EA036321B1 - Штамм lactobacillus paracasei chcc12777 dsm24651, обладающий противогрибковыми свойствами - Google Patents

Штамм lactobacillus paracasei chcc12777 dsm24651, обладающий противогрибковыми свойствами Download PDF

Info

Publication number
EA036321B1
EA036321B1 EA201891030A EA201891030A EA036321B1 EA 036321 B1 EA036321 B1 EA 036321B1 EA 201891030 A EA201891030 A EA 201891030A EA 201891030 A EA201891030 A EA 201891030A EA 036321 B1 EA036321 B1 EA 036321B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cfu
lactobacillus paracasei
food
strain
milk
Prior art date
Application number
EA201891030A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201891030A3 (ru
EA201891030A2 (ru
Inventor
Тина Хорнбек
Майке Лисберг
Силья Кей Диемер
Original Assignee
Кр. Хансен А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2012/056384 external-priority patent/WO2012136830A1/en
Application filed by Кр. Хансен А/С filed Critical Кр. Хансен А/С
Publication of EA201891030A2 publication Critical patent/EA201891030A2/ru
Publication of EA201891030A3 publication Critical patent/EA201891030A3/ru
Publication of EA036321B1 publication Critical patent/EA036321B1/ru

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23BPRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B4/00General methods for preserving meat, sausages, fish or fish products
    • A23B4/14Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12
    • A23B4/18Preserving with chemicals not covered by groups A23B4/02 or A23B4/12 in the form of liquids or solids
    • A23B4/20Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B4/22Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C13/00Cream; Cream preparations; Making thereof
    • A23C13/12Cream preparations
    • A23C13/16Cream preparations containing, or treated with, microorganisms, enzymes, or antibiotics; Sour cream
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02Making cheese curd
    • A23C19/032Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/06Treating cheese curd after whey separation; Products obtained thereby
    • A23C19/068Particular types of cheese
    • A23C19/076Soft unripened cheese, e.g. cottage or cream cheese
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23CDAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A23C9/158Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives containing vitamins or antibiotics
    • A23C9/1585Antibiotics; Bacteriocins; Fungicides from microorganisms
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K10/00Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23KFODDER
    • A23K10/00Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571Microorganisms; Enzymes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74Bacteria
    • A61K35/741Probiotics
    • A61K35/744Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10Antimycotics
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11Lactobacillus
    • A23V2400/165Paracasei
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23VINDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11Lactobacillus
    • A23V2400/175Rhamnosus
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225Lactobacillus
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215Microorganisms
    • Y10S435/822Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/853Lactobacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)

