ES2623768T3 - Bioprotección utilizando cepas de Lactobacillus paracasei - Google Patents
Bioprotección utilizando cepas de Lactobacillus paracasei Download PDFInfo
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Abstract
Cepa de Lactobacillus paracasei seleccionada del grupo consistente en la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 que fue depositada en la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ) con el número de depósito DSM25612 y cepas mutantes derivadas de la misma, donde las cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifúngicas o mejoradas que la cepa con el número de depósito nº DSM25612.
Description
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DESCRIPCION
Bioproteccion utilizando cepas de Lactobacillus paracasei CAMPO DE LA INVENCION
[0001] La presente invencion se refiere al campo de la bioproteccion, en particular a la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 con n° de deposito DSM25612. Ademas, la presente invencion se refiere a una composition antifungica que comprende la cepa, una composition antifungica que comprende la cepa y al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus, alimento, pienso y productos farmaceuticos que comprenden dicha composicion antifungica, un metodo de fabrication de dicho alimento, pienso y productos farmaceuticos, un metodo para la reduction del contenido de levaduras y hongos de dicho alimento, pienso y productos farmaceuticos y uso de la composicion antifungica.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
[0002] Durante muchos anos, las bacterias de acido lactico se han usado para aumentar el tiempo de conservation de productos alimenticios. Durante la fermentation, las bacterias de acido lactico producen acidos lacticos y otros acidos organicos, lo que reduce el pH del producto alimenticio y lo vuelve desfavorable para el crecimiento de microorganismos no deseados, tales como bacterias patogenicas, levaduras y mohos.
[0003] Adicionalmente, algunas bacterias de acido lactico tambien producen metabolitos con actividad antimicrobiana.
[0004] La solicitud de patente de EE. UU. n° US2011/0045134 se refiere al uso de Lactobacillus paracasei para conferir propiedades antifungicas a un producto lacteo fermentado.
[0005] La solicitud de patente europea n° EP1442113 se refiere a mezclas de Propionibacterium jensenii y Lactobacillus sp., tales como Lactobacillus paracasei, con actividades antimicrobianas para uso para bioproteccion.
[0006] Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de agentes bioprotectores con un efecto antifungico mejorado como cepas unicas o en combination con otras cepas bioprotectoras.
RESUMEN DE LA INVENCION
[0007] El objeto de la presente invencion es proporcionar nuevas cepas de bacterias de acido lactico con una eficacia alta como agentes bioprotectores.
[0008] Los presentes inventores han descubierto, mediante cribado e investigation exhaustivos, que determinadas cepas de Lactobacillus paracasei tienen un efecto significativamente mas alto contra las levaduras y mohos en comparacion con cultivos bioprotectores comerciales del mercado asi como con el sorbato de potasio, un conservante quimico usado habitualmente.
[0009] Los presentes inventores han descubierto ademas que un grupo determinado de bacterias de acido lactico, cuando se combina con otro grupo de bacterias de acido lactico, muestra un efecto antimicrobiano sinergistico significativo. El efecto antimicrobiano de los dos grupos de bacterias combinado, sorprendentemente, es mayor que la suma de los efectos individuales de los dos grupos de bacterias.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0010]
La FIGURA 1 representa el crecimiento de mohos en yogur con 1,5% de grasa fermentada con un cultivo iniciador YF-L901 solo (fila superior), junto con HOLDBAc™ YM-B (fila intermedia) y junto con Lactobacillus paracasei CHCC14676. Los contaminantes objetivo se anadieron a las concentraciones mencionadas en el texto de izquierda a derecha: Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) y Penicillium glabrum (M8), respectivamente. Los yogures se habian incubado a 7±1°C durante 61 dias.
La FIGURA 2 representa el recuento de celulas de un aislado de Debaryomyces hansenii anadido a yogur con 1,5% de grasa fermentado con un cultivo iniciador YF-L901 solo (Referencia) o junto con cultivo HOLDBAC™ YM-B (HoldBac YM-B), HOLDBAC™ YM-C (HoldBac YM-C) o la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (14676). Los yogures se almacenaron a 7±1°C y se analizaron a intervalos adecuados.
La FIGURA 3 muestra el crecimiento de mohos en placas obtenidos a partir de leche fermentada con un
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cultivo iniciador solo (referenda, primera imagen), junto con Lb. Paracasei CHCC14676 (segunda imagen), junto con Lb. Rhamnosus CHCC5366 (tercera imagen) o junto con una combinacion de Lb. Paracasei CHCC14676 y Lb. Rhamnosus CHCC5366 (cuarta imagen). Los contaminantes objetivo se anadieron a las concentraciones mencionadas en el texto desde arriba a la izquierda desplazandose en el sentido de las agujas del reloj hasta abajo a la izquierda de la placa: Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor y Penicillium crustosum, respectivamente. Las placas se habian incubado a 7±1°C durante 12 dias.
La FIGURA 4 muestra el crecimiento de mohos en placas preparadas a partir de leche fermentada con un cultivo iniciador solo (referencia, primera imagen), junto con Lb. Paracasei CHCC14676 (segunda imagen), junto con Lb. Rhamnosus CHCC14226 (tercera imagen) o junto con una combinacion de Lb. Paracasei CHCC14676 y Lb. Rhamnosus CHCC14226 (cuarta imagen). Los contaminantes objetivo se anadieron en las concentraciones mencionadas en el texto en el sentido de las agujas del rejoj desde la parte superior izquierda hasta la parte inferior izquierda de la placa: Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor y Penicillium crustosum, respectivamente. Las placas se habian incubado a 7±1°C durante 12 dias.
La FIGURA 5 muestra el crecimiento de Mucor ssp. en yogur griego obtenido a partir de leche fermentada con un cultivo iniciador solo (vaso de la izquierda) o de leche fermentada en presencia de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 (vaso de la derecha).
La FIGURA 6 muestra el crecimiento del moho Rhizopus stolonifer en yogur griego preparado a partir de leche fermentada con un cultivo iniciador solo (R. es decir, Referencia), con el cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (iM-B), con el cultivo iniciador y Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366), o con el cultivo iniciador y una combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676).
La FIGURA 7 muestra el crecimiento de Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) y Penicillium glabrum (M8) en crema agria hecha de leche fermentada solo con cultivo iniciador (fila superior); con cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (fila intermedia); o con cultivo iniciador y una combinacion de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (fila inferior).
La FIGURA 8 muestra el crecimiento de D. Hansenii en crema agria hecha de leche fermentada solo con cultivo iniciador (referencia); con cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (iM-B); o con cultivo iniciador, Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (12697+14676).
La FIGURA 9 muestra el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae en queso blanco en salmuera hecho a partir de leche fermentada solo con cultivo iniciador (referencia); con cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (iM-B); o con cultivo iniciador, Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
La FIGURA 10 muestra el crecimiento de Kluyveromyces marxianus en queso blanco en salmuera hecho a partir de leche fermentada solo con cultivo iniciador (referencia); con cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (iM-B); o con cultivo iniciador, Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
La FIGURA 11 muestra el crecimiento de Penicillium commune en queso blanco en salmuera hecho a partir de leche fermentada solo con cultivo iniciador (R, es decir, referencia); con cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (iM-B); o con cultivo iniciador, Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
La FIGURA 12 representa el crecimiento del moho Penicillium paneum en yogur con 1,5% de grasa obtenido a partir de leche fermentada solo con un cultivo iniciador (R, es decir referencia), con el cultivo iniciador y hOlDBAC™ YM-B (iM-B), con el cultivo iniciador y Lactobacillus rhamnosus cHcC5366 (5366), o con el cultivo iniciador y una combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676).
La FIGURA 13 muestra el crecimiento del moho Penicillium crustosum en yogur con 1,5% de grasa obtenido a partir de leche fermentada solo con un cultivo iniciador (fila superior), con cultivo iniciador y HOLDBAC™ YM-B (segunda fila), con cultivo iniciador y Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (tercera fila) o con cultivo iniciador y una combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 (fila inferior).
El contaminante objetivo se anadio en concentraciones de 100 esporas/vaso y los yogures se habian incubado a 7±1°C (columna izquierda), 12±1°C (columna central) o 22±1°C (columna derecha) durante 36 dias.
