CN107849550A - 具有改善的性质的凝乳酶变体 - Google Patents

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Abstract

具有改善的性质的凝乳酶变体。

Description

具有改善的性质的凝乳酶变体
技术领域
本发明涉及具有改善的性质的凝乳酶变体。
背景技术
凝乳酶(EC 3.4.23.4)和胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)(哺乳动物胃的乳凝酶)是属于一大类肽酶的天冬氨酸蛋白酶。
当在胃粘膜细胞中产生时，凝乳酶和胃蛋白酶分别作为酶促无活性的前凝乳酶原(pre-prochymosin)和前胃蛋白酶原(pre-pepsinogen)出现。当凝乳酶被分泌时，将N-末端肽片段，即前片段(pre-fragment)(信号肽)，切下以产生包含原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是基本上无活性形式的酶，然而，其在酸性条件下，通过自催化去除原片段而活化为活性凝乳酶。该活化发生在体内胃腔内的适当的pH条件下，或体外酸性条件下。
牛(即Bos taurus)前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶的结构和功能特征已被广泛研究。牛前凝乳酶原分子的前(pre-)部分包含16个aa残基并且相应的凝乳酶原的原(pro-)部分具有42个aa残基的长度。活性牛凝乳酶包含323个aa。
凝乳酶在哺乳动物种例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵羊、猪、人、猴和大鼠中天然产生。
牛凝乳酶和骆驼凝乳酶在奶品工业具有多年商业利用。
通过乳凝酶(milk-clotting enzyme)(例如凝乳酶和胃蛋白酶)对乳的酶促凝固是奶酪制造中最重要的工艺之一。酶促乳凝固是一个两阶段过程：第一阶段，其中蛋白水解酶，凝乳酶或胃蛋白酶，攻击κ-酪蛋白，产生酪蛋白胶束结构的亚稳态；和第二阶段，其中乳随后凝固并形成凝固物(参考文献1)。除了通过切割κ-酪蛋白促进乳凝固之外，凝乳酶还主要在Leu192和Tyr193之间切割β-酪蛋白(β-酪蛋白)，从而导致β(193-209)肽的形成。β(193-209)的进一步蛋白水解和短疏水肽的形成可导致产品的不期望的苦味。
WO02/36752A2(Ch.Hansen)描述了骆驼凝乳酶的重组生产。
WO2013/174840A1(Ch.Hansen)描述了牛和骆驼凝乳酶的突变体/变体。
WO2013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突变体。
以下列出的参考文献在当下语境中可被视为描述凝乳酶突变体的参考文献：
-Suzuki等：定点诱变揭示Thr218、Lys220和Asp304在凝乳酶中的功能性作用(Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218,Lys220and Asp304in chymosin)，Protein Engineering，第4卷，1990年1月，第69-71页；
-Suzuki等：通过定点诱变改变凝乳酶的催化性质(Alteration of catalyticproperties of chymosin by site-directed mutagenesis)，Protein Engineering，第2卷，1989年5月，第563-569页；
-van den Brink等：通过糖基化增加凝乳酶的产生(Increased production ofchymosin by glycosylation)，Journal of biotechnology，第125卷，2006年9月，第304-310页；
-Pitts等：里氏木霉中产生的凝乳酶pH最佳突变体的表达和表征(Expressionand characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricodermareesei)，Journal of biotechnology，第28卷，1993年3月，第69-83页；
-M.G.Williams等：牛凝乳酶点突变体的诱变、生物化学表征和X射线结构分析(Mutagenesis,biochemical characterization and X-ray structural analysis ofpoint mutants of bovine chymosin)，Protein engineering design and selection，第10卷，1997年9月，第991-997页；
-Strop等：工程酶亚位点特异性：Val111phe位点突变小牛凝乳酶的制备、动力学表征和在分辨率下的X射线分析(Engineering enzyme subsite specificity:preparation,kinetic characterization,and x-ray analysis at 2.0ANG resolutionof Val111phe site mutated calf chymosin)，Biochemistry，第29卷，1990年10月，第9863-9871页；
-Chitpinityol等：影响乳凝活性的小牛凝乳酶B的位点特异性突变(Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clottingactivity)，Food Chemistry，第62卷，1998年6月，第133-139页；
-Zhang等：二硫键Cys45-Cys50在重组凝乳酶原中的功能意义(Functionalimplications of disulfide bond,Cys45-Cys50,in recombinant prochymosin)，Biochimica et biophysica acta，第1343卷，1997年12月，第278-286页。
如下文所述，上述现有技术参考文献均未直接且明确地描述与衍生出变体的亲本相比在类似的凝结活性下具有降低的β-酪蛋白切割频率的任何凝乳酶变体。
发明内容
本发明待解决的问题是提供在与亲本多肽比较时具有更低的降低的β-酪蛋白切割频率、同时基本上维持其凝结效率的凝乳酶变体。
因此，本发明提供分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于：
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的凝结比活性(IMCU/mg总蛋白)是特征在于SEQID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的凝结比活性的至少80％；并且
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体以特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的β-酪蛋白切割频率的小于50％的频率切割β-酪蛋白，其中β-酪蛋白切割是通过对由孵育脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶所获得的β-酪蛋白肽进行定量确定的，其中定量是通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行的。
本发明的分离的凝乳酶多肽变体可衍生自亲本多肽，与SEQ ID NO:4的多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少例如85％、95％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
在一个相关方面，本发明的分离的凝乳酶多肽变体具有特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的至少70％，例如至少例如75％、80％、90％、100％、110％、120％、130％或150％的凝结比活性。
在又一相关方面，本发明的分离的凝乳酶多肽变体优选地至少具有特征在于SEQID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的小于50％，例如小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％或小于6％的非特异性蛋白水解活性(P)。
在又一相关方面，本发明的分离的凝乳酶多肽变体至少具有特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的C/P比率的至少300％、400％、500％、600％、700％、800％、1000％、1200％、1400％或1600％的C/P比率。
本发明的分离的凝乳酶多肽变体可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其中所述一个或多个取代、缺失或插入相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列被列出：Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242或I96，且更具体地，例如Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E和/或I96L。
本发明进一步提供制备本发明的分离的凝乳酶多肽变体的方法、使用所述分离的凝乳酶多肽变体制备食品或饲料产品的方法、包含这些变体的食品和饲料产品，以及所述变体用于制备食品和饲料产品的用途。
在一个相关的替代方面，本发明涉及用于制备具有降低的分离的凝乳酶多肽的方法，其包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:4的多肽的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在对应于以下任意位置的至少一个氨基酸位置上的取代、缺失或插入：
SEQ ID NO:4中的Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242或I96；
(b)：产生并分离步骤(a)的经改变的多肽。
通过以上方法产生的分离的凝乳酶可包含以下取代中的一个或多个：
Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E和/或I96L。
在一个相关方面，本发明的分离的凝乳酶多肽变体和通过以上方法产生的变体可包含取代的组合，并且其中每个取代相对于SEQ ID NO：4的氨基酸序列被列出：
I96+G163+V221；R67+H76+S132+V248+S271；R67+L130+M157；
V136+V221+L222+S226；S132+R254+V259+Y307；V32+I96+S277；
L130+M142+I200+V259+E294；L130+S132+V32；
L130+G163+Y307；R61+L166+T239；L130+T239+S277+L295；
D98+H146+V203+I263+S271；S132+V221+S255+S273+V317；
H76+L222+G251；H76+K231+G244；
Y127+S132+D158；V221+V248+L253+L295；V32+R61+H146；
V32+E294+R316+V317；H76+I96+D158；D98+M157+V183；
S226+G244+I263+G289；G70+L130+Y268；D59+V248+L222+V248；
R67+G70+H146+Q188+S226；S74+H76+M142+M157+G163；
R61+S226+T239+V248+G251；V32+L130+R145+L222+D279；
D59+L222+G251+E83+Q162；D59+L222+G251+F17+Y21；
D59+L222+G251+H76+S164；D59+L222+G251+K62+M165；D59+L222+G251+Q162+V155；D59+L222+G251+S273+L166；D59+L222+G251+Y268+V198；D59+L222+G251+S273+F66；D59+L222+G251+N165+L166；D59+L222+G251+H76+M165；D59+L222+G251+F17+S273；D59+L222+G251+L166+I45；
D59+L222+G251+L180+T284；D59+L222+G251+V32+L12+T284；
D59+L222+G251+Y21+L166；D59+L222+G251+V155+E262+V32；
D59+L222+G251+L105+S164；D59+L222+G251+Y21+L215+L105；
D59+L222+G251+I96+T177+K321；D59+L222+G251+F17+T284+V203；
D59+L222+G251+V32+K321+V260；D59+L222+G251+V198+V32+E83；
D59+L222+G251+I96+V203+V309；D59+L222+G251+Y268+L215+V32；
D59+L222+G251+H76+L105+V260；D59+L222+G251+Y21+H76+Y268；
D59+L222+G251+S164+R266+I96；D59+L222+G251+H181+F66+V32；
D59+L222+G251+H181+R266+D267；D59+L222+G251+Y268+L12+D267；
D59+L222+G251+L166+E262+T177；D59+L222+G251+F66+Q288+I96；
D59+L222+G251+V203+R266+F223；D59+L222+G251+I303+S154+V260；
D59+L222+G251+Y21+T284+I96；D59+L222+G251+Q288+K19+T177；
D59+L222+G251+K62+Y268+K19；
L12+Y21+D59+H76+M165+V198+L222+G251+Q288；
L12+Y21+D59+H76+M165+L222+G251+S273；
L12+D59+H76+M165+V198+L222+G251+S273+K321；
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L12+D59+H76+D98+M165+L222+G251+E262+Q288；
L12+V51+D59+H76+L166+L222+G251；
L12+D59+H76+D144+M165+V203+L222；
L12+D59+144+M165+L166+L222+G251：
L12+K19+D59+H76+S154+M165+V198+L222+G251；
L12+H76+D98+M165+L222+G251；
L12+V32+D59+H76+M165+L180+V198+L222+G251；
L12+D59+H76+S154+M165+S273；
L12+V51+D59+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W；
L12+V32+H76+M165+L222+E262；L12+N50+D59+H76+M165+G251+E262；
V51+D59+H76+M165+L180+L222+G251+E262；
L12+D59+H76+M165+G251+Q288+V309+K321；
L12+N50+D59+V203+L222+G251；L12+D59+H76+L180+L222+G251+K321；
L12+Y21+D59+M165+L222+K321；D59+H76+M165+L166+V198+L222；
L12+K19+N50+D59+H76+M165+L222+Q288；
L12+Y21+N50+D59+F66+H76+D144+M165+L222+G251；
H76+S132+S164+L222+N249+G251；
Y21+D59+H76+S164+L166+N249+G251+S273；
D59+H76+S164+L222+R242+S273+V309；
D59+H76+L130+L166+L222+N249+G251+S273；
Y21+D59+S164+L222+R242+G251+S273+V309；
K19+Y21+D59+H76+S132+S164+L222+G251+S273；
D59+H76+I96+L130+S164+L222+R242+G251；
H76+S164+L166+L222+S226+S273；K19+D59+I96+S164+L222+G251；
Y21+H76+S164+L222+R242+G251+S273；
H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273；
H76+S164+L222+N249+G251+S273+V309；
K19+D59+H76+S164+L222+N249+S273；
Y21+D59+H76+S164+L222+S226+G251+S273+V309；
H76+S164+L166+L222+R242+G251+S273；
D59+H76+I96+S164+L222+S226+N249+G251+S273；
D59+H76+L130+S164+L166+L222+G251+S273+V309；
D59+S132+S164+L222+R242+N249+G251+S273；
H76+I96+S164+G251+S273+V309；D59+H76+L130+S164+G251+V309；
K19+D59+S164+L166+L222+S226+G251+S273；
