M157L	K231N	V248I	71	79	89
402	I45V	R67Q	L130I	L222I	N291Q		91	89	103
403	R67Q	G70D	L130I	M157L	K231N	M256L	89	53	167
404	V32L	R67Q	L130I	M157L	D158S	V248I	58	82	71
405	R67Q	L130I	M157L	D158S	R242E	N291Q	92	16	556
406	R67Q	L130I	M157L	D158S	K231N	N292H	53	74	72
407	R67Q	L130I	V248I	M256L	N292H		58	107	55
408	V32L	R67Q	I96L	L130I	M157L	V248I	35	76	46
409	R67Q	I96L	N100Q	L130I	M157L	N292H	96	36	263
410	V32L	R67Q	G70D	N100Q	M157L		68	66	104
411	V32L	R67Q	L130I	M157L	K231N	M256L	102	18	574
412	R67Q	I96L	M157L	L222I	K231N		120	55	220

- 22 040259

413	R67Q	M157L	L222I	K231N	V248I	124	46	268
414	R67Q	L130I	M157L	R242E	M256L	N292H	115	59	196
415	R67Q	L222I	K231N	V248I			82	67	123
416	R67Q	S132A	L222I	K231N	R242E	V248I	129	42	306

В табл. 11 показаны варианты верблюжьего химозина с данными по удельной свертывающей активности (С), неспецифической протеолитической активности (Р) и соотношения С/Р. Из 50 вариантов, 6 обнаружили увеличенную на 10-29% удельную свертывающую активность по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-МАХ М). В то время как 23 варианта имеют увеличенное более чем на 10% соотношение С/Р, лучшим вариантом является 411, который демонстрирует приблизительно 6кратное улучшение по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-MAX М). Мутационный анализ библиотеки 3 множественных замен.

Статистический анализ позиционного и мутационного влияний на свертывающую активность (С) и соотношение С/Р выполняли на основании протеолитических данных библиотеки 3. Наиболее полезные мутации для увеличения свертывания и С/Р показаны в табл. 12 и 13 соответственно.

Таблица 12. Мутационный вклад (среднее) в увеличенную свертывающую активность и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
R242E	4,63Е-01	4,21Е-02
I96L	2,31Е-01	4,82Е-02
N291Q	1,67Е-01	3,97Е-02
K231N	1,34Е-01	3,52Е-02
M256L	1,28Е-01	4Д4Е-02
S132A	1,04Е-01	3,35Е-02
M157L	7,99Е-02	3,49Е-02

На основании результатов, приведенных в табл. 12, был сделан вывод, что мутации I96L, S132A, M157L, K231N, R242E, M256L и N291Q увеличивают удельную свертывающую активность химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации позволяют снизить дозу химозина в производстве сыра.

Таблица 13. Мутационный вклад (среднее) в увеличение соотношения С/Р и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
R242E	6,66Е-01	4,23 Е-02
G70D	3,32Е-01	5,72Е-02
Y11V	2,06Е-01	3,61Е-02
K231N	1Д5Е-01	2,92Е-02
L222I	1,09Е-01	3,71Е-02
V136I	1,02Е-01	4,53Е-02
I96L	9,84Е-02	6,02Е-02
N291Q.	4,78Е-02	4,20Е-02

На основании результатов, приведенных в табл. 13, был сделан вывод, что мутации Y11V, G70D, I96L, V136I, L222I, K231N, R242E и N291Q увеличивают соотношение С/Р химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации приводят к повышенному выходу при производстве сыра с использованием соответствующих вариантов химозина.

Библиотека 4 множественных замен.

Другой набор вариантов верблюжьего химозина, каждый из которых имел множественные замены по сравнению с диким типом, был получен и проанализирован, как описано выше. Все варианты имеют аминокислотную последовательность, идентичную верблюжьему химозину (SEQ ID NO: 2), за исключением вариаций, указанных в таблице. Верблюжий химозин (CHY-MAX М) включен в качестве эталона.

Активности свертывания определяли, используя метод REMCAT.

