JP6856551B2 - 改善された特性を有するキモシン変異体 - Google Patents
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Description
本発明は、改善された特性を有するキモシンの変異体に関する。
哺乳類の胃の凝乳酵素である、キモシン(EC3.4.23.4)及びペプシン(EC3.4.23.1)は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
国際公開第2013/174840A1号(Chr.Hansen)は、ウシ及びラクダキモシンの突然変異体/変異体を記載している。
国際公開第2013/164479A2号(DSM)は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。
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本発明によって解決されるべき問題は、実質的にその凝固効率を維持しながら、親ポリペプチドと比較した場合に、より低い低下したβ−カゼイン切断頻度を有する、キモシンの変異体を提供することである。
(a)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも80%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し;かつ
(b)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の50%未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続された、RP−HPLCによって行われる、
ことを特徴とする、単離されたキモシンポリペプチド変異体を提供する。
(a):配列番号4のポリペプチドをコードするDNA配列中の1又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置:
配列番号4におけるY11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242又はI96、のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含み;
(b):ステップ(a)の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含む、方法に関する。
Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E及び/又はI96L、の1又は複数を含んでもよい。
I96+G163+V221; R67+H76+S132+V248+S271; R67+L130+M157; V136+V221+L222+S226; S132+R254+V259+Y307; V32+I96+S277; L130+M142+I200+V259+E294; L130+S132+V32; L130+G163+Y307;R61+L166+T239; L130+T239+S277+L295; D98+H146+V203+I263+S271; S132+V221+S255+S273+V317; H76+L222+G251;H76+K231+G244; Y127+S132+D158;V221+V248+L253+L295;V32+R61+H146; V32+E294+R316+V317; H76+I96+D158; D98+M157+V183; S226+G244+I263+G289;G70+L130+Y268; D59+V248+L222+V248; R67+G70+H146+Q188+S226; S74+H76+M142+M157+G163; R61+S226+T239+V248+G251;V32+L130+R145+L222+D279; D59+L222+G251+E83+Q162; D59+L222+G251+F17+Y21; D59+L222+G251+H76+S164;D59+L222+G251+K62+M165;D59+L222+G251+Q162+V155;D59+L222+G251+S273+L166;D59+L222+G251+Y268+V198;D59+L222+G251+S273+F66;D59+L222+G251+M165+L166;D59+L222+G251+H76+M165;D59+L222+G251+F17+S273; D59+L222+G251+L166+I45; D59+L222+G251+L180+T284; D59+L222+G251+V32+L12+T284; D59+L222+G251+Y21+L166; D59+L222+G251+V155+E262+V32; D59+L222+G251+L105+S164; D59+L222+G251+Y21+L215+L105; D59+L222+G251+I96+T177+K321; D59+L222+G251+F17+T284+V203; D59+L222+G251+V32+K321+V260; D59+L222+G251+V198+V32+E83; D59+L222+G251+I96+V203+V309;
D59+L222+G251+Y268+L215+V32; D59+L222+G251+H76+L105+V260; D59+L222+G251+Y21+H76+Y268; D59+L222+G251+S164+R266+I96; D59+L222+G251+H181+F66+V32; D59+L222+G251+H181+R266+D267; D59+L222+G251+Y268+L12+D267; D59+L222+G251+L166+E262+T177; D59+L222+G251+F66+Q288+I96; D59+L222+G251+V203+R266+F223; D59+L222+G251+I303+S154+V260; D59+L222+G251+Y21+T284+I96; D59+L222+G251+Q288+K19+T177; D59+L222+G251+K62+Y268+K19; L12+Y21+D59+H76+M165+V198+L222+G251+Q288; L12+Y21+D59+H76+M165+L222+G251+S273; L12+D59+H76+M165+V198+L222+G251+S273+K321; L12+D59+H76+S154+M165+V203+L222+G251+V309; L12+D59+H76Q+D98+L222; L12+K19+V32+D59+H76+D144+M165+L222+G251; L12+Y21+D59+H76+M165+V203+L222+G251+E262; L12+V51+H76+M165+G251; L12+D59+F66+H76+M165+L180+L222+G251+V309; L12+D59+H76+S154+M165+L222+G251+Q288; L12+D59+H76+D98+M165+L222+G251+E262+Q288; L12+V51+D59+H76+L166+L222+G251; L12+D59+H76+D144+M165+V203+L222; L12+D59+144+M165+L166+L222+G251; L12+K19+D59+H76+S154+M165+V198+L222+G251; L12+H76+D98+M165+L222+G251; L12+V32+D59+H76+M165+L180+V198+L222+G251; L12+D59+H76+S154+M165+S273; L12+V51+D59+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W; L12+V32+H76+M165+L222+E262;L12+N50+D59+H76+M165+G251+E262; V51+D59+H76+M165+L180+L222+G251+E262; L12+D59+H76+M165+G251+Q288+V309+K321; L12+N50+D59+V203+L222+G251; L12+D59+H76+L180+L222+G251+K321; L12+Y21+D59+M165+L222+K321; D59+H76+M165+L166+V198+L222; L12+K19+N50+D59+H76+M165+L222+Q288; L12+Y21+N50+D59+F66+H76+D144+M165+L222+G251; H76+S132+S164+L222+N249+G251; Y21+D59+H76+S164+L166+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+R242+S273+V309; D59+H76+L130+L166+L222+N249+G251+S273;
