JP6856551B2 - 改善された特性を有するキモシン変異体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、改善された特性を有するキモシンの変異体に関する。
背景技術
哺乳類の胃の凝乳酵素である、キモシン(EC3.4.23.4)及びペプシン(EC3.4.23.1)は、広いクラスのペプチダーゼに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。
胃粘膜細胞で産生される場合、キモシン及びペプシンはそれぞれ、酵素的に不活性なプレ−プロキモシン及びプレ−ペプシノーゲンとして生じる。キモシンが分泌されると、N末端ペプチドフラグメントである、プレ−フラグメント(シグナルペプチド)が切断され、プロ−フラグメントを含むプロキモシンが得られる。プロキモシンは酵素の実質的に不活性な形態であるが、プロ−フラグメントの自己触媒除去により活性キモシンへと酸性条件下で活性化される。この活性化は、適切なpH条件下で胃管腔においてイン・ビボで、又は酸性条件下でイン・ビトロで起こる。
ウシ、すなわちボス・タウラス(Bos taurus)の、プレ−プロキモシン、プロキモシン及びキモシンの構造的及び機能的特性は広く研究されてきた。ウシプレ−プロキモシン分子のプレ−部分は16個のaa残基を含み、対応するプロキモシンのプロ−部分は42個のaa残基の長さを有する。活性ウシキモシンは323aaを含む。
キモシンは哺乳類種、例えばウシ、ラクダ、ヤギ(caprines)、バッファロー、ヒツジ、ブタ、ヒト、サル及びラットにおいて、天然に生成される。
ウシ及びラクダキモシンは長年にわたって酪農業界に市販されてきた。
凝乳酵素、例えばキモシン及びペプシンによる乳の酵素的凝固は、チーズの製造における最も重要な工程の1つである。酵素的な乳の凝固は、次の2相工程である:タンパク質分解酵素であるキモシン又はペプシンが、κ−カゼインを攻撃し、カゼインミセル構造の準安定状態をもたらす第1相、及び、続いて乳が凝固し、凝固物を形成する第2相(参考文献1)。κ−カゼインを切断することによって乳の凝固を促進することに加えて、キモシンは主にLeu192とTyr193との間でβ−カゼイン(β−カゼイン)を切断して、β(193−209)ペプチドの形成をもたらす。さらに、β(193−209)のタンパク質分解及び短い疎水性ペプチドの形成は、製品の望ましくない苦い風味をもたらし得る。
国際公開第02/36752A2号(Chr.Hansen)は、ラクダキモシンの組換え生成を記載している。
国際公開第2013/174840A1号(Chr.Hansen)は、ウシ及びラクダキモシンの突然変異体/変異体を記載している。
国際公開第2013/164479A2号(DSM)は、ウシキモシンの突然変異体を記載している。
以下に列挙した参考文献は、本文脈において、キモシンの突然変異体を記載する参考文献として参照される:
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286。
上述の先行技術文献のいずれも、以下に記載するように、変異体が由来する親と比較して同様の凝固活性で、β−カゼイン切断頻度が低下したキモシン変異体を直接かつ明確に記載していない。
発明の概要
本発明によって解決されるべき問題は、実質的にその凝固効率を維持しながら、親ポリペプチドと比較した場合に、より低い低下したβ−カゼイン切断頻度を有する、キモシンの変異体を提供することである。
従って、本発明は、単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、
(a)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも80%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し;かつ
(b)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の50%未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続された、RP−HPLCによって行われる、
ことを特徴とする、単離されたキモシンポリペプチド変異体を提供する。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4のポリペプチド(ラクダキモシン)と少なくとも80%、例えば、少なくとも例えば85%、95%、97%、98%、99%、100%の配列同一性を有する、親ポリペプチドに由来し得る。
関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも70%、例えば、少なくとも例えば75%、80%、90%、100%、110%、120%、130%又は150%を有する。
さらに関連する態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、好ましくは、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの非特異的タンパク質分解活性(P)の、少なくとも50%未満、例えば40%未満、30%未満、20%未満、15%未満、10%未満又は6%未満を有する。
さらなる関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのC/P比の、少なくとも300%、400%、500%、600%、700%、800%、1000%、1200%、1400%又は1600%のC/P比を有する。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、1又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含んでもよく、ここで、当該1又は複数の置換、欠失又は挿入は、配列番号4のアミノ酸配列に関して次のように特定されている:Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242又はI96、そしてより具体的には、例えばY11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E及び/又はI96L。
本発明はさらに、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体の作製方法、単離されたキモシンポリペプチド変異体を使用する食品又は飼料製品の製造方法、これら変異体を含む食品及び飼料製品、並びに、食品及び飼料製品を製造するための当該変異体の使用、を提供する。
関連する代替態様において、本発明は、減少した単離されたキモシンポリペプチドを作製するための方法であって、以下のステップ:
(a):配列番号4のポリペプチドをコードするDNA配列中の1又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置:
配列番号4におけるY11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242又はI96、のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含み;
(b):ステップ(a)の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
を含む、方法に関する。
上記方法によって生成された、単離されたキモシンは、以下の置換:
Y11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E及び/又はI96L、の1又は複数を含んでもよい。
関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体、及び上記方法によって生成された変異体は、置換の組み合わせを含んでもよく、かつ、各置換は、配列番号4のアミノ酸配列に関して次のように特定されている:
I96+G163+V221; R67+H76+S132+V248+S271; R67+L130+M157; V136+V221+L222+S226; S132+R254+V259+Y307; V32+I96+S277; L130+M142+I200+V259+E294; L130+S132+V32; L130+G163+Y307;R61+L166+T239; L130+T239+S277+L295; D98+H146+V203+I263+S271; S132+V221+S255+S273+V317; H76+L222+G251;H76+K231+G244; Y127+S132+D158;V221+V248+L253+L295;V32+R61+H146; V32+E294+R316+V317; H76+I96+D158; D98+M157+V183; S226+G244+I263+G289;G70+L130+Y268; D59+V248+L222+V248; R67+G70+H146+Q188+S226; S74+H76+M142+M157+G163; R61+S226+T239+V248+G251;V32+L130+R145+L222+D279; D59+L222+G251+E83+Q162; D59+L222+G251+F17+Y21; D59+L222+G251+H76+S164;D59+L222+G251+K62+M165;D59+L222+G251+Q162+V155;D59+L222+G251+S273+L166;D59+L222+G251+Y268+V198;D59+L222+G251+S273+F66;D59+L222+G251+M165+L166;D59+L222+G251+H76+M165;D59+L222+G251+F17+S273; D59+L222+G251+L166+I45; D59+L222+G251+L180+T284; D59+L222+G251+V32+L12+T284; D59+L222+G251+Y21+L166; D59+L222+G251+V155+E262+V32; D59+L222+G251+L105+S164; D59+L222+G251+Y21+L215+L105; D59+L222+G251+I96+T177+K321; D59+L222+G251+F17+T284+V203; D59+L222+G251+V32+K321+V260; D59+L222+G251+V198+V32+E83; D59+L222+G251+I96+V203+V309;
D59+L222+G251+Y268+L215+V32; D59+L222+G251+H76+L105+V260; D59+L222+G251+Y21+H76+Y268; D59+L222+G251+S164+R266+I96; D59+L222+G251+H181+F66+V32; D59+L222+G251+H181+R266+D267; D59+L222+G251+Y268+L12+D267; D59+L222+G251+L166+E262+T177; D59+L222+G251+F66+Q288+I96; D59+L222+G251+V203+R266+F223; D59+L222+G251+I303+S154+V260; D59+L222+G251+Y21+T284+I96; D59+L222+G251+Q288+K19+T177; D59+L222+G251+K62+Y268+K19; L12+Y21+D59+H76+M165+V198+L222+G251+Q288; L12+Y21+D59+H76+M165+L222+G251+S273; L12+D59+H76+M165+V198+L222+G251+S273+K321; L12+D59+H76+S154+M165+V203+L222+G251+V309; L12+D59+H76Q+D98+L222; L12+K19+V32+D59+H76+D144+M165+L222+G251; L12+Y21+D59+H76+M165+V203+L222+G251+E262; L12+V51+H76+M165+G251; L12+D59+F66+H76+M165+L180+L222+G251+V309; L12+D59+H76+S154+M165+L222+G251+Q288; L12+D59+H76+D98+M165+L222+G251+E262+Q288; L12+V51+D59+H76+L166+L222+G251; L12+D59+H76+D144+M165+V203+L222; L12+D59+144+M165+L166+L222+G251; L12+K19+D59+H76+S154+M165+V198+L222+G251; L12+H76+D98+M165+L222+G251; L12+V32+D59+H76+M165+L180+V198+L222+G251; L12+D59+H76+S154+M165+S273; L12+V51+D59+F66Y+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251W; L12+V32+H76+M165+L222+E262;L12+N50+D59+H76+M165+G251+E262; V51+D59+H76+M165+L180+L222+G251+E262; L12+D59+H76+M165+G251+Q288+V309+K321; L12+N50+D59+V203+L222+G251; L12+D59+H76+L180+L222+G251+K321; L12+Y21+D59+M165+L222+K321; D59+H76+M165+L166+V198+L222; L12+K19+N50+D59+H76+M165+L222+Q288; L12+Y21+N50+D59+F66+H76+D144+M165+L222+G251; H76+S132+S164+L222+N249+G251; Y21+D59+H76+S164+L166+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+R242+S273+V309; D59+H76+L130+L166+L222+N249+G251+S273;