- 23 040259

Таблица 14. Ферментативная активность вариантов верблюжьего химозина 417-461. Значения приведены, как % расщепления верблюжьего химозина дикого muna(CHY-MAX М)

вариант CHY-MAX М

мутации

Сверт (С) 100

Протеол (Р) 1 100

С/Р 100

417

Y11V

К19Т

D59N

S164G

L166V

L222I

R242E

N249E

G251D

132

20

651

418

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222I

R242E

N249E

G251D

114

21

556

419

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

N249E

G251D

108

20

554

420

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222I

R242E

G251D

98

11

898

421

Y11V

К19Т

D59N

I96L

L166V

L222V

R242E

N249E

G251D

L253I

132

84

156

422

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

R242E

105

13

802

423

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222V

R242E

G251D

89

8

1131

424

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

R242E

N249E

G251D

L253I

93

8

1111

425

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

N249E

G251D

105

18

572

426

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222V

R242E

N249E

G251D L253I

93

18

512

427

Y11V

К19Т

D59N

L166V

L222I

R242E

N249E

G251D

L253I

137

42

323

428

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222I

R242E

N249E

120

15

803

429

Y11V

К19Т

D59N

S164G

L166I

L222I

R242E

G251D

107

17

630

430

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

R242E

G251D

89

11

801

431

Y11V

D59N

I96L

S164G

L166I

L222V

R242E

G251D

L253I

79

28

283

432

Y11V

D59N

I96L

S164G

L166I

L222I

R242E

G251D

102

24

432

433

Y11I

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

G251D

L253I

97

25

392

434

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222I

R242E

N249E

G251D

99

33

301

435

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222V

R242E

G251D

88

17

514

436

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

N249E

L253I

95

10

949

437

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222V

R242E

N249E

G251D

114

22

520

438

Y11I

К19Т

I96L

S164G

L166V

R242E

N249E

G251D

93

7

1262

439

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

G251D

108

26

423

440

Y11V

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222V

R242E

N249E

G251D

105

9

1196

441

Y11I

К19Т

L222V

R242E

N249E

G251D

122

26

469

442

Y11V

К19Т

I96L

L222V

R242E

N249E

G251D

105

21

503

443

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

N249E

G251D

105

18

595

444

Y11V

К19Т

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

N249E

G251D

96

8

1242

445

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166I

L222V

R242E

N249E

G251D

82

12

707

446

Y11I

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

N249E

G251D

95

16

579

447

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222V

R242E

N249E

90

11

790

448

Y11I

К19Т

D59N

I96L

L222V

R242E

N249E

G251D

153

40

381

449

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222I

R242E

89

16

564

450

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L166V

R242E

G251D

88

5

1686

451

Y11I

К19Т

D59N

S164G

L166I

L222V

R242E

G251D

93

21

440

452

Y11I

I96L

L222V

R242E

N249E

G251D

122

22

566

453

Y11I

I96L

S164G

L222I

R242E

74

5

1375

454

Y11V

К19Т

I96L

L166V

L222V

R242E

G251D

119

52

228

455

Y11I

D59N

I96L

S164G

L222I

R242E

G251D

105

9

1139

456

Y11I

D59N

I96L

S164G

L222V

R242E

N249E

G251D

95

15

615

457

Y11I

К19Т

D59N

I96L

S164G

L222I

R242E

N249E

G251D

101

7

1419

458

Y11I

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

G251D

89

16

572

459

Y11V

К19Т

D59N

I96L

L222V

R242E

G251D

143

62

230

460

Y11I

К19Т

S164G

L166I

L222V

R242E

N249E

G251D

80

13

625

461

Y11I

D59N

I96L

S164G

L166V

L222V

R242E

N249E

G251D

96

35

273

В табл. 14 показаны варианты верблюжьего химозина с данными по удельной свертывающей активности (С), неспецифической протеолитической активности (Р) и соотношения С/Р. Из 45 вариантов 11 обнаружили увеличенную на 14-53% удельную свертывающую активность по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-МАХ М). В то время как все 45 вариантов имеют увеличенное более чем на 10% соотношение С/Р, лучшим вариантом является 450, который демонстрирует приблизительно 17кратное улучшение по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-MAX М).