D59+H76+I96+S132+S164+L222+S226+G251+S273；
K19+D59+H76+I96+S164+L166+L222+G251+S273；
K19+D59+H76+L130+S164+L222+S226+G251+S273；
K19+D59+H76+S132+L222+G251+S273+V309；
H76+L130+L222+S226+G251+S273；
K19+Y21+D59+H76+L130+S164+L222+S273；
Y21+D59+H76+I96+S164+L222+N249+G251+S273；
K19+D59+H76+S164+R242+N249+G251+S273；
D59+H76+S164+L222+S226+R242；
D59+H76+I96+S132+S164+L166+L222+G251+S273；
D59+H76+S132+S164+L166+S273；
Y21+D59+S164+L222+S226+N249+G251+S273；
D59+H76+L130+S132+S164+L222+R242+G251+S273；
D59+H76+S164+L166+L222+N249+G251+S273+V309；
D59+H76+I96+S164+L222+S226+G251+S273+V309；
K19+D59+H76+L166+L222+R242+G251+S273；
Y21+D59+H76+I96+L222+S273；
D59+H76+I96+L130+S164+L222+N249+G251+S273；
L130+S164+L222+S273；K19+Y21+H76+S164+L222+G251+S273；
Y21+D59+H76+L130+S132+S164+L222+G251+S273；
D59+H76+S226+R242+G251+S273；K19+D59+I96+S164+L222+G251；
Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251；K19+D59+I96+S164+G251；
K19+I96+S164+L166+L222+R242；
K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253；
D59+196+S164+L222+R242+L253+I263；
K19+D59+E83+I96+L222+G251+I263；
Y11+K19+D59+S164+L222+G251+I263；
K19+D59+I96+S164+L166+G251+L253；
K19+I96+S164+L222+N249+G251+L253；K19+I96+L222+R242+L253；
K19+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253；
D59+E83+I96+S164+L222+G251；
K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251；
K19+I96+S164+L166+L222+N249+I263；D59+I96+L166+L222+R242+G251；
K19+D59+E83+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+E83+I96+S164+L222+N249；
K19+E83+I96+S164+L222+R242+L253；
K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253；
K19+I96+S164+L222+R242+1263；Y11+D59+I96+S164+L222+G251+L253；
K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+I263；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+G251；
K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+I263；
K19+I96+S164+R242+L253；K19+D59+E83+I96+S164+L222+G251；
K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+I263；
K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+L253+I263；
Y11+K19+I96+S164+L222+R242+G251；
I96+S164+L222+R242+N249+G251+I263；
K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+I263；
K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+L253；
H76+196+S164+L222+R242+G251+S273；
K19+E83+I96+S164+L222+R242+N249+G251+L253；
I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263；
Y11+K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242；
Y11+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253+I263；
Y11+I96+S164+L222+R242+N249+L253+I263；
K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263；
Y11+E83+I96+S164+L222+R242+L253+I263；
K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253；
I96+S164+L222+R242+G251+S274；H76+I96+S164+L222+R242+G251；
I96+S164+L222+R242+G251；V32+N100+N291；V221+N100+N291；
D290+N100+N291；V136+N100+N291；E240+N100+N291；R242+N100+N291；
G289+N100+N291；N292+N100+N291；L295+N100+N291；V136+N100+N291；
D290+N100+N291；F119+N100+N291；Q280+N100+N291；F282+N100+N291；
R254+N100+N291；R242+N100+N291；V203+N100+N291；N249+N100+N291；
H56+N100+N291；S74+N100+N291；A131+N100+N291；Y190+N100+N291；
I297+N100+N291；H76+N100+N291；S273+N100+N291；K19+N100+N291；
D59+N100+N291；L222+N100+N291；V309+N100+N291；I96+N100+N291；
Y21+N100+N291；L130+N100+N291；S132+N100+N291；S226+N100+N291；
G251+N100+N291；Y243+N100+N291；S273+N100+N291；
R242+Q280+N100+N291；R242+N252+N100+N291；
N252+Q280+N100+N291；Y243+Q280+N100+N291；Y243+N252+N100+N291；
R254+Q280+N100+N291；S273+Q280+N100+N291；
R242+G251+N100+N291；R242+G251+Q280+N100+N291；
R242+S273+Q28D+N100+N291；N252+S273+Q280+N100+N291；
G251+S273+Q280+N100+N291；R242+R254+Q2B0+N100+N291；
R242+R254+S273+Q280+N100+N291；Y243+R254+S273+N100+N291；
V223+N252+N291；E290+N252+N291；A117+N252+N291；I136+N252+N291；
Q242+N252+N291；Q278+N252+N291；S289+N252+N291；
Q294+N252+N291；D249+N252+N291；D251+N252+N291；
G244+N252+N291；Q56+N252+N291；L32+N252+N291；K71+N252+N291；
P72+N252+N291；Q83+N252+N291；V113+N252+N291；E133+N252+N291；
Y134+N252+N291；K71+N252+N291；Y11+N100+N291；；
Y11+D290+N100+N291；L12+N100+N291；D13+N100+N291；
D13+N100+N291；R67+N100+L130+M157+V248+N291；
N100+L130+S132+M157+K231；R67+I96+L130+M157+L222+M256；
R67+L130+S132+M157+R242+V248；R67+N100+M157+R242+M256；
R67+G70+M157+R242+V248；V32+R67+M157+L222+R242；
Y11+R67+M157+V248+M256；R67+V136+M157+L222+V248；
L130+M157+V248+M256+N291；R67+I96+L130+M157+K231+R242；
V32+R67+L130+M157+L222+K231；L130+V136+M157+L222+N292；
R67+G70+M157+L222+N291；V32+R67+L130+K231+N292；
Y11+R67+N100+L130+V136+M157；R67+L130+L222+R242+M256；
R67+M157+L222+V248+N292；V32+R67+M157+M256+N291；
R67+L130+S132+M157+L222+N292；R67+N100+L130+M157+K231+N291；
R67+L130+K231+V248+N291；Y11+R67+L130+M157+L222+K231；
I45+L130+M157+K231+R242；V32+R67+V136+M157+N291；
R67+N100+L130+D158+V248；I45+R67+L130+M157+L222+K231；
V32+R67+L130+S132+M157+V248；Y11+R67+L130+M157+N291+N292；
R67+N100+L130+M157+L222+K231；I45+R67+G70+L130+S132；
I45+R67+L130+V248+N292；Y11+R67+L130+M157+L222+R242；
R67+N100+D158+L130+M157+L222；R67+L130+V136+M157+K231+V248；
I45+R67+L130+L222+N291；R67+G70+L130+M157+K231+M256；
V32+R67+L130+M157+D158+V248；R67+L130+M157+D158+R242+N291；
R67+L130+M157+D158+K231+N292；R67+L130+V248+M256+N292；
V32+R67+I96+L130+M157+V248；R67+196+N1D0+L130+M157+N292；
V32+R67+G70+N100+M157；V32+R67+L130+M157+K231+M256；
R67+I96+M157+L222+K231；R67+M157+L222+K231+V248；
R67+L130+M157+R242+M256+N292；R67+L222+K231+V248；
R67+S132+L222+K231+R242+V248；
Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+L166+L222+R242+N249+G251+L253；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+N249+G251+L253；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253；
Y11+K19+D59+L166+L222+R242+N249+G251+L253；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249；
Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+R242+G251；
Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253；
Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+L253；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+196+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+L222+R242+N249+G251；Y11+K19+I96+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249；
Y11+K19+D59+I96+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251；
Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+I96+L222+R242+N249+G251；Y11+I96+S164+L222+R242；
Y11+K19+I96+L166+L222+R242+G251；
Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251；
Y11+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251；
Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251；
Y11+K19+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251，例如
I96L+G163E+V221M；
R67Q+H76Q+S132A+V248I+S271P；
R67Q+L130I+M157L；
V136I+V221M+L222I+S226T；
S132A+R254S+V259I+Y307F；
V32L+I96L+S277N；
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q；
L130I+G163E+Y307F；
R61S+L166V+T239S；
L130I+T239S+S277N+L295K；
L130I+S132A+V32L；
D98V+H146R+V203A+I263L+S271P；
S132A+V221M+S255Y+S273Y+V317L；
H76Q+L222I+G251W；
H76Q+K231N+G244D；
Y127F+S132A+D158S；
V221M+V248I+L253I+L295K；
V32L+R61Q+H146R；
V32L+E294Q+R316L+V317L；
H76Q+I96L+D158S；
D98V+M157L+V183I；
S226T+G244D+I263L+G289S；
G70D+L130I+Y268F；
D59N+V248I+L222I+V248I；
R67Q+G70N+H146R+Q188E+S226T；
S74F+H76Q+M142I+M157L+G163E；
R61Q+S226T+T239S+V248I+G251W；
V32L+L130I+R145Q+L222I+D279E；
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S；
D59N+L222I+G251W+F17Y+Y21S；
D59N+L222I+G251D+H76Q+S164G；
D59N+L222I+G251D+K62Q+M165E；
D59N+L222I+G251D+Q162S+V155F；
D59N+L222I+G251D+S273Y+L166V；
D59N+L222I+G251D+Y268F+V198I；
D59N+L222I+G251D+S273Y+F66Y；
D59N+L222I+G251D+M165E+L166V；
D59N+L222I+G251D+H76Q+M165E；
D59N+L222I+G251D+F17Y+S273Y；
D59N+L222I+G251D+L166V+I45V；
D59N+L222I+G251W+L180I+T284S；
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S；
D59N+L222I+G251D+Y21S+L166V；
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L；
D59N+L222I+G251D+L105E+S164G；
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E；
D59N+L222I+G251D+I96L+T177S+K321P；
