CN101613667B - 一种制备l-乳酸的方法及其专用菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备L-乳酸的方法及其专用菌剂。本方法是发酵培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)SMB-07CGMCC № 3124，得到L-乳酸。实验结果表明，发酵37小时，发酵液中总乳酸的量为216-241g/L，L-乳酸的光学纯度为98-99％，发酵产率为2.2-6.5g/L·h。本发明通过混合发酵技术提高了L-乳酸的产量和产率，极大地降低了L-乳酸的成本，具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备L-乳酸的方法及其专用菌剂。
背景技术
随着石油资源的不断减少以及不可再生资源价格的节节攀升，开发利用对环境更友好的生物基产品已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环和实现经济社会可持续发展的战略需求。乳酸是一种重要的、多用途的生物基平台化合物，有两种异构体，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作为一种重要的生物化工材料，L-乳酸被广泛地应用于食品、医药、现代农业、日用化工和有机化工等领域，涵盖大量产品。其中最重要、最广泛的工业应用是用于生产可降解聚合物-聚乳酸(PLA)。聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性以及优良的机械性能和物理性能，因而被产业界认为是新世纪最有发展前途的新型可再生材料，是石油基产品的重要替代品之一。
L-乳酸的生产成本和市场价格偏高是聚乳酸市场开拓受阻的一个主要因素，根据国内外文献和专利的报道，目前利用微生物生产乳酸的方法主要有两种，即根霉发酵和乳杆菌发酵生产乳酸。采用根霉发酵具有如下缺点：(1)需要较高的空气系统及搅拌动力系统，对电、蒸汽等能源消耗较大，生产成本较高；(2)由于根霉发酵是乳酸的异型发酵，因此在发酵乳酸的过程中根霉同时进行其它路径的代谢，有大量的杂酸伴生，使发酸转化率低，产品质量低。因此，目前工厂更多地采用乳杆菌进行乳酸发酵生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备L-乳酸的专用菌剂。
本发明所提供的制备L-乳酸的专用菌剂，其活性成分为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07CGMCC № 3124。
上述菌剂在具体应用时，可根据需要在其中添加其他的辅料。
本发明的第二个目的是提供一种制备L-乳酸的方法。
本发明所提供的制备L-乳酸的方法，是发酵培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124，得至L-乳酸。
上述方法中，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为(1-3)∶(1-2)∶1。
上述方法中，所述发酵培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的发酵培养基每升的组成为：葡萄糖180～200g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HPO43g/L、KH2PO4 3g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-80 1ml/L、用于控制发酵液pH值的中和剂，其余为水。发酵过程中控制pH范围在5.0～5.5。
上述方法中，所述中和剂为CaCO3或氨水。
所述中和剂为CaCO3，所述CaCO3在发酵培养基中的终浓度为30g/L。
上述方法中，所述发酵培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC №3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的条件为35-42℃厌氧培养37-60小时，具体可为37℃厌氧培养37小时。
所述发酵培养的方式为分批补料发酵培养，在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖一次。
本发明所提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07均是从人的口腔唾液中筛选得到的，分别鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07均已于2009年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05的保藏登记号为CGMCC № 3122，唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06的保藏登记号为CGMCC № 3123，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07的保藏登记号为CGMCC № 3124。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122为革兰氏阳性菌、菌落乳白色、菌落的边缘整齐、光滑；唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123为革兰氏阳性菌、菌落淡乳白色、菌落边缘整齐、光滑；副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC №3124为革兰氏阳性菌、菌落淡乳白色、菌落较小、边缘整齐光滑。
本发明利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC №3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124发酵生产L-乳酸，结果表明，发酵37小时，发酵液中总乳酸的量为216-241g/L，L-乳酸的光学纯度为98-99％，发酵产率为2.2-6.5g/L·h。本发明通过混合发酵技术提高了L-乳酸的产量和产率，极大地降低了L-乳酸的成本，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；所述百分含量，如无特别说明均为质量百分含量。
实施例1、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07的分离、纯化及鉴定
1、菌种的分离和纯化
收集不同类型人的口腔唾液于无菌的生理盐水中充分混匀，然后将上述稀释后的口腔唾液加入到MRS液体培养基中，37℃厌氧富集培养48小时，获得pH＜4.0的富集液；取上述富集液，10倍梯度稀释后涂布于含4％(质量百分含量)CaCO3的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养24小时，挑取透明圈较大的单菌落分别接种于MRS液体培养基中厌氧培养24小时，观察是否产气，筛选得到不产气的菌株，即同型发酵乳酸菌；将上述筛选得到得同型发酵乳酸菌分别接种于复筛培养基上，37℃厌氧培养48小时，通过高效液相色谱检测总乳酸的产量，获得高产的乳酸菌；将上述获得的乳酸菌通过乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测L-乳酸的光学构型，最终得到三株L-乳酸光学纯度为98％的菌株，即鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07，经多次传代后发酵测试，总乳酸产量、L-乳酸的纯度没有明显变化。
MRS液体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
含4％质量百分含量CaCO3的MRS固体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L，CaCO3 40g/L，琼脂15g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
复筛培养基的组成为：葡萄糖120g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L，CaCO3 40g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
2、菌株的鉴定
将上述步骤1筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)SMB-07分别进行形态特征、生理生化试验和16S rDNA序列鉴定，具体过程如下：
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122为革兰氏阳性菌、菌落乳白色、菌落的边缘整齐、光滑；唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123为革兰氏阳性菌、菌落淡乳白色、菌落边缘整齐、光滑；副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124为革兰氏阳性菌、菌落淡乳白色、菌落较小、边缘整齐光滑。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhomnosus)SMB-05、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)SMB-07的生理生化特征如表1-表3所示。
表1 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05的生理生化特性
表2 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06的生理生化特性
表3 副干酪乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-07的生理生化特性
表1-表3中，“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中序列1示，唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中序列2示，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列3示。菌株SMB-05的16S rDNA与鼠李糖乳杆菌V3(GQ253959.1)的同源性最高，其同源性为95％；菌株SMB-06的16S rDNA与唾液乳杆菌RA2115(AY389803.1)的同源性最高，其同源性为93％；菌株SMB-07的16SrDNA与副干酪乳杆菌L7(EU526815.1)的同源性最高，其同源性为96％。
基于以上特征，将上述步骤1筛选得到的菌株SMB-05鉴定为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)，将上述步骤1筛选得到的菌株SMB-06鉴定为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)，将上述步骤1筛选得到的菌株SMB-07鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。上述三株菌均于2009年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05的保藏登记号为CGMCC № 3122，唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06的保藏登记号为CGMCC № 3123，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07的保藏登记号为CGMCC № 3124。
实施例2、利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124发酵生产L-乳酸
该实施例中所用培养基的组成如下：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温80 1mL/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5～6.2。115℃条件下灭菌20分钟。
发酵培养基：葡萄糖190g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HPO4 3g/L、KH2PO4 3g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-80 1ml/L，CaCO3 30g/L。pH5.0～5.5。115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入CaCO3的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。
将上述实施例1筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124分别接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。将上述三种乳杆菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为1∶1∶1，得到种子液。将上述种子液以10％的接种量接种到装有20L MRS液体培养基的种子发酵罐中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。
在装有120L上述发酵培养基的200L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液。发酵过程中，初始24小时通过氨水调节发酵液的pH为6.0进行发酵，然后通过发酵培养基中的碳酸钙调节pH为5.0-5.5。采用分批补料的方式进行发酵培养，即在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖一次，35℃厌氧发酵60小时，结束发酵。
发酵过程结束后，通过高效液相色谱法检测发酵液中总乳酸的产量和葡萄糖的含量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度40℃。L-乳酸的含量通过L-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、L-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度；
L-乳酸的光学纯度＝L-乳酸浓度/总乳酸浓度；
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表4所示。
表4不同发酵时间下的总乳酸产量和L-乳酸光学纯度
结果表明，当鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为1∶1∶1时，在60小时内总乳酸的产量为216g/L，L-乳酸的光学纯度为98％，发酵产率为2.2g/L·h。
实施例3、利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124发酵生产L-乳酸
该实施例中所用培养基的组成同实施例2。
将上述实施例1筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124分别接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。将上述三种乳杆菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为2∶1∶1，得到种子液。将上述种子液以10％的接种量接种到装有20L MRS液体培养基的种子发酵罐中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。
在装有120L上述发酵培养基的200L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液。发酵过程中，初始24小时通过氨水调节发酵液的pH为6.0进行发酵，然后通过发酵培养基中的碳酸钙调节pH为5.0-5.5。采用分批补料的方式进行发酵培养，即在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖一次，42℃厌氧发酵37小时，结束发酵。
发酵过程结束后，通过高效液相色谱法检测发酵液中总乳酸的产量和葡萄糖的含量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8 ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度40℃。L-乳酸的含量通过L-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、L-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度；
L-乳酸的光学纯度＝L-乳酸浓度/总乳酸浓度；
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表5所示。
表5不同发酵时间下的总乳酸产量和L-乳酸光学纯度
结果表明，当鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为2∶1∶1时，在37小时内总乳酸的产量为237g/L，L-乳酸的光学纯度为99％，发酵产率为6.4g/L·h。
实施例4、利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124发酵生产L-乳酸
该实施例中所用培养基的组成同实施例2。
将上述实施例1筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124分别接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。将上述三种乳杆菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为3∶2∶1，得到种子液。将上述种子液以10％的接种量接种到装有20L MRS液体培养基的种子发酵罐中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。
在装有120L上述发酵培养基的200L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液。发酵过程中，初始24小时通过氨水调节发酵液的pH为6.0进行发酵，然后通过发酵培养基中的碳酸钙调节pH为5.0-5.5。采用分批补料的方式进行发酵培养，即在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖一次，37℃厌氧发酵37小时，结束发酵。
发酵过程结束后，通过高效液相色谱法检测发酵液中总乳酸的产量和葡萄糖的含量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度40℃。L-乳酸的含量通过L-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、L-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度；
L-乳酸的光学纯度＝L-乳酸浓度/总乳酸浓度；
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表6所示。
表6不同发酵时间下的总乳酸产量和L-乳酸光学纯度
结果表明，当鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为3∶2∶1时，在37小时内总乳酸的产量为240g/L，L-乳酸的光学纯度为98％，发酵产率为6.5g/L·h。
实施例5、利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124发酵生产L-乳酸
该实施例中所用培养基的组成如下：
MRS液体培养基：同实施例2。
发酵培养基：葡萄糖200g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HPO4 3g/L、KH2PO4 3g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-80 1ml/L，CaCO330g/L。pH5.0～5.5，115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入CaCO3的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。
将上述实施例1筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124分别接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。将上述三种乳杆菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为3∶2∶1，得到种子液。将上述种子液以10％的接种量接种到装有20L MRS液体培养基的种子发酵罐中，39℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。
在装有120L上述发酵培养基的200L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液。发酵过程中，初始24小时通过氨水调节发酵液的pH为6.0进行发酵，然后通过发酵培养基中的碳酸钙调节pH为5.0-5.5。采用分批补料的方式进行发酵培养，即在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖一次，37℃厌氧发酵37小时，结束发酵。
发酵过程结束后，通过高效液相色谱法检测发酵液中总乳酸的产量和葡萄糖的含量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度40℃。L-乳酸的含量通过L-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、L-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度；
L-乳酸的光学纯度＝L-乳酸浓度/总乳酸浓度；
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表7所示。
表7不同发酵时间下的总乳酸产量和L-乳酸光学纯度
结果表明，当发酵培养基中葡萄糖浓度为210g/L时，37℃厌氧发酵37小时内总乳酸的产量为233g/L，L-乳酸的光学纯度为98％，发酵产率为6.3g/L·h。
实施例6、利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05 CGMCC №3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124发酵生产L-乳酸
该实施例中所用培养基的组成如下：
MRS液体培养基：同实施例2。
发酵培养基：葡萄糖180g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HPO4 3g/L、KH2PO4 3g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-80 1ml/L，CaCO3 30g/L。pH5.0～5.5，115℃条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入CaCO3的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。
将上述实施例1筛选得到的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)SMB-05CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06 CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124分别接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。将上述三种乳杆菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC № 3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC № 3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07 CGMCC № 3124的cfu比为3∶2∶1，得到种子液。将上述种子液以10％的接种量接种到装有20L MRS液体培养基的种子发酵罐中，39℃厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109～1011cfu/mL。
在装有120L上述发酵培养基的200L发酵罐中按照10％的体积比接入上述发酵种子液。发酵过程中，初始24小时通过氨水调节发酵液的pH为6.0进行发酵，然后通过发酵培养基中的碳酸钙调节pH为5.0-5.5。采用分批补料的方式进行发酵培养，即在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖一次，37℃厌氧发酵37小时，结束发酵。
发酵过程结束后，通过高效液相色谱法检测发酵液中总乳酸的产量和葡萄糖的含量。具体的检测条件如下：采用Agilent 1100液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8ID×300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20μL，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度40℃。L-乳酸的含量通过L-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。
按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、L-乳酸的光学纯度和发酵产率。
总乳酸的浓度＝(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)×标准样品质量浓度；
L-乳酸的光学纯度＝L-乳酸浓度/总乳酸浓度；
发酵产率＝总乳酸浓度/发酵总时间。
实验设3次重复，3次重复的平均值如表8所示。
表8不同发酵时间下的总乳酸产量和L-乳酸光学纯度
结果表明，当发酵培养基中葡萄糖浓度为180g/L时，37℃厌氧发酵37小时内总乳酸的产量为241g/L，L-乳酸的光学纯度为98％，发酵产率为6.5g/L·h。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种制备L-乳酸的方法及其专用菌剂
<130>CGGNARZ92418
<160>3
<210>1
<211>1440
<212>DNA
<213>鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
<400>1
cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga 60
agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt 120
tgtcggcgtg acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 180
aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt 240
tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag tgcatcggaa actgggaaac 300
ttgagtgcag aagaggacag tggaactaaa tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg 360
aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca 420
tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt 480
gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag 540
tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 600
gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct 660
gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 720
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca 780
gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 840
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa 900
cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta 960
ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg 1020
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca 1080
gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1140
gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200
cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa 1260
cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta 1320
cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta 1380
ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg 1440
<210>2
<211>1440
<212>DNA
<213>唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)
<400>2
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60
gaaactttct tacaccgaat gcttgcattc atcgtaagaa gttgagtggc ggacgggtga 120
gtaacacgtg ggtaacctgc ctaaaagaag gggataacac ttggaaacag gtgctaatac 180
cgtatatctc taaggatcgc atgatcctta gatgaaagat ggttctgcta tcgcttttag 240
atggacccgc ggcgtattaa ctagttggtg gggtaacggc ctaccaaggt gatgatacgt 300
agccgaactg agaggttgat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg 360
gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga 420
gtgaagaagg tcttcggatc gtaaaactct gttgttagag aagaacacga gtgagagtaa 480
ctgttcattc gatgacggta tctaaccagc aagtcacggc taactacgtg ccagcagccg 540
cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaaggg aacgcaggcg 600
gtcttttaag tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgga gtagtgcatt ggaaactgga 660
agacttgagt gcagaagagg agagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat 720
atggaagaac accagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggttcgaa 780
agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgct 840
aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cgcagctaac gcaataagca ttccgcctgg 900
ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc 1020
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc 1080
atggaagaac accagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gaggttcgaa 1140
agcgtgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgaatgct 1200
aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc cgcagctaac gcaataagca ttccgcctgg 1260
ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 1320
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc 1380
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctttgacc 1440
<210>3
<211>1440
<212>DNA
<213>副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400>3
agagtttgat gcctggctca ggatgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa 60
cgagttctcg ttgatgatcg gtgcttgcac cgaacttcaa catggaacga gtggcggacg 120
ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta agtgggggat aacatttgga aacagatgct 180
aataccgcat agatccaaga accgcatggt tcttggctga aagatggcgt aagctatcgc 240
ttttggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt aatggctcac caaggcgatg 300
atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 360
ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc 420
gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga atggtcggca 480
gagtaactgt tgtcggcgtg acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 540
cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 600
caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag cgcatcggaa 660
actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 720
agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 780
ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg 840
aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc 900
gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 960
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt 1020
ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt 1080
ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg 1140
aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc 1200
gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc cgcacaagcg 1260
gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt 1320
tgatcacctg agagatcagg tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggttt 1380
tgatcacctgagagatcagg tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggtta 1440
Claims (10)
1.一种制备L-乳酸的专用菌剂，其活性成分为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC№3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC№3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07CGMCC№3124。
2.一种制备L-乳酸的方法，是发酵培养鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC№3122、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SMB-06CGMCC№3123和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMB-07CGMCC№3124，得到L-乳酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)SMB-05 CGMCC№3122、所述唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)SMB-06 CGMCC№3123和所述副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)SMB-07 CGMCC№3124的cfu比为(1-3)∶(1-2)∶1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基每升的组成为：葡萄糖180～210g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HPO43g/L、KH2PO43g/L、乙酸钠2g/L、MgSO4·7H2O 0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25g/L、Tween-801ml/L、用于控制发酵液pH值的中和剂，其余为水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述用于控制发酵液pH值的中和剂为CaCO3或氨水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述用于控制发酵液pH值的中和剂为CaCO3，所述CaCO3在发酵培养的培养基中的终浓度为30g/L。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基的pH为5.0～5.5。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为35℃-42℃厌氧培养37-60小时。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为37℃厌氧培养37小时。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的方式为分批补料发酵培养；所述分批补料发酵培养为在发酵培养12小时后，每3小时补加5.8L浓度为1kg/L的葡萄糖。
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