Мутационный анализ библиотеки 4 множественных замен.

Статистический анализ позиционного и мутационного влияний на свертывающую активность (С) и соотношение С/Р выполняли на основании протеолитических данных библиотеки 4. Наиболее полезные мутации для увеличения свертывания и С/Р представлены в табл. 15 и 16 соответственно.

Таблица 15. Мутационный вклад (среднее) в увеличенную свертывающую активность и стандартные отклонения (sd) на основе статистического

анализа
мутация	среднее	sd
D59N	3,99Е-01	3,48Е-02
L222I	2,05Е-01	2,64Е-02
L166V	1,92Е-01	2,39Е-02
N249E	1,45Е-01	1,88Е-02
G251D	9,79Е-02	2,29Е-02

- 24 040259

На основании результатов, приведенных в табл. 15 был сделан вывод, что мутации Y11V, D59N,

L166V, L222I, R242E, N249E и G251D увеличивают удельную свертывающую активность химозина.

Следовательно, можно ожидать, что эти мутации позволяют снизить дозу химозина при производстве сыра.

Y11V	8,54Е-02	1,56Е-02
R242E	5Д4Е-02	2Д6Е-02

Таблица 16. Мутационный вклад (среднее) в увеличение соотношения С/Р и стандартные отклонения (sd) на основе статистического анализа

мутация	среднее	sd
S164G	7,51Е-01	4,50Е-02
К19Т	2,85Е-01	4,93Е-02
I96L	2,43Е-01	4Д6Е-02
R242E	2,25Е-01	7Д2Е-02
L253I	2,22Е-01	4,61Е-02
Y111	1,ЗОЕ-01	4,93Е-02
N249E	9,52Е-02	3,86Е-02
Y11V	9,49Е-02	3,55Е-02

На основании результатов, приведенных в таблице 16, был сделан вывод, что мутации Y11I, Y11V, Ю9Т, I96L, S164G, R242E, N249E и L253I увеличивают соотношение С/Р химозина. Следовательно, можно ожидать, что эти мутации приведут к повышенному выходу при производстве сыра с использованием соответствующих вариантов химозина.

Выбранные варианты библиотеки 4 множественных замен снова подвергали ферментации в 70 л с последующей очисткой и характеристикой их протеолитического профиля (табл. 17).

Таблица 17. Ферментативная активность выбранных вариантов верблюжьего химозина из 70 л ферментации. Значения приведены, как % расщепления верблюжьего химозина дикого muna(CHY-MAX M)

вариант CHY-МАХ М	мутации	Сверт(С) 1 100	Протеол. (Р) 1 100	С/Р 100
433	Ylll D59N I96L S164G L166V L222V R242E G251D L253I	151	11	1356
436	Y11V К19Т D59N I96L S164G L166V L222V R242E N249E L253I	188	9	2007
453	Ylll I96L S164G L222I R242E	153	8	1893
457	Ylll К19Т D59N I96L S164G L222I R242E N249E G251D	217	7	3002

В табл. 17 представлены варианты верблюжьего химозина из 70 л ферментации с данными по удельной свертывающей активности (С), неспецифической протеолитической активности (Р) и соотношения С/Р. Все 4 варианта обнаруживают увеличенную на 51%-117% удельную свертывающую активность по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-MAX М). В то время как все 4 варианта имеют более чем 13-кратное увеличение соотношения С/Р, лучшим вариантом является 457, который демонстрирует приблизительно 30-кратное улучшение по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа (CHY-MAX M).

- 25 040259

Ссылки

1. A. Kumar, S. Grover, J. Sharma, V. K. Batish, Crit. Rev. BiotechnoL 2010, 30, 243258.

2. M. W. Borsting, К. B. Qvist, M.Rasmussen, J. Vindelov, F. K. Vogensen, Y. Ardo, Dairy Sci. 2012, 92, 593-612.

3. K. Kastberg Moller, F. P. Rattray, Y. Ardo, J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 1142111432.

4. P. L. H. McSweeney, Int. J. Dairy Technol. 2004, 57, 127-144.

5. J. Langholm Jensen, A. Molgaard, J.-C. Navarro Poulsen, Μ. K. Harboe, J. B. Simonsen, A. M. Lorentzen, K. Hjerno, J. M. van den Brink, К. B. Qvist, S. Larsen, Acta Cryst. 2013, D69, 901-913.