D59N+L222I+G251D+F17Y+T284S+V203A；
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T；
D59N+L222I+G251D+V198I+V32L+E83S；
D59N+L222I+G251D+I96L+V203A+V309I；
D59N+L222I+G251D+Y268F+L215V+V32L；
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T；
D59N+L222I+G251D+Y21S+H76Q+Y268F；
D59N+L222I+G251D+S164G+R266V+I96L；
D59N+L222I+G251D+H181N+F66Y+V32L；
D59N+L222I+G251D+H181N+R266I+D267Q；
D59N+L222I+G251D+Y268F+L12M+D267Q；
D59N+L222I+G251D+L166V+E262T+T177S；
D59N+L222I+G251D+F66Y+Q288E+I96L；
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A；
D59N+L222I+G251D+I303L+S154A+V260T；
D59N+L222I+G251D+Y21S+T284S+I96L；
D59N+L222I+G251D+Q288E+K19T+T177S；
D59N+L222I+G251D+K62Q+Y268F+K19T
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+Q288E；
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+L222I+G251W+S273Y；
L12M+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+S273Y+K321P；
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I；
L12M+D59N+H76Q+D98V+L222I；
L12M+K19T+V32L+D59N+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D；
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251D+E262T；
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D；
L12M+D59N+F66Y+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+V309I；
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+L222I+G251W+Q288E；
L12M+D59N+H76Q+D98V+M165E+L222I+G251D+E262T+Q288E；
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D；
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I；
L12M+D59N+144Q+M165E+L166V+L222I+G251D；
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D；
L12M+H76Q+D98V+M165E+L222I+G251W；
L12M+V32L+D59N+H76Q+M165E+L180I+V198I+L222I+G251D；
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+S273Y；
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W；
L12M+V32L+H76Q+M165E+L222I+E262T；
L12M+N50D+D59N+H76Q+M165E+G251W+E262T；
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T；
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P；
L12M+N50D+D59N+V203A+L222I+G251D；
L12M+D59N+H76Q+L180I+L222I+G251W+K321P；
L12M+Y21S+D59N+M165E+L222I+K321P；
D59N+H76Q+M165E+L166V+V198I+L222I；
L12M+K19T+N50D+D59N+H76Q+M165E+L222I+Q288E；
L12M+Y21S+N50D+D59N+F66Y+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D；
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D；
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I；
D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y；
Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I；
K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D；
H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y；
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D；
Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y；
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y；
H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I；
K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y；
Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I；
H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I；
D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y；
H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I；
D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I；
K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y；
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K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y；
K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y；
K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I；
H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y；
K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y；
Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y；
K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E；
D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y；
Y21S+D59N+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I；
D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I；
K19T+D59N+G251D+S273；H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y；
Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y；
D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y；
L130I+S164G+L222I+S273Y；
K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y；
Y21S+D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y；
D59N+H76Q+S226T+R242E+G251D+S273Y；
K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D；
K19S+D59N+I96V+S164G+G251D；K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E；
K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I；
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L；
K19T+D59N+E83T+I96L+L222I+G251D+I263L；
Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V；
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+G251D+L253V；
K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I；
K19T+I96L+L222I+R242E+L253I；
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I；
D59N+E83T+I96L+S164N+L222V+G251D；
K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D；
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L；
D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D；
K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D；
Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D；
K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V；
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I；
K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L；
Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V；
K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D；
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V；
K19T+I96L+S164G+R242E+L253I；
K19S+D59N+E83S+I96L+S164N+L222I+G251D；
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V；
K19T+D59N+196L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L；
Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D；
I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L；
K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V；
K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I；
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y；
K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I；
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Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D；
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E；
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L；
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L；
K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L；
Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L；
K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I；
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S274Y；
H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D；
I96L+S164G+L222I+R242E+G251D；V32L+N100Q+N291Q；
V221K+N100Q+N291Q；D290E+N100Q+N291Q；V136I+N100Q+N291Q；
E240Q+N100Q+N291Q；R242Q+N100Q+N291Q；G289S+N100Q+N291Q；
N292H+N100Q+N291Q；L295K+N100Q+N291Q；V136E+N100Q+N291Q；
D290L+N100Q+N291Q；F119Y+N100Q+N291Q；Q280E+N100Q+N291Q；
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V203R+N100Q+N291Q；N249R+N100Q+N291Q；H56K+N100Q+N291Q；
S74D+N100Q+N291Q；A131D+N100Q+N291Q；Y190A+N100Q+N291Q；
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V309I+N100Q+N291Q；I96L+N100Q+N291Q；Y21S+N100Q+N291Q；
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S273D+Q280E+N100Q+N291Q；R242E+G251D+N100Q+N291Q；
R242E+G251D+Q280E+N100Q+N291Q；
R242E+S273D+Q280E+N100Q+N291Q；
N252D+S273D+Q280E+N100Q+N291Q；
G251D+S273D+Q280E+N100Q+N291Q；
R242E+R254E+Q280E+N100Q+N291Q；
R242E+R254E+S273D+Q280E+N100Q+N291Q；
Y243E+R254E+S273D+N100Q+N291Q；V223F+N252Q+N291Q；
E290D+N252Q+N291Q；A117S+N252Q+N291Q；I136V+N252Q+N291Q；
Q242R+N252Q+N291Q；Q278K+N252Q+N291Q；S289G+N252Q+N291Q；
Q294E+N252Q+N291Q；D249N+N252Q+N291Q；D251G+N252Q+N291Q；
G244D+N252Q+N291Q；Q56H+N252Q+N291Q；L32I+N252Q+N291Q；
K71E+N252Q+N291Q；P72T+N252Q+N291Q；Q83T+N252Q+N291Q；
V113F+N252Q+N291Q；E133S+N252Q+N291Q；Y134G+N252Q+N291Q；
K71A+N252Q+N291Q；Y11H+N100Q+N291Q；Y11K+N100Q+N291Q；
Y11R+N100Q+N291Q；Y11H+D290E+N100Q+N291Q；
Y11R+D290E+N100Q+N291Q；Y11F+N100Q+N291Q；Y11I+N100Q+N291Q；