Abstract

Изобретение относится к штамму Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651, обладающему противомикробными свойствами. Кроме того, настоящее изобретение относится к противогрибковой композиции, содержащей этот штамм, пищевым, кормовым и фармацевтическим продуктам, содержащим указанный штамм или противогрибковую композицию, способу получения таких пищевых, кормовых и фармацевтических продуктов и к применению указанных штамма и противогрибковой композиции для приготовления пищевого, кормового или фармацевтического продукта и для ингибирования роста дрожжей и плесневых грибов.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биозащиты, в частности к штамму Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651, обладающему противогрибковыми свойствами. Кроме того, настоящее изобретение относится к противогрибковой композиции, содержащей этот штамм, , пищевым, кормовым и фармацевтическим продуктам, содержащим такую противогрибковую композицию, способу получения таких пищевых, кормовых и фармацевтических продуктов, способу уменьшения содержания дрожжей и плесневых грибов в таких пищевых, кормовых и фармацевтических продуктах и к применению этой противогрибковой композиции.
Уровень техники изобретения
В течение многих лет молочнокислые бактерии использовались для увеличения срока хранения пищевых продуктов. В процессе брожения молочнокислые бактерии вырабатывают молочную кислоту и другие органические кислоты, что понижает значение pH пищевого продукта, делая его непригодным для роста нежелательных микроорганизмов, таких как патогенные бактерии, дрожжи и грибки.
Кроме того, некоторые молочнокислые бактерии вырабатывают метаболиты, обладающие противомикробной активностью.
В европейской патентной заявке № EP 0221499 описаны противогрибковые свойства штамма Lactobacillus rhamnosus NRRL-B-15972, который способен ингибировать рост различных плесневых грибов при культивировании на агаризованной среде с добавлением огуречного сока.
Европейская патентная заявка № EP 0576780 относится к штамму Lactobacillus rhamnosus LC-705, который способен ингибировать рост Penicillium, Cladosporium, Fusarium и Candida на среде, приготовленной на основе молочной сыворотки с добавлением казеинового гидролизата и дрожжевого экстракта.
Европейская патентная заявка № EP 1442113 относится к обладающей противомикробной активностью смеси Propionibacterium jensenii и Lactobacillus sp., таких как Lactobacillus rhamnosus, для применения для биозащиты.
Тем не менее, все еще существует потребность в биозащитных агентах с улучшенным противогрибковым действием в виде отдельных штаммов или в комбинации с другими биозащитными штаммами.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является создание новых штаммов молочнокислых бактерий, которые являются высокоэффективными биозащитными агентами.
В результате обширного скрининга и исследований авторами настоящего изобретения было обнаружено, что некоторые штаммы Lactobacillus paracasei обладают значительно более сильным действием против дрожжей и плесневых грибов по сравнению с имеющимися на рынке коммерческими биозащитными культурами, а также широко используемым химическим консервантом сорбатом калия.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что определенная группа молочнокислых бактерий, находясь в комбинации с другой группой молочнокислых бактерий, обладает значительным синергическим противомикробным действием. Противомикробное действие этих объединенных двух групп бактерий неожиданно оказалось сильнее, чем сумма отдельных действий этих двух групп бактерий.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан рост плесневых грибов в йогурте с жирностью 1,5%, ферментированном только заквасочной культурой YF-L901 (верхний ряд), вместе с HOLDBAC™ YM-B (средний ряд) и вместе с Lactobacillus rhamnosus CHCC5366. Исследуемые контаминанты, добавленные в концентрациях, указанных в тексте, были следующими (слева направо): Penicillium brevicompactum (M1), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) и Penicillium crustosum (M10) соответственно. Йогурты инкубировали при температуре 7±1°C в течение 45 суток.
На фиг. 2 показано количество клеток изолята Debaryomyces hansenii, добавленного в йогурт с жирностью 1,5%, ферментированный только заквасочной культурой YF-L901 (контроль) или вместе со следующими штаммами: HOLDBAC™ YM-B (HoldBac YM-B), HOLDBAC™ YM-C (HoldBac YM-C) или Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (CHCC 5366). Йогурты хранили при температуре 7±1°C и анализировали через соответствующие интервалы времени.
На фиг. 3 показан рост плесневых грибов на чашках с молоком, ферментированным только заквасочной культурой (контроль, первая фотография), вместе с Lb. paracasei CHCC14676 (вторая фотография), вместе с Lb. rhamnosus CHCC5366 (третья фотография) или вместе с комбинацией Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 (четвертая фотография). Исследуемые контаминанты, добавленные в концентрациях, указанных в тексте, были следующими (от левого верхнего по часовой стрелке до левого нижнего на чашке): Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum соответственно. Чашки инкубировали при температуре 7±1°C в течение 12 суток.
На фиг. 4 показан рост (1) Penicillium solitum, (2) P. palitans, (3) P. discolor, (4) P. spathulatum, (5) P. commune, (6) P. crustosum, (7) P. paneum, (8) P. roqueforti в контрольном йогурте (левая колонка), в йогурте, изготовленном с 0,023% сорбата калия (средняя колонка), и в йогурте, изготовленном с 1E+0,7 КОЕ/г CHCC5366 (правая колонка) после 60 суток инкубации при температуре 7°C, при инокуляции в
- 1 036321 концентрации приблизительно 1000 спор на чашку.
На фиг. 5 показан рост Mucor ssp. на греческом йогурте, приготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (левая чашка), или из молока, ферментированного в присутствии
Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (правая чашка).
На фиг. 6 показан рост плесневого гриба Rhizopus stolonifer на греческом йогурте, приготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (K, т.е. контроль), заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-B (YM-B), заквасочной культурой и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) или заквасочной культурой и комбинацией Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676).
На фиг. 7 показан рост Saccharomyces cerevisiae на белом рассольном сыре, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (контроль); заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-B (YM-B) или заквасочной культурой, Lactobacillus paracasei CHCC14676 и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
На фиг. 8 показан рост Kluyveromyces marxianus на белом рассольном сыре, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (контроль); заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-B (YM-B) или заквасочной культурой, Lactobacillus paracasei CHCC14676 и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
На фиг. 9 показан рост Penicillium commune на белом рассольном сыре, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (K, т.е. контроль); заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-B (YM-B) или заквасочной культурой, Lactobacillus paracasei CHCC14676 и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
На фиг. 10 показан рост P. crustosum на белом рассольном сыре, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (K, т.е. контроль); заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-В (YM-B) или заквасочной культурой и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366).
На фиг. 11 показан рост плесневого гриба Penicillium paneum в йогурте с жирностью 1,5%, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (K, т.е. контроль), заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-B (YM-B), заквасочной культурой и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) или заквасочной культурой и комбинацией Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676).
На фиг. 12 показан рост плесневого гриба Penicillium crustosum в йогурте с жирностью 1,5%, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (верхний ряд), заквасочной культурой и HOLDBAC™ YM-B (второй ряд), заквасочной культурой и Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (третий ряд) или заквасочной культурой и комбинацией Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (нижний ряд). Исследуемый контаминант добавляли в концентрациях 100 спор на чашку и инкубировали йогурты при температуре 7±1°C (левая колонка), 12±1°C (центральная колонка) или 22±1°C (правая колонка) в течение 36 суток.
Подробное описание изобретения
Определения.
Используемый термин молочнокислая бактерия обозначает грамположительную микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая сбраживает сахара с образованием кислот, в том числе молочной кислоты, в качестве преимущественно продуцируемой кислоты. Наиболее широко используемые в промышленности молочнокислые бактерии обнаружены в роде Lactobacillales, который включает в себя Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp. и Enterococcus spp. Они часто используются в качестве пищевых культур отдельно или в комбинации с другими молочнокислыми бактериями.
Подразумевается, что термин пищевой продукт также включает сыр. Подразумевается, что термин сыр включает любой сыр, включая твердые, полутвердые и мягкие сыры, такие как сыры следующих видов: Домашний, Фета, Чеддер, Пармезан, Моцарелла, Эмменталь, Данбо, Гауда, Эдам, сыры типа Фета, голубые сыры, рассольные сыры, Камамбер и бри. Специалисту в данной области техники известно, как из коагулянта получить сыр, способы можно найти в литературе, см., например, Kosikowski, F.V., and V.V. Mistry, Cheese and Fermented Milk Foods, 1997, 3rd Ed. F.V. Kosikowski, L.L.C. Westport, CT. В настоящем изобретении сыр, имеющий концентрацию NaCl ниже 1,7% (по массе), называется слабосоленый сыр.
Молочнокислые бактерии, включая бактерии видов Lactobacillus sp. и Lactococcus sp., как правило, поступают в молочную промышленность в виде замороженных или лиофилизированных культур для получения производственной закваски или в виде так называемых культур для прямого внесения в ванну (DVS), предназначенных для непосредственной инокуляции в ферментационный чан или ванну для производства молочного продукта, такого как кисломолочный продукт или сыр. Такие культуры молочнокислых бактерий обычно называются заквасочные культуры или закваски.
Используемый термин мезофильный относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при умеренных температурах (15-40°C). Наиболее широко применяемые в промышленности мезофиль- 2 036321 ные бактерии включают в себя Lactococcus spp. и Leuconostoc spp. Термин мезофильное брожение относится здесь к брожению при температуре от примерно 22°C до примерно 35°C. Термин мезофильный кисломолочный продукт относится к кисломолочным продуктам, полученным путем мезофильного брожения мезофильной заквасочной культуры и включающим в себя такие кисломолочные продукты, как пахта, простокваша, сквашенное молоко, сметана, сквашенные сливки и пресный сыр, такой как кварк, творог и сливочный сыр.
Используемый термин термофильный относится к микроорганизмам, которые лучше всего растут при температурах выше 43°C. Наиболее широкоприменяемые в промышленности термофильные бактерии включают Streptococcus spp. и Lactobacillus spp. Термин термофильное брожение относится к брожению при температуре выше примерно 35°C, например от примерно 35°C до примерно 45°C. Термин термофильный кисломолочный продукт относится к кисломолочным продуктам, полученным путем термофильного брожения термофильной заквасочной культуры и включающим в себя такие кисломолочные продукты, как йогурт с ненарушенным сгустком, йогурт с нарушенным сгустком и питьевой йогурт.
Под термином молоко понимается секрет молочной железы, получаемый путем доения любого млекопитающего, такого как коровы, овцы, козы, буйволы или верблюды. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молоко является коровьим молоком. Термин молоко также включает в себя растворы белка/жира, изготовленные из растительных материалов, например соевое молоко.