6. S. Chitpinityol, D. Goode, M. J. C. Crabbe, Food Chem. 1998, 62, 133-139.

7. G. L. Gilliland, E. L. Winbome, J. Nachman, A. Wlodawer, Proteins 1990, 8, 82-101.

8. D. S. Palmer, A. U. Christensen, J. Sorensen, L. Celik, K. Bruun Qvist, B. Schiott, Biochemistry 2010, 49, 2563-2573.

9. J. Sorensen, D. S. Palmer, B. Schiott, J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 7949-7959.

10. I. Schechter, A. Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967, 425, 497-502.

11. L. K. Creamer, N. F. Olsen, J. Food Sci. 1982, 47:631-636

12. N. Bansal, M. A. Drake, P. Piraino, M. L. Broe, M. Harboe, P. F. Fox, P. L. H. McSweeney, Int. Dairy J. 2009, 19:510-517.

13. A. C. Moynihan, S. Govindasamy-Lucey, J. J. Jaeggi, Μ. E. Johnson, J. A. Lucey, P.

L. H. McSweeney, J. Dairy Sci. 2014, 97:85-96.

14. J. Ehren, S. Govindarajan, B. Moron, J. Minshull, C. Khosla, Prot. Eng. Des. Sei. 2008, 21, 699-707.

15. S. Govindarajan, B. Mannervik, J. A. Silverman, K. Wright, D. Regitsky, U. Hegazy, T. J. Purcell, M. Welch, J. Minshull, C. Gustafsson, ACS Synth. Biol. 2015, 4, 221-227.

16. M. Newman, M. Safro, C. Frazao, G. Khan, A. Zdanov, I. J. Tickle, T. L. Blundell, N. Andreeva, J. Mol. Biol. 1991, 221, 1295-1309.

17. E. Gustchina, L. Rumsh, L. Ginodman, P. Maj er, N. Andreeva, FEBS Lett. 1996, 379, 60-62.

18. S. Visser, C. J. Slangen, P. J. van Rooijen, Biochem. J. 1987, 244, 553-558.

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенный вариант полипептида химозина, отличающийся тем, что:

   (а) этот выделенный вариант полипептида химозина имеет удельную свертывающую активность (IMCU(международная молокосвертывающая единица)/мг общего белка), которая составляет по меньшей мере 110% удельной свертывающей активности его родительского полипептида и/или (б) этот выделенный вариант полипептида химозина имеет соотношение С/Р (удельная свертывающая активность/протеолитическая активность), которое составляет по меньшей мере 200% соотношения С/Р его родительского полипептида, где этот выделенный вариант полипептида химозина содержит замену в одном или более (нескольких) следующих положениях, указанных в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2: N249, R242.
2. 2. Выделенный вариант полипептида химозина по п.1, где родительский полипептид имеет по меньшей мере 80%, такую как, например, по меньшей мере 82, 85, 95, 97, 98, 99 или 100% идентичность последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).
3. 3. Выделенный вариант полипептида химозина по п.1 или 2, где замены представляют собой одну или более замен, указанных в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2: R242E, R242D, N249D, N249E.
4. 4. Выделенный вариант полипептида химозина по п.3, имеющий удельную свертывающую актив-

   - 26 040259 ность (IMCU/мг свертывающего белка), составляющую по меньшей мере 110% удельной свертывающей активности родительского пептида, и содержащий одну или более из следующих комбинаций замен, и где каждая замена указана в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

   Y11V, К19Т, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

   Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

   Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

   Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

   H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

   H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

   D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

   H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

   D59N, H76Q, S164G, L166V, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

   D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

   K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

   Y1IV, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

   K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

   I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

   N249D, N100Q, N291Q;

   R242E, N100Q, N291Q;

   R242E, G251D, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, N252D, N100Q, N291Q;