Y11L+N100Q+N291Q；L12F+N100Q+N291Q；L12I+N100Q+N291Q；
D13N+N100Q+N291Q；D13Q+N100Q+N291Q；D13S+N100Q+N291Q；
D13T+N100Q+N291Q；D13F+N100Q+N291Q；D13L+N100Q+N291Q；
D13V+N100Q+N291Q；D13Y+N100Q+N291Q；
R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q；
N100Q+L130I+S132A+M157L+K231N；
R67Q+I96L+L130I+M157L+L222I+M256L；
R67Q+L130I+S132A+M157L+R242E+V248I；
R67Q+N100Q+M157L+R242E+M256L；R67Q+G70D+M157L+R242E+V248I；
V32L+R67Q+M157L+L222I+R242E；Y11V+R67Q+M157L+V248I+M256L；
R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I；L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q；
R67Q+I96L+L130I+M157L+K231N+R242E；
V32L+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N；
L130I+V136I+M157L+L222I+N292H；R67Q+G70D+M157L+L222I+N291Q；
V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H；
Y11V+R67Q+N100Q+L130I+V136I+M157L；
R67Q+L130I+L222I+R242E+M256L；R67Q+M157L+L222I+V248I+N292H；
V32L+R67Q+M157L+M256L+N291Q；
R67Q+L130I+S132A+M157L+L222I+N292H；
R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q；
R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q；
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N；
I45V+L130I+M157L+K231N+R242E；V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q；
R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I；
I45V+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N；
V32L+R67Q+L130I+S132A+M157L+V248I；
Y11V+R67Q+L130I+M157L+N291Q+N292H；
R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N；
I45V+R67Q+G70D+L130I+S132A；I45V+R67Q+L130I+V248I+N292H；
Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E；
R67Q+N100Q+D158S+L130I+M157L+L222I；
R67Q+L130I+V136I+M157L+K231N+V248I；
I45V+R67Q+L130I+L222I+N291Q；
R67Q+G70D+L130I+M157L+K231N+M256L；
V32L+R67Q+L130I+M157L+D158S+V248I；
R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q；
R67Q+L130I+M157L+D158S+K231N+N292H；
R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H；V32L+R67Q+I96L+L130I+M157L+V248I；
R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H；
V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L；
V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L；R67Q+I96L+M157L+L222I+K231N；
R67Q+M157L+L222I+K231N+V248I；
R67Q+L130I+M157L+R242E+M256L+N292H；R67Q+L222I+K231N+V248I；
R67Q+S132A+L222I+K231N+R242E+V248I；
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+196L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E；
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D；
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I；
Y11V+D59N+196L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D；
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E；
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D；
Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D；Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E；
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D；
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D；
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11I+D59N+196L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D；
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D或
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D。
一个替代方面涉及用于制备食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的本发明的分离的凝乳酶多肽变体添加到食品或饲料成分中以及进行我们的进一步的制造步骤以获得食品或饲料产品，例如基于乳的产品，并且任选地更具体地涉及用于制备奶酪(例如帕斯塔费拉塔奶酪(Pasta filata)、切达奶酪(Cheddar)、大陆型奶酪(Continental typecheese)、软奶酪或白卤奶酪(White Brine Cheese))的过程。
因此，本发明涉及包含如本文所述的凝乳酶多肽变体的食品或饲料产品。
本发明的多肽变体还可用于降低奶酪和其他乳制品(例如酸奶)中的苦味。
在奶酪熟化中，凝乳酶主要在Leu192和Tyr193之间切割β-酪蛋白(参考文献2、3)。所得肽β(193-209)将被蛋白酶进一步降解为味苦的短疏水肽(参考文献4)。由于乳品应用中的苦味经常被认为是不期望的特征，因此期望开发具有较低β-酪蛋白切割频率的凝乳酶变体。
基于智能设计和不同变体的比较分析，本发明人鉴别了一些氨基酸位置，这些氨基酸位置在以下意义上在本文中是重要的：通过在一个或多个这些位置上制备变体，可获得具有更低β-酪蛋白切割频率的改善的凝乳酶变体。
如本文所用的说明变体或突变的氨基酸编号是在成熟肽编号上完成的。为了清楚起见，SEQ ID NO：2的成熟多肽对应于SEQ ID NO：4。
如本领域已知的，从不同哺乳动物种(例如牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠)获得的不同天然野生型凝乳酶多肽序列具有相对高的序列相似性/同一性。
在图1中，这通过本文相关的不同凝乳酶序列的比对来例示。
鉴于该相对紧密的序列关系，相信不同天然野生型凝乳酶的3D结构也是相对类似的。
在本上下文中，天然获得的野生型凝乳酶(例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶)在本文中可以是亲本多肽的示例，即对其进行改变以产生本发明的变体凝乳酶多肽的亲本多肽。
不受限于理论，相信本文所讨论的与凝乳酶相关的氨基酸位置在任何本文相关的目标凝乳酶(例如牛、骆驼、绵羊、猪、大鼠等的凝乳酶)中在以下意义上是普遍重要的：通过在这些位置中的一个或多个上制备变体，通常可获得改善的凝乳酶变体(例如改善的牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠的凝乳酶变体)。
如本文所讨论的，在本文中使用序列为本文中的SEQ ID NO:2的公知的成熟单峰骆驼(Camelius dromedarius)凝乳酶序列，来作为用于确定目标亲本凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置的参考序列。在本文中也可将其称为骆驼凝乳酶。所述序列也显示在图1中。
在本上下文中，相信与成熟多肽SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)具有至少65％序列同一性的亲本凝乳酶多肽(例如来自绵羊或大鼠)可在本文中被视为与例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶足够结构相关的，以便通过在如本文所述的任何氨基酸位置上制备变体来加以改善。
下面描述本发明的实施方案。
定义
本文相关术语的所有定义均符合本领域技术人员关于本文相关技术背景所应理解的。
术语“β-切割”或“β-酪蛋白的切割”意指β-酪蛋白的任何酶切割。例如Leu192和Tyr193之间的切割，其导致β(193-209)肽的形成。在一个方面，通过对由脱脂乳与凝乳酶变体多肽或骆驼凝乳酶一起孵育所获得的β(193-209)肽进行定量来确定β-切割，其中定量是通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行的。在实施例中描述了确定β-酪蛋白切割的优选方法的全部细节。
术语“凝乳酶”涉及EC 3.4.23.4类别的酶。凝乳酶具有高特异性，并且主要通过切割酪蛋白的κ链中的单个104-Ser-Phe-|-Met-Ala-108键来凝结乳。作为副活性，凝乳酶还主要在Leu192和Tyr193之间切割β-酪蛋白(参考文献2、3)。所得肽β(193-209)将被蛋白酶进一步降解为味苦的短疏水肽(参考文献4)。用于本领域中的凝乳酶(chymosin)的替代名称是凝乳酶(rennin)。
术语“凝乳酶活性”涉及本领域技术人员在本上下文中所理解的凝乳酶的凝乳酶活性。
本领域技术人员知道如何确定本文相关的凝乳酶活性。
术语“凝结比活性”描述凝乳酶多肽的乳凝活性，并且可根据本领域众所周知的测定来确定。确定凝结比活性(根据IMCU/mg蛋白质)的优选方法是由国际乳品联合会(International Dairy Federation)开发的标准方法(IDF方法)，其包括如下步骤，其中从乳底物的可见絮凝所需的时间确定乳凝活性，并将样品的凝结时间与具有已知乳凝活性和与样品相同的酶组成(基于IDF标准110B)的参考标准物的凝结时间进行比较。在相同的化学和物理条件下测量样品和参考标准物。在实施例中描述了IDF方法的全部细节。
如本领域已知的，通过将凝结比活性(C)除以蛋白质水解活性(P)来确定本文相关的被称为的C/P比。
如本领域已知的，较高的C/P比通常意味着由于非特异性蛋白质降解而导致的蛋白质在例如奶酪制造期间的损失降低，即奶酪的产量提高。
术语“分离的变体”意指由人工修饰的变体。在一个方面，所述变体是至少1％纯，例如，至少5％纯、至少10％纯、至少20％纯、至少40％纯、至少60％纯、至少80％纯和至少90％纯，如通过SDS PAGE所确定的。
如本文所用的说明本发明的凝乳酶多肽变体的氨基酸编号是在成熟肽编号上完成的。在与本申请一起提供的序列表中：
SEQ ID NO:1表示牛前凝乳酶原(pre-prochmyosin)的完整多肽序列；
SEQ ID NO:2表示骆驼前凝乳酶原的完整多肽序列；
SEQ ID NO:3表示成熟牛凝乳酶的多肽序列；
SEQ ID NO:4表示成熟骆驼凝乳酶的多肽序列。
换句话说，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别对应于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸59到381。本文所标识的所有特定取代都是关于成熟凝乳酶序列的位置，即关于SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸编号来标识的。如果关于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸编号标识所述位置，就必须减去58个残基以标识SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的位置，反之亦然。
术语“成熟多肽”意指在翻译或任何翻译后修饰(例如N末端加工、C末端截短、糖基化、磷酸化等)后呈最终形式的肽。在本上下文中，可将本文相关的成熟凝乳酶多肽视为活性凝乳酶多肽序列-即不含前部分和/或原部分序列。成熟多肽的本文相关示例是例如SEQID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽，其为SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381；或SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，其为SEQ ID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
术语“亲本”、“亲本多肽”或“具有凝乳酶活性的亲本多肽”意指在其上进行改变以产生本发明的酶变体的多肽。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。在本发明的一个优选实施方案中，所述亲本多肽与SEQ ID NO:4(骆驼凝乳酶)的多肽具有至少80％，例如至少例如85％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
术语“序列同一性”涉及两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定的，如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends Genet.16:276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中所执行的。所用的可选参数是10的缺口开放罚分(gap open penalty)、0.5的缺口延伸罚分(gapextension penalty)和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵(substitutionmatrix)。使用标记为“最长同一性”(使用–nobrief选项获得)的Needle输出作为百分比同一性，并计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度–比对中缺口的总数)
出于本发明的目的，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度是使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，见上文)来确定的，如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000，见上文)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中所执行的。所用的可选参数是10的缺口开放罚分、0.5的缺口延伸罚分和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用标记为“最长同一性”(使用–nobrief选项获得)的Needle输出作为百分比同一性，并计算如下：
(相同的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度–比对中缺口的总数)。
术语“变体”意指包含一个或多个(数个)位置处的改变(即取代、插入和/或缺失)的具有凝乳酶活性的肽。取代意指用不同氨基酸替代占据位置的氨基酸；缺失意指去除占据位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，例如，理论上可能的是例如特别是D-异构体(或D-型)的例如D-丙氨酸的取代。
术语“野生型”肽是指如天然存在那样的核苷酸序列或肽序列，即尚未经受人工靶向突变的核苷酸序列或肽序列。
附图说明
