JP6856551B2 - 改善された特性を有するキモシン変異体 - Google Patents
改善された特性を有するキモシン変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6856551B2 JP6856551B2 JP2017566089A JP2017566089A JP6856551B2 JP 6856551 B2 JP6856551 B2 JP 6856551B2 JP 2017566089 A JP2017566089 A JP 2017566089A JP 2017566089 A JP2017566089 A JP 2017566089A JP 6856551 B2 JP6856551 B2 JP 6856551B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chymosin
- seq
- polypeptide
- isolated
- casein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 276
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 title claims description 269
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 title claims description 264
- 102200090626 rs121909749 Human genes 0.000 claims description 249
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 230
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 208
- 102220320096 rs202169962 Human genes 0.000 claims description 201
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 197
- 102220493691 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain_I96L_mutation Human genes 0.000 claims description 190
- 102220238200 rs1238996324 Human genes 0.000 claims description 156
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims description 130
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 claims description 122
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims description 122
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 claims description 103
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 82
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 79
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 79
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 78
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 49
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 46
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 31
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 31
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 31
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 31
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 31
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 15
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 9
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims description 4
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 3
- -1 S 164 Chemical compound 0.000 claims description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 claims description 2
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 claims description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 235000008983 soft cheese Nutrition 0.000 claims description 2
- 102220295319 rs1554851807 Human genes 0.000 claims 72
- 102220344315 rs1236509896 Human genes 0.000 description 162
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 80
- 102220214770 rs1060500599 Human genes 0.000 description 79
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 69
- 102220575218 Cellular tumor antigen p53_L130I_mutation Human genes 0.000 description 63
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 49
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 49
- 102200049608 rs863223414 Human genes 0.000 description 49
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 44
- 102220171239 rs150051467 Human genes 0.000 description 41
- 102220083031 rs746990000 Human genes 0.000 description 35
- 102220486540 Cytoplasmic polyadenylated homeobox-like protein 2_S132A_mutation Human genes 0.000 description 30
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 24
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 15
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 12
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 102200105084 rs41265127 Human genes 0.000 description 11
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 8
- 102220482045 Killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL1_F66Y_mutation Human genes 0.000 description 7
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 7
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 7
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 7
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 6
- 102220260761 rs1554096786 Human genes 0.000 description 6
- 102200116820 rs1554263625 Human genes 0.000 description 6
- 102200118200 rs34718174 Human genes 0.000 description 6
- 102220075532 rs568479156 Human genes 0.000 description 6
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 102220476931 Interleukin-1 receptor-associated kinase 3_D98V_mutation Human genes 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 5
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 5
- 102220324476 rs1555169422 Human genes 0.000 description 5
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 5
- 102220525074 45 kDa calcium-binding protein_N50D_mutation Human genes 0.000 description 4
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 4
- 102220576604 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain_K19S_mutation Human genes 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- 102220600074 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] cytochrome b small subunit, mitochondrial_I96V_mutation Human genes 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 102220418158 c.920A>T Human genes 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 102220075287 rs769591944 Human genes 0.000 description 4
- 102220087235 rs864622622 Human genes 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 3
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 235000012209 glucono delta-lactone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000182 glucono-delta-lactone Substances 0.000 description 3
- 229960003681 gluconolactone Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040768 60S ribosomal protein L32 Human genes 0.000 description 2
- 102220466243 Acyl-coenzyme A thioesterase MBLAC2_R170A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 2
- 102220565663 Carboxylesterase 4A_K71E_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220477021 Hexokinase-4_S411F_mutation Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220468791 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 2_Y167A_mutation Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102220562110 Polycystic kidney disease protein 1-like 2_G205R_mutation Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102220275318 rs1270851643 Human genes 0.000 description 2
- 102220285717 rs1555461680 Human genes 0.000 description 2
- 102220005309 rs33995148 Human genes 0.000 description 2
- 102220052102 rs35524245 Human genes 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PFMYVADTFJKUJF-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]benzene-1,2,3-triol Chemical compound [N+](=O)([O-])C1=CC=C(C=C1)N=NC1=C(C(=C(C=C1)O)O)O PFMYVADTFJKUJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220588026 Acidic mammalian chitinase_D13N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108050000244 Alpha-s1 casein Proteins 0.000 description 1
