CN101280003A - 蛋白质稳定与生物活性保护多肽及其编码基因、重组表达载体、表达菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明为一种蛋白质稳定与生物活性保护多肽及其编码基因、重组表达载体、表达菌及应用。本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽为如下(a)或(b)或(c)所述的多肽：(a)ZYZ20多肽，它为序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；(b)由2－8个ZYZ20多肽首尾串联而成的多肽，ZYZ20多肽之间由2－5个氨基酸连接起来；(c)将上述多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白质稳定与活性保护功能的由(a)或(b)衍生的多肽。本发明的多肽可保持蛋白质制剂的稳定性，保护蛋白质制剂的生物活性，应用于蛋白质稳定与蛋白质生物活性保护剂。

Description

蛋白质稳定与生物活性保护多肽及其编码基因、重组表达载体、表达菌及应用

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种蛋白质稳定与生物活性保护多肽及其编码基因、重组表达载体、表达菌及应用。

背景技术

在现代生物科学、化学和医学领域中，广泛使用具有生物活性的各种蛋白质制剂。蛋白质制剂的存贮方式一般有液体和固体(干粉)两种形式。第一种方式的蛋白质溶液由于在常温下容易变性，降低或丧失生物活性，因此需要存放在低温环境中，但在存贮和运输过程中，可能由于各种原因导致其脱离低温环境，造成蛋白质变性沉淀和生物活性降低。第二种方式是将蛋白质制剂成干粉，存放常温下，但冷冻干燥过程中的冷冻和干燥所导致的脱水过程可对蛋白质造成损伤变性，导致生物活性降低。此外，在蛋白质溶液制剂的使用过程中，反复冻融会显著降低蛋白质的生物活性。为了保持蛋白质的稳定性和保护蛋白质的生物活性，蛋白质制剂中往往加入了各种保护剂，例如：在蛋白酶溶液中加入血清蛋白和甘油等保护剂，血清蛋白可以防止蛋白酶发生由疏水相互作用引起的聚集和沉淀，甘油可以避免疏水作用引起的蛋白酶聚集，保护蛋白酶的生物活性。在蛋白质冻干制剂中加入了糖、多羟基化合物、血清蛋白、表面活性剂和氨基酸等各种保护剂，可与蛋白质表面的极性基团形成氨键，防止蛋白质在冷冻干燥过程中失水后氢键直接暴露于周围环境中，减少蛋白质的损伤、变性和聚集。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种蛋白质稳定与生物活性保护多肽。

本发明的第二个目的在于提供一种本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的编码基因。

本发明的第三个目的在于提供一种本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的重组表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种表达本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的表达菌。

本发明的第五个目的在于提供本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的应用。

植物胚胎发育晚期丰富蛋白是胚胎发生后期伴随脱水过程在种子中大量积累的一系列蛋白质，一般分为6组，其中第1组蛋白具高亲水性和热稳定性。本发明人注意到第1组蛋白含有高度保守的20氨基酸序列，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述，该20氨基酸序列主要由亲水性氨基酸组成，含大量自由卷曲结构和左手扩展螺旋结构，本发明人推测该20氨基酸序列可防止高温、干燥或冰冻引起的脱水及反复冻融对蛋白质的损伤和变性，保持蛋白质的稳定性和保护蛋白质的生物活性。本发明人将此20氨基酸序列命名为ZYZ20多肽，通过基因工程方法表达和获得了含有2-8个ZYZ20多肽的多肽，加入到蛋白质液体制剂和蛋白质固体制剂中，可有效提高蛋白质在常温条件下的稳定性，防止蛋白质在冷冻干燥过程的变性和失活，防止蛋白质在反复冻融过程中的失活，保护蛋白质的生物活性。

本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，为如下(a)或(b)或(c)所述的多肽：

(a)ZYZ20多肽，它为序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；

(b)由2-8个ZYZ20多肽首尾串联而成的多肽，ZYZ20多肽之间由2-5个氨基酸连接起来；

(c)将(a)或(b)所述的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白质稳定与活性保护功能的由(a)或(b)衍生的多肽，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在ZYZ20多肽序列的结构域内进行的取代和/或缺失和/或添加。

所述蛋白质稳定与生物活性保护具体为可防止高温、干燥、冷冻和反复冻融对蛋白质损伤、变性和生物活性丧失。

在(b)所述多肽中，ZYZ20多肽之间的连接氨基酸较佳为核酸内切酶的酶切位点所编码。

为了使发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽便于纯化，本发明可在(a)或(b)或(c)所述多肽的氨基末端或羧基末端连接有Poly-His标签或GST标签。

发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，较好的为序列表中SEQID NO.2所述的氨基酸序列，它是由2个ZYZ20多肽首尾串联而成的多肽；更好的为序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列，它是由4个ZYZ20多肽首尾串联而成的多肽。

本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。其中(c)所述多肽的编码基因可通过将(a)或(b)所述多肽的编码基因中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上Poly-His标签或GST标签的编码序列得到。

本发明的DNA序列，为如下(a)或(b)所述的DNA序列：

(a)编码上述本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的DNA序列；

(b)在严格条件下可与(a)所述DNA序列杂交的DNA序列；所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列，是编码ZYZ20多肽的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列，是编码序列表中SEQ ID NO.2所述多肽(申请人将其命名为ZYZ20-2多肽)的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列，是编码序列表中SEQ ID NO.3所述多肽的核苷酸序列。

本发明的重组表达载体，包含有上述本发明的任何一种DNA序列。可用现有的原核表达载体构建重组表达载体。

本发明的表达菌，包含有本发明的任何一种重组表达载体或本发明的任何一种DNA序列。

本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽的表达纯化方法，是将重组表达载体转化表达菌例如大肠杆菌后，诱导表达，收集菌体，细胞破碎，离心，亲和层析纯化，凝胶过滤。最终获得蛋白质稳定与生物活性保护多肽。

本发明的蛋白质稳定与生物活性保护多肽可应用于蛋白质稳定与蛋白质活性保护剂。

实验证明，本发明蛋白质稳定与生物活性保护剂，加入蛋白质溶液后，可以防止或降低因高温、冷冻、干燥或反复冻融所引起的蛋白质变性、聚集和沉淀，可以防止或降低因高温、冷冻、干燥或反复冻融所引起的蛋白质生物活性丧失。例如：序列表中SEQ ID NO.2所述ZYZ20-2多肽加入乳酸脱氢酶溶液后，用液氮冷冻，再在40℃融化，反复多次，可防止乳酸脱氨酶因反复冻融过程引起的酶活性下降，对反复冻融过程中的蛋白质生物活性具有明显的保护作用。序列表中SEQ ID NO.2所述ZYZ20-2多肽与海藻糖加入乳酸脱氢酶溶液中，在高温(如63℃)条件下，可与海藻糖发生协同作用，保护乳酸脱氢酶活性的作用效果高于单独的ZYZ20-2多肽或海藻糖。

本发明的蛋白质稳定与活性保护剂，可保持以液体形式存在的蛋白质在高温处理或反复冻融处理下的稳定性，保护蛋白质的生物活性，对蛋白质制剂的应用具有重要意义。

附图说明

图1是原核表达载体pET-ZYZ20-2的物理图谱。

图2是ZYZ20-2多肽诱导表达图。

图3是纯化的ZYZ20-2多肽的质谱图。

图4是ZYZ20-2多肽质谱鉴定图。

图5是ZYZ20-2多肽对反复冻融条件下乳酸脱氢酶(LDH)活性的保护作用结果图。

图6是ZYZ20-2多肽与海藻糖对高温条件下乳酸脱氢酶(LDH)活性的协同保护作用结果图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一：ZYZ20-2多肽的原核表达载体和重组菌株的构建

提取大豆白农6号未成熟种子的总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据Genebank数据库中检索到的大豆胚胎发育晚期丰富蛋白1组蛋白(LEA1)序列设计引物如下：

5’-ATGGGCGCATCTCGTCAAAA-3’

5’-CTTATCCTGGTCTTCGTTCT-3’。

以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为300bp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法(Proc NatlAcad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的大豆胚胎发育晚期丰富蛋白1组蛋白(LEA1)基因由318个脱氧核糖核苷酸组成，将含有该核苷酸序列的重组质粒命名为pGEM-LEA1。

根据大豆胚胎发育晚期丰富蛋白1组蛋白中20氨基酸核苷酸序列即序列表中SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列设计引物：

5’-AGCGCTAGC GGAGGGCAAACAAGGAAGGA-3’

5’-TTTGCGTCCCATTTCCTGGTACTAGTTAAAAGCTTAGC-3’。

以pGEM-LEA1为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为80bp的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Takara)回收该片段。将该回收片段与pET-28a连接，插入位点为Nhe I和HindIII，参照Cohen等的方法(ProcNatl Acad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，根据pET-28a载体上的卡那霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明为大豆胚胎发育晚期丰富蛋白1组蛋白(LEA1)20氨基酸的核苷酸序列，其开放阅读框(ORF)为序列表中SEQ ID NO.4的自5′末端第1至60位脱氧核糖核苷酸，编码的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.1的第1至20位氨基酸。

重复上述过程将20氨基酸核苷酸序列再次插入上面构建好的重组载体中，片断酶切位点为Nhe I和HindIII，载体酶切位点为Spe I和HindIII，获得可以表达2个20氨基酸序列的重组载体，其开放阅读框(ORF)为序列表中SEQ ID NO.5的自5′末端第1至126位脱氧核糖核苷酸，编码的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的多肽，即ZYZ20-2多肽。重复以上方法还可获得含有3-8个20氨基酸序列的重组载体，例如含有SEQ ID NO.3所述多肽的重组载体。

将含有序列表中SEQ ID NO.5所述脱氧核糖核苷酸序列的重组载体命名为pET-ZYZ20-2，参见附图1。

将重组载体pET-ZYZ20-2转化入大肠杆菌BL21 STAR，获得重组菌株BL21/ZYZ20-2。

实施例二：ZYZ20-2多肽的表达

接种BL21/ZYZ20-2单克隆于少量培养基中，37℃培养至吸光度值(OD₆₀₀)为0.8时，补加IPTG至0.2mM，37℃诱导4h，4000g离心收集菌体，2×样品缓冲液重悬，100℃水浴处理5min，10000g离心10分钟，取上清进行12％SDS-PAGE，染色，观察结果。同实验对照组BL21/pET-28a比较，BL21/ZYZ20-2出现一条特异的蛋白条带，与ZYZ20-2多肽预期分子量7.3kDa接近，见附图2。

实施例三：ZYZ20-2多肽的质谱鉴定

从SDS-PAGE胶上将表达的目标蛋白切下，用胰蛋白酶进行消化，用于质谱(Waters MALDI Q-tof Premier)鉴定。MALDI所用基质为CHCA，与样品按1∶1进行混合，取1ul点样，使用氮气激光器，阳离子V模式，激光能量为220。MALDI-Q-TOF质谱检测到多肽片段为ZYZ20-2多肽的片断，在质谱图中用*号标出，见附图3。

实施例四：ZYZ20-2多肽的纯化

接种单克隆于少量培养基中，37℃培养过夜；按1∶100比例转入1000ml LB液体培养基，37℃培养至吸光度值(OD₆₀₀)为0.8，补加异丙基-B-D硫代半乳糖苷(IPTG)至0.2mM，37℃诱导4h，4000g离心收集菌体，重悬于PBS中，冰浴超声破碎，4℃，20000g离心10分钟，收集上清，参照金属螯合亲和层析介质使用说明，使用Chelating Sepharose Fast Flow柱纯化融合蛋白，获得的初步纯化蛋白用Superdex 30PG预装柱进行凝胶过滤，收集目标蛋白，并进行12％SDS-PAGE。结果表明在预期分子量处有一条特异条带，而其余蛋白条带基本消失，获得了纯度较高的ZYZ20-2多肽，见附图4。

实施例五：ZYZ20-2多肽对反复冻融条件下乳酸脱氢酶(LDH)活性的保护作用

按ZYZ20-2多肽与乳酸脱氢酶的质量比为0∶1、1∶10、5∶1、3∶1、1∶1、5∶1和10∶1，将一定量的ZYZ20-2多肽与乳酸脱氢酶(终浓度为62.5ng/ml)溶液混合后，分成两组。一组用于直接测定乳酸脱氢酶的活性。另一组放入液氨中速冻1分钟，在50℃恒温混匀器上完全融化，反复处理10次，测定乳酸脱氢酶的残留酶活性，分析ZYZ20-2多肽对乳酸脱氢酶活性在反复冻融下的保护作用。以加入同样量的血清蛋白BSA作为对照组。

结果表明，经过反复冻融后，没有加入保护剂的乳酸脱氢酶活性几乎完全消失，酶活仅为处理前的0.6％。随着所加入ZYZ20-2多肽的增加，乳酸脱氢酶残留酶活升高，在质量浓度比为5∶1时，LDH的残留酶活达到最高，为处理前的95％。对照组加入BSA，可提高乳酸脱氢酶的残留酶活，但比ZYZ20-2多肽显著低，见附图5。实验表明ZYZ20-2多肽对反复冻融条件下乳酸脱氢酶活性具有良好的保护作用。

实施例六：ZYZ20-2多肽与海藻糖对高温条件下乳酸脱氢酶(LDH)活性的协同保护作用

按ZYZ20-2多肽与乳酸脱氢酶的质量比为0∶1、1∶1、15∶1和30∶1，将一定量的ZYZ20-2多肽与乳酸脱氢酶(终浓度为62.5ng/ml)混合后，分成两组。一组用于直接测定乳酸脱氢酶活性。另一组在63℃恒温混匀器上保持5分钟后，测定乳酸脱氢酶活性，比较加入ZYZ20-2多肽前后的乳酸脱氢酶活性，分析ZYZ20-2多肽对乳酸脱氢酶在高温下的保护作用。以加入同样量的血清蛋白BSA作为对照组。

在以上实验体系中同时加入终浓度为250ng/ml的海藻糖，经过上述同样过程处理后，测定乳酸脱氢酶的活性。

结果表明，乳酸脱氢酶在高温处理后，没有加入保护剂的乳酸脱氢酶活性仅为6％。在加入同样质量的ZYZ20-2多肽和BSA后，在蛋白与LDH酶的质量比例达到15∶1后，前者中的乳酸脱氢酶活性高于后者。实验体系中均加入50mM海藻糖后，在加入同样质量的ZYZ20-2多肽和BSA时，在蛋白与LDH酶的质量比例达到15∶1后，前者中的乳酸脱氢酶活性同样高于BSA，并且ZYZ20-2多肽和海藻糖共同存在时乳酸脱氢酶的活性高于ZYZ20-2多肽和海藻糖单独存在的乳酸脱氢酶活性的两者之和，见附图6。实验结果表明ZYZ20-2多肽对高温下的乳酸脱氢酶活性具有一定的保护作用，在与海藻糖同时存在的情况下，可发挥协同效应作用提高对乳酸脱氢酶活性的保护作用。

参照上述实施例的过程和方法可获得由3-8个ZYZ20多肽首尾串联而成的多肽，如SEQ ID NO.3所述的ZYZ20-4多肽。对ZYZ20-4多肽同样进行了反复冻融处理实验，实验结果表明在ZYZ20-4多肽与LDH酶的质量比为1∶1时，经过10次反复冻融处理后，LDH酶残留活性比ZYZ20-2多肽提高20％，表明与ZYZ20-2多肽相比ZYZ20-4多肽对LDH酶活性具有更强的保护作用。根据实验结果及理论推测，其它串联数目的ZYZ20系列多肽对LDH酶均具有保护作用，并且随着ZYZ20串联数目的增加，在加入同样质量的ZYZ20系列多肽的条件下，ZYZ20系列多肽对LDH酶的保护作用效果也相应提高。

                          序列表

<110>深圳大学

<120>蛋白质稳定与生物活性保护多肽及其编码基因、重组表达载体、表达菌及应用

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

Gly Gly Gln Thr Arg Lys Glu Gln Leu Gly Thr Glu Gly Tyr Gln Glu

1               5                   10                  15

Met Gly Arg Lys

            20

<210>2

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Gly Gly Gln Thr Arg Lys Glu Gln Leu Gly Thr Glu Gly Tyr Gln Glu

1               5                   10                  15

Met Gly Arg Lys Thr Ser Gly Gly Gln Thr Arg Lys Glu Gln Leu Gly

            20                  25                  30

Thr Glu Gly Tyr Gln Glu Met Gly Arg Lys

        35                  40

<210>3

<211>86

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Gly Gly Gln Thr Arg Lys Glu Gln Leu Gly Thr Glu Gly Tyr Gln Glu

1               5                   10                  15

Met Gly Arg Lys Thr Ser Gly Gly Gln Thr Arg Lys Glu Gln Leu Gly

            20                  25                  30

Thr Glu Gly Tyr Gln Glu Met Gly Arg Lys Thr Ser Gly Gly Gln Thr

        35                  40                  45

Arg Lys Glu Gln Leu Gly Thr Glu Gly Tyr Gln Glu Met Gly Arg Lys

    50                  55                  60

Thr Ser Gly Gly Gln Thr Arg Lys Glu Gln Leu Gly Thr Glu Gly Tyr

65                  70                  75                  80

Gln Glu Met Gly Arg Lys

                85

<210>4

<211>60

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>4

ggagggcaaa caaggaagga acagctgggt acagaagggt accaggaaat gggacgcaaa   60

<210>5

<211>126

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ggagggcaaa caaggaagga acagctgggt acagaagggt accaggaaat gggacgcaaa   60

actagcggag ggcaaacaag gaaggaacag ctgggtacag aagggtacca ggaaatggga  120

cgcaaa                                                             126

<210>6

<211>258

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ggagggcaaa caaggaagga acagctgggt acagaagggt accaggaaat gggacgcaaa  60

actagcggag ggcaaacaag gaaggaacag ctgggtacag aagggtacca ggaaatggga  120

cgcaaaacta gcggagggca aacaaggaag gaacagctgg gtacagaagg gtaccaggaa  180

atgggacgca aaactagcgg agggcaaaca aggaaggaac agctgggtac agaagggtac  240

caggaaatgg gacgcaaa                                                258

Claims (10)

1.一种蛋白质稳定与生物活性保护多肽，为如下(a)或(b)或(c)所述的多肽：

(a)ZYZ20多肽，它为序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；

(b)由2-8个ZYZ20多肽首尾串联而成的多肽，ZYZ20多肽之间由2-5个氨基酸连接起来；

(c)将(a)或(b)所述的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而成的具有蛋白质稳定与活性保护功能的由(a)或(b)衍生的多肽，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在ZYZ20多肽序列的结构域内进行的取代和/或缺失和/或添加。

2.根据权利要求1所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，其特征在于：为序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽，其特征在于：为序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。

4.一种DNA序列，为如下(a)或(b)所述的DNA序列：

(a)编码权利要求1所述蛋白质稳定与生物活性保护多肽的DNA序列；

(b)在严格条件下可与(a)所述DNA序列杂交的DNA序列；所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

5.根据权利要求4所述的DNA序列，其特征在于：为序列表中SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。

6.根据权利要求4所述的DNA序列，其特征在于：为序列表中SEQ ID NO.5所述的核苷酸序列。

7.根据权利要求4所述的DNA序列，其特征在于：为序列表中SEQ ID NO.6所述的核苷酸序列。

8.一种重组表达载体，包含有权利要求4所述的任何一种DNA序列。

9.一种表达菌，包含有权利要求8所述的任何一种重组表达载体或权利要求4所述的任何一种DNA序列。

10.权利要求1或2或3所述的蛋白质稳定与生物活性保护多肽在蛋白质稳定与生物活性保护剂上的应用。

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