ES2225857T3 - Cepas iniciadoras que expresan una proteasa de lactobacillus bulgaricus. - Google Patents
Cepas iniciadoras que expresan una proteasa de lactobacillus bulgaricus.Info
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Abstract
LA PROTEASA RECOMBINANTE PRTP DE LACTOBACILLUS BULGARICUS QUE POSEE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS SEQ ID NO:2, Y LAS PORCIONES PREPRO O DE ANCLAJE DE ESTA PROTEASA. UN ADN QUE CODIFICA LA PROTEASA PRTP Y LAS PORCIONES PREPRO O DE ANCLAJE. EL PROMOTOR DEL GEN PRTP DE LACTOBACILLUS BULGARICUS. UNA CELULA RECOMBINANTE QUE EXPRESA LA PROTEASA RECOMBINANTE PRTP. UN METODO PARA PRODUCIR LA PROTEASA RECOMBINANTE QUE COMPRENDE CULTIVAR CELULAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN LA PROTEASA RECOMBINANTE PRTP EN UN MEDIO DE CULTIVO ADECUADO EN CONDICIONES TALES QUE LAS CELULAS EXPRESEN DICHA PROTEASA RECOMBINANTE, Y OPCIONALMENTE AISLAR DICHA PROTEASA RECOMBINANTE EN FORMA DE UN CONCENTRADO. EL USO DE UNA CELULA RECOMBINANTE PARA LA FABRICACION DE PRODUCTOS LACTEOS FERMENTADOS.
Description
Cepas iniciadoras que expresan una proteasa de
Lactobacillus bulgaricus.
La presente invención se refiere a un sistema de
proteólisis del Lactobacillus bulgaricus, y especialmente con
el uso de la nueva proteasa recombinante PrtP para el desarrollo de
cepas iniciadoras eficientes con propiedades para la fermentación
acelerada.
El sistema de proteolisis es esencial para
asegurar un crecimiento rápido en la leche y para proporcionar a las
bacterias auxotroficas del ácido láctico los aminoácidos procedentes
de las caseínas, las proteínas mas abundantes en la leche. Este
sistema es complejo y ha sido extensivamente estudiado en los
lactococos (Kok et al., FEMS Microbiol. Rev, 87, 1542,
1990; Smid et al., Appl. Env. Microb., 57,
2447-2452, 1991; Pritchard et al., FEMS
Microbiol. Rev., 12, 179206, 1993).
El primer paso para la degradación de la caseína
de la leche lo lleva a cabo una proteasa de superficie celular,
PrtP. De acuerdo con su especificidad de sustrato, pueden
distinguirse dos tipos de PrtP. El tipo PI digiere preferentemente
la \beta-caseína, y el tipo PIII degrada las
caseínas \alpha, \beta y \kappa. Las PrtP de los lactococos
son serina proteasas y muestran una homología extensiva con las
subtilisinas segregadas por el género Bacillus. Las proteasas
de los lactococos se sintetizan como preproteínas inactivas. Un
péptido señal N-terminal de 33 residuos es eliminado
durante el paso a través de la membrana citoplasmática y el extremo
C-terminal permanece anclado en la cubierta celular.
Entonces el proceso de maduración lleva a la eliminación de la
región pro (154 residuos) en la que está implicada una lipoproteína
de membrana llamada PrtM. Esta proteína de 33 KDa está codificada
por un gen (prtM) que se encuentra situado inmediatamente
corriente arriba y en dirección opuesta del gen prtP. La
autodigestión del extremo carboxiterminal de PrtP da lugar a la
liberación del enzima al medio de cultivo. La incubación de las
células de los lactococos en un tampón libre de calcio estimula la
autodigestión y liberación de PrtP.
Los lactobacilos han sido investigados en menor
extensión, aunque presentan una elevada actividad proteasa en su
superficie celular con una especificidad diferente a la de loa
lacotococos (Bosman et al., FEMS Microbial. Rev., 12,
p. 72, 1993).
Las proteasas de superficie celular procedentes
de varios lactobacilos fueron purificadas: Lb. paracasei
subespecie paracasei NCDO 151, Lb. helveticus CNRZ 303
y L89, Lb. bulgaricus CNRZ 397 (Zevaco et al., Le
Lait, 68, 393-408, 1988; Laloi et al.,
Appl. Microbiol. Biotech., 36, 196-204, 1991;
Naes et al., J. Gen. Microbial., 138,
313-318, 1992; Martin Hernández et al., Appl.
Microbiol. Biotech., 40, 828-834, 1994). La
secuencia del gen que codifica para la proteasa de Lb.
paracasei fue clonada y la secuencia de aminoácidos deducida
muestra 1902 residuos y una elevada homología (96,6%) con la PrtP de
los lactococos. La presencia del gen prtM sugiere un proceso de
maduración similar a la de PrtP en lactococos. En contraposición,
las proteasas de los lactobacilos termófilos parecen diferentes. La
proteasa de Lb. helveticus CNRZ 303 se caracteriza por una
especificidad proteolítica original hacia la caseína
\alpha_{s1}. Las proteasas de Lb. bulgaricus CNRZ397 y
Lb. helveticus L89 no pueden ser liberadas de la pared
celular mediante el procedimiento que utiliza un tampón libre de
calcio. Además, el enzima de Lb. bulgaricus es sensible a los
inhibidores de las proteasas de serina y cisteína.
La proteasa de pared celular de Lb.
bulgaricus CNRZ397 muestra sin embargo propiedades bioquímicas
bastante diferentes. Este enzima ha sido purificado a partir de
extractos de pared celular obtenidos después del tratamiento con
lisozima y choque osmótico de las células enteras. Los inhibidores
de las proteasas de serina no tienen efecto sobre este enzima
caracterizado como una proteasa de cisteína con una masa molecular
de 170 KDa y que es capaz de hidrolizar cisteínas tanto alfa como
beta. El pH óptimo para la actividad del enzima es 5,5 en lugar del
rango entre 7,5 a 8,0 para la proteasa de Lb. helveticus. El
nivel de síntesis de la proteasa de la pared celular depende de la
naturaleza del medio de cultivo: aquellas células que han crecido en
un medio con leche presentan una mayor actividad que aquellas que
han sido desarrolladas en MRS (medio rico en péptidos).
En Mol. Gen Gent. 248 (1995), 407 - 416 se
describe un elemento IS de Lactobacillus delbrueckii
subespecie bulgaricus del cual se ha descubierto que se
encuentra localizado entre los dos loci LacZ y prtP.
Además, se revela un mapa de restricción de la mencionada área del
genoma bacteriano indicando la localización supuesta o aproximada
para los genes lacS y lacZ, el elemento ISL3 y el gen
prtP.
En J. of Appl. Bacteriol. 41 (1976),
175-184 se decribe una actividad proteasa durante el
crecimiento de Lactobacillus bulgaricus. Los autores de este
artículo informan de que la actividad proteasa descubierta - medida
mediante un sustrato específico (dimetilcaseína) - se encuentra
unida a la membrana celular del microorganismo.
La presente invención tiene el objetivo de
utilizar un gen efectivo de una proteasa para desarrollar cepas
iniciadoras diarias con propiedades para la fermentación acelerada.
Esta proteasa debe ser activa sin necesidad de un paso adicional de
maduración que implique a otra proteína. Además, el nivel de
actividad de esta proteasa debe de ser suficiente, aunque no
demasiado elevado, para permitir una fermentación acelerada de
productos diarios, sin acelerar la degradación de estos productos a
temperatura de refrigeración durante su almacenamiento. Finalmente,
esta proteasa debe de producir aminoácidos y péptidos precursores
implicados en la formación de sabores diarios típicos.
La invención se refiere a una célula recombinante
de un iniciador diario que expresa una proteasa recombinante prtP de
Lactobacillus bulgaricus que presenta una secuencia de
aminoácidos Id. de Sec. No:2 o un derivado funcional de la misma que
presente una secuencia de aminoácidos al menos un 50% idéntica al
ID. de SEC. No:2.
La invención además se refiere a un método para
la producción de la proteasa recombinante PrtP comprendiendo, el
cultivo de células recombinantes de acuerdo con la invención en un
medio de crecimiento adecuado bajo condiciones en las que las
células expresen la mencionada proteasa recombinante y, de manera
opcional, pueda aislarse dicha proteasa recombinante en forma de un
concentrado.
Además en la invención se proporciona el uso de
estas células recombinantes para la elaboración de productos
fermentados diarios.
Figura 1: fermentación de la leche por cepas
recombinantes de Lactococcus lactis que expresan la proteasa
PrtP (ver ejemplo 2: transformantes con plásmido pLL82).
Figura 2: fermentación de la leche por cepas
recombinantes de Lactococcus lactis que contienen, aunque no
la expresan, la proteasa PrtP (ver ejemplo 2: plásmido pLL81).
Figura 3: mapa de restricción de la región
prtP.
A propósito de esta revelación y
reivindicaciones, el término "prtP" hace referencia al
gen que codifica la proteasa relacionada "PrtP" de
Lactobacillus bulgaricus.
En el contexto de la presente invención la
expresión "derivado funcional" puede comprender todas las
secuencias de aminoácidos las cuales difieren por sustitución,
deleción, adición de algunos aminoácidos pero que mantienen sus
actividades o funciones originales. Una proteína puede ser
generalmente considerada como derivada de otra proteína, si su
secuencia es como mínimo un 50% idéntica a la proteína,
preferiblemente como mínimo un 70%, en particular un 90%. En la
presente revelación, la identidad es determinada por el cociente
entre el número de aminoácidos de una secuencia derivada los cuales
son idénticos a aquellos de PrtP y el número total de aminoácidos de
la mencionada secuencia derivada.
Asimismo, la expresión "un ADN codificante para
la proteasa PrtP" puede comprender cualquier ADN que codifique la
misma proteína derivada debida a la degeneración del código genético
o a la variación cruzada entre especies. Una molécula de ADN puede
ser generalmente considerada como un derivado de otra molécula de
ADN, si su secuencia es como mínimo un 40% idéntica a la otra
molécula de ADN, preferiblemente al menos un 60%, en particular un
80%. En la presente revelación, la identidad se determina mediante
el cociente entre el número de bases de una secuencia derivada los
cuales son idénticos con aquellos nucleótidos comprendidos entre 794
a 6631 de la ID. DE SEC. NO:1 y el número total de bases de la
mencionada secuencia derivada.
La molécula de ADN que codifica para la proteasa
PrtP se puede obtener, bajo una forma sustancialmente purificada,
utilizando el método descrito en los siguientes ejemplos, para
cualquier cepa de Lactobacillus bulgaricus, particularmente
de la cepa L. bulgaricus NCDO1489 (NCDO procede del
primer nombre "National Collection of Dairy Organisms" del
NCFB. - National Collection of Food Bacteria - la cual es una
Autoridad Depositaria Internacional bajo el Tratado de Budapest; ver
el catálogo de NCFB de cepas, 1986, p 85, No 1489).
Alternativamente, la molécula de ADN puede ser
recuperada también a partir de otros géneros o especies de bacteria
a través del uso de sondas de ADN derivadas de una secuencia de ADN
de la invención en un ensayo de hibridación astringente.