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DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones
[0011] Como se utiliza en este caso, el termino "bacteria de acido lactico" designa una bacteria grampositiva microaerofilica o anaerobica, que fermenta azucares con la produccion de acidos incluyendo acido lactico como el acido producido predominantemente. Las bacterias de acido lactico mas utiles industrialmente se encuentran en el orden "Lactobacillales", que incluye Lactococcus, spp. Streptococcus, spp. Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp. y Enterococcus spp. Estas se usan frecuentemente como cultivos de alimentos solas o en combinacion con otras bacterias de acido lactico.
[0012] Se entiende que el termino "alimento" tambien incluye el queso. Se entiende que el termino "queso" abarca cualquier queso, incluyendo quesos duros semiduros y blandos, tales como quesos de los siguientes tipos: cottage, feta, cheddar, parmesano, mozzarella, emmental, danbo, gouda, edam, de tipo feta, quesos azules, quesos salados, camembert y brie. El experto en la tecnica sabe como convertir la cuajada en queso, y se pueden encontrar metodos en la bibliografia, vease por ejemplo Kosikowski, F. V., y V. V. Mistry, "Cheese and Fermented Milk Foods", 1997,3rd Ed. F. V. Kosikowski, L. L. C. Westport, CT. Como se utiliza en este caso, un queso que tiene una concentracion de NaCl por debajo de 1,7% (p/p) se denomina un "queso bajo en sal".
[0013] Las bacterias de acido lactico, incluyendo bacterias de las especies Lactobacillus sp. y Lactococcus sp., normalmente se suministran a la industria lactea o bien como cultivos congelados o liofilizados para la propagacion de iniciadores en masa o como los denominados cultivos "Direct Vat Set" o de "inoculacion directa a cuba" (SVD), destinados a la inoculacion directa en una cuba o tina de fermentacion para la produccion de un producto lacteo, tal como un producto lacteo fermentado o un queso. Tales cultivos bacterianos de acido lactico se denominan en general "cultivos iniciadores" o "iniciadores".
[0014] El termino "mesofilo" en este contexto se refiere a microorganismos que crecen mejor a temperaturas moderadas (15°C-40°C). Las bacterias mesofilicas mas utiles industrialmente incluyen Lactococcus spp. y Leuconostoc spp. El termino "fermentacion mesofilica" en este contexto se refiere a la fermentacion a una temperatura entre aproximadamente 22°C y aproximadamente 35°C. El termino "producto lacteo fermentado mesofilico" se refiere a productos lacteos fermentados preparados mediante fermentacion mesofilica de un cultivo iniciador mesofilico e incluyen productos lacteos fermentados como suero de leche, leche agria, leche cultivada, smetana, crema agria y queso fresco, tal como quark, tvarog y queso crema.
[0015] El termino "termofilo" en este contexto se refiere a microorganismos que crecen mejor a temperaturas por encima de 43°C. Las bacterias termofilicas mas utiles industrialmente incluyen Streptococcus spp. y Lactobacillus spp. El termino "fermentacion termofilica" en este contexto se refiere a la fermentacion a una temperatura aproximadamente por encima de 35°C, tal como entre aproximadamente 35°C y aproximadamente 45°C. El termino "producto lacteo fermentado termofilico" se refiere a productos lacteos fermentados preparados mediante fermentacion termofilica de un cultivo iniciador termofilico e incluyen productos lacteos fermentados como el yogur firme, el yogur batido y el yogur liquido.
[0016] El termino "leche" debe entenderse como la secrecion lactea obtenida mediante el ordeno de cualquier mamifero, por ejemplo vacas, ovejas, cabras, bufalos o camellos. En una forma de realizacion preferida, la leche es leche de vaca. El termino leche tambien incluye soluciones de proteina/grasa hechas de materiales vegetales, por ejemplo leche de soja.
[0017] El termino "sustrato de leche" puede ser cualquier material de leche crudo y/o procesado que se pueda someter a fermentacion segun el metodo de la invencion. De este modo, los sustratos de leche utiles incluyen, pero de forma no limitativa, soluciones/suspensiones de cualquier producto lacteo o derivado lacteo que comprenden proteina, tal como leche de grasa entera o baja en grasa, leche desnatada, suero de leche, leche en polvo reconstituida, leche condensada, leche deshidratada, suero de leche, permeato de suero de leche, lactosa, liquido madre de cristalizacion de lactosa, concentrado de proteina de suero de leche, o nata.
Obviamente, el sustrato de leche puede proceder de cualquier mamifero, por ejemplo leche de mamifero sustancialmente pura, o leche en polvo reconstituida.
[0018] Antes de la fermentacion, el sustrato de leche se puede homogeneizar y pasteurizar segun metodos conocidos en la tecnica.
[0019] "Homogenizacion" como se utiliza en este caso significa una mezcla intensiva para obtener una emulsion o suspension soluble. Si la homogeneizacion se realiza antes de la fermentacion, se puede realizar para dividir la grasa lactea en tamanos menores de modo que esta ya no se separe de la leche. Esto se puede realizar haciendo pasar la leche a traves de pequenos orificios a alta presion.
[0020] "Pasteurizacion" segun se utiliza en este contexto significa el tratamiento del sustrato de leche para
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reducir o eliminar la presencia de organismos vivos, tales como microorganismos. Preferiblemente, la pasteurizacion se logra manteniendo una temperatura especifica durante un periodo de tiempo especifico. La temperatura especifica se logra normalmente por calentamiento. La temperatura y la duracion se pueden seleccionar de modo que se maten o inactiven ciertas bacterias, tales como bacterias nocivas. Un paso de enfriamiento rapido puede ir a continuacion.
[0021] "Fermentacion", en los metodos de la presente invention, significa la conversion de carbohidratos en alcoholes o acidos a traves de la action de un microorganismo. Preferiblemente, la fermentacion en los metodos de la invencion comprende la conversion de lactosa en acido lactico.
[0022] Los procesos de fermentacion para ser usados en la production de productos lacteos son ampliamente conocidos y el experto en la tecnica sabra como seleccionar condiciones del proceso adecuadas, tales como temperatura, oxigeno, cantidad y caracteristicas del/de los microorganismo(s) y tiempo de proceso.
Obviamente, las condiciones de fermentacion se seleccionan para favorecer el logro de la presente invencion, es decir, para obtener un producto lacteo en forma solida (tal como un queso) o forma liquida (tal como un producto lacteo fermentado).
[0023] Las composiciones de la invencion proporcionan la ventaja de que se pueden inhibir los microorganismos no deseados seleccionados de entre hongos, bacterias y mezclas de los mismos, por ejemplo en alimentos, piensos y productos farmaceuticos y en seres humanos y animales. La prevention y/o inhibition del crecimiento de hongos, tales como levaduras y mohos, esta particularmente prevista. Por lo tanto, en una forma de realization preferida, el termino "antimicrobiano" debe entenderse como "antifungico".
[0024] El termino "microorganismos no deseados" en este contexto se refiere a microorganismos tales como bacterias y hongos, tales como levaduras, que son patogenicos y/o capaces de deteriorar alimentos, piensos o productos farmaceuticos. Las composiciones de la invencion proporcionan la ventaja de que se pueden inhibir los microorganismos no deseados seleccionados de hongos, bacterias y mezclas de los mismos, por ejemplo en alimentos, piensos y productos farmaceuticos y en seres humanos y animales. La prevencion y/o inhibicion del crecimiento de hongos, tales como levaduras y mohos, esta particularmente prevista.
[0025] Los terminos "inhibir" y "ser inhibidor" en relation con levaduras y mohos significa, por ejemplo, que el crecimiento o el numero o la concentration de levaduras y mohos, por ejemplo en productos alimenticios y/o en la superficie de productos alimenticios que comprenden las cepas segun la presente invencion, es menor que en productos alimenticios y/o en la superficie de productos alimenticios que no comprenden tales cepas.
[0026] En el presente contexto, el termino "mutante" deberia entenderse como una cepa derivada a partir de una cepa de la invencion mediante, por ejemplo, ingenieria genetica, radiation y/o tratamiento quimico.