- 102000009366 Alpha-s1 casein Human genes 0.000 description 1
- 108050001786 Alpha-s2 casein Proteins 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 102100034713 C-type lectin domain family 18 member A Human genes 0.000 description 1
- 102220596352 CUGBP Elav-like family member 1_L12I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150083809 D10L gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044623 D13L gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000946283 Homo sapiens C-type lectin domain family 18 member A Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220536072 Lysophospholipase_R61S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220528082 M1-specific T cell receptor alpha chain_S74D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102220482874 Ornithine decarboxylase antizyme 1_H56K_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102220516769 Protein-arginine deiminase type-1_Y11F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101100498120 Vaccinia virus (strain Western Reserve) VACWR118 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000019636 bitter flavor Nutrition 0.000 description 1
- 239000004161 brilliant blue FCF Substances 0.000 description 1
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000020248 camel milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Substances O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 1
- 235000016046 other dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 108010001845 prepepsinogen Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 102220198217 rs1057519920 Human genes 0.000 description 1
- 102200108854 rs1230345 Human genes 0.000 description 1
- 102220125997 rs141863326 Human genes 0.000 description 1
- 102200119355 rs312262812 Human genes 0.000 description 1
- 102200135024 rs35877720 Human genes 0.000 description 1
- 102220097786 rs587782769 Human genes 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 150000003354 serine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical class [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 235000020255 yak milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0326—Rennet produced by fermentation, e.g. microbial rennet; Rennet produced by genetic engineering
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/06—Treating cheese curd after whey separation; Products obtained thereby
- A23C19/061—Addition of, or treatment with, microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/06—Treating cheese curd after whey separation; Products obtained thereby
- A23C19/068—Particular types of cheese
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
本発明は、改善された特性を有するキモシンの変異体に関する。
哺乳類の胃の凝乳酵素である、キモシン(EC3.4.23.4)及びペプシン(EC3.4.23.1)は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
国際公開第2013/174840A1号(Chr.Hansen)は、ウシ及びラクダキモシンの突然変異体/変異体を記載している。
国際公開第2013/164479A2号(DSM)は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286。
本発明によって解決されるべき問題は、実質的にその凝固効率を維持しながら、親ポリペプチドと比較した場合に、より低い低下したβ−カゼイン切断頻度を有する、キモシンの変異体を提供することである。
(a)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも80%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し;かつ
(b)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の50%未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続された、RP−HPLCによって行われる、
ことを特徴とする、単離されたキモシンポリペプチド変異体を提供する。
(a):配列番号4のポリペプチドをコードするDNA配列中の1又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置:
配列番号4におけるY11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242又はI96、のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含み;
(b):ステップ(a)の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含む、方法に関する。
Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E及び/又はI96L、の1又は複数を含んでもよい。
I96+G163+V221; R67+H76+S132+V248+S271; R67+L130+M157; V136+V221+L222+S226; S132+R254+V259+Y307; V32+I96+S277; L130+M142+I200+V259+E294; L130+S132+V32; L130+G163+Y307;R61+L166+T239; L130+T239+S277+L295; D98+H146+V203+I263+S271; S132+V221+S255+S273+V317; H76+L222+G251;H76+K231+G244; Y127+S132+D158;V221+V248+L253+L295;V32+R61+H146; V32+E294+R316+V317; H76+I96+D158; D98+M157+V183; S226+G244+I263+G289;G70+L130+Y268; D59+V248+L222+V248; R67+G70+H146+Q188+S226; S74+H76+M142+M157+G163; R61+S226+T239+V248+G251;V32+L130+R145+L222+D279; D59+L222+G251+E83+Q162; D59+L222+G251+F17+Y21; D59+L222+G251+H76+S164;D59+L222+G251+K62+M165;D59+L222+G251+Q162+V155;D59+L222+G251+S273+L166;D59+L222+G251+Y268+V198;D59+L222+G251+S273+F66;D59+L222+G251+M165+L166;D59+L222+G251+H76+M165;D59+L222+G251+F17+S273; D59+L222+G251+L166+I45; D59+L222+G251+L180+T284; D59+L222+G251+V32+L12+T284; D59+L222+G251+Y21+L166; D59+L222+G251+V155+E262+V32; D59+L222+G251+L105+S164; D59+L222+G251+Y21+L215+L105; D59+L222+G251+I96+T177+K321; D59+L222+G251+F17+T284+V203; D59+L222+G251+V32+K321+V260; D59+L222+G251+V198+V32+E83; D59+L222+G251+I96+V203+V309;
D59+L222+G251+Y268+L215+V32; D59+L222+G251+H76+L105+V260; D59+L222+G251+Y21+H76+Y268; D59+L222+G251+S164+R266+I96; D59+L222+G251+H181+F66+V32; D59+L222+G251+H181+R266+D267; D59+L222+G251+Y268+L12+D267; D59+L222+G251+L166+E262+T177; D59+L222+G251+F66+Q288+I96; D59+L222+G251+V203+R266+F223; D59+L222+G251+I303+S154+V260; D59+L222+G251+Y21+T284+I96; D59+L222+G251+Q288+K19+T177; D59+L222+G251+K62+Y268+K19; L12+Y21+D59+H76+M165+V198+L222+G251+Q288; L12+Y21+D59+H76+M165+L222+G251+S273; L12+D59+H76+M165+V198+L222+G251+S273+K321; L12+D59+H76+S154+M165+V203+L222+G251+V309; L12+D59+H76Q+D98+L222; L12+K19+V32+D59+H76+D144+M165+L222+G251; L12+Y21+D59+H76+M165+V203+L222+G251+E262; L12+V51+H76+M165+G251; L12+D59+F66+H76+M165+L180+L222+G251+V309; L12+D59+H76+S154+M165+L222+G251+Q288; L12+D59+H76+D98+M165+L222+G251+E262+Q288; L12+V51+D59+H76+L166+L222+G251; L12+D59+H76+D144+M165+V203+L222; L12+D59+144+M165+L166+L222+G251; L12+K19+D59+H76+S154+M165+V198+L222+G251; L12+H76+D98+M165+L222+G251; L12+V32+D59+H76+M165+L180+V198+L222+G251; L12+D59+H76+S154+M165+S273; L12+V51+D59+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W; L12+V32+H76+M165+L222+E262;L12+N50+D59+H76+M165+G251+E262; V51+D59+H76+M165+L180+L222+G251+E262; L12+D59+H76+M165+G251+Q288+V309+K321; L12+N50+D59+V203+L222+G251; L12+D59+H76+L180+L222+G251+K321; L12+Y21+D59+M165+L222+K321; D59+H76+M165+L166+V198+L222; L12+K19+N50+D59+H76+M165+L222+Q288; L12+Y21+N50+D59+F66+H76+D144+M165+L222+G251; H76+S132+S164+L222+N249+G251; Y21+D59+H76+S164+L166+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+R242+S273+V309; D59+H76+L130+L166+L222+N249+G251+S273;