Y21+D59+S164+L222+R242+G251+S273+V309; K19+Y21+D59+H76+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+R242+G251; H76+S164+L166+L222+S226+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y21+H76+S164+L222+R242+G251+S273; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; H76+S164+L222+N249+G251+S273+V309; K19+D59+H76+S164+L222+N249+S273; Y21+D59+H76+S164+L222+S226+G251+S273+V309; H76+S164+L166+L222+R242+G251+S273; D59+H76+I96+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S164+L166+L222+G251+S273+V309; D59+S132+S164+L222+R242+N249+G251+S273; H76+I96+S164+G251+S273+V309; D59+H76+L130+S164+G251+V309; K19+D59+S164+L166+L222+S226+G251+S273; D59+H76+I96+S132+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+I96+S164+L166+L222+G251+S273; K19+D59+H76+L130+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+S132+L222+G251+S273+V309; H76+L130+L222+S226+G251+S273; K19+Y21+D59+H76+L130+S164+L222+S273; Y21+D59+H76+I96+S164+L222+N249+G251+S273; K19+D59+H76+S164+R242+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+S226+R242; D59+H76+I96+S132+S164+L166+L222+G251+S273; D59+H76+S132+S164+L166+S273; Y21+D59+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S132+S164+L222+R242+G251+S273; D59+H76+S164+L166+L222+N249+G251+S273+V309; D59+H76+I96+S164+L222+S226+G251+S273+V309; K19+D59+H76+L166+L222+R242+G251+S273; Y21+D59+H76+I96+L222+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+N249+G251+S273; L130+S164+L222+S273; K19+Y21+H76+S164+L222+G251+S273; Y21+D59+H76+L130+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+S226+R242+G251+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; K19+D59+I96+S164+G251;
K19+I96+S164+L166+L222+R242; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; D59+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+D59+E83+I96+L222+G251+I263; Y11+K19+D59+S164+L222+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+G251+L253; K19+I96+S164+L222+N249+G251+L253; K19+I96+L222+R242+L253; K19+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253; D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; K19+I96+S164+L166+L222+N249+I263; D59+I96+L166+L222+R242+G251; K19+D59+E83+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+E83+I96+S164+L222+N249; K19+E83+I96+S164+L222+R242+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; K19+I96+S164+L222+R242+I263; Y11+D59+I96+S164+L222+G251+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+I263; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+G251; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+I263; K19+I96+S164+R242+L253; K19+D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+L253+I263; Y11+K19+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+L253; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; K19+E83+I96+S164+L222+R242+N249+G251+L253; I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253+I263; Y11+I96+S164+L222+R242+N249+L253+I263; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253;