   R242E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

   R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

   R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E ; или

   R67Q, L130I, M157L, R242E, M256L, N292H.
5. 5. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп.1-4, имеющий соотношение С/Р, составляющее по меньшей мере 200% соотношения С/Р его родительского полипептида, и содержащий одну или более комбинаций следующих замен, и где каждая замена указана по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

   Y1II, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

   - 27 040259

   Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

   Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

   Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

   H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

   Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

   D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, R242E, G251D;

   D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, N249D, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   D59N, H76Q, S164G, L222I, R242E, S273Y, V309I;

   D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

   D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

   D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

   Y21S, D59N, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y, V309I;

   D59N, H76Q, S226T, R242E, G251D, S273Y;

   Y21S, D59N, H76Q, S164G, LI66V, N249D, G251D, S273Y;

   H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;

   Y11V, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, L253I, I263L;

   Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

   Y11V, K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

   I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, I263L;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

   I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

   K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, I263V;

   K19T, I96L, S164G, R242E, L253I;

   D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;

   I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;

   - 28 040259

   K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242D, G251D, I263V;

   I96L, S164G, LI66V, L222I, R242E, N249D, I263L;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D, L253I;

   D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

   K19T, D59N, I96V, S164G, L166V, L222I, R242E, I263L;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L;

   Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I, I263L;

   K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;

   K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V;

   Y11I, K19T, D59N, I96V, L222I, R242D, G251D;

   K19T, E83T, I96L, S164G, L222I, R242E, L253V;

   K19S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;

   K19T, I96L, S164N, L222I, R242E, I263L;

   K19T, D59N, E83T, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D;

   K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I;

   Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;

   K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

   K19T, I96L, S164G, LI66V, L222I, N249D, I263L;

   R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, N252D, N100Q, N291Q;

   R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

   R67Q, L130I, M157L, D158S, R242E, N291Q;

   R67Q, V136I, M157L, L222I, V248I;

   Y11V, R67Q, L130I, M157L, L222I, R242E;

   R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;

   R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

   R67Q, L130I, L222I, R242E, M256L;

   R67Q, G70D, M157L, R242E, V248I или

   I45V, L130I, M157L, K231N, R242E.
6. 6. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп.1-5, включающий следующие стадии:

   (а) осуществление модификации в одном или более положениях последовательности ДНК, кодирующей полипептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, где модификация включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении;

   (б) выделение модифицированного полипептида со стадии (а) с получением варианта полипептида химозина со стадии (а).
7. 7. Способ по п.6, где родительский полипептид имеет по меньшей мере 85, 95, 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичность последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).
8. 8. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п.6 или 7, где:

   (а) вариант содержит одну или более следующих замен, указанных по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2: N249, R242, такую как, например, N249E, N249D, R242E, R242D.
9. 9. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п.7 или 8, где:

   (а) вариант содержит одну или более комбинаций следующих замен и где каждая замена указана по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2:

   - 29 040259

   Y1II, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

   Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

   Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

   Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

   H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

   H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

   K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

   Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

   D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

   H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

   D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

   Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

   K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

   K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

   K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

   I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

   R242E, N252D, N100Q, N291Q;

   R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

   R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

   R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I или

   R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E.
10. 10. Способ получения пищевого продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-5 к пищевому ингредиенту и осуществление дальнейших стадий производства с получением пищевого продукта, где пищевой продукт представляет собой продукт на основе молока, и пищевой ингредиент представляет собой молоко.
11. 11. Способ получения кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп.1-5 к кормовому ингредиенту и осуществление дальнейших стадий производства с получением кормового продукта, где кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока и кормовой ингредиент представляет собой молоко.
12. 12. Пищевой продукт, содержащий вариант полипептида химозина по любому из пп.1-5.
13. 13. Кормовой продукт, содержащий вариант полипептида химозина по любому из пп.1-5.
14. 14. Применение варианта полипептида химозина по любому из пп.1-5 для получения сыра.
15. 15. Применение варианта полипептида химозина по п.14 для получения вытяжного сыра, чеддера, сыров континентального типа, мягкого сыра или белого рассольного сыра.