CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere ao campo de bioproteção, em particular a uma cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 com acesso no. DSM23035. Além disso, a presente invenção se trata de uma composição antifúngica compreendendo uma cepa, uma composição antifúngica compreendendo uma cepa e, pelo menos, uma cepa de Lactobacillus paracasei, alimento, produtos de alimentação e farmacêuticos compreendendo tal composição antifúngica, um método de preparar tal alimento, produtos de alimentação e farmacêuticos, um método para reduzir o conteúdo de leveduras e fungos de alimento, produtos de alimentação e farmacêuticos, e usos da composição antifúngica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Por muitos anos, bactérias de ácido láctico têm sido usadas para aumentar o prazo de validade de produtos alimentícios. Durante a fermentação as bactérias de ácido láctico produzem ácidos lácticos e outros ácidos orgânicos desse modo reduzindo o pH do produto alimentício tornando-o desfavorável para o crescimento de microrganismos indesejáveis, tais como bactérias patogênicas, leveduras e fungos.
[003] Adicionalmente, algumas bactérias de ácido láctico também produzem metabólitos com atividade antimicrobiana.
[004] O Pedido de Patente Europeia no. EP0221499 descreve as propriedades antifúngicas de Lactobacillus rhamnosus NRRL-B-15972 que é capaz de inibir o crescimento de fungos diferentes, quando cultivados em meio de ágar-ágar suplementado com suco de pepino.
[005] O Pedido de Patente Europeia no. EP0576780 é relacionado ao Lactobacillus rhamnosus LC-705 que pode inibir o crescimento de Penicillium, Cladosporium, Fusarium e Candida em um meio baseado em lacto-soro, suplementado com hidrolisado de caseína e com extrato de levedura.
[006] O Pedido de Patente Europeia no. EP1442113 é dirigido para misturas de Propionibacterium jensenii e Lactobacillus sp., tal como Lactobacillus rhamnosus, com atividades antimicrobianas para uso por bioproteção.
[007] Entretanto, existe ainda uma necessidade de agentes bioprotetores com um efeito antifúngico melhorado como cepas únicas ou em combinação com outras cepas bioprotetoras.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008] O objetivo da presente invenção é a provisão de novas cepas de bactérias de ácido láctico com uma alta eficácia como agentes bioprotetores.
[009] Os presentes inventores constataram, através de varredura e pesquisa extensivas, que certas cepas de Lactobacillus rhamnous têm um efeito significativamente maior contra leveduras e fungos, quando comparadas às culturas bioprotetoras comerciais do mercado, como também como sorbato de potássio, um conservante químico comumente usado.
[0010] Os presentes inventores constataram ainda que um certo grupo de bactérias de ácido láctico, quando combinado com outro grupo de bactérias de ácido láctico, exibe um efeito antimicrobiano sinergístico significativo. O efeito antimicrobiano dos dois grupos de bactérias combinados, surpreendentemente, é maior do que a soma dos efeitos individuais dos dois grupos de bactérias.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] FIGURA 1 ilustra o crescimento de fungos em iogurte com 1,5% de gordura fermentada com uma cultura inicial YF-L901 sozinho (fileira de topo), junto com HOLDBAC™ YM-B (fileira do meio) e junto com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366. Os contaminantes alvos foram adicionados nas concentrações mencionadas no texto da esquerda para a direita: Penicillium brevicompactum (Ml), Penicillium commune (M6), Aspergillus versicolor (M7) e Penicillium crustosum (M10), respectivamente. Os iogurtes foram incubados a 7±1°C por 45 dias.
[0012] FIGURA 2 ilustra contagens de células de um Debaryomyces hansenii isolado, adicionado ao iogurte com 1,5% de gordura fermentada com uma cultura inicial YF-L901 sozinho (Referência) ou junto com as cepas a seguir: HOLDBAC™ YM-B (HoldBac YM-B), HOLDBAC™ YM-C (HoldBac YM-C) ou Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (CHCC 5366). Os iogurtes foram armazenados a 7±1°C e analisados em intervalos apropriados.
[0013] FIGURA 3 mostra o crescimento de fungos em placas preparadas com leite fermentado com uma cultura inicial sozinho (referência, primeiro desenho), junto com Lb. paracasei CHCC14676 (segundo desenho), junto com Lb. rhamnosus CHCC5366 (terceiro desenho) ou junto com a combinação de Lb. paracasei CHCC14676 e Lb. rhamnosus CHCC5366 (quarto desenho). Os contaminantes alvos foram adicionados nas concentrações mencionadas no texto topo esquerdo e se movimentando no sentido dos ponteiros do relógio para o fundo esquerdo da placa: Penicillium nalgiovense, Penicillium commune, Aspergillus versicolor e Penicillium crustosum, respectivamente. As placas foram incubadas a 7±1°C por 12 dias.
[0014] FIGURA 4 mostra o crescimento de: (1) Penicillium solitum, (2) P. palitans, (3) P. discolor, (4) P. spathulatum, (5) P. commune, (6). P. crustosum, (7) P. paneum, (8) P. roqueforti em um iogurte de referência (coluna da esquerda), um iogurte feito com 0,023% de sorbato de potássio (coluna do meio) e um iogurte feito com 1E+07 UFC/g de CHCC5366 (coluna da direita) depois de 60 dias de incubação a 7°C quando inoculado em concentrações de aproximadamente 1000 esporos/xícara.
[0015] FIGURA 5 mostra o crescimento de Mucor ssp. Em iogurte Grego preparado de leite fermentado com uma cultura inicial somente (xícara da esquerda) ou de leite fermentado na presença de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 (xícara da esquerda).
[0016] FIGURA 6 mostra o crescimento do humo Rhizopus stolonifer em iogurte Grego preparado de leite fermentado com uma cultura inicial somente (R, isto é, referência), com a cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (YM-B), com a cultura inicial e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366), ou com a cultura inicial e uma combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676).
[0017] FIGURA 7 mostra o crescimento de Saccharomyces cerevisiae em queijo branco de salmoura feito de leite fermentado somente com cultura inicial (referência); com cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (YM-B); ou com cultura inicial, Lactobacillus paracasei CHCC14676 e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
[0018] FIGURA 8 mostra o crescimento de Kluyveromyces marxianus em queijo branco de salmoura feito de leite fermentado somente com cultura inicial (referência); com cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (YM-B); ou com cultura inicial, Lactobacillus paracasei CHCC14676 e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
[0019] FIGURA 9 mostra o crescimento de Penicillium commune em queijo branco de salmoura feito de leite fermentado somente com cultura inicial (R, isto é, referência); com cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (YM-B); ou com cultura inicial, Lactobacillus paracasei CHCC14676 e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366+14676).
[0020] FIGURA 10 mostra o crescimento de P. crustosum no queijo branco de salmoura feito de leite fermentado somente com cultura inicial (R, isto é, referência); com cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (YM-B); ou com cultura inicial e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366).
[0021] FIGURA 11 ilustra o crescimento do humo Penicillium paneumi no iogurte com 1,5% de gordura preparada com leite fermentado com uma cultura inicial somente (R, isto é, referência), com a cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (YM-B), com a cultura inicial e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366), ou com a cultura inicial e uma combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5366+14676).
[0022] FIGURA 12 mostra o crescimento do humo Penicillium crustosum no iogurte com 1,5% de gordura preparado com leite fermentado com uma cultura inicial sozinho (fileira do topo), com a cultura inicial e HOLDBAC™ YM-B (segunda fileira), com a cultura inicial e Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (terceira fileira) ou com a cultura inicial e uma combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 (fileira do fundo). O contaminante alvo foi adicionado nas concentrações de 100 esporos/xícara e os iogurtes foram incubados a 7±1°C (coluna da esquerda), 12±1°C (coluna do centro) ou 22±1°C (coluna da direita) por 36 dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
[0023] Como usado aqui, o termo "bactéria de ácido láctico" designa uma bactéria gram-positiva, microaerofílica ou anaeróbica, que fermenta açúcares com a produção de ácidos, incluindo ácidos lácticos o ácido predominantemente produzido. As bactérias de ácido láctico, industrialmente mais úteis, são encontradas dentro da ordem de "Lactobacillales" que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp. e Enterococcus spp. Essas são frequentemente usadas com culturas de alimentos sozinhas ou em combinação com outras bactérias de ácido láctico.
[0024] O termo "alimento" é destinado a incluir também queijo. O termo "queijo" é entendido para abranger qualquer queijo, incluindo queijos duros, semiduros ou macios, tais como queijos dos tipos a seguir: Cottage, Feta, Cheddar, Parmesão, Mussarela, Emmental, Danbo, Gouda, Edam, tipo Feta-, queijos azuis, queijos de salmoura, Camembert e Brie. A pessoa versada na técnica sabe como converter o coágulo em queijo, os métodos podem ser encontrados na literatura, ver, por exemplo, Kosikowski, F. V., e V. V. Mistry, "Cheese and Fermented Milk Foods", (Queijo e Alimentos de Leite Fermentado) 1997, 3rd Ed. F. V. Kosikowski, L. L. C. Westport, CT. Como usado aqui, um queijo que tem uma concentração de NaCI abaixo de 1,7% (peso/peso) é referido como um "queijo de pouco sal".
[0025] Bactérias de ácido láctico, incluindo bactérias das espécies Lactobacillus sp. e Lactococcus sp., são normalmente supridas para a indústria de leiteria, como culturas congeladas ou congelamento- dessecação, para propagação de iniciadores de volume ou como as chamadas culturas "Direct Vat Set" (Conjunto de Cubas Direto) (DVS), destinados para a inoculação direta em um frasco de fermentação ou cuba para a produção de um produto de leiteria, tal como um produto de leite fermentado ou um queijo. Tais culturas de bactérias de ácido láctico são em geral referidas como "cultura de iniciador" ou "iniciadores".
[0026] O termo "mesófilo" aqui se refere aos microrganismos que crescem melhor a temperaturas moderadas (15°C-40°C). As bactérias mesofílicas mais úteis industrialmente incluem Lactococcus spp. e Leuconostoc spp. O termo "fermentação mesofílica" aqui se refere à fermentação em uma temperatura entre cerca de 22°C e cerca de 35°C. O termo "produto de leite fermentado mesofílico" se refere aos produtos de leite fermentado preparados pela fermentação mesofílica de uma cultura inicial mesofílico, e incluem tais produtos de leite fermentado como leitelho, leite azedo, leite cultivado, smetana, creme azedo e queijo fresco, tais como queijo quarc, tvarog e creme.
[0027] O termo "termófilo" aqui se refere aos microrganismos que medram melhor em temperaturas acima de 43°C. As bactérias termofílicas mais úteis industrialmente incluem Streptococcus spp. e Lactobacillus spp. O termo "fermentação termofílica" aqui se refere à fermentação em uma temperatura acima de cerca de 35°C, tal como entre cerca de 35°C a cerca de 45°C. O termo "produto de leite fermentado termofílico" se refere aos produtos de leite fermentado preparados por fermentação termofílica de uma cultura termofílica inicial e incluem tais produtos de leite fermentado como conjunto de iogurte, iogurte agitado e iogurte de beber.
[0028] O termo "leite" deve ser compreendido como a secreção láctea obtida ordenhando qualquer mamífero, tais como vacas, ovelhas, cabras, búfalos ou camelos. Em uma modalidade preferida, o leite é leite de vaca. O termo leite também inclui soluções de proteína/gordura feitas de materiais de plantas, por exemplo, leite de soja.
[0029] O termo "substrato de leite" pode ser qualquer material cru ou e/ou processado de leite, que pode ser submetido à fermentação de acordo com o método da invenção. Desse modo, substratos de leite úteis incluem, mas não são limitados a, soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos do tipo leite compreendendo proteína, tal como leite integral ou com baixo teor de gordura, leite desnatado, soro de leite coalhado, leite em pó reconstituído, leite condensado, leite desidratado, soro, permeado de soro, lactose, líquido de cristalização de lactose, concentrado de proteína de soro, ou creme. Obviamente, o substrato de leite pode se originar de qualquer mamífero, por exemplo, sendo leite de mamífero substancialmente puro, ou leite em pó reconstituído.
[0030] Antes da fermentação, o substrato de leite pode ser homogeneizado e pasteurizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0031] "Homogeneizando" como usado aqui significa misturar intensivamente para obter uma suspensão ou emulsão solúvel. Se a homogeneização é realizada antes da fermentação, ela pode ser realizada de maneira a decompor a gordura do leite em tamanhos menores de modo que ela não mais se separa do leite. Isto pode ser realizado forçando o leite em pressão alta através de pequenos orifícios.
[0032] "Pasteurizar" como usado aqui significa tratamento do substrato de leite para reduzir ou eliminar a presença de organismos vivos, tais como microrganismos. Preferivelmente, a pasteurização é alcançada mantendo uma temperatura especificada, por um período de tempo especificado. A temperatura especificada é normalmente alcançada por aquecimento. A temperatura e a duração podem ser selecionadas a fim de matar ou desativa\r certas bactérias, tais como nocivas. Uma etapa de congelamento rápido pode seguir.
[0033] "Fermentação" nos métodos da presente invenção significa a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos, através da ação de um microrganismo. Preferivelmente, a fermentação nos métodos da invenção compreende a conversão de lactose para ácido láctico.
[0034] Processos de fermentação, para ser usados na produção de produtos de leiteria, são bem conhecidos e a pessoa versada na técnica saberá como selecionar condições de processo apropriadas, tais como temperatura, oxigênio, quantidade e características de microrganismo(s) e tempo de processar. Obviamente, as condições de fermentação são selecionadas de maneira a suportar a realização da presente invenção, isto é, para obter um produto de leiteria em forma sólida (tal como um queijo) ou líquida (tal como um produto de leite fermentado).
[0035] As composições da invenção provêm a vantagem que microrganismos indesejáveis selecionados de fungos, bactérias e misturas dos mesmos, por exemplo, em alimento, produtos de alimentação e farmacêuticos e em seres humanos e animais, podem ser inibidos. A prevenção e/ou inibição do crescimento de fungos, tais como leveduras e fungos, é particularmente prevista. Desta maneira, em uma modalidade preferida, o termo "antimicrobiano" é para ser compreendido como "antifúngico".
[0036] O termo "microrganismos indesejáveis" aqui se refere aos microrganismos, tais como bactérias e fungos, tais como leveduras, que são patogênicas e/ou capazes de deteriorar alimento, produtos de alimentação ou farmacêuticos. As composições da invenção provêm a vantagem de que microrganismos indesejáveis selecionados de fungos, bactérias e misturas dos mesmos, por exemplo, em alimento, produtos de alimentação e farmacêuticos e em seres humanos e animais, podem ser inibidos. A prevenção e/ou inibição do crescimento de fungos, tais como leveduras e fungos, é particularmente prevista.
[0037] Os termos "inibir" e "estar inibindo", em relação às leveduras e fungos, significam, por exemplo, que o crescimento ou o número ou a concentração de leveduras e fungos, por exemplo, em produtos alimentícios e/ou na superfície de produtos alimentícios compreendendo as cepas, de acordo com a presente invenção, é mais baixo do que em produtos alimentícios e/ou na superfície de produtos alimentícios que não compreendem tais cepas.
[0038] No presente contexto, o termo "mutante" deverá ser compreendido como a cepa derivada de uma cepa da invenção por meio de, por exemplo, engenharia genética, radiação e/ou tratamento químico. É preferido que o mutante seja um mutante funcionalmente equivalente, por exemplo, um mutante que tem substancialmente as mesmas, ou melhoradas propriedades (por exemplo, em relação às propriedades antifúngicas) como a cepa mãe. Tal mutante faz parte da presente invenção. Especialmente, o termo "mutante" se refere a uma cepa obtida submetendo uma cepa da invenção a qualquer tratamento de mutagenização convencionalmente usado, incluindo tratamento com um mutagênio químico tal como sulfonato de etano metano (EMS) ou N-metil-N'-nitro-N-nitroguanidina (NTG), luz UV ou para um mutante ocorrendo espontaneamente. Um mutante pode ter sido submetido a diversos tratamentos de mutagenização (um único tratamento deverá ser compreendido como uma etapa de mutagenização seguida por uma etapa de varredura/seleção), mas atualmente é preferido que não mais do que 20, ou não mais do que 10, ou não mais do que 5 tratamentos (ou etapas de varredura/seleção) sejam realizadas. Em um mutante presentemente preferido, menos do que 5%, ou menos do que 1% ou ainda menos do que 0,1% de nucleotídeos, no genoma bacteriano, tenham sido desviados com outro nucleotídeo, ou deletado, em comparação à cepa mãe.
[0039] O uso dos termos "um" e "uma" e "o/a" e referentes similares no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados para cobrir ambos, o singular e o plural, a menos que de outra maneira indicado aqui ou claramente contraditório pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser considerados como termos ilimitados (isto é, significando "incluindo, mas não limitado a,") a menos que de outra maneira observado. A enumeração de faixas de valores aqui é meramente destinada a servir como um método estenográfico de se referir individualmente a cada valor separado se enquadrando na faixa, a menos que de outra maneira indicado aqui, e cada valor separado está incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente mencionado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem apropriada, a menos que de outra maneira indicado aqui ou contraditado pelo contexto. O uso de qualquer um ou todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") providos aqui, é destinado meramente a melhor esclarecer a invenção e não coloca uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado de outra maneira. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial à prática da invenção.
Implementação e aspectos da invenção
[0040] Os presentes inventores fizeram varredura entre 200 candidatos de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei e Lactobacillus rhamnosus para verificar as cepas mais eficientes contra uma ampla gama de microrganismos, tais como leveduras e fungos.
[0041] As varreduras foram realizadas em um modelo de ensaio imitando produtos de leite fermentado mesofílicos, tanto quanto possível, em meio baseado em leite para o qual uma relevante cultura inicial foi adicionada, com ou sem candidatos bioprotetores, e que foi fermentado sob condições relevante para os produtos de leite fermentado mesofílico. Organismos alvos foram isolados de produtos de leite fermentado mesofílico. Ambas as bactérias de ácido láctico purificadas das culturas HOLDBAC de Danisco A/S, Dinamarca, como também HOLDBAC™ YM-B completo e culturas de HOLDBAC™ YM- C, contendo ambas as bactérias de ácido láctico e bactérias de ácido propiônico, foram usadas como ponto de referência.
[0042] O ensaio modelo é descrito no Pedido de Patente Europeu no. EP11161609.0.
[0043] Dezessete candidatos entre Lactobacillus paracasei e Lactobacillus rhamnosus foram verificados geralmente inibir os 12 fungos indicadores, como também, ou melhor, do que as bactérias de ácido láctico pontos de referência, quando testadas a 25°C.
[0044] Quando testada em iogurte uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, uma cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, que foi depositada com a Coleção Germânica de Microrganismos e Culturas de Células (DSMZ), sob a avaliação no. DSM23035 mostraram ser significativamente melhores em inibir leveduras e fungos, do que uma cultura bioprotetora comercialmente disponível.
[0045] O efeito de inibição de uma cepa contra as leveduras e os fungos poderá ser determinado armazenando os produtos de leite fermentado em uma temperatura apropriada, durante um tempo de armazenamento, como descrito nos Exemplos abaixo.
[0046] Em geral, a temperatura apropriada, em que este método deverá ser realizado, depende da temperatura em que o alimento, produto de alimentação ou farmacêutico específico é normalmente armazenado e/ou preparado. A temperatura em que os produtos são normalmente armazenados são entre 5°C e 26°C, preferivelmente a temperatura é cerca de 8°C.
[0047] O tempo de armazenamento na temperatura depende do tempo durante o qual o alimento, produto de alimentação, ou farmacêutico é normalmente armazenado (prazo de validade). O tempo de armazenamento normalmente é de 5-65, preferivelmente 7-60 dias, mais preferivelmente 7-28 dias, e ainda mais preferivelmente o tempo de armazenamento é cerca de 21 dias.
[0048] Por isso, um primeiro aspecto da presente invenção se refere a uma cepa de Lactobacillus rhamnosus selecionada do grupo consistindo em cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 que foi depositada com a Coleção Germânica de Microrganismos e Culturas de Células (DSMZ) sob avaliação No. DSM23035 e cepas de mutantes derivadas das mesmas.
[0049] Desse modo, à parte da cepa depositada mencionada acima, a invenção também pertence aos mutantes que eram derivados dessa cepa, isto é, eles foram obtidos usando a cepa CHCC5366 depositada como um material de partida. A cepa de mutantes pode ser derivada da cepa depositada, por exemplo, por meio de engenharia genética, radiação, luz UV, tratamento químico e/ou métodos que induzem mudanças no genoma. Um mutante, de acordo com a invenção, inibirá e/ou evitará o crescimento de certas bactérias ou fungos, preferivelmente fungos. É preferido que o mutante tenha essencialmente pelo menos 80% ou mais, pelo menos 90% ou mais, pelo menos 95% ou mais, ou ainda até 100% ou mais de efeito antifúngico em comparação com sua cepa mãe, quando determinado, por exemplo, em um ensaio como descrito no Exemplo 1, usando um dos fungos P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor, D. hansenii ou P. crustosum como um organismo de referência, cujo crescimento deve ser inibido.
[0050] Está claro para a pessoa versada que, usando a cepa depositada como material de partida, o leitor versado pode, através de mutagênese convencional ou técnicas de reisolamento, rotineiramente obter mutantes ou derivados adicionais dos mesmos que retêm as características e vantagens relevantes aqui descritas. Por conseguinte, o termo "cepas mutantes derivadas do mesmo" do primeiro aspecto se refere às cepas mutantes obtidas usando a cepa depositada como material de partida.
[0051] Um segundo aspecto se refere a uma composição antifúngica compreendendo pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, preferivelmente cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366.
[0052] Quando testando a cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 em combinação com diferentes cepas de Lactobacillus paracasei, foi inesperadamente verificado que essas combinações eram ainda melhores do que de uma cepa sozinha, mesmo quando a concentração total de células era idêntica. Em uma modalidade, a invenção se refere à combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC12777. Em outra modalidade, a invenção se refere à combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676. Essas combinações pareceram ser mais eficientes do que as culturas de ponto de referência HOLDBAC™ YM-B e HOLDBAC™ YM-C de Danisco, Dinamarca.
[0053] Em consequência, em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere à composições antimicrobianas e mais preferivelmente antifúngicas, compreendendo cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 que foi depositada com a Coleção Germânica de Microrganismos e Culturas de Células (DSMZ) sob o registro No. DSM23035, ou um mutante derivado dos esmos e, pelo menos, uma cepa de Lactobacillus paracasei. Preferivelmente, a pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei é selecionada do grupo consistindo em cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 com registro no. DSM25612, cepa de Lactobacillus paracasei CHCC12777 com registro no. DSM24651 e cepas de mutantes derivadas dessas cepas depositadas.
[0054] Em um aspecto, a invenção desse modo provê um antimicrobiano e mais preferivelmente composição antifúngica compreendendo cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 ou um mutante derivado da mesma, e cepa de Lactobacillus paracasei CHCC12777 ou um mutante derivado da mesma. Em um outro aspecto, a invenção provê uma composição antimicrobiana, e mais preferivelmente antifúngica, compreendendo pelo menos a cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 ou um mutante derivado da mesma, e cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 ou um mutante derivado da mesma. Preferivelmente, a combinação da cepa de Lactobacillus paracasei e a cepa de Lactobacillus rhamnosus, nas composições da invenção, atua sinergisticamente em termos de atividade antimicrobiana e/ou antifúngica.
[0055] A composição antifúngica tipicamente compreende as bactérias em uma forma concentrada incluindo concentrações congeladas, secas ou congelamento-dessecação, tipicamente tendo uma concentração de células viável, que é na faixa de 104 a 1012 UFC (unidades formando colônias) por grama da composição, incluindo pelo menos 104 UFC por grama da composição, tal como pelo menos 105 UFC/g, por exemplo, pelo menos 105 UFC/g, tal como pelo menos 107 UFC/g, por exemplo, pelo menos 108 UFC/g, tal como pelo menos 109 UFC/g, por exemplo, pelo menos 1010 UFC/g, tal como pelo menos 1011 UFC/g. Desse modo, a composição da invenção está preferivelmente presente em uma forma congelada, seca ou de congelamento- dessecação, por exemplo, como uma cultura Direct Vat Set (DVS). Entretanto, como usado aqui, a composição pode também ser um líquido que é obtido depois da suspensão dos concentrados de células congeladas, secas ou de congelamento-dessecação, em um meio líquido tal como água ou tampão de PBS. Quando a composição da invenção é uma suspensão, a concentração de células viáveis é na faixa de 104 a 1012 UFC (unidades formadoras de colônias) por mL da composição, incluindo pelo menos 104 UFC por mL da composição, tal como pelo menos 105 UFC/mL, por exemplo, pelo menos 105 UFC/mL, tal como pelo menos 107 UFC/mL, por exemplo, pelo menos 108 UFC/mL, tal como pelo menos 109 UFC/mL, por exemplo, pelo menos 1010 UFC/mL, tal como pelo menos 1011 UFC/mL.
[0056] A composição pode, como componentes adicionais, conter crioprotetores e/ou aditivos convencionais, incluindo nutrientes tais como, extratos de levedura, açúcares e vitaminas, por exemplo, vitamina A, C, D, K ou vitaminas da família da vitamina B. Crioprotetores apropriados, que podem ser adicionados às composições da invenção, são componentes que melhoram a tolerância ao frio dos microrganismos, tais como manitol, sorbitol, tripolifosfato de sódio, xilitol, glicerol, rafinose, maltodextrins, eritritol, treitol, trealose, glicose e frutose. Outros aditivos podem incluir, por exemplo, carboidratos, flavorizantes, minerais, enzimas (por exemplo, coalho, lactase e/ou fosfolipase).
[0057] Nas composições da invenção que compreendem a cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e uma cepa de Lactobacillus paracasei, a proporção entre a cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e a cepa de Lactobacillus paracasei, por exemplo, a proporção da concentração, ou número de bactérias Lactobacillus rhamnosus e a concentração ou número de bactérias Lactobacillus paracasei, preferivelmente quantidades de 1:100 a 100:1, preferivelmente de 1:10 a 10:1.
[0058] A composição antifúngica da presente invenção pode ser usada em conexão com qualquer alimento, e produto de alimentação e farmacêutico que é susceptível à degradação microbiana e/ou contaminação com leveduras e fungos. Esses incluem, mas não são limitados a frutas e vegetais incluindo produtos derivados, grãos e produtos derivados de grãos, produtos de leiteria, carne, aves domésticas, e alimentos do mar. Em modalidades particularmente preferidas, a composição é usada em conexão com produto de leiteria e/ou carne ou ave doméstica. Em uma modalidade preferida, as composições da invenção são para uso como um aditivo na preparação de produtos de leiteria, tais como iogurte, tvarog, creme de soro, queijo de creme e similares.
[0059] Em uma modalidade preferida, as composições da invenção são usadas contra fungos, tais como leveduras e fungos. Isto significa que as composições são usadas para inibir e/ou prevenir o crescimento de fungos que causam contaminação em processos da indústria de leiteria, em particular em processos de fermentação de leite. As composições da presente invenção podem ser usadas, por exemplo, para inibir e/ou prevenir o crescimento de leveduras, tais como leveduras do gênero Klyveromyces (por exemplo, K. marxianus, K. lactis), Pichia (por exemplo, P. fermentans), Yarrowia (por exemplo, Y. lipolytica), Candida (por exemplo, C. sake), e similares; ou fungos, tais como fungos do gênero Penicillium (por exemplo, P. nalgiovense, P. commune, P. crustosum, P. brevicompactum, P. glabrum), Mucor spp., Cladiosporium ssp., Aspergillus (por exemplo, A. versicolor), Debaryomyces (por exemplo, D. hansenii), e similares. É especialmente preferido usar as composições da invenção para inibir e/ou prevenir o crescimento das espécies Klyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica, Penicillium nalgiovense, Cladiosporium ssp., Penicillium commune, Mucor ssp., Penicillium brevicompactum, Aspergillus versicolor, Penicillium crustosum, Kluyveromyces lactis, e/ou Debaryomyces hansenii.
[0060] A composição antifúngica, de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, pode também ser usada como um produto farmacêutico, preferivelmente um para tratar infecções com fungos patogênicos, tais como leveduras patogênicas.
[0061] Em um terceiro aspecto, a presente invenção é dirigida para um alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, compreendendo uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com o primeiro aspecto da invenção ou uma composição antifúngica, de acordo com o segundo aspecto da invenção.
[0062] Em uma modalidade preferida, o alimento, produto de alimentação ou farmacêutico é um produto alimentício.
[0063] Em uma modalidade mais preferida tal produto alimentício é selecionado do grupo consistindo em frutas e produtos derivados de frutas, produtos de vegetais e derivados de vegetais, grãos e produtos derivados de grãos, produtos de leiteria, carne, aves domésticas e alimentos do mar e misturas dos mesmos.
[0064] Em uma modalidade ainda mais preferida, o produto alimentício é um produto de leiteria, preferivelmente um produto de leite fermentado mesofílico ou termofílico, tal como queijo fresco, um iogurte, um creme de soro ou tvarog.
[0065] Em outra modalidade preferida, o produto alimentício é carne ou aves domésticas.
[0066] Em uma modalidade preferida, o alimento, a alimentação ou o produto farmacêutico é um produto farmacêutico.
[0067] Preferivelmente, o produto farmacêutico é um produto útil para administração da composição antifúngica, de acordo com um segundo aspecto da presente invenção, para um ser humano ou um animal para inibir microrganismos patogênicos e aliviar sintomas relacionados aos microrganismos patogênicos. Exemplos de tais sintomas incluem sintomas relacionados à infecção por levedura. Em tal modalidade, o produto farmacêutico pode ser uma forma de dosagem unitária compreendendo a composição antifúngica. Preferivelmente, a forma de dosagem unitária é uma cápsula ou um comprimido. Entretanto, a forma de dosagem unitária pode também ser apropriada para aplicação na mucosa ou na pele e, desse modo, ser na forma de uma pasta, creme, unguento e similares.
[0068] Um quarto aspecto da presente invenção se refere a um método para preparar um alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção, compreendendo adicionar pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição anti-fúngica, de acordo com o segundo aspecto da invenção, durante a preparação do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico. Preferivelmente, o método também compreende a etapa de controlar os parâmetros de preparação durante a preparação de tal maneira que a concentração, da pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus permanece constante ou é aumentada.
[0069] Em uma modalidade preferida, a concentração da pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus é, pelo menos, 1x105 UFC/g ou cada uma pelo menos 1x105 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada uma pelo menos 1x105 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico. Preferivelmente, a concentração da pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus é pelo menos 5x105 UFC/g ou cada uma de pelo menos 5x105 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada um de pelo menos 5x105 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, tal como pelo menos 1x107 UFC/g, ou cada um de pelo menos 1x107 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada um de pelo menos 1x105 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, tal como pelo menos 5xl07 UFC/g, ou cada um de pelo menos 5xl07 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada um de pelo menos 5x105 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico.
[0070] Quando o alimento, produto de alimentação ou farmacêutico é preparado pela adição de uma composição compreendendo a cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 ou um mutante derivado da mesma e pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei, a concentração da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 ou o mutante derivado da mesma e/ou a concentração da pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei, é cada um pelo menos 1x105 UFC/g ou cada um pelo menos 1x105 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada um pelo menos 1x105 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico. Preferivelmente, a concentração da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, ou o mutante derivado da mesma e/ou a concentração da pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei é cada um pelo menos 5x105 UFC/g, ou cada um pelo menos 5xl05 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada um pelo menos 5x105 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico. Em uma modalidade adicional, a concentração da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, ou o mutante derivado da mesma e/ou a concentração da pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei é cada um pelo menos 1x108 UFC/g, ou cada um pelo menos 1x108 UFC/mL do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico, ou cada um pelo menos 1x107 UFC/cm2 da superfície do alimento, produto de alimentação ou farmacêutico.
[0071] Em uma modalidade preferida, os parâmetros de preparação são controlados durante a preparação de tal maneira que a concentração da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (ou o mutante derivado da mesma) e a pelo menos uma cepa de Lactobacillus paracasei aumenta ou permanece constante.
[0072] Uma composição antifúngica, de acordo com a presente invenção, é mais prontamente usada misturando com e/ou aplicando em um alimento, produto de alimentação ou farmacêutico misturável, mas deverá também ser eficaz para tratar a superfície de produtos alimentícios sólidos, ou o interior de tais produtos, por exemplo, por injeção. Em ainda outras modalidades, a composição pode ser aplicada como um escabeche, empanado, esfregar temperos, acetinar, mistura corantes, e similares, os critérios chave sendo que a composição antifúngica está disponível para a superfície submeter à degradação e contaminação de bactérias com leveduras e fungos. Em ainda outras modalidades, a composição pode ser indiretamente colocada em contato com a superfície do alimento aplicando a composição, a embalagem do alimento e, depois disso, aplicar a embalagem para a superfície do alimento. A quantidade ideal para ser usada dependerá da composição do produto alimentício particular a ser tratado, e o método usado para aplicar a composição para a superfície do alimento, mas pode ser determinada por simples experimentação.
[0073] Em uma modalidade muito preferida, o método compreende uma ou mais etapas de fermentação e a pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, ou a composição antifúngica pode ser adicionada ao alimento, produto de alimentação ou farmacêutico antes, durante ou depois de tais uma ou mais etapas de fermentação.
[0074] Preferivelmente, o método compreende a fermentação de um substrato, tal como um substrato de leite, na presença de pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com a invenção, por um período de tempo suficiente para o aparecimento da atividade antifúngica da pelo menos uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com a invenção. Esta atividade antifúngica tem o efeito de inibir o desenvolvimento de leveduras e/ou fungos no produto fermentado, com a pelo menos uma cepa.
[0075] Em uma modalidade ainda mais preferida, o método compreende fermentar um substrato de leite com uma cultura inicial compreendendo pelo menos uma cepa dos gêneros selecionados de Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e Leuconostoc, tal como pelo menos uma cepa de Lactobacillus bulgaricus e pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus, ou tal como pelo menos uma cepa de Lactococcus lactis subespécie lactis, pelo menos uma cepa de Leuconostoc mesenteroides subespécie cremoris de pelo menos uma cepa de Lactococcus lactis subespécie de diacetylactis.
[0076] O quinto aspecto da invenção se refere a um produto alimentício que pode ser obtido pelo método de acordo com o quarto aspecto da invenção.
[0077] O sexto aspecto da presente invenção é dirigido ao uso de uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição antifúngica, de acordo com o segundo aspecto, para preparar um alimento, produto de alimentação ou farmacêutico. Preferivelmente, o produto alimentício produzido pelo uso da cepa de Lactobacillus paracasei, de acordo com o primeiro aspecto ou a composição antifúngica de acordo com o segundo aspecto, é um queijo, tal como um Cottage, Feta, Cheddar, Parmesão, Mussarela, Emmentaler, Danbo, Gouda, Edam, tipo Feta, queijo azul, queijo de salmoura, Camembert ou Brie.
[0078] O último aspecto da invenção se refere ao uso de uma cepa de Lactobacillus rhamnosus, de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição antifúngica de acordo com o segundo aspecto, para inibir o crescimento de leveduras e fungos, em particular nos produtos alimentício e alimentação.
[0079] Modalidades da presente invenção são descritas abaixo, a título de exemplos não limitantes.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Estudo de desafio sobre iogurte com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366.
[0080] Para o exame visual do efeito inibidor da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 nos diferentes fungos, P. brevicompactum, P. commune, A. versicolor e P. crustosum, iogurte com 1,5% de gordura foi preparado:
[0081] Leite homogeneizado (1,5% de gordura) foi tratado por calor 95°C±1°C durante 5 minutos em garrafas de 1 L, em um banho de água e resfriado imediatamente. Uma cultura inicial comercial (F-DVS YF- L901 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) foi inoculada a 0,02%. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (20DCU/100L) ou Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/mL) e uma garrafa foi usada como referência e só inoculada com cultura inicial.
[0082] O leite foi fermentado a 43°C±1°C até que o pH de 4,60±0,1 foi alcançado. O iogurte resultante foi despejado em xícaras (100 g) e armazenado a 7°C±1°C.
[0083] Um dia depois da preparação de iogurte, diferentes fungos foram inoculados como contaminantes de superfície em xícaras duplicadas de iogurte com uma marca na superfície do iogurte com um alvo de 100 esporos/marca. O crescimento dos fungos foi avaliado visualmente depois de armazenagem por 45 dias a 7°C±1°C
[0084] O resultado do teste de iogurte está apresentado na Figura 1, mostrando que P. brevicompactum (Ml), P. commune (M6), A. versicolor (M7) e P. crustosum (M10) crescem bem no iogurte feito de leite fermentado somente com a cultura inicial YF-L901 (fileira do topo) ou com a cultura inicial e a cultura de HOLDBAC™ YM-B (fileira do meio). Contrastando, quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 estava presente durante a fermentação do leite (fileira do fundo) o crescimento de todos os fungos testados foi inibido.
Exemplo 2: Determinações quantitativas do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 contra Debaryomyces hansenii.
[0085] Para um exame quantitativo do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 em D. hansenii, foi preparado iogurte:
[0086] Leite homogeneizado (1,5% de gordura) foi tratado por calor a 95°C±1°C por 5 minutos em garrafas de 1 L em um banho de água. O leite foi resfriado imediatamente. Cada garrafa foi inoculada com uma cultura inicial comercial (F-DVS YF-L901 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) a 0,02%. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100L) ou HOLDBAC™ YM-C (10 DCU/100L) ou Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/g) e uma garrafa foi usada como referência e inoculada somente com cultura inicial.
[0087] O leite foi fermentado a 43°C±1°C até o pH de 4,60±0,05 ter sido alcançado. O iogurte resultante foi despejado em xícaras (aproximadamente 75 mL) e armazenado a 7°C±1°C.
[0088] O dia depois de preparar o iogurte, as xícaras foram inoculadas em duplicata com 0,75 mL/cup de levedura, em um alvo de 20 CFU/g. A levedura foi igualmente dispersa no iogurte. As xícaras foram armazenadas sob uma tampa a 7°C±1°C e analisadas em intervalos apropriados para o nível de contaminação de D. hansenii, plaqueando 1 mL de iogurte e ainda diluições apropriadas 1- vez feitas em peptona salina no ágar-ágar de Glicose de Cloramfenicol de Levedura (YGC) seguida pela incubação aeróbica por 5 dias a 25°C.
[0089] Como ilustrado na Figura 2, o crescimento de D. hansenii foi inibido na presença da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366, quando inoculada junto com a cultura inicial YF-L901 antes da fermentação. Uma cepa causou inibição significativamente mais alta do que as culturas comerciais, HOLDBAC™ YM-B e HOLDBAC™ YM-C.
Exemplo 3: Determinações semiquantitativas do efeito inibidor de Lb. paracasei CHCC14676 e Lb. rhamnosus CHCC5366 sozinhas e em combinação contra diferentes contaminantes de humo.
[0090] Para os exames semiquantitativos de Lb. paracasei CHCC14676 e Lb. rhamnosus CHCC5366 sozinha e em combinação, um ensaio de ágar-ágar foi usado, semelhante ao processo de preparação e produto de iogurte:
[0091] Leite homogeneizado (1,5% de gordura peso/volume) foi tratado por calor a 95°C por cinco minutos e resfriado imediatamente. Uma cultura inicial comercial (F-DVS YC-350 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) foi inoculado a 0,02%, e o leite foi distribuído para garrafas de 220 mL. As garrafas foram ainda inoculadas com Lb. paracasei CHCC14676, Lb. rhamnosus CHCC5366 e uma combinação das duas cepas, respectivamente, em concentrações totais de 1x1O7 CFU/mL. Uma garrafa sem inoculação adicional do que a cultura inicial foi usada como referência. Além disso, 5% de um indicador de pH de bromocresol púrpura e bromocresol verde foram adicionados a todas as garrafas para conseguir uma indicação da velocidade de acidificação, e para obter uma cor azul/verde do meio que faria o crescimento subsequente de leveduras e fungos alvos mais facilmente detectáveis. Todas as garrafas foram incubadas em um banho de água a 43±1°C e fermentadas nessas condições até que um pH de 4,60±0,1 foi alcançado. Depois da fermentação, as garrafas foram imediatamente resfriadas em gelo e vigorosamente agitadas para quebrar o coágulo. Depois o leite fermentado foi aquecido para uma temperatura de 40°C e adicionado a 40 mL de 5% de uma solução de ágar-ágar estéril que tinha sido fundida e esfriada para 60°C. Esta solução foi depois derramada em pratos Petri estéreis e as placas foram secas em uma bancada LAF por 30 minutos.
[0092] Suspensões de esporos totalmente crescidos, em diluições apropriada dos fungos Penicillium nalgiovense (10x), Penicillium commune (100x), Aspergillus versicolor (100x) e Penicillium crustosum (100x) selecionados foram marcados nas placas. As placas foram incubadas a 7°C e examinadas para o crescimento de fungos em intervalos apropriados, regulares.
[0093] Resultados do ensaio de ágar são apresentados na Figura 3, mostrando que todos os fungos testados cresceram muito bem nas placas de ágar de leite fermentado somente com a cultura inicial (referência). Entretanto, quando Lb. paracasei CHCC14676 ou Lb. rhamnosus CHCC5366 estavam presentes durante a fermentação do leite, as placas resultantes reduziram firmemente o crescimento de todos os fungos. Além disso, quando Lb. paracasei CHCC14676 e Lb. rhamnosus CHCC5366 estavam presentes em combinação, durante a fermentação do leite, inibição ainda mais resistente foi observada para Penicillium commune, Aspergillus versicolor e Penicillium crustosum marcadas nas placas.
Exemplo 4: Estudo de desafio com Lb. rhamnosus CHCC5366 e sorbato de potássio.
[0094] Leite pasteurizado contendo 0,17% de gordura foi usado para preparar três lotes diferentes de iogurte, usando a cultura inicial comercial referido no Exemplo 1. A cultura inicial foi inoculada a 0,013%. Antes da fermentação, sorbato de potássio (0,023%) foi adicionado ao primeiro lote, Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/g) foi adicionado ao segundo lote, enquanto o terceiro lote foi usado como uma referência contendo somente a cultura inicial. A fermentação foi realizada a 43°C até que um pH de 4,55 foi alcançado. Depois de alcançar o pH 4,55, o iogurte foi armazenado a 7°C.
[0095] Os três tipos diferentes de iogurte foram distribuídos em pequenas xícaras com aproximadamente 100 g em cada uma, e a superfície inoculada com cada um dos fungos a seguir, anteriormente isolados dos produtos de leite fermentado estragados, para alcançar uma inoculação alvo de aproximadamente 1000 esporos /xícara: Penicillium solitum, Penicillium palitans, Penicillium discolor, Penicillium spathulatum, Penicillium commune, Penicillium crustosum,
[0096] Os iogurtes foram incubados a 7°C por 60 dias, e o crescimento dos diferentes fungos foi visualmente monitorado tirando os desenhos no fim do período de 60 dias.
[0097] Os resultados apresentados na Figura 4 demonstram que a presença de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 drasticamente reduziu o crescimento e a formação da cor típica azul/verde dos vários fungos no iogurte, durante 60 dias de armazenamento a 7°C. O efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 na extensão do crescimento e formação da cor dos fungos foi verificado ser consideravelmente mais forte do que o efeito enxertado pela adição de 0,023% de sorbato de potássio.
Exemplo 5: O estudo de desafio sobre o iogurte Grego com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação.
[0098] Para o exame visual do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação no Mucor ssp. Iogurte Grego foi preparado substancialmente como a seguir:
[0099] 1,5% de gordura de leite pasteurizado foi inoculada com uma cultura inicial comercial (F-DVS YF-L901 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) a 0,02%. Um lote inoculado somente com cultura inicial foi usado como uma referência. Outro lote foi ainda inoculado com uma combinação da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x105 CFU/g) e a cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x105 CFU/g).
[00100] O leite foi fermentado a 43°C±1°C para um pH final de 4,55 (6-7 horas). Subsequentemente, o iogurte foi resfriado para 25°C±1°C com uma pressão traseira de 200 KPa (2 bar) e armazenado a 6°C±1°C.
[00101] Um dia depois da preparação do iogurte, Mucor ssp. foi inoculado como contaminante de superfície em xícaras de duplicata de iogurte, aplicando uma marca na superfície do iogurte com uma concentração de inoculação alvo de 100 esporos/marca. O crescimento do humo foi avaliado visualmente depois de armazenamento por 15 dias a 22°C±1°C
[00102] Os resultados do teste de iogurte Grego são apresentados na Figura 5, mostrando que Mucor ssp. cresce bem no iogurte feito de leite fermentado somente com a cultura inicial (xícara da esquerda). Ao contrário, quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 estavam presentes durante a fermentação do leite (xícara da direita) o crescimento de Mucor ssp. foi inibido.
Exemplo 6: Segundo estudo de desafio sobre iogurte Grego com uma combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676.
[00103] Para o exame visual do efeito inibidor da combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 no humo de pão preto Rhizopus stolonifer, o iogurte Grego foi preparado substancialmente como a seguir:
[00104] 1,5% de leite de gordura pasteurizado foram inoculados com uma cultura inicial comercial (F-DVS YF-L901 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) a 0,02%. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 L), com cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/g), ou com uma combinação de cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x105 CFU/g) e cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x105 CFU/g). Um lote foi usado como referência e somente inoculado com cultura inicial.
[00105] O leite foi fermentado a 43°C±1°C para um pH final de 4,55 (6-7 horas). Subsequentemente, o iogurte foi resfriado para 25°C±1°C com uma pressão traseira de 200 KPa (2 bar) e armazenado a 6°C±1°C.
[00106] Um dia depois da preparação do iogurte, Rhizopus stolonifer foi inoculado como um contaminante de superfície em xícaras em duplicata de iogurte, aplicando uma marca na superfície do iogurte com uma contaminação alvo de 100 esporos/marca. O crescimento do humo foi avaliado visualmente depois do armazenamento por 42 dias a 7°C±1°C.
[00107] O resultado do teste de iogurte Grego é apresentado na Figura 6, mostrando que Rhizopus stolonifer cresce bem no iogurte feito de leite fermentado somente com a cultura inicial ("R", isto é, referência) ou com a cultura inicial e a cultura de HOLDBAC™ YM-B (YM-B). Entretanto, quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5366) estava presente, o crescimento de Rhizopus stolonifer foi inibido significantemente. Quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 estavam, ambos, presentes durante a fermentação de leite (5366+14676) o crescimento de Rhizopus stolonifer foi inibido quase completamente.
Exemplo 7: Estudo de desafio sobre queijo branco de salmoura com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação.
[00108] Para o exame quantitativo do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação contra Saccharomyces cerevisiae, queijo branco de salmoura foi preparado:
[00109] Leite pasteurizado e padronizado foi inoculado com uma cultura inicial comercial (FD-DVS SafeIT-1 que pode ser obtida de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) a 40 U por 1000 L de leite. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 L), ou com uma combinação de cepa Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x105 CFU/g) e a cepa Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x105 CFU/g). Um lote foi usado como referência e somente inoculado com a cultura inicial. O leite foi tratado por coalho a 36°C±1°C, usando Chy-Max plus (obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) com 220 mL por 1000 L por 90 minutos antes de cortar. Em pH 6,0 a coalhada foi bombeada para os fungos e à esquerda para drenagem para um pH final de 4,8-4,7 (20-24 horas). Os queijos foram adicionados em latas com salmoura resfriada (8%) e armazenada a 5°C±1°C.
[00110] Um dia depois da preparação do queijo braço de salmoura, as latas foram inoculadas em duplicata com levedura em um alvo de 20 CFU/mL. A levedura foi igualmente dispersa em salmoura. As xícaras foram armazenadas sob uma tampa a 7°C±1°C por até 40 dias, e 10 g foram analisadas em intervalos apropriados para o nível de contaminação de Saccharomyces cerevisiae chapeando diluições apropriada 1 vez, feitas em peptona salina no ágar de Cloroanfenicol de Glicose de Levedura (YGC) seguido por incubação aeróbica por 5 dias a 25°C.
[00111] Como ilustrado na Figura 7, o crescimento de Saccharomyces cerevisiae foi inibido na presença de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação, quando inoculado junto com a cultura inicial SafeIT-1. As cepas causaram inibição significativamente mais elevada do que a cultura comercialmente disponível, HOLDBAC™ YM-B.
Exemplo 8: Segundo estudo de desafio sobre queijo branco de salmoura com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação.
[00112] Para o exame quantitativo do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676, em combinação contra Kluyveromyces marxianus, o queijo branco de salmoura foi preparado como descrito no exemplo 1, com a exceção de que as latas foram inoculadas com Kluyveromyces marxianus como contaminante de levedura.
[00113] Como ilustrado na Figura 8, o crescimento de Kluyveromyces marxianus foi inibido na presença de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação, quando inoculados junto com a cultura inicial SafeIT-1. As cepas causaram inibição significativamente mais elevada do que a cultura comercialmente disponível HOLDBAC™ YM-B.
Exemplo 9: Terceiro estudo de desafio sobre queijo branco de salmoura com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676, em combinação.
[00114] Para o exame visual do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 em combinação contra P. commune, queijo branco de salmoura foi preparado como descrito no exemplo 1.
[00115] 7 dias depois da preparação do queijo branco de salmoura, o queijo foi removido da salmoura e P. commune foi inoculado como contaminante de superfície em queijos duplicados com três marcas sobre a superfície do queijo, com um alvo de 100 esporos/marca. O crescimento de dois diferentes P. commune isolados foi avaliado visualmente, depois da armazenagem por 12 dias a 7°C±1°C e, subsequentemente, 16 dias a 12°C±1°C.
[00116] Os resultados do teste de salmoura branca são apresentados na Figura 9, mostrando que os dois P. commune isolados crescem bem no queijo de salmoura branca feito de leite inoculado somente com a cultura inicial (esquerda). Ao contrário, quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 estavam presentes durante a produção de queijo (direita) o crescimento de P. commune foi fortemente inibido.
Exemplo 10: Estudo de desafio em queijo branco de salmoura com Lactobacillus paracasei CHCC5366
[00117] Para o exame visual do efeito inibidor de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 contra P. crustosum, queijo branco de salmoura foi preparado:
[00118] Leite pasteurizado e padronizado foi inoculado com uma cultura inicial comercial (FD-DVS SafeIT-1 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) a 40 U por 1000 L de leite. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (10 DCU/100 I) ou cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/g). Um lote foi usado como referência e somente inoculado com cultura inicial. O leite foi tratado com coalho a 36°C±1°C usando Chy-Max plus (que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) com 220 mL por 1000 I por 90 minutos antes de cortar. Em pH de 6,0 a coalhada foi bombeada para o fungo e à esquerda por drenagem para um pH final de 4,8-4,7 (20-24 horas). Os queijos foram adicionados em latas com salmoura resfriada (8%) e armazenados a 5°C±1°C.
[00119] 7 dias depois da preparação do queijo branco de salmoura, o queijo foi removido da salmoura e P. crustosum foi inoculado como contaminante de superfície de queijos em duplicata com três marcas na superfície do queijo com um alvo de 100 esporos/marca. Crescimento do P. crustosum isolado foi avaliado visualmente depois de armazenamento por 11 dias a 12°C±1°C, e, subsequentemente, 16 dias a 12°C±1°C.
[00120] Os resultados do teste de salmoura branca são apresentados na Figura 10 mostrando que o isolado P. crustosum cresce bem no queijo de salmoura branca feito de leite inoculado somente com a cultura inicial (esquerda). Ao contrário, quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 estava presente durante a produção do queijo (direita) o crescimento de P. crustosum foi inibido. Exemplo 11: O estudo de desafio sobre iogurte com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e CHCC14676 contra Penicillium paneum
[00121] Para o exame visual do efeito inibidor de cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 sozinha ou em combinação com Lactobacillus paracasei CHCC14676 no humo P. paneum, iogurte com 1,5% de gordura foi preparado:
[00122] Leite homogeneizado (1,5% de gordura) foi tratado por calor a 95°C±1°C por 5 minutos em garrafas de 1 L em um banho de água e resfriado imediatamente. Uma cultura inicial comercial (F-DVS YF-L901 pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) foi inoculado a 0,02%. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (20DCU/100L), com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/mL) sozinho, ou com uma combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x105 CFU/mL) e Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5xl05 CFU/mL). Uma garrafa foi usada como referência e inoculada somente com cultura inicial.
[00123] O leite foi fermentado a 43°C±1°C até pH de 4,60±0,1 foi alcançado. O iogurte resultante foi derramado nas xícaras (100 g) e armazenado a 7°C±1°C.
[00124] Um dia depois da preparação de iogurte, diferentes fungos foram inoculados como contaminantes de superfície nas xícaras em duplicata de iogurte com uma marca na superfície do iogurte com um alvo de 100 de esporos/marca. O crescimento dos fungos foi avaliado visualmente depois da armazenagem por 28 dias a 7°C±1°C
[00125] O resultado do teste de iogurte é apresentado na Figura 11, mostrando que P. paneum cresce bem em iogurte feito de leite fermentado somente com a cultura inicial YF-L901 ou com a cultura inicial e a cultura de HOLDBAC™ YM-B. Ao contrário, quando o Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 estava presente durante a fermentação do leite, o crescimento de P. paneum foi fortemente reduzido, e a combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676 causou inibição de crescimento ainda mais acentuada de P. paneum.
Exemplo 12: O estudo de desafio sobre iogurte com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e CHCC14676 em diferentes temperaturas de armazenamento
[00126] Para o exame visual do efeito inibidor da cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 só ou em combinação com Lactobacillus paracasei CHCC14676 no humo P. crustosum a diferentes temperaturas de armazenamento, iogurte com 1,5% de gordura foi preparado:
[00127] Leite homogeneizado (1,5% de gordura) foi tratado por calor 95°C±1°C por 5 minutos em garrafas de 1 L em um banho de água e resfriado imediatamente. Uma cultura inicial comercial (F-DVS YF-L901 que pode ser obtido de Chr. Hansen A/S, Dinamarca) foi inoculada a 0,02%. O leite foi ainda inoculado com HOLDBAC™ YM-B (20 DCU/100L), com Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (1x107 CFU/mL) só, ou com uma combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 (5x105 CFU/mL) e Lactobacillus paracasei CHCC14676 (5x105 CFU/mL). Uma garrafa foi usada como referência e somente inoculada com cultura inicial.
[00128] O leite foi fermentado a 43°C±1°C até que um pH de 4,60±0,1 foi alcançado. O iogurte resultante foi despejado em xícaras (100 g) e armazenado a 7°C±1°C.
[00129] Um dia depois da preparação de iogurte Penicillium crustosum foi inoculado como contaminante de superfície nas xícaras de iogurte em duplicata com uma marca na superfície do iogurte com um alvo de 100 esporos/marca. O crescimento dos fungos foi avaliado visualmente depois da armazenagem por 36 dias a 7°C±1°C, 12°C±1°C ou 22°C±1°C.
[00130] O resultado do teste de iogurte é apresentado na Figura 12, mostrando que P. crustosum cresce bem em iogurte feito de leite fermentado somente com a cultura inicial YF-L901, ou com a cultura inicial e a cultura de HOLDBAC™ YM-B em todas as temperaturas de armaenagem. Ao contrário, quando Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 sozinho ou em combinação com Lactobacillus paracasei CHCC14676 estavam presentes durante a fermentação de leite, o crescimento de P. crustosum foi completamente evitado mediante armazenagem de ambos a 7°C±1°C e 12°C±1°C por 36 dias. Mediante armazenagem a 22°C±1°C, o crescimento de P. crustosum foi firmemente reduzido na presença de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e ainda mais firme na presença da combinação de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 e Lactobacillus paracasei CHCC14676.
DEPÓSITOS E SOLUÇÃO DE PERITO
[00131] O requerente solicita que a amostra dos microrganismos depositados declarados abaixo, só pode ser colocada à disposição para um perito, até a data em que a patente é concedida.
[00132] A cepa de Lactobacillus rhamnosus CHCC5366 foi depositada 2009-10-14 na Coleção Germânica de Microrganismos e Culturas de Células (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig e dado o registro No.: DSM23035.
[00133] A cepa de Lactobacillus paracasei CHCC12777 foi depositada 2011-03-15 na Coleção Germânica de Microorganismos e Culturas de Células (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig e dado o registro No.: DSM24651.
[00134] A cepa de Lactobacillus paracasei CHCC14676 foi depositada 2012-02-02 na Coleção Germânica de Microrganismos e Culturas de Células (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig e dado o registro No.: DSM25612.
[00135] O depósito foi feito de acordo com o tratado de Budapeste em reconhecimento internacional do depósito de microrganismos para os fins do procedimento de patente. REFERÊNCIAS EP0221499 EP0576780 EP1442113 US5.378.458 EP11161609.0 Kosikowski, F.V. and Mistry, V.V., "Cheese and Fermented Milk Foods", (Queijo e Alimentos de Leite Fermentado) 1997, 3rd Ed. F.V. Kosikowski, L.L.C. Westport, CT