Термин молочный субстрат относится к любому сырому и/или переработанному молочному материалу, который может быть подвергнут брожению в соответствии со способом настоящего изобретения. Так, подходящие молочные субстраты включают в себя без ограничений растворы/суспензии любых молочных или молокообразных продуктов, содержащих белок, таких как цельное молоко или молоко с пониженным содержанием жира, обезжиренное молоко, пахта, восстановленное сухое молоко, сгущенное молоко, сухое молоко, молочная сыворотка, сывороточный пермеат, лактоза, маточная жидкость от кристаллизации лактозы, концентрат сывороточного белка или сливки. Очевидно, что молочный субстрат может быть получен от любого млекопитающего, например, представлять собой практически чистое молоко млекопитающих или восстановленный молочный порошок.
Перед брожением молочный субстрат может быть гомогенизирован и пастеризован в соответствии со способами, известными из уровня техники.
Используемый здесь термин гомогенизация означает интенсивное перемешивание с получением растворимой суспензии или эмульсии. Если гомогенизация проводится перед брожением, то она может быть проведена таким образом, чтобы разбить молочный жир на частицы более мелкого размера так, чтобы он больше не отделялся от молока. Это может быть выполнено путем принудительного пропускания молока под высоким давлением через маленькие отверстия.
Используемый здесь термин пастеризация означает обработку молочного субстрата, приводящую к уменьшению или устранению присутствия живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно пастеризация достигается путем поддержания определенной температуры в течение определенного периода времени. Определенная температура, как правило, достигается путем нагревания. Температура и продолжительность могут быть выбраны для того, чтобы убить или инактивировать определенные бактерии, например вредные бактерии. После этого может следовать этап быстрого охлаждения.
Термин брожение (сбраживание) в способах настоящего изобретения означает превращение углеводов в спирты или кислоты благодаря действию микроорганизма. Предпочтительно брожение в способах настоящего изобретения включает в себя превращение лактозы в молочную кислоту.
Процессы брожения, используемые в производстве молочных продуктов, хорошо известны, и специалисту в данной области техники хорошо известно как выбрать подходящие условия процесса, такие как температура, содержание кислорода, количества и свойства микроорганизма(ов), а также время процесса. Очевидно, что условия брожения выбираются таким образом, чтобы обеспечить осуществление настоящего изобретения, т.е. получение молочного продукта в твердой (например, сыр) или жидкой (например, кисломолочный продукт) форме.
Преимуществом композиций настоящего изобретения является то, что нежелательные микроорганизмы, выбранные из грибков, бактерий и их смесей, например, на пищевых, кормовых и фармацевтических продуктах, а также у людей и животных могут быть подавлены. В частности, предполагается предотвращение и/или ингибирование роста грибков, таких как дрожжи и плесневые грибы. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения термин противомикробный следует понимать как противогрибковый.
Термин нежелательные микроорганизмы относится к таким микроорганизмам, как бактерии и грибки, такие как дрожжи, которые являются патогенными и/или способны вызывать порчу пищевых, кормовых или фармацевтических продуктов. Преимуществом композиций настоящего изобретения является то, что нежелательные микроорганизмы, выбранные из грибков, бактерий и их смесей, например, на пищевых, кормовых и фармацевтических продуктах, а также у людей и животных могут быть подавлены. В частности, предполагается предотвращение и/или ингибирование роста грибков, таких как дрожжи и плесневые грибы.
- 3 036321
Термины «ингибировать и ингибирование по отношению к дрожжам и плесневым грибам означают, например, что рост или количество или концентрация дрожжей и плесневых грибов, например, в пищевых продуктах и/или на поверхности пищевых продуктов, содержащих штаммы настоящего изобретения, являются меньшими, чем в пищевых продуктах и/или на поверхности пищевых продуктов, которые не содержат таких штаммов.
В настоящем контексте термин мутант» следует понимать как штамм, полученный из штамма настоящего изобретения при помощи, например, генной инженерии, радиационного облучения и/или химической обработки. Предпочтительно, чтобы мутант представлял собой функционально эквивалентный мутант, например мутант, который обладает практически аналогичными или улучшенными свойствами (например, это относится к противогрибковым свойствам) по сравнению с исходным штаммом. Такой мутант является частью настоящего изобретения. В частности, термин мутант относится к штамму, полученному путем воздействия на штамм настоящего изобретения любой общепринятой процедуры мутагенеза, включая обработку химическим мутагеном, таким как этилметансульфонат (ЭМС) или Nметил-Н'-нитро-Н-нитрогуанидин (NTG), УФ-излучение или спонтанное возникновение мутаций. Мутант может быть подвергнут действию нескольких процедур мутагенеза (под одной процедурой следует понимать один этап мутагенеза с последующим этапом скрининга/отбора), но в настоящий момент является предпочтительным проводить не более 20, или не более 10, или не более 5 процедур (или этапов скрининга/отбора). У мутанта, являющегося предпочтительным в настоящее время, менее 5%, или менее 1%, или даже менее 0,1% нуклеотидов в бактериальном геноме заменены другим нуклеотидом или удалены по сравнению с исходным штаммом.
Следует считать, что термины, использованные в единственном числе, в контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) включают как единственное, так и множественное число, если прямо не указано иное или если это явно не противоречит контексту. Термины включающий, имеющий, включающий в себя и содержащий следует рассматривать как неограничивающие термины (т.е. означающие включающие без ограничений), если не указано иное. Указание диапазонов значений в настоящем описании является только кратким способом индивидуального указания каждого отдельного значения, находящегося в пределах этого диапазона, если не указано иное, и каждое отдельное значение является включенным в описание, как если бы оно было отдельно в нем указано. Все описанные здесь способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если прямо не указано иное или если это явно не противоречит контексту. Использование любого или всех примеров или указывающих на примеры выражений (например, такой как), приведенных в настоящей заявке, предназначено исключительно для лучшего раскрытия настоящего изобретения и не накладывает ограничений на объем изобретения, если не заявлено иное. Ни одна формулировка в описании не должна рассматриваться как указание на любой незаявленный элемент как необходимый для осуществления изобретения.
Осуществление и аспекты изобретения
Авторы настоящего изобретения провели скрининг 200 кандидатов из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus с целью найти штаммы, наиболее эффективные против широкого спектра микроорганизмов, таких как дрожжи и плесневые грибы.
Скрининг проводили в модельной системе, имитирующей, настолько, насколько это возможно, мезофильные кисломолочные продукты в среде на основе молока, к которой добавляли соответствующую заквасочную культуру вместе с биозащитными кандидатами или без них и которую подвергали сбраживанию в условиях, используемых для мезофильных кисломолочных продуктов. Исследуемые организмы выделяли из мезофильных кисломолочных продуктов. Как очищенные молочнокислые бактерии из культур HOLDBAC™ (Danisco A/S, Дания), так и полные культуры HOLDBAC™ YM-B и HOLDBAC™ YM-C, содержащие как молочнокислые бактерии, так и пропионовокислые бактерии, использовали в качестве показателя исходного уровня биологической защиты.
Эта модельная система описана в европейской патентной заявке № EP 11161609.0.
Было обнаружено, что семнадцать кандидатов из Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus в большинстве случаев ингибируют 12 индикаторных грибков, а также продемонстрировали лучший уровень биологической защиты, чем контрольные молочнокислые бактерии, при испытании при температуре 25°C.
Испытания на йогурте показали, что один штамм Lactobacillus rhamnosus - штамм Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, который был депонирован в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под регистрационным номером DSM23035, значительно лучше ингибирует дрожжи и плесневые грибы, чем коммерчески доступная биозащитная культура.
Ингибирующее действие штамма на дрожжи и плесневые грибы может быть определено путем хранения кисломолочных продуктов при подходящей температуре в течение подходящего периода времени хранения, как описано в примерах ниже.
Как правило, подходящая температура, при которой следует осуществлять данный способ, зависит от температуры, при которой, как правило, хранится и/или производится конкретный пищевой, кормовой или фармацевтический продукт. Температура, при которой, как правило, хранятся эти продукты, состав- 4 036321 ляет от 5 до 26°C, предпочтительно эта температура составляет 8°C.
Время хранения при этой температуре зависит от времени, в течение которого пищевой, кормовой или фармацевтический продукт, как правило, хранится (срока хранения). Время хранения обычно составляет 5-65, предпочтительно 7-60 суток, более предпочтительно 7-28 суток и еще более предпочтительно время хранения составляет примерно 21 сутки.
Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus rhamnosus, выбранному из группы, состоящей из штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, который был депонирован в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) под регистрационным номером DSM23035, и полученных из него мутантных штаммов.
Таким образом, кроме вышеуказанного депонированного штамма настоящее изобретение также относится к мутантам, которые были получены из этого штамма, т.е. они были получены с использованием депонированного штамма CHCC5366 в качестве исходного материала. Мутантный штамм может быть получен из депонированного штамма, например, при помощи генной инженерии, радиационного облучения, УФ-излучения, химической обработки и/или способов, индуцирующих изменения в геноме. В соответствии с настоящим изобретением мутант будет ингибировать и/или предотвращать рост некоторых бактерий или грибков, предпочтительно плесневых грибов. Предпочтительно, чтобы мутант обладал практически 80% или более, по меньшей мере 90% или более, по меньшей мере 95% или более или даже до 100% противогрибковой активности по сравнению со своим исходным штаммом, определяемой, например, в анализе, описанном в примере 1, с использованием одного из плесневых грибов P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor, D. hansenii или P. crustosum в качестве контрольного организма, рост которого необходимо ингибировать.
Для специалиста в данной области техники очевидно, что используя депонированный штамм в качестве исходного материала, специалист в данной области техники может при помощи стандартного мутагенеза или методов повторного выделения легко получить его дополнительные мутанты или производные, которые сохраняют описанные здесь характерные признаки и преимущества. Соответственно, термин мутантные штаммы, полученные из него в первом аспекте относится к мутантным штаммам, полученным с использованием депонированного штамма в качестве исходного материала.
Второй аспект относится к противогрибковой композиции, содержащей по меньшей мере один штамм Lactobacillus rhamnosus в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предпочтительно, штамм Lactobacillus rhamnosus CHCC5366.
При испытании штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 в комбинации с различными штаммами Lactobacillus paracasei неожиданно было обнаружено, что эти комбинации оказались даже более эффективными, чем каждый из этих штаммов в отдельности, даже когда общие концентрации клеток были одинаковыми. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus paracasei CHCC12777. В другом варианте осуществления изобретение относится к комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676. Эти комбинации, по-видимому, оказались более эффективными, чем контрольные культуры HOLDBAC™ YM-B и HOLDBAC™ YM-C (Danisco, Дания).
Таким образом, настоящее изобретение относится к противогрибковым композициям, содержащим штамм Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к противогрибковой композиции, содержащей штамм Lactobacillus paracasei CHCC12777.