Y21+D59+S164+L222+R242+G251+S273+V309; K19+Y21+D59+H76+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+R242+G251; H76+S164+L166+L222+S226+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y21+H76+S164+L222+R242+G251+S273; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; H76+S164+L222+N249+G251+S273+V309; K19+D59+H76+S164+L222+N249+S273; Y21+D59+H76+S164+L222+S226+G251+S273+V309; H76+S164+L166+L222+R242+G251+S273; D59+H76+I96+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S164+L166+L222+G251+S273+V309; D59+S132+S164+L222+R242+N249+G251+S273; H76+I96+S164+G251+S273+V309; D59+H76+L130+S164+G251+V309; K19+D59+S164+L166+L222+S226+G251+S273; D59+H76+I96+S132+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+I96+S164+L166+L222+G251+S273; K19+D59+H76+L130+S164+L222+S226+G251+S273; K19+D59+H76+S132+L222+G251+S273+V309; H76+L130+L222+S226+G251+S273; K19+Y21+D59+H76+L130+S164+L222+S273; Y21+D59+H76+I96+S164+L222+N249+G251+S273; K19+D59+H76+S164+R242+N249+G251+S273; D59+H76+S164+L222+S226+R242; D59+H76+I96+S132+S164+L166+L222+G251+S273; D59+H76+S132+S164+L166+S273; Y21+D59+S164+L222+S226+N249+G251+S273; D59+H76+L130+S132+S164+L222+R242+G251+S273; D59+H76+S164+L166+L222+N249+G251+S273+V309; D59+H76+I96+S164+L222+S226+G251+S273+V309; K19+D59+H76+L166+L222+R242+G251+S273; Y21+D59+H76+I96+L222+S273; D59+H76+I96+L130+S164+L222+N249+G251+S273; L130+S164+L222+S273; K19+Y21+H76+S164+L222+G251+S273; Y21+D59+H76+L130+S132+S164+L222+G251+S273; D59+H76+S226+R242+G251+S273; K19+D59+I96+S164+L222+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; K19+D59+I96+S164+G251;
K19+I96+S164+L166+L222+R242; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; D59+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+D59+E83+I96+L222+G251+I263; Y11+K19+D59+S164+L222+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+G251+L253; K19+I96+S164+L222+N249+G251+L253; K19+I96+L222+R242+L253; K19+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253; D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; K19+I96+S164+L166+L222+N249+I263; D59+I96+L166+L222+R242+G251; K19+D59+E83+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+E83+I96+S164+L222+N249; K19+E83+I96+S164+L222+R242+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+L253; K19+I96+S164+L222+R242+I263; Y11+D59+I96+S164+L222+G251+L253; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+I263; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+G251; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+I263; K19+I96+S164+R242+L253; K19+D59+E83+I96+S164+L222+G251; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+N249+G251+L253+I263; Y11+K19+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+N249+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251+I263; K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+L253; H76+I96+S164+L222+R242+G251+S273; K19+E83+I96+S164+L222+R242+N249+G251+L253; I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+G251+L253+I263; Y11+I96+S164+L222+R242+N249+L253+I263; K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+I263; Y11+E83+I96+S164+L222+R242+L253+I263; K19+E83+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251+L253;
I96+S164+L222+R242+G251+S274; H76+I96+S164+L222+R242+G251; I96+S164+L222+R242+G251; V32+N100+N291; V221+N100+N291; D290+N100+N291; V136+N100+N291; E240+N100+N291; R242+N100+N291; G289+N100+N291; N292+N100+N291; L295+N100+N291; V136+N100+N291; D290+N100+N291; F119+N100+N291; Q280+N100+N291; F282+N100+N291; R254+N100+N291; R242+N100+N291; V203+N100+N291; N249+N100+N291; H56+N100+N291; S74+N100+N291; A131+N100+N291; Y190+N100+N291; I297+N100+N291; H76+N100+N291; S273+N100+N291; K19+N100+N291; D59+N100+N291; L222+N100+N291; V309+N100+N291; I96+N100+N291; Y21+N100+N291; L130+N100+N291; S132+N100+N291; S226+N100+N291; G251+N100+N291; Y243+N100+N291; S273+N100+N291; R242+Q280+N100+N291; R242+N252+N100+N291; N252+Q280+N100+N291; Y243+Q280+N100+N291; Y243+N252+N100+N291; R254+Q280+N100+N291; S273+Q280+N100+N291; R242+G251+N100+N291; R242+G251+Q280+N100+N291; R242+S273+Q280+N100+N291; N252+S273+Q280+N100+N291; G251+S273+Q280+N100+N291; R242+R254+Q280+N100+N291; R242+R254+S273+Q280+N100+N291; Y243+R254+S273+N100+N291; V223+N252+N291; E290+N252+N291; A117+N252+N291; I136+N252+N291; Q242+N252+N291; Q278+N252+N291; S289+N252+N291; Q294+N252+N291; D249+N252+N291; D251+N252+N291; G244+N252+N291; Q56+N252+N291; L32+N252+N291; K71+N252+N291; P72+N252+N291; Q83+N252+N291; V113+N252+N291; E133+N252+N291; Y134+N252+N291; K71+N252+N291; Y11+N100+N291;; Y11+D290+N100+N291; L12+N100+N291; D13+N100+N291; D13+N100+N291; R67+N100+L130+M157+V248+N291; N100+L130+S132+M157+K231; R67+I96+L130+M157+L222+M256; R67+L130+S132+M157+R242+V248; R67+N100+M157+R242+M256; R67+G70+M157+R242+V248; V32+R67+M157+L222+R242; Y11+R67+M157+V248+M256; R67+V136+M157+L222+V248; L130+M157+V248+M256+N291; R67+I96+L130+M157+K231+R242; V32+R67+L130+M157+L222+K231; L130+V136+M157+L222+N292; R67+G70+M157+L222+N291; V32+R67+L130+K231+N292; Y11+R67+N100+L130+V136+M157; R67+L130+L222+R242+M256; R67+M157+L222+V248+N292;
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Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+L253; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+K19+D59+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+I96+L222+R242+N249+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+K19+I96+L166+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+L222+R242+G251; Y11+K19+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251、例えば:
I96L+G163E+V221M;
R67Q+H76Q+S132A+V248I+S271P;
R67Q+L130I+M157L;
V136I+V221M+L222I+S226T;
S132A+R254S+V259I+Y307F;
V32L+I96L+S277N;
L130I+M142I+I200V+V259I+E294Q;
L130I+G163E+Y307F;
R61S+L166V+T239S;
L130I+T239S+S277N+L295K;
L130I+S132A+V32L;
D98V+H146R+V203A+I263L+S271P;
S132A+V221M+S255Y+S273Y+V317L;
H76Q+L222I+G251W;
H76Q+K231N+G244D;
Y127F+S132A+D158S;
V221M+V248I+L253I+L295K;
V32L+R61Q+H146R;
V32L+E294Q+R316L+V317L;
H76Q+I96L+D158S;
D98V+M157L+V183I;
S226T+G244D+I263L+G289S;
G70D+L130I+Y268F;
D59N+V248I+L222I+V248I;
R67Q+G70N+H146R+Q188E+S226T;
S74F+H76Q+M142I+M157L+G163E;
R61Q+S226T+T239S+V248I+G251W;
V32L+L130I+R145Q+L222I+D279E;
D59N+L222I+G251D+E83S+Q162S;
D59N+L222I+G251W+F17Y+Y21S;
D59N+L222I+G251D+H76Q+S164G;
D59N+L222I+G251D+K62Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+Q162S+V155F;
D59N+L222I+G251D+S273Y+L166V;
D59N+L222I+G251D+Y268F+V198I;
D59N+L222I+G251D+S273Y+F66Y;
D59N+L222I+G251D+M165E+L166V;
D59N+L222I+G251D+H76Q+M165E;
D59N+L222I+G251D+F17Y+S273Y;
D59N+L222I+G251D+L166V+I45V;
D59N+L222I+G251W+L180I+T284S;
D59N+L222I+G251D+V32L+L12M+T284S;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L166V;
D59N+L222I+G251D+V155F+E262T+V32L;
D59N+L222I+G251D+L105E+S164G;
D59N+L222I+G251D+Y21S+L215V+L105E;
D59N+L222I+G251D+I96L+T177S+K321P;
D59N+L222I+G251D+F17Y+T284S+V203A;
D59N+L222I+G251D+V32L+K321P+V260T;
D59N+L222I+G251D+V198I+V32L+E83S;
D59N+L222I+G251D+I96L+V203A+V309I;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L215V+V32L;
D59N+L222I+G251D+H76Q+L105E+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+H76Q+Y268F;
D59N+L222I+G251D+S164G+R266V+I96L;
D59N+L222I+G251D+H181N+F66Y+V32L;
D59N+L222I+G251D+H181N+R266I+D267Q;
D59N+L222I+G251D+Y268F+L12M+D267Q;
D59N+L222I+G251D+L166V+E262T+T177S;
D59N+L222I+G251D+F66Y+Q288E+I96L;
D59N+L222I+G251D+V203A+R266V+F223A;
D59N+L222I+G251D+I303L+S154A+V260T;
D59N+L222I+G251D+Y21S+T284S+I96L;
D59N+L222I+G251D+Q288E+K19T+T177S;
D59N+L222I+G251D+K62Q+Y268F+K19T
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+Q288E;
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+L222I+G251W+S273Y;
L12M+D59N+H76Q+M165E+V198I+L222I+G251D+S273Y+K321P;
L12M+D59N+H76Q+S154A+M165E+V203A+L222I+G251D+V309I;
L12M+D59N+H76Q+D98V+L222I;
L12M+K19T+V32L+D59N+H76Q+D144Q+M165E+L222I+G251D;
L12M+Y21S+D59N+H76Q+M165E+V203A+L222I+G251D+E262T;
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L12M+D59N+F66Y+H76Q+M165E+L180I+L222I+G251D+V309I;
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R67Q+I96L+M157L+L222I+K231N; R67Q+M157L+L222I+K231N+V248I; R67Q+L130I+M157L+R242E+M256L+N292H; R67Q+L222I+K231N+V248I; R67Q+S132A+L222I+K231N+R242E+V248I; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E; Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D; Y11I+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D; Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D; Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D又は
Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D。
代替態様は、食品又は飼料製品を製造するための方法であって、
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに
食品又は飼料製品、例えば乳ベースの製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
を含む、方法に関し、
並びに、任意により具体的には、チーズ、例えばパスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズを製造するための方法、に関する。
従って、本発明は、本明細書に記載のキモシンポリペプチド(polypetide)変異体を含む、食品又は飼料製品に関する。
本発明のポリペプチド変異体はまた、チーズ及び、例えばヨーグルトのような他の乳製品における苦味を低減するために使用され得る。
チーズ熟成において、キモシンは、β−カゼインを主にLeu192とTyr193との間で切断する(参考文献2、3)。得られたペプチドβ(193−209)は、プロテアーゼによって、苦味がある短い疎水性ペプチドへとさらに分解されることになる(参考文献4)。乳製品用途における苦味は最も頻繁に望ましくない特徴とみなされるので、より低いβ−カゼイン切断頻度を有するキモシン変異体を開発することが望ましい。
異なる変異体の知的設計及び比較分析に基づいて、本発明者らは、多くのアミノ酸位置を同定し、このアミノ酸位置は、これらの位置の1又は複数における変異体を作製することによって、より低いβ−カゼイン切断頻度を有する改善されたキモシン変異体を得ることができるという意味で、本明細書において重要である。
変異体又は突然変異を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドの番号付けで行われる。明確化のために、配列番号2の成熟ポリペプチドは、配列番号4に対応する。
当該技術分野で知られているように、異なる哺乳動物種から得られた異なる天然野生型キモシンポリペプチド配列(例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット)は、比較的高い配列類似性/同一性を有している。
図1において、これは、本明細書で関連する異なるキモシン配列のアラインメントによって例示される。この比較的近い配列関係を考慮して、異なる天然野生型キモシンの3D構造も比較的類似していると考えられる。
本文脈において、天然に得られた野生型キモシン(例えばウシキモシン又はラクダキモシン)は、本明細書において親ポリペプチドの一例、すなわち、本発明の変異体キモシンポリペプチドを生成するために改変が成される親ポリペプチドであり得る。
理論に制限されることなく、本明細書で議論されたキモシンに関連するアミノ酸位置は、任意の本明細書に関連する目的のキモシン酵素(例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、ラットなどのキモシン)において一般的に重要であり、それは、これらの位置の1又は複数における変異体を作製することによって、一般的に改善されたキモシン変異体(例えば改善されたウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ又はラットキモシン変異体)を得ることができるという意味で、重要であると考えられる。
本明細書で議論されるように、目的の親キモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書における配列番号2の公知の成熟ヒトコブラクダ(Camelius dromedarius)キモシン配列が本明細書で使用される。それを本明細書では代わりにラクダキモシンと呼ぶことができる。当該配列はまた、本明細書の図1に示される。
本文脈において、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有する親キモシンポリペプチド(例えばヒツジ又はラット由来)は、本明細書に記載したアミノ酸位置のいずれかにおける変異体を作製することによって改善されるために、例えばウシ又はラクダキモシンに関して、本明細書において十分な構造として見ることができると考えられる。
本発明の実施形態を以下に説明する。
定義
本明細書において関連する用語の全ての定義は、本明細書で関連する技術的文脈に関して当業者により理解されることになるものに従う。
用語「β−切断」又は「β−カゼインの切断」は、β−カゼインの任意の酵素的切断を意味する。例えばLeu192とTyr193との間での切断は、β(193−209)ペプチドの形成をもたらす。一態様において、β−切断は、スキムミルクをキモシン変異体ポリペプチド又はラクダキモシンと共にインキュベートすることによって得られた、β(193−209)ペプチドを定量化することによって決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続されたRP−HPLCによって行われる。β−カゼイン切断を決定する好ましい方法の全詳細は、実施例に記載される。
用語「キモシン」は、EC3.4.23.4クラスの酵素に関する。キモシンは高い特異性を有し、カゼインのκ−鎖における単一104−Ser−Phe−|−Met−Ala−108結合の切断によって、主に乳を凝固させる。副活性(side-activity)として、キモシンはまた、β−カゼインを主にLeu192とTyr193との間で切断する(参考文献2、3)。得られたペプチドβ(193−209)は、プロテアーゼによって、苦味がある短い疎水性ペプチドへとさらに分解されることになる(参考文献4)。当該技術分野で使用されるキモシンの代替名は、レンニンである。
用語「キモシン活性」は、本文脈において当業者によって理解される、キモシン酵素のキモシン活性に関する。当業者は、本明細書において関連するキモシン活性の決定方法を知っている。
用語「凝固比活性」は、キモシンポリペプチドの乳凝固活性を説明し、当該技術分野でよく知られているアッセイに従って決定することができる。IMCU/mgタンパク質の単位で凝固比活性を決定するための好ましい方法は、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法(IDF法)であり、それは、乳凝固活性が、乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定され、そして試料の凝固時間が、既知の凝乳活性、及びIDF標準110Bによる試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較される、ステップを含む。試料及び参照標準は、同一の化学的及び物理的条件下で測定される。IDF法の全詳細は実施例に記載される。
当該技術分野において知られているように、本明細書で関連するいわゆるC/P比は、凝固比活性(C)をタンパク質分解活性(P)で割ることによって決定される。当該技術分野において知られているように、より高いC/P比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。
用語「単離された変異体」は、人間の行為によって改変された変異体を意味する。一態様において、当該変異体は、SDS PAGEにより決定されるように、少なくとも1%純粋、例えば、少なくとも5%純粋、少なくとも10%純粋、少なくとも20%純粋、少なくとも40%純粋、少なくとも60%純粋、少なくとも80%純粋、及び少なくとも90%純粋である。
本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために本明細書で使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟ペプチドの番号付けで行われる。配列表において、本願に以下の配列が提供される:
配列番号1は、ウシプレ−プロキモシン(prochmyosin)の完全なポリペプチド配列を表す;
配列番号2は、ラクダプレ−プロキモシンの完全なポリペプチド配列を表す;
配列番号3は、成熟ウシキモシンのポリペプチド配列を表す;
配列番号4は、成熟ラクダキモシンのポリペプチド配列を表す。
換言すれば、配列番号3及び4は、それぞれ配列番号1及び2のアミノ酸59〜381に対応する。本明細書で同定された特定の置換の全ては、成熟キモシン配列の位置に関連して、すなわち配列番号3又は4のアミノ酸の番号付けに関連して、同定されている。その位置が配列番号1又は2のアミノ酸の番号付けに関連して同定される限りにおいて、配列番号3又は4における位置を同定するために58残基を減算しなければならず、逆もまた同様である。
用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばN末端プロセシング、C末端切断、グリコシル化、リン酸化などの後の、その最終形態のペプチドを意味する。本文脈において、本明細書で関連する成熟キモシンポリペプチドは活性キモシンポリペプチド配列、すなわちプレ−部分及び/又はプロ−部分の配列を有さないものとして見られる。本明細書で関連する成熟ポリペプチドの例は、例えば、配列番号1のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381である、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチド、あるいは、配列番号2のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381である、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドである。
用語「親」、「親ポリペプチド」又は「キモシン活性を有する親ポリペプチド」は、本発明の酵素変異体を生成するために改変が成されるポリペプチドを意味する。この親は、天然に存在する(野生型)ポリペプチド又はその変異体であり得る。本発明の好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号4のポリペプチド(ラクダキモシン)と、少なくとも80%、例えば、少なくとも例えば85%、95%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有する。
用語「配列同一性」は、2つのアミノ酸配列間又は2つのヌクレオチド配列間での関連性に関する。
本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、Trends Genet.16:276-277)に実装されるような、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman及びWunsch、1970、J.Mol.Biol.48:443-453)、好ましくはバージョン3.0.0以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップ伸長ペナルティ、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」(-nobriefオプションを用いて得られる)の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される:
(同一残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)
本発明の目的のために、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、EMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite、Rice et al.、2000、上記参照)に実装されるような、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman及びWunsch、1970、上記参照)、好ましくはバージョン3.0.0以降、を用いて決定される。使用された任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップ伸長ペナルティ、及びEDNAFULL(NCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識「最長同一性」(-nobriefオプションを用いて得られる)の出力がパーセント同一性として使用され、そして次の通りに計算される:
(同一デオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数)。
用語「変異体」は、改変、すなわち、置換、挿入、及び/又は欠失を、1又は複数の(いくつかの)位置に含む、キモシン活性を有するペプチドを意味する。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の、異なるアミノ酸での置き換えを意味し;欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し;そして挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して1〜3個のアミノ酸を付加することを意味する。アミノ酸は天然又は非天然アミノ酸であってもよく、例として、例えばD−アラニンの、例えば特にD−異性体(又はD−型)による置換が、理論的に可能であり得る。
用語「野生型」ペプチドとは、天然に存在するヌクレオチド配列又はペプチド配列、すなわち、人間の行為による標的化された突然変異に供されていないヌクレオチド配列又はペプチド配列をいう。
本明細書で関連する異なるキモシン配列のアラインメント。示された「Bos_bovis_chymosin_B」は本明細書における配列番号1のウシキモシンであり、示された「ヒトコブラクダ(Camelus_dromedarius)」は本明細書における配列番号2のラクダキモシンである。本明細書に記載された参照配列として配列番号1のウシキモシンを用いると、例えば、ウシキモシンが位置10に「V」を有し、かつラクダキモシンが同じ位置10に「A」を有することがわかる。また、例えば、ウシ/ラット(Rat)は位置352に「Q」を有し、かつラクダ/フタコブラクダ(C._bactrianus)は同じ位置352に「E」を有することもわかる。図1に示されたキモシン配列に関連して、ヒツジ(Sheep)はウシ配列番号1と94.5%の配列同一性を有し;フタコブラクダ(C._bactrianus)は、ウシ配列番号1と83.2%の配列同一性を有し;ヒトコブラクダ(Camelus_dromedarius)(配列番号2のラクダキモシン)は、はウシ配列番号1と84%の配列同一性を有し;ブタ(Pig)はウシ配列番号1と80.3%の配列同一性を有し、そしてラットはウシ配列番号1と71.9%の配列同一性を有する。本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン−すなわち配列番号1のアミノ酸位置59〜381)と、例えばヒツジ、フタコブラクダ(C._bactrianus)、ラクダ、ブタ又はラットキモシンの成熟ポリペプチド配列との、本明細書で関連する配列同一性パーセンテージは、上述の配列同一性パーセンテージに比較的類似している。 紫で示された、結合したβ−カゼインのモデルを有するラクダキモシン(PDB:4AA9)の3D構造。β−カゼインは、残基192と193との間の切断可能な結合でキモシン基質の結合溝に配置されている。ラクダキモシン残基V32、L130、及びS132は緑色で強調されている。 紫で示された、結合したβ−カゼインのモデルを有するラクダキモシン(PDB:4AA9)の3D構造。β−カゼインは、残基192と193との間の切断可能な結合でキモシン基質の結合溝に配置されている。ラクダキモシン残基V32、L130、及びS132は緑色で強調されている。 ラクダキモシンの3D構造(PDB:4AA9)。ラクダキモシン残基V32及びL12は、緑色で強調されている。
発明の詳細な説明
目的のキモシンのアミノ酸位置の決定
上記で論じたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号2として開示された公知のラクダキモシン配列が使用される。
別のキモシンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1に開示されたポリペプチドとアラインされ、そしてアラインメントに基づいて、配列番号1に開示されたポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、本明細書の実施例1に記載のClustalWアルゴリズムを用いて決定される。
上記のよく知られたコンピュータープログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
本明細書の図1には、アラインメントの一例が示されている。
単なる一例として、図1において、例えば、本明細書で使用されるウシ参照配列番号1は位置50に「G」を有し、かつ「ヒトコブラクダ(Camelus_dromedarius)」(本明細書の配列番号2)はこの位置50に「A」を有することがわかる。
変異体の命名法
本発明の変異体を説明する際に、以下に記載した命名法が参照を容易にするために適用される。認められたIUPACの一文字又は三文字のアミノ酸の略号が使用される。
以下、この「命名法」セクションで論じた特定の変異体は、本明細書で関連する本発明の変異体でなくてもよく、すなわち、この「命名法」セクションは単に、本明細書で関連する使用された命名法それ自体を説明する。上記に示したように、本発明のキモシンポリペプチド変異体を特定するために使用されるアミノ酸の番号付けは、成熟キモシンポリペプチド配列におけるアミノ酸の位置に基づいている。
置換
アミノ酸置換のために、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置226でのアラニンによるスレオニンの論理的置換は、「Thr226Ala」又は「T226A」として指定される。複数の突然変異は、追加の印(「+」)により分離され、例えば、「Gly205Arg+Ser411Phe」又は「G205R+S411F」はそれぞれ、位置205及び411での、アルギニン(R)によるグリシン(G)の、及びフェニルアラニン(F)によるセリン(S)の置換を表す。置換、例えば指定された「226A」は、位置226でのアラニンによる親アミノ酸(例えばT、Q、S又は別の親アミノ酸)の置換を意味する。同様に、指定された「A226」又は「A226X」の置換は、位置226におけるアラニンの、別の不特定のアミノ酸による置換を意味する。
欠失
アミノ酸欠失に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、*。従って、位置195でのグリシンの欠失は、「Gly195*」又は「G195*」として指定される。複数の欠失は、追加の印(「+」)により分離され、例えば、「Gly195*+Ser411*」又は「G195*+S411*」となる。
挿入
アミノ酸挿入に関しては、次の命名法が使用される:元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置195でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」又は「G195GK」と指定される。複数のアミノ酸の挿入は、[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸#1、挿入されたアミノ酸#2;など]と指定される。例えば、位置195でのグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Gly195GlyLysAla」又は「G195GKA」として示される。
そのような場合、挿入されたアミノ酸残基(複数)は、挿入されたアミノ酸残基(複数)の前のアミノ酸残基の位置番号に小文字を付加することによって、番号付けされる。したがって、上記例において、配列は次の通りである:
Figure 0006856551
複数の改変
複数の改変を含む変異体は、追加の印(「+」)によって分離され、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」又は「R170Y+G195E」は、それぞれ、位置170及び195でのアルギニン及びグリシンについての、チロシン及びグルタミン酸の置換を表す。
異なる置換
異なる置換が1つの位置に導入され得る場合、その異なる置換はコンマによって分離され、例えば、「Arg170Tyr,Glu」又は「R170Y,E」は、位置170でのチロシン又はグルタミン酸による、アルギニンの置換を表す。したがって、「Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala」又は「Y167G,A+R170G,A」は、以下の変異体を指定する:
「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」、及び「Tyr167Ala+Arg170Ala」。
好ましい変異体:
以下の実施例に概説したように、本発明者らは、少なくともその凝固活性を維持しながら、対応する親ポリペプチドよりも低い頻度でβ−カゼインを切断する、多くの好ましいキモシンポリペプチド変異体を作製した。
β−カゼイン切断頻度が低減された好ましい変異体:
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも80%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも97%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を含む。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、配列番号4のポリペプチド(ラクダキモシン)と少なくとも80%、例えば、少なくとも例えば80%、85%、95%、97%、98%、99%の配列同一性を有する、親ポリペプチドに由来し得る。
本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、1又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含んでもよく、ここで、当該1又は複数の置換、欠失又は挿入は、配列番号4のアミノ酸配列に関して次のように特定されている:Y11、L130、S132、V32、S226、R266、L12、V221、S255、S277、L222、L253、M157、V260、S271、H76、K19、V183、S164、I263、V51、T239、Y307、R67、G251、R61、Q288、E83、D59、V309、S273、G251、S154、Y21、V203、L180、E294、G289、L215、D144、I303、L105、T284、Y127、V248、K321、V205、E262、K231、R316、M256、D158、D59、N249、L166、R242又はI96例えばY11I、Y11V、L130I、S132A、V32L、S226T、R266V、L12M、V221M、S255Y、S277N、L222I、L253I、M157L、V260T、S271P、H76Q、K19T、V183I、S164G、I263L、V51L、T239S、Y307F、R67Q、G251D、R61Q、Q288E、E83S、D59N、V309I、S273Y、G251W、S154A、Y21S、V203A、L180I、E294Q、G289S、L215V、D144Q、I303L、L105E、T284S、Y127F、V248I、K321P、V205I、E262T、K231N、R316L、M256L、D158S、D59N、N249E、L166V、R242E及び/又はI96L。
関連態様において、本発明の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、置換の組み合わせを含んでもよく、ここで当該置換の組み合わせは、以下を含むリスト:
Y11+K19+D59+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251;
Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+N249+G251+L253; Y11+K19+I96+S164+L166+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+I96+S164+L166+L222+R242+N249+G251; Y11+K19+D59+I96+S164+L222+R242+N249; Y11+K19+D59+I96+S164+L166+R242+G251; Y11+I96+S164+L222+R242; Y11+D59+I96+S164+L222+R242+G251又はY11I+K19+D59+I96+S164+ +R242+N249+G251例えば
Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I; Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E; Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D; Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E; Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D又はY11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D、
から選択され、ここで、各置換は、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている。
関連態様において、変異体は、キモシン活性を有する親ポリペプチドと比較して、1又は複数の特定の位置における改変を含んでもよく、ここで、当該改変は、以下の位置11、130、132、32、226、266、12、221、255、277、222、253、157、260、271、76、19、183、164、263、51、239、307、67、251、61、288、83、59、309、273、251、154、21、203、180、294、289、215、144、303、105、284、127、248、321、205、262、231、316、256、158、59、249、166、242又は96、のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含んでおり、ここで、親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと親ポリペプチドとのアラインメントによって決定され、そして親ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381である、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと、少なくとも65%の配列同一性を有し、ここで、単離されたキモシンポリペプチド変異体は、対応する親ポリペプチドよりも低い頻度でβ−カゼインを切断する。
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば、少なくとも例えば85%、95%、97%、98%、99%の配列同一性を有する。
好ましくは、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は変異体であり、ここで、当該変異体は、変異体が由来する親ペプチドと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を有する。
より好ましくは、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は変異体であり、ここで、当該変異体は、以下、
−本明細書における配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性;並びに
−本明細書における配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンと比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性、
を有する。
上記で論じたように、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)のアミノ酸位置を決定するための参照配列として、本明細書に配列番号2として開示された公知のラクダキモシン配列の成熟ペプチドが、本明細書で使用される。
上記で論じたように、例えば本明細書で論じられたコンピューター配列アラインメントプログラムに基づいて、本明細書で関連する目的のキモシンポリペプチド(例えばラクダ、ヒツジ、ウシなど)の本明細書で関連するアミノ酸位置を決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
用語「親ポリペプチドが配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有する」とは、本明細書で関連するその変異体を作製するために使用される親キモシンポリペプチドの配列に基づく制限に関連するものとして見られる。
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも92%の配列同一性を有し、より好ましくは、親ポリペプチドは配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有し、さらにより好ましくは、親ポリペプチドは配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも97%の配列同一性を有する。親ポリペプチドは配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドであることが好ましいであろう。
本文脈において当業者によって理解されるように、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、例えばすでに、例えば対応する野生型キモシンの、変異体であり得る。
換言すれば、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求される位置以外の位置において、改変(例えば置換)を含み得る。
本明細書の図1に示されたキモシン配列に関して、ヒツジはウシ配列番号1と94.5%の配列同一性を有し;フタコブラクダ(C._bactrianus)(ラクダ)はウシ配列番号1と83.2%の配列同一性を有し;ブタはウシ配列番号1と80.3%の配列同一性を有し、そしてラットはウシ配列番号1と71.9%の配列同一性を有する。
本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン−すなわち配列番号1のアミノ酸位置59〜381)と、例えば成熟ヒツジ、フタコブラクダ(C._bactrianus)、ラクダ、ブタ又はラットキモシンとの、本明細書で関連する配列同一性パーセンテージは、上述の配列同一性パーセンテージと比較的類似している。
好ましくは、本明細書に記載の単離されたウシキモシンポリペプチド変異体は変異体であり、ここで、当該変異体は、配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのβ−カゼイン切断頻度と比較して、より低いβ−カゼイン切断頻度を与えるキモシン活性を有する。
上記で論じたように、本明細書の実施例において、親ポリペプチドとして配列番号2(ラクダキモシン)のポリペプチドを用いて変異体が作製された。そのような変異体は、本明細書において、ラクダキモシン変異体と称され得る。
本文脈において当業者によって理解されるように、単離されたキモシン変異体は、上記で与えられた以外のアミノ酸位置における改変(例えば置換)を含み得る。
例として、配列番号2の野生型ラクダキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するラクダキモシン変異体は、依然として、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ポリペプチドであろう。
単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して30未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して20未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して10未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して5未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合がある。
本文脈において当業者によって理解されるように、上記の用語「単離された変異体ポリペプチドが配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと100%未満の配列同一性を有する」とは、本明細書に記載の単離されたラクダキモシン変異体が、配列番号2の公知の野生型ラクダキモシン配列と100%同一であるポリペプチド配列を有するものではないことに関する。
好ましい実施形態は、改変が、本明細書で請求された位置のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、単離されたラクダキモシンポリペプチド変異体に関する。
少なくとも1つの改変が置換であることが好ましい場合があり、すなわち、本明細書で関連する好ましい実施形態は、改変が、本明細書で請求された位置のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換を含んでいる、単離されたキモシンポリペプチド変異体に関する。
キモシン活性を有する好ましい親ポリペプチド:
好ましくは、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)及び/又は配列番号2(ラクダキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも80%、例えば85%、90%、95%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する。
単なる一例として、本明細書で好適な関連する親ポリペプチドは、例えばウシキモシンAであり得る。当該技術分野において知られているように、ウシキモシンAは、本明細書における配列番号1のウシキモシンBと比較して、1個のアミノ酸の差異のみを有し得る。
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも90%の配列同一性を有し、より好ましくは 親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有し、さらにより好ましくは親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも97%の配列同一性を有する。親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。
本文脈において当業者によって理解されるように、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドは、例えばすでに、例えば対応する野生型キモシンの変異体であり得る。
例として、配列番号1の成熟野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
換言すると、一般的には、本明細書で関連する単離されたキモシンポリペプチド変異体は、本明細書で請求された位置以外の位置における改変(例えば置換)を含み得る。
本文脈において当業者によって理解されるように、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダ)と少なくとも90%の配列同一性を有する親ポリペプチドは、依然として、配列番号1(ウシ)に基づく配列同一性要件の範囲内である。すなわち、それは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも65%の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも92%の配列同一性を有し、より好ましくは親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有し、さらにより好ましくは親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも97%の配列同一性を有する。親ポリペプチドは、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドであることが好ましい場合がある。
本文脈において当業者によって理解されるように、単離されたキモシン変異体は、上記で与えられた以外のアミノ酸位置における改変(例えば置換)を含み得る。
例として、配列番号1の野生型ウシキモシンポリペプチドと比較して、例えば5〜10の改変(例えば置換)を有するウシキモシン変異体は、依然として、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと少なくとも95%の配列同一性を有する親ペプチドであろう。
単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して30未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して20未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して10未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合があり、又は、単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1(ウシキモシン)の成熟ポリペプチドと比較して5未満のアミノ酸改変(例えば置換)を含むことが好ましい場合がある。