I96+S164+L222+R242+G251+S274; H76+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+G251; V32+N100+N291; V221+N100+N291; D290+N100+N291; V136+N100+N291; E240+N100+N291; R242+N100+N291; G289+N100+N291; N292+N100+N291; L295+N100+N291; V136+N100+N291; D290+N100+N291; F119+N100+N291; Q280+N100+N291; F282+N100+N291; R254+N100+N291; R242+N100+N291; V203+N100+N291; N249+N100+N291; H56+N100+N291; S74+N100+N291; A131+N100+N291; Y190+N100+N291; I297+N100+N291; H76+N100+N291; S273+N100+N291; K19+N100+N291; D59+N100+N291; L222+N100+N291; V309+N100+N291; I96+N100+N291; Y21+N100+N291; L130+N100+N291; S132+N100+N291; S226+N100+N291; G251+N100+N291; Y243+N100+N291; S273+N100+N291; R242+Q280+N100+N291; R242+N252+N100+N291; N252+Q280+N100+N291; Y243+Q280+N100+N291; Y243+N252+N100+N291; R254+Q280+N100+N291; S273+Q280+N100+N291; R242+G251+N100+N291; R242+G251+Q280+N100+N291; R242+S273+Q280+N100+N291; N252+S273+Q280+N100+N291; G251+S273+Q280+N100+N291; R242+R254+Q280+N100+N291; R242+R254+S273+Q280+N100+N291; Y243+R254+S273+N100+N291; V223+N252+N291; E290+N252+N291; A117+N252+N291; I136+N252+N291; Q242+N252+N291; Q278+N252+N291; S289+N252+N291; Q294+N252+N291; D249+N252+N291; D251+N252+N291; G244+N252+N291; Q56+N252+N291; L32+N252+N291; K71+N252+N291; P72+N252+N291; Q83+N252+N291; V113+N252+N291; E133+N252+N291; Y134+N252+N291; K71+N252+N291; Y11+N100+N291;; Y11+D290+N100+N291; L12+N100+N291; D13+N100+N291; D13+N100+N291; R67+N100+L130+M157+V248+N291; N100+L130+S132+M157+K231; R67+I96+L130+M157+L222+M256; R67+L130+S132+M157+R242+V248; R67+N100+M157+R242+M256; R67+G70+M157+R242+V248; V32+R67+M157+L222+R242; Y11+R67+M157+V248+M256; R67+V136+M157+L222+V248; L130+M157+V248+M256+N291; R67+I96+L130+M157+K231+R242; V32+R67+L130+M157+L222+K231; L130+V136+M157+L222+N292; R67+G70+M157+L222+N291; V32+R67+L130+K231+N292; Y11+R67+N100+L130+V136+M157; R67+L130+L222+R242+M256; R67+M157+L222+V248+N292;
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Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+I96+L166+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; Y11+K19+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251、例えば:
I96L+G163E+V221M;
R67Q+H76Q+S132A+V248I+S271P;
R67Q+L130I+M157L;
V136I+V221M+L222I+S226T;
S132A+R254S+V259I+Y307F;
V32L+I96L+S277N;
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q;
L130I+G163E+Y307F;
R61S+L166V+T239S;
L130I+T239S+S277N+L295K;
L130I+S132A+V32L;
D98V+H146R+V203A+I263L+S271P;
S132A+V221M+S255Y+S273Y+V317L;
H76Q+L222I+G251W;
H76Q+K231N+G244D;
Y127F+S132A+D158S;
V221M+V248I+L253I+L295K;
V32L+R61Q+H146R;
V32L+E294Q+R316L+V317L;
H76Q+I96L+D158S;
D98V+M157L+V183I;
S226T+G244D+I263L+G289S;
G70D+L130I+Y268F;
D59N+V248I+L222I+V248I;
R67Q+G70N+H146R+Q188E+S226T;
S74F+H76Q+M142I+M157L+G163E;
R61Q+S226T+T239S+V248I+G251W;
V32L+L130I+R145Q+L222I+D279E;
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S;
D59N+L222I+G251W+F17Y+Y21S;
D59N+L222I+G251D+H76Q+S164G;
D59N+L222I+G251D+K62Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+Q162S+V155F;
D59N+L222I+G251D+S273Y+L166V;
D59N+L222I+G251D+Y268F+V198I;
D59N+L222I+G251D+S273Y+F66Y;
D59N+L222I+G251D+M165E+L166V;
D59N+L222I+G251D+H76Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+F17Y+S273Y;
D59N+L222I+G251D+L166V+I45V;
D59N+L222I+G251W+L180I+T284S;
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L166V;
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L;
D59N+L222I+G251D+L105E+S164G;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E;
D59N+L222I+G251D+I96L+T177S+K321P;
D59N+L222I+G251D+F17Y+T284S+V203A;
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T;
D59N+L222I+G251D+V198I+V32L+E83S;
D59N+L222I+G251D+I96L+V203A+V309I;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L215V+V32L;
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+H76Q+Y268F;
D59N+L222I+G251D+S164G+R266V+I96L;
D59N+L222I+G251D+H181N+F66Y+V32L;
D59N+L222I+G251D+H181N+R266I+D267Q;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L12M+D267Q;