Y21+D59+S164+L222+R242+G251+S273+V309; K19+Y21+D59+H76+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+R242+G251; H76+S164+L166+L222+S226+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y21+H76+S164+L222+R242+G251+S273; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; H76+S164+L222+N249+G251+S273+V309; K19+D59+H76+S164+L222+N249+S273; Y21+D59+H76+S164+L222+S226+G251+S273+V309; H76+S164+L166+L222+R242+G251+S273; D59+H76+I96+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S164+L166+L222+G251+S273+V309; D59+S132+S164+L222+R242+N249+G251+S273; H76+I96+S164+G251+S273+V309; D59+H76+L130+S164+G251+V309; K19+D59+S164+L166+L222+S226+G251+S273; D59+H76+I96+S132+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+I96+S164+L166+L222+G251+S273; K19+D59+H76+L130+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+S132+L222+G251+S273+V309; H76+L130+L222+S226+G251+S273; K19+Y21+D59+H76+L130+S164+L222+S273; Y21+D59+H76+I96+S164+L222+N249+G251+S273; K19+D59+H76+S164+R242+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+S226+R242; D59+H76+I96+S132+S164+L166+L222+G251+S273; D59+H76+S132+S164+L166+S273; Y21+D59+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S132+S164+L222+R242+G251+S273; D59+H76+S164+L166+L222+N249+G251+S273+V309; D59+H76+I96+S164+L222+S226+G251+S273+V309; K19+D59+H76+L166+L222+R242+G251+S273; Y21+D59+H76+I96+L222+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+N249+G251+S273; L130+S164+L222+S273; K19+Y21+H76+S164+L222+G251+S273; Y21+D59+H76+L130+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+S226+R242+G251+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; K19+D59+I96+S164+G251;
K19+I96+S164+L166+L222+R242; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; D59+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+D59+E83+I96+L222+G251+I263; Y11+K19+D59+S164+L222+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+G251+L253; K19+I96+S164+L222+N249+G251+L253; K19+I96+L222+R242+L253; K19+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253; D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; K19+I96+S164+L166+L222+N249+I263; D59+I96+L166+L222+R242+G251; K19+D59+E83+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+E83+I96+S164+L222+N249; K19+E83+I96+S164+L222+R242+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; K19+I96+S164+L222+R242+I263; Y11+D59+I96+S164+L222+G251+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+I263; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+G251; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+I263; K19+I96+S164+R242+L253; K19+D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+L253+I263; Y11+K19+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+L253; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; K19+E83+I96+S164+L222+R242+N249+G251+L253; I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253+I263; Y11+I96+S164+L222+R242+N249+L253+I263; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253;
I96+S164+L222+R242+G251+S274; H76+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+G251; V32+N100+N291; V221+N100+N291; D290+N100+N291; V136+N100+N291; E240+N100+N291; R242+N100+N291; G289+N100+N291; N292+N100+N291; L295+N100+N291; V136+N100+N291; D290+N100+N291; F119+N100+N291; Q280+N100+N291; F282+N100+N291; R254+N100+N291; R242+N100+N291; V203+N100+N291; N249+N100+N291; H56+N100+N291; S74+N100+N291; A131+N100+N291; Y190+N100+N291; I297+N100+N291; H76+N100+N291; S273+N100+N291; K19+N100+N291; D59+N100+N291; L222+N100+N291; V309+N100+N291; I96+N100+N291; Y21+N100+N291; L130+N100+N291; S132+N100+N291; S226+N100+N291; G251+N100+N291; Y243+N100+N291; S273+N100+N291; R242+Q280+N100+N291; R242+N252+N100+N291; N252+Q280+N100+N291; Y243+Q280+N100+N291; Y243+N252+N100+N291; R254+Q280+N100+N291; S273+Q280+N100+N291; R242+G251+N100+N291; R242+G251+Q280+N100+N291; R242+S273+Q280+N100+N291; N252+S273+Q280+N100+N291; G251+S273+Q280+N100+N291; R242+R254+Q280+N100+N291; R242+R254+S273+Q280+N100+N291; Y243+R254+S273+N100+N291; V223+N252+N291; E290+N252+N291; A117+N252+N291; I136+N252+N291; Q242+N252+N291; Q278+N252+N291; S289+N252+N291; Q294+N252+N291; D249+N252+N291; D251+N252+N291; G244+N252+N291; Q56+N252+N291; L32+N252+N291; K71+N252+N291; P72+N252+N291; Q83+N252+N291; V113+N252+N291; E133+N252+N291; Y134+N252+N291; K71+N252+N291; Y11+N100+N291;; Y11+D290+N100+N291; L12+N100+N291; D13+N100+N291; D13+N100+N291; R67+N100+L130+M157+V248+N291; N100+L130+S132+M157+K231; R67+I96+L130+M157+L222+M256; R67+L130+S132+M157+R242+V248; R67+N100+M157+R242+M256; R67+G70+M157+R242+V248; V32+R67+M157+L222+R242; Y11+R67+M157+V248+M256; R67+V136+M157+L222+V248; L130+M157+V248+M256+N291; R67+I96+L130+M157+K231+R242; V32+R67+L130+M157+L222+K231; L130+V136+M157+L222+N292; R67+G70+M157+L222+N291; V32+R67+L130+K231+N292; Y11+R67+N100+L130+V136+M157; R67+L130+L222+R242+M256; R67+M157+L222+V248+N292;
V32+R67+M157+M256+N291; R67+L130+S132+M157+L222+N292; R67+N100+L130+M157+K231+N291; R67+L130+K231+V248+N291; Y11+R67+L130+M157+L222+K231; I45+L130+M157+K231+R242; V32+R67+V136+M157+N291; R67+N100+L130+D158+V248; I45+R67+L130+M157+L222+K231; V32+R67+L130+S132+M157+V248; Y11+R67+L130+M157+N291+N292; R67+N100+L130+M157+L222+K231; I45+R67+G70+L130+S132; I45+R67+L130+V248+N292; Y11+R67+L130+M157+L222+R242; R67+N100+D158+L130+M157+L222; R67+L130+V136+M157+K231+V248; I45+R67+L130+L222+N291; R67+G70+L130+M157+K231+M256; V32+R67+L130+M157+D158+V248; R67+L130+M157+D158+R242+N291; R67+L130+M157+D158+K231+N292; R67+L130+V248+M256+N292; V32+R67+I96+L130+M157+V248; R67+I96+N100+L130+M157+N292; V32+R67+G70+N100+M157; V32+R67+L130+M157+K231+M256; R67+I96+M157+L222+K231; R67+M157+L222+K231+V248; R67+L130+M157+R242+M256+N292; R67+L222+K231+V248; R67+S132+L222+K231+R242+V248; Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+L166+L222+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+D59+L166+L222+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253;
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+I96+L166+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; Y11+K19+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251、例えば:
I96L+G163E+V221M;
R67Q+H76Q+S132A+V248I+S271P;
R67Q+L130I+M157L;
V136I+V221M+L222I+S226T;
S132A+R254S+V259I+Y307F;
V32L+I96L+S277N;
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q;
L130I+G163E+Y307F;
R61S+L166V+T239S;
L130I+T239S+S277N+L295K;
L130I+S132A+V32L;
D98V+H146R+V203A+I263L+S271P;
S132A+V221M+S255Y+S273Y+V317L;
H76Q+L222I+G251W;
H76Q+K231N+G244D;
Y127F+S132A+D158S;
V221M+V248I+L253I+L295K;
V32L+R61Q+H146R;
V32L+E294Q+R316L+V317L;
H76Q+I96L+D158S;
D98V+M157L+V183I;
S226T+G244D+I263L+G289S;
G70D+L130I+Y268F;
D59N+V248I+L222I+V248I;
R67Q+G70N+H146R+Q188E+S226T;
S74F+H76Q+M142I+M157L+G163E;
R61Q+S226T+T239S+V248I+G251W;
V32L+L130I+R145Q+L222I+D279E;
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S;
D59N+L222I+G251W+F17Y+Y21S;
D59N+L222I+G251D+H76Q+S164G;
D59N+L222I+G251D+K62Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+Q162S+V155F;