配列番号2のラクダキモシンポリペプチドは、配列番号1のウシポリペプチド(すなわち、プレ及びプロ配列を含む、位置1〜381の完全な配列番号1)と、84%の配列同一性を有する。
単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法
上記で論じた通り、当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体を日常的に生成及び精製し得る。
換言すれば、当業者が、本明細書で関連する目的のキモシン活性を有する親ポリペプチド(例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はラット由来)を保有したならば、そのような目的の親キモシンの変異体を作製することは、当業者にとって日常的な作業である。
キモシン(変異体又は親)を生成及び単離するための好適な方法の例は、例えば国際公開第02/36752A2号(Chr.Hansen)に記載されたような、よく知られた、例えば真菌組み換え発現/生成に基づく技法によるものであり得る。
キモシン活性を有する親ポリペプチドにおける1又は複数の位置で、改変を行うことも、当業者にとって日常的な作業であり、ここで、当該改変は、少なくとも1つのアミノ酸位置における置換、欠失又は挿入を含んでいる。
当業者に知られているように、これは例えば、いわゆる部位特異的突然変異誘発、及び組み換え発現/生成に基づく技法によって行われ得る。
本明細書で関連する親ポリペプチド(例えばラクダ又はウシ野生型キモシン)及び/又は本明細書で関連する変異体が、キモシン活性を有するか否かを決定することはまた、当業者にとって日常的な作業である。当該技術分野において知られているように、キモシン特異性は、いわゆるC/P比によって決定することができ、この比は凝固比活性(C)をタンパク質分解活性(P)で割ることによって決定される。
当該技術分野において知られているように、より高いC/P比は、一般に、非特異的タンパク質分解による例えばチーズ製造中のタンパク質の損失が低減されること、すなわちチーズの収率が向上されることを意味する。
また、当該技術分野において知られているように、β−カゼイン切断及びβ−カゼイン(β(193−209)を含む)形成は、当業者に利用可能な標準的な方法を用いて決定され得る。
乳ベースの製品を製造するための方法
上記で論じたように、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体は、当該技術に従って、例えば目的の乳ベースの製品(例えばチーズ製品)を製造するために、使用され得る。
上記で論じたように、本発明の一態様は、食品又は飼料製品を製造するための方法であって、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに、食品又は飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、を含む、方法に関する。
好ましくは、前記食品又は飼料製品は乳ベースの製品であり、ここで、当該方法は、本明細書に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、乳に添加し、並びに乳ベースの製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、を含む。
例えば、本発明のキモシンポリペプチド変異体は、乳の発酵後に、乳ベースの製品に添加され得る。一態様において、本発明のキモシンポリペプチド変異体は、チーズの製造方法の一部として、発酵乳製品の凝固のために添加される。
前記乳は、例えば豆乳、ヒツジ乳、ヤギ乳、バッファロー乳、ヤク乳、ラマ乳、ラクダ乳又は牛乳であり得る。
前記乳ベースの製品は、例えば発酵乳製品、例えばクワルク(quark)又はチーズであり得る。
食品及び飼料製品
本発明はまた、本発明のキモシンポリペプチド変異体、又は本発明の方法に従って得ることができるキモシンポリペプチド変異体を含む、食品及び飼料製品を提供する。前記食品及び飼料製品は、好ましくは発酵食品、例えばチーズ及びクワルクを含む発酵乳製品である。
さらに関連する態様において、本発明は、食品又は飼料製品を製造するための方法であって、本発明に係る単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を添加すること、を含む、方法に関する。好ましくは、前記食品又は飼料製品は乳ベースの製品である。
本発明のキモシンポリペプチド変異体はまた、チーズを製造するためのプロセスにおいて、例えばチーズの苦味を低減するために、使用され得る。
実施例
実施例1:キモシンタンパク質配列及び変異体配列のアラインメント及び番号付け
キモシンタンパク質配列を、EBI(EBI、ツール、複数の配列アラインメント、CLUSTALW”、http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)によって提供され、Larkin MA、Blackshields G、Brown NP、Chenna R、McGettigan PA、McWilliam H、Valentin F、Wallace IM、Wilm A、Lopez R、Thompson JD、Gibson TJ、Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21)、2947-2948に記載された、ClustalWアルゴリズムを用いてアラインした。
複数の配列アラインメントのためのClustalW2設定は、タンパク質重量マトリックス=BLOSUM、GAP open=10、GAP EXTENSION= 0.05、GAP DISTANCES=8、No End Gaps、ITERATION=none、NUMITER=1、CLUSTERING=NJ、であった。
参照配列として、ウシキモシンBプレプロキモシンを使用し(Genbank受託番号P00794−配列番号1として本明細書に開示される)、ここで、N−末端メチオニンは番号1を有し(MRCL……)、そしてC−末端イソロイシン(タンパク質配列中…LAKAI)は番号381を有する。
実施例2:キモシン変異体の設計
キモシン変異体を異なる戦略を用いて設計した。
ラクダキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンに言及される。配列番号2のラクダキモシンは、そのラクダキモシン変異体を作製するために使用される、本明細書で関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドとして見られる。
ウシキモシンに言及される場合、本明細書における配列番号1のポリペプチドを含むウシキモシンに言及される。配列番号1のウシキモシンは、そのウシキモシン変異体を作製するために使用される、関連するキモシン活性を有する親ポリペプチドとして見られる。
ラクダキモシンの変異体1〜269及び367〜461は、ウシキモシンBと比較して25%以上の同一性を有する多くの組の公知のアスパラギン酸プロテアーゼ配列の、アラインメントに基づいて設計された。一般に、変異は、種間で高レベルのアミノ酸変異を有する領域に導入されたが、保存された領域は変更されなかった。アミノ酸置換は、β−カゼイン切断に対して有益な効果を示す可能性が高い変化を同定するために、系統学的、構造的及び実験的情報に基づいて選択された。複数の変異を各変異体構築物に導入して、種々の置換の間の共変動の影響を最小限にするために、各単一突然変異が複数の変異体構築物に存在することを確実にした。実験データの機械学習及び統計分析を使用して、キモシン変異体の測定された凝固性能に対するアミノ酸置換の相対的寄与を決定した(参考文献14、15)。
変異体271〜366を、ウシキモシン(PDBコード:4AA8)及びラクダキモシン(PDBコード:4AA9)の詳細な構造分析に基づいて設計した。変異を、それぞれのアミノ酸側鎖の化学的性質、及びカゼイン基質結合又は一般的酵素特性のいずれかに対するその予想される影響に基づいて選択した。変異体271〜346におけるアミノ酸置換の大部分は、基質結合溝内に又はそれに構造的に近接しているいずれかの配列位置で、あるいは結合したカゼイン基質と接触する二次構造要素で、作製された。さらに、変化は、これらの領域の電荷プロファイルを変更する、タンパク質表面上の位置で成され(参考文献5)、それゆえ、酵素性能に影響を及ぼすことが予想される。変異体347〜366は、ウシ及びラクダキモシンにおけるN−末端配列の異なる構造配座に基づいて作製された。アミノ酸置換は、ラクダキモシンのN−末端と相互作用する基質結合溝内の位置で成された。
実施例3:キモシン変異体酵素材料の調製
全てのキモシン変異体を、合成遺伝子として合成し、真菌発現ベクター、例えばpGAMpR−Cにクローニングした(国際公開第02/36752A2号に記載)
ベクターを大腸菌(E.coli)に形質転換し、プラスミドDNAを当業者に既知の標準的な分子生物学プロトコルを用いて精製した。
変異体プラスミドを個々に、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)株に形質転換し、タンパク質を本質的に国際公開第02/36752A2号に記載のように産生し、標準的なクロマトグラフィー技法を用いて精製した。
当該技術分野において知られているように、当業者は、その共通の一般的知識に基づいて、キモシン及びキモシン変異体−例えば本明細書に記載のウシ及びラクダキモシン変異体を、生成及び精製することができる。
実施例4:特定のキモシン活性の決定
4.1 乳凝固活性の決定
乳凝固活性を、国際酪農連盟によって開発された標準的な方法(IDF法)である、REMCAT法を用いて決定した。
乳凝固活性を、0.5g/L(pH≒6.5)の塩化カルシウム溶液での、低温、低脂肪乳粉末から調製された標準乳基質の目視可能な凝集に必要とされる時間から決定する。レンネット試料の凝固時間を、既知の凝乳活性を有し、かつIDF標準110Bによって当該試料と同じ酵素組成を有する、参照標準の凝固時間と比較する。試料及び参照標準を、同一の化学的及び物理的条件下で測定した。変異体試料を、84mMの酢酸緩衝液pH5.5を用いて約3IMCU/mlに調整した。その後、200μlの酵素調製物を、一定の攪拌下で32℃±1℃の一定温度を維持することができる水浴中に配置した、ガラス試験管中の10mlの予熱した乳(32℃)に加えた。あるいは、20μLの酵素調製物を、上記のように1mLの予熱した乳に加えた。
レンネットの総凝乳活性(強度)を、以下の式に従って、試料と同じ酵素組成を有する標準に対して国際凝乳単位(IMCU)/mlで計算した:
IMCU/mlでの強度=S標準 x T標準 x D試料
D標準 x T試料
S標準:レンネットについての国際参照標準の凝乳活性
T標準:標準希釈について得られた秒での凝固時間
D試料:試料についての希釈係数
D標準:標準についての希釈係数
T試料:酵素の添加から凝集の時間までの希釈されたレンネット試料について得られた秒での凝固時間
ライブラリ1、3、4及び6変異体、並びに構造設計による変異体の凝固活性決定のために、μIMCU法を、REMCAT法の代わりに使用した。REMCATと比較して、μIMCUアッセイにおけるキモシン変異体の凝集時間を、UV/VISプレートリーダーで800nmにおける96−ウェルマイクロタイタープレートでのOD測定によって決定した。既知の凝固強度を有する参照標準の種々の希釈の標準曲線を、各プレートに対して記録した。84mMの酢酸緩衝液、0.1%のtriton X−100(pH5.5)により酵素を希釈することによって、試料を調製した。32℃での反応を、4%(w/w)低温、低脂肪乳粉末及び7.5%(w/w)塩化カルシウム(pH≒6.5)を含有する標準乳基質の250μLを、25μLの酵素試料に添加することによって、開始した。国際凝乳単位(IMCU)/mlでのキモシン変異体の乳凝固活性を、標準曲線に対する試料の凝集時間に基づいて決定した。
4.2 総タンパク質含有量の決定
総タンパク質含有量を、Thermo ScientificからのPierce BCA Protein Assay Kitを使用し、提供者の支持に従って決定した。
4.3 凝固比活性の計算
凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を、凝固活性(IMCU/ml)を総タンパク質含有量(mg総タンパク質/ml)で割ることによって決定した。
実施例5:β−カゼイン切断の決定
β−カゼイン加水分解活性の決定
乳タンパク質のキモシン媒介タンパク質分解を、pH4.6で抽出した水溶性ペプチドのプロファイルを決定することによって特徴づけた。96ウェルプレートで作製された無培養(culture free)チーズモデルを研究に使用した。簡潔には、グルコノ−デルタ−ラクトン(GDL)及び塩化カルシウムを添加した、Ollingegard、Denmarkからの750μlのスキムミルクを、96ディープウェルプレートのウェルに等分した。乳へのGDLの添加から10分後に、キモシンの変異体をプレートの個々のウェルに添加して、0.05IMCU/mlの最終活性とした。形成した凝塊を、ピペットチップで凝塊を十分に攪拌することによって、レンネットの添加から30分後に切断した;各ウェルに新しいチップを使用した。その後、プレートをさらに60分間放置した後、2500gで10分間プレートを遠心分離することによって、カード及びホエーを分離した。乳を、レンネッティング(renneting)、切断及び離水(syneresis)の間、30℃に保った。最後に、ホエーをプレートからデカントし、プレートに残ったレンネットカードのペレットを4日間室温で保存した。各ウェルに0.5Mのクエン酸三ナトリウムの500μlを添加し、プレートを37℃で24時間穏やかに振とうすることによって、ペプチドを抽出した。次に、ここで完全に溶解したレンネットカードを、4.4〜4.5の最終pHまで塩酸を添加することによって沈殿させた。プレートを遠心分離機でスピンダウンし、pH4.5可溶性ペプチドのさらなる分析のために上清を回収した。
pH4.5可溶性ペプチドのプロファイルを、ESI−Q−TOF質量分析計に接続したRP−HPLCを用いて決定した。質量分析計(G6540A Q−TOF、Agilent Technologies A/S、サンタクララ、カリフォルニア、USA)に接続された、液体クロマトグラフィーシステム(Agilent 1290 infinity、Agilent Technologies A/S、サンタクララ、カリフォルニア、USA)を用いて、分析を行った。LCシステムにおけるカラムは、Ascentis Express Peptide ES−C18m、2.7μm、100x2.1mm(Supelco、Sigma-Aldrich、セントルイス、USA)であった。移動相は、溶離液A(水中の0.1%ギ酸)、及び溶離液B(アセトニトリル:水中の0.1%ギ酸、9:1)からなる。2%Bでのカラムの平衡化後、10μLの試料容量を注入した。溶離液Bを15カラム容量にわたって2%から50%まで増加させることによって生成した勾配溶離によって、ペプチドを分離した。流速は0.44mL/分であった。214nmでのUV吸光度を連続的に測定することにより、ペプチドを検出した。100〜2000m/zのMSスキャンを実行することによって、質量スペクトルを収集した。各スキャンからの2つの最も強いイオンに対して、MS/MS分析を実施した。分析された全ての試料の等量からなる混合試料を調製し、この試料を各12試料について分析した。MSデータを、Agilent .dフォーマットから、MSConvert ver.3.0.6618を用いて.mzmlファイルに変換した。全てのさらなるデータ分析はR3.1.3を用いて行った。ペプチドを、Rパッケージ「MSGFplus」バージョン1.05を用いてMS/MSスペクトルから同定した。ペプチド同定のための検索データベースは、ウシの乳タンパク質:αs1−カゼイン、αs2−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、ラクトペルオキシダーゼ及びラクトフェリン、に限定された。セリンのリン酸化及びメチオニンの酸化が、可変修飾として含まれた。Rパッケージ「xcms」v.1.42.0を、Smithら(2006)に従って試料セットにおける試料にわたってピークを検出及びグループ化するために使用した。Massifquant法をピーク検出のために使用し、ピークのグループ化は密度法に基づいて行った。同一性は、β−カゼイン193−209を含む同定されたペプチドの定量的表をもたらす、グループ化されたピークに割り当てられた。
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析
統計的機械学習アプローチ及びPCAに基づく分析を用いて、位置192/193でのβ−カゼインの切断に対する、マルチ置換ライブラリ1〜3、4及び6の変異体に存在する全ての単一突然変異の影響を決定した。
結果
マルチ置換ライブラリ1
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシンの変異体を生成し、上記のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
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表1には、位置192/193でのβ−カゼインの切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての酵素変異体は、実験において0.05IMCU/mLの正規化された濃度で使用されたため、低いβ−カゼイン切断は、低い一般的酵素活性よりもむしろ、β−カゼイン192/193を超えるκ−カゼイン104/105の切断についてのそれぞれの変異体の高い特異性を示す。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の半分以下を有する変異体は、太字で強調されている(変異体9、16、26、39、47、51、60、68、78、84、95)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異のパターンと比較して、突然変異V32L、L130I、及びS132Aが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する6つの変異体のうち4つ、突然変異L130Iを有する6つの変異体のうち4つ、及び突然変異S132Aを有する5つの変異体のうち3つが、野生型ラクダキモシンの50%と等しいかそれ未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。
ラクダキモシンの三次元構造において、位置V32は基質ペプチド配列のP1残基と相互作用しており(図2)、一方で、位置L130及びS132はそれぞれ、P5´(L130)並びにP2´及びP6´(S132)と相互作用している(図3;参考文献5〜10)。キモシン基質結合部位における3つの位置の配置は、突然変異V32L、L130I、及びS132Aが、より低いβ−カゼイン192/193切断を引き起こし、したがって、κ−及びβ−カゼインとの直接的な相互作用によって、一定の凝固強度でβ−カゼインフラグメントβ(193−209)のより低い生成を引き起こすことを示唆している。変異体セットを通して最も低いβ−カゼイン192/193切断を示している、変異体95は、突然変異V32L及びL130Iの両方を含んでいる。これは、カゼイン基質特異性に対する突然変異の影響の加法性を示唆している。
マルチ置換ライブラリ2
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、REMCAT法を用いて決定した。
Figure 0006856551
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表2には、位置192/193でのβ−カゼインの切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての酵素変異体は、実験において0.05IMCU/mLの正規化された濃度で使用されたため、低いβ−カゼイン切断は、低い一般的酵素活性よりもむしろ、β−カゼイン192/193切断を超えるκ−カゼイン104/105の切断についてのそれぞれの変異体の高い特異性を示す。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の25%未満を有する変異体は、太字で強調されている(変異体110、112、122、125、132)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異のパターンと比較して、突然変異V32Lが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する6つの変異体のうち5つが、野生型ラクダキモシンの25%と等しいかそれ未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。これらの結果は、先の変異体セットの所見及び結論を支持する。
マルチ置換ライブラリ3
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の第3のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシンと同一のアミノ酸配列を有する。ウシ及びラクダキモシンのいずれも、参照として含まれた。凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表3には、位置192/193でのβ−カゼインの切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての酵素変異体は、実験において0.05IMCU/mLの正規化された濃度で使用されたため、低いβ−カゼイン切断は、低い一般的酵素活性よりもむしろ、β−カゼイン192/193を超えるκ−カゼイン104/105の切断についてのそれぞれの変異体の高い特異性を示す。
β−カゼインに対する野生型タンパク質分解活性の10%未満を有する変異体は、太字で強調されている(変異体150、161、165)。それらにおいて、示された変異体セット全体に存在する突然変異パターンと比較して、突然変異V32Lが過剰に出現している。突然変異V32Lを有する3つ全ての変異体が、野生型ラクダキモシンの10%未満のβ−カゼイン192/193切断を示している。
この変異体セットからの1つの変異体のみ(変異体176)が、野生型ラクダキモシンと比較して50%を超えるβ−カゼイン192/193切断を示している。これはまた、突然変異L12Mを欠いているこのセットからの唯一の変異体である。
位置L12は、酵素の基質結合溝に結合しているラクダキモシンのN−末端の近くの配列ストレッチに位置している(図4)。ラクダキモシンにおいて、N−末端配列は、基質が結合していない時に、酵素の基質結合溝をブロックしていることが記載されている(参考文献5)。カゼイン基質分子は、活性部位に結合するためにこのN−末端配列を置き換える必要があり、続いて切断される。酵素のこの不活性形態を安定化しているキモシンにおける突然変異は、結果として基質結合を減少させ、したがって、カゼイン切断特異性に影響を与え得る。本発明者らは、この作用のモードを突然変異L12Mに結論付けた。ラクダキモシンの三次元構造において、位置L12及びV32は互いに直接接触している。β−カゼイン結合に対するその直接的な影響に加えて、V32Lが同様に酵素の不活性形態を安定化し得る。両方の突然変異を含む変異体(150、161、165)は、このセットの全ての変異体の中で最も低いβ−カゼイン192/193切断を示したので、カゼイン基質特異性に対するそれらの影響は加法的であると思われる。
マルチ置換ライブラリ1〜3の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ1〜3のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表4に示す。
Figure 0006856551
得られた結果に基づいて、表4に示された突然変異がβ−カゼイン192/193切断を減少させ、上述の突然変異L130I、S132A、V32L、及びL12Mが突然変異の中で最も強い影響を有すると結論付けられる(表4に太字で強調されている)。表4に示された突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
マルチ置換ライブラリ4
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表5には、β−カゼイン192/193の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して、44%〜93%減少したタンパク質分解活性を明らかにしている。
マルチ置換ライブラリ4の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ4変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を表6に示す。
Figure 0006856551
得られた結果に基づいて、表6に示された突然変異がβ−カゼイン192/193切断を減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
マルチ置換ライブラリ5
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
凝固活性をREMCAT法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表7には、β−カゼイン192/193の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。47個の変異体のうち、46個が野生型ラクダキモシンと比較して、16%〜83%減少したタンパク質分解活性を明らかにしている。
マルチ置換ライブラリ5の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ5変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表8に示す。
Figure 0006856551
得られた結果に基づいて、表8に示された突然変異がβ−カゼイン192/193切断を減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
ラクダキモシンにおける構造に基づく変異
ラクダキモシン(配列番号2)の変異体を、タンパク質構造分析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表9)。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表9に示された結果に基づいて、突然変異K19T、Y21S、V32L、D59N、H76Q、I96L、L130I、S132A、Y190A、L222I、S226T、D290E、D290L、R242E、R242Q、Y243E、G251D、R254S、S273D、S273Y、Q280E、F282E、G289S、及びV309Iが、β−カゼイン192/193の切断を10%超減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
表9に示された減少したβ−カゼイン192/193の切断を有する24個の変異体のうち10個が、基質結合溝内に又はその構造的近接に突然変異(V32L、H76Q、L130I、S132A、Y190A、L222I、S226T、G289S、D290E、D290L)を有し(図5)、β−カゼイン結合に対するそれらの突然変異の直接的な影響を示唆している。
表9に示された減少したβ−カゼイン192/193の切断を有する24個の変異体のうち9個が、図6に見られるように結合溝に近接して位置するタンパク質表面上の明確な領域に、突然変異(R242E、R242Q、Y243E、G251D、R254S、S273D、S273Y、Q280E、F282E)を有する。この領域は、位置P10〜P4(参考文献10)においてその正に荷電した配列Arg96〜His102(参考文献5、16〜18)と相互作用することによって、κ−カゼイン基質の結合を支持することが示唆されている。導入された突然変異は、タンパク質表面上のこの領域の正味の電荷を減少させることによって、それらの相互作用を強化し得る。κ−カゼインの結合の増加は最終的に、他の基質、例えばβ−カゼインの結合及び加水分解を阻害することになる。結果は、この領域における単一アミノ酸置換がC/Pを有意に増加させることができることを示す。
ラクダキモシンにおける負電荷の組み合わせ
ラクダキモシン(配列番号2)のより多くの変異体を、上記の表面領域(R242E、Y243E、G251D、N252D、R254E、S273D、Q280E)に、負電荷を導入する突然変異の組み合わせにより作製した。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た(表10)。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表10に示された全ての変異体が、非グリコシル化ラクダキモシンと比較して、減少したβ−カゼイン切断を明らかにしている。キモシン構造上の領域と相互作用するP10−P4に負電荷を導入することによるβ−カゼイン切断の阻害は、それぞれの突然変異の組み合わせによってさらに増強され得ると結論付けられる。
ウシキモシンにおける構造に基づく変異
ウシキモシン(配列番号1)の変異体を、タンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表11)。突然変異N252Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ウシキモシン(BovUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
I136Vを除いて、全ての突然変異が、表11に示された変異体においてβ−カゼイン192/193の切断の増加を引き起こした。特に、置換I136V、Q242R、D251G、S289G、及びE290Dは、ウシキモシンのβ−カゼイン切断を増加させたが、減少したβ−カゼイン切断が、ラクダキモシンにおけるそれぞれの逆突然変異V136I、R242Q、G251D、G289S、及びD290Eによって観察された(表9)。同様の影響が位置32に見られる。V32Lはラクダキモシンのβ−カゼイン切断の減少を引き起こしたが、Vに構造的に類似したβ分岐疎水性アミノ酸である、IへのL32の突然変異は、ウシキモシンのβ−カゼイン切断の増加をもたらした。これは、これらのアミノ酸変化が種を超えて、キモシン特異性に同様の効果を発揮することを実証している。
ラクダキモシンN−末端の変異
ラクダキモシン(配列番号2)の変異体を、基質結合溝内のN−末端配列Y11−D13の分子相互作用のタンパク質構造解析によって決定された位置におけるアミノ酸変化により作製した(表12)。突然変異N100Q及びN291Qを、これらの変異体及び参照ラクダキモシン(CamUGly)の両方のN−グリコシル化部位に導入して、非グリコシル化された均質なタンパク質試料を得た。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
ラクダキモシン構造の分析は、N−末端配列Y11−D13、並びにY11の潜在的な相互作用パートナーである位置D290における変異を導いた(図7)。カゼイン基質は、結合溝内に結合するためにN−末端キモシン配列と競合するので、結合溝とモチーフY11−D13との相互作用を変化させるアミノ酸置換は、種々のカゼイン基質に対する酵素活性に、したがって、β−カゼイン192/193の切断に、影響を与えることが期待される。それぞれの変異体347〜366の結果は、β−カゼイン切断の強い変異を示す(表12)。特に、変異体353及び355は、いずれも突然変異D290Eを有し、β−カゼイン切断の減少を明らかにしている。
マルチ置換ライブラリ6
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表13には、β−カゼイン192/193の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。50個全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して、19%〜97%減少したタンパク質分解活性を明らかにしている。
マルチ置換ライブラリ6の突然変異分析
β−カゼイン切断に対する位置及び突然変異の影響の統計分析を、ライブラリ6変異体のタンパク質分解データに基づいて行った。減少したβ−カゼイン切断に最も有益な突然変異を、表14に示す。
Figure 0006856551
得られた結果に基づいて、表14に示された突然変異がβ−カゼイン192/193切断を減少させることが結論付けられる。
これらの突然変異は、β−カゼインのC−末端フラグメント、β(193−209)のより少ない生成を引き起こすため、それらは、β−カゼインの切断を減少させることによる、より苦味の少ないチーズを製造するためのキモシン変異体における好ましい突然変異を表す。
野生型と比較して複数の置換をそれぞれ有するラクダキモシン変異体の別のセットを生成し、上述のように分析した。全ての変異体は、表に記載された変異を除いて、ラクダキモシン(配列番号2の成熟ポリペプチド)と同一のアミノ酸配列を有する。ラクダキモシン(CHY−MAX M)が参照として含まれる。
凝固活性は、μIMCU法を用いて決定した。
Figure 0006856551
表15には、β−カゼイン192/193の切断に関するデータを有するラクダキモシン変異体が示されている。45個全ての変異体は、野生型ラクダキモシンと比較して減少したタンパク質分解活性を示す。
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Claims (11)

  1. 単離されたキモシンポリペプチド変異体であって、
    (a)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の少なくとも70%である、凝固比活性(IMCU/mg総タンパク質)を有し;かつ
    (b)当該単離されたキモシンポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのβ−カゼイン切断の頻度の50%未満の頻度で、β−カゼインを切断し、ここで、β−カゼイン切断は、スキムミルクをキモシン変異体又はラクダキモシンと共にインキュベートすることにより得られたβ−カゼインペプチドを定量化することによって、決定され、ここで、定量化は、ESI−Q−TOF質量分析計に接続されたRP−HPLCによって行われる、
    ことを特徴と
    ここで、前記変異体が、以下を含むリスト:
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D;
    Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E;
    Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D;
    Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I;
    Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
    Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E;
    Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D;
    Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;又は
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
    から選択される置換の組み合わせを含み、
    ここで、各置換が、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている、単離されたキモシンポリペプチド変異体。
  2. 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの凝固比活性の、少なくとも75%を有する、請求項1記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
  3. 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドの非特異的タンパク質分解活性(P)の、50%未満有する、請求項1からのいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
  4. 前記ポリペプチド変異体が、配列番号4によって特徴づけられる単離されたラクダキモシンポリペプチドのC/P比の、少なくとも300%C/P比を有する、請求項1からのいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体。
  5. 請求項1からのいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体を作製するための方法であって、以下のステップ:
    (a):配列番号4のポリペプチドをコードするDNA配列中の1又は複数の位置で、改変を行い、ここで、当該改変が、以下の位置:Y11、L222、L253、K19、S164、G251、D59、N249、L166、R242及び/又はI96、
    のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸位置における置換を含み、
    (b):ステップ(a)の改変されたポリペプチドを生成及び単離すること、
    を含み、
    ここで、前記変異体が、以下
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11I+K19T+I96L+S164G+L166V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E+G251D;
    Y11I+I96L+S164G+L222I+R242E;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+G251D
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D
    Y11V+K19T+D59N+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+R242E;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+L166V+L222I+R242E+N249E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222I+R242E+N249E;
    Y11V+K19T+D59N+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+R242E+G251D;
    Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D+L253I;
    Y11V+D59N+I96L+S164G+L166I+L222I+R242E+G251D;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D+L253I;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+L253I;
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    Y11I+K19T+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11V+K19T+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;
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    Y11I+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+K19T+D59N+I96L+S164G+L222I+R242E;
    Y11I+K19T+D59N+S164G+L166I+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+I96L+L166V+L222V+R242E+G251D;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L222V+R242E+N249E+G251D;
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+G251D;
    Y11V+K19T+D59N+I96L+L222V+R242E+G251D;
    Y11I+K19T+S164G+L166I+L222V+R242E+N249E+G251D;又は
    Y11I+D59N+I96L+S164G+L166V+L222V+R242E+N249E+G251D、
    の置換の組み合わせの1又は複数を含み、
    ここで、各置換が、配列番号4のアミノ酸配列に関して特定されている、方法。
  6. 食品又は飼料製品を製造するための方法であって、
    請求項1からのいずれか一項に記載の単離されたキモシンポリペプチド変異体の有効量を、食品又は飼料成分(複数)に添加し、並びに
    食品又は飼料製品を得るためのさらなる製造ステップを実施すること、
    を含む、方法。
  7. 前記食品又は飼料製品が乳ベースの製品である、請求項に記載の方法。
  8. 請求項1からのいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド(polypetide)変異体を含む、食品又は飼料製品。
  9. チーズを製造するためのプロセスにおける、請求項1からのいずれか一項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
  10. パスタ・フィラータ、チェダー、コンチネンタルタイプチーズ、ソフトチーズ又はホワイトブラインチーズ、を製造するためのプロセスにおける、請求項に記載のキモシンポリペプチド変異体の使用。
  11. チーズの苦味を低減するための、請求項又は10に記載の使用。
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