Противогрибковая композиция, как правило, содержит бактерии в концентрированном виде, включая замороженные, высушенные или лиофилизированные концентраты, как правило, имеющие концентрацию жизнеспособных клеток в диапазоне от 104 до 1012 КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 г композиции, в том числе по меньшей мере 104 КОЕ на 1 г композиции, как, например, по меньшей мере 105 КОЕ/г, например по меньшей мере 106 КОЕ/г, как, например, по меньшей мере 107 КОЕ/г, например по меньшей мере 108 КОЕ/г, как, например, по меньшей мере 109 КОЕ/г, например по меньшей мере 1010 КОЕ/г, как, например, по меньшей мереЮ11 КОЕ/г. Таким образом, композиция настоящего изобретения предпочтительно находится в замороженной, высушенной или лиофилизированной форме, например, как культура для прямого внесения в ванну (DVS). Однако композиция настоящего изобретения также может представлять собой жидкость, которая получается после суспендирования замороженных, высушенных или лиофилизированных клеточных концентратов в жидкой среде, такой как вода или ФСБбуфер. Когда композиция настоящего изобретения представляет собой суспензию, концентрация жизнеспособных клеток находится в диапазоне от 104 до 1012 КОЕ (колониеобразующих единиц) на 1 мл композиции, в том числе по меньшей мере 104 КОЕ/мл композиции, как, например, по меньшей мере 105 КОЕ/мл, например по меньшей мере 106 КОЕ/мл, как, например, по меньшей мере 107 КОЕ/мл, например по меньшей мере 108 КОЕ/мл, как, например, по меньшей мере 109 КОЕ/мл, например по меньшей мере 1010 КОЕ/мл, как, например, по меньшей мере 1011 КОЕ/мл.
В качестве дополнительных компонентов композиция может содержать криопротекторы и/или стандартные добавки, включая питательные вещества, такие как дрожжевой экстракт, сахара и витамины, например витамин A, C, D, K или витамины группы В. Подходящие криопротекторы, которые могут
- 5 036321 быть добавлены в композиции настоящего изобретения, представляют собой компоненты, которые улучшают переносимость микроорганизмами низких температур, такие как маннит, сорбит, триполифосфат натрия, ксилит, глицерин, раффиноза, мальтодекстрин, эритрит, треит, трегалоза, глюкоза и фруктоза. Другие добавки могут включать в себя, например, углеводы, вкусоароматические добавки, минералы, ферменты (например, сычужный фермент, лактаза и/или фосфолипаза).
Противогрибковая композиция настоящего изобретения может применяться с любым пищевым, кормовым и фармацевтическим продуктом, который подвержен микробиальной порче и/или контаминации дрожжами и плесневыми грибами. К таким продуктам относятся, без ограничений, фрукты и овощи, включая продукты их переработки, зерно и продукты переработки зерна, молочные продукты, мясо, мясо птицы и морепродукты. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция применяется с молочным продуктом и/или мясом и мясом птицы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции настоящего изобретения применяются в качестве добавки при приготовлении молочных продуктов, таких как йогурт, творог, сметана, сливочный сыр и т.п.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиции настоящего изобретения применяются против грибков, таких как дрожжи и плесневые грибы. Это означает, что композиции применяются для ингибирования и/или предотвращения роста грибков, которые вызывают контаминацию в процессах в молочной промышленности, в частности в процессах сбраживания молока. Композиции настоящего изобретения могут применяться, например, для ингибирования и/или предотвращения роста дрожжей, таких как дрожжи родов Klyveromyces (например, K. marxianus, K. lactis), Pichia (например, P. fermentans), Yarrowia (например, Y. lipolytica), Candida (например, C. sake) и т.п.; или плесневых грибов, таких как плесневые грибы родов Penicillium (например, P. nalgiovense, P. commune, P. crustosum, P. brevicompactum, P. glabrum), Mucor spp., Cladiosporium ssp., Aspergillus (например, A. versicolor), Debaryomyces (например, D. hansenii) и т.п. Особенно предпочтительным является применение композиций настоящего изобретения для ингибирования и/или предотвращения роста видов Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, Cladiosporium ssp., Penicillium commune, Mucor ssp., Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crustosum, Kluyveromyces lactis и/или Debaryomyces hansenii.
Противогрибковая композиция в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения может также применяться в качестве фармацевтического продукта, предпочтительно продукта для лечения инфекций, вызванных патогенными грибками, такими как патогенные дрожжи.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к пищевому, кормовому или фармацевтическому продукту, содержащему штамм Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651 в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения или противогрибковую композицию, содержащую по меньщей мере один штамм Lactobacillus paracasei в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения пищевой, кормовой или фармацевтический продукт представляет собой пищевой продукт.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения такой пищевой продукт выбран из группы, состоящей из фруктов и продуктов переработки фруктов, овощей и продуктов переработки овощей, зерна и продуктов переработки зерна, молочных продуктов, мяса, мяса птицы и морепродуктов, а также их смесей.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения пищевой продукт представляет собой молочный продукт, предпочтительно мезофильный или термофильный кисломолочный продукт, такой как пресный сыр, йогурт, сметана или творог.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения пищевой продукт представляет собой мясо или мясо птицы.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения пищевой, кормовой или фармацевтический продукт представляет собой фармацевтический продукт.
Предпочтительно фармацевтический продукт представляет собой продукт, пригодный для введения противогрибковой композиции в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения человеку или животному для подавления патогенных микроорганизмов и облегчения симптомов, связанных с патогенными микроорганизмами. Примеры таких симптомов включают в себя симптомы, связанные с кандидозом. В таком варианте осуществления изобретения фармацевтический продукт может представлять собой единичную лекарственную форму, содержащую противогрибковую композицию. Предпочтительно единичная лекарственная форма является капсулой или таблеткой. Однако единичная лекарственная форма также может быть пригодной для нанесения на слизистую оболочку или кожу и, таким образом, находиться в виде пасты, крема, мази и т.п.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения пищевого, кормового или фармацевтического продукта в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, включающему в себя добавление по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei в соответствии с первым аспектом или противогрибковой композиции в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения во время изготовления пищевого, кормового или фармацевтического продукта. Предпочти- 6 036321 тельно данный способ также включает в себя этап регулирования технологических параметров во время процесса изготовления таким образом, чтобы концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus оставалась постоянной или повышалась.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х 106 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 1х105 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта. Предпочтительно концентрация по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 5х106 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 5х106 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 5х105 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта, например по меньшей мере 1х 107 КОЕ/г или каждого по меньшей мере 1 х 107 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 1х 106 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта, например по меньшей мере 5х107 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 5х107 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 5х106 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта.
Когда пищевой, кормовой или фармацевтический продукт производится путем добавления композиции, содержащей штамм Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651, концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет каждого по меньшей мере 1х 106 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 1х 106 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 1х105 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта. Предпочтительно концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет каждого по меньшей мере 5х 106 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 5х106 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 5х105 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта. В еще одном варианте осуществления изобретения концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет каждого по меньшей мере 1х 108 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 1х 108 КОЕ/мл пищевого, кормового или фармацевтического продукта, или каждого по меньшей мере 1 х 107 КОЕ/см2 поверхности пищевого, кормового или фармацевтического продукта.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения технологические параметры регулируются во время процесса изготовления таким образом, чтобы концентрация штамма Lactobacillus paracasei повышалась или оставалась постоянной.
Противогрибковую композицию настоящего изобретения проще всего применять путем смешивания с и/или нанесения на смешиваемый пищевой, кормовой или фармацевтический продукт, но она также является эффективной при нанесении на поверхность твердых пищевых продуктов или введении внутрь таких продуктов, например, при помощи инъекции. В других вариантах осуществления изобретения композиция может применяться в составе маринада, панировки, толченых специй, глазури, смеси красителей и т.п., при этом ключевым критерием является то, чтобы противогрибковая композиция была доступна на поверхности, подверженной бактериальной порче и контаминации дрожжами и плесневыми грибами. В других вариантах осуществления изобретения композиция может быть опосредованно приведена в контакт с поверхностью пищевого продукта путем нанесения композиции на упаковку пищевого продукта и затем приведения этой упаковки в контакт с поверхностью пищевого продукта. Необходимое для применения оптимальное количество будет зависеть от состава конкретного пищевого продукта, подлежащего обработке, и применяемого способа нанесения композиции на поверхность пищевого продукта, но оно может быть определено при помощи несложных экспериментов.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения способ включает один или несколько этапов брожения, и по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei или противогрибковая композиция могут быть добавлены в пищевой, кормовой или фармацевтический продукт до, во время или после этих одного или нескольких этапов брожения.
Предпочтительно способ включает сбраживание субстрата, такого как молочный субстрат, в присутствии по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei настоящего изобретения в течение периода времени, достаточного для проявления противогрибковой активности, по меньшей мере одного штамма Lactobacillus paracasei настоящего изобретения. Эта противогрибковая активность обладает эффектом ингибирования развития дрожжей и/или плесневых грибов в продукте, ферментированном по меньшей мере одним штаммом.
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения способ включает сбраживание молочного субстрата заквасочной культурой, содержащей по меньшей мере один штамм родов, выбранных из Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus и Leuconostoc, например по меньшей мере один штамм Lactobacillus bulgaricus и по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus, или, например, по меньшей мере один штамм Lactococcus lactis subsp. lactis, по меньшей мере один штамм Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris и по меньшей мере один штамм Lactococcus lactis subsp. diacetylactis.
- 7 036321
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к пищевому продукту, получаемому способом в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к применению штамма Lactobacillus paracasei в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения или противогрибковой композиции в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения для приготовления пищевого, кормового или фармацевтического продукта. Предпочтительно пищевой продукт, получаемый с применением штамма Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651 в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения или противогрибковой композиции в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, представляет собой сыр, такой как Домашний, Фета, Чеддер, Пармезан, Моцарелла, Эмменталь, Данбо, Гауда, Эдам, сыр типа Фета, голубой сыр, рассольный сыр, Камамбер или Бри.