D59N+L222I+G251D+S273Y+L166V;
D59N+L222I+G251D+Y268F+V198I;
D59N+L222I+G251D+S273Y+F66Y;
D59N+L222I+G251D+M165E+L166V;
D59N+L222I+G251D+H76Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+F17Y+S273Y;
D59N+L222I+G251D+L166V+I45V;
D59N+L222I+G251W+L180I+T284S;
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L166V;
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L;
D59N+L222I+G251D+L105E+S164G;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E;
D59N+L222I+G251D+I96L+T177S+K321P;
D59N+L222I+G251D+F17Y+T284S+V203A;
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T;
D59N+L222I+G251D+V198I+V32L+E83S;
D59N+L222I+G251D+I96L+V203A+V309I;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L215V+V32L;
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+H76Q+Y268F;
D59N+L222I+G251D+S164G+R266V+I96L;
D59N+L222I+G251D+H181N+F66Y+V32L;
D59N+L222I+G251D+H181N+R266I+D267Q;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L12M+D267Q;
D59N+L222I+G251D+L166V+E262T+T177S;
D59N+L222I+G251D+F66Y+Q288E+I96L;
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A;
D59N+L222I+G251D+I303L+S154A+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+T284S+I96L;
D59N+L222I+G251D+Q288E+K19T+T177S;
D59N+L222I+G251D+K62Q+Y268F+K19T
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+Q288E;
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+L222I+G251W+S273Y;
L12M+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+S273Y+K321P;
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I;
L12M+D59N+H76Q+D98V+L222I;
L12M+K19T+V32L+D59N+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D;
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251D+E262T;
L12M+V51L+H76Q+M165E+G251D;
L12M+D59N+F66Y+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+V309I;
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+L222I+G251W+Q288E;
L12M+D59N+H76Q+D98V+M165E+L222I+G251D+E262T+Q288E;
L12M+V51L+D59N+H76Q+L166V+L222I+G251D;
L12M+D59N+H76Q+D144Q+M165E+V203A+L222I;
L12M+D59N+144Q+M165E+L166V+L222I+G251D;
L12M+K19T+D59N+H76Q+S154A+M165E+V198I+L222I+G251D;
L12M+H76Q+D98V+M165E+L222I+G251W;
L12M+V32L+D59N+H76Q+M165E+L180I+V198I+L222I+G251D;
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+S273Y;
L12M+V51L+D59N+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W;
L12M+V32L+H76Q+M165E+L222I+E262T;
L12M+N50D+D59N+H76Q+M165E+G251W+E262T;
V51L+D59N+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+E262T;
L12M+D59N+H76Q+M165E+G251D+Q288E+V309I+K321P;
L12M+N50D+D59N+V203A+L222I+G251D;
L12M+D59N+H76Q+L180I+L222I+G251W+K321P;
L12M+Y21S+D59N+M165E+L222I+K321P;
D59N+H76Q+M165E+L166V+V198I+L222I;
L12M+K19T+N50D+D59N+H76Q+M165E+L222I+Q288E;
L12M+Y21S+N50D+D59N+F66Y+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D;
H76Q+S132A+S164G+L222I+N249D+G251D; Y21S+D59N+H76Q+S164G+L166V+N249D+G251D+S273Y; D59N+H76Q+S164G+L222I+R242E+S273Y+V309I; D59N+H76Q+L130I+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y; Y21S+D59N+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y+V309I; K19T+Y21S+D59N+H76Q+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y; D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+R242E+G251D; H76Q+S164G+L166V+L222I+S226T+S273Y; K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D; Y21S+H76Q+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y; H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y; H76Q+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I; K19T+D59N+H76Q+S164G+L222I+N249D+S273Y; Y21S+D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I; H76Q+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y; D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y; D59N+H76Q+L130I+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y+V309I; D59N+S132A+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+S273Y; H76Q+I96L+S164G+G251D+S273Y+V309I; D59N+H76Q+L130I+S164G+G251D+V309I; K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+S226T+G251D+S273Y; D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y; K19T+D59N+H76Q+I96L+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y; K19T+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y; K19T+D59N+H76Q+S132A+L222I+G251D+S273Y+V309I; H76Q+L130I+L222I+S226T+G251D+S273Y; K19T+Y21S+D59N+H76Q+L130I+S164G+L222I+S273Y; Y21S+D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y; K19T+D59N+H76Q+S164G+R242E+N249D+G251D+S273Y; D59N+H76Q+S164G+L222I+S226T+R242E; D59N+H76Q+I96L+S132A+S164G+L166V+L222I+G251D+S273Y; D59N+H76Q+S132A+S164G+L166V+S273Y; Y21S+D59N+S164G+L222I+S226T+N249D+G251D+S273Y; D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y; D59N+H76Q+S164G+L166V+L222I+N249D+G251D+S273Y+V309I; D59N+H76Q+I96L+S164G+L222I+S226T+G251D+S273Y+V309I; K19T+D59N+G251D+S273; H76Q+L166V+L222I+R242E+G251D+S273Y; Y21S+D59N+H76Q+I96L+L222I+S273Y; D59N+H76Q+I96L+L130I+S164G+L222I+N249D+G251D+S273Y; L130I+S164G+L222I+S273Y; K19T+Y21S+H76Q+S164G+L222I+G251D+S273Y; Y21S+D59N+H76Q+L130I+S132A+S164G+L222I+G251D+S273Y; D59N+H76Q+S226T+R242E+G251D+S273Y; K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96V+L222I+R242D+G251D; K19S+D59N+I96V+S164G+G251D;K19S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E; K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D+L253I;
D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L; K19T+D59N+E83T+I96L+L222I+G251D+I263L; Y11I+K19T+D59N+S164G+L222I+G251D+I263V; K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+G251D+L253V; K19T+I96V+S164G+L222I+N249D+G251D+L253I; K19T+I96L+L222I+R242E+L253I; K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I; D59N+E83T+I96L+S164N+L222V+G251D; K19S+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+N249D+I263L; D59N+I96L+L166V+L222I+R242E+G251D; K19T+D59N+E83T+S164G+L166V+L222I+R242D+G251D; Y11I+K19T+D59N+E83S+I96L+S164G+L222I+N249D; K19T+E83T+I96L+S164G+L222I+R242E+L253V; K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D+L253I; K19T+I96L+S164N+L222I+R242E+I263L; Y11V+D59N+I96L+S164G+L222I+G251D+L253V; K19T+D59N+I96V+S164G+L166V+L222I+R242E+I263L; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164N+L166I+L222I+G251D; K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+I263V; K19T+I96L+S164G+R242E+L253I; K19S+D59N+E83S+I96L+S164N+L222I+G251D; K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+N249E+G251D+I263V; K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+N249E+G251D+L253V+I263L; Y11I+K19T+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+I263L; K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242D+G251D+I263V; K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249D+L253I; H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S273Y; K19T+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I; I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L; Y11V+K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E; Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+L253I+I263L;