D59N+L222I+G251D+L166V+E262T+T177S;
D59N+L222I+G251D+F66Y+Q288E+I96L;
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A;
D59N+L222I+G251D+I303L+S154A+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+T284S+I96L;
D59N+L222I+G251D+Q288E+K19T+T177S;
D59N+L222I+G251D+K62Q+Y268F+K19T
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+Q288E;
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+L222I+G251W+S273Y;
L12M+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+S273Y+K321P;
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I;
L12M+D59N+H76Q+D98V+L222I;
L12M+K19T+V32L+D59N+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D;
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251D+E262T;
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L12M+D59N+F66Y+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+V309I;
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K71A+N252Q+N291Q; Y11H+N100Q+N291Q; Y11K+N100Q+N291Q; Y11R+N100Q+N291Q; Y11H+D290E+N100Q+N291Q; Y11R+D290E+N100Q+N291Q; Y11F+N100Q+N291Q; Y11I+N100Q+N291Q; Y11L+N100Q+N291Q; L12F+N100Q+N291Q; L12I+N100Q+N291Q; D13N+N100Q+N291Q; D13Q+N100Q+N291Q; D13S+N100Q+N291Q; D13T+N100Q+N291Q; D13F+N100Q+N291Q; D13L+N100Q+N291Q; D13V+N100Q+N291Q; D13Y+N100Q+N291Q; R67Q+N100Q+L130I+M157L+V248I+N291Q; N100Q+L130I+S132A+M157L+K231N; R67Q+I96L+L130I+M157L+L222I+M256L; R67Q+L130I+S132A+M157L+R242E+V248I; R67Q+N100Q+M157L+R242E+M256L; R67Q+G70D+M157L+R242E+V248I; V32L+R67Q+M157L+L222I+R242E; Y11V+R67Q+M157L+V248I+M256L; R67Q+V136I+M157L+L222I+V248I; L130I+M157L+V248I+M256L+N291Q; R67Q+I96L+L130I+M157L+K231N+R242E; V32L+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N; L130I+V136I+M157L+L222I+N292H; R67Q+G70D+M157L+L222I+N291Q; V32L+R67Q+L130I+K231N+N292H; Y11V+R67Q+N100Q+L130I+V136I+M157L; R67Q+L130I+L222I+R242E+M256L; R67Q+M157L+L222I+V248I+N292H; V32L+R67Q+M157L+M256L+N291Q; R67Q+L130I+S132A+M157L+L222I+N292H; R67Q+N100Q+L130I+M157L+K231N+N291Q; R67Q+L130I+K231N+V248I+N291Q; Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N; I45V+L130I+M157L+K231N+R242E; V32L+R67Q+V136I+M157L+N291Q; R67Q+N100Q+L130I+D158S+V248I; I45V+R67Q+L130I+M157L+L222I+K231N; V32L+R67Q+L130I+S132A+M157L+V248I; Y11V+R67Q+L130I+M157L+N291Q+N292H; R67Q+N100Q+L130I+M157L+L222I+K231N; I45V+R67Q+G70D+L130I+S132A; I45V+R67Q+L130I+V248I+N292H; Y11V+R67Q+L130I+M157L+L222I+R242E; R67Q+N100Q+D158S+L130I+M157L+L222I; R67Q+L130I+V136I+M157L+K231N+V248I; I45V+R67Q+L130I+L222I+N291Q; R67Q+G70D+L130I+M157L+K231N+M256L; V32L+R67Q+L130I+M157L+D158S+V248I; R67Q+L130I+M157L+D158S+R242E+N291Q; R67Q+L130I+M157L+D158S+K231N+N292H; R67Q+L130I+V248I+M256L+N292H; V32L+R67Q+I96L+L130I+M157L+V248I; R67Q+I96L+N100Q+L130I+M157L+N292H; V32L+R67Q+G70D+N100Q+M157L; V32L+R67Q+L130I+M157L+K231N+M256L;
R67Q+I96L+M157L+L222I+K231N; R67Q+M157L+L222I+K231N+V248I; R67Q+L130I+M157L+R242E+M256L+N292H; R67Q+L222I+K231N+V248I; R67Q+S132A+L222I+K231N+R242E+V248I; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D; Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに
食品又は飼料製品、例えば乳ベースの製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法に関し、
並びに、任意により具体的には、チーズ、例えばパスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズを製造するための方法、に関する。
本明細書において関連する用語の全ての定義は、本明細書で関連する技術的文脈に関して当業者により理解されることになるものに従う。
配列番号1は、ウシプレ−プロキモシン(prochmyosin)の完全なポリペプチド配列を表す;
配列番号2は、ラクダプレ−プロキモシンの完全なポリペプチド配列を表す;
配列番号3は、成熟ウシキモシンのポリペプチド配列を表す;
配列番号4は、成熟ラクダキモシンのポリペプチド配列を表す。
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、Trends Genet.16:276-277)に実装されるような、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman及びWunsch、1970、J.Mol.Biol.48:443-453)、好ましくはバージョン3.0.0以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップ伸長ペナルティ、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」(-nobriefオプションを用いて得られる)の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される:
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)。
目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
上記で論じたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号2として開示された公知のラクダキモシン配列が使用される。
上記のよく知られたコンピュータープログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
単なる一例として、図1において、例えば、本明細書で使用されるウシ参照配列番号1は位置50に「G」を有し、かつ「ヒトコブラクダ(Camelus_dromedarius)」(本明細書の配列番号2)はこの位置50に「A」を有することがわかる。
本発明の変異体を説明する際に、以下に記載した命名法が参照を容易にするために適用される。認められたIUPACの一文字又は三文字のアミノ酸の略号が使用される。
以下、この「命名法」セクションで論じた特定の変異体は、本明細書で関連する本発明の変異体でなくてもよく、すなわち、この「命名法」セクションは単に、本明細書で関連する使用された命名法それ自体を説明する。上記に示したように、本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟キモシンポリペプチド配列におけるアミノ酸の位置に基づいている。
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置226でのアラニンによるスレオニンの論理的置換は、「Thr226Ala」又は「T226A」として指定される。複数の突然変異は、追加の印(「+」)により分離され、例えば、「Gly205Arg+Ser411Phe」又は「G205R+S411F」はそれぞれ、位置205及び411での、アルギニン(R)によるグリシン(G)の、及びフェニルアラニン(F)によるセリン(S)の置換を表す。置換、例えば指定された「226A」は、位置226でのアラニンによる親アミノ酸(例えばT、Q、S又は別の親アミノ酸)の置換を意味する。同様に、指定された「A226」又は「A226X」の置換は、位置226におけるアラニンの、別の不特定のアミノ酸による置換を意味する。
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、*。従って、位置195でのグリシンの欠失は、「Gly195*」又は「G195*」として指定される。複数の欠失は、追加の印(「+」)により分離され、例えば、「Gly195*+Ser411*」又は「G195*+S411*」となる。
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置195でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」又は「G195GK」と指定される。複数のアミノ酸の挿入は、[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸#1、挿入されたアミノ酸#2;など]と指定される。例えば、位置195でのグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Gly195GlyLysAla」又は「G195GKA」として示される。
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基(複数)は、挿入されたアミノ酸残基(複数)の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって、番号付けされる。したがって、上記例において、配列は次の通りである:
複数の改変を含む変異体は、追加の印(「+」)によって分離され、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」又は「R170Y+G195E」は、それぞれ、位置170及び195でのアルギニン及びグリシンについての、チロシン及びグルタミン酸の置換を表す。
異なる置換が1つの位置に導入され得る場合、その異なる置換はコンマによって分離され、例えば、「Arg170Tyr,Glu」又は「R170Y,E」は、位置170でのチロシン又はグルタミン酸による、アルギニンの置換を表す。したがって、「Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala」又は「Y167G,A+R170G,A」は、以下の変異体を指定する:
「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」、及び「Tyr167Ala+Arg170Ala」。
以下の実施例に概説したように、本発明者らは、少なくともその凝固活性を維持しながら、対応する親ポリペプチドよりも低い頻度でβ−カゼインを切断する、多くの好ましいキモシンポリペプチド変異体を作製した。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも80%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を含む。
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251;
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251又はY11I+K19+D59+I96+S164+ +R242+N249+G251例えば
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D又はY11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
から選択され、ここで、各置換は、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている。
−本明細書における配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性;並びに
−本明細書における配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性、
を有する。
換言すれば、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求される位置以外の位置において、改変(例えば置換)を含み得る。
例として、配列番号2の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するラクダキモシン変異体は、依然として、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)及び/又は配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば85%、90%、95%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する。
例として、配列番号1の野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
上記で論じた通り、当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を日常的に生成及び精製し得る。
換言すれば、当業者が、本明細書で関連する目的のキモシン活性を有する親ポリペプチド(例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット由来)を保有したならば、そのような目的の親キモシンの変異体を作製することは、当業者にとって日常的な作業である。