图1：本文相关的不同凝乳酶序列的比对。所示的“母牛_凝乳酶_B(Bos_bovis_chymosin_B)”是本文中的SEQ ID NO:1的牛凝乳酶，并且所示的“单峰骆驼(Camelus_dromedarius)”是本文中的SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶。使用SEQ ID NO:1的牛凝乳酶作为如本文所述的参考序列，可以例如看出，牛凝乳酶在10位具有“V”，并且骆驼凝乳酶在同一10位具有“A”。例如还可以看出，牛/大鼠在352位具有“Q”，并且骆驼/双峰骆驼(C._bactrianus)在同一352位具有“E”。
关于图1中所示的凝乳酶序列，绵羊与牛SEQ ID NO:1具有94.5％的序列同一性；双峰骆驼与牛SEQ ID NO:1具有83.2％的序列同一性；单峰骆驼(SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶)与牛SEQ ID NO:1具有84％的序列同一性；猪与牛SEQ ID NO:1具有80.3％的序列同一性，并且大鼠与牛SEQ ID NO:1具有71.9％的序列同一性。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，例如绵羊、双峰骆驼、骆驼、猪或大鼠凝乳酶的成熟多肽序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶-即SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到381)的本文相关序列同一性百分比与上述序列同一性百分比相对类似。
图2和图3：
具有以紫色显示的被结合β-酪蛋白的模型的骆驼凝乳酶(PDB：4AA9)的3D结构。将β-酪蛋白置于在残基192和193之间具有易切断键的凝乳酶底物结合槽(cleft)中。骆驼凝乳酶残基V32、L130和S132以绿色突出显示。
图4：
骆驼凝乳酶(PDB：4AA9)的3D结构。骆驼凝乳酶残基V32和L12以绿色突出显示。
发明详述
确定目标凝乳酶的氨基酸位置
如上文所讨论的，在本文中使用本文被公开为SEQ ID NO:2的公知的骆驼凝乳酶序列作为用于确定本文相关的目标凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置的参考序列。
将另一凝乳酶多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中所公开的多肽进行比对，并且基于该比对，使用如本文工作实施例1中所述的ClustalW算法来确定对应于SEQ ID NO:1中所公开的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置号。
基于以上熟知的计算机程序，确定本文相关的目标凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置是本领域技术人员的常规工作。
在本文图1中显示比对的示例。
仅作为示例，在图1中可以例如看出，本文中所用的牛参考SEQ ID NO:1在50位具有“G”并且“单峰骆驼”(本文中的SEQ ID NO:2)在该50位具有“A”。
变体的命名法
在描述本发明的变体时，为了便于参考，对下文所述的命名法加以调整。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
以下此“命名法”部分所讨论的具体变体可以不是本发明的本文相关变体，即该“命名法”部分仅仅是原样描述本文相关的所用命名法。如上文所示，用于说明本发明的凝乳酶多肽变体的氨基酸编号是基于成熟凝乳酶多肽序列中氨基酸的位置。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。
因此，在226位处用丙氨酸对苏氨酸的理论取代被命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多重突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别表示在205位用精氨酸(R)对甘氨酸(G)的取代以及在411位用苯丙氨酸(F)对丝氨酸(S)的取代。例如命名为“226A”的取代是指在226位处用丙氨酸对亲本氨基酸(例如T、Q、S或另一亲本氨基酸)的取代。同样，命名为“A226”或“A226X”的取代是指226位处的丙氨酸被另一未指定的氨基酸的取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在195位处甘氨酸的缺失被命名为“Gly195*”或“G195*”。多重缺失由加号(“+”)分开，例如“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在195位处甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被命名[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸1号、插入氨基酸2号；等等]。例如，在195位处甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被指示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过向一个或多个插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号添加小写字母来对所述一个或多个插入的氨基酸残基进行编号。在上面的示例中，因此顺序将是：
亲本： 变体：
195 195 195a 195b
G G-K-A
多重改变。包含多重改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”，分别表示在170位和195位用酪氨酸和谷氨酸对精氨酸和甘氨酸的取代。
不同的取代。当可在一个位置引入不同的取代时，不同的取代通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”表示在170位用酪氨酸或谷氨酸对精氨酸的取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”或“Y167G,A+R170G,A”指以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
优选的变体：
如以下实施例中所概述的，本发明人已经制备了许多优选的凝乳酶多肽变体，其以比相应的亲本多肽更低的频率切割β-酪蛋白，同时至少维持其凝结活性。
具有降低的β-酪蛋白切割频率的优选变体：
本发明的分离的凝乳酶多肽变体的凝结比活性(IMCU/mg总蛋白质)是特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的凝结比活性的至少80％，包括凝结比活性(IMCU/mg总蛋白)为特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的凝结比活性的至少85％、至少90％、至少95％或至少97％。
本发明的分离的凝乳酶多肽变体可衍生自亲本多肽，与SEQ ID NO:4的多肽(骆驼凝乳酶)具有至少80％，例如至少例如80％、85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
本发明的分离的凝乳酶多肽变体可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，其中所述一个或多个取代、缺失或插入相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列被列出：Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242或I96，例如Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E和/或I96L。
在一个相关方面，本发明的分离的凝乳酶多肽变体可包含取代的组合，其中所述取代的组合选自包括以下的列表：
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+N249+G251+L253；
Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251；
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249；
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251；Y11+I96+S164+L222+R242；
Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251或Y11I+K19+D59+I96+S164++R242+N249+G251，例如
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D；
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E；
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D或
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D，并且其中每个取代均相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列被列出。
在一个相关方面，与具有凝乳酶活性的亲本多肽相比，所述变体可包含一个或多个列出位置处的改变，其中所述改变包括在对应于以下任何位置的至少一个氨基酸位置处的取代、缺失或插入：11、130、132、32、226、266、12、221、255、277、222、253、157、260、271、76、19、183、164、263、51、239、307、67、251、61、288、83、59、309、273、251、154、21、203、180、294、289、215、144、303、105、284、127、248、321、205、262、231、316、256、158、59、249、166、242或96，其中所述亲本多肽的所述氨基酸位置通过所述亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽的比对来确定，并且所述亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少65％的序列同一性，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381，其中所述分离的凝乳酶多肽变体以比相应的亲本多肽低的频率切割β-酪蛋白。
在一个优选实施方案中，所述亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少80％，例如至少例如85％、95％、97％、98％、99％的序列同一性。
优选地，如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体是变体，其中所述变体与从中获得所述变体的亲本肽相比具有更低的β-酪蛋白切割频率。
更优选地，如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体是变体，其中所述变体具有
-与包含本文的SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶相比产生更低的β-酪蛋白切割频率的凝乳酶活性；和
-与包含本文的SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶相比产生更低的β-酪蛋白切割频率的凝乳酶活性。
如上文所讨论的，在本文中使用本文被公开为SEQ ID NO:2的公知的骆驼凝乳酶序列的成熟多肽作为用于确定本文相关的目标凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置的参考序列。
如上文所讨论的，基于例如本文讨论的计算机序列比对程序，确定本文相关的目标凝乳酶多肽(例如骆驼、绵羊、牛等)的本文相关氨基酸位置是本领域技术人员的常规工作。
术语“亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少65％的序列同一性”可被视为涉及对用于制备其本文相关变体的亲本凝乳酶多肽的基于序列的限定。
在一个优选的实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少92％的序列同一性，更优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％的序列同一性，且甚至更优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少97％的序列同一性。可以优选的是，亲本多肽是SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，具有凝乳酶活性的本文相关亲本多肽可以已经例如是例如相应的野生型凝乳酶的变体。
换句话说，本文相关的分离的凝乳酶多肽变体可包含在除例如本文所要求的位置以外的其它位置的改变(例如取代)。
关于本文图1中所示的凝乳酶序列，绵羊与牛SEQ ID NO:1具有94.5％的序列同一性；双峰骆驼(骆驼)与牛SEQ ID NO:1具有83.2％的序列同一性；猪与牛SEQ ID NO:1具有80.3％的序列同一性，并且大鼠与牛SEQ ID NO:1具有71.9％的序列同一性。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，例如绵羊、双峰骆驼、骆驼、猪或大鼠成熟凝乳酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶-即SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到381)的本文相关序列同一性百分比与上述序列同一性百分比相对类似。
优选地，如本文所述的分离的牛凝乳酶多肽变体是变体，其中所述变体具有与包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的β-酪蛋白切割频率相比产生更低的β-酪蛋白切割频率的凝乳酶活性。
如上文所讨论的，在本文的工作实施例中，使用SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的多肽作为亲本多肽制备变体，此类变体在本文中可被称为骆驼凝乳酶变体。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，分离的凝乳酶变体可包含在上面给出的氨基酸位置之外的其他氨基酸位置的改变(例如取代)。
例如，与SEQ ID NO:2的野生型骆驼凝乳酶多肽相比，具有例如5-10个改变(例如取代)的骆驼凝乳酶变体仍将是与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的亲本多肽。
可优选的是，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于30个氨基酸改变(例如取代)，或者可优选的是，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于20个氨基酸改变(例如取代)，或者可优选的是，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如取代)，或者可优选的是，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体包含少于5个氨基酸改变(例如取代)。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，上文的术语“分离的变体多肽与SEQID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有小于100％的序列同一性”涉及本文所述的分离的骆驼凝乳酶变体不应具有与公知的SEQ ID NO:2的野生型骆驼凝乳酶蛋白序列100％相同的多肽序列。
一个优选的实施方案涉及分离的骆驼凝乳酶多肽变体，其中所述改变包括在对应于本文所要求的任何位置的至少一个氨基酸位置的取代、缺失或插入。
可优选的是，至少一个改变是取代，即一个本文相关的优选实施方案涉及分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包括对应于本文所要求的任何位置的至少一个氨基酸位置处的取代。
具有凝乳酶活性的优选亲本多肽：
优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)和/或SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽具有至少80％，例如85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
仅作为示例，本文适合的相关亲本多肽可例如是牛凝乳酶A，如本领域已知的，与本文的SEQ ID NO:1的牛凝乳酶B相比，牛凝乳酶A可仅具有一个氨基酸差异。
在一个优选的实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少90％的序列同一性，更优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％的序列同一性，且甚至更优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少97％的序列同一性。可优选亲本多肽是SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，具有凝乳酶活性的本文相关亲本多肽可已经例如是例如相应的野生型凝乳酶的变体。