Y11V+I96L+S164G+L222I+R242E+N249D+L253I+I263L; K19T+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+I263L; Y11V+E83S+I96L+S164G+L222I+R242E+L253I+I263L; K19T+E83S+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249D+G251D+L253I; I96L+S164G+L222I+R242E+G251D+S274Y; H76Q+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D; I96L+S164G+L222I+R242E+G251D; V32L+N100Q+N291Q; V221K+N100Q+N291Q; D290E+N100Q+N291Q; V136I+N100Q+N291Q; E240Q+N100Q+N291Q; R242Q+N100Q+N291Q; G289S+N100Q+N291Q; N292H+N100Q+N291Q; L295K+N100Q+N291Q; V136E+N100Q+N291Q; D290L+N100Q+N291Q; F119Y+N100Q+N291Q; Q280E+N100Q+N291Q; F282E+N100Q+N291Q; R254S+N100Q+N291Q; R242E+N100Q+N291Q; V203R+N100Q+N291Q; N249R+N100Q+N291Q; H56K+N100Q+N291Q; S74D+N100Q+N291Q; A131D+N100Q+N291Q; Y190A+N100Q+N291Q; I297A+N100Q+N291Q; H76Q+N100Q+N291Q; S273Y+N100Q+N291Q; K19T+N100Q+N291Q; D59N+N100Q+N291Q; L222I+N100Q+N291Q; V309I+N100Q+N291Q; I96L+N100Q+N291Q; Y21S+N100Q+N291Q; L130I+N100Q+N291Q; S132A+N100Q+N291Q; S226T+N100Q+N291Q; G251D+N100Q+N291Q; Y243E+N100Q+N291Q; S273D+N100Q+N291Q; R242E+Q280E+N100Q+N291Q; R242E+N252D+N100Q+N291Q; N252D+Q280E+N100Q+N291Q; Y243E+Q280E+N100Q+N291Q; Y243E+N252D+N100Q+N291Q; R254E+Q280E+N100Q+N291Q; S273D+Q280E+N100Q+N291Q; R242E+G251D+N100Q+N291Q; R242E+G251D+Q280E+N100Q+N291Q; R242E+S273D+Q280E+N100Q+N291Q; N252D+S273D+Q280E+N100Q+N291Q; G251D+S273D+Q280E+N100Q+N291Q; R242E+R254E+Q280E+N100Q+N291Q; R242E+R254E+S273D+Q280E+N100Q+N291Q; Y243E+R254E+S273D+N100Q+N291Q; V223F+N252Q+N291Q; E290D+N252Q+N291Q; A117S+N252Q+N291Q; I136V+N252Q+N291Q; Q242R+N252Q+N291Q; Q278K+N252Q+N291Q; S289G+N252Q+N291Q; Q294E+N252Q+N291Q; D249N+N252Q+N291Q; D251G+N252Q+N291Q; G244D+N252Q+N291Q; Q56H+N252Q+N291Q; L32I+N252Q+N291Q; K71E+N252Q+N291Q; P72T+N252Q+N291Q; Q83T+N252Q+N291Q; V113F+N252Q+N291Q; E133S+N252Q+N291Q; Y134G+N252Q+N291Q;
K71A+N252Q+N291Q; Y11H+N100Q+N291Q; Y11K+N100Q+N291Q; Y11R+N100Q+N291Q; Y11H+D290E+N100Q+N291Q; Y11R+D290E+N100Q+N291Q; Y11F+N100Q+N291Q; Y11I+N100Q+N291Q; Y11L+N100Q+N291Q; L12F+N100Q+N291Q; L12I+N100Q+N291Q; D13N+N100Q+N291Q; D13Q+N100Q+N291Q; D13S+N100Q+N291Q; D13T+N100Q+N291Q; D13F+N100Q+N291Q; D13L+N100Q+N291Q; D13V+N100Q+N291Q; D13Y+N100Q+N291Q; R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q; N100Q+L130I+S132A+M157L+K231N; R67Q+I96L+L130I+M157L+L222I+M256L; R67Q+L130I+S132A+M157L+R242E+V248I; R67Q+N100Q+M157L+R242E+M256L; R67Q+G70D+M157L+R242E+V248I; V32L+R67Q+M157L+L222I+R242E; Y11V+R67Q+M157L+V248I+M256L; R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I; L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q; R67Q+I96L+L130I+M157L+K231N+R242E; V32L+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N; L130I+V136I+M157L+L222I+N292H; R67Q+G70D+M157L+L222I+N291Q; V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H; Y11V+R67Q+N100Q+L130I+V136I+M157L; R67Q+L130I+L222I+R242E+M256L; R67Q+M157L+L222I+V248I+N292H; V32L+R67Q+M157L+M256L+N291Q; R67Q+L130I+S132A+M157L+L222I+N292H; R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q; R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q; Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N; I45V+L130I+M157L+K231N+R242E; V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q; R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I; I45V+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N; V32L+R67Q+L130I+S132A+M157L+V248I; Y11V+R67Q+L130I+M157L+N291Q+N292H; R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N; I45V+R67Q+G70D+L130I+S132A; I45V+R67Q+L130I+V248I+N292H; Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E; R67Q+N100Q+D158S+L130I+M157L+L222I; R67Q+L130I+V136I+M157L+K231N+V248I; I45V+R67Q+L130I+L222I+N291Q; R67Q+G70D+L130I+M157L+K231N+M256L; V32L+R67Q+L130I+M157L+D158S+V248I; R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q; R67Q+L130I+M157L+D158S+K231N+N292H; R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H; V32L+R67Q+I96L+L130I+M157L+V248I; R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H; V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L; V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L;
R67Q+I96L+M157L+L222I+K231N; R67Q+M157L+L222I+K231N+V248I; R67Q+L130I+M157L+R242E+M256L+N292H; R67Q+L222I+K231N+V248I; R67Q+S132A+L222I+K231N+R242E+V248I; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D; Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに
食品又は飼料製品、例えば乳ベースの製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法に関し、
並びに、任意により具体的には、チーズ、例えばパスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズを製造するための方法、に関する。
本明細書において関連する用語の全ての定義は、本明細書で関連する技術的文脈に関して当業者により理解されることになるものに従う。
配列番号1は、ウシプレ−プロキモシン(prochmyosin)の完全なポリペプチド配列を表す;
配列番号2は、ラクダプレ−プロキモシンの完全なポリペプチド配列を表す;
配列番号3は、成熟ウシキモシンのポリペプチド配列を表す;
配列番号4は、成熟ラクダキモシンのポリペプチド配列を表す。
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、Trends Genet.16:276-277)に実装されるような、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman及びWunsch、1970、J.Mol.Biol.48:443-453)、好ましくはバージョン3.0.0以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップ伸長ペナルティ、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」(-nobriefオプションを用いて得られる)の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される:
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)。
目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
上記で論じたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号2として開示された公知のラクダキモシン配列が使用される。
上記のよく知られたコンピュータープログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
単なる一例として、図1において、例えば、本明細書で使用されるウシ参照配列番号1は位置50に「G」を有し、かつ「ヒトコブラクダ(Camelus_dromedarius)」(本明細書の配列番号2)はこの位置50に「A」を有することがわかる。
本発明の変異体を説明する際に、以下に記載した命名法が参照を容易にするために適用される。認められたIUPACの一文字又は三文字のアミノ酸の略号が使用される。
以下、この「命名法」セクションで論じた特定の変異体は、本明細書で関連する本発明の変異体でなくてもよく、すなわち、この「命名法」セクションは単に、本明細書で関連する使用された命名法それ自体を説明する。上記に示したように、本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟キモシンポリペプチド配列におけるアミノ酸の位置に基づいている。
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置226でのアラニンによるスレオニンの論理的置換は、「Thr226Ala」又は「T226A」として指定される。複数の突然変異は、追加の印(「+」)により分離され、例えば、「Gly205Arg+Ser411Phe」又は「G205R+S411F」はそれぞれ、位置205及び411での、アルギニン(R)によるグリシン(G)の、及びフェニルアラニン(F)によるセリン(S)の置換を表す。置換、例えば指定された「226A」は、位置226でのアラニンによる親アミノ酸(例えばT、Q、S又は別の親アミノ酸)の置換を意味する。同様に、指定された「A226」又は「A226X」の置換は、位置226におけるアラニンの、別の不特定のアミノ酸による置換を意味する。
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、*。従って、位置195でのグリシンの欠失は、「Gly195*」又は「G195*」として指定される。複数の欠失は、追加の印(「+」)により分離され、例えば、「Gly195*+Ser411*」又は「G195*+S411*」となる。
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置195でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」又は「G195GK」と指定される。複数のアミノ酸の挿入は、[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸#1、挿入されたアミノ酸#2;など]と指定される。例えば、位置195でのグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Gly195GlyLysAla」又は「G195GKA」として示される。
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基(複数)は、挿入されたアミノ酸残基(複数)の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって、番号付けされる。したがって、上記例において、配列は次の通りである:
複数の改変を含む変異体は、追加の印(「+」)によって分離され、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」又は「R170Y+G195E」は、それぞれ、位置170及び195でのアルギニン及びグリシンについての、チロシン及びグルタミン酸の置換を表す。
異なる置換が1つの位置に導入され得る場合、その異なる置換はコンマによって分離され、例えば、「Arg170Tyr,Glu」又は「R170Y,E」は、位置170でのチロシン又はグルタミン酸による、アルギニンの置換を表す。したがって、「Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala」又は「Y167G,A+R170G,A」は、以下の変異体を指定する:
「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」、及び「Tyr167Ala+Arg170Ala」。
以下の実施例に概説したように、本発明者らは、少なくともその凝固活性を維持しながら、対応する親ポリペプチドよりも低い頻度でβ−カゼインを切断する、多くの好ましいキモシンポリペプチド変異体を作製した。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも80%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を含む。
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251;
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251又はY11I+K19+D59+I96+S164+ +R242+N249+G251例えば
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D又はY11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
から選択され、ここで、各置換は、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている。
−本明細書における配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性;並びに
−本明細書における配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性、
を有する。
換言すれば、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求される位置以外の位置において、改変(例えば置換)を含み得る。
例として、配列番号2の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するラクダキモシン変異体は、依然として、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)及び/又は配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば85%、90%、95%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する。
例として、配列番号1の野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
上記で論じた通り、当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を日常的に生成及び精製し得る。
換言すれば、当業者が、本明細書で関連する目的のキモシン活性を有する親ポリペプチド(例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット由来)を保有したならば、そのような目的の親キモシンの変異体を作製することは、当業者にとって日常的な作業である。
当業者に知られているように、これは例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発、及び組み換え発現/生成に基づく技法によって行われ得る。
当該技術分野において知られているように、より高いC/P比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。
上記で論じたように、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、当該技術に従って、例えば目的の乳ベースの製品(例えばチーズ製品)を製造するために、使用され得る。
本発明はまた、本発明のキモシンポリペプチド変異体、又は本発明の方法に従って得ることができるキモシンポリペプチド変異体を含む、食品及び飼料製品を提供する。前記食品及び飼料製品は、好ましくは発酵食品、例えばチーズ及びクワルクを含む発酵乳製品である。
実施例1:キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアラインメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、EBI(EBI、ツール、複数の配列アラインメント、CLUSTALW”、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)によって提供され、Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21)、2947-2948に記載された、ClustalWアルゴリズムを用いてアラインした。
キモシン変異体を異なる戦略を用いて設計した。
全てのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、真菌発現ベクター、例えばpGAMpR−Cにクローニングした(国際公開第02/36752A2号に記載)
変異体プラスミドを個々に、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)株に形質転換し、タンパク質を本質的に国際公開第02/36752A2号に記載のように産生し、標準的なクロマトグラフィー技法を用いて精製した。
4.1 乳凝固活性の決定
乳凝固活性を、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法(IDF法)である、REMCAT法を用いて決定した。
乳凝固活性を、0.5g/L(pH≒6.5)の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪乳粉末から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定する。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつIDF標準110Bによって当該試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料及び参照標準を、同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体試料を、84mMの酢酸緩衝液pH5.5を用いて約3IMCU/mlに調整した。その後、200μlの酵素調製物を、一定の攪拌下で32℃±1℃の一定温度を維持することができる水浴中に配置した、ガラス試験管中の10mlの予熱した乳(32℃)に加えた。あるいは、20μLの酵素調製物を、上記のように1mLの予熱した乳に加えた。
レンネットの総凝乳活性(強度)を、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位(IMCU)/mlで計算した:
IMCU/mlでの強度=S標準 x T標準 x D試料
D標準 x T試料
S標準:レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
T標準:標準希釈について得られた秒での凝固時間
D試料:試料についての希釈係数
D標準:標準についての希釈係数
T試料:酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCA Protein Assay Kitを使用し、提供者の支持に従って決定した。
凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を、凝固活性(IMCU/ml)を総タンパク質含有量(mg総タンパク質/ml)で割ることによって決定した。
β−カゼイン加水分解活性の決定
乳タンパク質のキモシン媒介タンパク質分解を、pH4.6で抽出した水溶性ペプチドのプロファイルを決定することによって特徴づけた。96ウェルプレートで作製された無培養(culture free)チーズモデルを研究に使用した。簡潔には、グルコノ−デルタ−ラクトン(GDL)及び塩化カルシウムを添加した、Ollingegard、Denmarkからの750μlのスキムミルクを、96ディープウェルプレートのウェルに等分した。乳へのGDLの添加から10分後に、キモシンの変異体をプレートの個々のウェルに添加して、0.05IMCU/mlの最終活性とした。形成した凝塊を、ピペットチップで凝塊を十分に攪拌することによって、レンネットの添加から30分後に切断した;各ウェルに新しいチップを使用した。その後、プレートをさらに60分間放置した後、2500gで10分間プレートを遠心分離することによって、カード及びホエーを分離した。乳を、レンネッティング(renneting)、切断及び離水(syneresis)の間、30℃に保った。最後に、ホエーをプレートからデカントし、プレートに残ったレンネットカードのペレットを4日間室温で保存した。各ウェルに0.5Mのクエン酸三ナトリウムの500μlを添加し、プレートを37℃で24時間穏やかに振とうすることによって、ペプチドを抽出した。次に、ここで完全に溶解したレンネットカードを、4.4〜4.5の最終pHまで塩酸を添加することによって沈殿させた。プレートを遠心分離機でスピンダウンし、pH4.5可溶性ペプチドのさらなる分析のために上清を回収した。
統計的機械学習アプローチ及びPCAに基づく分析を用いて、位置192/193でのβ−カゼインの切断に対する、マルチ置換ライブラリ1〜3、4及び6の変異体に存在する全ての単一突然変異の影響を決定した。
マルチ置換ライブラリ1
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシンの変異体を生成し、上記のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の半分以下を有する変異体は、太字で強調されている(変異体9、16、26、39、47、51、60、68、78、84、95)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異のパターンと比較して、突然変異V32L、L130I、及びS132Aが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する6つの変異体のうち4つ、突然変異L130Iを有する6つの変異体のうち4つ、及び突然変異S132Aを有する5つの変異体のうち3つが、野生型ラクダキモシンの50%と等しいかそれ未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、REMCAT法を用いて決定した。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の第3のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の10%未満を有する変異体は、太字で強調されている(変異体150、161、165)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異パターンと比較して、突然変異V32Lが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する3つ全ての変異体が、野生型ラクダキモシンの10%未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。
この変異体セットからの1つの変異体のみ(変異体176)が、野生型ラクダキモシンと比較して50%を超えるβ−カゼイン192/193切断を示している。これはまた、突然変異L12Mを欠いているこのセットからの唯一の変異体である。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ1〜3のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表4に示す。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ4変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を表6に示す。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ5変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表8に示す。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
ラクダキモシン(配列番号2)の変異体を、タンパク質構造分析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表9)。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
ラクダキモシン(配列番号2)のより多くの変異体を、上記の表面領域(R242E、Y243E、G251D、N252D、R254E、S273D、Q280E)に、負電荷を導入する突然変異の組み合わせにより作製した。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た(表10)。
ウシキモシン(配列番号1)の変異体を、タンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表11)。突然変異N252Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ウシキモシン(BovUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
ラクダキモシン(配列番号2)の変異体を、基質結合溝内のN−末端配列Y11−D13の分子相互作用のタンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表12)。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ6変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表14に示す。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
