IT201900006815A1 - Produzione di antimicrobici da scarti vegetali - Google Patents

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Camilla Lazzi
Valentina Bernini
Erasmo Neviani
Gianni Galaverna
Annalisa Ricci
Martina Cirlini
Antonietta Maoloni
Luca Calani
Silvia Zanetti
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Universita’ Degli Studi Di Parma
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Description

DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
“Produzione di antimicrobici da scarti vegetali ”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un processo per la preparazione di un estratto con attività antimicrobica mediante la fermentazione di sottoprodotti o di prodotti di scarto della filiera ortofrutticola. Forma ulteriore oggetto dell’invenzione l’estratto così ottenuto ed il suo uso per aumentare la shelf-life di prodotti alimentari.
BACKGROUND DELL’INVENZIONE
Durante la conservazione e la distribuzione, gli alimenti sono esposti ad un numero elevato di fattori in grado di modificare le loro proprietà intrinseche e tra i possibili agenti degradativi vanno citati ossigeno, luce ed umidità. È in questo contesto che diventa cruciale il concetto di “shelf-life”, definito come l’intervallo di tempo durante il quale l’alimento mantiene un livello di sicurezza e qualità accettabile e quindi quel periodo di tempo che corrisponde, in determinate condizioni di conservazione, ad una tollerabile diminuzione della qualità di un alimento.
La “shelf-life” spesso si intreccia anche con un altro concetto che è quello della commerciabilità di un prodotto. Infatti, l’instaurarsi di processi che modificano l’alimento possono renderlo non più vendibile nonostante questo sia ancora commestibile, determinando un notevole aggravio sui costi aziendali.
Oltre alla determinazione della “shelf-life”, i produttori si trovano spesso di fronte alla necessità di rendere più stabili i loro prodotti per far fronte a catene distributive che richiedono “shelf-life” sempre più lunghe o, semplicemente, per riuscire a preservare meglio le qualità del proprio prodotto. Gli alimenti molto deperibili dal punto di vista microbiologico, in cui si utilizza la data di scadenza, sono prodotti che normalmente devono essere conservati in frigorifero, come formaggi freschi, carne ed alcuni prodotti a base di carne, pasta fresca, piatti pronti refrigerati, frutta e verdura, etc.
Le tecnologie utilizzate per migliorare la conservazione, e quindi la “shelflife” dell’alimento, si basano essenzialmente sulla capacità di limitare la crescita microbica (effetto batteriostatico) o sull’inattivazione definitiva della flora associata (effetto battericida). Nel primo gruppo rientrano, ad esempio, la refrigerazione o il congelamento, l’essiccamento, la conservazione sotto vuoto o l’utilizzo di atmosfera modificata, l’utilizzo di conservanti organici o inorganici. Tecnologie come la pastorizzazione, l’irradiamento con radiazioni ionizzanti, l’applicazione di alte pressioni idrostatiche (HPP), l’utilizzo di cariche elettriche ad elevato voltaggio o l’aggiunta di lisozima determinano invece un effetto battericida.
Oggigiorno vi è una maggiore tendenza da parte dei consumatori a preferire prodotti senza conservanti artificiali e questo ha spinto l’industria alimentare a sviluppare tecnologie che agiscono mediante approcci “più naturali”. Tra queste individuiamo sicuramente l’irradiazione o l’applicazione di alte pressioni idrostatiche. Queste tecnologie di nuova generazione agiscono in maniera definitiva sulla carica microbica associata agli alimenti trattati.
Tuttavia, non tutti i prodotti alimentari possono essere sottoposti ai trattamenti sopra citati; ad esempio l’HPP non può essere utilizzata su carne fresca poiché ne determina uno sbiancamento poco gradevole alla vista del consumatore o su alimenti spugnosi come le fragole. La necessità di individuare sostanze naturali o di sviluppare nuove tecnologie da applicare al settore alimentare diventano sempre più pressanti da parte delle industrie.
A causa delle loro proprietà intrinseche, gli alimenti molto deperibili costituiscono un facile terreno di crescita per i microrganismi: in breve tempo compaiono progressivi segni di alterazione accompagnati da livelli crescenti di microrganismi, fino a diventare inaccettabili per il consumo o non sicuri. Nel settore carni i rischi di contaminazioni negli ultimi anni hanno principalmente riguardato contaminazioni microbiologiche causate da Salmonella spp., Escherichia coli e Listeria monocytogenes. L’impiego di antimicrobici di origine naturale rappresenta una nuova frontiera per limitare l’uso di conservanti tradizionali e per migliorare la “shelf-life” e la sicurezza di un alimento.
SOMMARIO INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per l’ottenimento di un estratto partendo da sottoprodotti o prodotti di scarto, preferibilmente della filiera ortofrutticola. Il processo della presente invenzione prevede una fase di inoculo dei sottoprodotti o prodotti di scarto con almeno un batterio, una fase di fermentazione ed una fase di estrazione del prodotto fermentato ottenuto.
In particolare, sono risultati particolarmente efficaci i batteri lattici, preferibilmente scelti tra le specie: L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus. In particolare, il processo della presente invenzione si è mostrato utile all’ottenimento di un estratto con capacità antimicrobiche.
La Richiedente ha sorprendentemente trovato che partendo da prodotti di scarto o sottoprodotti della filiera ortofrutticola, in particolare, da sottoprodotti della lavorazione di frutta e ortaggi, si ottiene un estratto in grado di aumentare la “shelf-life” di alimenti riducendo la carica microbica alterativa e patogena.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un estratto ottenuto con il processo della presente invenzione. Preferibilmente, l’estratto comprende una miscela di acidi organici, polifenoli, peptidi ed amminoacidi.
Un terzo aspetto dell’invenzione riguarda l’uso come antimicrobico dell’estratto ottenuto con il processo della presente invenzione e sopra descritto o di una composizione comprendente detto estratto.
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda l’uso dell’estratto ottenuto con il processo della presente invenzione e sopra descritto o di una composizione comprendente detto estratto per aumentare la vita media (shelf life) degli alimenti.
DEFINIZIONI
Nel contesto della presente invenzione, con il termine "sottoprodotto" o "prodotto di scarto" si intende un prodotto secondario proveniente dalla trasformazione di altri prodotti, in particolare prodotti ortofrutticoli, normalmente disponibili a basso costo o gratuitamente. I termini “sottoprodotti” o “prodotti di scarto” vengono utilizzati in modo intercambiabile all’interno del testo.
Nel contesto della presente invenzione, con il termine “composto attivo” si intende una sostanza che possiede una certa attività biologica.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un processo per preparare un estratto vegetale comprendente le fasi di:
a) inoculare sottoprodotti o prodotti di scarto della trasformazione di prodotti ortofrutticoli con batteri del genere Lactobacillus formando una miscela di fermentazione;
b) incubare la miscela di fermentazione formando un prodotto fermentato;
c) preparare un estratto del prodotto fermentato comprendente una miscela di composti attivi.
In una forma di realizzazione preferita, l’estratto ottenuto comprende una miscela di composti attivi quali per esempio acidi organici, polifenoli, peptidi e amminoacidi.
In una forma di realizzazione, i sottoprodotti vengono liofilizzati prima dello step (a) per un tempo compreso tra 50 e 80 ore.
Al termine della liofilizzazione, i sottoprodotti vengono reidratati con quantità di acqua comprese tra il 50 e il 75% p/p, preferibilmente tra il 60 e il 70% p/p.
Al fine di garantire l'assenza di microflora endogena nel substrato da fermentare, i sottoprodotti vengono quindi trattati termicamente preferibilmente in autoclave ad una temperatura superiore a 100°C, preferibilmente compresa tra 100°C e 130°C, più preferibilmente tra 110°C e 125°C, per un tempo compreso tra 10 e 40 minuti, preferibilmente compreso tra 15 e 30 minuti.
In una forma di realizzazione, i prodotti di scarto sono ridotti in parti di piccole dimensioni, preferibilmente tramite distruzione meccanica, per esempio tramite triturazione o macinazione.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, i sottoprodotti o i prodotti di scarto sono preferibilmente scelti tra: cuticole, bucce, semi, polpa, gambi e foglie di ortaggi o frutta.
In una forma di realizzazione, i sottoprodotti o prodotti di scarto sono ottenuti da frutta scelta tra: agrumi, preferibilmente arance, mandaranci, limoni, mandarini, pesche, albicocche, prugne, carote, mele, meloni, pere e uva.
In una forma di realizzazione, i sottoprodotti di scarto sono ottenuti da ortaggi scelti tra: pomodori, patate, insalate, zucchine, carote, cipolle, finocchi, melanzane, peperoni e fagioli.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, i sottoprodotti o prodotti di scarto sono ottenuti dalla trasformazione di pomodori, carote e melone.
In una forma di realizzazione, i batteri sono batteri lattici, preferibilmente del genere Lactobacillus, scelti tra le specie: L. casei, L. paracasei, e L. rhamnosus.
In una forma di realizzazione dell’invenzione, i batteri appartengono ad almeno un ceppo batterico scelto tra: Lactobacillus rhamnosus 1019, Lactobacillus rhamnosus 1473, Lactobacillus paracasei 4186, Lactobacillus casei 2240 e Lactobacillus casei 2246.
Il L. rhamnosus 1019 è stato depositato il 12 febbraio 2019 presso la Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) con numero di accesso LMG P-31263 e con il seguente nome (denominazione): UNIPR1019.
In accordo con una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il ceppo L. rhamnosus 1019 è caratterizzato da una sequenza di DNA, preferibilmente una sequenza di DNA codificante per l’rRNA 16S, detta sequenza comprendente la SEQ ID NO: 1 o qualunque sequenza caratterizzata da una identità dell’80-99,9% con la SEQ ID NO:1 riportata in Tabella 1.
Il L. rhamnosus 1473 è stato depositato il 12 febbraio 2019 presso la BCCM con numero di accesso LMG P-31264 e con il seguente nome (denominazione): UNIPR1473.
In accordo con una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il ceppo L. rhamnosus 1473 è caratterizzato da una sequenza di DNA, preferibilmente una sequenza di DNA codificante per l’rRNA 16S, detta sequenza comprendente la SEQ ID NO: 2 o qualunque sequenza caratterizzata da una identità dell’80-99,9% con la SEQ ID NO:2
Il L. paracasei 4186 è stato depositato il 12 febbraio 2019 presso la BCCM con numero di accesso LMG P-31266 e con il seguente nome (denominazione): UNIPR4186.
In accordo con una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il ceppo L. paracasei 4186 è caratterizzato da una sequenza di DNA, preferibilmente una sequenza di DNA codificante per l’rRNA 16S, detta sequenza comprendente la SEQ ID NO: 3 o qualunque sequenza caratterizzata da una identità dell’80-99,9% con la SEQ ID NO:3
Il L. casei 2240 è stato depositato il 12 febbraio 2019 presso la BCCM) con numero di accesso LMG P-31265 e con il seguente nome (denominazione): UNIPR2240.
In accordo con una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il ceppo L. casei 2240 è caratterizzato da una sequenza di DNA, preferibilmente una sequenza di DNA codificante per l’rRNA 16S, detta sequenza comprendente la SEQ ID NO: 4 o qualunque sequenza caratterizzata da una identità dell’80-99,9% con la SEQ ID NO:4
Il L. L. casei 2246 è stato depositato il 12 febbraio 2019 presso la BCCM con numero di accesso LMG P-31267 e con il seguente nome (denominazione): UNIPR2246.
In accordo con una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il ceppo L. casei 2246 è caratterizzato da una sequenza di DNA, preferibilmente una sequenza di DNA codificante per l’rRNA 16S, detta sequenza comprendente la SEQ ID NO: 5 o qualunque sequenza caratterizzata da una identità dell’80-99,9% con la SEQ ID NO:5.
Tabella 1
In una forma di realizzazione, i ceppi batterici utilizzati nel processo della presente invenzione vengono coltivati e replicati in vitro prima di essere messi in contatto con i sottoprodotti o prodotti di scarto. Preferibilmente, i ceppi batterici sono replicati in vitro almeno 24 ore prima dell’inoculo con i sottoprodotti per ottenere la miscela di fermentazione.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, almeno uno dei ceppi batterici sopra identificati è inoculato con i sottoprodotti o prodotti di scarto per ottenere una concentrazione iniziale (ovvero prima della fermentazione) nella miscela di fermentazione compresa tra 10<4 >e 10<11 >Unità Formanti Colonia/g (UFC/g), preferibilmente tra 10<5 >e 10<10 >UFC/g, più preferibilmente tra 10<7 >e 10<8 >UFC/g.
La fermentazione degli scarti o sottoprodotti, come definita nello step (b) del presente processo, avviene ad una temperatura compresa tra 27°C e 42°C, preferibilmente tra 28°C e 39°C, per un tempo compreso tra 48 e 96 ore, preferibilmente compreso tra 60 e 80 ore.
Al termine della fermentazione, la concentrazione dell’almeno un ceppo batterico nel prodotto fermentato ottenuto è compresa tra 10<7 >e 10<10 >UFC/g, preferibilmente tra 10<8 >e 10<9 >UFC/g.
Al termine della fermentazione il prodotto fermentato ottenuto può essere sottoposto direttamente all’estrazione o essere conservato mediante congelamento.
In una forma di realizzazione, il prodotto fermentato ottenuto è liofilizzato per eliminare la maggior parte dell’acqua presente e per concentrare il campione. Preferibilmente, i prodotti fermentati vengono liofilizzati per 48-96 ore, più preferibilmente per 60-72 ore prima di essere sottoposti a estrazione secondo lo step c).
Il prodotto fermentato, preferibilmente liofilizzato, viene sottoposto ad almeno un’estrazione in solvente acquoso e/o organico. In una forma di realizzazione, il prodotto fermentato è sottoposto ad un processo di estrazione con una miscela acqua/solvente organico. Il solvente organico è preferibilmente un alcol, per esempio etanolo o metanolo.
In una forma di realizzazione, la soluzione acquosa comprende inoltre un acido, preferibilmente un acido carbossilico.
L’estrazione con miscela acqua/solvente organico prevede anche un omogeneizzazione ed una centrifugazione dell’omogeneizzato per recuperare la fase liquida contenente l’estratto, che può essere successivamente filtrata. La fase solida recuperata mediante centrifugazione può essere sottoposta ad una seconda estrazione.
Secondo una forma di realizzazione dell’invenzione, la miscela acqua/solvente organico è acqua/etanolo in una proporzione 30/70 v/v, preferibilmente 40/60 v/v, più preferibilmente 50/50 v/v. Detta miscela è preferibilmente acidificata con acido formico in una concentrazione compresa tra 0,02 e 0,2%, preferibilmente 0,05 e 0,15% v/v.
La soluzione di estrazione è quindi concentrata a dare l’estratto secondo l’invenzione, il quale può essere risospeso in un buffer e/o in una soluzione acquosa.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda un estratto ottenuto con il processo secondo la presente invenzione.
In una forma di realizzazione, l’estratto comprende una miscela di composti con attività antimicrobica preferibilmente con attività batteriostatica e/o battericida.
In una forma di realizzazione preferita, l’estratto comprende una miscela di composti scelti tra: acidi organici, polifenoli, peptidi, amminoacidi.
In una forma di realizzazione dell’invenzione, l’estratto comprende acidi organici scelti tra: acido lattico, acido acetico, acido citrico e loro combinazioni.
Preferibilmente, l’estratto comprende:
- acido lattico in una concentrazione compresa tra 50 e 90% v/v, preferibilmente tra 55 e 85% v/v, più preferibilmente tra 60 e 80% v/v;
- acido citrico in una concentrazione compresa tra 2 e 25% v/v, preferibilmente tra 3 e 22% v/v, più preferibilmente tra 5 e 20% v/v; e
- acido acetico in una concentrazione compresa tra 1 e 15% v/v, preferibilmente tra 2 e 12% v/v, più preferibilmente tra 3 e 10% v/v. In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, l’estratto comprende acidi organici scelti tra: acido lattico, acido acetico, acido succinico, acido glicerico, acido malico, acido tartarico, acido citrico ed un dimero dell’acido lattico.
Preferibilmente, l’estratto comprende:
- acido lattico in una concentrazione compresa tra 50 e 90% v/v, preferibilmente tra 55 e 85% v/v, più preferibilmente tra 60 e 80% v/v;
- acido citrico in una concentrazione compresa tra 2 e 25% v/v, preferibilmente tra 3 e 22% v/v, più preferibilmente tra 5 e 20% v/v; - acido acetico in una concentrazione compresa tra 1 e 15% v/v, preferibilmente tra 2 e 12% v/v, più preferibilmente tra 3 e 10% v/v; - acido glicerico in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 8% v/v, più preferibilmente tra 1 e 5% v/v; - acido malico in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 8% v/v, più preferibilmente tra 1 e 5% v/v; - acido lattico in forma dimerica in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 5% v/v, più preferibilmente tra 0,8 e 3% v/v;
- acido succinico in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 5% v/v, più preferibilmente tra 0,8 e 3% v/v; e
- acido tartarico in una concentrazione compresa tra 0,1 e 5% v/v, preferibilmente tra 0,2 e 4% v/v, più preferibilmente tra 0,3 e 3% v/v.
In una forma di realizzazione l’estratto comprende ulteriori acidi organici scelti tra: acido idrossivalerico o acido idrossi-iso-valerico o acido metilbutirrico, acido leucico, acido fenillattico, acido caffeico, acido idrossifenillattico, acido diidrocaffeico e acido indol-3-lattico.
In una forma di realizzazione, l’estratto comprende inoltre amminoacidi e alcaloidi steroidei (polifenoli).
Gli amminoacidi sono preferibilmente scelti tra: leucina, isoleucina, triptofano, tirosina, adenosina e valina.
Gli alcaloidi steroidei sono preferibilmente scelti tra tomatidina, glicoalcaloide steroideo, Neorickiioside A/Lycoperoside H e Esculeoside B. Un terzo aspetto dell’invenzione riguarda l’uso come antimicrobico dell’estratto ottenuto con il processo della presente invenzione e sopra descritto o di una composizione comprendente detto estratto.
L’estratto ottenuto con il processo descritto nella presente invenzione ha infatti mostrato, quando valutato con tecniche convenzionali, una buona attività antimicrobica.
In una forma di realizzazione dell’invenzione, l’estratto o la composizione comprendente l’estratto è utilizzato/a come antimicrobico.
In una forma di realizzazione, l’estratto o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella spp e E.coli.
In una forma di realizzazione preferita, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di pomodoro o di carota o di melone o la composizione che lo comprende è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella spp e E.coli.
In una forma di realizzazione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di melone con il ceppo L. casei 2240 o con L. paracasei 4186 o con L. rhamnosus 1473 o con L. rhamnosus 1019 o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella spp e E.coli.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di melone con il ceppo L. casei 2240 o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus e Salmonella spp. In una forma di realizzazione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di carota con il ceppo L. casei 2240 o con L. casei 2246 o con L. paracasei 4186 o con L. rhamnosus 1473 o con L. rhamnosus 1019 o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella spp e E.coli.
In una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di carota con il ceppo L. casei 2246 o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella spp e E. coli, preferibilmente nei confronti di B. cereus.
In una forma di realizzazione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di pomodoro o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di L. monocytogenes, B. cereus e Salmonella spp.
In una forma di realizzazione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di pomodoro con il ceppo L. casei 2246 o con L. rhamnosus 1473 o con L. rhamnosus 1019 o la composizione che comprende l’estratto è utilizzato/a come antibatterico nei confronti di L. monocytogenes, B. cereus e Salmonella spp.
In una forma di realizzazione dell’invenzione, l’estratto o la composizione comprendente l’estratto è utilizzato/a come antifungino, preferibilmente contro lieviti. L’estratto ottenuto con il processo descritto nella presente invenzione ha infatti mostrato, quando valutato con tecniche convenzionali, una buona attività antifungina.
In una forma di realizzazione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di carota o di melone o la composizione che lo comprende è utilizzato/a come antifungino, preferibilmente contro lieviti.
In una forma di realizzazione, l’estratto ottenuto dalla fermentazione di scarti di carota o di melone con il ceppo L. rhamnosus 1019 o la composizione che lo comprende è utilizzato/a come antifungino, preferibilmente contro lieviti.
ESEMPIO
Preparazione dei substrati
Gli scarti di pomodoro, carota e melone sono stati macinati, divisi in aliquote da 250 g, e sterilizzati in autoclave a 121°C per 20 minuti in modo da garantire l'assenza di microflora endogena nel substrato da fermentare. In seguito, le aliquote sterilizzate sono state conservate a - 80°C fino al momento dell'utilizzo.
Ceppi microbici utilizzati per la fermentazione
Per la fermentazione sono stati utilizzati 7 ceppi microbici appartenenti a quattro diverse specie: Lactobacillus casei (2240 e 2246), Lactobacillus paracasei (4186), Lactobacillus rhamnosus (1019 e 1473) e Lactobacillus plantarum (PR1 e PR285). I ceppi sono stati isolati da matrici vegetali e casearie (Tabella 2).
Tutti i ceppi fanno parte della collezione del Dipartimento di Scienze degli Alimenti e del Farmaco dell’Università degli Studi di Parma. Tutti i ceppi sono stati mantenuti in stock a -80°C in de Man, Rogosa and Sharpe (MRS) (VWR chemicals, Milano, Italia) addizionati con 12,5% di glicerolo (v/v).
Tabella 2, specie e ceppi utilizzati per la fermentazione.
Fermentazione
Partendo dagli stock congelati a – 80°C, le colture sono state rivitalizzate facendo crescere i ceppi due volte, per 24 h, con un inoculo del 3% v/v in MRS brodo (VWR) a 37°C (L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus) e a 30°C (L. plantarum), in condizioni di aerobiosi. Una volta rivitalizzate le colture, è stato effettuato un inoculo del 3% v/v in MRS brodo (VWR) incubando a 37°C (L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus) e a 30 °C (L. plantarum), per 15 ore, in modo da ottenere una concentrazione cellulare di 10<9 >UFC/ml. Le cellule della coltura overnight sono state raccolte mediante centrifugazione (10000 x g, 10 minuti, 4°C), lavate due volte in soluzione Ringer (VWR chemicals, Milano, Italia), e risospese in acqua sterile.
I substrati da fermentare sono stati inoculati con un’aliquota della sospensione batterica tale da ottenere una concentrazione finale di 10<7 >UFC/g. I substrati inoculati sono stati incubati per 72 ore a 37°C (per L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus) e a 30°C (per L. plantarum). Ogni fermentazione è stata condotta in triplicato.
Determinazione della crescita dei microrganismi
I campioni sono stati analizzati all’inizio (T0) e alla fine della fermentazione (72 ore): 5 g di ciascun campione sono stati addizionati di 45 ml di soluzione Ringer (VWR) e omogenati per 2 minuti a 230 rpm mediante l’omogeneizzatore peristaltico Stomacher 400 Circulator (Seward, Worthing, UK). Le diluizioni decimali dei substrati fermentati sono state allestite in Ringer (VWR) e piastrate in MRS agar (VWR), a cui è seguita l’incubazione a 37°C (L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus) e a 30°C (L. plantarum) per 72 ore in aerobiosi.
Per quanto riguarda la fermentazione dei sottoprodotti di melone, ogni ceppo utilizzato ha dimostrato di adattarsi facilmente a tale substrato, come mostrato dagli elevati delta di crescita. In particolare, entrambi i ceppi di L. rhamnosus, 1019 e 1473, hanno mostrato il più alto incremento nel numero di cellule con delta rispettivamente di 2,51 e 2,55 Log UFC/g. Invece, per L. paracasei 4186 si è osservato un delta di crescita inferiore a tutti gli altri pari a 1,22 Log UFC/g.
Tabella 3.
Concentrazioni di cellule vitali e coltivabili espresse in Log UFC/g ai tempi iniziale
(T0) e finale (72 ore) della fermentazione lattica dei sottoprodotti di melone e rispettivi delta di crescita. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard
Anche per quanto riguarda la fermentazione dei sottoprodotti della carota, ogni ceppo utilizzato ha dimostrato di adattarsi facilmente a tale substrato (Tabella 4). In particolare, i ceppi che presentano un maggiore delta di crescita sono L. plantarum PR1 e L. casei 2246 (delta di crescita rispettivamente di 2,04 e 2,03 Log UFC/g).
Tabella 4
Concentrazioni di cellule vitali e coltivabili espresse in Log UFC/g ai tempi iniziale (T0) e finale (72 ore) della fermentazione lattica dei sottoprodotti di carota e rispettivi delta di crescita. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard.
Infine, per quanto riguarda il pomodoro, complessivamente tutti i ceppi utilizzati hanno mostrato una buona capacità di crescita (Tab.5) anche se L. plantarum PR285, ed in particolare il ceppo PR1 isolato da pomodoro, è risultata la specie meglio adattata.
Tabella 5
Concentrazioni di cellule vitali e coltivabili espresse in Log UFC/g ai tempi iniziale (T0) e finale (72 ore) della fermentazione lattica dei sottoprodotti di pomodoro e rispettivi delta di crescita. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard.
Estrazione e concentrazione dei substrati fermentati
I substrati fermentati sono stati liofilizzati per 72 ore (LIO-5P DIGITAL, Cinquepascal, MI) al fine di eliminare la maggior parte dell’acqua presente e aumentare, quindi, la concentrazione del campione. I campioni fermentati e liofilizzati sono stati conservati a -80°C fino al momento della loro estrazione. Per estrarre molecole con potenziale attività antimicrobica come polifenoli, piccoli peptidi e acidi, è stato eseguito un processo di estrazione modificando il protocollo riportato da Dall'Asta et al. (2013). Il solvente utilizzato per l’estrazione è costituito da acqua/etanolo 50/50 v/v acidificato con 0,1% di acido formico (HCOOH).
Di ogni campione fermentato e liofilizzato, sono stati pesati 10 g suddivisi in due aliquote da 5 g. Ciascuna delle due aliquote è stata aggiunta di 50 ml di solvente e è stata omogenata per 5 minuti alla velocità di 4000 rpm (rotazioni per minuto) utilizzando l’omogeneizzatore ultra-turrax (IKA T50 digital, Staufen, Germania).
Per quanto riguarda lo scarto di melone fermentato, la soluzione ottenuta è stata filtrata su carta per permettere il recupero della parte solida alla quale sono stati aggiunti altri 50 ml di solvente procedendo con una seconda estrazione come descritto precedentemente. La soluzione ottenuta dalla seconda estrazione è stata nuovamente filtrata su carta per 45 minuti. Le due frazioni liquide ottenute, quindi, sono state unite.
Per quanto riguarda lo scarto di carota fermentata, la soluzione ottenuta è stata filtrata su carta per permettere il recupero della parte solida alla quale sono stati aggiunti altri 50 ml di solvente procedendo con una seconda estrazione come descritto precedentemente. La soluzione ottenuta dalla seconda estrazione è stata centrifugata (4000 rpm, 5 minuti, 4°C). La frazione liquida recuperata in seguito alla centrifugazione è stata unita alla frazione liquida ottenuta dalla prima filtrazione e la soluzione ottenuta è stata quindi sottoposta a filtrazione sottovuoto.
Una volta ottenuti, gli estratti sono stati concentrati mediante l’utilizzo dell’evaporatore rotante STRIKE 300 (Steroglass, Italia, PG). Per facilitare la concentrazione degli estratti la velocità di rotazione è stata fissata a 150 rpm e la temperatura del bagnetto settata a 40°C. Gli estratti concentrati sono stati quindi risospesi in acqua sterile in modo tale da ottenere una concentrazione del 60%.
Gli estratti così ottenuti sono stati conservati a -80°C fino al momento del loro utilizzo.
Attività antimicrobica: “agar well diffusion assay”
La valutazione dell’attività antimicrobica degli estratti ottenuti dalle fermentazioni lattiche di pomodoro, melone e carota, è stata effettuata con il metodo “agar well diffusion assay” come riportato da Kim et al. (2013) con alcune modifiche.
Per la valutazione dell’attività antimicrobica degli estratti di carota e melone le piastre sono state preparate utilizzando come terreno Tryptic Soy Agar (TSA) (Oxoid) per i 14 ceppi patogeni e il bulk di microrganismi potenzialmente alterativi, e Sabouraud (MAST Group LTD, UK) per il bulk di lieviti.
La concentrazione microbica delle colture overnight dei ceppi patogeni, del bulk di microrganismi potenzialmente alterativi e del bulk di lieviti, è stata determinata mediante conta vitale rispettivamente su TSA (Oxoid), PCA (Oxoid) e YEDC Agar (Remel). Le colture overnight dei ceppi patogeni e del bulk di microrganismi potenzialmente alterativi, e il bulk di lieviti sono stati quindi diluiti in soluzione Ringer (VWR) fino alla concentrazione di 10<8 >UFC/ml. Con ciascuna soluzione ottenuta come descritto e con concentrazione pari a 10<8 >UFC/ml è stato imbevuto un tampone sterile con cui si è proceduto a seminare a tappeto la piastra contenente il terreno agarizzato, sul quale sono poi stati realizzati dei fori dal diametro di 7 mm da riempire con 30 μl di ciascuna soluzione da testare.
L’attività antimicrobica è stata valutata per: gli estratti di pomodoro, melone e carota fermentati e non fermentati, sterili e non sterili.
Le piastre inoculate con i patogeni sono state infine incubate a 37°C, mentre quelle inoculate con il bulk di lieviti e con microrganismi potenzialmente alterativi a 30°C. L’attività antimicrobica è stata valutata misurando l’alone di inibizione totale (mm) osservabile dopo 24, 48 e 120 ore di incubazione, per i microrganismi patogeni e alterativi; dopo 48 e 120 ore di incubazione per i lieviti.
Attività antimicrobica degli estratti di melone
Per quanto riguarda gli estratti dei sottoprodotti di melone, si può affermare che i campioni non fermentati, ovvero quelli di melone non sterile e sterile, non abbiano alcuna attività antimicrobica. In generale, gli estratti fermentati dimostrano maggiore attività nei confronti di S. aureus, L. monocytogenes e B. cereus, (benché, per quest'ultimo, l'attività antimicrobica si riduca notevolmente nel tempo), mentre presentano un'attività nettamente minore nei confronti di E. coli. Gli estratti che presentano minore attività antimicrobica in assoluto sono quelli dei fermentati con i due L. plantarum, PR1 e PR285, mentre quelli che presentano maggiore attività appartengono al gruppo L. casei, e in particolare sono L. casei 2240 e L. paracasei 4186.
Nel complesso l'estratto ottenuto dalla fermentazione con L. casei 2240 sembra possedere la migliore attività antimicrobica. Tale attività si mantiene molto bene nel tempo, fino alle 120 h di osservazione, nei confronti di tutti i microrganismi testati, eccezion fatta per B. cereus. Nei confronti di questa specie l’estratto ottenuto dall’impiego di L. casei 2240 ha espletato la miglior performance fra tutti gli estratti specialmente dopo 24 h con un alone di inibizione di 6,25 ± 1,77 mm. Tuttavia, dopo 120 h l'alone di inibizione si riduce a 1,75 ± 0,88 mm, presentando il minimo assoluto di attività. L'estratto ottenuto con L. casei 2246 presenta la sua maggiore attività contro L. monocytogenes dopo 24 h con un alone di inibizione di 4,56 ± 0,10 mm. Tuttavia tale attività non viene mantenuta nel tempo in particolare si riduce soprattutto dopo 120 h (2,03 ± 0,38 mm). Questo estratto mostra una buona attività anche nei confronti del bulk dei microorganismi alterativi che viene mantenuta con il passare del tempo, mentre mostra la minor attività nei confronti di E. coli, specialmente dopo 120 h.
Anche l'estratto derivante dalla fermentazione con L. paracasei 4186 mostra una buona attività antimicrobica. In particolare, dopo 24 h espleta la sua maggiore attività verso B. cereus presentando un alone di inibizione di 6,25 ± 1,77 mm che, però, alle 120 h si riduce a 1,75 ± 0,88 mm (minimo assoluto di attività). Contrariamente a quello che è stato osservato nei confronti di B. cereus l’attività contro il bulk di alterativi si mantiene nel tempo (valore medio 2,89 ± 0,19 mm), esprimendo un comportamento simile all’estratto ottenuto utilizzando L. casei 2240.
L’utilizzo di L. rhamnosus 1019 porta anch’esso a una buona attività verso B. cereus alle 24 h (4,46 ± 0,18 mm) presentando però lo stesso comportamento degli estratti descritti in precedenza alle 120 h. Risulta invece mantenuta molto bene l’attività antimicrobica contro Salmonella spp. Anche nei confronti di E. coli e S. aureus l’attività viene mantenuta, almeno fino alle 48 h diminuendo dopo 120 h.
S. aureus è il microrganismo maggiormente inibito dall’estratto ottenuto dalla fermentazione con L. rhamnosus 1473 dopo le 24 h (alone di inibizione di 3,86 ± 0,46 mm). Poca attività invece è stata osservata nei confronti di E. coli che diminuisce ulteriormente dopo 120 h, ma, contrariamente a quanto osservato per E. coli, questo estratto mantiene nel tempo la sua attività verso Salmonella spp., B. cereus e il bulk di alterativi.
Attività antimicrobica degli estratti di carota
Per quanto riguarda gli estratti dei sottoprodotti della carota, si è osservato che i campioni non fermentati, ovvero quelli di carota non sterile e carota sterile, non hanno alcuna attività antimicrobica verso nessuno dei patogeni testati ad eccezione di S. aureus e B. cereus. Curiosamente, gli estratti di carota sterile dimostrano avere maggiore attività nei confronti delle due specie microbiche sopra citate rispetto agli estratti non sterili. In generale, gli estratti fermentati dimostrano maggiore attività nei confronti di S. aureus e L. monocytogenes, mentre presentano un'attività nettamente minore nei confronti di E. coli. L'attività antimicrobica sembra mantenersi costante nel tempo principalmente nei confronti del bulk di alterativi e di E. coli.
Gli estratti che presentano minore attività antimicrobica in assoluto sono quelli dei fermentati con L. paracasei 4186, mentre quelli che presentano maggiore attività sono fermentati con ceppi che appartengono al gruppo L. casei, e sono L. casei 2246 e L. rhamnosus
1019 .
L'estratto ottenuto con L. casei 2240 presenta attività massima contro S. aureus alle 24 h (3,62 ± 0,32 mm) e attività minima nei confronti di B. cereus dopo 120 h (1,04 ± 0,08 mm). Alle 24 h Salmonella spp., E. coli e il bulk di alterativi mostrano una sensibilità a questo estratto inferiore rispetto a S. aureus ma tali valori rimangono inalterati con il passare del tempo.
L'estratto ottenuto con L. casei 2246 è uno degli estratti che presenta maggiore attività nei confronti di tutti i microrganismi testati mostrando attività massima contro B. cereus alle 24 h (3,99 ± 0,51 mm) e attività minima nei confronti di E. coli dopo 120 h (1,59 ± 0,57 mm). Tale estratto oltre ad avere una buon attività nei confronti di tutti i microrganismi testati è in grado di mantenerla nel tempo, tranne nei confronti di B. cereus dopo 120 h di incubazione.
L'estratto ottenuto con L. paracasei 4186 è quello che ha attività antimicrobica minore verso tutti i ceppi patogeni e il bulk di alterativi testati, infatti, contro L. monocytogenes, E. coli e B. cereus, alle 120 h non presenta affatto attività. L'estratto 4186 risulta più attivo nei confronti di S. aureus, verso cui, alle 24 h presenta un massimo di attività antimicrobica (2,00 ± 0,72 mm), anche se l'attività scema notevolmente nel tempo.
L. rhamnosus 1019 conferisce all’estratto una buona attività verso tutti i microrganismi patogeni e alterativi testati. In particolare, l'estratto 1019 mostra la più alta attività nei confronti di S. aureus a 24 h (4,35 ± 1,03 mm). Questo estratto, inoltre, dimostra di avere una buona attività anche nei confronti di L. monocytogenes. Minore attività invece è stata osservata nei confronti di B. cereus, E. coli, S. aureus e bulk di alterativi anche se con performance migliori rispetto ad altri estratti testati e ai controlli.
L'estratto ottenuto con L. rhamnosus 1473 presenta una discreta attività antimicrobica nei confronti di tutti i microrganismi patogeni e alterativi utilizzati. L'attività maggiore si riscontra per S. aureus alle 24 h con un valore di inibizione di 3,74 ± 0,44 mm, il valore di attività minore si ha per Salmonella spp. dopo 120 h, 0,61 ± 0,27 mm. Mentre sia contro il bulk degli alterativi che per E. coli l'attività dell'estratto si mantiene nel tempo.
Attività antimicrobica degli estratti di pomodoro
Complessivamente gli estratti ottenuti dopo la fermentazione hanno evidenziato un’attività maggiore, su tutti i microrganismi patogeni testati, rispetto a quelli ottenuti in assenza di fermentazione e a due conservanti impiegati ovvero il lattato di sodio e il lattato di sodio/diacetato di sodio. In particolare, i risultati più evidenti, in termini di dimensione di alone di inibizione, si sono osservati nei confronti di Salmonella spp., L. monocytogenes e B. cereus mentre una minore attività è stata osservata contro E. coli, S. aureus. L’attività antimicrobica degli estratti è stata osservata non solo nei confronti dei patogeni ma anche verso il bulk di microorganismi alterativi. L’attività antimicrobica evidenziata non sembra essere correlata alla capacità replicativa in questo substrato, infatti i due ceppi 2246 e 1473, che avevano evidenziato andamenti di crescita differenti, hanno presentato pressoché gli stessi aloni di inibizione.
Si può inoltre osservare che l’effetto degli estratti si mantiene costante nel tempo dopo 24, 48 e 120 ore, ad eccezione dei campioni con L. rhamnosus 1473 e 1019 che dopo le 24 ore mostrano la miglior capacità antimicrobica in vitro sui microrganismi testati.
Attività contro lieviti
L’attività antimicrobica degli estratti fermentati di melone e carota è stata testata anche su un bulk di lieviti isolati da un prodotto vegetale a base di melone e addensanti. L’attività antimicrobica degli estratti è stata misurata come per i patogeni con il metodo dell’ “agar well diffusion assay”, con due sole differenze: si è usato come terreno Sabouraud Agar e le misure sono state effettuate solo a 48 e 120 ore, compatibilmente con i tempi di crescita dei lieviti. Entrambe le tipologie di estratti, derivanti dalla fermentazione di melone e carota, mostrano un blanda attività nei confronti del bulk di lieviti isolati da prodotto vegetale a base di melone. Gli estratti derivanti da carota e melone fermentati con L. rhamnosus 1019 sono quelli che danno la maggiore attività contro i lieviti (Tabelle 6 e 7), che però rimane molto inferiore rispetto a quella osservata nei confronti dei microrganismi patogeni o cellule batteriche alterative (bulk alterativi).
Tabella 6.
Valori di attività antimicrobica dei singoli estratti fermentati di melone espressi in mm. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard.
Tabella 7.
Valori di attività antimicrobica dei singoli estratti fermentati di carota espressi in mm. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard.
Applicazione su prodotto vegetale a base di melone
L'attività antimicrobica degli estratti dei fermentati è stata testata anche in situ su un prodotto vegetale a base di melone. Per verificare l'efficacia degli estratti sono stati preparati tre prodotti, del peso di 1 kg ciascuno, al primo sono stati aggiunti 20 g di estratti fermentati di melone, al secondo 20 g di estratti fermentati di carota e il terzo prodotto è stato lasciato tal quale per poter essere utilizzato come controllo. Quindi, si è monitorata la crescita della microflora alterativa presente nel prodotto vegetale mediante conta vitale in piastra all’inizio (T0) e dopo 7, 15 e 30 giorni di conservazione a 4 °C e sottovuoto. L'analisi è stata condotta in doppio. Per la ricettazione con aggiunta di estratti sono stati utilizzati gli estratti ottenuti dalla fermentazione con i microorganismi appartenenti al gruppo L. casei che hanno dimostrato in vitro di avere la migliore attività antimicrobica verso il bulk di alterativi. L’aggiunta degli estratti fermentati alla preparazione vegetale riduce la crescita della flora alterativa endogena (Tabella 8). In particolare la maggior attività è stata osservata con l’aggiunta degli estratti ottenuti dalla fermentazione dei sottoprodotti del melone confermando quanto osservato dai test in vitro dove gli estratti fermentati di melone possedevano una maggiore attività antimicrobica nei confronti del bulk di alterativi. Fin dalla prima analisi (T0) è stato possibile osservare una riduzione delle microflora alterativa presente nel prodotto vegetale (4,04± 0,47 Log UFC/g) dopo l’aggiunta degli estratti sia di melone che di carota (< 1 Log UFC/g). Tale riduzione si mantiene costante per tutti i 30 giorni di monitoraggio con l’aggiunta dell’estratto
ottenuto dal melone fermentato (< 1 Log UFC/g) mentre, quando viene utilizzato l’estratto fermentato di carota la microflora alterativa si mantiene sotto i limiti di rivelazione (< 1 Log UFC/g) fino a 7 giorni per poi salire dopo 15 giorni (1,83±0,40 Log UFC/g) rimanendo praticamente costante fino ai 30 giorni di conservazione.
Tabella 8.
Concentrazioni di microrganismi alterativi vitali e coltivabili presenti nella preparazione vegetale, espresse in Log UFC/g ai tempi iniziale (T0 ) e dopo 7, 15 e 30 giorni. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard.
Oltre alla carica microbica, è stata monitorata anche la variazione del pH. La misurazione del pH è stata effettuata al tempo iniziale e dopo 30 giorni di conservazione refrigerata sottovuoto su campioni diluiti 1:10 in soluzione Ringer. I campioni addizionati con gli estratti dei fermentati al tempo iniziale sono risultati essere più acidi del campione di controllo (5,20 ± 0,04 valore medio) mostrando una differenza da quest’ultimo pari a 1,48. Il pH dei campioni addizionati con gli estratti non ha subito variazioni nel corso dei 30 giorni, mentre, invece, il pH del campione di controllo si è abbassato di 1,17 unità (5,51 ± 0,2) (Tabella 9). Tale aumento nell’acidità potrebbe essere dovuto al metabolismo della flora alterativa endogena che aumenta durante il passare dei giorni di conservazione.
Tabella 9
Valori di pH dei campioni di preparato vegetale tal quale, di preparato con aggiunta di estratti fermentati di melone e di preparato con aggiunta di estratti fermentati di carota, al tempo iniziale (T0) e dopo 30 giorni (T30) di conservazione refrigerata sottovuoto. I valori sono indicati come medie ± deviazione standard.
Valutazione attività antimicrobica su carne suina
L’attività antimicrobica dell’estratto fermentato, impiegato al 4% p/p, è stata valutata mediante Microbiological Challenge Test (MCT) su carne macinata di suino fresca (I), e confrontata con quella di carne non addizionata di estratto (II), addizionata di lattato di sodio al 2% p/p (III) e di lattato di sodio/diacetato di sodio (96:4) al 2,5% p/p (IV); ciascun campione è stato inoculato separatamente con 5 specie microbiche: B. cereus, Salmonella spp., E. coli, L. monocytogenes e S. aureus.
La concentrazione di ogni patogeno è stata valutata al momento dell’inoculo (T0) e dopo 3, 6 e 9 giorni di conservazione in condizioni refrigerate, mediante conta vitale in substrato agarizzato su Mannitol egg yolk polymyxin agar base-MYP (ISO) (VWR), Rambach Agar (MERCK, Milano, Italia), Chromocult Coliform Agar (MERCK), Listeria selective agar base acc. to Ottaviani and Agosti (ISO) (VWR), e CHROMagar Staph Aureus (CHROMagar, Parigi, Francia), rispettivamente. Il pH di buccette e semi di pomodoro, prima e dopo la fermentazione, e dell’estratto dei sottoprodotti fermentati, è stato misurato mediante pH metro (Mettler Toledo, Svizzera).
L’attività antimicrobica è stata anche valutata monitorando la crescita della microflora alterativa su prodotti refrigerati senza conservanti, con l’estratto della presente invenzione o senza l’estratto.
Il ceppo di L. rhamnosus 1473 è incrementato di 1,57 Log UFC/g dopo 72 ore nel substrato utilizzato per la fermentazione causando una leggera acidificazione del substrato (da pH 4,26±0,02, prima della fermentazione, a 3,82±0,01, dopo la fermentazione). L’estratto ha dimostrato di possedere un’attività antimicrobica superiore o paragonabile ai conservanti tradizionali di riferimento. L’azione antimicrobica è risultata superiore verso Salmonella spp. e L. monocytogenes, con una diminuzione della carica al termine della conservazione, pari a 0,85 e 1,38 Log UFC/g rispettivamente. Al termine della conservazione si è avuta una diminuzione di 1,19 Log UFC/g anche verso S. aureus che però anche nella carne non trattata è diminuito di 0,88 Log UFC/g. L’attività antimicrobica dell’estratto verso B. cereus è risultata paragonabile a quella esibita dalla miscela lattato di sodio/diacetato di sodio; dopo 9 giorni la carica del patogeno è paragonabile a quella dell’inoculo, con una crescita di 0,40 Log UFC/g. Infine, E. coli ha mostrato un’iniziale diminuzione di 0,36 Log UFC/g ma è stato successivamente in grado di crescere fino a raggiungere una carica paragonabile a quella dell’inoculo. Non disponendo ancora di una completa caratterizzazione dell’estratto si può ipotizzare che la sua attività antimicrobica sia dovuta a polifenoli, acidi organici e piccoli peptidi. L’acidità dell’estratto (pH 3,50±0,14) potrebbe aver inibito la crescita dei patogeni: diversi studi infatti, hanno dimostrato la suscettibilità agli ambienti acidi dei patogeni utilizzati. Jay et al. (2009) riportano che il valore limite di pH che consente la crescita di Salmonella può variare in funzione del tipo di acido: per lattico 4,4, per citrico 4,05 e per acetico è 5,40.
È comunque doveroso considerare non solo l’acidità dell’estratto, come possibile causa di inibizione batterica, ma anche la probabile presenza di altre sostanze derivate dalla fermentazione (Singh et al., 2010). I batteri lattici infatti sono in grado di produrre anche etanolo, anidride carbonica, diacetile e batteriocine (Ray e Joshi, 2015). Inoltre, in letteratura, sono presenti studi che dimostrano la capacità del pomodoro e di estratti, di inibire la crescita di microrganismi patogeni, grazie alla presenza di diversi composti bioattivi: Omodamiro e Amechi (2013) l’attribuiscono ai carotenoidi, Silva-Beltràn (2015) a vari composti fenolici e glicoalcaloidi. Caratterizzazione dei composti fitochimici in scarti di pomodoro mediante UHPLC-ESI-MSn
Un campione di estratto di pomodoro non fermentato sterilizzato (denominato controllo C) e un campione di estratto di pomodoro fermentato con ceppo 1473 di L. rhamnosus (denominato Ferm_L.r._1473) sono stati analizzati mediante Ultra High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization- multiple-stage mass spectrometry (UHPLC-ESI-MSn).
Entrambi gli estratti sono stati analizzati previa diluizione (25x) con acqua acidificata allo 0.1% di acido formico per l’analisi con colonna a fase inversa mentre gli estratti sono stati diluiti con acetonitrile prima dell’analisi in modalità HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography). I campioni sono stati analizzati mediante Ultra-HPLC interfacciato ad uno spettrometro di massa a trappola ionica lineare LTQ XL con sorgente H-ESI II.
Per la separazione cromatografica in fase inversa sono stati utilizzati acqua (B) ed acetonitrile (A) come solventi, entrambi acidificati allo 0.1%, ed una colonna Acquity UPLC HSS T3 (100 × 2.1 mm, 1.8 μm) dotata di precolonna VanGuard (2.1x5 mm, 1.8 µm). Il flusso di fase mobile con la miscela di solventi A e B è stato fissato a 0.3 mL/minuto. La colonna è stata termostatata a 40°C.
I campioni sono stati analizzati mediante ionizzazione negativa, con una metodica Full-Scan Data Dependent MS3 nel range 100-2000 (m/z) con condizioni spettrometriche ottimizzate per l’analisi della componente polifenolica. Per l’analisi in ionizzazione negativa è stato utilizzato il seguente gradiente: da 0 a 0.5 minuti 95% B; da 0.5 a 9 minuti il solvente B diminuisce al 49%. Poi la percentuale di B è diminuita al 20% in modo da permettere il lavaggio della colonna cromatografica incrementando all’80% la fase organica. Dopo 2 minuti di lavaggio, il gradiente è stato settato alle condizioni iniziali (95% B) in modo da riequilibrare la colonna prima dell’analisi successiva.
Un’analisi in ionizzazione positiva è stata eseguita per l’analisi di molecole molto polari in Full-Scan Data Dependent MS3 nel range 100-1000 (m/z), utilizzando il seguente gradiente: da 0 a 4 minuti 99% B; da 4 a 6 minuti il solvente B diminuisce al 20%, condizioni mantenute per 2 minuti in modo da permettere il lavaggio della colonna cromatografica incrementando all’80% la fase organica. In seguito il gradiente è stato settato alle condizioni iniziali (99% B) in modo da riequilibrare la colonna prima dell’analisi successiva.
Un’ulteriore analisi in ionizzazione positiva è stata eseguita per le analisi di glicoalcaloidi steroidei, mediante una metodica Full-Scan Data Dependent MS3 nel range 220-2000 (m/z), utilizzando uno standard di tomatina per ottimizzare le condizioni spettrometriche. Il gradiente utilizzato è stato il seguente: da 0 a 0.5 minuti 80% B; da 0.5 a 8 minuti il solvente B diminuisce al 40%. Poi la percentuale di B è diminuita al 20% in modo da permettere il lavaggio della colonna cromatografica incrementando all’80% la fase organica. Dopo 2 minuti di lavaggio, il gradiente è stato settato alle condizioni iniziali (80% B) in modo da riequilibrare la colonna prima dell’analisi successiva.
Nonostante la capacità della colonna a fase inversa Acquity HSS T3 di ritenere composti polari e mediamente polari, ulteriori analisi sono state eseguite in modalità HILIC per discriminare o identificare composti altamente polari che sono poco o per nulla ritenuti dalla colonna cromatografica a fase inversa indicata sopra. Per l’analisi HILIC è stata utilizzata una colonna Acquity UPLC BEH Amide (150 × 2.1 mm, 1.7 μm) utilizzando acetonitrile (A), acqua (B), entrambi acidificati allo 0.1% e ammonio formiato 20 mM acidificato con1% di acido formico (C). Il flusso della fase mobile è stato fissato a 0.25 mL/minuto. La colonna è stata termostatata a 45°C. L’eluente C è stato mantenuto costante al 10% durante tutta l’analisi modificando solo le percentuali di A e B. Il gradiente utilizzato è stato il seguente: da 0 a 4 minuti è stato mantenuto costante all’89% di A ed 1 % di B. Da 4 a 14 minuti B incrementava al 50%, seguito da un tempo di riequilibrio della colonna alle condizioni iniziali in modo da riequilibrare la colonna per l’analisi successiva. L’analisi è stata eseguita in ionizzazione positiva mediante un metodo Full-Scan Data Dependent MS3 nel range 100-1000 (m/z)
In aggiunta alle analisi indicate sopra che si possono considerare “untargeted” (cioè analisi per la caratterizzazione qualitativa senza conoscerne a priori il contenuto), sono state eseguite analisi mirate denominate “targeted”, monitorando composti specifici non discriminabili dalla precedente analisi “untargeted”.
Nelle tabelle 10-14 sono state inserite le informazioni cromatografiche e spettrometriche dei composti identificati, ottenute dalle analisi preliminari. L’identificazione è stata eseguita mediante confronto degli spettri di frammentazione in MSn con la letteratura, mediante confronto con composti standards disponibili e mediante l’utilizzo di database online contenenti informazioni spettrometriche per numerosi composti fitochimici. I principali database utilizzati per l’identificazione sono stati: PubChem; ReSpect ;Metlin; mzClou; MoNA – MassBank of North America.
Nelle tabelle 10-13 sono stati evidenziati in verde i composti che aumentano sensibilmente come concentrazione nell’estratto L.r. 1473 rispetto al controllo. Durante le analisi preliminari, non è stata determinata la concentrazione effettiva di ogni composto, ma il dato di NL (Normalization Level) si riferisce all’abbondanza ionica di ogni composto, che è direttamente proporzionale alla concentrazione nei campioni (ciò vale solo confrontando la stessa molecola fra estratto e controllo). A causa dell’indisponibilità dei relativi composti standards, alcuni composti non sono stati possibili identificarli in modo univoco a causa della presenza di diversi isomeri che possiedono le medesime caratteristiche spettrometriche e frammentazioni simili tra loro (es. 2-hydroxyvaleric acid/2-hydroxyisovaleric acid/2-hydroxy-2-methylbutyric acid).
Tabella 10 Informazioni cromatografiche e spettrometriche dei composti fitochimici identificati in campioni di pomodoro in ionizzazione negativa.
Tabella 11. Informazioni cromatografiche e spettrometriche dei composti fitochimici identificati in campioni di pomodoro in ionizzazione positiva
Tabella 12. Informazioni cromatografiche e spettrometriche dei composti fitochimici identificati in campioni di pomodoro in modalità HILIC
g ,
Tabella 13. Informazioni cromatografiche e spettrometriche degli alcaloidi steroidei identificati in campioni di pomodoro
Caratterizzazione degli acidi organici dell’estratto di pomodoro
Si è voluta caratterizzare la frazione in acidi organici dell’estratto di pomodoro. Per questa analisi l’estratto è stato derivatizzato con agenti silanizzanti (esa5metildisilazano HMDS e trimetilclorosilano TMCS) e quindi successivamente analizzato tramite tecnica GC-MS (gas-cromatografia accoppiata a spettrometria di massa), al fine di identificare i composti presenti. In particolare è stato utilizzato un gas-cromatografo Thermo TRACE 1300 interfacciato con uno spettrometro di massa a singolo quadrupolo (ISQ) con sorgente ad impatto elettronico (EI) (Thermo Fisher Scientific). La separazione cromatografica è stata ottenuta su di una colonna capillare con fase stazionaria apolare (fenil-metil-silossano al 5% di fenile; colonna BP5MS 30 m x 0.25 mm, 0.25 µm film interno, SGE) applicando un gradiente di temperatura da 60° C a 280°C ed utilizzando elio come gas carrier (flus5so 1 ml/min), mentre il riconoscimento delle sostanze presenti è stato ottenuto tramite il confronto tra gli spettri di massa registrati per ciascun composto (range 41 – 500 m/z) con gli spettri di massa presenti nella libreria dello strumento (NIST 14).. Per l’identificazione è stato considerata una corrispondenza minima del 98%. Dalle analisi è emersa la presenza di 8 composti di interesse, in particolare sono sta1ti0 identificati: acido lattico, acetico, succinico, glicerico, malico, tartarico, citrico ed un dimero dell’acido lattico. L’acido che maggiormente rappresenta questa frazione dell’estratto di pomodoro è senza dubbio il lattico (73.50 % del totale) seguito da acido citrico (11.91 %), acido acetico (5.25 %), acido glicerico (2.64 %), acido malico (2.25 %), acido lattico sotto forma di dimero (1.91 %), acido succinico (1.8145 %) e infine da acido tartarico (0.69 %).

Claims (11)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Processo per preparare un estratto vegetale comprendente le fasi di: a) inoculare sottoprodotti o prodotti di scarto della trasformazioni di prodotti ortofrutticoli con batteri del genere Lactobacillus formando una miscela di fermentazione; b) incubare la miscela di fermentazione formando un prodotto fermentato; c) preparare un estratto del prodotto fermentato comprendente una miscela di composti attivi.
  2. 2. Processo secondo la rivendicazione 1, dove i batteri sono scelti tra le specie: L. casei, L. paracasei e L. rhamnosus.
  3. 3. Processo secondo la rivendicazione 1 o 2, dove i batteri appartengono ad almeno un ceppo batterico scelto tra: Lactobacillus rhamnosus 1019 (LMG P-31263), Lactobacillus rhamnosus 1473 (LMG P-31264), Lactobacillus paracasei 4186 (LMG P-31266), Lactobacillus casei 2240 (LMG P-31265) e Lactobacillus casei 2246 (LMG P-31267) e loro combinazioni.
  4. 4. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, dove i sottoprodotti o i prodotti di scarto sono scelti tra: cuticole, bucce, semi, polpa, gambi e foglie di ortaggi o frutta.
  5. 5. Processo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, dove i sottoprodotti o prodotti di scarto sono ottenuti da frutta scelta tra: agrumi, preferibilmente arance, mandaranci, limoni, mandarini, pesche, albicocche, prugne, carote, mele, meloni, pere e uva e/o sono ottenuti da ortaggi scelti tra: pomodori, patate, insalate, zucchine, carote, cipolle, finocchi, melanzane, peperoni e fagioli, preferibilmente i sottoprodotti o prodotti di scarto sono ottenuti da pomodori o da carote o da meloni.
  6. 6. Estratto ottenuto con il processo secondo le rivendicazioni 1-5, comprendente una miscela di composti con attività antimicrobica, preferibilmente con attività batteriostatica e/o battericida, antifungina, preferibilmente contro i lieviti,.
  7. 7. Estratto secondo la rivendicazione 6, comprendente acido lattico in una concentrazione compresa tra 50 e 90% v/v, preferibilmente tra 55 e 85% v/v, più preferibilmente tra 60 e 80% v/v, acido citrico in una concentrazione compresa tra 2 e 25% v/v, preferibilmente tra 3 e 22% v/v, più preferibilmente tra 5 e 20% v/v, acido acetico in una concentrazione compresa tra 1 e 15% v/v, preferibilmente tra 2 e 12% v/v, più preferibilmente tra 3 e 10% v/v, acido glicerico in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 8% v/v, più preferibilmente tra 1 e 5% v/v, acido malico in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 8% v/v, più preferibilmente tra 1 e 5% v/v, acido lattico in forma dimerica in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 5% v/v, più preferibilmente tra 0,8 e 3% v/v, acido succinico in una concentrazione compresa tra 0,3 e 10% v/v, preferibilmente tra 0,5 e 5% v/v, più preferibilmente tra 0,8 e 3% v/v, e acido tartarico in una concentrazione compresa tra 0,1 e 5% v/v, preferibilmente tra 0,2 e 4% v/v, più preferibilmente tra 0,3 e 3% v/v.
  8. 8. Estratto secondo la rivendicazione 6 o 7, comprendente ulteriori acidi organici, aminoacidi e alcaloidi steroidei, dove gli ulteriori acidi organici sono scelti tra: acido 2-idrossivalerico/ acido 2-idrossi-isovalerico/acido 2-idrossi-2-metilbutirrico, acido leucico, acido fenillattico, acido caffeico, acido p-idrossifenillattico, acido diidrocaffeico e acido indol-3-lattico, gli amminoacidi sono preferibilmente scelti tra: leucina, isoleucina, fenilalanina, triptofano, tirosina, adenosina e valina, e gli alcaloidi steroidei sono preferibilmente scelti tra tomatidina, glicoalcaloide steroideo, Neorickiioside A/ Lycoperoside H e Esculeoside B.
  9. 9. Uso dell’estratto secondo le rivendicazioni 6-8 come antibatterico, preferibilmente contro S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus, Salmonella spp. e E.coli.
  10. 10. Uso dell’estratto secondo le rivendicazioni 6-8 come antifungino, preferibilmente contro lieviti.
  11. 11. Uso dell’estratto secondo le rivendicazioni 6-8, per aumentare la shelf life di alimenti.
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