Se prefiere que la mutante sea una mutante equivalente funcionalmente, por ejemplo una mutante que tiene sustancialmente las mismas propiedades, o mejoradas (por ejemplo en cuanto a las propiedades antifungicas), que la cepa progenitora. Tal mutante forma parte de la presente invencion. Especialmente, el termino "mutante" se refiere a una cepa obtenida sometiendo a una cepa de la invencion a cualquier tratamiento de mutagenizacion usado de forma convencional que incluye un tratamiento con un mutageno quimico tal como etano-metano- sulfonato (EMS) o N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV o a una mutante presente de forma espontanea. Una mutante se puede haber sometido a mas tratamientos de mutagenizacion (un tratamiento unico deberia entenderse como un paso de mutagenizacion seguido de una etapa de cribado/seleccion), pero actualmente se prefiere que no se lleven a cabo mas de 20, o no mas de 10, o no mas de 5 tratamientos (o pasos de cribado/seleccion). En una mutante preferida actualmente, menos del 5%, o menos del 1% o incluso menos del 0,1% de los nucleotidos en el genoma bacteriano han sido desplazados con otro nucleotido, o eliminados, en comparacion con la cepa progenitora.
[0027] El uso de los terminos "un" y "el" y referentes similares en el contexto de la description de la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se deben interpretar cubriendo el singular y el plural, a menos que se indique lo contrario en este texto o el contexto lo contradiga claramente.
Los terminos "que comprende(n)", "que tiene(n)", "que incluye(n)" y "que contiene(n)" se deben interpretar como terminos abiertos (es decir, con el significado de "que incluye(n), pero no se limita(n) a,") a menos que se indique lo contrario. Las enumeraciones de rangos de valores en este texto estas destinadas meramente a servir como un metodo abreviado de hacer referencia individualmente a cada valor separado que este dentro del rango, a menos que se indique lo contrario en el texto, y cada valor separado se incorpora a la especificacion como si estuviera enumerado individualmente en ella. Todos los metodos aqui descritos se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario aqui o a menos que lo contradiga claramente el contexto del presente documento. El uso de cualquier ejemplo y de todos los ejemplos o de expresiones ejemplificadoras (como "tal como") proporcionadas aqui tiene la mera intention de aclarar mejor la invencion y no plantea una limitation en el ambito de la invencion a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresion de la especificacion deberia interpretarse como indicativa de que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la practica de la invencion.
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Implementacion y aspectos de la invencion
[0028] Los presentes inventores han realizado un cribado entre 200 candidatos de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei y Lactobacillus rhamnosus para encontrar la cepa o combination de 2 cepas mas eficaz contra una gama amplia de microorganismos, tales como levaduras y mohos.
[0029] Las pruebas de cribado se realizaron en un ensayo modelo que imitabla productos lacteos fermentados mesofilicos en la medida de lo posible en medios a base de leche a los que se anadio un cultivo iniciador pertinente con o sin candidatos bioprotectores y que se fermento bajo condiciones pertinentes para productos lacteos fermentados mesofilicos. Los organismos objetivo se aislaron de los productos lacteos fermentados mesofilicos. Las bacterias de acido lactico purificadas procedentes de los cultivos HOLDBAC™ de Danisco A/S, Dinamarca, al igual que los cultivos completos HOLDBAC™ YM-B y HOLDBAC™ YM-C cultivos, que contienen tanto bacterias de acido lactico como bacterias de acido propionico, se usaron como punto de referencia.
[0030] El ensayo modelo se describe en la solicitud de patente europea n° EP11161609.0.
[0031] Se descubrio que diecisiete candidatos entre Lactobacillus paracasei y Lactobacillus rhamnosus inhibian generalmente los 12 hongos indicadores tan bien o mejor que las bacterias de acido lactico de referencia cuando se evaluaron a 25°C.
[0032] Cuando se evaluo en yogur, una cepa de Lactobacillus paracasei, la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 depositada en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ) con el numero de deposito DSM25612, demostro ser significativamente mejor en la inhibition de levaduras y mohos que cultivos bioprotectores disponibles comercialmente.
[0033] El efecto inhibidor de la cepa contra las levaduras y mohos podria determinase mediante el almacenamiento de los productos lacteos fermentados a una temperatura adecuada durante un tiempo de almacenamiento adecuado como se describe en los ejemplos que aparecen a continuation.
[0034] En general, la temperatura adecuada a la que este metodo deberia realizarse depende de la temperatura en la que el alimento, pienso o producto farmaceutico especifico, se almacena y/o se fabrica normalmente.
La temperatura a la que los productos se almacenan normalmente esta entre 5°C y 26°C, preferiblemente la temperatura es aproximadamente 8°C.
[0035] El tiempo de almacenamiento a dicha temperatura depende del tiempo durante el que el alimento, pienso, o producto farmaceutico se almacena normalmente (vida util de almacenamiento). El tiempo de almacenamiento es normalmente 5-65, preferiblemente 7-60 dias, mas preferiblemente 7-28 dias, e incluso mas preferiblemente el tiempo de almacenamiento es aproximadamente 21 dias y mas preferiblemente hasta 60 dias o mas...
[0036] Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a una cepa de Lactobacillus paracasei seleccionada del grupo consistente en la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 que fue depositada en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ) con el numero de deposito DSM 25612 y cepas mutantes derivadas de la misma, donde las cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que la cepa con el numero de deposito n° DSM25612.
[0037] Asi, ademas de la cepa depositada mencionada anteriormente, la invencion tambien se refiere a mutantes que se han derivado de esta cepa, es decir, que se han obtenido usando la cepa depositada CHCC14676 como material de partida. La cepa mutante se puede derivar de la cepa depositada, por ejemplo, mediante ingenieria genetica, radiation, luz UV, tratamiento quimico y/o metodos que inducen cambios en el genoma.
Una mutante segun la invencion inhibira y/o prevendra el crecimiento de ciertas bacterias u hongos, preferiblemente mohos. Se prefiere que la mutante tenga esencialmente al menos el 80% o mas, al menos el 90% o mas, al menos el 95% o mas, o incluso hasta el 100% o mas del efecto antifungico en comparacion con su cepa progenitora cuando se determina, por ejemplo, en un ensayo como se describe en el ejemplo 1 que usa uno de los mohos P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor, D. hansenii o P. glabum como organismo de referencia cuyo crecimiento debe ser inhibido. Dichas cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que la cepa con el numero de deposito DSM25612.
[0038] Es evidente para la persona experta que, al usar la cepa depositada como material de partida, el lector experto puede obtener de forma rutinaria por mutagenesis convencional o tecnicas de reaislamiento otras mutantes o derivadas de la misma que conservan las caracteristicas y ventajas pertinentes descritas aqui.
Por consiguiente, el termino "cepas mutanes deriveadas de la misma" del primer aspecto se refiere a cepas mutantes obtenidas usando la cepa depositada como material de partida. Dichas cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antigfungicas o mejoradas que la cepa depositada con el numero de deposito DSM25612.
[0039] Un segundo aspecto se refiere a una composition antifungica que comprende al menos una cepa de
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Lactobacillus paracasei segun el primer aspecto de la invention, preferiblemente la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676.
[0040] Cuando se realizaron experimentos con la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combination con cepas de Lactobacillus rhamnosus diferentes, se descubrio de forma inesperada que estas combinaciones eran aun mejores que cualquiera de las cepas solas, incluso cuando las concentraciones totales de celulas eran identicas. En una forma de realization, la invencion se refiere a una combinacion de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366. En otra forma de realizacion, la invencion se refiere a una combinacion de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC12697. Estas combinaciones parecieron ser mas eficaces que los cultivos de referencia HOLDBAC™ YM-B y HOLDBAC™ YM-C de Danisco, Dinamarca.
[0041] Por consiguiente, en una forma de realizacion preferida, la presente invencion se refiere a composiciones antimicrobianas y mas preferiblemente antifungicas que comprenden la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 que se deposito en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ) con el numero de deposito DSM25612 o una derivada mutante de la misma que tiene sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que la cepa depositada con el numero de deposito DSM25612 y al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus.
Preferiblemente, la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus se selecciona del grupo consistente en la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 con numero de deposito DSM24616, la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 con numero de deposito DSM23035 y cepas mutantes derivadas de estas cepas depositadas, donde las cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que una de las cepas depositadas con el numero de deposito DSM24616, DSM24652 o DSM23035.
[0042] En un aspecto, la invencion proporciona por lo tanto una composition antimicrobiana y mas preferiblemente antifungica que comprende la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 o una derivada mutante de la misma y la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC141226 o una derivada mutante de la misma. En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion antimicrobiana y mas preferiblemente antifungica que comprende al menos la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14226 o una derivada mutante de la misma y la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 o una derivada mutante de la misma. En otra forma de realizacion, la invencion proporciona una composicion antimicrobiana y mas preferiblemente atifungica que comprende al menos la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC12697 o una mutante de la misma.
Preferiblemente, la combinacion de la cepa de Lactobacillus paracasei y la cepa de Lactobacillus rhamnosus en las composiciones de la invencion actua sinergisticamente en cuanto a su actividad antimicrobiana y/o antifungica. Dichas cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que una de las cepas con el numero de deposito DSM25612, DSM24616, DSM24652 o DSM23035.
[0043] La composicion antifungica comprende tipicamente las bacterias en una forma concentrada, incluyendo concentrados congelados, deshidratados o liofilizados que tienen tipicamente una concentration de celulas viables que esta en el rango de 104 a 1012 ufc (unidades formadoras de colonias) por gramo de la composicion incluyendo al menos 104 ufc por gramo de la composicion, tal como al menos 105 ufc/g, por ejemplo al menos 106 ufc/g, tal como al menos 107 ufc/g, por ejemplo al menos 108 ufc/g, tal como al menos 109 ufc/g, por ejemplo al menos 1010 ufc/g, tal como al menos 1011 ufc/g.
Asi, la composicion de la invencion preferiblemente esta presente en una forma congelada, deshidratada o liofilizada, por ejemplo como un cultivo de inoculation directa a cuba (DVS). Sin embargo, como se utiliza en este caso, la composicion tambien puede ser un liquido que se obtiene despues de la suspension de los concentrados congelados, deshidratados o liofilizados en un medio liquido tal como agua o tampon PBS.
Cuando la composicion de la invencion es una suspension, la concentracion de celulas viables esta en el rango de 104 a 1012 ufc (unidades formadoras de colonias) por ml de la composicion incluyendo al menos 104 ufc por ml de la composicion, tal como al menos 105 ufc/ml, por ejemplo al menos 106 ufc/ml, tal como al menos 107 ufc/ml, por ejemplo al menos 108 ufc/ml, tal como al menos 109 ufc/ml, por ejemplo al menos 1010 ufc/ml, tal como al menos 1011 ufc/ml.
[0044] La composicion puede contener como otros componentes aditivos crioprotectores y/o convencionales que incluyen nutrientes tales como extractos de levadura, azucares y vitaminas, por ejemplo vitamina A, C, D, K o vitaminas de la familia de la vitamina B. Los crioprotectores adecuados que se pueden anadir a las composiciones de la invencion son componentes que mejoran la tolerancia al frio de los microorganismos, tales como manitol, sorbitol, tripolifosfato de sodio, xilitol, glicerol, rafinosa, maltodextrina, eritritol, treitol, trehalosa, glucosa y fructosa. Otros aditivos pueden incluir, por ejemplo, carbohidratos, sabores, minerales, enzimas (por ejemplo cuajo, lactasa y/o fosfolipasa).
[0045] En composiciones de la invencion que comprenden una cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y una cepa de Lactobacillus rhamnosus, la proportion entre la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y la cepa de Lactobacillus rhamnosus, por ejemplo la proporcion de la concentracion o numero de bacterias Lactobacillus paracasei y la concentracion o numero de bacterias Lactobacillus rhamnosus, preferiblemente es de 1:100 a 100:1, preferiblemente 1:10 a 10:1.
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[0046] La composition antifungica de la presente invention se puede utilizar en relation con cualquier alimento, pienso y producto farmaceutico que sea susceptible a la degradation microbiana y/o contamination con levaduras y mohos. Estos incluyen, pero de forma no limitativa, frutas y verduras, incluyendo productos derivados, cereales y productos derivados de los cereales, productos lacteos, carne, carne de ave y pescado y marisco. En formas de realization particularmente preferidas, la composition se usa en relation con productos lacteos y/o carne y carne de ave. En una forma de realization preferida, las composiciones de la invention son para un uso como aditivo en la preparation de productos lacteos, tales como yogur, tvarog, crema agria, queso crema, queso blanco en salmuera y similares.
[0047] En una forma de realization preferida, las composiciones de la invention se usan contra hongos, tales como levaduras y mohos. Esto significa que las composiciones se usan para inhibir y/o evitar el crecimiento de hongos que causan contamination en los procesos de la industria lactea, en particular en procesos de fermentation de la leche. Las composiciones de la presente invention pueden utilizarse, por ejemplo, para inhibir y/o evitar el crecimiento de levaduras, tales como levaduras de los generos Klyveromyces (por ejemplo, K. marxianus, K. lactis), Pichia (por ejemplo, P. fermentans), Yarrowia (por ejemplo, Y. lipolytica), Candida (por ejemplo, C. sake), y similates; o mohos, tales como mohos del genero Penicillium (por ejemplo, P. nalgiovense, P. commune, P. crustosum, P. brevicompactum, P. glabrum), Mucor spp., Cladiosporium ssp., Aspergillus (por ejemplo, A. versicolor), Debaryomyces (por ejemplo, D. hansenii), y similares.
Se prefiere especialmente el uso de las composiciones de la invention para inhibir y/o evitar el crecimiento de las especies Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, Cladiosporium ssp., Penicillium commune, Mucor ssp., Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crustosum, Kluyveromyces lactis, y/o Debaryomyces hansenii.
[0048] La composition antifungica segun el segundo aspecto de la presente invention tambien se puede usar como un producto farmaceutico, preferiblemente uno para tratar infecciones con hongos patogenicos, tales como levaduras patogenicas.
[0049] En un tercer aspecto, la presente invention se refiere a un alimento, pienso o producto farmaceutico que comprende una cepa de Lactobacillus paracasei segun el primer aspecto de la invention o una composition antifungica segun el segundo aspecto de la invention.
[0050] En una forma de realization preferida, el alimento, pienso o producto farmaceutico es un producto alimentario.
[0051] En una forma de realization mas preferida, tal producto alimenticio se selecciona del grupo consistente en frutas y productos derivados de la fruta, vegetales y productos derivados vegetales, cereales y productos derivados de los cereales, productos lacteos, carne, carne de ave y pescado y marisco y mezclas de los mismos.
[0052] En una forma de realization aun mas preferida, el producto alimenticio es un producto lacteo, preferiblemente un producto lacteo fermentado mesofilico o termofilico, tal como queso fresco, un yogur, una crema agria o tvarog.
[0053] En otra forma de realization preferida, el producto alimenticio es carne o carne de ave.
[0054] En una forma de realization preferida el alimento, pienso o producto farmaceutico es un producto farmaceutico.
[0055] Preferiblemente, el producto farmaceutico es un producto util para la administration de la composition antifungica segun un segundo aspecto de la presente invention a un humano o a un animal para inhibir microorganismos patogenicos y paliar los sintomas relacionados con los microorganismos patogenicos.
Algunos ejemplos de tales sintomas incluyen los sintomas relacionados con la infection por levadura.
En tal forma de realization, el producto farmaceutico puede ser una forma de dosificacion unitaria que comprende la composition antifungica. Preferiblemente, la forma de dosificacion unitaria es una capsula o un comprimido. Sin embargo, la forma de dosificacion unitaria tambien puede ser adecuada para la aplicacion a las mucosas o la piel y, por lo tanto, ser en forma de pasta, crema, pomada y similares.
[0056] Un cuarto aspecto de la presente invention se refiere a un metodo para la fabrication de un alimento, pienso o producto farmaceutico segun el tercer aspecto de la presente invention que comprende anadir al menos una cepa de Lactobacillus paracasei segun el primer aspecto o una composition antifungica segun el segundo aspecto de la invention durante la production del alimento, pienso o producto farmaceutico. Preferiblemente, el metodo tambien comprende la etapa de controlar los parametros de fabrication durante la fabrication de manera que la concentration de la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei permanezca constante o aumente.
[0057] En una forma de realization preferida, la concentration de la al menos una cepa de Lactobacillus
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paracasei es al menos 1x106 ufc/g o cada una al menos 1x106 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos 1x105 ufc/cm2 de la superfine del alimento, pienso o producto farmaceutico. Preferiblemente, la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei es al menos 5x106 ufc/g o cada una al menos 5x106 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos
5x105 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico, tal como al menos 1x107 ufc/g o
cada una al menos 1x107 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos
1x106 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico, tal como al menos 5x107 ufc/g o cada
una al menos 5x107 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos 5x106 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico.
[0058] Cuando el alimento, pienso o producto farmaceutico se fabrica por adicion de una composicion que comprende la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 o una derivada mutante de la misma y al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus, la concentracion de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 o la derivada mutante de la misma y/o la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus es cada una de al menos 1x106 ufc/g o cada una al menos 1x106 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos 1x105 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico.
Preferiblemente, la concentracion de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 o la derivada mutante de la misma y/o la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus es cada una de al menos 5x106 ufc/g o cada una al menos 5x106 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos 5x105 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico.
En otra forma de realization, la concentracion de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 o la derivada mutante de la misma y/o la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus es cada una al menos 1x108 ufc/g o cada una al menos 1x108 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o cada una al menos 1x107 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico.
[0059] En una forma de realizacion preferida, los parametros de fabrication se controlan durante la fabrication de manera que la concentracion de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (o la derivada mutante de la misma) y la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus aumenta o permanece constante.
[0060] Una composicion antifungica segun la presente invention se usa de manera mas sencilla mezclandola con y/o aplicandola a un alimento pienso o producto farmaceutico mezclable, pero tambien deberia ser eficaz para tratar la superficie de productos alimenticios solidos, o el interior de tales productos, por ejemplo por inyeccion. En otras formas de realizacion, la composicion se puede aplicar como un liquido de marinado, empanado, aderezo, glaseado, mezcla colorante y similares, el criterio clave siendo que la composicion antifungica este disponible para la superficie sujeta a degradation bacteriana y contamination con levaduras y mohos. En otras formas mas de realizacion, la composicion puede ponerse en contacto indirectamente con la superficie del alimento aplicando la composicion al envase del alimento y luego aplicando el envase a la superficie del alimento. La cantidad optima que se ha de usar dependera de la composicion del producto alimenticio particular que se va a tratar y del metodo usado para aplicar la composicion a la superficie alimenticia, pero se puede determinar por simple experimentation.
[0061] En una forma de realizacion muy preferida, el metodo comprende uno o mas pasos de fermentation y la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei o la composicion antifungica se pueden anadir al alimento, pienso o producto farmaceutico antes, durante o despues de dichos uno o mas pasos de fermentacion.
[0062] Preferiblemente, el metodo comprende la fermentacion de un sustrato, tal como un sustrato de leche, en presencia de al menos una cepa de Lactobacillus paracasei segun la invencion durante un periodo de tiempo suficiente para la aparicion de actividad antifungica de la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei segun la invencion.
Esta actividad antifungica tiene el efecto de inhibir el desarrollo de levaduras y/o mohos en el producto fermentado con la al menos una cepa.
[0063] En una forma de realizacion aun mas preferida, el metodo comprende la fermentacion de un sustrato de leche con un cultivo iniciador que comprende al menos una cepa de los generos seleccionados de Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus y Leuconostoc, tal como al menos una cepa de Lactobacillus bulgaricus y al menos una cepa de Streptococcus thermophilus o tal como al menos una cepa de Lactococcus lactis subesp. lactis, al menos una cepa de Leuconostoc mesenteroides subesp. cremoris y al menos una cepa de Lactococcus lactis subesp. Diacetilactis.
[0064] El quinto aspecto de la presente invencion se refiere al uso de una cepa de Lactobacillus paracasei segun el primer aspecto o una composicion antifungica segun el segundo aspecto para la preparation de un alimento, pienso o producto farmaceutico.
Preferiblemente, el producto alimenticio producido usando la cepa de Lactobacillus paracasei segun el primer aspecto o la composicion antifungica segun el segundo aspecto es un queso, tal como un cottage, feta, cheddar, parmesano, mozzarella, emmental, danbo, gouda, edam, de tipo feta, queso azul, queso salado, camembert o brie.
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[0065] El ultimo aspecto de la invencion se refiere al uso de una cepa de Lactobacillus paracasei segun el primer aspecto o una composicion antifungica segun el segundo aspecto para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos, en particular en productos alimenticios y piensos.
[0066] Las formas de realization de la presente invencion se describen a continuation, por medio de ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: prueba de exposition en el yogur con Lactobacillus paracasei CHCC14676.
[0067] Para la evaluation visual del efecto inhibitorio de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 en los distintos mohos P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor y P. glabrum, se preparo yogur con 1,5% de grasa:
Se termotrato leche homogeneizada (1,5% de grasa) a 95°C±1°C durante 5 min. en botellas de 1 L al bano maria y se enfrio inmediatamente. Un cultivo iniciador comercial (F-DVS YF-L901 obtenible de Chr.Hansen A/S, Dinamarca) se inoculo al 0,02%. Tambien se inoculo a la leche con HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100L) o Lactobacillus paracasei CHCC14676 (1x107 ufc/ml) y se uso una botella como referencia y solo se inoculo con cultivo iniciador.
[0068] La leche se fermento a 43°C±1°C hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.1. El yogur resultante se vertio en vasos (100 g) y se almaceno a 7°C±1°C.
[0069] Un dia despues de la preparation del yogur, se inocularon diferentes mohos como contaminantes de superficie en vasos duplicados de yogur con un punto en la superficie del yogur con un objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento de los mohos se evaluo visualmente despues del almacenamiento durante 45 dias a 7°C±1°C
[0070] El resultado de la prueba con yogur se presenta en la figura 1, que muestra que P. brevicompactum (M1), P. commune (M6), A. versicolor (M7) y P. glabum (M8) crecen bien en yogur hecho a partir de leche fermentada solo con el cultivo iniciador YF-L901 (fila superior) o con el cultivo iniciador y el cultivo HOLDBAC™ YM-B (fila intermedia). En cambio, cuando Lactobacillus paracasei CHCC14676 estuvo presente durante la fermentation de la leche (fila inferior) el crecimiento de todos los mohos evaluados se vio inhibido.
Ejemplo 2: determinaciones cuantitativas del efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CHCC14676 contra Debaryomyces hansenii.
[0071] Para una evaluacion cuantitativa del efecto inhibitorio de Lactobacillus paracasei CHCC14676 en D. hansenii, se preparo yogur:
Se termotrato leche homogeneizada (1,5% de grasa) a 95°C±1°C durante 5 min. en botellas de 1 L al bano maria y se enfrio inmediatamente. Se inoculo un cultivo iniciador comercial (F-DVS YF-L901 obtenible de Chr.Hansen A/S, Dinamarca) al 0,02%. La leche tambien se inoculo con HOLdBaC™ YM-B (20 DCU/100L) o HOLDBAC™ YM-C (10 DCU/100L) o Lactobacillus paracasei CHCC14676 (1x107 ufc/g) y se uso una botella como referencia y solo se inoculo con cultivo iniciador.
[0072] La leche se fermento a 43°C±1°C hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.1. El yogur resultante se vertio en vasos (aprox. 100 ml) y se almaceno a 7°C±1°C.
[0073] El dia despues de la preparacion del yogur, los vasos se inocularon por duplicado con 1,00 ml/vaso de levadura en un objetivo de 20 ufc/g. La levadura se disperso de forma homogenea en el yogur.
Los vasos se almacenaron bajo tapa a 7°C±1°C y se analizaron a intervalos adecuados para detectar el nivel de contamination de D. hansenii mediante la preparacion en placa de 1 ml de yogur y otras diluciones de factor 1 apropiadas hechas en peptona salina sobre agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC) seguida de incubation aerobica durante 5 dias a 25°C.
[0074] Como se ilustra en la figura 2, el crecimiento de D. Hansenii fue inhibido en presencia de la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 cuando se inoculo junto con el cultivo iniciador YF-L901 antes de la fermentacion. La cepa provocada causo una inhibition significativamente mas alta que los cultivos comerciales, HOLDBAC™ YM-B y HOLDBAC™ YM-C.
Ejemplo 3: determinaciones semicuantitativas del efecto inhibitorio de Lb. paracasei CHCC14676 y Lb. rhamnosus CHCC5366 solas y en combinacion contra distintos mohos contaminantes.
[0075] Para las evaluaciones semicuantitativas de Lb. paracasei CHCC14676 y Lb. rhamnosus CHCC5366 solas y en combinacion, se utilizo un ensayo en agar, parecido al proceso de fabricacion y producto de yogur:
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Se termotrato leche homogeneizada (1,5% p/v de grasa) a 95°C durante cinco minutos y se enfrio inmediatamente. Un cultivo iniciador comercial (F-DVS YC-350 obtenible de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) se inoculo al 0,02%, y la leche se distribuyo a botellas de 220 ml. Las botellas ademas se inocularon con Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC5366 y una combinacion de las dos cepas, respectivamente, en concentraciones totalds de 1x107 ufc/ml. Una botella sin mas inoculacion que el cultivo iniciador se uso como referencia. Ademas, 5% de un indicador de pH de purpura de bromocresol y verde de bromocresol se anadio a todas las botellas para obtener una indication de la velocidad de acidification, y para obtener un color azul/verde de los medios que hana que el crecimiento posterior de levaduras y mohos objetivo fuera mas facilmente detectable. Todas las botellas se incubaron al bano maria a 43±1°C y se fermentaron a estas condiciones hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.1. Despues de la fermentation, las botellas se enfriaron inmediatamente en hielo y se agitaron energicamente para romper la cuajada. Despues, la leche fermentada se calento a una temperatura de 40°C y se anadio a 40 ml de una solution de agar esteril al 5% que habia sido derretida y enfriada hasta 60°C. Esta solucion luego se vertio en placas de Petri esteriles y las placas se secaron en una mesa de flujo laminar durante 30 min.
[0076] Se depositaron en las placas suspensiones de esporas completamente cultivadas en diluciones apropiadas de los mohos seleccionados Penicillium nalgiovense (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) y Penicillium crustosum (100x). Las placas se incubaron a 7°C y se examino el crecimiento de moho a intervalos adecuados y regulares..
[0077] Los resultados del ensayo en agar se presentan en la figura 3, que muestra que todos los mohos evaluados crecieron muy bien en las placas de agar a partir de leche fermentada solo con el cultivo iniciador (referencia). Sin embargo, cuando Lb. paracasei CHCC14676 o Lb. rhamnosus CHCC5366 estaban presentes durante la fermentacion de la leche, las placas resultantes redujeron considerablemente el crecimiento de todos los mohos. Ademas, cuando Lb. paracasei CHCC14676 y Lb. rhamnosus CHCC5366 estaban presentes en combinacion durante la fermentacion de la leche, se observo una inhibition incluso mas fuerte, en particular para Penicillium commune, Aspergillus versicolor y Penicillium crustosum depositadas en pequenas cantidades en las placas.
Ejemplo 4: determinaciones semicuantitativas del efecto inhibitorio de Lb. Paracasei CHCC14676 y Lb. Rhamnosus CHCC14226 solas y en combinacion contra distintos mohos contaminantes.
[0078] Para las evaluaciones semicuantitativas de Lb. Paracasei CHCC14676 y Lb. Rhamnosus CHCC14226 solas y en combinacion, se utilizo un ensayo en agar, parecido al proceso de fabrication y producto del yogur:
Se termotrato leche homogeneizada (1,5% p/v de grasa) a 95°C durante cinco minutos y se enfrio inmediatamente. Un cultivo iniciador comercial (F-DVS Yoflex® Mild obtenible de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) se inoculo al 0,02%, y la leche se distribuyo en botellas de 220 ml. Ademas, se inoculo a las botellas Lb. Paracasei CHCC14676, Lb. Rhamnosus CHCC14226 y una combinacion de las dos cepas, respectivamente, en concentraciones totales de 1x107 ufc/ml. Una botella sin mas inoculacion que el cultivo iniciador se uso como referencia. Ademas, 5% de un indicador de pH de purpura de bromocresol y verde de bromocresol se anadio a todas las botellas para obtener una indicacion de la velocidad de acidificacion, y para obtener un color azul/verde de los medios que haria mas facilmente detectable el crecimiento posterior de las levaduras y mohos objetivo. Todas las botellas se incubaron al bano maria a 43±1°C y se fermentaron a estas condiciones hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.1. Despues de la fermentacion, las botellas se enfriaron inmediatamente en hielo y se agitaron energicamente romper el coagulo. Luego, la leche fermentada se calento a una temperatura de 40°C y se anadieron a 40 ml de una solucion de agar esteril al 5% que habia sido derretida y enfriada hasta 60°C. Esta solucion se vertio luego en placas de Petri esteriles y las placas se secaron en una mesa de flujo laminar durante 30 min.
[0079] Se depositaron en las placas pequenas cantidades de suspensiones de esporas completamente cultivadas en diluciones apropiadas de los mohos seleccionados Penicillium nalgiovense (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) y Penicillium crustosum (100x). Las placas se incubaron a 7°C y se examino el crecimiento de moho a intervalos adecuados y regulares.
[0080] Los resultados del ensayo en agar se presentan en la figura 4, que muestra que todos los mohos evaluados crecieron muy bien en las placas de agar a partir de leche fermentada solo con el cultivo iniciador (referencia). Sin embargo, cuando Lb. Paracasei CHCC14676 o Lb. Rhamnosus CHCC14226 estuvieron presentes durante la fermentacion de la leche, las placas resultantes redujeron considerablemente el crecimiento de todos los mohos.
Ademas, cuando Lb. Paracasei CHCC14676 y Lb. Rhamnosus CHCC14226 estuvieron presentes en combinacion durante la fermentacion de la leche, se observo una inhibicion incluso mas fuerte para Penicillium commune, Aspergillus versicolor y Penicillium crustosum depositados en pequenas cantidades en las placas.
Ejemplo 5: prueba de exposition en yogur griego con Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion.
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[0081] Para la evaluacion visual del efecto inhibitorio de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion sobre Mucor ssp, se preparo sustacialmente yogur griego de la siguiente manera:
Se inoculo en leche pasteurizada con un 1,5% de grasa un cultivo iniciador comercial (F-DVS YF-L901 obtenible de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) al 0,02%. Un lote inoculado solamente con cultivo iniciador se uso como referencia. Otro lote tambien se inoculo con una combinacion de la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x106 ufc/g) y la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x106 ufc/g).
[0082] La leche se fermento a 43°C±1°C a un pH final de 4.55 (6-7 horas). Posteriormente, el yogur se enfrio a 25°C±1°C con una contrapresion de 2 bares y se almaceno a 6°C±1°C.
[0083] Un dia despues de la preparation del yogur, se inoculo Mucor ssp. como como contaminante de superficie en vasos duplicados de yogur aplicando un punto en la superficie del yogur con una concentration de inoculation objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento del moho se evaluo visualmente despues del almacenamiento durante 15 dias a 22°C±1°C
[0084] Los resultados de la prueba con yogur griego se presentan en la figura 5, que muestra que Mucor ssp. crece bien en yogur hecho a partir de leche fermentada solamente con el cultivo iniciador (vaso de la izquierda). En cambio, cuando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 estuvieron presentes durante la fermentation de la leche (vaso de la derecha) el crecimiento de Mucor ssp. fue inhibido.
Ejemplo 6: segunda prueba de exposition en yogur griego con una combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676.
[0085] Para la evaluacion visual del efecto inhibitorio de la combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en el moho de pan negro Rhizopus stolonifer, el yogur griego se preparo sustancialmente de la siguiente manera:
Se inoculo en leche pasteurizada con un 1,5% de grasa un cultivo iniciador comercial (F-DVS YF-L901 obtenible de Chr.Hansen A/S, Dinamarca) al 0,02 %. Tambien se inoculo en la leche HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 I), con la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 ufc/g), o con una combinacion de la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x106 ufc/g) y la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x106 ufc/g). Un lote se uso como referencia y solo se inoculo con cultivo iniciador.
[0086] La leche se fermento a 43°C±1°C hasta llegar a un pH final de 4.55 (6-7 horas).
Posteriormente, el yogur se enfrio a 25°C±1°C con una contrapresion de 2 bares y se almaceno a 6°C±1°C.
[0087] Un dia despues de la preparacion del yogur, se inoculo Rhizopus stolonifer como contaminante de superficie en vasos duplicados de yogur aplicando un punto en la superficie del yogur con una contamination objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento del moho se evaluo visualmente despues del almacenamiento durante 42 dias a 7°C±1°C.