1. A. Kumar, S. Grover, J. Sharma, V. K. Batish, Crit. Rev. Biotechnol. 2010, 30, 243-258.
2. M. W. Borsting, K. B. Qvist, M.Rasmussen, J. Vindelov, F. K. Vogensen, Y. Ardo, Dairy Sci. 2012, 92, 593-612.
3. K. Kastberg Moller, F. P. Rattray, Y. Ardo, J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 11421-11432.
4. P. L. H. McSweeney, Int. J. Dairy Technol. 2004, 57, 127-144.
5. J. Langholm Jensen, A. Molgaard, J.-C. Navarro Poulsen, M. K. Harboe, J. B. Simonsen, A. M. Lorentzen, K. Hjerno, J. M. van den Brink, K. B. Qvist, S. Larsen, Acta Cryst. 2013, D69, 901-913.
6. S. Chitpinityol, D. Goode, M. J. C. Crabbe, Food Chem. 1998, 62, 133-139.
7. G. L. Gilliland, E. L. Winborne, J. Nachman, A. Wlodawer, Proteins 1990, 8, 82-101.
8. D. S. Palmer, A. U. Christensen, J. Sorensen, L. Celik, K. Bruun Qvist, B. Schiott, Biochemistry 2010, 49, 2563-2573.
9. J. Sorensen, D. S. Palmer, B. Schiott, J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 7949-7959.
10.I. Schechter, A. Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967, 425, 497-502.
11.L. K. Creamer, N. F. Olsen, J. Food Sci. 1982, 47:631-636
12.N. Bansal, M. A. Drake, P. Piraino, M. L. Broe, M. Harboe, P. F. Fox, P. L. H. McSweeney, Int. Dairy J. 2009, 19:510-517.
13.A. C. Moynihan, S. Govindasamy-Lucey, J. J. Jaeggi, M. E. Johnson, J. A. Lucey, P. L. H. McSweeney, J. Dairy Sci. 2014, 97:85-96.
14.J. Ehren, S. Govindarajan, B. Moron, J. Minshull, C. Khosla, Prot. Eng. Des. Sel. 2008, 21, 699-707.
15.S. Govindarajan, B. Mannervik, J. A. Silverman, K. Wright, D. Regitsky, U. Hegazy, T. J. Purcell, M. Welch, J. Minshull, C. Gustafsson, ACS Synth. Biol. 2015, 4, 221-227.
16.M. Newman, M. Safro, C. Frazao, G. Khan, A. Zdanov, I. J. Tickle, T. L. Blundell, N. Andreeva, J. Mol. Biol. 1991, 221, 1295-1309.
17.E. Gustchina, L. Rumsh, L. Ginodman, P. Majer, N. Andreeva, FEBS Lett. 1996, 379, 60-62.
18.S. Visser, C. J. Slangen, P. J. van Rooijen, Biochem. J. 1987, 244, 553-558.
Claims (11)
- 単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、
(a)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも70%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し;かつ
(b)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の50%未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続されたRP−HPLCによって行われる、
ことを特徴とし、
ここで、前記変異体が、以下を含むリスト:
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D;
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I;
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D;
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
から選択される置換の組み合わせを含み、
ここで、各置換が、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている、単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも75%を有する、請求項1に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの非特異的タンパク質分解活性(P)の、50%未満を有する、請求項1から2のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのC/P比の、少なくとも300%のC/P比を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法であって、以下のステップ:
(a):配列番号4のポリペプチドをコードするDNA配列中の1又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置:Y11、L222、L253、K19、S164、G251、D59、N249、L166、R242及び/又はI96、
のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換を含み、
(b):ステップ(a)の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含み、
ここで、前記変異体が、以下:
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D;
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I;
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D;
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
の置換の組み合わせの1又は複数を含み、
ここで、各置換が、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている、方法。 - 食品又は飼料製品を製造するための方法であって、
請求項1から4のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに
食品又は飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法。 - 前記食品又は飼料製品が乳ベースの製品である、請求項6に記載の方法。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド(polypetide)変異体を含む、食品又は飼料製品。
- チーズを製造するためのプロセスにおける、請求項1から4のいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
- パスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズ、を製造するためのプロセスにおける、請求項9に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
- チーズの苦味を低減するための、請求項9又は10に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP15173099 | 2015-06-22 | ||
EP15173099.1 | 2015-06-22 | ||
PCT/EP2016/064414 WO2016207214A1 (en) | 2015-06-22 | 2016-06-22 | Variants of chymosin with improved properties |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018525974A JP2018525974A (ja) | 2018-09-13 |
JP6856551B2 true JP6856551B2 (ja) | 2021-04-07 |
Family
ID=53496438
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017566089A Active JP6856551B2 (ja) | 2015-06-22 | 2016-06-22 | 改善された特性を有するキモシン変異体 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11174473B2 (ja) |
EP (2) | EP3310914B1 (ja) |
JP (1) | JP6856551B2 (ja) |
KR (1) | KR102612929B1 (ja) |
CN (1) | CN107849550B (ja) |
AR (1) | AR105620A1 (ja) |
AU (1) | AU2016282825B2 (ja) |
BR (1) | BR112017027536A2 (ja) |
CA (1) | CA2989488A1 (ja) |
DK (1) | DK3310914T3 (ja) |
MX (1) | MX2017016623A (ja) |
NZ (1) | NZ738238A (ja) |
RU (1) | RU2740317C2 (ja) |
WO (1) | WO2016207214A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3201812A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
EP3110948A1 (en) | 2014-02-26 | 2017-01-04 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
EP3310914B1 (en) | 2015-06-22 | 2022-04-06 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
BR112018003493A2 (pt) * | 2015-08-31 | 2018-09-18 | Chr Hansen As | variantes de quimosina com propriedades aperfeiçoadas |
US10961524B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-03-30 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
EA201892534A1 (ru) * | 2016-05-19 | 2019-06-28 | Кхр. Хансен А/С | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
WO2023001832A1 (en) | 2021-07-20 | 2023-01-26 | Chr. Hansen A/S | Composition for clotting milk, methods and uses thereof |
WO2023194285A2 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Chr. Hansen A/S | Aspartic protease, methods and uses thereof |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3549390A (en) * | 1968-09-09 | 1970-12-22 | Miles Lab | Milk-clotting enzyme product and process therefor |
EP0123928A3 (en) | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
US7390936B1 (en) | 1999-08-23 | 2008-06-24 | Sembiosys Genetics Inc. | Commercial production of chymosin in plants |
RU2192137C2 (ru) | 2000-08-07 | 2002-11-10 | Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" | Способ производства сыра |
EP2365069B1 (en) | 2000-11-06 | 2018-02-21 | Chr. Hansen A/S | Method of producing non-bovine chymosin and use hereof |
RU2296160C2 (ru) * | 2001-02-23 | 2007-03-27 | ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. | Новые гены, кодирующие новые протеолитические ферменты |
US20040146938A1 (en) | 2002-10-02 | 2004-07-29 | Jack Nguyen | Methods of generating and screening for proteases with altered specificity |
US20050136428A1 (en) | 2003-06-27 | 2005-06-23 | Roberto Crea | Look-through mutagenesis |
WO2005094185A2 (en) | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Sudershan Biotech Limited | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
WO2008098973A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Chr. Hansen A/S | Coagulation of milk |
JP2010046034A (ja) | 2008-08-22 | 2010-03-04 | Toyota Central R&D Labs Inc | 変異体のスクリーニング方法 |
BRPI1013484B1 (pt) * | 2009-03-24 | 2019-08-27 | Meito Sangyo Kk | protease, dna, vetor de expressão, célula transformada, e, método para produzir uma protease |
LT2844750T (lt) * | 2012-05-03 | 2018-09-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Pagerinti fermento variantai |
CA3201812A1 (en) * | 2012-05-25 | 2013-11-28 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
KR20150062717A (ko) * | 2013-11-29 | 2015-06-08 | 롯데푸드 주식회사 | 발효 크림치즈 제조방법 |
EP3110948A1 (en) * | 2014-02-26 | 2017-01-04 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
RU2741804C2 (ru) | 2015-02-10 | 2021-01-28 | Кхр. Хансен А/С | Смеси химозинов с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
EP3310914B1 (en) | 2015-06-22 | 2022-04-06 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
BR112018003493A2 (pt) | 2015-08-31 | 2018-09-18 | Chr Hansen As | variantes de quimosina com propriedades aperfeiçoadas |
EA201892534A1 (ru) * | 2016-05-19 | 2019-06-28 | Кхр. Хансен А/С | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
US10961524B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-03-30 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
-
2016
- 2016-06-22 EP EP16751481.9A patent/EP3310914B1/en active Active
- 2016-06-22 US US15/738,562 patent/US11174473B2/en active Active
- 2016-06-22 CN CN201680045079.7A patent/CN107849550B/zh active Active
- 2016-06-22 MX MX2017016623A patent/MX2017016623A/es unknown
- 2016-06-22 CA CA2989488A patent/CA2989488A1/en active Pending
- 2016-06-22 NZ NZ738238A patent/NZ738238A/en unknown
- 2016-06-22 RU RU2017144572A patent/RU2740317C2/ru active
- 2016-06-22 WO PCT/EP2016/064414 patent/WO2016207214A1/en active Application Filing
- 2016-06-22 AR ARP160101858A patent/AR105620A1/es unknown
- 2016-06-22 EP EP22166709.0A patent/EP4079849A1/en not_active Withdrawn
- 2016-06-22 JP JP2017566089A patent/JP6856551B2/ja active Active
- 2016-06-22 BR BR112017027536A patent/BR112017027536A2/pt active Search and Examination
- 2016-06-22 DK DK16751481.9T patent/DK3310914T3/da active
- 2016-06-22 KR KR1020187002038A patent/KR102612929B1/ko active IP Right Grant
- 2016-06-22 AU AU2016282825A patent/AU2016282825B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016207214A1 (en) | 2016-12-29 |
JP2018525974A (ja) | 2018-09-13 |
RU2740317C2 (ru) | 2021-01-13 |
NZ738238A (en) | 2024-07-05 |
EP3310914B1 (en) | 2022-04-06 |
AR105620A1 (es) | 2017-10-25 |
CN107849550A (zh) | 2018-03-27 |
EP4079849A1 (en) | 2022-10-26 |
CA2989488A1 (en) | 2016-12-29 |
RU2017144572A (ru) | 2019-07-22 |
US11174473B2 (en) | 2021-11-16 |
EP3310914A1 (en) | 2018-04-25 |
US20180187179A1 (en) | 2018-07-05 |
AU2016282825A1 (en) | 2018-01-04 |
BR112017027536A2 (pt) | 2018-09-11 |
KR102612929B1 (ko) | 2023-12-12 |
CN107849550B (zh) | 2021-09-03 |
MX2017016623A (es) | 2018-05-15 |
KR20180021098A (ko) | 2018-02-28 |
DK3310914T3 (da) | 2022-06-20 |
AU2016282825B2 (en) | 2022-11-17 |
RU2017144572A3 (ja) | 2020-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6856551B2 (ja) | 改善された特性を有するキモシン変異体 | |
KR102699499B1 (ko) | 특성이 개선된 키모신 변이체 | |
KR102494645B1 (ko) | 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체 | |
US11555182B2 (en) | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties | |
KR102245756B1 (ko) | 개선된 응유 특성을 갖는 키모신의 변이체 | |
JP7084317B2 (ja) | 改善された凝乳特性を有するキモシン変異体 | |
RU2764544C9 (ru) | Варианты химозина с улучшенными свойствами | |
EA040259B1 (ru) | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20190617 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200602 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200902 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200928 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20210216 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210318 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6856551 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |