ES2767884T3 - Cultivo mixto anti-listeria y método para la producción de queso - Google Patents
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Abstract
Método para la producción de un producto lácteo fermentado, preferiblemente queso, donde dicho método comprende inocular directamente la leche con a. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase I la, donde al menos una es una cepa de Lb. plantarum y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y b. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase I, donde al menos una se selecciona del grupo que consiste en Lactococcus spp. y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y c. opcionalmente, una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales; donde las bacterias del ácido láctico viables que producen una bacteriocina de tipo clase Ila están presentes en una cantidad de al menos 1.10' UFC por g de producto lácteo fermentado.
Description
DESCRIPCIÓN
Cultivo mixto anti-listeria y método para la producción de queso
Campo de la invención
[0001] La presente invención está en el campo de productos lácteos de fermentación, en particular en el campo de la producción de queso.
Antecedentes de la invención
[0002] Impulsada por la preferencia del consumidor, la industria láctea está buscando constantemente conseguir alimentos mínimamente procesados que estén libres de conservantes artificiales. En este contexto, mucha atención se está dirigiendo a prevenir el crecimiento de y/o matar Listería spp. con el uso de bacteriocinas producidas por microorganismos que se reconocen generalmente como seguros (GRAS), incluidas muchas bacterias del ácido láctico (LAB).
[0003] Las bacteriocinas son compuestos antimicrobianos sintetizados ribosómicamente que son producidas por muchas especies bacterianas diferentes.
[0004] Una de las bacteriocinas mejor conocidas y ampliamente estudiada es nisina, una bacteriocina aprobada por la FDA producida por Lactococcus lactis. Maisnier-Patin et al. en Lait 1992, 72, 249-263, demostró el potencial de usar iniciadores productores de nisina para la inhibición de Listería monocytogenes en el queso Camembert. Sin embargo, como reconocen los autores, los efectos anti-listeria del cultivo productor de nisina todavía podrían mejorarse, en particular con respecto a la prevención del rebrote de Listería spp. y la inhibición de Listería en caso de existir a concentraciones superiores a 103 UFC/ml. Hasta la fecha, los cultivos productores de nisina se usan comercialmente en las fermentaciones de productos lácteos para evitar el crecimiento de Clostrídium spp.
[0005] Mientras que nisina es un representante de una bacteriocina de clase I, que tiene una acción de amplio espectro contra los microorganismos grampositivos, las bacteriocinas de clase lia y sus organismos productores son de interés considerable como bioconservantes debido a su alta actividad anti-listeria. Como se declara en la revisión por L. O'Sullivan et al. en Biochimie 2002, 84, 593-604, las bacteriocinas de clase lia son agentes anti-listeria más interesantes que las bacteriocinas de clase I, porque no tienen un espectro inhibitorio tan amplio y, por lo tanto, no matan muchos cultivos iniciadores, mientras que mata las cepas de Listería más eficazmente. Sin embargo, también se declara aquí que hay limitaciones a la utilidad de las bacteriocinas de clase lia, ya que raramente se consigue la supresión completa del patógeno.
[0006] Reviriego et al. en Journal of Food Protection, 2007, vol. 70(11), páginas 2512-2517 divulga un método para producir queso, que comprende inocular leche con bacterias del ácido láctico (es decir, Lactococcus lactis) capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia (es decir, pediocina) y bacterias del ácido láctico (es decir, Lactococcus lactis) capaces de producir una bacteriocina de tipo clase I (es decir, nisina).
[0007] Por lo tanto, todavía hay margen de mejora con respecto a la inhibición y/o la muerte de Listería spp. cuando se produce un producto lácteo fermentado.
Resumen de la invención
[0008] Con este fin, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para producir un producto fermentado, en particular un queso, donde dicho método comprende la inoculación de leche con
a. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase lia, donde al menos una es una cepa de Lb. plantarum y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y b. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase i, donde al menos una se selecciona del grupo que consiste en Lactococcus spp. y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y
c. opcionalmente, una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales;
donde las bacterias del ácido láctico viables que producen una bacteriocina de tipo clase lia están presentes en una cantidad de al menos 1-107 UFC por g de producto lácteo fermentado.
[0009] Se ha observado que la combinación de la una o más cepas de bacterias del ácido láctico tal y como se define bajo (a.) y (b.), una que produce una bacteriocina de tipo clase lia y la otra una de tipo clase i, respectivamente, produjeron una eliminación significativamente mejorada de Listería viable en productos lácteos fermentados en comparación con el efecto anti-listeria que se puede conseguir inoculando la leche con dichas cepas individuales con tasas comparables.
[0010] A este respecto cabe señalar que ha sido sugerido por Hanlin et al. en J. Food Prot. 1993, 56, 252-255 un uso sinérgico de nisina y pediocina (un ejemplo de una bacteriocina de clase lia) contra la contaminación por Listería en alimentos.
[0011] Sin embargo, Hanlin no dice nada sobre fermentaciones de productos lácteos. Además, Hanlin enseña el uso combinado de las bacteriocinas per se, y no dice nada sobre el uso de microorganismos productores de bacteriocinas. Ya que las bacteriocinas de tipo clase i se conocen comúnmente por tener una inhibición de amplio espectro hacia las bacterias, incluidas la mayoría de las bacterias del ácido láctico, incluidos, por ejemplo, los lactococos y los lactobacilos, cabría esperar que la producción de una bacteriocina de clase iia por los microorganismos productores de bacteriocinas de clase iia estuviera seriamente obstaculizada en presencia de una cepa productora de bacteriocinas de clase i.
[0012] Los presentes inventores descubrieron que el uso combinado de microorganismos productores de bacteriocinas es más preferido que el uso de las bacteriocinas per se descrito por Hanlin, especialmente en fermentaciones de productos lácteos. Sin estar limitado por la teoría, se piensa que las condiciones que favorecerán el crecimiento de Listeria generalmente estimularán también el crecimiento de las cepas productoras de bacteriocinas, de modo que la(s) bacteriocina(s) puede(n) estar presente(s) a niveles eficaces durante al menos parte del tiempo de conservación del producto lácteo fermentado. En cambio, ya que los productos lácteos fermentados contienen generalmente bacterias proteolíticamente positivas, cuando las bacteriocinas de clase i y/o iia se añaden per se sin ser producidas in situ, pueden agotarse durante la producción y/o el tiempo de conservación del producto lácteo fermentado.
[0013] La invención proporciona también una cepa de Lactobacillus plantarum depositada bajo el número LMG P-26358. En el método de la invención, esta cepa funciona extremadamente bien con una cepa bacteriana del ácido láctico productora de tipo 1 en la producción de una mezcla de bacteriocinas que es altamente eficaz contra la Listeria. Además, se puede obtener un queso de muy buen gusto.
[0014] La invención proporciona además una composición de cultivo bacteriano que comprende bacterias viables de Lb. plantarum depositadas bajo el número LMG P-26358, preferiblemente con un recuento de células viables de 1108 UFC/ml o superior, tal como 1109 UFC/ml o superior. En el método de la invención, la cepa de Lb. plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 se proporciona preferiblemente en forma de tal composición de cultivo bacteriano.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
[0015] En el contexto de esta invención, el término "recuento de células viables" se considera que significa "densidad de unidades formadoras de colonias (UFC)" expresada como UFC por volumen o UFC por peso.
[0016] El término "bacterias del ácido láctico" es conocido por la persona experta en la materia. En el contexto de esta invención, el término "bacterias del ácido láctico" se define preferiblemente como cocos o bacilos grampositivos, no formadores de esporas, anaerobios o anaerobios facultativos, negativos para catalasa capaces de formar ácido láctico como producto final de su metabolismo de carbohidratos. Los géneros bien conocidos incluyen Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Lactospaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Vagococcus y Weissella. Todas las bacterias del ácido láctico descritas aquí son capaces de fermentar lactosa y, por lo tanto, de convertir lactosa en, entre otros, glucosa como uno de los primeros pasos en su metabolismo de lactosa. Las bacterias del ácido láctico se pueden clasificar como homofermentativas o heterofermentativas. Estas definiciones son conocidas por la persona experta. Las expresiones "heterofermentativo/a/os/as" y "homofermentativo/a/os/as " cuando están relacionadas con las bacterias del ácido láctico se definen preferiblemente como en el manual "Bacterial Starter Cultures for Foods", Stanley E. Gilliland, CRC Press, Boca Raton, segunda
impresión, 1986, capítulo 2, especialmente las págs. 8-11. Las páginas 8-11, las referencias a Orla-Jensen y a Kandler y, especialmente, la figura 3 en la pág. 11 son especialmente relevantes. Preferiblemente, cuando se cultivan en leche desnatada reconstituida al 10 %, las bacterias del ácido láctico homofermentativas producirán ácido láctico casi exclusivamente a través de la vía de la hexosa difosfato. Preferiblemente, cuando se cultivan en leche desnatada reconstituida al 10 %, las bacterias del ácido láctico heterofermentativas usarán adicional y/o alternativamente a la vía de la hexosa difosfato una vía donde se descarboxila la glucosa y se forma un azúcar pentosa; la pentosa se escindirá luego en un fragmento C3 y uno C2, donde el fragmento C3 se puede reducir finalmente a ácido láctico; el fragmento C2 puede terminar como acetato o puede reducirse adicionalmente, por ejemplo, en la producción de acetaldehído y/o etanol. Preferiblemente, en bacterias del ácido láctico homofermentativas, durante el crecimiento en leche reconstituida al 10 %, más del 95 %, más preferiblemente más del 98 %, aún más preferiblemente más del 99 % del ácido láctico se produce a través de la vía de la hexosa difosfato y, por lo tanto, a través del piruvato como producto intermedio. Preferiblemente, durante el crecimiento en leche reconstituida al 10 %, en bacterias del ácido láctico heterofermentativas, más del 5 %, más preferiblemente más del 10 %, aún más preferiblemente más del 15 % o aún más del 50 % o más del 80 % del ácido láctico se produce a través de una vía metabólica que implica un producto intermedio que contiene pentosa. Las especies bacterianas del ácido láctico heterofermentativas representativas incluyen Leuconostoc spp., Oenococcus spp., Weissella spp. y Lactobacillus spp. seleccionadas del grupo que consiste en Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lb. plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fermentum y Lactobacillus reuteri. Las especies bacterianas del ácido láctico homofermentativas representativas incluyen Lactococcus spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., Pediococcus spp. y Lactobacillus spp. seleccionadas del grupo que consiste en Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus y Lactobacillus salivarius.
Las bacterias del ácido láctico pueden formar además otros metabolitos tales como bacteriocinas, exopolisacáridos y/o compuestos de sabor.
[0017] La expresión "bacteriocina de tipo clase lia" es conocida por la persona experta y preferiblemente se refiere a un péptido antilisteria sintetizado ribosómicamente que lleva un enlace o puente disulfuro. Un ejemplo de una bacteriocina de tipo clase lia es la pediocina. Otras bacteriocinas de tipo clase lia se conocen como bacteriocinas de tipo pediocina. Las bacteriocinas de tipo clase lia se distinguen de las bacteriocinas de tipo clase llb en que estas últimas requieren dos péptidos para la actividad antilisteria. Las bacteriocinas de tipo clase llc son circulares.
[0018] Una bacteriocina de tipo clase l es conocida por la persona experta en la materia y preferiblemente se refiere a un lantibiótico o a una lantionina o metil-lantionina que contiene un péptido bacteriocina. La lantionina o metil-lantionina que contiene un péptido bacteriocina tiene preferiblemente un peso molecular < 10 kDa. Nisina es una de las bacteriocinas de tipo clase l más importantes. La actividad de la nisina se expresa convenientemente en unidades o como Ul, donde 40 unidades o 40 Ul corresponden a 1 mg de nisina pura. La expresión "nisina" se puede leer como "una nisina" y puede referirse a cualquier nisina, por ejemplo, referirse a nisina A o nisina Z. Preferiblemente, "nisina" se refiere a nisina A. Preferiblemente "una nisina" se refiere a nisina A.
[0019] Aquí, la expresión "leche" se refiere a cualquier leche. La leche comprende preferiblemente o más preferiblemente consiste en leche cruda. La leche cruda es muy susceptible a la contaminación por Listeria. Dicha leche -preferiblemente cruda- se selecciona preferiblemente de leche de vaca, leche de oveja o leche de cabra, o se proporciona como una mezcla que contiene dos o más de dichos tipos de leche.
[0020] La similitud de secuencia o la identidad se determina preferiblemente usando BLAST. BLAST es un algoritmo bien conocido y se describe en Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410.
[0021] La similitud o la identidad entre secuencias de ADN o ARN se determina preferiblemente según un algoritmo BLAST nucleótido-nucleótido conocido como BLASTn usando parámetros por defecto y disponible a través del sitio web de BLAST del NCBl, en el momento de escribir este algoritmo es accesible a través de http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome.
[0022] La similitud o la identidad entre secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente según un algoritmo BLAST proteína-proteína conocido como BLASTp usando parámetros por defecto y disponible a través del sitio web de BLAST del NCBl, en el momento de escribir este algoritmo es accesible a través de http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome.
[0023] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitativo para significar que se incluyen los artículos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los artículos no específicamente mencionados. Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "una" o "un" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno del elemento, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. Por lo tanto, el artículo indefinido "una" o "un" significa normalmente "al menos uno/a".
Cepas de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia
[0024] Se describe aquí lo siguiente: se pueden usar favorablemente cepas heterofermentativas. Ventajosamente, al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico capaz de producir una bacteriocina de tipo clase lia es heterofermentativa. Se prefiere especialmente que al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico capaz de producir una bacteriocina de tipo clase lia se seleccione del grupo que consiste en Leuconostoc spp., Oenococcus spp., Weissella spp. y Lactobacillus spp., donde dicha Lactobacillus spp. se selecciona del grupo que consiste en Lb. casei, Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. sakei, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum y Lb. reuteri.
[0025] Preferiblemente, la población total de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia comprende 10-100 % de bacterias del ácido láctico heterofermentativas (donde el resto son bacterias del ácido láctico homofermentativas); el porcentaje se expresa preferiblemente como 100 veces el recuento de células viables de la población bacteriana del ácido láctico heterofermentativa dividido por el recuento de células viables de la población bacteriana del ácido láctico total. Aquí, dichas bacterias heterofermentativas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en Leuconostoc spp., Oenococcus spp., Weissella spp. y Lactobacillus spp., donde dichas Lactobacillus spp. se seleccionan del grupo que consiste en Lb.*casei, Lb.*curvatus, Lb.*plantarum, Lb.*paraplantarum, Lb.*pentosus, Lb.*sakei, Lb.*brevis, Lb.*buchneri, Lb.*fermentum y Lb.*reuteri.
[0026] Generalmente, las bacterias del ácido láctico heterofermentativas per se no se desean en la producción de queso, ya que el metabolismo heterofermentativo de lactosa produce generalmente CO2 y/o a veces subproductos no deseados tales como el ácido acético, el aldehído acético y/o el etanol. Generalmente, la producción de estos metabolitos no es deseable para el queso, especialmente si se desea un queso con no demasiados agujeros u ojos ni/o demasiado grandes, y/o si se desea un queso con un sabor limpio. Sin embargo, en presencia de la una o más cepas de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase l, la producción de CO2 no deseada y/o la formación de sabores extraños -que podría o estaría causada por las bacterias heterofermentativas en ausencia de la bacteriocina de tipo clase l- se puede reducir o evitar.
[0027] Se prefieren especialmente los lactobacilos.
Se revela que al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico capaz de producir una bacteriocina de tipo clase lia se selecciona del grupo que consiste en Lactobacillus spp., y se selecciona especialmente preferiblemente del grupo que consiste en Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. sakei, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum, Lb. reuteri y Lb. paracasei. Preferiblemente, Lactobacillus spp. y especialmente la Lactobacillus spp. seleccionada del grupo que consiste en Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. sakei, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum, Lb. reuteri y Lb. paracasei están presentes con un recuento de células viables de 30-100 % del recuento total de células viables de todas las bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia. Preferiblemente, dicha Lactobacillus spp. está presente con un recuento de células viables de 50-100 %, más preferiblemente 70-100 %, más preferiblemente 90-100 %, más preferiblemente aproximadamente del 100 %, del recuento total de células viables de todas las bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lla.
[0028] Los lactobacilos, especialmente los lactobacilos seleccionados del grupo que consiste en Lb. curvatus, Lb. plantarum, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. sakei, Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum, Lb. reuteri y Lb. paracasei, pueden ser capaces de producir notas de tipo sulfuroso u otros tipos de sabores extraños que en muchos casos son no deseados. Sorprendentemente, se ha descubierto que la aparición de dichos sabores extraños se reduce o incluso se evita en presencia de una cepa productora de bacteriocinas de tipo clase i, produciendo así un queso con mejor control de la formación de ojos y/o con menor gusto extraño en comparación con un queso que no comprende la cepa productora de bacteriocinas de tipo clase i.
[0029] Las cepas capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia son sensibles preferiblemente a la bacteriocina de tipo clase i.
Se puede obtener una muerte mejorada de Listeria si al menos una, o incluso todas las cepas de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia son sensibles a la(s) bacteriocina(s) de clase I producida(s) por la una o más cepas capaces de producir una bacteriocina de tipo clase I. Aquí, la bacteriocina de clase I comprende preferiblemente, o es, una nisina.
[0030] En el contexto de esta invención, una cepa de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia y que es sensible a la(s) bacteriocina(s) de clase I producida(s) por la una o más cepas capaces de producir una bacteriocina de tipo clase I es una cepa que, cuando se cultiva a su temperatura de crecimiento óptimo durante 4 h en leche desnatada reconstituida al 10 %, crece en ausencia de nisina hasta una densidad de unidades formadoras de colonias que es al menos 5 veces superior a la densidad de unidades formadoras de colonias que se alcanza cuando la misma cepa se incuba en presencia de 320 Ul/ml de nisina bajo, por lo demás, las mismas condiciones. Si es necesario para el crecimiento óptimo, la leche desnatada reconstituida se suplementa con extracto de levadura al 0,1 % y/o 0,2 g-l-1 de MnS0 4 -4 H2 0.
[0031] Se revela que la cepa de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia crece, cuando se cultiva a su temperatura de crecimiento óptimo durante 4 h en leche desnatada reconstituida al 10 % en ausencia de nisina, hasta una densidad de unidades formadoras de colonias que es al menos 5 veces superior al recuento de células que se alcanza cuando la misma cepa se incuba en presencia de 320 Ul/ml de nisina bajo, por lo demás, las mismas condiciones. Opcionalmente, la leche desnatada reconstituida se suplementa con extracto de levadura al 0,1 % y/o 0,2 g-l-1 de MnS0 4 -4 H20 en el caso de que sea necesario para el crecimiento óptimo.
[0032] Sorprendentemente se ha descubierto que, aunque una cepa bacteriana del ácido láctico capaz de producir una de tipo clase lla sea sensible a una bacteriocina de tipo clase l, será inhibida por la cepa productora de bacteriocinas de clase l, pero todavía se consigue la producción de la bacteriocina de clase lla y, por lo tanto, la eliminación eficaz de especies de Listeria. Dicha capacidad para la producción de una bacteriocina de tipo clase lla en presencia de una cepa capaz de producir una bacteriocina de tipo clase l se consigue especialmente si la leche es directamente inoculada con:
- al menos una, y preferiblemente todas las cepas de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase l se proporcionan en forma congelada o liofilizada, y
- al menos una, y preferiblemente todas las cepas de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lla se proporcionan en forma congelada o liofilizada.
[0033] Aquí la expresión "directamente inoculada" es conocida por la persona experta y tiene el mismo significado que en "inoculación de tanque directa" y significa que a las bacterias congeladas o liofilizadas, antes de su adición a la leche, no se les permite conseguir un crecimiento en más de 1 (una) unidad logarítmica, más preferiblemente en más de 0,2 unidades logarítmicas. Sin embargo, las bacterias congeladas o liofilizadas pueden descongelarse opcionalmente, o disolverse en un medio acuoso, antes de añadirlas a la leche.
[0034] Se ha descubierto que los lactobacilos -incluso si son sensibles a nisina u otra bacteriocina de tipo clase l- son especialmente capaces de sobrevivir bien en queso obtenido usando el método, manteniendo los recuentos de células de Lactobacillus viables de 1-106 UFC/g o superiores o incluso de 1-107 UFC/g o superiores durante hasta 18 semanas después de su producción, especialmente cuando el queso se mantiene a una temperatura de entre 2 y 18 °C, aún más preferiblemente entre 4 y 15 °C.
[0035] Cepas capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lla.
Según la invención, al menos una de las bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase lla es una cepa de Lactobacillus plantarum o es una cepa bacteriana del ácido láctico, con un gen del ARNr 16S con una secuencia que tiene más del 95 %, preferiblemente más del 97 %, más preferiblemente más del 99 % de similitud, preferiblemente identidad, o más preferiblemente con el 100 % de similitud, preferiblemente identidad, con la SEQ lD NO 1. La SEQ lD NO 1 es la secuencia génica del ARNr 16S de la Lactobacillus plantarum depositada bajo el número LMG P-26358.
[0036] Se prefiere especialmente que al menos una de las bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase lla sea la cepa Lactobacillus plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 o un mutante de la misma que tenga la capacidad a producir una bacteriocina de tipo clase lla y tiene preferiblemente el 100 % de similitud, preferiblemente identidad, del gen del ARNr 16S, con la SEQ lD NO 1.
[0037] En una forma de realización especialmente adicionalmente preferida, cepas de Lactobacillus plantarum o cepas bacterianas del ácido láctico que tienen un gen del ARNr 16S con una secuencia que tiene más del 95 %, preferiblemente más del 97 %, más preferiblemente más del 99 % de similitud, preferiblemente identidad, o más preferiblemente con el 100 % de similitud, preferiblemente identidad, con la SEQ ID NO 1, están presentes con un recuento de células viables que es 30-100 %, preferiblemente 50-100 %, más preferiblemente 70-100 %, más preferiblemente 90-100 %, más preferiblemente aproximadamente el 100 %, del recuento total de células viables de todas las bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase IIa. Se prefiere particularmente que la cepa sea Lactobacillus plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 o un mutante de la misma que tiene la capacidad de producir una bacteriocina de tipo clase IIa y tiene preferiblemente el 100 % de similitud, preferiblemente identidad, del gen del ARNr 16S con la SEQ ID NO 1.
[0038] En estas formas de realización preferidas, el gusto, la textura y el efecto antilisteria óptimos se pueden obtener en un método para producir queso, especialmente si la(s) bacteriocina(s) de tipo clase I producida(s) por la una o más cepas bacterianas del ácido láctico en (b) comprende(n) o consiste(n) en una nisina.
Cepas de bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase I
[0039] Según la invención, al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase I se selecciona del grupo que consiste en Lactococcus spp., o preferiblemente se selecciona como una cepa de Lactococcus lactis subesp. lactis biovar diacetylactis.
[0040] Adicionalmente preferiblemente, al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase I es una cepa bacteriana del ácido láctico que produce una nisina o una lacticina, más preferiblemente una nisina.
[0041] Se prefiere especialmente que al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase I sea una cepa de L. lactis, tal como una cepa de L. lactis subesp. lactis biovar diacetylactis, que esa produzca una nisina y que sea inmune a las nisinas, por lo cual adicionalmente preferiblemente la capacidad de producir nisina y la inmunidad a nisina están codificadas por información genética que está presente en, o deriva de, un transposón, tal como preferiblemente Tn5276-NI.
[0042] El término "cepa productora de nisina" o de forma equivalente "cepa capaz de producir una nisina" preferiblemente se refiere a una cepa bacteriana del ácido láctico que es capaz, opcionalmente en presencia de un extracto de levadura, de producir al menos 10 UI, más preferiblemente al menos 100 UI, más preferiblemente al menos 300 UI de una nisina por ml de leche (pasteurizada) durante la incubación de dicha leche durante 24 horas a 30 °C, donde la leche se ha inoculado con la cepa productora de nisina a aproximadamente 106 UFC/ml. Preferiblemente, en el contexto de esta invención, el término "cepa productora de nisina" o, de forma equivalente, "cepa capaz de producir una nisina" se refiere a una cepa bacteriana del ácido láctico que es capaz, opcionalmente en presencia de un extracto de levadura, de producir al menos 100 UI, más preferiblemente al menos 300 UI de una nisina por ml de leche pasteurizada durante la incubación de dicha leche durante 8 horas a 30 °C, donde la leche se ha inoculado con la cepa productora de nisina a aproximadamente 106 UFC/ml.
[0043] En una forma de realización especialmente adicionalmente preferida, las cepas productoras de nisina de L. lactis y/o las (sub)especies adicionales de las mismas están presentes con un recuento de células viables que es 30-100 %, preferiblemente 50-100 %, más preferiblemente 70-100 %, más preferiblemente 90-100 %, más preferiblemente aproximadamente el 100 %, del recuento total de células viables de todas las bacterias del ácido láctico capaces de producir una bacteriocina de tipo clase I.
[0044] Un cultivo concentrado que comprende bacterias de una cepa productora de nisina inmune a nisina de L. lactis subesp. lactis biovar diacetylactis y de una cepa inmune a nisina de L. lactis subesp. cremoris, cada una con un recuento de células viables de al menos 1-109 UFC/ml, está comercialmente disponible, por ejemplo, como D509, de la gama de DairySafe de CSK Food Enrichment BV, Países Bajos.
[0045] Cultivos de lactococos productores de nisina también pueden, por ejemplo, obtenerse de Chr. Hansen, por ejemplo, como BS-10. Cultivos de lactococos productores de nisina se conocen también en la bibliografía, por ejemplo, de Bouksaim et al., 2000, Int. J. Food Microbiol. vol. 59, págs. 141-156).
La opcionalmente una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales
[0046] En una forma de realización del método según la invención, además de las cepas productoras de bacteriocinas de tipo clase lia y de bacteriocinas de tipo clase I, están presentes una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales. Preferiblemente, la una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales son cepas acidificantes de lactococos. Preferiblemente, la una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales son resistentes o inmunes a las bacteriocinas de tipo clase I, preferiblemente, la una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales son resistentes o inmunes a nisina.
[0047] Una cepa acidificante de lactococos que es resistente o inmune a una bacteriocina de tipo clase I, en particular resistente o inmune a nisina, se refiere a una cepa de lactococos que, cuando se añade a leche pasteurizada en una cantidad de un 1 % en peso con respecto al peso de la leche, en presencia de una bacteriocina de tipo clase I, en particular nisina, a 10 unidades/ml, es capaz de reducir el pH de la leche en al menos 1 unidad de pH durante la incubación de la leche durante 6 horas a una temperatura de 30 °C.
[0048] En una forma de realización, una cepa bacteriana del ácido láctico adicional que está presente, es una cepa inmune a nisina de L. lactis, preferiblemente de la subespecie cremorís. La inmunidad a nisina en esta cepa está codificada preferiblemente por información genética que está presente en, o deriva de un transposón, tal como por ejemplo Tn5276-NI. Un cultivo concentrado que comprende bacterias de una cepa productora de nisina de L. lactis subesp. lactis biovar diacetylactis y de una cepa inmune a nisina de L. lactis subesp. cremoris, cada una con un recuento de células viables de aproximadamente 11010 UFC/ml, está comercialmente disponible, por ejemplo, como D509, de la gama de DairySafe de CSK Food Enrichment BV, Países Bajos.
[0049] Adicional o alternativamente, en una forma de realización, una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales que están presentes son una o más cepas de Lb. helvéticas y/o de Lb. acidophilus. Por consiguiente, se puede obtener un gusto aún mejor de un queso en un método para hacer el queso. Un cultivo concentrado que comprende bacterias de Lb. helveticus con un recuento de células viables de al menos 1109 UFC/ml está comercialmente disponible, por ejemplo, como L700, de CSK Food Enrichment BV, Países Bajos.
Formas de realización preferidas específicas para el cultivo mixto.
[0050] La composición de cultivo del ácido láctico mixto en el método según la invención consiste preferiblemente en (1) bacterias del ácido láctico; (2) agua; (3) opcionalmente bacterias no acidolácticas, preferiblemente con un recuento total de células viables inferior a 104 UFC/g de la composición, y (4), opcionalmente, aditivos adicionales en una cantidad de hasta el 20 % en peso respecto al peso de la composición. Las bacterias del ácido láctico están presentes preferiblemente con un recuento de células viables de al menos 1109 UFC/g, más preferiblemente de al menos 11010 UFC/g de la composición. Los aditivos opcionales adicionales comprenden preferiblemente un crioprotector, tal como un monosacárido, y/o un disacárido, y/o un oligosacárido tal como la inulina y/o un polisacárido tal como la goma arábiga o la goma xantana, o una mezcla de los mismos. El crioprotector está presente preferiblemente en una cantidad de un 1-15 % en peso respecto al peso de la composición.
[0051] La composición de cultivo del ácido láctico mixto está en forma congelada o liofilizada. Cuando está en forma congelada, la composición de cultivo del ácido láctico mixto está preferiblemente en forma de partículas congeladas adicionalmente preferiblemente con un diámetro de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 50 mm, aún más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Tales partículas se conocen comúnmente como gránulos.
[0052] Preferiblemente, al menos una de las cepas bacterianas del ácido láctico que produce una nisina y al menos una de las cepas de las bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase IIa no es capaz de crecer en presencia de la nisina a una concentración de 300 UIm l-1, más preferiblemente a una concentración de la nisina de 500 UIm l-1.
[0053] Al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase IIa está presente como una cepa de Lb. plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 o un mutante de la misma que produce una bacteriocina de tipo clase IIa y tiene preferiblemente el 100 % de similitud, preferiblemente identidad, del gen del ARNr 16S con dicha cepa depositada; y al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase I se selecciona del grupo que consiste en Lactococcus spp., preferiblemente como una cepa de L. lactis subesp. lactis biovar diacetylactis, y es una cepa que es capaz de producir una nisina.
[0054] La una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase lia están presentes en la composición de cultivo con un recuento total de células viables de al menos 1-108, más preferiblemente de al menos 1-109 UFC por gramo de la composición de cultivo, y la una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase l están presentes en la composición de cultivo con un recuento total de células viables de al menos 1-108, más preferiblemente de al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo. Resultados especialmente buenos en cuanto al gusto y la producción de bacteriocinas se pueden obtener si la proporción de bacterias del ácido láctico viables que producen una bacteriocina de tipo clase lia a bacterias del ácido láctico viables que producen una bacteriocina de tipo clase i está entre 50:1 y 1:2, más preferiblemente entre 30:1 y 1:1, más preferiblemente entre 20:1 y 3:1. Estas proporciones también se usan preferiblemente en el método para la producción del producto lácteo fermentado.
[0055] La composición de cultivo bacteriano del ácido láctico mixto comprende preferiblemente bajo (a) la cepa de Lb. plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 o un mutante de la misma que tiene la capacidad de producir una bacteriocina de tipo clase lia y tiene preferiblemente el 100 % de similitud, preferiblemente identidad, del gen del ARNr 16S con dicha cepa depositada con un recuento total de células viables de preferiblemente al menos 1108, más preferiblemente de al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo, y comprende preferiblemente adicionalmente bajo (b) una cepa de Lactococcus spp., preferiblemente una cepa de L. lactis subesp. lactis biovar diacetylactis, donde dicha cepa de lactococos es capaz de producir una nisina, y donde dicha cepa de lactococos está presente con un recuento total de células viables de al menos 1108, más preferiblemente de al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo.
[0056] Bajo (c), la composición de cultivo bacteriano del ácido láctico mixto comprende adicionalmente preferiblemente una o más cepas de Lb. helveticus y/o de Lb. acidophilus. El recuento de células viables de dicha una o más cepas de Lb. helveticus y/o de Lb. acidophilus en la composición de cultivo es preferiblemente al menos 1 ■ 108, más preferiblemente al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo. Adicional o alternativamente a la una o más cepas de Lb.* helveticus y/o de Lb.* acidophilus, la composición de cultivo bacteriano del ácido láctico mixto comprende preferiblemente una cepa acidificante de lactococos inmune a nisina o resistente a nisina, preferiblemente con un recuento de células viables de al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo. Un cultivo concentrado que comprende bacterias de Lb. helveticus con un recuento de células viables de al menos 1109 UFC/ml está comercialmente disponible, por ejemplo, como L700, de CSK Food Enrichment BV, Países Bajos.
[0057] Se obtienen mejores resultados, especialmente en cuanto al efecto anti-listeria y el gusto de un queso producido con el mismo, si la composición de cultivo bacteriano del ácido láctico mixto comprende una cepa de lactococos productora de nisina, opcionalmente una cepa de lactococos inmune o resistente a nisina, y la cepa de Lb.*plantarum LMG P-26358, donde las bacterias de cada una de dichas cepas están presentes a al menos 1108 UFC/ml, más preferiblemente al menos 1109 UFC/ml de la composición de cultivo, y donde la proporción de bacterias viables de Lb. plantarum LMG P-26358 a lactococos productores de nisina viables está entre 50:1 y 1:2, más preferiblemente entre 30:1 y 1:1, más preferiblemente entre 20:1 y 3:1. Estas proporciones también se usan preferiblemente en el método para la producción del producto lácteo fermentado.
La bacteriocina de tipo clase lia
[0058] La bacteriocina de tipo clase iia comprende preferiblemente un dominio N-terminal que comprende la secuencia consenso SEQ iD NO 2: YGNGV(X)C(X)4C(X)V(X)4a, donde X representa cualquier aminoácido. Aquí, cada letra codifica para un aminoácido según el esquema de codificación de letra única para aminoácidos conocido por la persona experta.
[0059] La bacteriocina de tipo clase iia tiene preferiblemente un peso molecular de 3929 /- 4 Dalton. La bacteriocina de tipo clase iia se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en una plantaricina, una pediocina, una sakacina, una mesentericina, una carnobacteriocina, una curvacina, una leucocina y una enterocina. Preferiblemente, la bacteriocina de tipo clase iia tiene una secuencia de aminoácidos que tiene el 95 % de similitud, preferiblemente identidad, o superior, más preferiblemente el 97 % de similitud, preferiblemente identidad, o superior, más preferiblemente el 99 % de similitud, preferiblemente identidad, o incluso aproximadamente el 100 % de similitud, preferiblemente identidad con la secuencia de aminoácidos de que tiene una masa molecular de 3932,74 como describe Van Reenen et al. en int. J. Food Microbiol. 2003, vol. 81, págs. 29-40. La secuencia de aminoácidos de la bacteriocina producida por la cepa de Lb.*plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 tiene al menos el 99 % de similitud, preferiblemente identidad, con la secuencia de aminoácidos de la plantaricina 423.
El producto fermentado
[0060] El producto fermentado comprende preferiblemente bacterias del ácido láctico viables capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia en una cantidad de al menos 1106 UFC/g, más preferiblemente de al menos 1-107 UFC/g, más preferiblemente de al menos 1-108 UFC/g de producto lácteo fermentado. Por consiguiente, se pueden obtener mejores resultados anti-listeria. Se ha observado que, con recuentos de células viables por debajo de 1108 y especialmente por debajo de 1-107 o por debajo de 1-106 UFC/g de producto lácteo fermentado, el efecto antilisteria se reduce visiblemente, especialmente si las bacterias del ácido láctico viables capaces de producir una bacteriocina de tipo clase lia se seleccionan como Lactobacillus spp. Preferiblemente, el producto fermentado comprende además bacterias del ácido láctico viables capaces de producir una bacteriocina de tipo clase l en una cantidad de al menos 1106 UFC por gramo de producto lácteo fermentado. El producto fermentado es preferiblemente un queso, más preferiblemente un queso semicurado o un queso curado. El queso semicurado o el queso curado se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en queso de tipo Gouda, queso de tipo Cheddar, Tilsit y Gruyere. La expresión "queso de tipo Gouda" comprende todos los quesos semicurados y curados obtenidos por un proceso de fabricación de queso que comprende salar en una solución de salmuera, tal como Gouda, Edam y Maasdam.
La cepa depositada y el cultivo bacteriano que comprende la cepa depositada
[0061] La cepa Lb. plantarum LMG P-26358 se ha aislado de la superficie de un queso artesanal francés suave. Se cortó una rebanada de este queso consistente en superficie y aproximadamente 1 cm de queso por debajo y la cepa se aisló de esta rebanada. Dicha cepa es una bacteria del ácido láctico y se depositó el 17 de marzo de 2011 según las condiciones del tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines de los procedimientos en materia de patentes en Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM™), Laboratorium voor Microbiologie - Bacterienverzameling, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gante, Bélgica. Se le asignó el número de depósito LMG P-26358. La bacteriocina anti-listeria producida por LMG P-26358 se determinó en un ensayo de difusión en pocillo de agar usando Enterococcus faecalis DPC 5055/LMG 7973 o, más preferiblemente, Listeria innocua como el organismo indicador.
[0062] Aquí la expresión "mutante" es conocida por la persona experta y preferiblemente se refiere a una cepa de Lb. plantarum obtenida por mutación, variación o recombinación de la cepa depositada de Lb. plantarum LMG P-26358.
[0063] La presente invención proporciona también una composición de cultivo bacteriano que comprende bacterias viables de Lb. plantarum LMG P-26358. La composición de cultivo bacteriano comprende preferiblemente las bacterias viables de Lb. plantarum LMG P-26358 con un recuento viable de al menos 1108 UFC/ml, más preferiblemente de al menos 1109 UFC/ml, más preferiblemente de al menos 11010 UFC/ml de la composición de cultivo; el recuento viable de la Lb. plantarum LMG P-26358 residirá en condiciones prácticas por debajo de 11012 UFC/ml de la composición de cultivo.
[0064] Esta composición de cultivo bacteriano está preferiblemente en forma congelada o liofilizada. Un cultivo congelado o liofilizado es fácil de almacenar hasta su uso. Cuando está en forma congelada, la composición de cultivo del ácido láctico mixto está preferiblemente en forma de partículas congeladas adicionalmente preferiblemente con un diámetro de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 50 mm, aún más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Tales partículas se conocen comúnmente como gránulos.
[0065] Alternativamente, esta composición de cultivo bacteriano también puede estar en forma líquida. La forma líquida es particularmente ventajosa en un método que comprende aplicar esta composición líquida de cultivo bacteriano a la superficie de un queso. La invención divulga también un queso que se puede obtener por este método.
[0066] Esta composición de cultivo bacteriano consiste preferiblemente en (1) bacterias del ácido láctico que comprenden Lb. plantarum LMG P-26358; (2) agua; (3), opcionalmente, bacterias no acidolácticas, preferiblemente con un recuento total de células viables inferior a 104 UFC/g de la composición, y (4), opcionalmente, aditivos adicionales en una cantidad de hasta el 20 % en peso respecto al peso de la composición. Las bacterias del ácido láctico están presentes preferiblemente con un recuento de células viables de al menos 1109 UFC/g, más preferiblemente de al menos 11010 UFC/g de la composición de cultivo. Los aditivos opcionales adicionales comprenden preferiblemente un crioprotector, tal como un monosacárido, y/o un disacárido, y/o un oligosacárido tal como la inulina y/o un polisacárido tal como la goma arábiga o la goma xantana, o una mezcla de los mismos. El crioprotector está presente preferiblemente en una cantidad de 1-15 % en peso respecto al peso de la composición de cultivo.
[0067] Para todos los organismos microbianos depositados mencionados en la presente solicitud de patente se aplica lo siguiente. En cuanto a las respectivas oficinas de patentes de los respectivos estados designados, los solicitantes solicitan que una muestra de los microorganismos depositados declarados anteriormente solo se ponga a disposición de una persona experta designada por el solicitante hasta la fecha en la que la patente se conceda o la fecha en la que la solicitud se haya rechazado o retirado o se considere retirada.
[0068] En particular se solicita que una muestra del microorganismo depositado se pondrá a disposición hasta la publicación de la mención de la concesión de la patente europea o hasta la fecha en la que la solicitud se haya rechazado o retirado o se considere retirada, solo por la emisión de tal muestra a una persona experta designada por la persona que solicita la muestra, y aprobada o i) por el Solicitante y/o ii) por la Oficina Europea de Patentes, según corresponda (regla 32 CPE).
Ejemplos
Materiales y métodos
Aislamiento de Lactobacillus plantarum LMG P-26358 y ensayos de bacteriocina
[0069] Aproximadamente 1 g de un queso francés artesanal suave se homogeneizó en 9 ml de diluyente de máxima recuperación (MRD), se diluyó en serie y se sembró en agar MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.) y se cultivó a 30 °C durante 2-3 días. Las colonias que se desarrollaron se cubrieron con 10 ml de agar GM17 [medio M17 (Difco Laboratories) suplementado con glucosa al 0,5 % (p/v)] inoculado al 0,25 % con un cultivo de L. innocua (DPC6579) durante toda la noche. Las placas se incubaron durante otras 18 h a 37 °C y se inspeccionaron en busca de zonas de inhibición del cultivo cubierto. Las colonias que mostraron una zona clara de inhibición se subcultivaron en caldo MRS fresco habiéndose eliminado primero de la capa de agar usando una cuchilla de escalpelo estéril. Se obtuvieron cultivos puros cultivando en estría sobre agar MRS. Se realizaron ensayos de bacteriocina y una estimación de la actividad de bacteriocina en unidades de actividad (UA)/ml mediante el ensayo de difusión en pocillo de agar (WDA) como describen Ryan et al. et al. en Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, págs. 612 619. La fuente de cada organismo indicador evaluado para determinar los espectros de inhibición se enumera en la tabla 1 con las condiciones de crecimiento apropiadas. La sensibilidad de una cepa a la bacteriocina producida por los aislados de queso francés artesanal se puntuó según el diámetro de la zona de inhibición circundante que produce. Cada ensayo se realizó por triplicado. Otros medios usados en el estudio incluyeron caldo ICC (infusión cerebrocorazón) (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, Inglaterra), RCM (medio reforzado para clostridios) (Merck, Darmstadt, Alemania), agar LBS (selectivo para lactobacilos) (Difco Laboratories), PCA (recuento total en placa) (Difco Laboratories), SLB (caldo de lactato de sodio) descritos por Drinan y Cogan (1992). Todas las cepas se almacenaron en glicerol al 50 % a -20 °C.
Identificación de Lactobacillus plantarum LMG P-26358
[0070] Se aisló ADN genómico de 1,5 ml de cultivo de caldo MRS durante toda la noche usando un método de Hoffman y Winston conocido con ligera modificación como se describe por Mills S, Griffin C, Coffey A, Meijer WC, Hafkamp B, Ross RP: CRISPR Analysis of Bacteriophage Insensitive Mutants (BIMs) of Industrial Streptococcus thermophilus-Implications for Starter Design In submission 2009. El método de Hoffmann y Winston se describe en Hoffman CS, Winston F: A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 1987, 57: 267-272.
[0071] Los cebadores del ARNr 16s CO1 (SEQ ID NO 3: AGTTTGATCCTGGCTCAG) y CO2 (SEQ ID NO 4: TACCTTGTTACGACTT) se usaron para amplificar un producto de 1500 pb usando una temperatura de hibridación de 60 °C. Se realizó una amplificación por PCR en una unidad Hybaid PCR express (Hybaid Ltd., Middlesex, Reino Unido) según las especificaciones del fabricante usando una ADN-polimerasa Biotaq (BioTaq, Bioline Ltd., Londres, Reino Unido). El producto de la PCR se purificó usando un sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y se secuenció con un secuenciador de ADN automatizado (Beckman Coulter Genomics, Hope End, Takeley, Reino Unido). La secuencia génica del ARNr 16S se analizó usando BLAST para identificar el vecino bacteriano más cercano, según protocolos descritos por S.F. Altschul et al. en Nucleic Acids Res.