[0088] El resultado de la prueba con el yogur griego se presenta en la figura 6, que muestra que Rhizopus stolonifer crece bien en yogur hecho a partir de leche fermentada solamente con el cultivo iniciador ("R", es decir, referencia) o con el cultivo iniciador y el cultivo HOLDBAC™ YM-B (YM-B). Sin embargo, cuando el Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) estuvo presente, el crecimiento de Rhizopus stolonifer fue inhibido significativamente. Cuando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 estuvieron ambos presentes durante la fermentacion de la leche (5366+14676) el crecimiento de Rhizopus stolonifer fue inhibido casi completamente.
Ejemplo 7: prueba de exposicion en crema agria con Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 en combinacion.
[0089] Para la evaluacion visual del efecto inhibitorio de una combinacion de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 en el crecimiento de diferentes mohos, se preparo crema agria sustancialmente de la siguiente manera:
Se inoculo leche alta en grasa pasteurizada con un cultivo iniciador comercial heterofermentativo (F-DVS DSG-2000 obtenible de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) al 0,01%. Ademas, se inoculo a la leche HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100L) o una combinacion de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (2,5x106 ufc/g) y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (2,5x106 ufc/g). Un lote se uso como referencia y se inoculo solo con cultivo iniciador.
[0090] La leche se fermento a 28°C±1°C hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.05 y la crema agria se sometio a post-tratamiento. La crema agria se agito y enfrio a 20°C±1°C y se almaceno a 7°C±1°C.
[0091] Un dia despues de la preparacion de la crema agria, se inocularon diferentes mohos como contaminantes de superficie en vasos duplicados de crema agria aplicando un punto en la superficie de la crema agria con una
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concentration objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento de los mohos se evaluo visualmente despues de almacenamiento durante 61 dias a 7°C±1°C.
[0092] El resultado de la prueba de crema agria se presenta en la figura 7, que muestra que Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) y Penicillium glabrum (M8) crecen bien en la crema agria hecha a partir de leche fermentada solo con cultivo iniciador (fila superior) o con el cultivo iniciador y el cultivo HOLDBAC™ YM-B (fila intermedia). En cambio, cuando Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 estuvieron presentes durante la fermentation de la leche (fila inferior), el crecimiento de todos los mohos evaluados fue inhibido.
Ejemplo 8: determinaciones cuantitativas del efecto inhibitorio de una combination de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 contra Debaryomyces hansenii en crema agria.
[0093] Para una evaluation cuantitativa del efecto inhibitorio de una combinacion de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 contra Debaryomyces hansenii, se preparo una crema agria sustancialmente de la siguiente manera:
Se inoculo leche alta en grasa pasteurizada con un cultivo iniciador comercial heterofermentativo (F-DVS DSG-2000 obtenible de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) al 0,01%. Ademas, se inoculo a la leche HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100L) o una combinacion de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (2,5x106 ufc/g) y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 (2,5x106 ufc/g). Se uso un lote como referencia y se inoculo solo con cultivo iniciador.
[0094] La leche se fermento a 28°C±1°C hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.05 y la crema agria se sometio a post-tratamiento. La crema agria se agito y se enfrio a 20°C±1°C y se almaceno a 7°C±1°C.
[0095] El dia despues de la preparation de la crema agria, se inoculo en los vasos por duplicado 1,0 ml/vaso de levadura a un objetivo de 20 ufc/g. La levadura se disperso de manera homogenea en la crema agria.
Los vasos se almacenaron bajo tapa a 7°C±1°C y se analizaron a intervalos adecuados para detectar el nivel de contamination por D. hansenii mediante la colocation en placas de 1 ml de crema agria y diluciones apropiadas de factor 1 hechas en peptona salina sobre agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC) seguida de incubation aerobica durante 5 dias a 25°C.
[0096] Como se ilustra en la figura 8, el crecimiento de D. Hansenii fue inhibido en presencia de una combinacion de Lactobacillus paracasei CHCC14676 y Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 cuando se inocularon con el cultivo iniciador DSG-2000 antes de la fermentacion. Las cepas causaron una inhibition significativamente mas alta que el cultivo comercial, HOLDBAC™ YM-B.
Ejemplo 9: prueba de exposition en queso blanco en salmuera con Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion.
[0097] Para la evaluacion cuantitativa del efecto inhibitorio de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion contra Saccharomyces cerevisiae, se preparo queso blanco en salmuera:
Se inoculo en leche pasteurizada y normalizada un cultivo iniciador comercial (FD-DVS SafeIT-1 obtenible de Chr.Hansen A/S, Dinamarca) a 40 U por 1000 l de leche Tambien se inoculo en la leche HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 I) o con una combinacion de la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x106 ufc/g) y la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x106 ufc/g). Un lote se uso como referencia y solamente se inoculo con cultivo iniciador. La leche se trato con cuajo a 36°C±1°C usando Chy-Max plus (obtenido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) con 220 ml por 1000 l durante 90 min. antes del corte. A pH 6.0 la cuajada se bombeo hasta los mohos y se dejo drenar hasta alcanzar un pH final de 4.8-4.7 (20-24 horas). Los quesos se colocaron en latas con salmuera fria (8%) y se almacenaron a 5°C±1°C.
[0098] Un dia despues de la preparacion del queso blanco en salmuera, se inoculo levadura a las latas por duplicado con un objetivo de 20 ufc/ml. La levadura se disperso uniformemente en la solution salina.
Los vasos se almacenaron bajo tapa a 7°C±1°C durante hasta 40 dias y se analizaron 10 g a intervalos adecuados para detectar el nivel de contaminacion de Saccharomyces cerevisiae mediante la preparacion en placa apropiada de diluciones de factor 1 hechas en peptona salina sobre agar extracto de levadura-glucosa- cloranfenicol (YGC) seguida de incubacion aerobica durante 5 dias a 25°C.
[0099] Como se ilustra en la figura 9, el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae fue inhibido en presencia de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion cuando se inocularon junto con el cultivo iniciador SafeIT-1. Las cepas provocaron una inhibicion significativamente mas alta que el cultivo disponible comercialmente, HOLDBAC™ YM-B.
Ejemplo 10: segunda prueba de exposicion en queso blanco en salmuera con Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion.
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[0100] Para la evaluacion cuantitativa del efecto inhibitorio de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion contra Kluyveromyces marxianus, se preparo queso blanco en salmuera como se describe en el ejemplo 1, con la exception que se inoculo Kluyveromyces marxianus en las latas como levadura contaminante.
[0101] Como se ilustra en la figura 10, el crecimiento de Kluyveromyces mancianus fue inhibido en presencia de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion cuando se inocularon junto con el cultivo iniciador SafeIT-1. Las cepas provocaron una inhibition significativamente mas alta que el cultivo disponible comercialmente, HOLDBAC™ YM-B.
Ejemplo 11: tercera prueba de exposition en queso blanco en salmuera con Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion.
[0102] Para la evaluacion visual del efecto inhibitorio de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 en combinacion contra P. commune, se preparo queso blanco en salmuera como se describe en el ejemplo 1.
[0103] 7 dias despues de la preparation del queso blanco en salmuera, el queso se retiro de la solution salina y se inoculo P. commune como contaminante de superficie en quesos duplicados con tres puntos en la superficie del queso con un objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento de dos aislados de P. commune diferentes se evaluo visualmente despues de almacenamiento durante 12 dias a 7°C±1°C y, posteriormente, 16 dias a 12°C±1°C
[0104] Los resultados de la prueba del queso blanco en salmuera se presentan en la figura 11, que muestra que los dos aislados de P. commune crecen bien en el queso blanco en salmuera hecho a partor de leche inoculada solo con el cultivo iniciador (izquierda).
En cambio, cuando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 estuvieron presentes durante la production de queso (derecha), el crecimiento de P. commune fue fuertemente inhibido.