Además, la molécula de ADN puede también ser
sintetizada a partir de las secuencias del listado de secuencias
presentado más abajo, multiplicadas in vitro por ejemplo
utilizando la reacción en cadena de la polimeras o multiplicadas
in vivo por ejemplo en bacterias de la especie Escherichia
coli, Lactococcus lactis, o Streptococcus
thermophilus.
La molécula de ADN comprende como mínimo la
secuencia de ADN ID. DE SEC. NO:1, en particular desde el nucleótido
794 al 6631 de la ID. DE SEC. NO:1 que codifica el gen prtP
gen.
La molécula de ADN puede también comprender una
secuencia la cual sea derivada (ver definición) de las secuencias
mencionadas anteriormente.
La molécula de ADN puede estar presente en un
vector, como por ejemplo un plásmido replicativo o un plásmido no
replicativo linearizado o integrativo circular.
La molécula de ADN puede también comprender,
ligadas de forma operativa a dicho ADN, secuencias reguladoras
nativas del organismo del cual deriva la secuencia nucleotídica. Las
mencionadas secuencias nativas puede ser, por ejemplo, un promotor,
un terminador, una secuencia Shine-Dalgarno, un
potenciador, o una secuencia que codifique un peptido leader,
por ejemplo que regulen la expresión de prtP.
Otra forma de realización, las secuencias
reguladoras pueden ser secuencias nativas que regulen un gen
diferente en el mencionado organismo de origen o que regulen un gen
diferente en un organismo extraño, por ejemplo, una secuencia
reguladora puede ser generalmente seleccionada por su elevada
eficiencia. Es también posible seleccionar un promotor en base a
otras características deseables, por ejemplo capacidad para ser
inducido térmicamente, o una secuencia que codifique un péptido
señal el cual permitirá la excreción de la proteína.
Si se prefiere la expresión heteróloga,
significando esto que los genes prtP son expresados en otros
organismos diferentes al huésped original (cepa, variedad, especie,
género, familia, orden, clase o división) la secuencia reguladora es
preferiblemente derivada de un organismo similar o igual al huésped
de expresión. Por ejemplo, si el huésped es una célula de levadura,
entonces las secuencias reguladoras pueden ser derivadas de una
célula de levadura. El promotor adecuado para una expresión
constitutiva, preferiblemente cuando el huésped es un hongo, puede
ser un promotor de los siguientes genes:
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, triosa fosfato isomerasa y
acetamidasa, por ejemplo. El promotor adecuado para una expresión
inducible, preferiblemente, cuando el huésped es un hongo, puede ser
un promotor de los siguientes genes: endoxilanasa IIA, glucoamilasa
A, celobiosa hidrolasa, amilasa, invertasa, alcohol deshidrogenasa y
amiloglucosidasa. La selección de una secuencia reguladora deseable
que se encuentre ligada de forma operativa a una secuencia de la
invención y sea capaz de dirigir la expresión de la mencionada
secuencia de nucleótidos es considerada obvia para los entendidos en
el tema.
La molécula de ADN puede también comprender un
marcador de selección para discriminar las células huésped en la que
el ADN recombinante ha sido introducido de aquellas células que no
contienen el mencionado material recombinante. Puede también
comprender como mínimo un origen de replicación adecuado. Métodos de
transformación adecuados así como vectores de expresión adecuados
proporcionados con un promotor de la transcripción adecuado, señales
terminadoras de la transcripción adecuadas y genes marcadores
adecuados para seleccionar las células transformadas son ya
conocidos en la literatura para muchos organismos incluyendo
diferentes especies de bacterias, hongos y plantas.
La sobreexpresión de proteínas puede ser
conseguida por la incorporación de una molécula de ADN en un huésped
de expresión, la mencionada molécula de ADN conteniendo una o más
secuencias reguladoras las cuales sirven para el incremento de los
niveles de expresión de la proteína o proteínas. La sobreexpresión
también puede ser alcanzada a través de, por ejemplo, la
introducción de una multicopia de una molécula de ADN.
La invención atañe a una célula recombinante de
una cepa de un iniciador diario que contiene la molécula de ADN
descrita anteriormente. Estas células pueden derivar del grupo de
células de hongos, en particular del género Aspergillus,
células de levadura en particular del género Saccharomyces,
Kluyveromyces, Hansenula y Pichia, células
bacterianas en particular bacterias Gram positivas del género
Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus en
particular Streptococcus thermophilus, Bifidobacteria,
Staphylococcus y Lactococcus en particular
Lactococcus lactis, y células de plantas en particular de los
grupos de los arboles y de las hortalizas, por ejemplo.
Las células recombinantes pueden comprender la
molécula de ADN descrita anteriormente integrada de forma estable en
el cromosoma o en un plásmido replicativo. Preferiblemente, la
molécula de ADN se integra en el cromosoma utilizando el proceso
descrito en PE564966, esto es,
(1) transformando una cepa de microorganismos
huésped con un plásmido donante el cual no se replica en la cepa
huésped, en donde el plásmido donante comprende un vector esqueleto
y una secuencia que contenga un gen foráneo sin promotor
(prtP o genes similares) integrado de forma operativa en al
menos una parte de un operon de la cepa huésped, manteniendo la
pauta de lectura y la función del operón genómico de la cepa
huésped;
(2) identificando transformantes cointegrados en
los cuales el plásmido donante completo se integra en el operón
genómico de la cepa huésped;
y (3) seleccionando un transformante integrado a
partir de los transformantes cointegrados, donde el genoma de los
integrantes transformados no incluye el vector esqueleto del
plásmido donante pero sí que incluye el gen foráneo, el cual está
integrado de forma operativa en el operón genómico conservado y que
es mantenido de forma estable y expresado en el correcto
funcionamiento del cistrón esencial dada la presión selectiva en
crecimiento en un medio estándar.
La progenie de un huésped de expresión que
contenga una molécula de ADN como la descrita también se incluye en
la presente invención. De acuerdo con la invención, la invención se
dirige a una célula que contenga una molécula de ADN recombinante
del gen prtP anterior de las maneras descritas anteriormente,
en donde la mencionada célula es capaz de integrar la proteasa PrtP
o derivados funcionales de la misma en la pared celular o en la
membrana celular o de secretar los enzimas en el espacio
periplasmático o en el medio de cultivo. La ruta de secreción a
seguir por las proteínas recombinantes de acuerdo con la invención
dependerá de la célula huésped seleccionada y de la composición del
ADN recombinante de acuerdo con la invención. Sin embargo, es más
preferible que la proteína se una a la pared celular externa. Con
esta finalidad, la célula de acuerdo con la invención puede
comprender un ADN recombinante más que comprenda un ADN ligado de
forma operativa codificando secuencias leader foráneas (pre o
prepro), por ejemplo.
La invención también se dirige al procedimiento
para la producción de proteína o proteínas recombinantes que
contengan, proporcionando células recombinantes de acuerdo con la
invención en un medio de cultivo apropiado bajo condiciones en las
que las células expresen las mencionadas proteínas recombinantes, y
opcionalmente aislando dichas proteínas recombinantes bajo la forma
de concentrado. La selección del medio apropiado puede basarse en la
selección de un huésped de expresión y/o basarse en los
requerimientos reguladores del ADN recombinante. Tales medios son
bien conocidos de aquellos que son entendidos en el tema.
Después de la fermentación, las células pueden
ser eliminadas del caldo de fermentación tanto por centrifugación
como por filtración. Dependiendo de si la células huésped han
secretado las proteínas recombinantes en el medio o si las
mencionadas proteínas se encuentran aún unidas a las células huésped
de alguna manera, ya sea en el citoplasma, en el espacio
periplasmático o unida de alguna manera a la pared celular o
membranas, las células pueden experimentar tratamientos posteriores
para obener las proteínas recombinantes. En el último caso, donde
las proteínas recombinantes se encuentran todavía conectadas a las
células, la recuperación de las proteínas recombinantes puede
realizarse a través de la ruptura de las células por ejemplo
mediante alta presión, sonicación, digestión enzimática o
simplemente por autolisis celular seguida de un posterior
aislamiento del producto deseado. En este contexto, un método como
el que se describe en Laloi et al. Appl. Microb. Biotech.,
36, 196-204, 1991 puede ser aplicado. Las
proteínas pueden ser separadas de la masa celular por medio de
varios métodos, tales como la ultra-filtración, y
posteriormente precipitadas por medio de un disolvente orgánico. Las
proteínas aisladas pueden ser luego purificadas por medio de métodos
convencionales tales como la precipitación y/o cromatografía.
La invención también se encuentra dirigida al uso
de células recombinantes de acuerdo con la invención, para la
manufactura de productos fermentados diarios, en particular yogur,
leche acidificada y queso.
Efectivamente, de todos los procesos implicados
en la maduración del queso, por ejemplo el Cheddar o el Gouda, la
degradación de las proteínas de la leche por medio de proteasas de
cultivos iniciadores es el proceso más importante. Idealmente, el
objetivo de acelerar la maduración debe de ser el acelerar todas las
reacciones deseables implicadas en la maduración de una forma
equilibrada controlando aquellas que son indeseables. Sin embargo,
dado que las reacciones clave responsables del sabor único no son
conocidas en muchos casos, una aproximación más o menos empírica
debe de ser adoptada. Dado que las reacciones glucolíticas ocurren
realmente rápido y dado que la modificación de la lactosa en muchos
quesos no es el paso limitante de la tasa de fermentación, no parece
ser necesario acelerar la glucolisis y reacciones posteriores a la
misma. Asimismo, la lipolisis no es importante, de hecho es
indeseable, en muchas variedades. Por lo tanto, intentar acelerar la
maduración debe centrarse en la proteolisis. Esencialmente, hay dos
aproximaciones para acelerar la maduración del queso. Aunque las
temperaturas elevadas pueden dar resultados satisfactorios con un
50% de reducción en el tiempo de maduración, la industria parece ser
reticente a la aplicación de esta técnica. El desarrollo de
"super" iniciadores por medio de ingeniería, los cuales puedan
acelerar la maduración son por lo tanto esperados.
Por otro lado, aunque se considera que los
cultivos iniciadores del yogur son débilmente proteolíticos, S.
thermophilus y L. bulgaricus pueden, durante la
fermentación, causar un grado significante de proteolisis, y esta
actividad puede ser importante por las siguientes razones:
(a) La hidrólisis enzimática de las proteínas de
la leche resulta en la liberación de péptidos de diversas medidas
así como de aminoácidos libres, y estos posibles cambios pueden
afectar la estructura física del yogur.
(b) La liberación de aminoácidos en la leche es
esencial para el crecimiento de S. Thermophilus. Realmente
S. thermophilus no posee una actividad proteolítica
extracelular sustancial y el contenido en aminoácidos y péptidos
libres en la leche no es suficientemente alto para promover su
crecimiento completo.
(c) Aunque los aminoácidos y los péptidos pueden
no contribuir directamente en el sabor del yogur, pueden actuar como
precursores de multitud de reacciones las cuales producen
componentes del sabor.
Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar
cepas iniciadoras diarias con propiedades para la fermentación
acelerada, o capaces de un crecimiento total en leche (S.
thermophilus por ejemplo).
Sin embargo, estos iniciadores no deben exhibir
una actividad proteasa demasiado alta, de otra forma la ventaja de
una maduración o fermentación aceleradas es compensada por una
acelerada degradación del producto. Por lo tanto, la actividad
proteasa debe de ser escogida con precaución, ya que no debe de
degradar el producto a temperatura de refrigeración.
Se ha observado de forma sorprendente, que la
proteasa recombinante PrtP de acuerdo con la invención cumple con
estas necesidades.
Con la finalidad de mejorar la estabilidad de los
productos diarios fermentados por células de acuerdo con la
invención, es posible hacer que el gen que codifica para la
mencionada PrtP sea dependiente de temperatura o pH a través de un
promotor sensible a estos factores y seleccionado para ser inhibido
a temperatura de refrigeración, es decir entre 9ºC y 12ºC, o a pH
ácido, por ejemplo menor de 5,5. Tales promotores son ya conocidos
para las personas entendidas en el tema.
Alternativamente, el gen mismo puede ser mutado
para hacerlo sensible a la temperatura o al pH. Por lo tanto, es
posible utilizar una célula recombinante de acuerdo con la invención
que exprese un derivado recombinante de la proteasa PrtP de acuerdo
con la invención, este derivado exhiba una actividad disminuida como
mínimo en un 20% respecto a la de la proteasa que tiene la secuencia
de aminoácidos ID. DE SEC. NO:2, bajo las condiciones de
almacenamiento de los productos fermentados diarios, pero donde el
mencionado derivado retenga al menos un 90% de su actividad bajo las
condiciones de producción de los productos fermentados diarios en
comparación con la proteasa que presenta la secuencia de aminoácidos
ID. DE SEC. NO:2.
Preferentemente, la proteasa derivada de acuerdo
con la invención exhibe una actividad disminuida a una temperatura
por debajo de 20ºC, o a un pH por debajo de 5,5.
Tales variantes y células recombinantes se pueden
obtener fácilmente a través de un proceso que comprenda:
a) insertando el gen prtP en un
vector;
b) realizando mutaciones en varios vectores del
paso a);
c) seleccionando aquellos vectores del paso b) en
los que dicho gen está mutado cuando el vector seleccionado es
utilizado para transformar un organismo, la expresión del gen
seleccionado produce una variante del enzima que exhibe una
actividad disminuida como mínimo en un 20% respecto a la del enzima
PrtP que presenta la secuencia de aminoácidos ID. DE SEC. NO:2.,
bajo condiciones de almacenamiento del producto fermentado diario,
pero donde dicho derivado retiene como mínimo un 90% de su actividad
bajo las condiciones de producción del producto fermentado diario
cuando se compara con el enzima PrtP que presenta la secuencia de
aminoácidos ID. DE SEC. NO:2.
d) insertando y expresando un gen seleccionado
que codifique para la variante del enzima del paso c) en un
organismo adecuado para la producción del producto alimentario
fermentado.
Este método ya ha sido utilizado para el
desarrollo de variantes de \beta-galactosidasa,
como se describe en PE 402 450.
La presente invención se encuentra además
ilustrada, y no limitada, por una descripción suplementaria que hace
referencia a ejemplos de caracterización de moléculas de ADN,
células, proteínas y usos de acuerdo con la invención, en las que
todas las partes, tasas, y porcentajes son expresados en base a un
peso a no ser que se indique de otra forma, con referencia a las
figuras acompañantes.
Los métodos que implican técnicas de ADN son
realizados esencialmente como se describe en el libro de Sambrook
et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
1989).
A partir del gen lacZ del L.
bulgaricus de la cepa NCDO 1489, la PCR reversa nos permitió
recoger la región de ADN corriente abajo al gen lacZ (ver
Figura 3). El fragmento de PCR fue clonado en pUC19 y secuenciado
(Yanisch et al., Gene, 33, 103-119,
1991). La búsqueda de homología proteica en librerías de proteínas
reveló una identidad del 27,8% entre la secuencia de aminoácidos
deducida y el PrtP de Lb. paracasei NCD0151. Entonces, la
región corriente abajo a lacZ y que incluye un gen del tipo
prtP fue determinada en una estrategia de PCR en cascada
utilizando cebadores sitetizados en base a la secuencia conocida. Un
mapa de restricción de la zona donde se encuentra el gen prtP
L. bulgaricus se presenta en la figura Fig. 3.
La secuencia de nucleótidos del gen prtP
se presenta en el listado de secuencias presentado más abajo (ver
nucleótidos del 794 al 6631 de ID de SEC No:1).
El gen prtP se encuentra bajo el control
de un promotor localizado alrededor de los nucleótidos del 588 al
793 de ID. DE SEC. NO:1.
La pauta abierta de lectura (ORF: nucleótidos del
794-6631) muestra homología con los genes
prtP de los lactococos. El primer codón codificante del ADN
(ATG) se encuentra precedido por una secuencia
Shine-Dalgarno que se complementa bien con el ARNr
16S de las especies de lactobacilos (ver nucleótidos del 784 al 790
de ID. DE SEC. NO:1). Además, el extremo N-terminal
de la secuencia de aminoácidos traducida se parece al péptido señal
de las PrtP. La parte anterior contiene tres cajas características y
debe de ser la región promotora (ver nucleótidos del 632 al 659 de
ID. DE SEC. NO: 1). Además, 5 nucleótidos antes de la caja -35,
existe una tercera señal de reconocimiento la cual se llama elemento
UP y se caracteriza por tramos de oligo A y T (ver nucleótidos del
608 al 627 de ID. DE SEC. NO: 1). El elemento UP ha sido ya
encontrado en los promotores del gen prtP de los lactococos y
de Lb. delbrueckii subespecie lactis y se sabe que
potencia la transcripción (Kok et al., Appl. Environ.
Microbiol., 54, 231-238,
1988).
1988).
La secuencia codificante del gen prtP
tiene una longitud de 5.841 nucleótidos, lo cual se encuentra dentro
del rango de longitudes de los genes ptrP. El contenido en GC
del gen prtP se ha estimado en 47,6% el cual es muy similar
al que se ha descrito para los genes prtP de Lb.
paracasei y Lc. lactis NCDO 763 (47,5% y 47,2%,
respectivamente). Es interesante expresar que el genoma de Lb.
bulgaricus exhibe un contenido de GC del 54% y el de Lc.
lactis del 38% (Kilpper-Balz et al., Cur.
Microbiol., 7, 245-250, 1982). Por lo tanto,
el gen prtP difiere de forma significativa de otros genes de
L. bulgaricus (lacZ, lacS y pepIP) los
cuales muestran un contenido en GC de 52,5%, 53,1% y 56,9%,
respectivamente (Leong et al., J. Bacteriol., 173,
1951-1957, 1991, Atlan et al., Microbiol.,
140, 527-535,
1994).
1994).
La proteasa esperada PrtP consiste en 1.946
aminoácidos y se caracteriza por una Mr estimada de 212,271.
La secuencia de aminoácidos de esta proteasa PrtP
se presenta en el listado se secuencias presentado más abajo (ver
ID. DE SEC. NO:2). Esta longitud encaja con la de otras PrtP
descritas: 1.902 residuos para Lb. paracasei, Lc.
cremoris Wg2 y Lc. lactis NCDO 763, y 1.962 residuos para
Lc. cremoris SK11 asociados con una duplicación de 60
aminoácidos en el extremo COOH.
La PrtP de L. bulgaricus muestra una
identidad del 27% con la PrtP de Lb. paracasei en los
primeros 1.806 residuos hasta un 39,5% donde solamente los primeros
820 residuos fueron comparados. El extremo
C-terminal de la proteasa de superficie celular no
comparte ninguna homología con la proteasa PrtP.
El aminoácido más abundante de PrtP es la lisina
(12%) en lugar de la leucina para otros enzimas de Lb.
bulgaricus (LacS, Betagalactosidasa y PepIP) o treonina para
otras PrtP de lactococos y Lb. paracasei. La utilización de
los codones fue investigada y es similare al de otros enzimas de
L. bulgaricus (LacS, \beta-galactosidasa y
PepIP) para lisina y glicina; pero serina, ácido aspártico, y valina
se encuentran preferiblemente codificados como en los lactococos.
Finalmente, la preferencia de codón para la alanina es específica
para PrtP.
Al nivel de los aminoácidos, la homología de las
secuencias entre las regiones N-terminales de PrtP
exhibe un extremo N muy cargado de forma positiva seguido de una
hélice \alpha con un elevado contenido en leucina y alanina. Este
dominio es muy parecido a los péptidos señal de las proteínas
exportadas de las bacterias Gram positivas. La porción prepro del
enzima prtP se encuentra de esta manera localizada entre los
aminoácidos 1 y 192 de ID. DE SEC. NO:2.
La ausencia de un gen del tipo prtM localizado
inmediatamente antes o después del gen prtP y que expresa una
chaperona funcional da lugar a dos hipótesis. La maduración y
exportación de PrtP puede ser procesada por una chaperona del tipo
PrtM codificada por un gen localizado en cualquier lugar del
cromosoma; sin embargo, no puede ser descartado que una chaperona
general actúe sobre diferentes proteínas extracitoplasmáticas,
incluida la PrtP. Por otra parte, la PrtP puede no ser
preferiblemente no procesada por una chaperona del tipo PrtM, ya que
la PrtP recombinante es funcional en diferentes sistemas huésped
(ver ejemplos 2 y 3).
En contraposición con las proteasas PrtP, la PrtP
de L. bulgaricus no es nunca recuperada en el medio de
cultivo y, en consecuencia, esta desprovista de la capacidad de
eliminación del extremo C-terminal por
auto-digestión. Por lo tanto se cree que una porción
del enzima prtP es una secuencia de anclaje que permite al enzima
permanecer mantenida de forma estable en la membrana externa de la
célula. Esta porción se encuentra por lo tanto localizada desde el
aminoácido 1883 hasta al menos el aminoácido 1915 de la ID. DE SEC.
NO:2.
Dado que en los primeros pasos del catabolismo de
la caseína, los péptidos liberados por la acción de PrtP son
diferentes de los que resultan de las hidrólisis realizadas por las
PrtPs. Otros pasos del sistema de proteolisis de Lb.
bulgaricus se sospecha que son diferentes. Por ejemplo, Lb.
bulgaricus exhibe altas actividades hacia sustratos que
contengan prolina (Sasaki et al., FEMS Microbiol. Rev.
12, p 75D16, 1993).
ADN de L. bulgaricus NCDO 1489 fue
purificado por el metodo de spooling (Delley et al.,
Appl. Environ. Microbiol., 56, 1967-1970,
1990). Un gen de una proteasa asociada a pared celular (prtP)
fue amplificado por PCR utilizando polimerasas de Biotag (biosonda,
FR) y una dilución de 1/20 de Pfu (ADN polimerasa Pfu clonada
Stratagen, USA) y las condiciones 92ºC durante l minuto, 55ºC
durante 2 minutos y 72ºC durante 6 minutos (Saiki et al.,
Science, 239, 487-491, 1988). Para este fin,
el gen prtP se amplificó sin su promotor (los cebadores
presentaban la secuencia de 763 a 787 y de 6831 a 6858 de ID. DE
SEC. NO:1, respectivamente) y con su promotor (los cebadores
presentaban la secuencia de 557 a 583 y de 6831 a 6858 de ID. DE
SEC. NO:1, respectivamente). Los productos de PCR fueron digeridos
mediante BamHI y XbaI y ligados en pNZ124 digeridos con XbaI/BglII
(Platteeuw et al., Applied and Env. Microbio., 60,
587-593,1994).
Los plásmidos recombinantes pLL81 (libres del
promotor prtP) y pLL82 (con el promotor prtP) fueron
introducidos en Lactococcus lactis MG1363 (libre de
plásmidos) por electroporación (Holo y Nes, Applied and Env.
Microb., 55, 3119-3123, 1989).
Los transformantes fueron cultivados en M17 con
un 1% de gucosa (labratorio Difco) en presencia de 5 \mug/ml de
cloranfenicol. Como ejemplo, un transformante que comprenda el
plásmido pLL82a (el gen prtP con su promotor) ha sido
depositado en el Instituto Pasteur, 28 rue du Dr. Roux,
F-75724 Paris 15, Francia, donde recibió, el 24 de
mayo de 1996 el número de deposito CNCM I-1713.
Los transformantes pre-cultivados
en 10% de leche desnatada reconstituida conteniendo un 0,1% de
extracto de levadura, glucosa al 1% y 5 \mug/ml de cloranfenicol.
El crecimiento fue seguido en leche desnatada pasteurizada (80ºC, 30
minutos) reconstituida al 10% conteniendo un 1% de glucosa Y 5
\mug/ml de cloramfenicol a través de la medida de impedancia
(RABIT: rapid automated bacterial impedence technique, Don
Whitley scientific limited, England).
La Figura 1 presenta los resultados de la
fermentación: el gráfico 1 designa el Lactococcus lactis cepa
MG1363 sin plásmido, los gráficos del 2 al 4 designan 3
Lactococcus lactis transformantes independientes que
comprenden el plásmido pLL82 (prtP con promotor). Como
control, en la Figura 2 se muestra los resultados de la fermentación
con transformantes de Lactococcus lactis que contienen el
plásmido pLL81 (prtP sin promotor): gráfico 1 designa al
Lactococcus lactis cepa MG1363 sin plásmido, gráficos 2 al 4
designan 3 Lactococcus lactis transformantes independientses
que comprenden el plásmido pLL81.
Los plásmidos pLL81 y pLL82 del ejemplo 2 fueron
usados para la transformación de un Streptococcus thermo-
philus. Los transformantes fueron precultivados y cultivados de
la misma forma descrita en el ejemplo 2. Los resultados son
similares a aquellos presentados en las Figuras 1 y 2.
Un iniciador mixto congelado comprendiendo una
mezcla de una cepa de Streptococcus thermophilus conteniendo
un gen prtP expresado de Lb. bulgaricus (ver ejemplo
3) y el Lactobacillus delbruckii subespecie bulgaricus
de la cepa CNCM I-1420 se preparó como sigue. Para
este fin, se reconstituyó leche desnatada utilizando un 10% de leche
desnatada en polvo, un 1% de extracto de levadura fue añadido, y la
mezcla se esterilizó hasta 115ºC durante 30 minutos y luego enfriada
hasta una temperatura de aproximadamente 42ºC. A esta leche se le
añadió un 1% de precultivo fresco de la cepa de S.
thermophilus y un 2% de precultivo fresco de la cepa de L.
delbruckii subespecie bulgaricus. La leche fue
posteriormente incubada a una temperatura de aproximadamente 42ºC
hasta llegar a un pH de 4,7. La leche fue enfriada hasta una
temperatura de 4ºC. Entonces un 5% de glicerol estéril fue añadido y
la mezcla congelada a -75ºC.
Yogures agitados fueron entonces preparados por
medio de inoculación directa de este iniciador congelado. Para tal
fin la leche se preparó con leche conteniendo toda su crema con un
3,7% de grasa y 2,5% de leche desnatada en polvo. 40 litros de esta
leche se esterilizó a 105ºC durante 2 minutos, posteriormente
homogeneizada a 75ºC y 300 bar (primer nivel) y finalmente enfriada
a una temperatura de aproximadamente 43ºC. Esta leche es entonces
fermentada con 10 ml del iniciador congelado a 43ºC hasta alcanzar
un pH de aproximadamente 4,65 y entonces se enfrió hasta 4ºC. Los
resultados muestran que ganamos tiempo durante la fermentación, en
comparación con los iniciadores tradicionales. Además, el yogur es
estable durante varias semanas a 4ºC.
Una leche acidificada fue preparada
tradicionalmente con la misma cepa de S. thermophilus que
expresa el gen prtP de Lb. bulgaricus (ver ejemplo 3).
Los resultados muestran que la leche puede ser acidificada hasta un
pH por debajo de 4,9. Además, la leche acidificada es estable
durante muchas semanasa 4ºC.
