CN104254599B - 应用副干酪乳杆菌菌株的生物保护 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物保护领域，尤其涉及保藏编号为DSM25612的副干酪乳杆菌CHCC14676菌株。而且，本发明涉及一种包含所述菌株的抗真菌组合物、一种包含所述菌株和至少一种鼠李糖乳杆菌菌株的抗真菌组合物、包含此种抗真菌组合物的食品产品、饲料产品和药品、一种制造此种食品产品、饲料产品和药品的方法、一种降低此种食品产品、饲料产品和药品的真菌和霉菌含量的方法以及所述抗真菌组合物的用途。

Description

应用副干酪乳杆菌菌株的生物保护
技术领域
本发明涉及生物保护领域，尤其涉及保藏编号为DSM25612的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CHCC14676菌株。而且，本发明涉及一种包含所述菌株的抗真菌组合物，一种包含所述菌株和至少一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株的抗真菌组合物，包含此种抗真菌组合物的食品产品、饲料产品和药品，一种制造此种食品产品、饲料产品和药品的方法，一种降低此种食品产品、饲料产品和药品的真菌和霉菌含量的方法，以及所述抗真菌组合物的用途。
技术背景
多年来，乳酸菌一直被用于延长食品产品的保存期。乳酸菌在发酵过程中产生乳酸和其他有机酸，从而降低所述食品产品的pH值，使其不适于诸如病原细菌、酵母和真菌的不需要的微生物的生长。
此外，有些乳酸菌也产生具有抗微生物活性的代谢物。
美国专利申请US2011/0045134涉及副干酪乳杆菌将抗真菌特性赋予发酵乳制品的用途。
欧洲专利申请EP1442113涉及詹氏丙酸杆菌(Propionibacterium jensenii)和诸如副干酪乳杆菌的乳杆菌的种(Lactobacillus sp.)的混合物，其具有抗微生物活性，用于生物保护。
但是，仍然需要作为单一菌株或与其他生物保护性菌株相结合的具有改善的抗真菌效果的生物保护剂。
发明内容
本发明的目的在于提供可作为生物保护剂的具有高效的新颖乳酸菌菌株。
本发明人通过大量的筛选和研究已经发现，与市场上商品化的生物保护性培养物相比，某些副干酪乳杆菌菌株对抗酵母和霉菌显著更高效。
本发明人已经进一步发现，某一组乳酸菌在与另一组乳酸菌组合时表现显著的协同抗微生物效果。令人惊讶的是，经组合的这两组细菌的抗微生物效果大于这两组细菌单独的效果的总和。
附图说明
图1显示了霉菌在含1.5％脂肪的酸奶中的生长，所述酸奶单独由起子培养物YF-L901(顶行)、由起子培养物YF-L901连同HOLDBACTM YM-B(中间行)和由起子培养物YF-L901连同副干酪乳杆菌CHCC14676发酵。以文本中提及的浓度从左到右分别添加目标污染物：短密青霉(Penicillium brevicompactum)(M1)、普通青霉(Penicillium commune)(M6)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)(M7)和光孢青霉(Penicillium glabrum)(M8)。所述酸奶已在7±1℃孵育了61天。
图2显示了向含1.5％脂肪的酸奶中添加的汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)分离菌的细胞计数，所述酸奶单独由起子培养物YF-L901(参照)或由起子培养物YF-L901连同HOLDBACTM YM-B培养物(HoldBac YM-B)，由起子培养物YF-L901连同HOLDBACTMYM-C培养物(HoldBac YM-C)，或由起子培养物YF-L901连同副干酪乳杆菌菌株CHCC14676(14676)一起发酵。酸奶储存在7±1℃并于适当的时间间隔进行分析。
图3显示了霉菌在平板上的生长，所述平板制备于单独由起子培养物(参照，第一幅图)、由起子培养物连同副干酪乳杆菌CHCC14676(第二幅图)、由起子培养物连同鼠李糖乳杆菌CHCC5366(第三幅图)，或由起子培养物连同副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366的组合(第四幅图)发酵的奶。以文本中提及的浓度从平板的左上顺时针移至左下分别添加目标污染物：纳地青霉(Penicillium nalgiovense)、普通青霉(Penicilliumcommune)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)和皮落青霉(Penicillium crustosum)。所述平板已在7±1℃孵育了12天。
图4显示了霉菌在平板上的生长，所述平板制备于单独由起子培养物(参照，第一幅图)、由起子培养物连同副干酪乳杆菌CHCC14676(第二幅图)、由起子培养物连同鼠李糖乳杆菌CHCC14226(第三幅图)、或由起子培养物连同副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC14226的组合(第四幅图)发酵的奶。以文本中提及的浓度从平板的左上顺时针移至左下分别添加目标污染物：纳地青霉(Penicillium nalgiovense)、普通青霉(Penicilliumcommune)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)和皮落青霉(Penicillium crustosum)。所述平板已在7±1℃孵育了12天。
图5显示了毛霉属(Mucor ssp.)在希腊式酸奶(Greek yoghurt)中的生长，所述希腊式酸奶制备于仅由起子培养物发酵的奶(左侧杯)，或者在鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676都存在时发酵的奶(右侧杯)。
图6显示了匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)在希腊式酸奶中的生长，所述希腊式酸奶制备于仅由起子培养物(R，即参照)，由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(YM-B)，由起子培养物和鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5366)，或由起子培养物和鼠李糖乳杆菌CHCC5366与副干酪乳杆菌CHCC14676的组合(5366+14676)发酵的奶。
图7显示了短密青霉(M1)、普通青霉(M6)、杂色曲霉(M7)和光孢青霉(M8)在酸奶油中的生长，所述酸奶油制备于仅由起子培养物(顶行)；由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(中间行)；或由起子培养物和副干酪乳杆菌CHCC14676与鼠李糖乳杆菌CHCC12697的组合(底行)发酵的奶。
图8显示了汉逊德巴利酵母在酸奶油中的生长，所述酸奶油制备于仅由起子培养物(参照)；由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(YM-B)；或由起子培养物、副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697(12697+14676)发酵的奶。
图9显示了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在白卤奶酪(white brinecheese)上的生长，所述白卤奶酪制备于仅由起子培养物(参照)；由起子培养物和HOLDBACTMYM-B(YM-B)；或由起子培养物、副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5366+14676)发酵的奶。
图10显示了马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)在白卤奶酪上的生长，所述白卤奶酪制备于仅由起子培养物(参照)；由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(YM-B)；或由起子培养物、副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5366+14676)发酵的奶。
图11显示了普通青霉在白卤奶酪上的生长，所述白卤奶酪制备于仅由起子培养物(R，即参照)；由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(YM-B)；或由起子培养物、副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5366+14676)发酵的奶。
图12显示了霉菌潘氏青霉(Penicillium paneum)在含1.5％脂肪的酸奶中的生长，所述酸奶制备于由单独的起子培养物(R，即参照)，由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(YM-B)，由起子培养物和鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5366)，或由起子培养物和鼠李糖乳杆菌CHCC5366与副干酪乳杆菌CHCC14676的组合(5366+14676)发酵的奶。
图13显示了霉菌皮落青霉在含1.5％脂肪的酸奶中的生长，所述酸奶制备于由单独的起子培养物(顶行)，由起子培养物和HOLDBACTM YM-B(第二行)，由起子培养物和鼠李糖乳杆菌CHCC5366(第三行)，或由起子培养物和鼠李糖乳杆菌CHCC5366与副干酪乳杆菌CHCC14676的组合(最后一行)发酵的奶。以100个孢子/杯的浓度添加目标污染物，而且所述酸奶已在7±1℃(左栏)、12±1℃(中栏)或22±1℃(右栏)孵育36天。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“乳酸菌”指革兰氏阳性的微需氧或厌氧的细菌，其发酵糖产生酸，包括乳酸为主要产生的酸。工业上最有用的乳酸菌属于“乳杆菌(Lactobacillales)”目，其包括乳球菌属(Lactococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属(Leuconostoc spp.)、伪明串珠菌属(Pseudoleuconostoc spp.)、小球菌属(Pediococcus spp.)、短杆菌属(Brevibacteriumspp.)和肠球菌属(Enterococcus spp.)。这些细菌经常单独或与其他乳酸菌组合被用作食品培养物。
术语“食品”旨在也包括奶酪。术语“奶酪”被理解为包含任何奶酪，包括硬质奶酪、半硬质奶酪和软质奶酪，诸如如下类型的奶酪：卡特吉奶酪(Cottage)、菲达奶酪(Feta)、切达奶酪(Cheddar)、帕尔玛奶酪(Parmesan)、莫萨里拉奶酪(Mozzarella)、埃门塔尔奶酪(Emmentaler)、丹博奶酪(Danbo)、高达奶酪(Gouda)、艾丹姆奶酪(Edam)、菲达式奶酪(Feta-type)、蓝奶酪(blue cheeses)、卤奶酪(brine cheese)、卡芒贝尔奶酪(Camembert)和布里奶酪(Brie)。本领域技术人员了解如何将凝结物转变成奶酪，可从文献中找到方法，参见例如Kosikowski,F.V和V.V.Mistry,“Cheese and Fermented Milk Foods”,1997,第三版，F.V.Kosikowski,L.L.C.Westport,CT.如本文所用，将具有低于1.7％(w/w)的NaCl浓度的奶酪称为“低盐奶酪”。
通常将包括乳杆菌种和乳球菌种的细菌的乳酸菌供应给乳品工业，其或者以冷冻或冻干培养物的形式用于批量起子增殖，或者以所谓“直投式”(“Direct Vat Set”)(DVS)培养物形式，旨在直接接种到发酵容器或发酵桶中用于生产诸如发酵奶产品或奶酪的乳制品。此种乳酸菌培养物一般被称为“起子培养物”或“起子”。
本文中的术语“中温菌”指在中等温度(15℃至40℃)下生长最旺盛的微生物。工业上最有用的中温细菌包括乳球菌属和明串珠菌属。本文中的术语“中温发酵”指在大约22℃至大约35℃的温度下的发酵。术语“中温发酵奶产品”指通过中温起子培养物的中温发酵所制备的发酵奶产品，并且包括诸如酪乳、酸乳(sour milk)、发酵奶(cultured milk)、斯美塔那酸奶油(smetana)、酸奶油和新鲜奶酪(诸如夸克奶酪、tvarog奶酪和奶油奶酪)的发酵奶产品。
本文中的术语“嗜热菌”指在高于43℃的温度生长最旺盛的微生物。工业上最有用的嗜热细菌包括链球菌属和乳杆菌属。本文中的术语“高温发酵”指在高于大约35℃(诸如大约35℃至大约45℃)的温度下的发酵。术语“高温发酵奶产品”指通过嗜热起子培养物的高温发酵所制备的发酵奶产品，并且包括诸如凝固型酸奶、搅拌型酸奶和饮用型酸奶的发酵奶产品。
术语“奶”应被理解为通过对诸如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼的任何哺乳动物进行挤奶而获得的乳汁分泌物。在一个优选的实施方案中，奶是牛奶。术语奶也包括由植物原料制造的蛋白质/脂肪溶液，例如大豆奶。
术语“奶底物”可以是可根据本发明的方法经历发酵的任何的生奶原料和/或加工奶原料。因此，有用的奶底物包括但不限于包含蛋白质的任何奶或类奶产品的溶液/悬液，诸如全脂奶或低脂奶、脱脂奶、酪乳、复原奶粉、炼乳、干奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、乳糖结晶母液、乳清蛋白浓缩物或奶油。显然，奶底物可能来源于任何哺乳动物，例如，作为基本上纯的哺乳动物奶或复原奶粉。
在发酵之前，可根据本领域中已知的方法对奶底物进行均质化和巴氏消毒。
如本文所用，“均质化”的意思是彻底混合以获得可溶的悬液或乳液。如果在发酵之前进行均质化，那么其目的是为了将奶脂肪破碎为较小的尺寸，使其不再与奶分离。这可以通过在高压下迫使奶穿过小孔而实现。
如本文所用，“巴氏消毒”的意思是对奶底物进行处理，以减少或消除诸如微生物的活有机体的存在。优选地，巴氏消毒是通过将指定温度维持指定时段而实现的。所述指定温度通常通过加热而实现。可以选择温度和持续时间，以杀死或灭活某些细菌，比如有害细菌。接下来可以进行快速冷却步骤。
本发明的方法中，“发酵”的意思是通过微生物的作用将碳水化合物转化为醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括将乳糖转化为乳酸。
打算用于乳制品生产中的发酵方法是众所周知的，而且本领域技术人员将了解如何选择合适的工艺条件，诸如温度、氧气、微生物的数量和特性，以及加工时间。显然，对发酵条件进行选择是为了有助于本发明的实现，即为了获得固态形式的乳制品(诸如奶酪)或液态形式的乳制品(诸如发酵奶产品)。
本发明的组合物所提供的优势在于，例如在食品产品、饲料产品和药品上以及在人类和哺乳动物中，选自真菌、细菌和其混合物的不需要的微生物能够被抑制。特别预期阻止和/或抑制诸如酵母和霉菌的真菌的生长。因此，在一个优选实施方案中，术语“抗微生物”应被理解为“抗真菌”。
本文中的术语“不需要的微生物”指病原微生物和/或能够使食品产品、饲料产品或药品变质的微生物，诸如细菌和真菌，诸如酵母。本发明的组合物所提供的优势在于，例如在食品产品、饲料产品和药品上以及在人类和哺乳动物中，选自真菌、细菌和其混合物的不需要的微生物能够被抑制。特别预期阻止和/或抑制诸如酵母和霉菌的真菌的生长。
与酵母和霉菌相关的术语“抑制”的意思是，例如，酵母和霉菌的生长或数量或浓度在例如包含根据本发明的菌株的食品产品中和/或其表面上比在不包含这样的菌株的食品产品中和/或其表面上低。
在本文中，术语“突变体”应该被理解为通过例如基因工程、辐射和/或化学处理手段从本发明的菌株衍生的菌株。优选地，所述突变体是一种功能等同的突变体，例如，与母菌株具有基本上相同或者改善的特性(例如关于抗真菌特性)的突变体。这样的突变体是本发明的一部分。特别地，术语“突变体”指通过使本发明的菌株经历任何常规使用的诱变处理而获得的菌株，或自发产生的突变体，所述诱变处理包括用诸如甲磺酸乙酯(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)的化学诱变剂处理、用UV光处理。突变体可能经历了数次诱变处理(单次处理应该被理解为一个诱变步骤和随后的筛选/选择步骤)，但是，目前优选进行不超过20次，或不超过10次，或不超过5次处理(或筛选/选择步骤)。在一个目前优选的突变体中，相比母菌株，其细菌基因组中少于5％，或少于1％，或甚至少于0.1％的核苷酸已被被另一种核苷酸取代，或被缺失。
除非本文中另有说明或通过上下文明确表示相反意思，在说明本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“a(一/一个/一种)”、“an(一/一个/一种)”和“该/所述”以及类似用语应该被理解为涵盖单数和复数。除非另有说明，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应该理解为开放式术语(即表示“包括但不限于”)。除非本文中另有说明，本文中说明的数值范围仅旨在用作单独引用落入该范围的每个离散数值的简单表述方法，并且每个离散数值都如同被在文中被单独引用那样结合于说明书中。除非本文中另有说明或通过上下文明确表示相反意思，本文中描述的所有方法都可以按照任何适当的顺序实施。除非另有声明，本文提供的任何和所有实施例或者举例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在用于更好地说明本发明，而不是作为对本发明的范围的限制。说明书中的所有语言都不应被理解为任何非要求保护的元素对于实施本发明是必要的。
本发明的实施方案和方面
本发明人已对植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的200个候选菌株进行筛选，以找到对抗诸如酵母和霉菌的广范围微生物的最有效的单一菌株或双菌株组合。
筛选在基于奶的基质中以尽可能模拟中温发酵奶产品的模型分析进行，所述基质中添加有含有或不含有生物保护性候选物的相关起子培养物，并且所述基质在与中温发酵奶产品相关的条件下被发酵。从中温发酵奶产品中分离出目标有机体。使用以下二者作为基准：从丹麦丹尼斯公司(Danisco A/C,Denmark)的HOLDBACTM培养物纯化的乳酸菌，以及含有乳酸菌和丙酸菌二者的完全HOLDBACTM YM-B和HOLDBACTM YM-C培养物。
所述模型分析描述于欧洲专利申请EP11161609.0。
在25℃检测时，发现副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中有17种候选菌株通常能够与所述基准乳酸菌相当地或较其更佳地抑制12种指示真菌。
在酸奶上检测时，副干酪乳杆菌的一个菌株，即以保藏编号DSM25612保藏于德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)的副干酪乳杆菌菌株CHCC14676，在抑制酵母和霉菌方面显示比商业可得的生物保护性培养物显著更佳。
所述菌株对抗酵母和霉菌的抑制效果可以如下文的实施例所描述的那样，通过将发酵奶产品在合适的温度下储存一段合适的存储时间来确定。
一般而言，应实施该方法的合适的温度取决于具体食品产品、饲料产品或药品通常被储存和/或制造的温度。通常储存所述产品的温度在5℃和26℃之间，优选地，所述温度为大约8℃。
在所述温度下的储存时间取决于所述食品产品、饲料产品或药品通常储存的时间(保存期)。储存时间通常是5-65天，优选7-60天，更优选7-28天，且甚至更优选地，所述储存时间为大约21天，且更优选高达60天或更多。
因此，本发明的第一方面涉及副干酪乳杆菌菌株，其选自由以下组成的组：以保藏编号DSM25612保藏于德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)的鼠李糖乳杆菌菌株CHCC14676，和由其衍生的突变菌株。
因此，除了上文提到的保藏菌株之外，本发明也涉及衍生自这一菌株的突变体，即，所述突变体已通过使用所述保藏菌株CHCC14676为起始材料获得。所述突变菌株可例如通过如下手段衍生自所述保藏菌株：基因工程、辐射、UV光、化学处理和/或诱导基因组变化的方法。根据本发明所述的突变体将抑制和/或阻止某些细菌或真菌、优选霉菌的生长。优选地，当在如实施例1中所描述的分析中，采用其生长将被抑制的短密青霉、普通青霉、杂色曲霉、汉逊德巴利酵母或光孢青霉的霉菌之一作为参照有机体进行测定时，所述突变体与其母菌株相比具有基本上至少80％或更多、至少90％或更多、至少95％或更多，或甚至高达100％或更多的抗真菌效果。
本领域技术人员清楚，通过采用所述保藏的菌株为起始材料，有经验的读者借助常规的诱变作用或再分离技术可常规地获得保持本文中所描述的相关特征和优势的进一步的突变体或其衍生物。因此，第一方面的术语“由其衍生的突变菌株”涉及通过使用所述保藏的菌株为起始材料所获得的突变菌株。
第二方面涉及一种抗真菌组合物，其包含至少一种根据本发明的第一方面的副干酪乳杆菌菌株，优选副干酪乳杆菌菌株CHCC14676。
当与不同的鼠李糖乳杆菌菌株组合测试副干酪乳杆菌菌株CHCC14676时，出乎意料地发现，这些组合甚至比单独的任一菌株更佳，即使在细胞的总浓度相同的情况下。在一个实施方案中，本发明涉及副干酪乳杆菌菌株CHCC14676与鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366的组合。在另一个实施方案中，本发明涉及副干酪乳杆菌菌株CHCC14676与鼠李糖乳杆菌菌株CHCC14226的组合。还在另一个实施方案中，本发明涉及副干酪乳杆菌菌株CHCC14676与鼠李糖乳杆菌菌株CHCC12697的组合。这些组合看起来比来自丹麦丹尼斯公司的基准培养物HOLDBACTM YM-B和HOLDBACTM YM-C更有效。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及抗微生物组合物且更优选涉及抗真菌组合物，所述组合物包含以保藏编号DSM25612保藏于德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)的副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体，以及至少一种鼠李糖乳杆菌菌株。优选地，所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株选自由保藏编号为DSM24616的鼠李糖乳杆菌菌株CHCC12697、保藏编号为DSM24652的鼠李糖乳杆菌菌株CHCC14226、保藏编号为DSM23035的鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366，和由这些保藏菌株衍生的突变菌株组成的组。
在本发明在一个方面因而提供一种抗微生物组合物且更优选抗真菌组合物，所述组合物包含副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体，以及鼠李糖乳杆菌菌株CHCC14226或其衍生的突变体。在另一方面，本发明提供一种抗微生物且更优选抗真菌的组合物，其包含至少副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或由其衍生的突变体，以及鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366或由其衍生的突变体。还在另一方面，本发明提供一种抗微生物组合物且更优选抗真菌组合物，所述组合物包含至少副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体，以及鼠李糖乳杆菌菌株CHCC12697或其衍生的突变体。优选地，本发明组合物中的所述副干酪乳杆菌菌株和所述鼠李糖乳杆菌菌株的组合在他们的抗微生物和/或抗真菌活性方面协同作用。
所述抗真菌组合物典型地包含浓缩形式的细菌，包括冷冻、干燥或冻干的浓缩物，所述浓缩形式的细菌典型地具有的活细胞浓度在每克组合物104到1012cfu(菌落形成单元)的范围，包括每克组合物至少104cfu，诸如至少105cfu/g，例如至少106cfu/g，诸如至少107cfu/g，例如至少108cfu/g，诸如至少109cfu/g，例如至少1010cfu/g，诸如至少1011cfu/g。因此，本发明的组合物优选以冷冻、干燥或冻干形式存在，例如，作为直投式(DVS)培养物。然而，如本文所用，所述组合物也可能是将所述冷冻、干燥或冻干的细胞浓缩物悬浮于诸如水或PBS缓冲液的液体基质中后所获得的液体。当本发明的组合物为悬液时，活细胞的浓度在每毫升组合物104到1012cfu(菌落形成单元)的范围，包括每毫升组合物至少104cfu，诸如至少105cfu/ml，例如至少106cfu/ml，诸如至少107cfu/ml，例如至少108cfu/ml，诸如至少109cfu/ml，例如至少1010cfu/ml，诸如至少1011cfu/ml。
所述组合物可含有防冻剂和/或常规添加剂作为进一步的成分，所述常规添加剂包括诸如酵母提取物、糖和维生素(例如维生素A、C、D、K或者维生素B族的维生素)的营养素。可添加到本发明的组合物中的合适的防冻剂是改善微生物的耐寒性的成分，诸如甘露醇、山梨醇、三聚磷酸钠、木糖醇、甘油、棉子糖、麦芽糖糊精、赤藓醇、苏糖醇、海藻糖、葡萄糖和果糖。其他添加剂可包括，例如碳水化合物、调味剂、矿物质、酶(例如粗制凝乳酶(rennet)、乳糖酶和/或磷脂酶)。
在包含副干酪乳杆菌菌株CHCC14676和鼠李糖乳杆菌菌株的本发明的组合物中，副干酪乳杆菌菌株CHCC14676和所述鼠李糖乳杆菌菌株之间的比例，例如副干酪乳杆菌细菌的浓度或数量与鼠李糖乳杆菌细菌的浓度或数量之间的比例，优选为1:100到100:1，优选为1:10到10:1。
本发明的抗真菌组合物可与容易被微生物降解和/或容易被酵母和霉菌污染的任何食品产品、饲料产品和药品相关使用。这些包括但不限于水果和蔬菜(包括衍生产品)、谷物和谷物衍生产品、乳制品、肉类、家禽类和海产类。在特别优选的实施方案中，所述组合物与乳制品和/或肉类和家禽类相关使用。在一个优选实施方案中，本发明的组合物用于在诸如酸奶、tvarog奶酪、酸奶油、奶油奶酪、白卤奶酪等乳制品的制备中作为添加剂。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物用于对抗真菌，诸如酵母和霉菌。这意味着所述组合物用于抑制和/或阻止在乳制品工业过程中，尤其是奶发酵过程中，导致污染的真菌的生长。本发明的组合物能够用于，例如抑制和/或阻止酵母的生长，诸如以下属的酵母：克鲁维酵母属(Klyveromyces)(例如马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis))、毕赤酵母属(Pichia)(例如发酵毕赤酵母(P.fermentans))、耶氏酵母属(Yarrowia)(例如解脂耶氏酵母(Y.lipolytica))、假丝酵母属(Candida)(例如清酒假丝酵母(C.sake))等；或者抑制和/或阻止霉菌的生长，诸如来自以下属的霉菌：青霉属(Penicillium)(例如纳地青霉、普通青霉、皮落青霉、短密青霉、光孢青霉)、毛霉属(Mucorspp.)、枝孢菌属(Cladiosporium ssp.)、曲霉属(Aspergillus)(例如杂色曲霉)、德巴利酵母属(Debaryomyces)(例如汉逊德巴利酵母(D.hansenii))等。特别优选的是，使用本发明的组合物抑制和/或阻止如下种的生长：马克斯克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、纳地青霉、枝孢菌属、普通青霉、毛霉属、短密青霉、杂色曲霉、皮落青霉、乳酸克鲁维酵母和/或汉逊德巴利酵母。
根据本发明的第二方面的抗真菌组合物也可以用作药品，优选用于治疗病原性真菌感染，诸如病原性酵母感染的药品。
在第三方面，本发明涉及包含根据本发明的第一方面的副干酪乳杆菌菌株或根据本发明的第二方面的抗真菌组合物的食品产品、饲料产品或药品。
在一个优选实施方案中，所述食品产品、饲料产品或药品为食品产品。
在一个更优选的实施方案中，此种食品产品选自由水果和水果衍生产品、蔬菜和蔬菜衍生产品、谷物和谷物衍生产品、乳制品、肉类、家禽类和海产品类和其混合物组成的组。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述食品产品是乳制品，优选中温发酵奶产品或高温发酵奶产品，诸如新鲜奶酪、酸奶、酸奶油或tvarog奶酪。
在另一个优选实施方案中，所述食品产品是肉类或家禽类。
在一个优选实施方案中，所述食品产品、饲料产品或药品是药品。
优选地，所述药品是可用于对人或动物施用根据本发明的第二方面的抗真菌组合物，以抑制病原性微生物和减轻与病原性微生物相关的症状的产品。此种症状的实例包括与酵母感染相关的症状。在这类实施方案中，所述药品可以是包含抗真菌组合物的单位剂型。优选地，所述单位剂型是胶囊或片剂。然而，所述单位剂型也可以适合于施用给粘膜或皮肤，并且因此以糊剂、乳膏、油膏等形式存在。
本发明的第四方面涉及一种用于制造根据本发明的第三方面的食品产品、饲料产品或药品的方法，所述方法包括在所述食品产品、饲料产品或药品的制造过程中添加至少一种根据本发明的第一方面的副干酪乳杆菌菌株或根据本发明的第二方面的抗真菌组合物。优选地，所述方法还包括在制造过程中控制制造参数的步骤，以使得所述至少一种副干酪乳杆菌菌株的浓度维持恒定或提高。
在一个优选实施方案中，所述至少一种副干酪乳杆菌菌株的浓度为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×106cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×106cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少1×105cfu/cm2。优选地，所述至少一种副干酪乳杆菌菌株的浓度为所述食品产品、饲料产品或药品的至少5×106cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少5×106cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少5×105cfu/cm2，诸如为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×107cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×107cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少1×106cfu/cm2，诸如为所述食品产品、饲料产品或药品的至少5×107cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少5×107cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少5×106cfu/cm2。
当通过添加包含副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体和至少一种鼠李糖乳杆菌菌株来制造所述食品产品、饲料产品或药品时，副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体的浓度和/或所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株的浓度各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×106cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×106cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少1×105cfu/cm2。优选地，副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体的浓度和/或所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株的浓度各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少5×106cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少5×106cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少5×105cfu/cm2。在一个进一步的实施方式中，副干酪乳杆菌菌株CHCC14676或其衍生的突变体的浓度和/或所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株的浓度各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×108cfu/g或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的至少1×108cfu/ml，或各自为所述食品产品、饲料产品或药品的表面的至少1×107cfu/cm2。
在一个优选实施方案中，在制造过程中控制制造参数，使得副干酪乳杆菌菌株CHCC14676(或其衍生的突变体)和所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株的浓度提高或保持恒定。
根据本发明的抗真菌组合物最容易通过与可掺合的食品产品、饲料产品或药品混合和/或施加到可掺合的食品产品、饲料产品或药品上而使用，但是，处理固体食品产品的表面或例如通过注射处理这类产品的内部也应当是有效的。还在其它实施方案中，所述组合物可以作为腌泡汁(marinade)、滚面包屑(breading)、擦调味料(seasoning rub)、挂浆(glaze)、着色剂混合物等应用，关键的标准是经受细菌降解及酵母和霉菌污染的表面可以接触到所述抗真菌组合物。还在其它实施方案中，通过将组合物应用于食品包装并且随后将包装应用于食品表面，可以将所述组合物间接地与食品表面接触。所要使用的最佳量将取决于将要处理的特定食品产品的组成和用于将组合物施用至食品表面的方法，但可以通过简单实验确定。
在一个更优选的实施方案中，所述方法包括一个或多个发酵步骤，并且至少一种副干酪乳杆菌菌株或所述抗真菌组合物可以在此一个或多个发酵步骤之前、期间或之后被添加到食品产品、饲料产品或药品中。
优选地，所述方法包括在存在至少一种根据本发明的副干酪乳杆菌菌株的情况下以一段时间发酵底物，诸如奶底物，所述时间足以使得所述至少一种根据本发明的副干酪乳杆菌菌株表现抗真菌活性。这一抗真菌活性具有抑制酵母和/或霉菌在用所述至少一种菌株发酵的产品中生长的效果。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述方法包括用起子培养物发酵奶底物，所述起子培养物包含选自以下属的至少一种菌株：乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属和明串珠菌属，诸如至少一种保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)菌株和至少一种嗜热链球菌菌株(Streptococcus thermophilus)，或诸如至少一种乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)菌株、至少一种肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)菌株和至少一种乳酸乳球菌双乙酰亚种(Lactococcus lactis subsp.diacetylactis)菌株。
本发明的第五方面涉及通过根据本发明的第四方面所述的方法可获得的食品产品。
本发明的第六方面涉及根据第一方面的副干酪乳杆菌菌株或根据第二方面的抗真菌组合物用于制备食品产品、饲料产品或药品的用途。优选地，通过使用根据第一方面的副干酪乳杆菌菌株或根据第二方面的抗真菌组合物所生产的食品产品为奶酪，诸如卡特吉奶酪、菲达奶酪、切达奶酪、帕尔玛奶酪、莫萨里拉奶酪、埃门塔尔奶酪、丹博奶酪、高达奶酪、艾丹姆奶酪、菲达式奶酪、蓝奶酪、卤奶酪、卡芒贝尔奶酪或布里奶酪。
本发明最后的方面涉及根据第一方面的副干酪乳杆菌菌株或根据第二方面的抗真菌组合物用于抑制酵母和霉菌的生长的用途，尤其在食品产品和饲料产品中。
下文通过非限制性实施例描述本发明的实施方案。
实施例
实施例1：用副干酪乳杆菌CHCC14676在酸奶上进行的攻击研究
为了肉眼检验副干酪乳杆菌菌株CHCC14676对于不同的霉菌——短密青霉、普通青霉、杂色曲霉和光孢青霉——的抑制效果，制备了含1.5％脂肪的酸奶：
95℃±1℃下在1L的瓶子中水浴热处理均质奶(1.5％脂肪)5分钟，并立即冷却。以0.02％接种市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS YF-L901)。用HOLDBACTM YM-B(20DCU/100L)或副干酪乳杆菌CHCC14676(1×107CFU/ml)进一步接种奶，并且一个瓶子用作参照且仅用起子培养物接种。
在43℃±1℃下发酵奶直至pH达到4.60±0.1。将得到的酸奶倾倒入杯子(100g)中并在7℃±1℃下储存。
在酸奶制备一天后，将不同霉菌作为表面污染物一式两份地接种到酸奶杯中，在酸奶表面上形成一个菌斑，目标为100个孢子/菌斑。在7℃±1℃下储存45天后目测评估霉菌的生长。
该酸奶测试的结果呈现于图1中，图1显示短密青霉(M1)、普通青霉(M6)、杂色曲霉(M7)和光孢青霉(M8)在由仅使用起子培养物YF-L901发酵的奶制备的酸奶上(顶行)或由使用起子培养物和HOLDBACTM YM-B培养物发酵的奶制备的酸奶上(中间行)都良好地生长。相比之下，当副干酪乳杆菌CHCC14676存在于奶发酵过程中时(底行)，所有测试的霉菌的生长都被抑制了。
实施例2：副干酪乳杆菌CHCC14676对抗汉逊德巴利酵母的抑制效果的定量测定
为了定量检验副干酪乳杆菌CHCC14676对于汉逊德巴利酵母的抑制效果，制备了酸奶：
95℃±1℃下在1L瓶子中水浴热处理均质奶(1.5％脂肪)5分钟并立即冷却。以0.02％接种市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS YF-L901)。用HOLDBACTM YM-B(20DCU/100L)、HOLDBACTMYM-C(10DCU/100L)或副干酪乳杆菌CHCC14676(1×107CFU/g)进一步接种奶，并且一个瓶子用作参照且仅用起子培养物接种。
在43℃±1℃下发酵奶直至pH达到4.60±0.1。将得到的酸奶倾倒入杯子(100g)中并在7℃±1℃下储存。
酸奶制备一天后，用1.00ml/杯的酵母一式两份地在杯中接种，目标为20CFU/g。将酵母均匀地分散到酸奶中。将杯子盖上盖储存在7℃±1℃下，并通过以下方式以合适的时间间隔针对汉逊德巴利酵母的污染程度进行分析：将1ml酸奶和另外的在盐水蛋白胨(saline peptone)中制备的适当的1倍稀释液平板接种到酵母葡萄糖氯霉素(YGC)琼脂上，随后在25℃下供氧孵育5天。
如图2中所说明，当在发酵之前与起子培养物YF-L901一起接种时，在存在副干酪乳杆菌菌株CHCC14676的情况下，汉逊德巴利酵母的生长受到抑制。所述菌株比市售培养物HOLDBACTM YM-B和HOLDBACTM YM-C导致显著更高的抑制。
实施例3：单独的副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366和其组合对抗不同的霉菌污染物的抑制效果的半定量测定
为了对单独的副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366和其组合进行半定量检验，使用琼脂分析，模拟酸奶的制造过程和产物：
在95℃下热处理均质奶(1.5％w/v脂肪)5分钟，并立即冷却。以0.02％接种市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS YC-350)，并将奶分配到220ml瓶子中。以1×107CFU/ml的总浓度在瓶子中分别进一步接种副干酪乳杆菌CHCC14676、鼠李糖乳杆菌CHCC5366和这两种菌株的组合。除了起子培养物未进行进一步接种的一个瓶子被用作参照。此外，在所有瓶子中添加5％的溴甲酚紫和溴甲酚绿pH指示剂用于对酸化速度进行指示，和用于使基质获得蓝色/绿色，这将使得目标酵母和霉菌的后续生长可更容易地检测。所有的瓶子都在水浴中在43±1℃下孵育，并在这些条件下发酵直至pH达到4.60±0.1。发酵之后，立即在冰上冷却瓶子并剧烈振荡以破碎凝结物。然后将发酵奶升温到40℃的温度并添加到40ml的5％无菌琼脂溶液中，所述无菌琼脂溶液已经熔化并被冷却到60℃。然后将该溶液倾倒入无菌培养皿中，并在LAF工作台中干燥平板30分钟。
将适当稀释的选定霉菌纳地青霉(10×)、普通青霉(100×)、杂色曲霉(100×)和皮落青霉(100×)的完全长出的孢子悬液点样到平板上。将平板在7℃下孵育并以合适且规律的时间间隔检查霉菌的生长。
琼脂分析的结果呈现于图3中，图3显示所有测试的霉菌在由仅使用起子培养物发酵的奶制得的琼脂平板上(参照)都非常好地生长。然而，当副干酪乳杆菌CHCC14676或鼠李糖乳杆菌CHCC5366存在于奶发酵过程中时，得到的平板强烈地减少所有霉菌的生长。此外，当副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC5366组合存在于奶发酵过程中时，观察到尤其对于点样到平板上的普通青霉、杂色曲霉和皮落青霉的甚至更强烈的抑制。
实施例4：单独的副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC14226和其组合对抗不同的霉菌污染物的抑制效果的半定量测定
为了对单独的副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC14226和其组合进行半定量检验，使用琼脂分析，模拟酸奶的制造过程和产物：
在95℃下热处理均质奶(1.5％w/v脂肪)5分钟，并立即冷却。以0.02％接种市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVSMild)，并将奶分配到220ml瓶子中。以1×107CFU/ml的总浓度在瓶子中分别进一步接种副干酪乳杆菌CHCC14676、鼠李糖乳杆菌CHCC14226和这两种菌株的组合。除了起子培养物未进行进一步接种的一个瓶子被用作参照。此外，在所有瓶子中添加5％的溴甲酚紫和溴甲酚绿pH指示剂用于对酸化速度进行指示，和用于使基质获得蓝色/绿色，这将使得目标酵母和霉菌的后续生长可更容易地检测。所有的瓶子都在水浴中在43±1℃下孵育，并在这些条件下发酵直至pH达到4.60±0.1。发酵之后，立即在冰上冷却瓶子并剧烈振荡以破碎凝结物。然后将发酵奶升温到40℃的温度并添加到40ml的5％无菌琼脂溶液中，所述无菌琼脂溶液已经熔化并被冷却到60℃。然后将该溶液倾倒入无菌培养皿中，并在LAF工作台中干燥平板30分钟。
将适当稀释的选定霉菌纳地青霉(10×)、普通青霉(100×)、杂色曲霉(100×)和皮落青霉(100×)的完全长大的孢子悬液点样到平板上。将平板在7℃下孵育并以合适且规律的时间间隔检查霉菌的生长。
琼脂分析的结果呈现于图4中，图4显示所有测试的霉菌在由仅使用起子培养物发酵的奶制得的琼脂平板(参照)上都非常好地生长。然而，当副干酪乳杆菌CHCC14676或鼠李糖乳杆菌CHCC14266存在于奶发酵过程时，得到的平板强烈地减少所有霉菌的生长。此外，当副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC14266组合存在于奶发酵过程中时，观察到对于点样到平板上的普通青霉、杂色曲霉和皮落青霉的甚至更强烈的抑制。
实施例5：用组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676在希腊式酸奶上进行的攻击研究
为了肉眼检验组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676对于毛霉属的抑制效果，基本上如下制备希腊式酸奶：
用市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVSYF-L901)以0.02％接种巴氏消毒的1.5％脂肪奶。仅用起子培养物接种的一批用作参照。另一批进一步用鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366(5×106CFU/g)和副干酪乳杆菌菌株CHCC14676(5×106CFU/g)的组合接种。
在43℃±1℃下发酵奶至最终pH 4.55(6-7小时)。随后用2巴的反压将酸奶冷却到25℃±1℃并储存在6℃±1℃。
在酸奶制备后一天，通过在酸奶表面上涂一个菌斑，将毛霉属作为表面污染物一式两份地接种到酸奶杯中，目标接种浓度为100个孢子/菌斑。在22℃±1℃下储存15天后目测评估霉菌的生长。
该希腊式酸奶测试的结果呈现于图5中，图5显示毛霉属在由仅使用起子培养物(左杯)发酵的奶制得的酸奶上良好地生长。相比之下，当鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676存在于奶发酵过程中时(右杯)，毛霉属的生长被抑制。
实施例6：用鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676的组合在希腊式酸奶上的第二次攻击研究
为了肉眼检验鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676的组合对于黑根霉菌(black bread mold)匍枝根霉的抑制效果，基本上如下制备希腊式酸奶：
用市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVSYF-L901)以0.02％接种巴氏消毒的1.5％脂肪奶。用HOLDBACTM YM-B(10DCU/100L)、用鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366(1×107CFU/g)，或用鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366(5×106CFU/g)和副干酪乳杆菌菌株CHCC14676(5×106CFU/g)的组合进一步接种奶。一批用作参照并且仅用起子培养物接种。
在43℃±1℃下发酵奶至最终pH 4.55(6-7小时)。随后用2巴的反压将酸奶冷却到25℃±1℃并储存在6℃±1℃。
在酸奶制备后一天，通过酸奶表面上途一个菌斑，将匍枝根霉作为表面污染物一式两份地接种到酸奶杯中，目标污染为100个孢子/菌斑。在7℃±1℃下储存42天后目测评估霉菌的生长。
该希腊式酸奶测试的结果呈现于图6中，图6显示匍枝根霉在由仅使用起子培养物发酵的奶制得的酸奶(“R”，即参照)上、或由使用起子培养物和HOLDBACTM YM-B培养物(YM-B)发酵的奶制得的酸奶上良好地生长。然而，当鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5366)存在时，匍枝根霉的生长被显著抑制。当鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676都存在于奶发酵过程中时(5366+14676)，匍枝根霉的生长几乎被完全抑制。
实施例7：用组合的副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697在酸奶油上的攻击研究
为了肉眼检验副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697的组合对于不同的霉菌的生长的抑制效果，基本上如下制备了酸奶油：
在巴氏消毒的高脂奶中以0.01％接种市售的异型发酵起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS DSG-2000)。用HOLDBACTM YM-B(10DCU/100L)或用副干酪乳杆菌CHCC14676(2.5×106CFU/g)和鼠李糖乳杆菌CHCC12697(2.5×106CFU/g)的组合进一步接种奶。一批用作参照并且仅用起子培养物接种。
在28℃±1℃下发酵奶直到pH达到4.60±0.05，并对酸奶油进行后处理。搅拌酸奶油并冷却到20℃±1℃并在7℃±1℃下储存。
在酸奶油制备一天后，通过在酸奶油表面上涂一个菌斑，将不同霉菌作为表面污染物一式两份地接种到酸奶油杯中，目标浓度为100个孢子/菌斑。在7℃±1℃下储存61天后目测评估霉菌的生长。
该酸奶油测试的结果呈现于图7中，图7显示短密青霉(M1)、普通青霉(M6)、杂色曲霉(M7)和光孢青霉(M8)在由仅使用起子培养物发酵的奶制得的酸奶油(顶行)上、或由使用起子培养物和HOLDBACTM YM-B培养物发酵的奶制得的酸奶油(中间行)上都良好地生长。相比之下，当在副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697存在于奶发酵过程中时(底行)，所有测试的霉菌的生长都被抑制了。
实施例8：副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697的组合对抗酸奶油中的汉逊德巴利酵母的抑制效果的定量测定。
为了定量检验副干酪乳杆菌菌株CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697的组合对抗汉逊德巴利酵母的抑制效果，基本上如下制备了酸奶油：
在巴氏消毒的高脂奶中以0.01％接种市售的异型发酵起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS DSG-2000)。用HOLDBACTM YM-B(10DCU/100L)或用副干酪乳杆菌CHCC14676(2.5×106CFU/g)和鼠李糖乳杆菌CHCC12697(2.5×106CFU/g)的组合进一步接种奶。一批用作参照并且仅用起子培养物接种。
在28℃±1℃下发酵奶直到pH达到4.60±0.05，并对酸奶油进行后处理。搅拌酸奶油并冷却到20℃±1℃并在7℃±1℃下储存。
在酸奶油制备一天后，将1.00毫升/杯的酵母一式两份地接种到杯中，目标为20CFU/g。将酵母均匀地分散在酸奶油中。将杯子盖上盖储存在7℃±1℃，并且通过以下方式以合适的时间间隔针对汉逊德巴利酵母的污染程度进行分析：将1毫升酸奶油和另外的在盐水蛋白胨中制备的适当的1倍稀释液平板接种到酵母葡萄糖氯霉素(YGC)琼脂上，随后在25℃下供氧孵育5天。
如图8中所说明，当在发酵之前与起子培养物DSG-2000一起接种时，在存在副干酪乳杆菌CHCC14676和鼠李糖乳杆菌CHCC12697的组合的情况下，汉逊德巴利酵母的生长受到抑制。所述菌株比市售培养物HOLDBACTM YM-B导致显著更高的抑制。
实施例9：用组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676在白卤奶酪上的攻击研究
为了定量检验组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676对抗酿酒酵母的抑制效果，制备了白卤奶酪：
用市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的FD-DVS SafeIT-1)以每1000升(l)奶40U接种巴氏消毒且标准化的奶。用HOLDBACTM YM-B(10DCU/100L)或用鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366(5×106CFU/g)和副干酪乳杆菌菌株CHCC14676(5×106CFU/g)的组合进一步接种奶。一批用作参照且仅接种起子培养物。在36℃±1℃下，采用Chy-Max plus(从丹麦的Chr.Hansen A/S获得)以每1000升(l)220毫升(ml)对奶进行粗制凝乳酶处理90分钟，然后进行切割。在pH 6.0时，将凝乳用泵输送到模具中并排液，以达到最终pH 4.8-4.7(20-24小时)。将奶酪添加到含有冷卤水(8％)的罐中并在5℃±1℃下储存。
在白卤奶酪制备后一天，将酵母一式两份地接种到所述罐中，目标为20CFU/ml。将酵母均匀地分散在卤水中。将杯子盖上盖储存在7℃±1℃下，最长达40天，并且通过以下方式以合适的时间间隔针对酿酒酵母的污染程度分析10g：将在盐水蛋白胨中制备的适当的1倍稀释液平板接种到酵母葡萄糖氯霉素(YGC)琼脂上，随后在25℃下供氧孵育5天。
如图9中所说明，当与起子培养物SafeIT-1一起接种时，在存在组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676的情况下，酿酒酵母的生长被抑制。所述菌株比市售培养物HOLDBACTM YM-B导致显著更高的抑制。
实施例10：用组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676在白卤奶酪上的第二次攻击研究
为了定量检验组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676对抗马克斯克鲁维酵母的抑制效果，如实施例1中的描述制备了白卤奶酪，例外之处在于所述罐用马克斯克鲁维酵母作为酵母污染物来接种：
如图10中所说明，当与起子培养物SafeIT-1一起接种时，在存在组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676的情况下，马克斯克鲁维酵母的生长被抑制。所述菌株比市售培养物HOLDBACTM YM-B导致显著更高的抑制。
实施例11：用组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676在白卤奶酪上的第三次攻击研究
为了肉眼检验组合的鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676对抗普通青霉的抑制效果，如实施例1中的描述制备了白卤奶酪：
在白卤奶酪制备7天后，将奶酪从卤水中移出，并且将普通青霉作为表面污染物一式两份地接种到奶酪上，在奶酪表面上形成三个菌斑，目标为100个孢子/菌斑。在7℃±1℃下储存12天和随后在12℃±1℃下储存16天后，目测评估两个不同的普通青霉分离株的生长。
该白卤奶酪测试的结果呈现于图11中，图11显示两个普通青霉分离株在由仅使用起子培养物接种的奶制得的白卤奶酪(左)上良好地生长。相比之下，当鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676存在于奶酪生产过程中时(右)，普通青霉的生长被强烈抑制。
实施例12：用鼠李糖乳杆菌CHCC5366和CHCC14676在酸奶上的对抗潘氏青霉的攻击研究
为了肉眼检验单独的鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366或其与副干酪乳杆菌CHCC14676组合对于霉菌潘氏青霉的抑制效果，制备了含有1.5％脂肪的酸奶：
95℃±1℃下在1L的瓶子中水浴热处理均质奶(1.5％脂肪)5分钟，并立即冷却。以0.02％接种市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS YF-L901)。用HOLDBACTM YM-B(20DCU/100L)，单独用鼠李糖乳杆菌CHCC5366(1×107CFU/ml)，或用鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5×106CFU/ml)与副干酪乳杆菌CHCC14676(5×106CFU/ml)的组合进一步接种奶。一个瓶子用作参照且仅用起子培养物接种。
在43℃±1℃下发酵奶直至pH达到4.60±0.1。将得到的酸奶倾倒入杯(100g)中并在7℃±1℃下储存。
在酸奶制备一天后，将不同霉菌作为表面污染物一式两份地接种到酸奶杯中，在酸奶表面上形成一个菌斑，目标为100个孢子/菌斑。在7℃±1℃下储存28天后目测评估霉菌的生长。
该酸奶测试的结果呈现于图12中，图12显示潘氏青霉在由仅使用起子培养物YF-L901发酵的奶制得的酸奶上、或由使用起子培养物和HOLDBACTM YM-B培养物发酵的奶制得的酸奶上都良好地生长。相比之下，当鼠李糖乳杆菌CHCC5366存在于奶发酵过程中时，潘氏青霉的生长强烈减少，而且，鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676的组合导致甚至更强烈的潘氏青霉的生长抑制。
实施例13：用鼠李糖乳杆菌CHCC5366和CHCC14676在不同储存温度下在酸奶上的攻击研究
为了肉眼检验单独的鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366或其与副干酪乳杆菌CHCC14676组合在不同储存温度下对于霉菌皮落青霉的抑制效果，制备了含有1.5％脂肪的酸奶：
95℃±1℃下在1L的瓶子中水浴热处理均质奶(1.5％脂肪)5分钟，并立即冷却。以0.02％接种市售起子培养物(可从丹麦的Chr.Hansen A/S获得的F-DVS YF-L901)。用HOLDBACTM YM-B(20DCU/100L)，单独用鼠李糖乳杆菌CHCC5366(1×107CFU/ml)，或用鼠李糖乳杆菌CHCC5366(5×106CFU/ml)与副干酪乳杆菌CHCC14676(5×106CFU/ml)的组合进一步接种奶。一个瓶子用作参照且仅用起子培养物接种。
在43℃±1℃下发酵奶直至pH达到4.60±0.1。将得到的酸奶倾倒入杯(100g)中并在7℃±1℃下储存。
在酸奶制备一天后，将皮落青霉作为表面污染物一式两份地接种到酸奶杯中，在酸奶表面上形成一个菌斑，目标为100个孢子/菌斑。在7℃±1℃、12℃±1℃或22℃±1℃下储存36天后目测评估霉菌的生长。
该酸奶测试的结果呈现于图13中，图13显示皮落青霉在由仅使用起子培养物YF-L901发酵的奶制得的酸奶上、或由使用起子培养物和HOLDBACTM YM-B培养物发酵的奶制得的酸奶上在所有储存温度下都良好地生长。相比之下，当鼠李糖乳杆菌CHCC5366单独或与副干酪乳杆菌CHCC14676组合存在于奶发酵过程中时，在7℃±1℃和12℃±1℃储存36天的两种情况下，皮落青霉的生长被完全阻止。在22℃±1℃储存的情况下，皮落青霉的生长在存在鼠李糖乳杆菌CHCC5366的情况下强烈地减少，并且在存在鼠李糖乳杆菌CHCC5366和副干酪乳杆菌CHCC14676组合的情况下甚至更强烈地减少。
保藏物和专家解决方案
申请人要求在本专利的授权日之前，以下声明的保藏微生物的样品仅可供专业人士使用。
副干酪乳杆菌菌株CHCC14676于2012年2月2日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)并且被指定保藏编号DSM25612。
鼠李糖乳杆菌菌株CHCC5366于2009年10月14日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)并且被指定保藏编号DSM23035。
鼠李糖乳杆菌菌株CHCC12697于2011年3月1日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)并且被指定保藏编号DSM24616。
鼠李糖乳杆菌菌株CHCC14226于2011年3月15日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSMZ)(Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig)并且被指定保藏编号DSM24562。
保藏物是根据“国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约”准备的。
参考文献
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Claims (20)

1.一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)菌株，其为以保藏编号DSM25612保藏于德国微生物与细胞培养物保藏中心的副干酪乳杆菌菌株CHCC14676。
2.一种抗真菌组合物，其包含根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株。
3.一种抗真菌组合物，其包含根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株和至少一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。
4.根据权利要求3所述的抗真菌组合物，其中所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株选自由以下组成的组：保藏编号为DSM24616的鼠李糖乳杆菌CHCC12697、保藏编号为DSM24652的鼠李糖乳杆菌CHCC14226、以及保藏编号为DSM23035的鼠李糖乳杆菌CHCC5366。
5.一种食品产品，其包含根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物。
6.根据权利要求5所述的食品产品，其包含有效赋予所述食品产品抗真菌特性的量的根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的食品产品，其中所述食品产品选自由以下组成的组：水果和水果衍生产品、蔬菜和蔬菜衍生产品、谷物和谷物衍生产品、乳制品和肉类和其混合物。
8.根据权利要求5或权利要求6所述的食品产品，其中所述食品产品选自由以下组成的组：家禽类和海产类。
9.根据权利要求7所述的食品产品，其中所述食品产品为乳制品，且所述乳制品为中温发酵奶产品或高温发酵奶产品。
10.根据权利要求9所述的食品产品，其中所述乳制品为酸奶或酸奶油。
11.一种饲料产品，其包含根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物。
12.一种药品，其包含根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物。
13.一种制造食品产品、饲料产品或药品的方法，其包括在制造过程中将根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物添加到所述食品产品、饲料产品或药品中，并且在制造过程中控制制造参数，使得该副干酪乳杆菌菌株的浓度保持恒定或提高。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述副干酪乳杆菌菌株的浓度为每g所述食品产品、饲料产品或药品至少1×106cfu或各自为每ml所述食品产品、饲料产品或药品至少1×106cfu，或每cm2的所述食品产品、饲料产品或药品的表面至少1×105cfu。
15.根据权利要求13所述的方法，其包括：
(a)在制造所述食品产品、饲料产品或药品的过程中添加根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物，使得所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌菌株的浓度各自为每g所述食品产品、饲料产品或药品至少1×106cfu或每ml所述食品产品、饲料产品或药品至少1×106cfu，或每cm2的所述食品产品、饲料产品或药品的表面至少1×105cfu；和
(b)在制造过程中控制制造参数，使得所述至少一种鼠李糖乳杆菌菌株和/或所述副干酪乳杆菌菌株的浓度提高或保持恒定。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个发酵步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括用起子培养物发酵奶底物，所述起子培养物包含选自以下属的至少一种菌株：乳杆菌(Lactobacillus)属、链球菌(Streptococcus)属、乳球菌(Lactococcus)属和明串珠菌(Leuconostoc)属。
18.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物用于制备食品产品、饲料产品或药品的用途。
19.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物用于抑制真菌和霉菌的生长的非治疗用途。
20.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌菌株或根据权利要求2至4中的任一项所述的抗真菌组合物在制备用于抑制真菌和霉菌的生长的药物中的用途。
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