Ejemplo 12: prueba de exposicion en yogur con Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y CHCC14676 contra Penicillium paneum
[0105] Para la evaluacion visual del efecto inhibitorio de la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 sola o en combinacion con Lactobacillus paracasei CHCC14676 en el moho P. paneum, se preparo yogur con 1,5% de grasa:
Se termotrato leche homogeneizada (1,5% de grasa) a 95°C±1°C durante 5 min. en botellas de 1 L al bano maria y se enfrio inmediatamente. Se inoculo un cultivo iniciador comercial (F-DVS YF-L901 obtenible de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) al 0,02%. Tambien se inoculo a la leche hOlDBAC™ YM-B (20DCU/100L), Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 ufc/ml) solo, o una combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x106 ufc/ml) y Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x106 ufc/ml). Se uso una botella como referencia y solo se le inoculo cultivo iniciador.
[0106] La leche se fermento a 43°C±1°C hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.1. El yogur resultante se vertio en vasos (100 g) y se almaceno a 7°C±1°C.
[0107] Un dia despues de la preparacion de yogur, se inocularon distintos mohos como contaminantes de superficie en vasos duplicados de yogur con un punto en la superficie del yogur con un objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento de los mohos se evaluo visualmente despues de almacenamiento durante 28 dias a 7°C±1°C
[0108] El resultado de la prueba con yogur se presenta en la figura 12, que muestra que P. Paneum crece bien en yogur hecho a partir de leche fermentada solo con el cultivo iniciador YF-L901 o con el cultivo iniciador y el cultivo HOLDBAC™ YM-B. En cambio, cuando el Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 estuvo presente durante la fermentation de leche, el crecimiento de P. Paneum se vio fuertemente reducido, y la combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676 causo una inhibicion del crecimiento incluso mas fuerte que P. Paneum.
Ejemplo 13: prueba de exposicion en yogur con Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y CHCC14676 a temperaturas de almacenamiento diferentes
[0109] Para la evaluacion visual del efecto inhibitorio de la cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 sola o en combinacion con Lactobacillus paracasei CHCC14676 en el moho P. crustosum a temperaturas de almacenamiento diferentes, se preparo yogur con 1,5% de grasa:
Se termotrato leche homogeneizada (1,5% de grasa) a 95°C±1°C durante 5 min. en botellas de 1 L al bano maria y se enfrio inmediatamente. Un cultivo iniciador comercial (F-DVS YF-L901 obtenible de Chr. Hansen
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A/S, Dinamarca) se inoculo al 0,02%. A la leche tambien se inoculo HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100L), Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 ufc/ml) solo, o una combination de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x106 ufc/ml) y Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x106 ufc/ml). Se uso una botella como referencia y solo se le inoculo cultivo iniciador.
[0110] La leche se fermento a 43°C±1°C hasta que se alcanzo un pH de 4.60±0.1. El yogur resultante se vertio en vasos (100 g) y se almaceno a 7°C±1°C.
[0111] Un dia despues de la preparation del yogur, se inoculo Penicillium crustosum como contaminante de superficie en vasos duplicados de yogur con un punto en la superficie del yogur con un objetivo de 100 esporas/punto. El crecimiento de los mohos se evaluo visualmente despues de almacenamiento durante 36 dias a 7°C±1°C,12°C±1°C o 22°C±1°C
[0112] El resultado de la prueba con yogur se presenta en la figura 13, que muestra que P. Crustosum crece bien en yogur hecho a partir de leche fermentada solo con el cultivo iniciador YF-L901 o con el cultivo iniciador y el cultivo HOLDBAC™ YM-B a cualquier temperatura de almacenamiento.
En cambio, cuando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 solo o en combinacion con Lactobacillus paracasei CHCC14676 estuvo presente durante la fermentation de la leche, el crecimiento de P. Crustosum fue completamente inhibido durante el almacenamiento tanto a 7°C±1°C como a 12°C±1°C durante 36 dias.
Tras el almacenamiento a 22°C±1°C, el crecimiento de P. crustosum fue fuertemente reducido en presencia de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e incluso mas fuerte en presencia de la combinacion de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 y Lactobacillus paracasei CHCC14676.
DEPOSITOS Y SOLUCION EXPERTA
[0113] El solicitante pide que una muestra de los microorganismos depositados mencionados a continuation solo pueda estar disponible para un experto, hasta la fecha en la que se conceda la patente.
[0114] La cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 se deposito a fecha de en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig y se le asigno el n° de deposito DSM25612.
[0115] La cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 se deposito a fecha de en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig y se le asigno el n° de deposito DSM23035.
[0116] La cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 se deposito a fecha de en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig y se le asigno el n° de deposito DSM24616.
[0117] La cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14226 se deposito a fecha de en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig y se le asigno el n° de deposito DSM24652.
[0118] El deposito se hizo segun el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes.
REFERENCIAS
[0119]
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Claims (15)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Cepa de Lactobacillus paracasei seleccionada del grupo consistente en la cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 que fue depositada en la Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ) con el numero de deposito DSM25612 y cepas mutantes derivadas de la misma, donde las cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que la cepa con el numero de deposito n° DSM25612.
- 2. Composicion antifungica que comprende al menos una cepa de Lactobacillus paracasei segun la reivindicacion 1.
- 3. Composicion antifungica segun la reivindicacion 2 que comprende ademas al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus.
- 4. Composicion antifungica segun la reivindicacion 3, donde la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus se selecciona del grupo consistente en Lactobacillus rhamnosus CHCC12697 con numero de deposito DSM24616 y Lactobacillus rhamnosus CHCC14226 con numero de deposito DSM24652, Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 con numero de deposito DSM23035 y cepas mutantes derivadas de las mismas, donde las cepas mutantes tienen sustancialmente las mismas propiedades antifungicas o mejoradas que una de las cepas depositadas con el numero de deposito DSM24616, dSm24652 o DSM23035.
- 5. Alimento, pienso o producto farmaceutico que comprende una cepa de Lactobacillus paracasei segun la reivindicacion 1 o una composicion antifungica segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
- 6. Producto alimenticio segun la reivindicacion 5 que incluye una cantidad de una cepa de Lactobacillus paracasei segun la reivindicacion 1 eficaz para impartir propiedades antifungicas al producto alimenticio.
- 7. Producto alimenticio segun la reivindicacion 5 o 6, donde el producto alimenticio se selecciona del grupo consistente en frutas y productos derivados de fruta, vegetales y productos derivados vegetales, cereales y productos derivados de los cereales, productos lacteos, carne, carne de ave y pescado y marisco y mezclas de los mismos.
- 8. Producto alimenticio segun la reivindicacion 7, donde el producto alimenticio es un producto lacteo y el producto lacteo es un producto lacteo fermentado mesofilico o termofilico, tal como un yogur o una crema agria.
- 9. Metodo para la produccion de un alimento, pienso o producto farmaceutico que comprende anadir al menos una cepa de Lactobacillus paracasei segun la reivindicacion 1 o una composicion antifungica segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 al alimento, pienso o producto farmaceutico durante la produccion y controlar los parametros de produccion durante la produccion de manera que la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei permanezca constante o aumente.
- 10. Metodo segun la reivindicacion 9, donde la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei es al menos 1x106 ufc/g o cada una al menos 1x106 ufc/ml de alimento, pienso o producto farmaceutico, o al menos 1x105 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico.
- 11. Metodo segun la reivindicacion 9, que comprende(a) anadir la composicion antifungica segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 durante la produccion del alimento, pienso o producto farmaceutico de manera que la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus y/o al menos una cepa de Lactobacillus paracasei sea cada una de al menos 1x106 ufc/g o al menos 1x106 ufc/ml del alimento, pienso o producto farmaceutico, o al menos 1x105 ufc/cm2 de la superficie del alimento, pienso o producto farmaceutico, y(b) controlar los parametros de produccion durante la produccion de manera que la concentracion de la al menos una cepa de Lactobacillus rhamnosus y/o la al menos una cepa de Lactobacillus paracasei aumente o permanezca constante.
- 12. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el metodo comprende uno o mas pasos de fermentacion.
- 13. Metodo segun la reivindicacion 12, donde el metodo comprende fermentar un sustrato de leche con un cultivo iniciador que comprende al menos una cepa de los generos seleccionados de Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus y Leuconostoc.
- 14. Uso de una cepa de Lactobacillus paracasei segun la reivindicacion 1 o una composicion antifungica segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para la preparation de un producto alimenticio, pienso o farmaco.
- 15. Uso no medico de una cepa de Lactobacillus paracasei segun la reivindicacion 1 o una composition antifungica segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 para la inhibition del crecimiento de levaduras y mohos.
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