1997, 25, págs. 3389-3402.
Efectos de la proteinasa K, el pH y la temperatura en la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 y estabilidad de producción
[0072] El sobrenadante libre de células se cosechó a partir de 1 mi de cultivo durante toda la noche y se expuso a una concentración final de 50 mg/ml proteinasa K (Sigma-Aldrich, Poole Dorset, Reino Unido) y se incubó durante 2 horas a 37 °C. El agar WDA se realizó luego contra L. innocua con la muestra tratada con proteinasa K y sobrenadante libre de células no tratado como control. Para determinar el efecto del pH en la actividad de bacteriocina, el pH de los sobrenadantes libres de células se ajustó a valores de pH que varían de 1 a 10 usando NaOH 1 M o HCl 1 M y se incubó durante 2 horas a 25 °C antes de realizar el agar WDA. En un experimento separado se evaluó el efecto de la temperatura en la actividad de bacteriocina incubando los sobrenadantes libres de células a 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 °C durante 30 min, después de lo cual se evaluó la actividad contra L. innocua. Se evaluó la estabilidad de producción de bacteriocina subcultivando Lb. plantarum LMG P-26358 (2 %) en caldo MRS dos veces al día durante un periodo de 10 días y realizando el agar WDA contra L. innocua cada día. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Purificación por HPLC y espectrometría de masas
[0073] La bacteriocina se purificó y la masa molecular se determinó de la siguiente manera: 50 pl de cultivo madre se cultivaron durante toda la noche a 37 °C en 5 ml de caldo MRS. Cuarenta ml de MRS se inocularon al 1 % en peso del cultivo durante toda la noche y se incubó durante 6-7 horas a 37 °C y esto se usó luego para proporcionar un inóculo al 1 % en peso para 2 litros de caldo MRS. Después de una incubación durante toda la noche a 37 °C, el cultivo se centrifugó a 14.160 x g durante 15 minutos y se descartó el sobrenadante. Las células se mezclaron con 250 ml de isopropanol al 70 %, ácido trifluroacético (TFA) al 0,1 % y se agitaron durante 3 horas a temperatura ambiente. Las células se volvieron a centrifugar y el sobrenadante libre de células se evaluó para determinar la actividad anti-listeria. El isopropanol se eliminó del sobrenadante libre de células usando un evaporador rotatorio Buchi (Buchi, Suiza) y la preparación resultante se pasó a través de una columna Strata C18-E SPE de 5 g, 20 ml (Phenomenex, Cheshire, Reino Unido), la columna se lavó con 20 ml de etanol al 30 %y la bacteriocina se eluyó con 20 ml de isopropanol al 70 %, TFA al 0,1 %. El isopropanol se eliminó de 20 ml de la muestra que contiene bacteriocina y esta se aplicó luego a una columna de HPLC en fase inversa C12 Proteo circulando un gradiente de acetonitrilo al 25-40 %, TFA al 0,1 % durante 35 minutos. Se realizaron típicamente dos ciclos de HPLC por preparación de 2 litros. Se realizó una espectrometría de masas sobre las fracciones anti-listeria usando un espectrómetro de masas Axima TOF2 MALDI TOF (Shimadzu Biotech, Manchester, Reino Unido). Una parte alícuota de 0,5 pl de solución de matriz (ácido sinapínico, 10 mg/ml en acetonitrilo al 50 %-TFA al 0,1 % (v/v)) se depositó sobre la diana y se dejó durante 5 segundos antes de ser eliminada. La solución restante se dejó secar al aire y la solución de muestra se depositó sobre el punto de muestra recubierta previamente. Se añadió solución de matriz (0,5 pl) a la muestra depositada y se dejó secar al aire. La muestra se analizó posteriormente en el modo lineal de iones positivos. El péptido purificado se resuspendió en tampón fosfato 0,1 M (pH 6,8) y se almacenó a -20 °C. La actividad en UA/ml se determinó por WDA como han descrito previamente M.P. Ryan et al. en Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62, págs. 612-619.
Identificación de genes que codifican la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
[0074] La secuenciación N-terminal del péptido fue realizada por Aberdeen Proteomics (Aberdeen University, Aberdeen, Reino Unido). En función de la similitud de secuencia de aminoácidos con la plantaricina 423, cebadores diseñados para el gen estructural, plaA, (423A5: SEQ ID NO 5: AAATACTATGGTAATGGGG y 423A3: SEQ ID NO 6: CATGGAAAGTGCTAATTA) descritos por C.A. van Reenen et al. en Int J Food Microbiol 2003, 81, págs. 29-40. Los cebadores diseñados para el operón entero en este estudio (423F: SEQ ID NO 7: ATGATGAAAAAAATTGAAAAA y 423R: SEQ ID NO 8: CTTGATTATGAATTAACCGT) se usaron para las amplificaciones por PCR. El ADN se amplificó en una unidad Hybaid PCR express. El sistema Expand High Fidelity pCr System (Roche Diagnostics Ltd., East Sussex, Reino Unido) se usó para amplificar los productos según el manual de aplicaciones de Roche Diagnostics. El producto de la PCR que representa el operón entero se purificó usando el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). El producto purificado se clonó en el kit TOPO XL PCR Cloning (Invitrogen, Paisley, Reino Unido). Los clones se secuenciaron con un secuenciador de ADN automatizado (Beckman Coulter Genomics, Reino Unido) usando los sitios de cebado M13 directo e inverso en el vector pCR-XL-TOPO. Las enzimas de restricción se compraron de New England Biolabs (Hertfordshire, Reino Unido) y se usaron según las instrucciones del fabricante. La secuencia se anotó usando ORF Finder (NCBI) y se analizó usando BLAST según Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997, 25, págs. 3389-3402.
Modo de acción de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
[0075] Para determinar el modo de acción de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 en las células en fase exponencial de L. innocua, un inóculo al 2 % en peso?? del cultivo se cultivó durante 3 horas, después de lo cual, el cultivo se dividió en dos muestras de igual volumen. Una preparación purificada de la bacteriocina (2560 UA/ml) se añadió a una muestra (de prueba) y tanto la prueba como el control se incubaron a 37 °C durante 8 horas. Se determinaron la densidad óptica (600 nm) y los números celulares (unidades formadoras de colonias (UFC/ml)) en intervalos de 2 horas.
[0076] En un experimento separado se determinó el modo de acción de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 en células en fase estacionaria de L. innocua. Un inóculo al 1 % en peso?? del cultivo se cultivó durante toda la noche. El día siguiente, las células se cosecharon y se resuspendieron en tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,0). La muestra se dividió luego en prueba y control y se añadieron a la prueba 2560 UA/ml de una preparación purificada de la bacteriocina. Ambas muestras se incubaron a 37 °C durante 8 horas. Se determinaron la densidad óptica (600 nm) y los números celulares (UFC/ml) en intervalos de 2 horas. Cada experimento se realizó por triplicado y el porcentaje de muerte se calculó según el método de Deraz et al. J. Ind. Microbiol. Biotechnol 2007, 34, págs. 373 379. En particular, se aplicó el cálculo siguiente:
% de muerte = [(8células viables iniciales)-(células viables finales))/(células viables iniciales)] x 100.
Concentración mínima inhibitoria (CMI) y actividad específica de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
[0077] La CMI se determinó según el método de Gravesen et al. Microbiology 2002 148, págs. 2361-2369 y Ramnath et al. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, págs. 3098-3101. Brevemente, 5 pl de una dilución en serie dos veces del sobrenadante libre de células (2560 UA/ml de plantaricina producida por Lb. plantarum LMG P-26358) o péptido purificado se localizaron sobre placas GM17 sembradas con L. innocua al 0,25 %. La CMI se calculó como la concentración mínima que produjo una zona visible después de 18 horas a 37 °C. El experimento se realizó por triplicado. La actividad específica se midió experimentalmente generando una curva estándar de concentración de bacteriocina en mg/ml frente a UA/ml. El experimento se realizó por triplicado con dos preparaciones purificadas diferentes de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358. En ambos experimentos, el valor R2 estaba por encima del nivel de confianza del 95 %.
Caracterización de la producción de ácido por Lactobacillus plantarum LMG P-26358 y Lactococcus lactis CSK65
[0078] Se realizaron perfiles de temperatura de queso como se describe por Harrington y Hill Appl. Environ. Microbiol.
1991, 57, 3405-3409. Sin embargo, en el caso de Lb. plantarum LMG P-26358, la RSM al 10 % se suplementó con extracto de levadura al 0,1 % y 0,2 g/l de MnS0 4 -4 H2 0 y la muestra de prueba se suplementó con 320 UA/ml de nisina. El pH se registró para la prueba y el control cada hora durante 7 horas. Para probar el efecto de la bacteriocina producida por Lb. plantarum Lm G P-26358 sobre la acidificación de L. lactis CSK65, se añadieron 2560 UA/ml de dicha bacteriocina a la muestra de prueba. El pH se monitoreó para la prueba y el control cada hora durante 7 horas.
Producción de queso a escala de laboratorio con Lactobacillus plantarum LMG P-26358
[0079] Los cultivos se inocularon en 1 l de leche entera calentada a 32 °C. L. innocua (DPC6578) (una cepa resistente a la estreptomicina) se añadió a cada tanque de muestra a un nivel de 103 UFC/ml. Treinta min después de la inoculación se añadió cuajo Chymax (Hansens, Little Island, Cork, Irlanda) según las instrucciones del fabricante y la cuajada se cortó en el tiempo apropiado. La temperatura se elevó luego de 32 °C a 38,5 °C durante un periodo de 30 min. A un pH de 6,2, el suero de leche se drenó y la temperatura se redujo a 32 °C. Cuando la cuajada alcanzó un pH de 5,2, la cuajada se drenó adicionalmente y se prensó en moldes durante toda la noche. Los quesos se incubaron luego a 20 °C durante 16 horas, después de lo cual se envasaron al vacío y se maduraron a 12 °C durante 4 semanas. L. innocua se contó en cada queso semanalmente homogeneizando 1 g de queso en MRD y sembrando diluciones en serie sobre GM17 con estreptomicina (500 pg/ml). Lb. plantarum LMG P-26358 se contó sembrando en agar LBS. Cada prueba de queso se realizó por triplicado.