例如，与SEQ ID NO:1的成熟野生型牛凝乳酶多肽相比，具有例如5-10个改变(例如取代)的牛凝乳酶变体仍将是与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的亲本多肽。
换句话说并且通常，本文相关的分离的凝乳酶多肽变体可包含在除本文所要求的位置以外的其它位置的改变(例如取代)。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，与SEQ ID NO:2(骆驼)的成熟多肽具有至少90％序列同一性的亲本多肽仍在基于SEQ ID NO:1(牛)的序列同一性要求之内，即它将是与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少65％序列同一性的亲本多肽。
在一个优选的实施方案中，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少92％的序列同一性，更优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％的序列同一性，且甚至更优选地，亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少97％的序列同一性。可优选亲本多肽是SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽。
如本领域技术人员在本上下文中所理解的，分离的凝乳酶变体可包含在上面给出的氨基酸位置之外的其他氨基酸位置的改变(例如取代)。
例如，与SEQ ID NO:1的野生型牛凝乳酶多肽相比，具有例如5-10个改变(例如取代)的牛凝乳酶变体仍将是与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽具有至少95％序列同一性的亲本多肽。
可优选，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于30个氨基酸改变(例如取代)，或者可优选，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于20个氨基酸改变(例如取代)，或者可优选，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如取代)，或者可优选，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于5个氨基酸改变(例如取代)。
SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶多肽与SEQ ID NO:1的牛多肽(即1位到381位的完整SEQ ID NO:1，其包括前序列和原序列)具有84％的序列同一性。
用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法
如上文所讨论的，如本领域已知的，本领域技术人员可基于其公知常识常规地产生和纯化凝乳酶和凝乳酶变体。
换句话说，一旦本领域技术人员拥有具有目标凝乳酶活性的本文相关亲本多肽(例如来自牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠)，则制备此类目标亲本凝乳酶的变体是本领域技术人员的常规工作。
产生和分离凝乳酶(变体或亲本)的适合方法的示例可以是众所周知的，例如，如在诸如WO02/36752A2(Chr.Hansen)中所述的基于真菌重组表达/产生的技术。
对本领域技术人员来说，在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置处进行改变也是常规工作，其中所述改变包括在至少一个氨基酸位置处的取代、缺失或插入。
如本领域技术人员已知的，这可例如通过基于被称为定点诱变和重组表达/产生的技术来完成。
对于本领域技术人员来说，确定本文相关的亲本多肽(例如骆驼野生型凝乳酶或牛野生型凝乳酶)和/或本文相关的变体是否具有凝乳酶活性也是常规工作。如本领域已知的，凝乳酶特异性可通过被称为C/P比来确定，所述C/P比通过将凝结比活性(C)除以蛋白水解活性(P)来确定。
如本领域已知的，更高的C/P比通常意味着由于非特异性蛋白质降解而导致的蛋白质例如在奶酪制造期间的损失被降低，即奶酪的产量提高。
还如本领域已知的，可使用本领域技术人员可利用的标准方法来确定β-酪蛋白切割和β-酪蛋白(包括β(193-209))形成。
用于制备基于乳的产品的方法
如上文所讨论的，可根据本领域使用如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体，例如以制备基于乳的目标产品(例如奶酪产品)。
如上文所讨论的，本发明的一个方面涉及用于制备食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体添加到食品或饲料成分中，和实施进一步的制造步骤以获得所述食品或饲料产品。
优选地，食品或饲料产品是基于乳的产品，并且其中所述方法包括将有效量的如本文所述的分离的凝乳酶多肽变体添加到乳中和实施进一步制造步骤以获得基于乳的产品。
例如，本发明的凝乳酶多肽变体可在乳发酵后被添加到基于乳的产品。在一个方面，作为生产奶酪的方法的一部分，添加本发明的凝乳酶多肽变体用于发酵乳产品的凝固。
乳可以例如是豆乳、绵羊乳、山羊奶、水牛乳、牦牛乳、羊驼乳、骆驼乳或牛乳。
基于乳的产品可以例如是发酵乳产品，例如夸克(quark)或奶酪。
食品和饲料产品
本发明还提供包含本发明的凝乳酶多肽变体或根据本发明的方法可获得的凝乳酶多肽变体的食品和饲料产品。食品和饲料产品优选发酵食品，例如发酵乳产品，包括奶酪和夸克。
在再一相关方面，本发明涉及用于制备食品或饲料产品的方法，其包括添加有效量的根据本发明的分离的凝乳酶多肽变体。优选地，食品或饲料产品是基于乳的产品。
本发明的凝乳酶多肽变体还可用于制备奶酪的过程，例如以减少奶酪的苦味。
实施例
实施例1：凝乳酶蛋白质序列和变体序列的比对和编号
使用如由EBI(EBI,多序列比对工具,CLUSTALW”,http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)提供以及如Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG(2007)Bioinformatics 23(21),2947-2948中所述的ClustalW算法对凝乳酶蛋白质序列进行比对。
多个序列比对的ClustalW2设置为蛋白质权重矩阵＝BLOSUM，缺口开放(GAPopen)＝10，缺口延伸(GAP EXTENSION)＝0.05，缺口距离(GAP DISTANCE)＝8，无末端缺口(No End Gap)，迭代(ITERATION)＝无，NUMITER＝1，聚类(CLUSTERING)＝NJ
作为参考序列，使用牛凝乳酶B前凝乳酶原(Genbank保藏号P00794-本文被公开为SEQ ID NO:1)，其中N-末端甲硫氨酸具有编号1(MRCL……)并且C-末端异亮氨酸(在蛋白质序列……LAKAI中)具有编号381。
实施例2：凝乳酶变体的设计
使用不同的策略设计凝乳酶变体。
当提到骆驼凝乳酶时，是指包含本文SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶。
SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶可被视为用于制备其骆驼凝乳酶变体的具有凝乳酶活性的本文相关亲本多肽。
当提到牛凝乳酶时，是指包含本文SEQ ID NO:1的多肽的牛凝乳酶。
SEQ ID NO:1的牛凝乳酶可被视为用于制备其牛凝乳酶变体的具有凝乳酶活性的相关亲本多肽。
骆驼凝乳酶的变体1到269和367到461是基于与牛凝乳酶B相比具有25％或更高同一性的一大组公知的天冬氨酸蛋白酶序列的比对而设计的。
通常在物种之间氨基酸变异水平高的区域中引入变异，而不改变保守区域。根据系统发育、结构和实验信息选择氨基酸取代，以鉴别具有高的对β-酪蛋白切割显示出有益作用的概率的变化。在每个变体构建体中引入多个变异，确保每个单一突变存在于多个变体构建体中，以将各种取代之间的共变效应降到最低。使用实验数据的机器学习和统计分析来确定氨基酸取代对凝乳酶变体的测量的凝固性能的相对作用(参考文献14、15)。
基于牛凝乳酶(PDB代码：4AA8)和骆驼凝乳酶(PDB代码：4AA9)的详细结构分析来设计变体271到366。基于各自氨基酸侧链的化学性质和它们对酪蛋白底物结合或一般酶性质的预期影响来选择变异。变体271至346中的大多数氨基酸取代是在底物结合槽内或结构紧邻底物结合槽处的序列位置上进行的，或在与被结合的酪蛋白底物接触的二级结构单元中进行的。此外，在蛋白质表面上的位置进行变化，所述变化改变这些区域的电荷概况(profile)(参考文献5)，因此预期对酶性能有影响。基于牛和骆驼凝乳酶中的N-末端序列的不同结构构象制成变体347到366。在底物结合槽内与骆驼凝乳酶中的N-末端相互作用的位置进行氨基酸取代。
实施例3：凝乳酶变体酶材料的制备
将所有凝乳酶变体合成为合成基因并克隆到真菌表达载体例如pGAMpR-C中(描述于WO02/36752A2中)。
使用本领域技术人员已知的标准分子生物学方案将所述载体转化到大肠杆菌中并纯化质粒DNA。
将变体质粒单个地转化到黑曲霉(Aspergillus niger)或构巢曲霉(Aspergillusnidulans)菌株中，并且基本上如WO02/36752A2中所述生产蛋白质，并使用标准色谱技术加以纯化。
如本领域已知的，本领域技术人员可基于其公知常识来生产和纯化凝乳酶和凝乳酶变体，例如本文所述的牛凝乳酶变体和骆驼凝乳酶变体。
实施例4：凝乳酶比活性的确定
4.1乳凝活性的确定
使用REMCAT方法来确定乳凝活性，该方法是由国际乳品联合会(InternationalDairy Federation)开发的标准方法(IDF方法)。
从用0.5g/l氯化钙溶液(pH≈6.5)由低热低脂乳粉制备的标准乳基质的可见絮凝所需的时间确定乳凝活性。将凝乳酶样品的凝结时间与具有已知的乳凝活性并且具有与样品相同的酶组成(通过IDF标准110B确定)的参考标准物的凝结时间进行比较。在相同的化学和物理条件下测量样品和参考标准物。使用84mM乙酸缓冲液(pH 5.5)将变体样品调节到大约3IMCU/ml。此后，在置于水浴中的玻璃试管中，向10ml预热乳(32℃)中添加200μl酶制剂，所述水浴能够在持续搅拌下维持32℃±1℃的恒温。或者，如上所述将20μL酶制剂添加到1mL预热乳中。
相对于具有与根据下式的样品相同的酶组成的标准物以国际乳凝单位(International Milk-Clotting Unit)(IMCU)/ml计算凝乳酶的总乳凝活性(强度)：
S标准物：凝乳酶的国际参考标准物的乳凝活性。
T标准物：针对标准物稀释获得的凝结时间(秒)。
D样品：样品的稀释因子
D标准物：标准物的稀释因子
T样品：针对稀释的凝乳酶样品获得的从添加酶到絮凝时的凝结时间(秒)
对于文库(library)1、3、4和6变体以及通过结构设计获得的变体的凝结活性确定，使用μIMCU方法代替REMCAT方法。与REMCAT相比，通过在96孔微量滴定板中在UV/VIS板读数器中在800nm处进行OD测量来确定μIMCU测定中的凝乳酶变体的絮凝时间。在每个板上记录具有已知凝结强度的各种稀释度的参考标准物的标准曲线。通过在84mM乙酸盐缓冲液、0.1％triton X-100(pH 5.5)中稀释酶来制备样品。通过将250uL含有4％(w/w)低热低脂乳粉和7.5％(w/w)氯化钙(pH≈6.5)的标准乳底物添加到25uL酶样品中来开始在32℃的反应。基于相对于标准曲线的样品絮凝时间确定以国际乳凝单位(IMCU)/ml表示的凝乳酶变体的乳凝活性。
4.2总蛋白质含量的确定
使用来自Thermo Scientific的Pierce BCA蛋白质测定试剂盒，依照提供商的说明确定总蛋白质含量。
4.3凝结比活性的计算
通过将凝结活性(IMCU/ml)除以总蛋白质含量(mg总蛋白质/ml)来确定凝结比活性(IMCU/mg总蛋白质)。
实施例5：β-酪蛋白切割的确定
β-酪蛋白水解活性的确定
通过确定在pH 4.6提取的水溶性肽的概况(profile)来表征凝乳酶介导的乳蛋白质的蛋白水解。将在96孔板中制备的无培养物奶酪模型用于研究。简单地说，将来自丹麦，的添加有葡糖酸-δ-内酯(GDL)和氯化钙的750μl脱脂乳等分到96深孔板的孔中。在将GDL添加到乳中10min后，将凝乳酶变体添加到板的各个孔中，至最终活性为0.05IMCU/ml。在添加凝乳酶30min后，通过用移液管尖头(tip)充分搅拌凝固物来切割形成的凝固物；每个孔都使用了新的尖头。随后，在凝乳之前将板再静置60min，并通过将板以2500g离心10min来分离乳清。在凝乳、切割和凝缩期间，将乳保持在30℃。最后，从板中倾析乳清，并将留在板中的凝固乳酪(rennet curd)在室温储存4天。通过向各孔中添加500μl的0.5M柠檬酸三钠并在37℃将板轻轻振荡24小时来提取肽。然后通过将盐酸添加到4.4-4.5的最终pH使此时最终完全溶解的凝固乳酪沉淀。将板在离心机中旋转沉淀，并回收上清液用于pH4.5可溶性肽的进一步分析。
使用与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC确定pH 4.5可溶性肽的概况。通过使用与质谱仪(G6540A Q-TOF,Agilent Technologies A/S,Santa Clara,California,USA)偶联的液相色谱系统(Agilent 1290infinity,Agilent Technologies A/S,Santa Clara,California,USA)进行分析。LC系统中的柱为Ascentis Express Peptide ES-C18m，2.7μm，100x2.1mm(Supelco,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)。流动相由洗脱液A(于水中的0.1％甲酸)和洗脱液B(乙腈：于水中的0.1％甲酸，9:1)组成。在用2％B平衡柱后，注入10μL的样品体积。通过梯度洗脱分离所述肽，所述梯度洗脱通过在15个柱体积内将洗脱液B从2％增加到50％而产生。流动速率为0.44mL/min。通过在214nm处连续测量UV吸光度来检测肽。通过运行100到2000m/z的MS扫描来收集质谱。对来自每次扫描的两个最强离子进行MS/MS分析。制备由等体积的所有分析样品组成的混合样品，并针对每12个样品分析该样品。使用MSConvert 3.0.6618版将MS数据从Agilent.d格式转换为.mzml文件。所有进一步的数据分析均使用R 3.1.3进行。使用R包'MSGFplus'1.05版从MS/MS谱鉴别肽。用于肽鉴别的搜索数据库限于牛乳蛋白质：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳过氧化物酶和乳铁蛋白。丝氨酸磷酸化和甲硫氨酸氧化作为可变修饰被包括在内。R软件包'xcms'v.1.42.0被用于根据Smith等(2006)对样品集中的样本的峰进行检测和分组。Massifquant法用于峰检测并且峰的分组基于密度法。将同一性分配给分组的峰，得到鉴别的肽(包括β-酪蛋白193-209)的定量表。
位置和突变对β-酪蛋白切割的作用的统计分析
使用统计机器学习方法和基于PCA的分析来确定多重取代文库(libraries)1-3、4和6的变体中存在的所有单突变对β-酪蛋白的192/193位的切割的影响。
结果
多重取代文库1
如上所述，产生各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。牛凝乳酶和骆驼凝乳酶两者均被用来作为参考。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表1：骆驼凝乳酶变体1-95对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的切割％给出。
在表1中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白在192/193位的切割的数据。由于所有酶变体在实验中均以0.05IMCU/mL的归一化浓度使用，因此低β-酪蛋白切割表明相应变体对κ-酪蛋白104/105切割相对于对β-酪蛋白192/193切割的高特异性，而非一般酶活性低。
为对β-酪蛋白的野生型蛋白水解活性的一半或更小的变体以粗体突出显示(变体9、16、26、39、47、51、60、68、78、84、95)。在这些中，突变V32L、L130I和S132A与所示的全部变体组中存在的突变模式相比占有更大的比例。具有突变V32L的六种变体中的四种、具有突变L130I的六种变体中的四种和具有突变S132A的五种变体中的三种显示等于或小于野生型骆驼凝乳酶的50％的β-酪蛋白192/193切割。
在骆驼凝乳酶的三维结构中，V32位与底物肽序列的P1残基相互作用(图2)，而L130位和S132位分别与P5′(L130)以及P2′和P6′(S132)相互作用(图3；参考文献5-10)。凝乳酶底物结合位点中的三个位置的定位表明突变V32L、L130I和S132A通过与κ-和β-酪蛋白的直接相互作用在恒定的凝固剂浓度下，导致较低的β-酪蛋白192/193切割，并因此导致β-酪蛋白片段β(193-209)的较低产生。在整个变体组中显示最低β-酪蛋白192/193切割的变体95含有突变V32L和L130I两者。这表明突变对酪蛋白底物特异性的作用的加和性。
多重取代文库2
如所述，产生另一组各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。牛凝乳酶和骆驼凝乳酶两者均被作为参考。使用REMCAT方法确定凝结活性。
表2：骆驼凝乳酶变体96-143对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的切割％给出。
在表2中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白在192/193位的切割的数据。由于所有酶变体在实验中均以0.05IMCU/mL的归一化浓度使用，因此低β-酪蛋白切割表明相应变体对κ-酪蛋白104/105切割相对于对β-酪蛋白192/193切割的高特异性，而非一般酶活性低。
对β-酪蛋白具有小于25％的野生型蛋白水解活性的变体以粗体突出显示(变体110、112、122、125、132)。在这些中，突变V32L与所示的全部变体组中存在的突变模式相比占有更大的比例。具有突变V32L的六种变体中的五种显示等于或小于25％的野生型骆驼凝乳酶的β-酪蛋白192/193切割。这些结果支持先前变体组的发现和结论。
多重取代文库3
如所述，产生第三组各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。牛凝乳酶和骆驼凝乳酶两者均用來作为参考。使用μIMCU方法确定凝结活性。
表3：骆驼凝乳酶变体144-179对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)对β-酪蛋白的切割％给出。
在表3中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白在192/193位的切割的数据。由于所有酶变体在实验中均以0.05IMCU/mL的归一化浓度使用，因此低β-酪蛋白切割表明相应变体对κ-酪蛋白104/105切割相对于对β-酪蛋白192/193切割的高特异性，而非一般酶活性低。
对β-酪蛋白具有小于10％的野生型蛋白水解活性的变体以粗体突出显示(变体150、161、165)。在这些中，突变V32L与所示的全部变体组中存在的突变模式相比占有更大的比例。具有突变V32L的所有三种变体均显示与野生型骆驼凝乳酶的β-酪蛋白192/193切割相比小10％。
仅来自该变体组的一种变体(变体176)显示与野生型骆驼凝乳酶的β-酪蛋白192/193切割相比高于50％。这也是该组中缺少突变L12M的唯一变体。
位置L12位于靠近骆驼凝乳酶N-末端的在所述酶的底物结合槽中被结合的序列延伸部(sequence stretch)(图4)。已描述在骆驼凝乳酶中，当没有底物结合时，N-末端序列封闭所述酶的底物结合槽(参考文献5)。酪蛋白底物分子需要替代该N-末端序列以结合到活性位点并随后被切割。凝乳酶中使该无活性形式的酶稳定的突变可因此降低底物结合，并因此影响酪蛋白切割特异性。我们推断用于突变L12M的这种作用模式。在骆驼凝乳酶的三维结构中，L12位和V32位彼此直接接触。除了直接影响β-酪蛋白结合之外，V32L还可使所述酶的无活性形式稳定。由于包含这两种突变的变体(150、161、165)在该组的所有变体中均显示最低的β-酪蛋白192/193切割，因此它们对酪蛋白底物特异性的影响似乎是加合性的。
多重取代文库1-3的突变分析
基于文库1-3变体的蛋白水解数据进行位置和突变对β-酪蛋白切割的作用的统计分析。用于降低的β-酪蛋白切割的最有益突变示于表4中。
表4：基于统计分析的突变对降低的β-酪蛋白192/193切割的作用(平均值)和标准偏差(sd)。
基于所获得的结果可得出结论，表4中所示的突变降低β-酪蛋白192/193的切割，其中上述突变L130I、S132A、V32L和L12M属于具有最强影响的突变(在表4中以粗体突出显示)。
由于表4中所示的突变导致β-酪蛋白的C-末端片段β(193-209)的产生较少，因此它们代表了凝乳酶变体中的优选突变，所述变体由于对β-酪蛋白的切割降低而用于制备具有较少苦味的奶酪。
多重取代文库4
如上文所述，产生另一组各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。包括骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)作为参考。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表5：骆驼凝乳酶变体180-222对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX)对β-酪蛋白的切割％给出。
在表5中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白192/193切割的数据。所有变体均揭示与野生型骆驼凝乳酶相比44％至93％降低的蛋白水解活性。
多重取代文库4的突变分析
基于文库4变体的蛋白水解数据进行位置和突变对β-酪蛋白切割的作用的统计分析。用于降低的β-酪蛋白切割的最有益突变示于表6中。
表6：基于统计分析的突变对降低的β-酪蛋白192/193切割的作用(平均值)和标准偏差(sd)。
基于所获得的结果可得出结论，表6中所示的突变降低β-酪蛋白192/193切割。
由于这些突变导致β-酪蛋白的C-末端片段β(193-209)的产生较少，因此它们代表了凝乳酶变体中的优选突变，所述变体由于对β-酪蛋白的切割降低而用于制备具有较少苦味的奶酪。
多重取代文库5
如上文所述，产生另一组各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)用来作为参考。
使用REMCAT方法确定凝结活性。
表7：骆驼凝乳酶变体223-269对β-酪蛋白的192/193位的切割。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)对β-酪蛋白的切割％给出。
在表7中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白192/193切割的数据。在47种变体中，有46种揭示与野生型骆驼凝乳酶的蛋白水解活性相比降低16％至83％。
多重取代文库5的突变分析
基于文库5变体的蛋白水解数据进行位置和突变对β-酪蛋白切割的作用的统计分析。用于降低的β-酪蛋白切割的最有益突变示于表8中。
表8：基于统计分析的突变对降低的β-酪蛋白192/193切割的作用(平均值)和标准偏差(sd)。
基于所获得的结果可得出结论，表8中所示的突变降低β-酪蛋白192/193切割。
由于这些突变导致β-酪蛋白的C-末端片段β(193-209)的产生较少，因此它们代表了凝乳酶变体中的优选突变，所述变体由于对β-酪蛋白的切割降低而用于制备具有较少苦味的奶酪。
骆驼凝乳酶的基于结构的变异
利用通过蛋白质结构分析确定的位置中的氨基酸变化制成骆驼凝乳酶(SEQ IDNO:2)的变体(表9)。将突变N100Q和N291Q引入到这些变体和参考骆驼凝乳酶(CamUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的、均质的蛋白质样品。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表9：骆驼凝乳酶变体270-308对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以非糖基化骆驼凝乳酶(CamUGly)的切割％给出。
基于表9中所示的结果可得出结论，突变K19T、Y21S、V32L、D59N、H76Q、I96L、L130I、S132A、Y190A、L222I、S226T、D290E、D290L、R242E、R242Q、Y243E、G251D、R254S、S273D、S273Y、Q280E、F282E、G289S和V309I将β-酪蛋白192/193的切割降低超过10％。
由于这些突变导致β-酪蛋白的C-末端片段β(193-209)的产生较少，因此它们代表了凝乳酶变体中的优选突变，所述变体由于对β-酪蛋白的切割降低而用于制备具有较少苦味的奶酪。
表9中所示的具有降低的β-酪蛋白192/193切割的24种变体中的10种在底物结合槽内或结构邻近底物结合槽处携带突变(V32L、H76Q、L130I、S132A、Y190A、L222I、S226T、G289S、D290E、D290L)(图5)，表明这些突变对β-酪蛋白结合的直接影响。
表9中所示的具有降低的β-酪蛋白192/193切割的24种变体中的9种在蛋白质表面上位于结合槽附近的独特区域中携带突变(R242E、R242Q、Y243E、G251D、R254S、S273D、S273Y、Q280E、F282E)，如图6中所见。其已表明该区域支持通过与其在P10位到P4位(参考文献10)处带正电荷的序列Arg96到His102(参考文献5、16-18)相互作用来结合κ-酪蛋白底物。引入的突变可通过降低蛋白质表面上该区域的净电荷来加强这些相互作用。κ-酪蛋白的增加结合将最终抑制其他底物(例如β-酪蛋白)的结合和水解。结果显示该区域中的单个氨基酸取代可显著增加C/P。
骆驼凝乳酶中的负电荷组合
利用将负电荷引入上述表面区域中的突变组合(R242E、Y243E、G251D、N252D、R254E、S273D、Q280E)制备骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)的更多变体。将突变N100Q和N291Q引入到这些变体和参考骆驼凝乳酶(CamUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的、均质的蛋白质样品(表10)。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表10：骆驼凝乳酶变体309-323对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以非糖基化骆驼凝乳酶(CamUGly)的切割％给出。
示于表10中的所有变体均揭示与非糖基化骆驼凝乳酶相比降低的β-酪蛋白切割。结论为可通过各自突变的组合进一步增强通过将负电荷引入凝乳酶结构上的P10-P4相互作用区域而对β-酪蛋白切割的抑制。
牛凝乳酶的基于结构的变异
利用通过蛋白质结构分析确定的位置中的氨基酸变化制成牛凝乳酶(SEQ ID NO:1)的变体(表11)。将突变N252Q和N291Q引入到这些变体和参考牛凝乳酶(BovUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的、均质的蛋白质样品。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表11：牛凝乳酶变体325-346对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以非糖基化牛凝乳酶(BovUGly)的切割％给出。
除I136V外，所有突变均导致表11所示变体中β-酪蛋白192/193的切割增加。值得注意地，虽然取代I136V、Q242R、D251G、S289G和E290D增加了牛凝乳酶的β-酪蛋白切割，但在骆驼凝乳酶中通过各自的逆突变V136I、R242Q、G251D、G289S和D290E观察到降低的β-酪蛋白切割(表9)。在32位看到类似的作用。虽然V32L导致骆驼凝乳酶的降低的β-酪蛋白切割，但L32突变为I(与V具有结构相似性的β支链疏水氨基酸)导致牛凝乳酶的增加的β-酪蛋白切割。这证实这些氨基酸变化对不同物种间凝乳酶的特异性施加类似的作用。
骆驼凝乳酶N末端的变异
利用在通过底物结合槽内N-末端序列Y11-D13的分子相互作用的蛋白质结构分析所确定的位置处的氨基酸变化制备骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2)的变体(表12)。将突变N100Q和N291Q引入到这些变体和参考骆驼凝乳酶(CamUGly)的N-糖基化位点中以产生非糖基化的、均质的蛋白质样品。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表12：骆驼凝乳酶变体347-366对β-酪蛋白在192/193位的切割。数字以非糖基化骆驼凝乳酶(CamUGly)的切割％给出。
对骆驼凝乳酶结构的分析指导N-末端序列Y11-D13以及D290位(Y11的潜在相互作用伴侣)的变异(图7)。由于酪蛋白底物与N-末端凝乳酶序列竞争结合槽内的结合，因此预期改变结合槽和基序Y11-D13之间相互作用的氨基酸取代会影响对各种酪蛋白底物的酶活性，并因此影响β-酪蛋白192/193的切割。各自的变体347-366的结果显示β-酪蛋白切割的强变异(表12)。值得注意地，变体353和355(两者均带有突变D290E)揭示降低的β-酪蛋白切割。
多重取代文库6
如上文所述，产生另一组各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)被用来作为参考。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表13：骆驼凝乳酶变体367-416对β-酪蛋白的192/193位的切割。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)的切割％给出。
在表13中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白192/193切割的数据。所有50种变体均揭示与野生型骆驼凝乳酶的蛋白水解活性相比降低19％至97％。
多重取代文库6的突变分析
基于文库6变体的蛋白水解数据进行位置和突变对β-酪蛋白切割的作用的统计分析。用于降低的β-酪蛋白切割的最有益突变示于表14中。
表14：基于统计分析的突变对降低的β-酪蛋白192/193切割的作用(平均值)和标准偏差(sd)。
基于所获得的结果可得出结论，表14中所示的突变降低β-酪蛋白192/193切割。
由于这些突变导致β-酪蛋白的C-末端片段β(193-209)的产生较少，因此它们代表了凝乳酶变体中的优选突变，所述变体由于对β-酪蛋白的切割降低而用于制备具有较少苦味的奶酪。
如上文所述，产生另一组各自与野生型相比具有多重取代的骆驼凝乳酶变体并加以分析。所有变体均具有与骆驼凝乳酶(SEQ ID NO:2的成熟多肽)除了表中提到的变异之外相同的氨基酸序列。骆驼凝乳酶(CHY-MAX M)被用来作为参考。
使用μIMCU方法确定凝结活性。
表15：骆驼凝乳酶变体417-461的对β-酪蛋白在192/193位的切割(β)、特异性凝结(C)、蛋白水解(P)和C/P比率。数字以野生型骆驼凝乳酶(CHY-MAX M(CMM))的％给出。
在表15中显示骆驼凝乳酶变体，及其关于β-酪蛋白192/193切割的数据。所有45变体均显示与野生型骆驼凝乳酶相比降低的蛋白水解活性。
参考文献
1.A.Kumar,S.Grover,J.Sharma,V.K.Batish,Crit.Rev.Biotechnol.2010,30,243-258.
2.M.W.K.B.Qvist,M.Rasmussen,J.F.K.Vogensen,Y.Dairy Sci.2012,92,593-612.
3.K.KastbergF.P.Rattray,Y.J.Agric.Food Chem.2012,60,11421-11432.
4.P.L.H.McSweeney,Int.J.Dairy Technol.2004,57,127-144.
5.J.Langholm Jensen,A.J.-C.Navarro Poulsen,M.K.Harboe,J.B.Simonsen,A.M.Lorentzen,K.J.M.van den Brink,K.B.Qvist,S.Larsen,ActaCryst.2013,D69,901-913.
6.S.Chitpinityol,D.Goode,M.J.C.Crabbe,Food Chem.1998,62,133-139.
7.G.L.Gilliland,E.L.Winborne,J.Nachman,A.Wlodawer,Proteins 1990,8,82-101.
8.D.S.Palmer,A.U.Christensen,J.L.Celik,K.Bruun Qvist,B.Biochemistry 2010,49,2563-2573.
9.J.D.S.Palmer,B.J.Agric.Food Chem.2013,61,7949-7959.
10.I.Schechter,A.Berger,Biochem.Biophys.Res.Commun.1967,425,497-502.
11.L.K.Creamer,N.F.Olsen,J.Food Sci.1982,47:631-636
12.N.Bansal,M.A.Drake,P.Piraino,M.L.Broe,M.Harboe,P.F.Fox,P.L.H.McSweeney,Int.Dairy J.2009,19:510-517.
13.A.C.Moynihan,S.Govindasamy-Lucey,J.J.Jaeggi,M.E.Johnson,J.A.Lucey,P.L.H.McSweeney,J.Dairy Sci.2014,97:85-96.
14.J.Ehren,S.Govindarajan,B.Moron,J.Minshull,C.Khosla,Prot.Eng.Des.Sel.2008,21,699-707.
15.S.Govindarajan,B.Mannervik,J.A.Silverman,K.Wright,D.Regitsky,U.Hegazy,T.J.Purcell,M.Welch,J.Minshull,C.Gustafsson,ACS Synth.Biol.2015,4,221-227.
16.M.Newman,M.Safro,C.Frazao,G.Khan,A.Zdanov,I.J.Tickle,T.L.Blundell,N.Andreeva,J.Mol.Biol.1991,221,1295-1309.
17.E.Gustchina,L.Rumsh,L.Ginodman,P.Majer,N.Andreeva,FEBS Lett.1996,379,60-62.
18.S.Visser,C.J.Slangen,P.J.van Rooijen,Biochem.J.1987,244,553-558.
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<110> 科.汉森有限公司
<120> 具有改善的性质的凝乳酶变体
<130> P5885PC00
<160> 4
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 381
<212> PRT
<213> 牛 （Bovine）
<400> 1
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Val Phe Ala Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Ala Glu Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr Lys Gly Lys Ser Leu Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Lys Glu His Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Lys Gln Gln
35 40 45
Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Tyr Ser Gly Phe Gly Glu Val Ala Ser Val
50 55 60
Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Ala Cys Lys Asn
100 105 110
His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Gln Asn Leu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Gln Gly Ile Leu
130 135 140
Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Ile Gln Gln Thr
145 150 155 160
Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp Val Phe Thr Tyr Ala Glu
165 170 175
Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr
180 185 190
Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn Arg His Leu Val Ala Gln
195 200 205
Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Glu Ser Met Leu
210 215 220
Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp
225 230 235 240
Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val
245 250 255
Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu Gly Gly Cys Gln Ala Ile
260 265 270
Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu
275 280 285
Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln Asn Gln Tyr Gly Glu Phe
290 295 300
Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met Pro Thr Val Val Phe Glu
305 310 315 320
Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Gln
325 330 335
Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Ser Glu Asn His Ser Gln
340 345 350
Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe
355 360 365
Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile
370 375 380
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 骆驼（Camelus）
<400> 2
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Gln Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Thr Arg Ile Pro Leu His Lys Gly Lys Thr Leu Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Arg Gln Gln
35 40 45
Tyr Ala Val Ser Ser Lys Tyr Ser Ser Leu Gly Lys Val Ala Arg Glu
50 55 60
Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Ile
65 70 75 80
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Val Cys Lys Asn
100 105 110
His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Arg Asn Leu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Glu Gly Phe Leu
130 135 140
Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Pro Asn Gln Thr
145 150 155 160
Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu Val Phe Thr Tyr Ser Glu
165 170 175
Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr
180 185 190
Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp Arg His Leu Val Ala Arg
195 200 205
Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Gly Ser Met Leu
210 215 220
Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp
225 230 235 240
Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val
245 250 255
Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val Gly Gly Cys Gln Ala Ile
260 265 270
Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu
275 280 285
Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu Asn Arg Tyr Gly Glu Phe
290 295 300
Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met Pro Thr Val Val Phe Glu
305 310 315 320
Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Lys
325 330 335
Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Gly Asp Asn Asn Ser Glu
340 345 350
Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe
355 360 365
Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile
370 375 380
<210> 3
<211> 323
<212> PRT
<213> 牛（Bos）
<400> 3
Gly Glu Val Ala Ser Val Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ile Tyr Leu Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu
20 25 30
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys
35 40 45
Ser Asn Ala Cys Lys Asn His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser
50 55 60
Thr Phe Gln Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ser Met Gln Gly Ile Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile
85 90 95
Val Asp Ile Gln Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp
100 105 110
Val Phe Thr Tyr Ala Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro
115 120 125
Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn
130 135 140
Arg His Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gln Glu Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr
165 170 175
Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln
180 185 190
Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu
195 200 205
Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Ile Leu Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln
225 230 235 240
Asn Gln Tyr Gly Glu Phe Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met
245 250 255
Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro
260 265 270
Ser Ala Tyr Thr Ser Gln Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln
275 280 285
Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg
290 295 300
Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ile
<210> 4
<211> 323
<212> PRT
<213> 骆驼（Camelus）
<400> 4
Gly Lys Val Ala Arg Glu Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val
20 25 30
Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys
35 40 45
Ser Asn Val Cys Lys Asn His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser
50 55 60
Thr Phe Arg Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ser Met Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile
85 90 95
Val Asp Pro Asn Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu
100 105 110
Val Phe Thr Tyr Ser Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro
115 120 125
Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp
130 135 140
Arg His Leu Val Ala Arg Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gln Gly Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr
165 170 175
Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln
180 185 190
Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val
195 200 205
Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Ile Leu Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu
225 230 235 240
Asn Arg Tyr Gly Glu Phe Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met
245 250 255
Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro
260 265 270
Ser Ala Tyr Thr Ser Lys Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln
275 280 285
Gly Asp Asn Asn Ser Glu Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg
290 295 300
Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ile

Claims (17)

1.一种分离的凝乳酶多肽变体，其特征在于
(a)所述分离的凝乳酶多肽变体的凝结比活性(IMCU/mg总蛋白)是特征在于SEQ IDNO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的凝结比活性的至少70％；并且
(b)所述分离的凝乳酶多肽变体以特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的β-酪蛋白切割频率的小于50％的频率切割β-酪蛋白，其中β-酪蛋白切割是通过对由孵育脱脂乳与所述凝乳酶变体或所述骆驼凝乳酶所获得的β-酪蛋白肽进行定量确定的，其中定量是通过与ESI-Q-TOF质谱仪偶联的RP-HPLC进行的。
2.根据权利要求1所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述亲本多肽与SEQ ID NO:4(骆驼凝乳酶)的所述多肽具有至少80％，例如至少例如85％、95％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述多肽变体具有特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的凝结比活性的至少70％，例如至少例如75％、80％、90％、100％、110％、120％、130％或150％的凝结比活性。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述多肽变体具有特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的小于50％，例如小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％或小于6％的非特异性蛋白水解活性(P)。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述多肽变体具有特征在于SEQ ID NO:4的分离的骆驼凝乳酶多肽的C/P比率的至少300％、400％、500％、600％、700％、800％、1000％、1200％、1400％或1600％的C/P比率。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个取代相对于SEQ ID NO:4的所述氨基酸序列被列出：Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242或I96。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含一个或多个氨基酸取代，其中所述一个或多个取代相对于SEQ ID NO:4的所述氨基酸序列被列出：Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E和/或I96L。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体包含选自包括以下的列表的取代的组合：
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D；
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E；
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D或
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D，
其中每个取代均相对于SEQ ID NO:4的氨基酸序列被列出。
9.一种用于制备根据权利要求1到8中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤：
(a)：在编码SEQ ID NO:4的多肽的DNA序列中的一个或多个位置处进行改变，其中所述改变包括在对应于以下任一位置的至少一个氨基酸位置上的取代：Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242和/或I96
(b)：产生并分离步骤(a)的经改变的多肽。
10.根据权利要求9所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中：
(a)所述变体包含以下取代中的一个或多个：Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E和/或I96L。
11.根据权利要求9或10所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中：
(a)所述变体包含以下取代的组合中的一个或多个，并且其中每个取代均相对于SEQID NO:4的所述氨基酸序列被列出：
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I；
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E；
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D；
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E；
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D或
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D。
12.一种用于制备食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的根据权利要求1到8中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体添加到食品或饲料成分中，和实施进一步的制造步骤以获得所述食品或饲料产品。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述食品或饲料产品是基于乳的产品。
14.食物或饲料产品，其包含根据权利要求1到8中任一项所述的凝乳酶多肽变体。
15.根据权利要求1到8中任一项所述的凝乳酶多肽变体在用于制备奶酪的方法中的用途。
16.根据权利要求15所述的凝乳酶多肽变体的用途，其用于制备帕斯塔费拉塔奶酪、切达奶酪、大陆型奶酪、软奶酪或白卤奶酪的过程中。
17.根据权利要求15或16的用途，其用于降低奶酪中的苦味。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108135193A (zh) * 2015-08-31 2018-06-08 科.汉森有限公司 具有改善性质的凝乳酶的变体
CN109688825A (zh) * 2016-05-19 2019-04-26 科·汉森有限公司 具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3201812A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
EP3110948A1 (en) 2014-02-26 2017-01-04 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
EP3310914B1 (en) 2015-06-22 2022-04-06 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved properties
US10961524B2 (en) 2016-05-19 2021-03-30 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
WO2023001832A1 (en) 2021-07-20 2023-01-26 Chr. Hansen A/S Composition for clotting milk, methods and uses thereof
WO2023194285A2 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Chr. Hansen A/S Aspartic protease, methods and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3549390A (en) * 1968-09-09 1970-12-22 Miles Lab Milk-clotting enzyme product and process therefor
CN102361975A (zh) * 2009-03-24 2012-02-22 名糖产业株式会社 来自微生物的改进型凝乳蛋白酶
CN104487572A (zh) * 2012-05-25 2015-04-01 科.汉森有限公司 具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体
CN106062187A (zh) * 2014-02-26 2016-10-26 科.汉森有限公司 具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0123928A3 (en) 1983-03-31 1986-02-05 Codon Genetic Engineering Laboratories Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity
US7390936B1 (en) 1999-08-23 2008-06-24 Sembiosys Genetics Inc. Commercial production of chymosin in plants
RU2192137C2 (ru) 2000-08-07 2002-11-10 Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" Способ производства сыра
EP2365069B1 (en) 2000-11-06 2018-02-21 Chr. Hansen A/S Method of producing non-bovine chymosin and use hereof
RU2296160C2 (ru) * 2001-02-23 2007-03-27 ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. Новые гены, кодирующие новые протеолитические ферменты
US20040146938A1 (en) 2002-10-02 2004-07-29 Jack Nguyen Methods of generating and screening for proteases with altered specificity
US20050136428A1 (en) 2003-06-27 2005-06-23 Roberto Crea Look-through mutagenesis
WO2005094185A2 (en) 2004-03-30 2005-10-13 Sudershan Biotech Limited Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same
WO2008098973A1 (en) 2007-02-13 2008-08-21 Chr. Hansen A/S Coagulation of milk
JP2010046034A (ja) 2008-08-22 2010-03-04 Toyota Central R&D Labs Inc 変異体のスクリーニング方法
LT2844750T (lt) * 2012-05-03 2018-09-10 Dsm Ip Assets B.V. Pagerinti fermento variantai
KR20150062717A (ko) * 2013-11-29 2015-06-08 롯데푸드 주식회사 발효 크림치즈 제조방법
RU2741804C2 (ru) 2015-02-10 2021-01-28 Кхр. Хансен А/С Смеси химозинов с улучшенными молокосвертывающими свойствами
EP3310914B1 (en) 2015-06-22 2022-04-06 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved properties
BR112018003493A2 (pt) 2015-08-31 2018-09-18 Chr Hansen As variantes de quimosina com propriedades aperfeiçoadas
EA201892534A1 (ru) * 2016-05-19 2019-06-28 Кхр. Хансен А/С Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами
US10961524B2 (en) 2016-05-19 2021-03-30 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3549390A (en) * 1968-09-09 1970-12-22 Miles Lab Milk-clotting enzyme product and process therefor
CN102361975A (zh) * 2009-03-24 2012-02-22 名糖产业株式会社 来自微生物的改进型凝乳蛋白酶
CN104487572A (zh) * 2012-05-25 2015-04-01 科.汉森有限公司 具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体
CN106062187A (zh) * 2014-02-26 2016-10-26 科.汉森有限公司 具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAPPELER SR ET AL.,: "chymosin precursor [Camelus dromedarius]", 《NCBI》 *
杨宝进等: "凝乳酶蛋白质工程的研究", 《中国乳品工业》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108135193A (zh) * 2015-08-31 2018-06-08 科.汉森有限公司 具有改善性质的凝乳酶的变体
CN109688825A (zh) * 2016-05-19 2019-04-26 科·汉森有限公司 具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体

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