В последнем аспекте настоящее изобретение относится к применению штамма Lactobacillus paracasei в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения или противогрибковой композиции в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения для ингибирования роста дрожжей и плесневых грибов, в частности, в пищевых и кормовых продуктах.
Варианты осуществления настоящего изобретения описаны ниже путем приведения неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1. Контрольное заражение йогурта, содержащего Lactobacillus rhamnosus CHCC5366.
Для визуальной оценки ингибирующего действия штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 на различные плесневые грибы P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor и P. crustosum получали йогурт с жирностью 1,5%.
Гомогенизированное молоко (с жирностью 1,5%) подвергали термической обработке при температуре 95±1°C в течение 5 мин в бутылках объемом 1 л на водяной бане и немедленно охлаждали. Коммерческую заквасочную культуру (F-DVS YF-L901, полученную от Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали в количестве 0,02%. Затем молоко инокулировали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л) или Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1х 107 КОЕ/мл) и одну бутылку, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля.
Молоко сбраживали при температуре 43±1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60±0,1. Полученный йогурт разливали по чашкам (100 г) и хранили при температуре 7±1°C.
На следующий день после приготовления йогурт в чашках инокулировали в двух повторностях различными плесневыми грибами в качестве поверхностных контаминантов в одну точку на поверхности йогурта в количестве 100 спор на точку. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 45 суток при температуре 7±1°C.
Результаты испытания йогурта приведены на фиг. 1, на которой видно, что P. brevicompactum (M1), P. commune (M6), A. Versicolor (M7) и P. crustosum (M10) хорошо растут на йогурте, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой YF-L901 (верхний ряд) или заквасочной культурой и культурой HOLDBAC™ YM-В (средний ряд). В отличие от этого, когда во время брожения в молоке присутствовал Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (нижний ряд), рост всех исследуемых плесневых грибов был ингибирован.
Пример 2. Количественное определение ингибирующего действия Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 против Debaryomyces hansenii.
Для количественного определения ингибирующего действия Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 на D. hansenii получали йогурт.
Гомогенизированное молоко (с жирностью 1,5%) подвергали термической обработке при температуре 95±1°C в течение 5 мин в бутылках объемом 1 л на водяной бане. Молоко немедленно охлаждали.
Каждую бутылку инокулировали коммерческой заквасочной культурой (F-DVS YF-L901, полученной от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,02%. Затем молоко инокулировали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л), или HOLDBAC™ YM-C (10 DCU/100 л), или Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1х107 КОЕ/г) и одну бутылку, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля.
Молоко сбраживали при температуре 43±1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60±0,05. Полученный йогурт разливали по чашкам (приблизительно 75 мл) и хранили при температуре 7±1°C.
На следующий день после приготовления йогурта чашки в двух повторностях инокулировали дрожжами в количестве 0,75 мл на чашку с получением конечной концентрации 20 КОЕ/г. Дрожжи равномерно распределяли в йогурте. Чашки хранили под крышкой при температуре 7±1°C и анализировали через соответствующие интервалы времени для определения уровня контаминации D. hansenii путем посева 1 мл йогурта и последующих 1-кратных разведений в пептонно-солевом растворе на агар с дрожжевым экстрактом, глюкозой и хлорамфениколом (YGC) с последующей инкубацией в аэробных условиях в течение 5 суток при температуре 25°C.
Как показано на фиг. 2, рост D. hansenii подавлялся в присутствии штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, когда его вводили вместе с заквасочной культурой YF-L901 перед сбраживанием. Этот
- 8 036321 штамм вызывал значительно более сильное ингибирование, чем коммерческие культуры HOLDBAC™
YM-B и HOLDBAC™ YM-C.
Пример 3.. Полуколичественное определение ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC14676 и
Lb. rhamnosus CHCC5366 no отдельности и в комбинации на различные плесневые контаминанты.
Для полуколичественного определения ингибирующего действия Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 по отдельности и в комбинации использовали анализ на агаре, имеющий сходство с процессом производства йогурта.
Гомогенизированное молоко (с жирностью 1,5% (мас./об.)) подвергали термической обработке при температуре 95°C в течение 5 мин и немедленно охлаждали. Коммерческую заквасочную культуру (F-DVS YC-350, полученную от Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали в количестве 0,02% и молоко разливали по бутылкам объемом 220 мл. Затем бутылки инокулировали Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC5366 и комбинацией этих двух штаммов, соответственно, с общей концентрацией 1 х 107 КОЕ/мл. Одну бутылку, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля. Кроме того, во все бутылки добавляли 5% индикатора pH бромкрезоловый пурпурный и бромкрезоловый зеленый, чтобы получить представление о скорости закисления среды и получить синий/зеленый цвет среды, что в дальнейшем сделало более легким обнаружение роста исследуемых дрожжей и плесневых грибов. Все бутылки инкубировали на водяной бане при температуре 43±1°C и проводили брожение в этих условиях до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60±0,1. После брожения бутылки сразу охлаждали на льду и энергично встряхивали, чтобы разрушить сгусток. Затем ферментированное молоко нагревали до температуры 40°C и добавляли 4 0 мл стерильного 5% раствора агара, который был расплавлен и охлажден до 60°C. Этот раствор наливали в стерильные чашки Петри и сушили эти чашки на столе с ламинарным потоком воздуха в течение 30 мин.
Соответствующие разведения суспензий полностью проросших спор выбранных плесневых грибов Penicillium nalgiovense (10х), Penicillium commune (100х), Aspergillus versicolor (100х) и Penicillium crustosum (100х) наносили в точку на чашках. Чашки инкубировали при температуре 7°C и анализировали на наличие роста плесневых грибов через соответствующие постоянные интервалы времени.
Результаты анализа на агаре приведены на фиг. 3, на которой видно, что все использованные в анализе плесневые грибы очень хорошо росли на чашках с агаром из молока, ферментированного только заквасочной культурой (контроль). Однако на чашках с агаром из молока, в котором во время брожения присутствовал Lb. paracasei CHCC14676 или Lb. rhamnosus CHCC5366, рост всех плесневых грибов значительно уменьшался. Кроме того, когда в молоке во время брожения Lb. paracasei CHCC14676 и Lb. rhamnosus CHCC5366 присутствовали в комбинации, еще более сильное ингибирование наблюдалось для посеянных на чашки Penicillium commune, Aspergillus versicolor и Penicillium crustosum.
Пример 4. Контрольное заражение йогурта, содержащего Lb. rhamnosus CHCC5366 и сорбат калия.
Пастеризованное молоко, содержащее 0,17% жира, использовали для приготовления трех различных партий йогурта с применением коммерческой заквасочной культуры, указанной в примере 1. Эту заквасочную культуру инокулировали в количестве 0,013%. Перед брожением в первую партию добавляли сорбат калия (0,023%), Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1х 107 КОЕ/г) добавляли во вторую партию, в то время как третью партию использовали в качестве контроля, содержащего только заквасочную культуру. Брожение осуществляли при температуре 43°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,55. После того как значение pH достигало 4,55, йогурт хранили при температуре 7°C.
Три различных типа йогурта распределяли по маленьким чашкам по приблизительно 100 г в каждую и поверхность инокулировали каждым из следующих плесневых грибов, ранее выделенных из испорченных кисломолочных продуктов, в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию 1000 спор на чашку:
Penicillium solitum,
Penicillium palitans,
Penicillium discolor,
Penicillium spathulatum,
Penicillium commune,
Penicillium crustosum,
Penicillium paneum,
Penicillium roqueforti.
Йогурты инкубировали при температуре 7°C в течение 60 суток, рост различных плесневых грибов оценивали визуально с помощью фотографирования в конце 60-дневного периода.
Результаты, приведенные на фиг. 4, показывают, что присутствие Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 резко уменьшает разрастание и образование типичного зеленого/синего окрашивания различных плесневых грибов в йогурте во время хранения в течение 60 суток при температуре 7°C. Было обнаружено, что ингибирующее действие Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 на величину разрастания и образование окрашивания плесневых грибов было значительно более сильным, чем действие, вызываемое добавлением 0,023% сорбата калия.
- 9 036321
Пример 5. Контрольное заражение греческого йогурта, содержащего комбинацию Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676.
Для визуальной оценки ингибирующего действия комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и
Lactobacillus paracasei CHCC14676 на Mucor ssp. греческий йогурт получали следующим образом.
Пастеризованное молоко (с жирностью 1,5%) инокулировали коммерческой заквасочной культурой (F-DVS YF-L901, полученной от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,02%. Одну партию, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля. Другую партию дополнительно инокулировали комбинацией штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5х 106 КОЕ/г) и штамма Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5х 106 КОЕ/г).
Молоко сбраживали при температуре 43±1°C до конечного значения pH 4,55 (6-7 ч). Затем йогурт охлаждали до температуры 25±1°C с обратным давлением 2 бар и хранили при температуре 6±1°C.
На следующий день после приготовления йогурта Mucor ssp. инокулировали в качестве поверхностного контаминанта в чашки йогурта в двух повторностях путем нанесения одной точки на поверхность йогурта с концентрацией при инокуляции 100 спор на точку. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 15 суток при температуре 22±1°C.
Результаты испытания греческого йогурта представлены на фиг. 5, и они показывают, что Mucor ssp. хорошо растет на йогурте, приготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (левая чашка). В отличие от этого, когда во время брожения в молоке присутствовали Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (правая чашка), рост Mucor ssp. был ингибирован.
Пример 6. Второе контрольное заражение греческого йогурта, содержащего комбинацию Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676.
Для визуальной оценки ингибирующего действия комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 на плесень черного хлеба Rhizopus stolonifer греческий йогурт получали следующим образом.
Пастеризованное молоко (с жирностью 1,5%) инокулировали коммерческой заквасочной культурой (F-DVS YF-L901, полученной от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 0,02%. Затем молоко дополнительно инокулировали HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 л), штаммом Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 1 х 107 КОЕ/г) или комбинацией штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5х 106 КОЕ/г) и штамма Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5х106 КОЕ/г). Одну партию, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля.
Молоко сбраживали при температуре 43±1°C до конечного значения pH 4,55 (6-7 ч). Затем йогурт охлаждали до температуры 25±1°C с обратным давлением 2 бар и хранили при температуре 6±1°C.
На следующий день после приготовления йогурта Rhizopus stolonifer инокулировали в качестве поверхностного контаминанта в чашки йогурта в двух повторностях путем нанесения одной точки на поверхность йогурта с концентрацией при инокуляции 100 спор на точку. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 42 суток при температуре 7±1°C.
Результаты испытания греческого йогурта представлены на фиг. 6, и они показывают, что Rhizopus stolonifer хорошо растет на йогурте, приготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой (K, т.е. контроль) или заквасочной культурой и культурой HOLDBAC™ YM-B (YM-B). Однако в присутствии Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) рост Rhizopus stolonifer значительно ингибировался. Когда в молоке во время брожения присутствовали как Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, так и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676), то рост Rhizopus stolonifer ингибировался почти полностью.
Пример 7. Контрольное заражение белого рассольного сыра, содержащего комбинацию Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676.
Для количественной оценки ингибирующего действия комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 против Saccharomyces cerevisiae получали белый рассольный сыр.
Пастеризованное и стандартизированное молоко инокулировали коммерческой заквасочной культурой (F-DVS SafeIT-1, полученной от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 40 Ед. на 1000 л молока. Затем молоко дополнительно инокулировали HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 л) или комбинацией штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5х 106 КОЕ/г) и штамма Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5х 106 КОЕ/г). Одну партию, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля. Молоко при температуре 36±1°C обрабатывали сычужным ферментом (Chy-Max plus, полученным от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 220 мл на 1000 л в течение 90 мин перед разрезанием. При значении pH 6,0 сгусток перекачивали в формы и оставляли для осушки до конечного значения pH 4,8-4,7 (20-24 ч). Сыр переносили в жестяные формы с холодным рассолом (8%) и хранили при температуре 5±1°C.
На следующий день после приготовления белого рассольного сыра жестяные формы в двух повторностях инокулировали дрожжами в конечной концентрации 20 КОЕ/мл. Дрожжи равномерно дисперги- 10 036321 ровали в рассоле. Чашки хранили под крышкой при температуре 7±1°C в течение периода времени до 40 суток и 10 г анализировали через соответствующие интервалы времени на уровень контаминации Saccharomyces cerevisiae путем посева соответствующих 1-кратных разведений в пептонно-солевом растворе на агар с дрожжевым экстрактом, глюкозой и хлорамфениколом (YGC) с последующей инкубацией в аэробных условиях в течение 5 суток при температуре 25°C.
Как показано на фиг. 7, рост Saccharomyces cerevisiae подавлялся в присутствии комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676, когда ее вводили вместе с заквасочной культурой SafeIT-1. Эти штаммы вызывали значительно более сильное ингибирование, чем коммерчески доступная культура HOLDBAC™ YM-B.
Пример 8. Второе контрольное заражение белого рассольного сыра, содержащего комбинацию Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676.
Для количественной оценки ингибирующего действия комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 против Kluyveromyces marxianus белый рассольный сыр получали, как описано в примере 1, за исключением того, что жестяные формы инокулировали Kluyveromyces marxianus в качестве дрожжевого контаминанта.
Как показано на фиг. 8, рост Kluyveromyces marxianus подавлялся в присутствии комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676, когда ее вводили вместе с заквасочной культурой SafeIT-1. Эти штаммы вызывали значительно более сильное ингибирование, чем коммерчески доступная культура HOLDBAC™ YM-B.
Пример 9. Третье контрольное заражение белого рассольного сыра, содержащего комбинацию Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676.
Для визуальной оценки ингибирующего действия комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 против P. commune белый рассольный сыр получали, как описано в примере 1.
Через 7 дней после приготовления белого рассольного сыра сыр извлекали из рассола и инокулировали его в двух повторностях P. commune в качестве поверхностного контаминанта в три точки на поверхности сыра с конечной концентрацией 100 спор на точку. Рост двух различных изолятов P. commune оценивали визуально после хранения в течение 12 суток при температуре 7±1°C и затем в течение 16 суток при температуре 12±1°C.
Результаты испытания белого рассольного сыра представлены на фиг. 9, и они показывают, что два изолята P. commune хорошо растут на белом рассольном сыре, изготовленном из молока, инокулированного только заквасочной культурой (левая фотография). В отличие от этого, когда при изготовлении сыра использовались Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (правая фотография), рост P. commune в значительной степени ингибировался.
Пример 10. Контрольное заражение белого рассольного сыра, содержащего Lactobacillus rhamnosus CHCC5366.
Для визуальной оценки ингибирующего действия Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 против P. crustosum получали белый рассольный сыр.
Пастеризованное и стандартизированное молоко инокулировали коммерческой заквасочной культурой (F-DVS SafeIT-1, полученной от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 40 Ед. на 1000 л молока. Затем молоко дополнительно инокулировали HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 л) или штаммом Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1х 107 КОЕ/г). Одну партию, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля. Молоко при температуре 36±1°C обрабатывали сычужным фернтом (Chy-Max plus, полученным от Chr. Hansen A/S, Дания) в количестве 220 мл на 1000 л в течение 90 мин перед разрезанием. При значении pH 6,0 сгусток перекачивали в формы и оставляли для осушки до конечного значения pH 4,8-4,7 (20-24 ч). Сыр переносили в жестяные формы с холодным рассолом (8%) и хранили при температуре 5±1°C.
Через 7 дней после приготовления белого рассольного сыра сыр извлекали из рассола и инокулировали его в двух повторностях P. crustosum в качестве поверхностного контаминанта в три точки на поверхности сыра с конечной концентрацией 100 спор на точку. Рост изолята P. crustosum оценивали визуально после хранения в течение 11 суток при температуре 12±1°C и затем в течение 16 суток при температуре 12±1°C.
Результаты испытания белого рассольного сыра представлены на фиг. 10, и они показывают, что изолят P. crustosum хорошо растет на белом рассольном сыре, изготовленном из молока, инокулированного только заквасочной культурой (левая фотография). В отличие от этого, когда при изготовлении сыра использовался Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (правая фотография), рост P. crustosum был ингибирован.
Пример 11. Контрольное заражение йогурта, содержащего Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и CHCC14676, Penicillium paneum.
Для визуальной оценки ингибирующего действия штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, отдельно или в комбинации с Lactobacillus paracasei CHCC14676 против плесневого гриба P. paneum полу- 11 036321 чали йогурт с жирностью 1,5%.
Гомогенизированное молоко (с жирностью 1,5%) подвергали термической обработке при температуре 95±1°C в течение 5 мин в бутылках объемом 1 л на водяной бане и немедленно охлаждали. Коммерческую заквасочную культуру (F-DVS YF-L901, полученную от Chr Hansen A/S, Дания) инокулировали в количестве 0,02%. Затем молоко инокулировали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л) или Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1х107 КОЕ/мл) отдельно или комбинацией Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5х 106 КОЕ/мл) и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5х 106 КОЕ/мл). Одну бутылку, инокулированную только заквасочнои культурой, использовали в качестве контроля.
Молоко сбраживали при температуре 43±1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60±0,1. Полученный йогурт разливали по чашкам (100 г) и хранили при температуре 7±1°C.
На следующий день после приготовления йогурт в чашках инокулировали в двух повторностях различными плесневыми грибами в качестве поверхностных контаминантов в одну точку на поверхности йогурта в количестве 100 спор на точку. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 28 суток при температуре 7±1°C.
Результаты испытания йогурта приведены на фиг. 11, на которой видно, что P. paneum хорошо растет на йогурте, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочнои культурой YF-L901 или заквасочнои культурой и культурой HOLDBAC™ YM-B. В отличие от этого, когда во время брожения в молоке присутствовал Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, рост P. paneum был сильно замедлен, а комбинация Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676 вызывала еще более сильное ингибирование роста P. paneum.
Пример 12. Контрольное заражение йогурта, содержащего Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и CHCC14676, при различных температурах хранения.
Для визуальной оценки ингибирующего действия штамма Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, отдельно или в комбинации с Lactobacillus paracasei CHCC14676, на плесневый гриб P. crustosum при различных температурах хранения получали йогурт с жирностью 1,5%.
Гомогенизированное молоко (с жирностью 1,5%) подвергали термической обработке при температуре 95±1°C в течение 5 мин в бутылках объемом 1 л на водяной бане и немедленно охлаждали. Коммерческую заквасочную культуру (F-DVS YF-L901, полученную от Chr. Hansen A/S, Дания) инокулировали в количестве 0,02%. Затем молоко инокулировали HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100 л) или Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1х107 КОЕ/мл) отдельно или комбинацией Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5х 106 КОЕ/мл) и Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5х106 КОЕ/мл). Одну бутылку, инокулированную только заквасочной культурой, использовали в качестве контроля.
Молоко сбраживали при температуре 43±1°C до тех пор, пока значение pH не достигало 4,60±0,1. Полученный йогурт разливали по чашкам (100 г) и хранили при температуре 7±1°C.
На следующий день после приготовления йогурт в чашках инокулировали в двух повторностях Penicillium crustosum в качестве поверхностного контаминанта в одну точку на поверхности йогурта в количестве 100 спор на точку. Рост плесневых грибов оценивали визуально после хранения в течение 36 суток при температуре 7±1°C, 12±1°C или 22±1°C.
Результаты испытания йогурта приведены на фиг. 12, на которой видно, что P. crustosum хорошо растет на йогурте, изготовленном из молока, ферментированного только заквасочной культурой YF-L901 или заквасочной культурой и культурой HOLDBAC™ YM-B, при всех температурах хранения. В отличие от этого, когда во время брожения в молоке присутствовал Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 один или в комбинации с Lactobacillus paracasei CHCC14676, рост P. crustosum полностью предотвращался при хранении как при 7±1°C, так и при 12±1°C в течение 36 суток. При хранении при 22±1°C рост P. crustosum был сильно замедлен в присутствии Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и еще сильнее замедлен в присутствии комбинации Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 и Lactobacillus paracasei CHCC14676.
Депонирование и экспертное решение
Заявитель просит, чтобы образцы депонированных микроорганизмов, перечисленных ниже, до даты вынесения решения о выдаче патента могли быть доступны только эксперту.
Штамм Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 был депонирован 14.10.2009 в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig под регистрационным номером DSM23035.
Штамм Lactobacillus paracasei CHCC12777 был депонирован 15.03.2011 в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig под регистрационным номером DSM24651.
Штамм Lactobacillus paracasei CHCC14676 был депонирован 02.02.2012 в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig под регистрационным номером DSM25612.
Депонирование было проведено в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
- 12 036321
Ссылки.
ЕР0221499
ЕР0576780
ЕР1442113
US5378458
ЕР11161609.0
Kosikowski, F.V. and Mistry, V.V., «Cheese and Fermented Milk
Foods», 1997, 3rd Ed. F.V. Kosikowski, L.L.C.

Claims (21)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Штамм Lactobacillus paracasei CHCC12777 DSM24651, обладающий противогрибковыми свойствами.
  2. 2. Противогрибковая композиция, содержащая по меньшей мере один штамм Lactobacillus paracasei по п.1.
  3. 3. Пищевой продукт, содержащий штамм Lactobacillus paracasei по п.1 или противогрибковую композицию по п.2.
  4. 4. Пищевой продукт по п.3, выбранный из группы, состоящей из фруктов и продуктов переработки фруктов, овощей и продуктов переработки овощей, зерна и продуктов переработки зерна, молочных продуктов, мяса, мяса птицы и морепродуктов, а также их смесей.
  5. 5. Пищевой продукт по п.3, представляющий собой мезофильный или термофильный кисломолочный продукт, такой как йогурт.
  6. 6. Кормовой продукт, содержащий штамм Lactobacillus paracasei по п.1 или противогрибковую композицию по п.2.
  7. 7. Фармацевтический продукт, содержащий штамм Lactobacillus paracasei по п.1 или противогрибковую композицию по п.2.
  8. 8. Способ получения пищевого продукта, включающий добавление штамма Lactobacillus paracasei по п.1 или противогрибковой композиции по п.2 в пищевой продукт во время его изготовления и регулирование параметров во время процесса изготовления таким образом, чтобы концентрация штамма Lactobacillus paracasei оставалась постоянной или повышалась.
  9. 9. Способ по п.8, где концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х106 КОЕ/г, или по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл пищевого продукта, или по меньшей мере 1x105 КОЕ/см2 поверхности пищевого продукта.
  10. 10. Способ по п.8, включающий добавление противогрибковой композиции по п.2 во время изготовления пищевого продукта таким образом, что концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х106 КОЕ/г, или по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл пищевого продукта, или по меньшей мере 1x105 КОЕ/см2 поверхности пищевого продукта.
  11. 11. Способ получения кормового продукта, включающий добавление штамма Lactobacillus paracasei по п. 1 или противогрибковой композиции по п.2 в кормовой продукт во время его изготовления и регулирование параметров во время процесса изготовления таким образом, чтобы концентрация штамма Lactobacillus paracasei оставалась постоянной или повышалась.
  12. 12. Способ по п.11, где концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х106 КОЕ/г, или по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл кормового продукта, или по меньшей мере 1x105 КОЕ/см2 поверхности кормового продукта.
  13. 13. Способ по п.11, включающий добавление противогрибковой композиции по п.2 во время изготовления пищевого продукта таким образом, что концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х106 КОЕ/г, или по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл кормового продукта, или по меньшей мере 1х105 КОЕ/см2 поверхности кормового продукта.
  14. 14. Способ получения фармацевтического продукта, включающий добавление штамма Lactobacillus paracasei по п.1 или противогрибковой композиции по п.2 в фармацевтический продукт во время его изготовления и регулирование параметров во время процесса изготовления таким образом, чтобы концентрация штамма Lactobacillus paracasei оставалась постоянной или повышалась.
  15. 15. Способ по п.14, где концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х106 КОЕ/г, или каждого по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл фармацевтического продукта, или по меньшей мере 1х105 КОЕ/см2 поверхности фармацевтического продукта.
  16. 16. Способ по п.14, включающий добавление противогрибковой композиции по п.2 во время изготовления фармацевтического продукта таким образом, что концентрация штамма Lactobacillus paracasei составляет по меньшей мере 1х106 КОЕ/г, или по меньшей мере 1х106 КОЕ/мл фармацевтического продукта, или по меньшей мере 1 х 105 КОЕ/см2 поверхности пищевого продукта.
  17. 17. Пищевой продукт, получаемый способом по любому из пп.8-10.
    - 13 036321
  18. 18. Применение штамма Lactobacillus paracasei по п.1 для приготовления пищевого, кормового или фармацевтического продукта.
  19. 19. Применение противогрибковой композиции по п.2 для приготовления пищевого, кормового или фармацевтического продукта.
  20. 20. Применение штамма Lactobacillus paracasei по п.1 для ингибирования роста дрожжей и плесневых грибов.
  21. 21. Применение противогрибковой композиции по п.2 для ингибирования роста дрожжей и плесневых грибов.
EA201891030A 2012-04-09 2013-04-09 Штамм lactobacillus paracasei chcc12777 dsm24651, обладающий противогрибковыми свойствами EA036321B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12163508 2012-04-09
PCT/EP2012/056384 WO2012136830A1 (en) 2011-04-08 2012-04-09 Synergistic antimicrobial effect
EP12168977 2012-05-22
EP13154591 2013-02-08

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201891030A2 EA201891030A2 (ru) 2018-09-28
EA201891030A3 EA201891030A3 (ru) 2019-03-29
EA036321B1 true EA036321B1 (ru) 2020-10-26

Family

ID=49327139

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201891030A EA036321B1 (ru) 2012-04-09 2013-04-09 Штамм lactobacillus paracasei chcc12777 dsm24651, обладающий противогрибковыми свойствами
EA201491847A EA033656B1 (ru) 2012-04-09 2013-04-09 Штамм lactobacillus rhamnosus, обладающий противогрибковыми свойствами

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491847A EA033656B1 (ru) 2012-04-09 2013-04-09 Штамм lactobacillus rhamnosus, обладающий противогрибковыми свойствами

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9485992B2 (ru)
EP (1) EP2836587B1 (ru)
JP (1) JP6430931B2 (ru)
KR (1) KR101947110B1 (ru)
CN (1) CN104284975B (ru)
AR (1) AR090631A1 (ru)
BR (1) BR112014024918B1 (ru)
DK (1) DK2836587T3 (ru)
EA (2) EA036321B1 (ru)
ES (1) ES2630711T3 (ru)
HK (1) HK1206391A1 (ru)
HU (1) HUE034259T2 (ru)
MX (1) MX351628B (ru)
PL (1) PL2836587T3 (ru)
PT (1) PT2836587T (ru)
UA (1) UA115330C2 (ru)
WO (1) WO2013153074A1 (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9635870B2 (en) 2011-02-28 2017-05-02 Franklin Foods Holdings Inc. Direct-set cheese
US9462817B2 (en) 2011-02-28 2016-10-11 Franklin Foods Holdings Inc. Processes for making cheese products utilizing denatured acid whey proteins
JP6073857B2 (ja) 2011-04-08 2017-02-01 セーホーエル.ハンセン アクティーゼルスカブ 合成抗微生物効果
DK2836588T3 (en) 2012-04-09 2017-05-22 Chr Hansen As Bioprotection using Lactobacillus paracasei strains
HUE034259T2 (en) 2012-04-09 2018-02-28 Chr Hansen As Biological protection using Lactobacillus rhamnosus strains
GB201409468D0 (en) * 2014-05-28 2014-07-09 Dupont Nutrition Biosci Aps Bacterium
KR20160107635A (ko) 2015-03-04 2016-09-19 한국교통대학교산학협력단 제한된 항균작용을 갖는 박테리오신 생산 락토바실러스 람노서스 cjnu 0519 및 이의 용도
WO2017026635A1 (ko) * 2015-08-12 2017-02-16 씨제이제일제당(주) 신규한 락토바실러스 속 미생물 및 이를 포함하는 동물 사료용 조성물
UA127431C2 (uk) * 2015-08-31 2023-08-23 Кр. Гансен А/С Бактерія lactobacillus rhamnosus з протигрибковою активнiстю
BR112018003474A2 (pt) * 2015-08-31 2018-09-25 Chr Hansen As bactérias lactobacillus fermentum que reduzem a concentração de acetaldeído
DK3344052T3 (da) * 2015-08-31 2019-11-11 Chr Hansen As Lactobacillus fermentum-bakterier, som inhiberer eftersyrning
MX2018013760A (es) * 2016-05-11 2019-03-21 Chr Hansen As Bacterias de acido lactico para producto alimenticio tratado con calor para almacenamiento a temperatura ambiente.
EP3279312B1 (en) 2016-08-02 2019-07-31 DSM IP Assets B.V. Bioprotection of dairy products
MX2020004195A (es) * 2017-10-27 2020-08-13 Chr Hansen As Lactobacillus rhamnosus con produccion incrementada de diacetilo.
CN108450482B (zh) 2018-03-26 2020-06-12 景岳生物科技股份有限公司 提高抗逆境能力的植物生长调节剂及其用途
MX2020010846A (es) * 2018-04-19 2020-11-09 Chr Hansen As Inhibicion del crecimiento de hongos mediante el agotamiento de manganeso.
US20220151267A1 (en) * 2019-04-16 2022-05-19 Locus Ip Company, Llc Microbe-Based Emulsifying Food Additives
IT201900006815A1 (it) * 2019-05-14 2020-11-14 Universita’ Degli Studi Di Parma Produzione di antimicrobici da scarti vegetali
AR120265A1 (es) * 2019-10-23 2022-02-09 Chr Hansen As Composición bacteriana para controlar el deterioro por hongos y su uso
FR3105258B1 (fr) 2019-12-23 2022-10-14 Flores de Terroirs Levains bioprotecteurs obtenus à partir de laits natifs : utilisation de ces levains pour préparer des levains terroirs et pour purifier le lait cru
CN111567261B (zh) * 2020-05-14 2022-03-04 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种植物增色剂及应用、使用方法
WO2023073187A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Dsm Ip Assets B.V. Bioprotection of dairy products
WO2023073183A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Dsm Ip Assets B.V. Bioprotection of dairy products
CN114027479A (zh) * 2021-11-18 2022-02-11 武汉自然萃创新科技有限公司 一种微胶囊化益生菌蜂蜜的制备方法
WO2024141408A1 (en) * 2022-12-27 2024-07-04 Chr. Hansen A/S Bioprotective lacticaseibacillus rhamnosus with low postacidification

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110045134A1 (en) * 2007-12-04 2011-02-24 Louise Perrier Use of L. Casei Ssp. Paracasei as Antifungal Agent

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965414A (en) * 1985-11-04 1999-10-12 Microlife Technics, Inc. Process for producing yeast and mold inhibiting products with lactobacillus
US4956177A (en) 1985-11-04 1990-09-11 Microlife Technics, Inc. Method for inhibiting fungi
CA1320165C (en) 1987-08-06 1993-07-13 Microlife Technics, Inc. Process for producing novel yeast and mold inhibiting products
US5107116A (en) 1990-12-21 1992-04-21 Eastman Kodak Company Split V-roof mirror collector for photostimulable phosphor imaging system
FI92498C (fi) 1992-06-10 1994-11-25 Valio Meijerien Uusi mikro-organismikanta, sitä sisältävät bakteerivalmisteet ja näiden käyttö hiivojen ja homeiden torjuntaan
JP3001338B2 (ja) * 1992-06-10 2000-01-24 ヴァリオ・マイイェリーン・ケスクソスースリーケ 新規の微生物株、その菌株を含む細菌製剤、および酵母およびカビの制御のための上記菌株および製剤の使用
FR2758051B1 (fr) 1997-01-06 1999-12-17 Cobiotex Procedes d'eradication systematique du portage d'agents pathogenes par des animaux et compositions mises en oeuvre dans ces procedes
EP1308506A1 (en) 2001-11-06 2003-05-07 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Mixtures of Propionibacterium jensenii and Lactobacillus sp. with antimicrobial activities for use as a natural preservation system
UA78547C2 (en) 2002-02-21 2007-04-10 Nestle Sa Light-protective composition for skin intended for oral administration
RU2309760C2 (ru) 2002-02-21 2007-11-10 Сосьете Де Продюи Нестле С.А. Композиция для фотопротекции кожи
FI113057B (fi) 2002-11-04 2004-02-27 Valio Oy Menetelmä hiivojen kasvun estämiseksi
US20100166721A1 (en) 2006-06-09 2010-07-01 Fabiola Masri Probotic compositions and uses thereof
US20080107699A1 (en) 2006-10-25 2008-05-08 Mark Spigelman Method of using topical probiotics for the inhibition of surface contamination by a pathogenic microorganism and composition therefor
DK1992351T3 (en) * 2007-05-18 2016-06-06 Nestec Sa Lactobacillus johnsonii for the prevention of post-surgical infection
CN101613667B (zh) * 2009-07-23 2011-02-02 中国科学院微生物研究所 一种制备l-乳酸的方法及其专用菌剂
JP6073857B2 (ja) 2011-04-08 2017-02-01 セーホーエル.ハンセン アクティーゼルスカブ 合成抗微生物効果
HUE034259T2 (en) 2012-04-09 2018-02-28 Chr Hansen As Biological protection using Lactobacillus rhamnosus strains
DK2836588T3 (en) 2012-04-09 2017-05-22 Chr Hansen As Bioprotection using Lactobacillus paracasei strains

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110045134A1 (en) * 2007-12-04 2011-02-24 Louise Perrier Use of L. Casei Ssp. Paracasei as Antifungal Agent

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHNURER J. et al. Antifungal lactic acid bacteria as biopreservatives. Trends in Food Science & Technology, 2005, 16, pp. 70-78 *
SCHWENNINGER S.M. et al. Detection of Antifungal Properties in Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei SM20, SM29, and SM63 and Molecular Typing of the Strains. Journal of Food Protection, 2005, Vol. 68, No. 1, pp. 111-119 *
THARMARAJ N. et al. Antimicrobial effects of probiotic bacteria against selected species of yeasts and moulds in cheese-based dips. International Journal of Food Science & Technology, 2009, 44, pp. 1916-1926 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20150079057A1 (en) 2015-03-19
UA115330C2 (uk) 2017-10-25
MX2014012050A (es) 2015-01-16
EA201491847A1 (ru) 2015-05-29
EP2836587A1 (en) 2015-02-18
EA033656B1 (ru) 2019-11-13
BR112014024918B1 (pt) 2022-04-19
PL2836587T3 (pl) 2017-08-31
EA201891030A3 (ru) 2019-03-29
JP6430931B2 (ja) 2018-11-28
DK2836587T3 (en) 2017-05-08
JP2015515273A (ja) 2015-05-28
CN104284975B (zh) 2016-08-24
WO2013153074A1 (en) 2013-10-17
EA201891030A2 (ru) 2018-09-28
HUE034259T2 (en) 2018-02-28
HK1206391A1 (en) 2016-01-08
MX351628B (es) 2017-10-23
ES2630711T3 (es) 2017-08-23
KR101947110B1 (ko) 2019-02-13
CN104284975A (zh) 2015-01-14
AR090631A1 (es) 2014-11-26
BR112014024918A2 (ru) 2017-06-20
PT2836587T (pt) 2017-05-26
KR20140148479A (ko) 2014-12-31
EP2836587B1 (en) 2017-03-01
US9485992B2 (en) 2016-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10993974B2 (en) Synergistic antimicrobial effect
US10767158B2 (en) Bioprotection using lactobacillus paracasei strains
US9485992B2 (en) Bioprotection using Lactobacillus rhamnosus strains
US11096396B2 (en) Lactobacillus fermentum bacteria with antifungal activity
AU2016315139A1 (en) Lactobacillus fermentum bacteria inhibiting post-acidification

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM