JP2008516624A - 後酸敗性が低減したａｍｉ欠損性ストレプトコッカス・テルモフィラス菌株 - Google Patents

後酸敗性が低減したａｍｉ欠損性ストレプトコッカス・テルモフィラス菌株 Download PDF

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Abstract

本発明は後酸敗性が低減したＡＭＩ欠損性ストレプトコッカス・テルモフィラス（Streptococcus thermophilus）の野生株に関する。本発明はまた、発酵食品の製造に対するこの菌株の使用、ならびにこうして製造された発酵食品にも関する。

Description

本発明は、食品工業で使用される乳酸菌の分野に関する。
より正確には、本発明は、ストレプトコッカス・テルモフィラス（Streptococcus thermophilus）の天然菌株またはかかる菌株の天然変異株に関し、この菌株または変異株は後酸敗（post-acidification）が低減したＡＭＩ欠損性型である。
本発明はまた、発酵食品の製造へのこの菌株の使用と、こうして製造された発酵食品にも関する。
食品、特に発酵乳製品の製造に対する乳酸菌の選択は、酸性化活性および製品の官能的性質を左右する芳香化合物の産生、ならびに「きめ」やクリーミーさに役割を果たす増粘物質の産生、を含む多くの基準を必要とする。
酸性化活性は下記３つのパラメータにより本質的に特徴づけられる：(ｉ) 酸性化の速度、(ii) 製品の官能的性質とその貯蔵適性に影響する滴定可能な酸性度、すなわち、最終発酵ｐＨ、および(iii) 製品の貯蔵中に生ずる後酸敗（後酸性化）。
高い酸性化速度は、汚染物に敏感な期間である製品の製造期間を短縮し、従って細菌汚染の危険性を低減させることができる。
酸性化速度が高いと、生産性と工業材料の柔軟性が高まることによりプロセスの経済性も改善される。
使用菌株の後酸敗特性は製品の貯蔵（保管）にとって特に重要である。生の（未加熱処理の）発酵製品は一般に４〜８℃の温度で４週間貯蔵される。細菌の代謝活性は低温貯蔵により低下するが、それでも遮断されたわけではない。この残存活性が乳糖（ラクトース）からの乳酸の産生を生じて、ｐＨの低下と、製品の官能的性質を劣化させる酸っぱい味の増大とを生ずる。
また、菌株の選択には、製品の品質に寄与するために維持される基準に加えて、例えば、発酵温度、酸性化速度および耐ファージ性といった、他のより特異的に結びつく因子も含まれる。
耐ファージ性（ファージに対する耐性）は、生産中のファージによる事象の危険性を低減させるために菌株の選択において非常に重要な基準となる。なぜなら、ファージによる事象は、汚染除去を実施する一定ではない期間の間、生産工程全体を止める可能性があるからである。
仏国特許第２７２５２１２号は、フランス国立微生物収集機関(ＣＮＣＭ、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [パスツール研究所、フランス、パリ]）に番号Ｉ−１４４７として寄託された、高度の酸性度を可能にする速い酸性化速度を有し、生の発酵乳製品の貯蔵中に後酸敗を生じないストレプトコッカス・テルモフィラスの菌株を記載している。
別のストレプトコッカス・テルモフィラス（１９９４年１２月３０日に番号Ｉ−１５２０としてＣＮＣＭに登録）が、後酸敗能力が低減したものとして、仏国特許第２７７１６００号に記載されている。
それにもかかわらず、機能性食品（すなわち、生体内の１または２以上の目標機能に有益な効果を及ぼす食品）、特に有益なものとして選択したタンパク質および／またはペプチド系の生物活性食品成分を含有するもの、の製造にこのような菌株を使用することは有利ではない。これらの菌株は、維持したいと望んでいることが明らかな選択した機能性タンパク質および／またはペプチドを包含するタンパク質および／またはペプチドを代謝する（換言すると、窒素供給源として使用するために分解する）能力をなお保持しているからである。
(ｉ) 生存性に優れ、(ii) 後酸敗活性が非常に低いか、実質的にゼロであり、ならびに(iii) タンパク質および／もしくはペプチドの代謝能力が非常に低い、発酵用細菌が利用可能となることが食品産業にとって重要である理由はこのことによる。
食品産業はまた、微生物、より詳しくは生きた微生物を含有させたヒトおよび／または動物用の食品を開発する時に、第４の制約も考慮しなければならない。遺伝子が改変された生物（ＧＭＯまたは突然変異物）（この場合は微生物）は、一般に消費者により警戒と懸念を持って見られる。ＧＭＯが一般に受けるマイナス・イメージは、ＧＭＯを含んでいる食品がボイコットされがちであることを意味する。そのため、消費者が売られている食品の中身とそれらの食品の成分の出所について常にますます透明性を望んでいることを考慮すると、製造業者はＧＭＯを含まない製品を提供することを好むようになる。従って、微生物を含有する工業的に生産された食品が、天然菌株または天然菌株の天然変異株だけを使って製造されることは重要である。
仏国特許第２７２５２１２号 仏国特許第２７７１６００号 ＥＰ０７１４９１０ ＵＳ６５１４９４１ ＥＰ０５８３０７４ ＥＰ０７３７６９０ ＥＰ１３０２２０７ ＥＰ０８２１９６８ 特開平６−１９７７８６号公報 Garault et al., (2002) Journal of Biological Chemistry 277: 32-39 Letort et al., (2001) J. Appl. Microbiol. 91: 1023-1029 Letort, C. et al., (2002) Applied and Environmental Microbiology 68: 3162-3165 Spinnier H.E. et al., Automatic method to quantify starter activity based on pH measurement, J. of Dairy Research, 56 (1989) 755-764; de Roissart H. et & Luquet F.M.編, Lorica ISBN: 2-9507477-0-1 Kayser et al., (1996) FEBS Letters 383, 18-20 Hata Y. et al., (1996) Am. J. Clin. Nutr. 64, 767-71 Nakamura Y. et al., (1995) J. Dairy Sci. 78, 1253-7 Migliore-Samour D. et al., (1988) Experimentia 44,188-93 Defilippi C. et al., (1995) Nutr. 11, 751-4 Tome D. et al., (1987) Am. J. Physiol. 253, G737-44 Tome D. et al.,(1988) Reprod. Nutri. Develop. 28, 909-18 Ben Mansour A. et al., (1988) Pediatr. Res. 24, 751-5 Mahe S. et al., (1989) Reprod. Nutri. Develop. 29, 725-32 Schusdziarra V. et al., (1983) Diabetologia 24, 113-6 Yvon M. et al., (1994) Reprod. Nutri. Develop. 34, 527-37 Zucht H.D. et al., (1995) FEBS Letters 372, 185-8 Tomita M. et al.,(1994) Acta Paed. Jap. 36, 585-91 Lahov E. et al., (1996) Food Chem. Toxic. 34, 131-145 Migliore-Samour D. et al., (1989) Int. Dairy Res. 56, 357-62 Jolies P. et al., (1986) Europ. J. Biochem, 158, 379-82 Raha S. et al., (1988) Blood 772, 172-8 Chabance B. et al., (1995) Brit. J. Nut. 73, 582-90 Kohmura M. et al., (1989) Agric. Biol. Chem. 53, 2107-14 Masuda O. et al.,(1996) J. Nutr. 126, 3063-8 Yamamoto N. et al.,(1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58, 776-8 Ermisch A. et al.,(1983) J. Neurochem. 41, 1229 Umbach M. et al.,(1985) Regul. Pept. 12, 223-30 Singh M. et al.,(1989) Pediatr. Res. 26, 34-8 Svedberg J.et al.,(1985) Peptides 6, 825-30 Teschemacher H. et al.,(1986) J. Dairy Res. 53, 135-8 Yoshikawa M. et al.,(1986) Agric. Biol. Chem. 50, 2419-21 Chiba H. et al.,(1989) J. Dairy Sci. 72, 363 Beucher S. et al., (1994) J. Nutr. Biochem, 5, 578-84 Parker F. et al,,(1984) Eur. J. Biochem, 45, 677-82 Otani H. et al., (1992) Milchwiss. 47, 512-5 Otani H. et al., (1995) J. Dairy Res. 62, 339-48 Drouet et al., (1990) Nouv. Rev. Fr. Hermatol, 32, 59-62 Mullaly M. et al., (1997) Int. Dairy J. 7, 299-303 Meisel H. et al., (1986) FEBS Letters 196, 223-7 Danone World Newsletter No. 17 (September 1998) Higgins C.F. & Gibson M.M., (1986) Peptide transport in bacteria, Methods in Enzymology 125, 365-377
本発明が、後酸敗性が低減したＡＭＩ欠損性のストレプトコッカス・テルモフィラスの天然菌株またはかかる菌株の天然変異株を提案することにより対応するのは、まさに上記の組合わせの制約である。
乳中でのストレプトコッカス・テルモフィラスの増殖は次の３つの増殖期に分けることができる：
・第１期の指数増殖期（乳カゼインには依存しない）；
・第２期のいわゆる遷移増殖期；および
・第３期の指数増殖期（明らかにペプチド輸送により制限される)(Letort et al, 2002)。
ストレプトコッカス・テルモフィラスにおけるオリゴペプチド輸送系は、４種類のタンパク質（ＡｍｉＣ，ＡｍｉＤ，ＡｍｉＥおよびＡｍｉＦ）並びに３種類の非常に似ている結合タンパク質（ＡｍｉＡ１，ＡｍｉＡ２およびＡｍｉＡ３）からなるＡＢＣ輸送体（トランスポータ）（ＡＴＰ−結合カセット）である。このオリゴペプチド輸送系が変質している乳中での突然変異物の増殖は最適ではなく、これがこの輸送系の重要性を実証している（Gerault et al., 2002）。
本発明の範囲内において、出願人は、オリゴヌクレオチド輸送系が少なくとも部分的に変質しているストレプトコッカス・テルモフィラス菌株の天然菌株および天然変異株をはじめて見出した。出願人はまた、かかる菌株および変異株が特に興味ある乳の酸性化特性を有することを示した。
一方では、ｐＨがＡＭＩ欠損性変異株では発酵の最後に安定になる。実際、乳中での第１増殖期は影響されず、これらの変異株は比較的速い第１期の酸性化を保持すると同時に、ずっと遅い第２期の酸性化を有することができる。それらの変異株は．ＡＭＩ機能性の野生株による酸性化が遅くなるｐＨより高いｐＨでそれよりずっと遅くなる酸性化グラフを与えることができる。この発酵温度での「酸性化プラトー」は、実質的な酸性化を伴わずにずっと長期にわたって発酵塊を発酵温度で貯蔵することを可能にする点で、興味がある。発酵槽に対するデクロッティング（declotting、凝塊除去）時間は、それらのサイズを考慮すればかなり長い。従って、ＡＭＩ欠損性変異株の使用により、デカンテーション（冷却によるデクロッティングまたは直接パッケージング）中での発酵乳のｐＨ変化を制限することが可能になる。
他方では、酸性化が著しく遅くなるｐＨ閾値（限界値）は、ＡＭＩ系により輸送されて乳中に存在することができる遊離アミノ酸およびジ／トリペプチドの量に依存する。従って、乳のペプチド分を変化させる（定性的および定量的に）ことにより発酵を停止させるためにｐＨを操作することが可能となる。
よって、本発明は、後酸敗性が低減したＡＭＩ欠損性ストレプトコッカス・テルモフィラスの天然菌株および類似の乳酸性化特性を有するその天然ＡＭＩ欠損性変異株、ならびにそれらの生物学的に純粋な培養物および培養物画分を包含する。
本発明において、「ＡＭＩ欠損性天然菌株」または「ＡＭＩ欠損性天然変異株」とは、その増殖が遊離アミノ酸の混合物により刺激されるが、オリゴペプチドだけからなる混合物では刺激されない菌株または変異株を意味する。
「類似の乳酸性化特性を有する天然ＡＭＩ欠損性変異株」なる用語は、参考天然菌株から出発する遺伝子改変により得られた菌株であって、得られた菌株が参考菌株と同様に低減した後酸敗性を示すものを意味する。ここで、「変異株（variant）」および「天然変異株」なる用語は、主として参考菌株の突然変異と選択とにより得られた得られた菌株を意味するために使用されるのに対し、「突然変異物（mutant）」なる用語は、特定部位の突然変異誘発法、すなわち、参考菌株に適用されるベクターを用いた遺伝的形質転換により得られた菌株を指すためにより具体的に使用される。
１態様によれば、本発明の天然菌株および／または天然変異株は、ＡＭＩオリゴペプチド輸送系により輸送される毒性オリゴペプチド類似物に対して耐性である。
特に、この毒性類似物はアミノプテリン、トリオミチンおよびトリリシンから選ぶことができる。この類似物は好ましくはアミノプテリンである。
「アミノプテリンに対して耐性」とは、アミノプテリン２００μｇ中に浸漬されたペーパーディスクの存在下で観察しと時に、飽和細菌懸濁液１００μＬを接種した皿（シャーレ）における阻害直径が約２ｃｍ以下、好ましくは約１.８ｃｍ以下である、と定義される。
かかる定義は、当業者によりその技術常識に照らして、ＡＭＩ系により輸送される他のオリゴペプチド毒性類似物に、必要な変更を伴って拡張されよう。すなわち、当業者は、阻害直径の最大値を、当該毒性類似物に応じて適宜変更することもできよう。
好ましくは、本発明に係る菌株は下記から選ばれる：
・２００４年５月１０日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３２１１として登録された菌株、
・２００４年９月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３３０１として登録された菌株；
・２００４年９月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３３０２として登録された菌株；
・２００２年１月２４日にＣＮＣＭに番号Ｉ−２７７４として登録された菌株。
本発明に関して興味あり、後で実施例により実証されている酸性化特性の１例として、ＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０２（２００４年９月１６日にＣＮＣＭに登録された、ＡＭＩ機能性母株Ｉ−３２９９の変異株）が、培養（インキュベーション）終了時のｐＨと製品の保存寿命終了時のｐＨとの間に０.２９のｐＨ変化が得られたのに対し、ＡＭＩ機能性の母株Ｉ−３２９９のこれら２つの時点での間のｐＨ変化は０.５６に増大することを指摘しておく。この場合、ＡＭＩ機能性菌株ではなくＡＭＩ欠損性菌株を使用することの利点は、従って、培養終了時と製品保存寿命終了時との間のｐＨ変化が０.２７だけ減少することである。
上述したように、ＡＭＩ欠損性変異株は参考母株から得られる。従って、本発明の範囲内において、これは、例えば、突然変異と酸性化特性の観点からの選択により得られた、天然変異株を意味する。このための技法は公知であり、酸性化特性を規定するのを可能にする試験法についてもそうである（すなわち、Spinner H.E., Corrieu G., 1989）。
ＡＭＩ機能性母株の天然ＡＭＩ欠損性変異株である菌株Ｉ−３２１１，Ｉ−３３０１およびＩ−３３０２（後の実験の箇所で説明）とは異なり、菌株Ｉ−２７７４は出願人により単離され、天然にＡＭＩ欠損性であると同定されたものである。
本発明に係る菌株は、発酵食品の製造において特に興味がある。
好ましくは、この発酵食品は乳製品または植物性製品である。
本発明によれば、「乳製品」とは、乳（ミルク）に加えて、クリーム、アイスクリーム、バター、チーズおよびヨーグルトといった乳から誘導された製品；乳清およびカゼインのような二次製品；ならびに主成分として乳または乳の成分を含む任意の加工食品（例えば、調製粉乳）を意味する。
「植物性製品」とは、とりわけ、例えば、豆乳、オート麦乳および米乳を包含する果汁および野菜汁といった、植物ベースから得られた製品を意味する。
さらに、上記の乳製品および植物性製品の定義はそれぞれ、例えば、乳と果汁との混合物といった、乳製品と植物性製品の混合物を含有する任意の製品も包含する。
従って、本発明はまた、上述したような少なくとも１種の生きた菌株を用いて基質を発酵させる、発酵食品の製造方法にも関する。
この方法では、上述したような１種または２種以上の細菌菌株を少なくとも１種の他の生きた細菌菌株と併用することを想定することが有利である。
有利には、この他の細菌菌株は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種；ラクトバシラス属（Lactobacillus）の種、すなわち、ラクトバシラス・ブルガリカス（L. bulgaricus）、ラクトバシラス・アシドフィルス（L. acidophilus）およびラクトバシラス・カゼイ（L. casei）；ラクトコッカス属（Lactococcus）の種およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の種といった乳酸菌である。
好ましくは、上記方法で使用される基質は、乳系基質、即ち、ミルク、または果物、穀物および大豆のような植物性未加工成分を主成分とする基質から選ばれる。従って、下記を使用することができる：
・基質が乳系のものである場合、天然もしくは還元乳（脱脂もしくは非脱脂）、または乳系培地もしくは乳由来の製品；ならびに
・基質が植物性未加工成分を主成分とするものである場合、果汁および／もしくは野菜汁。
基質は有利には、食品加工業界において発酵食品、すなわち、乳系デザートの製造に現在使用されている成分も含有することができる。そのような成分は、特に、例えば、果物、オート麦またはシリアル（穀物）といった固体成分であるが、他の液体の甘味つけ製品もしくはチョコレート含有製品でもよい。
本発明はまた、その官能的性質が貯蔵中保存される発酵食品にも関する。「官能的性質が貯蔵期間中保存される」とは、その製品の官能的性質が、少なくともその製品の賞味期限（ＥＤ）まで、そして有利にはその期限を超えた期間の間、変化しない（すなわち、消費者にとって著しい変化ではない）ことを意味する。
１態様によると、この発酵食品は、本発明に係る少なくとも１種の生きた菌株を含有する。
別の態様によると、本発明に係る発酵食品は上述した方法により得ることが可能なものである。
好ましくは、本発明に係る発酵食品は、特に、タンパク質、ペプチド、ならびにそれらの類似物もしくは誘導体から選ばれた、少なくとも１種の生物活性成分（すなわち、機能性食品成分）を含有する。
「生物活性または機能性食品成分」とは、その栄養効果とは別に、生体の１または２以上の目標機能に有利に影響する成分を意味する。従って、このような成分の効果は、この成分の通常量を摂取した消費者に健康改善および／または安寧および／または疾病発症の危険性の低減を生ずることであろう。
この定義は、かかる成分を含有する食品または製品にも拡張することができ、該成分の含有によりその食品または製品それ自体が生物活性または機能性となる。
「類似物」とは、初期化合物（この場合はタンパク質またはペプチド）の任意の改変物を意味し、この改変物は天然または合成物質であり、炭素、水素もしくは酸素原子のような１もしくは２以上の原子、または窒素、硫黄もしくはハロゲンのようなヘテロ原子が初期化合物の構造に付加またはこれから除去されることにより新たな分子化合物となったものである。
本発明に関して「誘導体」とは、参考化合物（タンパク質またはペプチド）との類似性またはこれと共通する構造モチーフを有する任意の化合物である。この定義は、一方では、単独でもしくは他の化合物と共に、１もしくは２以上の化学反応を経た参考化合物の合成において前駆体もしくは中間体となることができる化合物を、また他方では、単独でもしくは他の化合物と共に、１もしくは２以上の化学反応を経て該参考化合物から形成されうる化合物をも包含する。
従って、「誘導体」なる用語は、少なくともタンパク質および／またはペプチドの加水分解物、特にトリプシンの作用で生じる加水分解物、加水分解物の画分、ならびに加水分解物および／もしくは加水分解物画分の混合物を包含する。
本発明に係る発酵食品中に使用することが可能な生物活性食品成分の中では、下記を制限を意図しない例として挙げることができる：αＳ１カゼインの[91-100]ペプチド（欧州特許ＥＰ０７１４９１０を参照）、Ｃ６−αS1[194-199]ペプチド（米国特許ＵＳ６５１４９４１を参照）、Ｃ７−β[177-183]ペプチド（米国特許ＵＳ６５１４９４１を参照）、Ｃ１２−αS1[23-34]ペプチド（米国特許ＵＳ６５１４９４１を参照）、カゼイノホスホペプチド、α−カゾモルフィン、α-カゼインエキソルフィン、カゾキニン（casokinin）、β−カゾモルフィン、カゼインマクロペプチド（ＣＭＰ）およびグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）、カゾキシン（casoxin）、カゾプラテリン（casoplatelins）、フラグメント50-53、β−ラクトルフィン（β-lactorphins）、ラクトフェロキシン（lactoferroxin）、Val-Pro-Proペプチド（欧州特許ＥＰ０５８３０７４を参照）、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Glnペプチド（欧州公開ＥＰ０７３７６９０を参照）、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leuペプチド（欧州公開ＥＰ０７３７６９０を参照）、Tyr-Proペプチド（欧州公開ＥＰ１３０２２０７および欧州特許ＥＰ０８２１９６８を参照）、Ile-Pro-Proペプチド（Nakamura et al., 1995および特開平６−１９７７８６号を参照）、それらのフラグメント、類似物および誘導体、それらを含むタンパク質および／もしくはペプチド、ならびにそれらの混合物（概説については、Danone World Newsletter No. 17, 1998年9月を参照）。
次の表１は人乳および牛乳タンパク質の加水分解により放出される主要な機能性ペプチドを列挙する。
次の表２は、今日まで知られている乳中に見出された機能性ペプチドの主な生理学的活性をまとめたものである。
有利には、本発明に係る食品は機能性食品である。
上に簡単に述べたように、「機能性食品」とは、その栄養効果とは別に、生体の１または２以上の目標機能に有利に影響する食品を意味する。従って、機能性食品は、その食品の通常量を摂取した消費者に健康改善および／または安寧および／または疾病発症の危険性の低減を生ずることができる。「機能性食品」の効果の例として、抗がん、免疫刺激、骨健康増進、抗ストレス、オピエート（阿片様の抑制）、抗高血圧、カルシウムの生物学的利用能向上、および抗菌の各効果を挙げることができる。
かかる機能性食品は、人間用および／または動物用のものとすることができる。
１態様によると、本発明が包含する食品は生（未加熱）の食品である。
別の態様によると、本発明が包含する食品は特に飲料、ヨーグルト、クリームデザート、発酵乳または果汁から選ばれる。
純品または他の菌株と組合わせた本発明の菌株の培養物を、ヒトまたは動物用食品においてプロバイオティック剤として、さらには、例えば上述した方法における乳汁（乳酸）発酵素として使用することもできる。
さらに、本発明は、後酸敗性が低減したＡＭＩ欠損性ストレプトコッカス・テルモフィラスの少なくとも１種の天然菌株および／もしくはやはりＡＭＩ欠損性、後酸敗性が低減したそのいくつかの天然変異株、ならびに／またはそれらの生物学的に純粋な培養物および培養物画分を、その官能的性質が貯蔵中保存される発酵食品の製造に使用することにも関する。
本発明の他の特徴および利点は、以下に示した例示を目的とする実験に関する説明に示される例を読むと明らかとなろう。
実験の説明
Ｉ：材料および方法
Ｉ.１：ＡＭＩ欠損性変異株の取得
ａ）ストレプトコッカス・テルモフィラスにおけるアミノプテリン耐性の生物多様性の評価
まず、ストレプトコッカス・テルモフィラス菌株のアミノプテリンに対する感受性を検証する。そのために、エリカー（Elliker）培地を入れ、細菌懸濁液１００μＬを加えたシャーレ内に置いたディスクに２００μｇのアミノプテリンを加えた。使用した菌株が耐性であれば、一晩インキュベーションした後、阻害直径がディスク周囲に現れる。興味ある組織上の性質を有することから、母株Ｉ−１６３０（１９９５年１０月２４日にＣＮＣＭ登録）およびＩ−３２９９（２００４年９月１６日にＣＮＣＭに登録）を選択した。菌株Ｉ−１６３０は壁プロテアーゼ（wall protease）を有していないのに対し、菌株Ｉ−３２９９は有している。従って、これら２つの菌株は非常に異なる増殖特性を有する。
菌株の種類に応じて異なる感受性が観察された。
表３において、得られたＡＭＩ欠損性変異株は、必要であればそれらの母株と共に、影つきボックス内に太字で示してある。
アミノプテリン耐性は、変異株の方が対応する母株に比べて大きい。
野生株Ｉ−２７７４はそのＡＭＩ輸送系における欠損により見られた天然のアミノプテリン耐性を示す。
ｂ）ＡＭＩ欠損性変異株の取得
毒性ペプチド類似物を用いたペプチド輸送に対する欠損変異株を選択するためのプロトコルは既に文献に記載されている（Higgins and Gibson, 1986）。
要約すると、ストレプトコッカス・テルモフィラス増殖に対して適合させた、窒素供給源として２０種の遊離アミノ酸を含有する化学的に規定された培地（ＭＣＤａａ）を用いて、０〜２００μｇ／ｍＬのアミノプテリン範囲を作り上げた。
この範囲の全試験管を、ＭＣＤａａ内で調製した予備培養物を用いて１％濃度で接種した。３７℃で３日間のインキュベーション後、各培養管の１００μＬを用いて、エリカー寒天培地を細菌で一面に覆った。この皿（シャーレ）の中央に、上に２００μｇのアミノプテリンを付着させたディスクを載せた。この皿をその後、嫌気性条件下、３７℃で３日間インキュベーションした。
その後、阻害ゾーン内でのクローンの存在を観察し、約２０クローンを取り出して、エリカー培地５ｍＬに接種するのに使用した。
クローンはこの培地内で分割されて、３７℃で１６時間のインキュベーションの後に細菌懸濁液を生じた。これは、２００μｇのアミノプテリン中に浸漬されたディスクを載せたエリカー培地の表面全体を覆うようになる。
得られた全クローンを次いで乳中での発酵により試験した。酸性化速度は、これらの変異株の乳酸性化能についての情報を与えた。
Ｉ.２：乳の調製
乳は、水９３０ｍＬ中に脱脂粉乳１２０ｇの割合での還元乳であった。３０分間の水和後、乳に９５℃で３０分間の低温殺菌(パスツライゼーション）を行った。
成分Ｎ３を１０％水溶液の形態で添加した後、０.２２μｍ濾過により滅菌した。
試験する残りの成分は、低温殺菌前に乳に添加した。
アミノ酸溶液は水中で調製し、０.２２μｍ濾過により滅菌した。
Ｉ.３：酸性化追跡のための発酵素の調製
１％の酵母自己分解物を接種し、４２℃で１８時間インキュベーションした滅菌乳内で予備培養物を調製した。次いで、４２℃でインキュベーションされている自己分解物を含む滅菌乳１００ｍＬ中で発酵素を調製し、酸性度が８０°Ｄに達した時点で氷水に入れることにより停止させた。この発酵素を酸性化追跡の開始まで４℃で貯蔵した。
酸性化の追跡を始めるため、２５０ｍＬの乳に１％のストレプトコッカス・テルモフィラス発酵素を接種した。
Ｉ.４：材料
Ｎ３：プロテアーゼペプトンＮｏ.３、製品番号R211693、Difco社、米国（ペプチドと主成分として遊離アミノ酸とを含有するカゼイン加水分解物）。
粉乳：Milex 240, Arla Food Ingredients社。
酵母自己分解物：酵母エキス、製品番号AEB171109、AES Laboratories社。
酸性化追跡用のＣＩＮＡＣ：G. Corrieuにより開発された酸性化活性の測定用自動システム、LGMPA社、製品名YSEBAERT。
Ａｌａｃｏ７０１４：乳清タンパク質加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
ＭＰＨ９５５：カゼイン加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
ＤＳＥ６４４１：乳清タンパク質加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
ＭＰＨ９１７：カゼイン加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
ＷＰＨ９２６：乳清タンパク質加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
ＭＰＨ９４８：カゼイン加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
Ｃ１２：乳タンパク質加水分解物、DMV International NCB社、Laan 80、 PO Box 13 5460, Ba Zeghel, オランダ。
ＭＰＨ９１０：カゼイン加水分解物、NZMP GmbH社, Siemens Strasse 6-14, D-25462, Rellingen, ドイツ。
ＩＩ：結果
ＩＩ.１：成分Ｎ３の存在下および不存在下でのＡＭＩ機能性母株Ｉ−３２９９および誘導体ＡＭＩ欠損性菌株の酸性化速度
図１および２から、ＡＭＩ機能性母株Ｉ−３２９９は乳中の成分Ｎ３の存在下と不存在下とで同じ速度を示すことがわかる。
他方、ＡＭＩ欠損性菌株は異なる速度を示す。
ＩＩ.２：変動する量の成分Ｎ３、ＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０１の酸性化速度
菌株Ｉ−３３０１は、成分Ｎ３の存在下でより短い潜伏期を持つ酸性化速度を示す。また、発酵の最後のｐＨは、培地中の成分Ｎ３の量が多いほど高くなる。
ＩＩ.３：変動する量の成分Ｎ３、ＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０２の酸性化速度
酸性化速度は培地中の成分Ｎ３の量が多いほど速くなる。また、発酵の最後のｐＨは、培地中の成分Ｎ３の量が多いほど低くなる。
ＩＩ.４：純菌株の後酸敗（母株Ｉ−３２９９との比較）
ＡＭＩ欠損性菌株は、培養（インキュベーション）終了時のｐＨと製品の保存期限の最後でのそのｐＨとの間のｐＨ差（ΔｐＨ）が０.２９となることができるのに対し、母株でのΔｐＨは０.５６に増大する。このような条件下でのΔｐＨを比較するなら、ＡＭＩ欠損性菌株を使用することの利点は０.２７のｐＨ単位（酸敗の低下）である。
ＩＩ.５：ＡＭＩ機能性母株Ｉ−１６３０（１９９５年１０月２４日にＣＮＣＭ登録）および誘導体ＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３２１１によりアミノ酸添加後の乳発酵で得られた酸性化速度
乳への遊離アミノ酸の添加により生じた刺激は母株とＡＭＩ欠損性菌株とで同じである。この結果は、遊離アミノ酸がこのような条件下では２種類の菌株に対する唯一の利用可能な窒素供給源となるので、当を得ている。
ＩＩ.６：乳＋成分Ｎ３で得られた速度
ＡＭＩ機能性母株Ｉ−１６３０（１９９５年１０月２４日にＣＮＣＭ登録）は乳への成分Ｎ３の添加により明らかに刺激されるのに対し、誘導体ＡＭＩ欠損性菌株はそうではない。Ｎ３ペプチド加水分解物を母株は利用することができるが、ＡＭＩ欠損性菌株は利用できない。
ＩＩ.７：ＡＭＩ欠損性Ｉ−３２１１による各種成分共存下での酸性化
ＭＰＨ９５５およびＷＰＨ９２６加水分解物は乳中でのＡＭＩ欠損性菌株の発酵のよりよい刺激を生ずる。それらはまた小ペプチドおよび遊離アミノ酸の含有量が最も高い２つの加水分解物でもある。
ＡＭＩ機能性の母株Ｉ−３２９９およびＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０１の酸性化速度を示すグラフ。 milk：カゼイン加水分解物無添加の乳; milk＋N3 0.2 g/L：乳１リットルあたり０.２ｇの成分Ｎ３(製品番号211693、Difco社、米国)を添加した乳。 ＡＭＩ機能性の母株Ｉ−３２９９およびＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０２の酸性化速度を示すグラフ。
milk：カゼイン加水分解物無添加の乳; milk＋N3 0.2 g/L：乳１リットルあたり０.２ｇの成分Ｎ３を添加した乳。
変動する量のＮ３の存在下でのＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０１の酸性化速度を示すグラフ。
milk：カゼイン加水分解物無添加の乳; milk＋0.05 N3：乳１リットルあたり０.０５ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.1 N3：乳１リットルあたり０.１ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.2 N3：乳１リットルあたり０.２ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.4 N3：乳１リットルあたり０.４ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.8 N3：乳１リットルあたり０.８ｇの成分Ｎ３を添加した乳。
変動する量のＮ３の存在下でのＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３３０２の酸性化速度を示すグラフ。
milk：カゼイン加水分解物無添加の乳; milk＋0.05 N3：乳１リットルあたり０.０５ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.1 N3：乳１リットルあたり０.１ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.2 N3：乳１リットルあたり０.２ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.4 N3：乳１リットルあたり０.４ｇの成分Ｎ３を添加した乳; milk＋0.8 N3：乳１リットルあたり０.８ｇの成分Ｎ３を添加した乳。
ＡＭＩ機能性の母株Ｉ−１６３０（１９９５年１０月２４日にＣＮＣＭ登録）およびＡＭＩ欠損性菌株Ｉ−３２１１によるアミノ酸添加後に乳発酵から得られた酸性化速度を示すグラフ。
菌株名のみ：乳発酵；菌株名＋aa：２０種アミノ酸（ストレプトコッカス・テルモフィラスに適合させた化学的に規定された培地用に特定された量 <Letort et al., 2001> の１／４０量に対応）を添加して実施された発酵。
成分Ｎ３を添加した乳で得られた速度のグラフ。 各種成分混合物で得られた酸性化速度のグラフ。

Claims (25)

  1. 後酸敗性が低減した天然のＡＭＩ欠損性ストレプトコッカス・テルモフィラス（Streptococcus thermophilus）菌株および類似の乳酸性化特性を有するその天然ＡＭＩ欠損性変異株、ならびにそれらの生物学的に純粋な培養物および培養物画分、ただし、２００２年１月２４日にＣＮＣＭに番号Ｉ−２７７４として登録された菌株を除く。