El Lactococcus lactis CNCM
I-1713 se usa en el proceso convencional de
fabricación del queso Cheddar. A la leche se le añade 0,8% de un
iniciador totalmente maduro que contiene una elevada población de
Leuconostoc mesenteroides subespecie cremoris
comercial y la cepa de Lactococcus lactis CNCM
I-1713, y 5,10^{6} CFU/ml de un Lactobacillus
plantarum comercial seco. Se permitió a la mezcla madurar
durante una 1 hora después de la cual se añadió jugo estomacal de
ternero a concentración simple. Un coágulo adecuado se forma en 30
minutos en este punto se produce el corte. Los métodos estándar de
producción de quesos son seguidos para proporcionar un requesón de
Cheddard el cual es molido cuando se alcanza un pH de 5,4. El
requesón molido es salado para proporcionar un producto final con un
1,8% de sal. El requesón terminado presenta un contenido de humedad
del 37% y un contenido de grasa del 33%. Los bloques son entonces
envueltos y envejecidos a 10ºC durante 3 meses los cuales resultan
en la producción de un sabor típico de queso Cheddar envejecido (6
meses). Una larga maduración a 10ºC da un queso Cheddar con sabor
fuerte que dura 12 meses con tan sólo 6 meses de almacenamiento. El
índice de desarrollo del sabor puede ser sustancialmente reducido
disminuyendo la temperatura de maduración de 10ºC a 7ºC o
inferior.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SOCIETE DES PRODUITS NESTLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: AVENUE NESTLE 55
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: VEVEY
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CANTON DE VAUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: SUIZA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 1800
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (41).21924.47.60
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (41).21.924.28.80
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Cepas iniciadoras con propiedades de fermentación aceleradas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID de SEC. NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MEDIDA: 7156 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- APAREAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómica)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 794..6631
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE/CLAVE: misc feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 608..627
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- OTRA INFORMACIÓN:/función= "Up-element"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal -35
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 632..637
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: señal -10
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 654..659
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: RBS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 784..790
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC Nº:1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID de SEC No:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1946 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID de SEC No: 2:
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Claims (10)
1. Las células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos, siendo dichas células seleccionadas del
grupo que consiste de Lactococos y Streptococos,
caracterizadas por la introducción en dichas células de una
secuencia de nucleótidos, que codifican por la proteasa PrtP de
Lactobacillus bulgaricus con la secuencia de aminoácidos ID
de SEC No:2 o un derivado funcional de dicha proteasa PrtP con una
secuencia que es al menos idéntica en un 90% a dicha secuencia de
nucleótidos, y en dicha célula expresándose dicha proteasa PrtP de
Lactobacillus bulgaricus o dicho derivado funcional del
mismo.
2. Las células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde
el gen que codifica dicha proteasa recombinante PrtP o dicho
derivado funcional del mismo está bajo el control de un
promotor.
3. Las células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con la reivindicación 2, en donde
dicho promotor es un promotor de Lactobacillus bulgaricus del
gen prtP.
4. Las células recombinantes de la cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con la reivindicación 3, en donde
dicho promotor es el promotor de Lactobacillus bulgaricus del
gen prtP, con la secuencia de nucleótidos desde el nucleótido 588 al
793 de ID. de SEC. No: 1.
5. Las células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicha célula se selecciona de
un grupo de Lactococcus lactis y Streptococus
thermophilus.
6. Las células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde dicha célula es
Lactococcus lactis CNCM 1-1713.
7. Un método para la producción de una proteasa
recombinante PrtP de Lactobacillus bulgaricus, dicho método
comprende: el cultivo de células recombinantes que expresan una
proteasa recombinante PrtP de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en un medio de crecimiento adecuado
bajo la condición que las células expresen dicha proteasa
recombinante.
8. El uso de células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a a 6,
en la elaboración de productos lácteos fermentados.
9. El uso de células recombinantes de la cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con la reivindicación 8, en donde
dichos productos lácteos se seleccionan del grupo consistente en
yogur, leche acidificada y queso.
10. El uso de células recombinantes de una cepa
iniciadora de lácticos de acuerdo con la reivindicación 8,
expresando dichas células un DNA recombinante que codifica dicha
proteasa PrtP con la secuencia de aminoácidos ID. de SEC. No: 2,
bajo la dependencia de un promotor sensible a la temperatura o al
pH.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP96201495A EP0810289B1 (en) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | Starter strains expressing a protease of Lactobacillus bulgaricus |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2225857T3 true ES2225857T3 (es) | 2005-03-16 |
Family
ID=8224029
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96201495T Expired - Lifetime ES2225857T3 (es) | 1996-05-29 | 1996-05-29 | Cepas iniciadoras que expresan una proteasa de lactobacillus bulgaricus. |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0810289B1 (es) |
AT (1) | ATE274591T1 (es) |
DE (1) | DE69633221T2 (es) |
DK (1) | DK0810289T3 (es) |
ES (1) | ES2225857T3 (es) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2836014B1 (fr) * | 2002-02-15 | 2004-07-23 | Gervais Danone Sa | Nouveau procede de fabrication de produits laitiers fermentes mettant en oeuvre des enzymes d'origine bacterienne |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8902010A (nl) * | 1989-08-04 | 1991-03-01 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Dna-fragment met ten minste een protease-gen, een dergelijk dna-fragment bevattende cloneringsvektor, een gastheercel getransformeerd met een dusdanig opgebouwde cloneringsvektor, alsmede de met dergelijke gastheercellen geproduceerde proteasen resp. bereide produkten zoals voedingsmiddelen. |
-
1996
- 1996-05-29 DK DK96201495T patent/DK0810289T3/da active
- 1996-05-29 AT AT96201495T patent/ATE274591T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-29 DE DE69633221T patent/DE69633221T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-29 EP EP96201495A patent/EP0810289B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-29 ES ES96201495T patent/ES2225857T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE274591T1 (de) | 2004-09-15 |
EP0810289A1 (en) | 1997-12-03 |
EP0810289B1 (en) | 2004-08-25 |
DK0810289T3 (da) | 2005-01-03 |
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DE69633221D1 (de) | 2004-09-30 |
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