Producción de queso Gouda a escala industrial con Lactobacillus plantarum LMG P-26358
[0080] Se fabricó queso Gouda a escala industrial según un protocolo estándar. Más específicamente, para cada ciclo, se usaron 1500 l de leche por tanque para producir 15 x 10 kg de ruedas de queso con el 51 % de grasa, el 41 % de humedad y el 3 % de contenido de sal. La leche se bactofugó a 68 °C durante 13 s y se pasteurizó a 73 °C durante 13 s, luego la leche para queso se enfrió hasta 32 °C. En este punto se añadieron nitrato (como solución acuosa al 35 %) y cloruro de calcio (como solución acuosa al 33 %) en las cantidades de 55 y 70 g, respectivamente, por 1500 L. La(s) combinación/combinaciones de cultivo(s) se añadieron como se indica debajo bajo el título "Producción de queso Gouda a escala industrial usando Lactobacillus plantarum LMG P-26358 como un cultivo complementario". Una cantidad de cuajo de ternero, Ceska®-Lase 150 IMCU (CSK Food Enrichment, Ede, Países Bajos) añadida fue 20 gramos por 1500 l de leche para queso. Después de un tiempo de coagulación de 35 min, la cuajada se cortó durante 20 min y luego se eliminó el 40 % del suero de leche. La lactosa restante se lavó de la cuajada por adición de agua caliente. La cuajada se agitó adicionalmente durante 33 min a una temperatura constante de 35 °C. Después del drenaje del suero de leche, el queso se prensó durante 90 min y se puso en salmuera durante 72 horas. El pH de los quesos después de un día fue de 5,20. Los quesos se recubrieron múltiples veces a intervalos regulares con Ceska®-Coat durante 18 semanas de maduración a 13 °C.
[0081] Los quesos industriales así producidos se evaluaron para determinar la actividad antimicrobiana homogeneizando 1 g de queso en 9 ml de diluyente al que se le añadieron 104 UFC/ml de L. innocua (DPC6578) de un cultivo durante toda la noche. También se estableció un control que no contenía ningún queso. La suspensión acuosa de queso/Listeria se incubó luego a temperatura ambiente durante 24 horas y los recuentos de Listeria se determinaron a las 5 y/o 24 horas sembrando diluciones en serie sobre agar GM17 con estreptomicina (500 mg/ml). Un coágulo de cada queso también se cubrió con L. innocua para determinar si la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 estaba activa. El análisis se realizó por triplicado en los días 1 y 14 y las semanas 6, 13 y 18.
Detección de nisina y plantaricina 423 en quesos industriales por espectrometría de masas MALDI-TOF
[0082] Las muestras de queso se sometieron a espectrometría de masas para detectar la presencia de bacteriocinas. Brevemente, se añadieron 20 ml de isopropanol al 70 %, TFA al 0,1 % a 1 g de muestra de queso y se mezcló a temperatura ambiente durante 3-4 horas. Las mezclas de queso se centrifugaron y 20 ml de isopropanol al 70 %, TFA al 0,1 % se añadieron al sobrenadante. El isopropanol se eliminó utilizando la evaporación rotatoria y las suspensiones se volvieron a centrifugar para centrifugar el material particulado. El pH del sobrenadante se ajustó a 4-5 añadiendo aproximadamente 30 ml de NaOH 7,5 N y luego se pasó a través de una columna Phenomenex Strata C18-E SPE de 5 g 20 ml, las columnas se lavaron con etanol al 20 % y las bacteriocinas se eluyeron con isopropanol al 70 %, TFA al 0,1 %. El isopropanol se eliminó de las muestras en isopropanol al 70 %, TFA al 0,1 % antes de aplicarse a una columna semi prep C12 Proteo Jupiter RP-HPLC RP-HPLC circulando un gradiente de acetonitrilo al 25-48 %, TFA al 0,1 % durante 35 minutos. El eluyente se monitoreó a través de UV a 214 nm. Las fracciones se recogieron en intervalos de 1 min y las fracciones con nisina y plantaricina se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF tal y como se ha descrito anteriormente para confirmar su presencia.
Secado por atomización
[0083] Lb. plantarum LMG P-26358 se cultivó a 8 l en RSM (leche desnatada reconstituida) al 20 % con un 0,5 % de extracto de levaduras y 0,2 g/l de MnSO4-4H2O. La masa fermentada se concentró hasta el 40 % de sólidos totales en un evaporador de película descendente de efecto único (Anhydro F1-Lab) antes de secarse por atomización. Los concentrados se deshidrataron luego en un secador por atomización Anhydro (modelo Lab 3) a escala piloto con una temperatura de entrada de 187 °C y una temperatura de salida de aire de 85 °C. El polvo se evaluó para determinar las células viables sembrando en PCA y LBS, y los recuentos se compararon a través de ambos conjuntos de placas para determinar las UFC de Lb. plantarum LMG P-26358 por g de polvo secado por atomización. La actividad antilisteria se evaluó añadiendo el polvo al 1 % (p/v), 5 % (p/v), 10 % (p/v) y 15 % (p/v) a 104 UFC/ml de L. innocua (DPC6578) en caldo GM17 (Difco Laboratories). La mezcla de cultivo/polvo se incubó durante 6 horas a 37 °C y las muestras se eliminaron cada 2 horas para contar Listeria seleccionando sobre GM17 con estreptomicina (500 mg/ml). Cada experimento se realizó por triplicado.
Ensayos antifúngicos
[0084] Contaminantes fúngicos en quesos a escala de laboratorio se sembraron en estría sobre PDA (agar de dextrosa y patata) (Difco Laboratories) e YGC (agar de extracto de levadura, glucosa, cloranfenicol) (Difco Laboratories). Las
placas se incubaron durante 5 días a 25 °C. El crecimiento en las placas se examinó para determinar diferentes morfologías. Las esporas y las células de levadura se eliminaron con un asa estéril y se sembraron en estría sobre PDA e YGC, respectivamente, para purificar los contaminantes fúngicos. Las levaduras y los mohos se almacenaron luego en pendientes de YGC y PDA y se almacenaron a 4 °C después del crecimiento. El ensayo de actividad antifúngica se realizó esencialmente como describen Magnusson y Schnurer Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, págs. 1-5. Se cultivaron estrías de Lb. plantarum LMG P-26358 de aproximadamente 2 cm durante 48 horas en agar MRS y se cubrieron luego con 10 ml de PDA (agar al 0,7 %) o YGC (agar al 0,7 %) con 104 esporas fúngicas o células de levadura, respectivamente. Las placas se incubaron luego aeróbicamente a 30 °C durante unas 48 horas adicionales después de las cuales se examinaron para determinar zonas claras de inhibición alrededor de las estrías.
Resultados
Aislamiento e identificación de Lactobacillus plantarum LMG P-26358
[0085] Lb. plantarum se aisló de un queso francés artesanal suave debido a su producción asociada de una gran zona de la colonia cuando se cubre con L. innocua. Después de la purificación se identificó posteriormente como Lb. plantarum por secuenciación del gen del ARNr 16s y se designó y depositó en BCCM como Lb. plantarum LMG P-26358. La secuencia determinada se muestra en el esquema 1. Para determinar si la actividad inhibitoria era de naturaleza proteica, el sobrenadante fue tratado con proteinasa K y evaluado contra L. innocua por WDA. La pérdida de actividad confirmó que la sustancia antimicrobiana producida por Lb. plantarum era de hecho proteínica. El nivel de actividad inhibitoria en el sobrenadante del cultivo contra L. innocua se determinó que era de 2560 UA/ml (zona de 7 8 mm) cuando se midió por WDA. Los perfiles de acidificación de azúcar indicaron que Lb. plantarum LMG P-26358 puede crecer eficazmente tanto en glucosa como en lactosa con tiempos de generación (TG) de 100 min y tasas de crecimiento específico de 0,1814 y 0,1815, respectivamente. La cepa de Lb. plantarum Lm G P-26358 es también capaz de crecer en sacarosa, trehalosa, fructosa, galactosa, maltosa y celobiosa. La maltosa fue el azúcar más eficiente para el crecimiento con un TG de 79 min y una tasa de crecimiento específico de 0,2277, mientras que la cepa fue incapaz de metabolizar la rafinosa. Véase también la tabla 4.
Identificación de la sustancia antimicrobiana producida por Lactobacillus plantarum LMG P-26358 y caracterización de la maquinaria genética
[0086] La sustancia antimicrobiana se purificó por HPLC y la masa molecular se determinó que era de 3929 Da usando la espectrometría de masas MALDI-TOF. El péptido se secuenció luego parcialmente revelando los primeros 10 aminoácidos. Se descubrió que estos 10 aminoácidos son homólogos a la de bacteriocina de clase lia plantaricina 423 que es producida por Lb. plantarum 423 y tiene una masa molecular de 3932,74 (Van Reenen et al., 2003). En función de la secuencia de la plantaricina 423, se generaron cebadores para el gen estructural de la bacteriocina y para el operón completo implicado en la producción de la bacteriocina. Ambos conjuntos de cebadores generaron productos de la PCR del tamaño correcto para el gen estructural (150 pb) y el operón ( 3582 pb). El análisis de secuencia de ADN y la anotación del operón amplificado revelaron que el gen estructural era idéntico al de la plantaricina 423. Mientras que se observaron 17 diferencias de pares de bases a lo largo del resto del operón, tales cambios pudieron considerarse silenciosos en la mayoría de casos. La bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 es así una plantaricina, la secuencia peptídica de la cual coincide con la estructura y la secuencia de aminoácidos de la plantaricina 423. En general, cuatro genes están codificados en el operón de la plantaricina de Lb. plantarum LMG P-26358, lo que es usual para las bacteriocinas de clase lia. El primer gen plaP26358 codifica la prebacteriocina. La presecuencia tiene 58 pb de longitud y se escinde en el lado C-terminal del motivo de glicina doble (GG) para liberar el péptido maduro. PlaB codifica el gen de inmunidad, plaC codifica una proteína accesoria de función desconocida y plaD codifica el transportador ABC (casete de unión a ATP) que se requiere para la secreción de la bacteriocina. Como la plantaricina 423 contiene un puente disulfuro en ambos dominios N-terminal y C-terminal, la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358, con una secuencia peptídica idéntica, contiene supuestamente dos de esos puentes.
Efecto del calor y el pM sobre la actividad de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 y estabilidad de la producción de bacteriocina por Lb. plantarum LMG P-26358 durante un periodo de 10 días
[0087] El tratamiento térmico de la bacteriocina a 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 °C durante 30 minutos no comprometió su actividad antimicrobiana. Asimismo, la actividad de la bacteriocina no se vio afectada por el pH, ya que la bacteriocina continuó produciendo 2560 UA/ml después de la incubación del sobrenadante a valores de pH de 1 a 10 durante 2 horas a 25 °C. La cepa productora, Lb. plantarum LMG P-26358, se subcultivó durante 10 días y el sobrenadante se
evaluó para determinar la actividad cada día. La cepa continuó produciendo actividad potente equivalente contra L. innocua cada día del periodo de 10 días.
Espectro de inhibición
[0088] La actividad de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 se evaluó contra 26 cepas indicadoras (tabla 1) que incluían iniciadores de LAB tales como Lactococcus lactis y especies de Lactobacillus, así como bacterias de alteración de alimentos y patógenas tales como Bacillus subtilis y Salmonella typhi. Además de la actividad inhibitoria esperada contra L. innocua, la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 también inhibió E. faecalis, produciendo una zona de 5 mm, y Enterococcus faecium, produciendo una zona de 2 mm. La falta de inhibición contra los iniciadores evaluados en el estudio indica que Lb. plantarum LMG P-26358 es un complemento adecuado para la producción de queso.
Modo de acción de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
[0089] El efecto de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 sobre la Listeria se investigó para determinar si tiene un modo de acción bactericida o bacteriostático usando tanto células en fase estacionaria como exponencial. El péptido purificado (resuspendido en tampón fosfato) con una actividad inicial de 102.400 UA/ml se añadió a suspensiones celulares (o en fase estacionaria o exponencial) a una concentración final de 2560 UA/ml y el crecimiento se evaluó midiendo la densidad óptica y los números celulares durante un periodo de ocho horas, y también se calculó el porcentaje de muerte. Durante el periodo de ocho horas, se observó una reducción marcada tanto en la densidad óptica como en la viabilidad celular para las células en fase estacionaria y exponencial en comparación con los controles (tabla 2). En las dos primeras horas se observó una reducción de tres log en los números de Listeria para las células en fase exponencial en presencia de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 correspondiente a una reducción del 99,9 %. Después de 4 horas, la reducción aumentó hasta el 100 % (reducción de 5 log), mientras que después de 6 y 8 horas, se observó una reducción de tres log en la viabilidad celular correspondiente al 99,9 % de muerte. La densidad óptica disminuyó drásticamente en el periodo de ocho horas para las células exponenciales en presencia de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358, lo que indica que la actividad de la bacteriocina contra las células exponenciales es bactericida con lisis simultánea. Un patrón similar se observó para las células en fase estacionaria. De hecho, se registró una reducción de tres log para las células en presencia de bacteriocina en las 2 primeras horas, correspondiente al 99,9 % de muerte, y se observó una reducción de 2 log después de la octava hora (99 % de muerte). La reducción drástica en la densidad óptica indica que la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 también tiene un efecto bactericida en células en fase estacionaria de L. innocua.
Concentración mínima inhibitoria y actividad específica de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
[0090] La concentración mínima inhibitoria (CMI), determinada como la concentración mínima que muestra una zona visible de inhibición, contra L. innocua se estimó que era de 40 UA/ml usando bacteriocina purificada producida por Lb. plantarum LMG P-26358 o sobrenadante libre de células. Se generó una curva estándar para determinar la actividad específica de la plantaricina. Los puntos de datos pudieron ajustarse (R2 = 0,9896) a la ecuación y = 10-5(X), donde X es la actividad expresada como UA/ml e y es la actividad expresada como mg/ml. Por lo tanto, la CMI que se determinó que era de 40 uA/ml es equivalente a 0,4 mg/ml (0,10173 pM).
[0091] En un aviso separado, se ha observado que, bajo las mismas condiciones de prueba, la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 tiene la misma CMI contra una pluralidad de especies de Listeria monocytogenes, incluida L. monocytogenes DPC3440 (Scott A).
Capacidad de Lactobacillus plantarum LMG P-26358 para sobrevivir en un entorno de productos lácteos con iniciadores productores de nisina y eficacia de los productores de nisina en presencia de Lactobacillus plantarum LMG P-26358
[0092] Se descubrió que Lb. plantarum LMG P-26358 crece adecuadamente en RSM al 10 % sustituida con extracto de levadura al 0,1 %. Se mostró también que la suplementación del medio de cultivo iniciador con 0,2 g/l de MnS0 4 -4 H20 facilita su crecimiento. La combinación de la cepa con el productor de nisina L. lactis CSK 65 (produce 320 UA/ml de nisina) eliminó el requisito de adición de extracto de levadura a la RSM al 10 % (resultado no mostrado) y la cepa continúa produciendo bacteriocina. Lb. plantarum LMG P-26358 se cultivó luego en RSM al 10 %, extracto de levadura al 0,1 % y 0,2 g/l de MnS0 4 -4 H20 en ausencia y presencia de 320 UA/ml de nisina (purificada de Nisaplin®), y se analizaron los recuentos de células y la producción de bacteriocina después de 4, 8 y 24 horas. La presencia de nisina
inhibió el crecimiento de Lb. plantarum LMG P-26358 hasta cierto punto (tabla 3a). De hecho, después de cuatro horas, la cepa cultivada con nisina era aproximadamente 100 veces menos que el control (1,73 x 106 UFC/ml frente a 1,13 x 108 UFC/ml, respectivamente) y los tamaños de las zonas contra Listeria se registraron a 4 mm (cepa con nisina) frente a 6 mm (control), respectivamente. En la octava hora, solo una diferencia de 10 veces existía entre la prueba (1,66 x 107 UFC/ml) y el control (4,6 x 108 UFC/ml), aunque la cepa de control produjo una zona mayor de 8,5 mm contra Listeria, mientras que la cepa de prueba produjo una zona de solo 4,5 mm. Después de 24 horas, tanto la prueba como el control produjeron una zona de 8,5 mm contra Listeria, aunque el control era 10 veces superior en UFC/ml (3,3 x 109 UFC/ml) que la cepa cultivada en presencia de nisina (5 x 108 UFC/ml).
[0093] El efecto de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 sobre la producción de nisina se evaluó examinando la viabilidad celular y la producción de nisina (usando el organismo indicador L. lactis HP) después del crecimiento de L. lactis CSK65 en presencia y ausencia de 2560 UA/ml de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 (tabla 3b). La actividad antimicrobiana contra L. lactis HP no difirió entre la prueba y el control durante el periodo de 24 horas. Sin embargo, los números celulares fueron ligeramente inferiores para la cepa cultivada en presencia de la bacteriocina producida por Lb.*plantarum LMG P-26358, que fueron 10 veces inferiores al control a las 4 y las 24 horas. En cuanto a la acidificación, la presencia de 2560 UA/ml de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 no alteró las propiedades acidificantes de L.* lactis CSK65 (datos no mostrados). Sin embargo, las propiedades de acidificación de Lb. plantarum LMG P-26358 se redujeron seriamente en presencia de 320 UA/ml de nisina. Para ser más preciso, mientras que, en ausencia de nisina, la cepa Lb. plantarum LMG P-26358 fue capaz de reducir el pH de la leche desnatada reconstituida de 6,4 a 5,8 en 6 horas y por debajo de 5,5 en 7 horas, en presencia de 320 Ul/ml de nisina, la misma cepa fue no capaz de reducir el pH de la leche desnatada reconstituida de 6,4 a 6,2 o por debajo, durante el mismo intervalo temporal.
Producción de queso a escala de laboratorio usando Lactobacillus plantarum LMG P-26358 como un cultivo complementario
[0094] Se fabricó queso a escala de laboratorio adicionado con 103 UFC/ml de L. innocua para probar la capacidad antilisteria de Lb. plantarum LMG P-26358 en presencia y ausencia del productor de nisina L. lactis CSK65. Cuatro tanques se establecieron de la siguiente manera, porcentajes de volumen/volumen:
Tanque 1 = 0,75 % de L. lactis DPC4268 (iniciador de queso); tanque 2 = 0,75 % de L. lactis DPC4268, 0,75 % de L. lactis CSK65 (productor de nisina); tanque 3 = 0,75 % de L lactis DPC4268, 0,75 % de Lb. plantarum LMG P-26358; tanque 4 = 0,75 % de L lactis DPC4268, 0,5 % de Lb. plantarum LMG P-26358, 0,5 % de L. lactis CSK65.
[0095] Cada cultivo se proporcionó como un cultivo recién cultivado durante toda la noche. Cabe señalar que el cultivo fresco de L. lactis CSK65 se puede sustituir con un efecto similar por otro cultivo de lactococos productor de nisina recién cultivado adecuado tal como un cultivo fresco de L. lactis subesp. lactis BS-10 ex. Chr. Hansen A/S, Dinamarca, 0 un cultivo fresco de L. lactis subesp. lactis biovar diacetylactis UL719 como se describe en Bouksaim et al. International Journal of Food Microbiology 2000, 59(3), págs. 141-156.
[0096] Cada queso se maduró a 12 °C durante 4 semanas y Listeria y Lb. plantarum LMG P-26358 se enumeraron cada semana del periodo de maduración. El día 28, un coágulo de cada queso también se cubrió con L. innocua para determinar si la bacteriocina todavía estaba activa. El día 28, los números de L. innocua se redujeron drásticamente en el tanque 3 en comparación con los tanques 1 y 2 y no se detectó Listeria en el tanque 4, lo que sugiere que la combinación de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 y nisina fue más eficaz que la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 sola. Lb. plantarum LMG P-26358 estaba presente con 108 UFC/ml los días 1 y 28 después de la producción de queso. Las capas de coágulos de queso el día 28 indicaron que los quesos que contienen Lb. plantarum LMG P-26358 produjeron una zona de inhibición contra L. innocua.
[0097] En otro experimento, el queso Gouda a escala de laboratorio se fabricó para determinar la actividad anti-listeria de Lb. plantarum LMG P-26358 usando un inóculo al 0,4 % del cultivo en combinación con un productor de nisina. Sin embargo, en este caso, el efecto antimicrobiano fue mucho menor (resultados no mostrados). Los recuentos de Lb. plantarum LMG P-26358 alcanzaron solo 107 UFC/ml el día de la producción de queso y permanecieron a este nivel en todo el periodo de maduración de 28 días, lo que puede ser un reflejo del inóculo más pequeño. Ya hemos observado que con 107 UC/ml, Lb. plantarum LMG P-26358 no es tan activa contra Listeria, produciendo una zona mucho más pequeña de inhibición cuando se mide por WDA (tabla 3a).
Producción de queso Gouda a escala industrial usando Lactobacillus plantarum LMG P-26358 como un cultivo complementario
[0098] Se fabricaron 12 kg de ruedas de queso Gouda en cuatro tanques de queso diferentes según el protocolo industrial indicado anteriormente, bajo el título "Producción de queso Gouda a escala industrial con Lactobacillus plantarum LMG P-26358'.
[0099] Con respecto a los cultivos bacterianos, los tanques de queso se establecieron de la siguiente manera.
Tanque 1: se añadieron 375 g de cultivo D509 por 1500 litros de leche para queso, y se produjo queso Gouda según dicho protocolo conocido. D509 es un concentrado de cultivo mixto en forma de granulos congelados que comprende cantidades de peso iguales de una cepa inmune a nisina de L. lactis subesp. cremoris 13M y una cepa productora de nisina de L. lactis biovar diacetylactis TC17-5, cada una con aproximadamente 1 ■ 1010 UFC/ml. El recuento total de células viables en D509 es aproximadamente 11010 UFC/ml. D509 está comercialmente disponible, por ejemplo, suministrado en cubiertas a dos aguas de 500 ml, de CSK Food Enrichment BV, Leeuwarden, Países Bajos.
Tanque 2: se añadieron 278 g de un cultivo inmune a nisina (C76) y 700 g de ZC-LMG P-26358 por 1500 litros de leche para queso, y se produjo queso Gouda según el mismo protocolo. Aquí, C76-5 es un concentrado de cultivo en forma de gránulos congelados, que comprende L. lactis subesp. cremoris 13M con T1010 UFC/ml. C76-5 se puede obtener de CSK Food Enrichment, Leeuwarden, Países Bajos. ZC-LMG P-26358 es un concentrado de Lb. plantarum LMG P-26358 en forma de gránulos congelados. Este se obtuvo cultivando LMG P-26358 bajo condiciones anaeróbicas en un fermentador de la siguiente manera: 20 ml de medio líquido de caldo MRS se inocularon con LMG P-26358 durante 16 h a 37 °C hasta pH 6,9. El cultivo se centrifugó luego durante 10-15 minutos a 4400 r.p.m. (17 °C). Al concentrado obtenido, se le añadió lactosa como crioprotector (8 %). Este concentrado fue congelado en nitrógeno líquido para obtener ZC-LMG P-26358 como gránulos con un diámetro de entre 0,01 y 0,5 cm. El recuento de células viables de LMG P-26358 en estos gránulos fue 21010 UFC/ml (contando en agar MRS con 0,2 g/l de MnS0 4 -4 H2 0 ).
Tanque 3: se añadieron 375 g de cultivo D509 en combinación con 700 g de ZC-LMG P-26358 por 1500 litros de leche para queso, y se produjo queso Gouda según el mismo protocolo. Aquí, ZC-LMG P-26358 es el concentrado de Lb. plantarum LMG P-26358 en forma de gránulos congelados anteriormente descritos.
Tanque 4 = se añadieron 375 g de cultivo D509 en combinación con 1400 g de ZC-LMG P-26358 por 1500 litros de leche para queso, y se produjo queso Gouda según el mismo protocolo. Aquí, ZC-LMG P-26358 es el concentrado de Lb. plantarum LMG P-26358 en forma de gránulos congelados anteriormente descritos.
[0100] Las ruedas de queso se maduraron, mientras recibían varias capas de Ceska-Coat® a intervalos regulares, a 13 °C y con una humedad relativa de entre el 83 y el 89 % HR según un protocolo convencional durante 18 semanas. Los quesos se evaluaron durante este periodo de 18 semanas para determinar la actividad anti-listeria generando suspensiones acuosas de queso/Listeria en MRD. Los resultados se resumen en la tabla 5. Los quesos producidos con Lb. plantarum LMG P-26358 fueron mucho más eficaces en el control de los números de Listeria que usando el productor de nisina solo. Un ligero efecto antagonista puede haber ocurrido entre el productor de nisina y Lb. plantarum LMG P-26358, ya que las zonas de los coágulos de queso de los tanques 3 y 4 fueron siempre ligeramente más pequeños que las zonas del tanque 2. Ya hemos observado que nisina ralentiza el crecimiento de Lb. plantarum LMG P-26358 (tabla 3). Sin embargo, cada uno de los quesos ofreció un nivel de protección contra Listeria durante el periodo de maduración. De hecho, nisina y la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 se detectaron ambas en los quesos apropiados por espectrometría de masas durante el periodo de maduración de 18 semanas.
[0101] De manera interesante e importante, después de madurar durante 18 semanas, los quesos del tanque 2 habían desarrollado un sabor extraño desagradable de tipo sulfuroso. Este sabor extraño fue mucho más reducido e incluso estaba ausente en el queso producido en los tanques 3 o 4, es decir, en presencia de una cepa productora de nisina.
[0102] Cabe señalar que, en el tanque 2, el cultivo C76 inmune a nisina se puede sustituir, con resultados similares, por cualquier cultivo acidificante de lactococos adecuado, ya que ningún cultivo productor de nisina está presente. Por ejemplo, C76 se puede sustituir por R-604 en forma F-DVS, ex Chr. Hansen A/S, Dinamarca.
1
[0103] La prueba se repitió exitosamente, donde a cada tanque de queso se añadieron adicionalmente 187,5 g de cultivo L700 por 1500 litros de leche para queso. L700 es un cultivo de desamargado que comprende lactobacilos termófilos, especialmente de Lb. helveticus, suministrados por CSK Food Enrichment BV, Países Bajos. Se descubrió que el gusto del queso mejora adicionalmente por la adición de L700.
Frecuencia del desarrollo de resistencia a bacteriocina en Listeria innocua
[0104] La frecuencia del desarrollo de resistencia en L. innocua a 2560 UA/ml de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 (preparación purificada) se calculó a 1,13 x 10'3. Sin embargo, la frecuencia del desarrollo de resistencia frente a 320 uA/ml de nisina fue inferior a 2,16 x 10-2. La exposición simultánea a la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358 y nisina a los niveles anteriores redujeron la frecuencia del desarrollo de resistencia a 1,34 x 10-4. Las colonias resistentes se recogieron y se evaluaron para determinar su sensibilidad a la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358. Sin embargo, todas las cepas resistentes a la bacteriocina permanecieron sensibles a 2560 UA/ml de la bacteriocina producida por Lb. plantarum LMG P-26358, lo que sugiere que las células eran 'tolerantes' más que completamente resistentes.
Actividad antimicrobiana de polvo secado por atomización de Lb. plantarum LMG P-26358
[0105] Un total de 8 l de una masa fermentada durante toda la noche de Lb. plantarum LMG P-26358 se secó por atomización, lo que produjo aproximadamente 1 kg de polvo con 6,0 x 104 UFC viables/g de Lb. plantarum LMG P-26358. El polvo se evaluó contra L. innocua a concentraciones del 1,5, 10 y 15 %. Todas las concentraciones evaluadas mostraron actividad antimicrobiana contra L. innocua. De hecho, al 15 %, el polvo redujo los números de Listeria en aproximadamente 4 logs en 6 horas en comparación con el control.
Actividad antifúngica de Lactobacillus plantarum LMG P-26358
[0106] Observamos que los quesos Cheddar a escala de laboratorio fabricados con Lb. plantarum LMG P-26358 fueron menos susceptibles a la contaminación por levadura y moho. Los contaminantes fúngicos se aislaron de quesos contaminados y consistieron en levadura, moho verde y moho blanco. Estrías de 2 cm de Lb. plantarum LMG P-26358 se cubrieron con cada uno de los tres contaminantes fúngicos. Se descubrió que el moho blanco es particularmente susceptible a Lb. plantarum LMG P-26358.
Tabla 1 Espectros de inhibición de Lactobacillus plantarum LMG P-26358
Tabla 2 Modo de acción de plantaricina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
Tabla 3(a) Rendimiento de Lactobacillus plantarum LMG P-26358 en presencia y ausencia de nisina en RSM al 10 %, extracto de levadura al 0,1 % y 0,2 g/l de MnS0 4 -4 H2 0
Tabla 3(b) Rendimiento de Lactococcus lactis CSK65 en presencia y ausencia de la plantaricina producida por Lb. plantarum LMG P-26358
Tabla 4. Perfil de crecimiento de Lactobacillus plantarum LMG P-26358 en caldo MRS sustituido con varios azúcares. Tiempo de generación (TG) y tasa de crecimiento específico (pmax) se calculan para Lb. plantarum LMG P-26358 en presencia de cada azúcar. La pmax se determina como la pendiente máxima en la curva DO600 en función del tiempo que representa el crecimiento de la Lb. plantarum LMG P-26358 en el caldo MRS.
Tabla 5. Recuentos de Listeria innocua tras 5 o 24 horas de exposición a 1 g de quesos industriales- Tanque 1 = cultivo mixto D509- tanque 2 = L. lactis C76 inmune a nisina en combinación con un cultivo concentrado de Lb. plantarum LMG P-26358- tanque 3 = cultivo mixto D509 en combinación con un cultivo concentrado de Lb. plantarum LMG P-26358- tanque 4 = como el tanque 3 con la cantidad doble del cultivo concentrado de Lb.
Claims (9)
1. Método para la producción de un producto lácteo fermentado, preferiblemente queso, donde dicho método comprende inocular directamente la leche con
a. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase lia, donde al menos una es una cepa de Lb. plantarum y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y b. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase l, donde al menos una se selecciona del grupo que consiste en Lactococcus spp. y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y
c. opcionalmente, una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales;
donde las bacterias del ácido láctico viables que producen una bacteriocina de tipo clase lia están presentes en una cantidad de al menos 1-107 UFC por g de producto lácteo fermentado.
2. Método según la reivindicación 1, donde la cepa de Lb. plantarum es una cepa con un gen del ARNr 16S, con una secuencia que tiene más del 95 %, preferiblemente más del 97 %, más preferiblemente más del 99 % de similitud o de la manera más preferible que tiene el 100 % de similitud con la SEQ ID NO 1.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la Lb. plantarum es Lb. plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 o un mutante de la misma que produce la misma bacteriocina de tipo clase lia y tiene preferiblemente el 100 % de similitud del gen del ARNr 16S con la SEQ ID NO 1.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase l es una cepa bacteriana del ácido láctico que produce una nisina.
5. Método según la reivindicación 4, donde además al menos una de las cepas de bacterias del ácido láctico que produce una bacteriocina de tipo clase lia no es capaz de crecer en presencia de la nisina a una concentración de al menos 300 Ul/ml, más preferiblemente a una concentración de la nisina de al menos 500 Ul/ml.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase lla y la una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase l se proporcionan como una composición de cultivo bacteriano del ácido láctico mixto que comprende
a. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase lla, donde al menos una es una cepa de Lb.*plantarum y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y b. una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase l, donde al menos una se selecciona del grupo que consiste en Lactococcus spp. y donde todas las cepas se proporcionan en forma congelada o liofilizada; y
c. opcionalmente, una o más cepas bacterianas del ácido láctico adicionales,
y donde la una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase lla están presentes en la composición con un recuento total de células viables de al menos 1108, más preferiblemente en una cantidad de al menos 1109 UFC por gramo de la composición, y donde la una o más cepas de bacterias del ácido láctico que producen una bacteriocina de tipo clase l están presentes en la composición con un recuento total de células viables de al menos 1108, más preferiblemente en una cantidad de al menos 1109 UFC por gramo de la composición.
7. Método según la reivindicación 6, donde la Lb.*plantarum es Lb.*plantarum depositada bajo el número LMG P-26358 o un mutante de la misma que produce una bacteriocina de tipo clase lla y tiene preferiblemente el 100 % de similitud del gen del ARNr 16S con la SEQ lD NO 1, con un recuento de células viables de al menos 1108, más preferiblemente de al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo, y que comprende una cepa de Lactococcus spp., preferiblemente una cepa de L. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, dicha cepa de lactococos que produce una nisina, con un recuento de células viables de al menos 1108, más preferiblemente de al menos 1109 UFC por gramo de la composición de cultivo.
8. Cepa de Lb. plantarum depositada bajo el número LMG P-26358.
9. Composición de cultivo bacteriano que comprende bacterias viables de Lb. plantarum depositada bajo el número LMG P-26358, preferiblemente con un recuento de células viables de 1-109 UFC/ml o superior.
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