  2. ＡＭＩ系により輸送される毒性オリゴペプチド類似物に耐性である、請求項１に記載の菌株。
  3. 前記毒性類似物がアミノプテリンである、請求項２に記載の菌株。
  4. アミノプテリン２００μｇ中に浸漬されたペーパーディスクの存在下で観察された阻害直径が、飽和細菌懸濁液１００μＬを接種した皿において、約２ｃｍ以下、好ましくは約１.８ｃｍ以下である、請求項３に記載の菌株。
  5. 下記から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の菌株：
    ・２００４年５月１０日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３２１１として登録された菌株；
    ・２００４年９月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３３０１として登録された菌株；および
    ・２００４年９月１６日にＣＮＣＭに番号Ｉ−３３０２として登録された菌株。
  6. 前記天然ＡＭＩ欠損性変異株が突然変異とその酸性化特性の選択により得られたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の菌株。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種の生きた菌株を用いて基質を発酵させる、発酵食品の製造方法。
  8. 発酵を少なくとも１種の他の生きた細菌菌株の共存下で行う、請求項７に記載の方法。
  9. 前記他の細菌菌株が乳酸菌である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記乳酸菌が、ストレプトコッカス属（Streptococcus）の種；ラクトバシラス属（Lactobacillus）の種、すなわち、ラクトバシラス・ブルガリカス（L. bulgaricus）、ラクトバシラス・アシドフィルス（L. acidophilus）およびラクトバシラス・カゼイ（L. casei）；ラクトコッカス属（Lactococcus）の種およびビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の種から選ばれる、請求項９に記載の方法。
  11. 前記基質が乳系基質、即ち、ミルク、または果物、穀物および大豆のような植物性未加工成分を主成分とする基質から選ばれる、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記基質が固体成分を含んでいる、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記固体成分が果物、チョコレート含有製品および穀物から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
  14. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種の生きた菌株を含有する発酵食品。
  15. 請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法により得ることが可能な発酵食品。
  16. 乳製品または植物性食品である、請求項１４または１５に記載の発酵食品。
  17. 少なくとも１種の生物活性食品成分を含有する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の発酵食品。
  18. 前記生物活性食品成分がタンパク質、ペプチド、ならびにそれらの類似物もしくは誘導体から選ばれる、請求項１７に記載の発酵食品。
  19. 機能性食品である、請求項１７または１８に記載の発酵食品。
  20. 生の食品である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の発酵食品。
  21. 飲料、ヨーグルトもしくはクリームデザート、発酵乳または果汁から選ばれる、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の発酵食品。
  22. その官能的性質が貯蔵中保存される、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の発酵食品。
  23. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種の菌株の乳汁発酵素としての使用。
  24. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種の菌株のヒトまたは動物用食品におけるプロバイオティック剤としての使用。
  25. その官能的性質が貯蔵中も保存される発酵食品の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種の菌株の使用。
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