当業者に知られているように、これは例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発、及び組み換え発現/生成に基づく技法によって行われ得る。
当該技術分野において知られているように、より高いC/P比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。
上記で論じたように、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、当該技術に従って、例えば目的の乳ベースの製品(例えばチーズ製品)を製造するために、使用され得る。
本発明はまた、本発明のキモシンポリペプチド変異体、又は本発明の方法に従って得ることができるキモシンポリペプチド変異体を含む、食品及び飼料製品を提供する。前記食品及び飼料製品は、好ましくは発酵食品、例えばチーズ及びクワルクを含む発酵乳製品である。
実施例1:キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアラインメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、EBI(EBI、ツール、複数の配列アラインメント、CLUSTALW”、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)によって提供され、Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21)、2947-2948に記載された、ClustalWアルゴリズムを用いてアラインした。
キモシン変異体を異なる戦略を用いて設計した。
全てのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、真菌発現ベクター、例えばpGAMpR−Cにクローニングした(国際公開第02/36752A2号に記載)
変異体プラスミドを個々に、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)株に形質転換し、タンパク質を本質的に国際公開第02/36752A2号に記載のように産生し、標準的なクロマトグラフィー技法を用いて精製した。
4.1 乳凝固活性の決定
乳凝固活性を、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法(IDF法)である、REMCAT法を用いて決定した。
乳凝固活性を、0.5g/L(pH≒6.5)の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪乳粉末から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定する。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつIDF標準110Bによって当該試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料及び参照標準を、同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体試料を、84mMの酢酸緩衝液pH5.5を用いて約3IMCU/mlに調整した。その後、200μlの酵素調製物を、一定の攪拌下で32℃±1℃の一定温度を維持することができる水浴中に配置した、ガラス試験管中の10mlの予熱した乳(32℃)に加えた。あるいは、20μLの酵素調製物を、上記のように1mLの予熱した乳に加えた。
レンネットの総凝乳活性(強度)を、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位(IMCU)/mlで計算した:
IMCU/mlでの強度=S標準 x T標準 x D試料
D標準 x T試料
S標準:レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
T標準:標準希釈について得られた秒での凝固時間
D試料:試料についての希釈係数
D標準:標準についての希釈係数
T試料:酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCA Protein Assay Kitを使用し、提供者の支持に従って決定した。
凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を、凝固活性(IMCU/ml)を総タンパク質含有量(mg総タンパク質/ml)で割ることによって決定した。
β−カゼイン加水分解活性の決定
乳タンパク質のキモシン媒介タンパク質分解を、pH4.6で抽出した水溶性ペプチドのプロファイルを決定することによって特徴づけた。96ウェルプレートで作製された無培養(culture free)チーズモデルを研究に使用した。簡潔には、グルコノ−デルタ−ラクトン(GDL)及び塩化カルシウムを添加した、Ollingegard、Denmarkからの750μlのスキムミルクを、96ディープウェルプレートのウェルに等分した。乳へのGDLの添加から10分後に、キモシンの変異体をプレートの個々のウェルに添加して、0.05IMCU/mlの最終活性とした。形成した凝塊を、ピペットチップで凝塊を十分に攪拌することによって、レンネットの添加から30分後に切断した;各ウェルに新しいチップを使用した。その後、プレートをさらに60分間放置した後、2500gで10分間プレートを遠心分離することによって、カード及びホエーを分離した。乳を、レンネッティング(renneting)、切断及び離水(syneresis)の間、30℃に保った。最後に、ホエーをプレートからデカントし、プレートに残ったレンネットカードのペレットを4日間室温で保存した。各ウェルに0.5Mのクエン酸三ナトリウムの500μlを添加し、プレートを37℃で24時間穏やかに振とうすることによって、ペプチドを抽出した。次に、ここで完全に溶解したレンネットカードを、4.4〜4.5の最終pHまで塩酸を添加することによって沈殿させた。プレートを遠心分離機でスピンダウンし、pH4.5可溶性ペプチドのさらなる分析のために上清を回収した。
統計的機械学習アプローチ及びPCAに基づく分析を用いて、位置192/193でのβ−カゼインの切断に対する、マルチ置換ライブラリ1〜3、4及び6の変異体に存在する全ての単一突然変異の影響を決定した。
マルチ置換ライブラリ1
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシンの変異体を生成し、上記のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の半分以下を有する変異体は、太字で強調されている(変異体9、16、26、39、47、51、60、68、78、84、95)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異のパターンと比較して、突然変異V32L、L130I、及びS132Aが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する6つの変異体のうち4つ、突然変異L130Iを有する6つの変異体のうち4つ、及び突然変異S132Aを有する5つの変異体のうち3つが、野生型ラクダキモシンの50%と等しいかそれ未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、REMCAT法を用いて決定した。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の第3のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の10%未満を有する変異体は、太字で強調されている(変異体150、161、165)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異パターンと比較して、突然変異V32Lが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する3つ全ての変異体が、野生型ラクダキモシンの10%未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。
この変異体セットからの1つの変異体のみ(変異体176)が、野生型ラクダキモシンと比較して50%を超えるβ−カゼイン192/193切断を示している。これはまた、突然変異L12Mを欠いているこのセットからの唯一の変異体である。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ1〜3のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表4に示す。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ4変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を表6に示す。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ5変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表8に示す。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
ラクダキモシン(配列番号2)の変異体を、タンパク質構造分析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表9)。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
ラクダキモシン(配列番号2)のより多くの変異体を、上記の表面領域(R242E、Y243E、G251D、N252D、R254E、S273D、Q280E)に、負電荷を導入する突然変異の組み合わせにより作製した。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た(表10)。
ウシキモシン(配列番号1)の変異体を、タンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表11)。突然変異N252Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ウシキモシン(BovUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
ラクダキモシン(配列番号2)の変異体を、基質結合溝内のN−末端配列Y11−D13の分子相互作用のタンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表12)。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ6変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表14に示す。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
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Claims (11)
- 単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、
(a)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも70%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し;かつ
(b)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の50%未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続されたRP−HPLCによって行われる、
ことを特徴とし、
ここで、前記変異体が、以下を含むリスト:
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D;
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I;
Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D;
Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
から選択される置換の組み合わせを含み、
ここで、各置換が、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている、単離されたキモシンポリペプチド変異体。 - 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも75%を有する、請求項1に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの非特異的タンパク質分解活性(P)の、50%未満を有する、請求項1から2のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのC/P比の、少なくとも300%のC/P比を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法であって、以下のステップ:
(a):配列番号4のポリペプチドをコードするDNA配列中の1又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置:Y11、L222、L253、K19、S164、G251、D59、N249、L166、R242及び/又はI96、
のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換を含み、
(b):ステップ(a)の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含み、
ここで、前記変異体が、以下:
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D;
Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E;
Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
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Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
の置換の組み合わせの1又は複数を含み、
ここで、各置換が、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている、方法。 - 食品又は飼料製品を製造するための方法であって、
請求項1から4のいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに
食品又は飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法。 - 前記食品又は飼料製品が乳ベースの製品である、請求項6に記載の方法。
- 請求項1から4のいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド(polypetide)変異体を含む、食品又は飼料製品。
- チーズを製造するためのプロセスにおける、請求項1から4のいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
- パスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズ、を製造するためのプロセスにおける、請求項9に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
- チーズの苦味を低減するための、請求項9又は10に記載の使用。
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