MXPA98000016A - Expresion de peptido anticongelante de pez de oceano en un organismo de grado alimenticio y su aplicacion en productos alimenticios - Google Patents
Expresion de peptido anticongelante de pez de oceano en un organismo de grado alimenticio y su aplicacion en productos alimenticiosInfo
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Abstract
Se describe el uso de un polipéptido protenína con una secuencia de aminoácido que corresponde sustancialmente a HPLC-12 de AFP de tipo III como aditivo en un producto para mejorar el producto, la mejora recibiendo en propiedades mejoradas de modificación de procedimientos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencia en las características de tamaño y forma del hielo en particular en el recrecimento, de esta manera, por ejemplo reduciendo al mínimo el daño de congelación potencial por ejemplo evitando o inhibiendo la recristalización de hielo del producto después de congelación, el uso ocurriendo en una forma conocida per se para péptido anticongelantes para obtener una actividad de modificación específica superior en particular la actividad anticongelante que la que se puede obtener con la misma cantidad de AFP de Winter Flounder.
Description
EXPRESIÓN PE PEPTIDO ANTICO NGE LA NT E„ DE PEZ DE
OCÉANO EN UN ORGAN I SMO DE GRADO ALI M ENTI CIO Y SU
APLI CACIÓN EN PRODUCTOS ALIMENTI CIOS
1 . I NTRODUCCIÓN
La sangre de un pez polar es protegida de congelación a través de la presencia de péptidos anticongelantes- Estos péptidos anticongelantes pueden ser clasificados en cuatro tipos de acuerdo con sus estructuras (Davies and Hew, 1990). El AFP de Tipo I son ricos en alanina con residuos de treonina y asparagina regularmente separados y tienen una conformación a-helicoidal . AFP de Tipo II tienen un contenido de cisteína característico alto (8%) AFP de Tipo lll son péptidos globulares pequeños (aproximadamente 64 aminoácidos de longitud). El grupo final, las glicoproteínas anticongelantes tienen un motivo de tripéptido repetido al cual se une un disacárido específico. Todos estos péptidos comparten la propiedad de depresión de punto de congelación no coligativo e inhibición de crecimiento de cristal de hielo. Estos aspectos pueden encontrar aplicación para alterar el estado de cristal de hielo de productos congelados. Ya que la purificación de estos péptidos de sangre de pez probablemente se debe a un proceso económicamente viable, se busca un método para la producción a granel de AFP utilizando biotecnología moderna. Los primeros trabajos en la producción de péptidos anticongelantes en microorganismos se concentraron en la expresión de AFP de Tipo I tanto en levadura como en Escherichia coli (Warren et al, 1993, McKown et al, 1991 ). Ya que E. coli tiene la capacidad de producir toxinas, esta bacteria generalmente no es considerada como segura (GRAS) la cual posee problemas para su uso en la producción de AFP destinado para la aplicación en la industria alimenticia. Las cepas de levadura como Saccharomyces cere visiae se conoce que se consideran organismos GRAS y , a diferencia de E. coli, tienen la capacidad de secretar proteínas heterólogas hacia el medio de crecimiento, que facilita el procesamiento corriente abajo del producto. Por lo tanto, es un organismo huésped atractivo para la producción de una variedad de proteínas heteróiogas (Romanos et al, 1992). Los primeros reportes de la producción de AFP en levadura se refieren a la acumulación i ntracel ular de una fusión de una AFP de Tipo I sintética con una proteína A Staphylococcus aureus (Warren et al, 1993) . Se reclamó que este péptido protegió la levadura contra los efectos dañinos de la congelación. No se describe ninguna producción extracelular de AFP de Tipo I . No se menciona nada con respecto a los otros tipos de AFP. En este laboratorio, los transformantes de levadura llevando un vector de expresión conteniendo un gen sintético de un AFP de Tipo I natural Winter Flounder (HPLC6) han sido construidos (Driedonks et al, 1995) y esto se describe en la solicitud de PCT del solicitante WO 94/03617 ahora abandonada. La secreción de AFP de monómero activo a través de estas levaduras no fue demostrable. La única forma para obtener la actividad de inhibición de recristalización de hielo significativa fue expresar multímeros de AFP de Tipo I designado para permitir su procesamiento subsecuente a través una proteasa de levadura endógena para producir monómeros activos (Driedonks et al, 1995). Este aspecto, aunque finalmente permite la producción de AFP de Tipo I activo dio como resultado la secreción de formas heterogéneas parcialmente procesadas del AFP multimérico. El tratamiento subsecuente para obtener péptido activo como un monómero se considera inaceptable para propósitos de producción industrial. Además de los esfuerzos extras y los costos, tal adición también pudo conducir a problemas para obtener permiso para la aplicación en productos alimenticios. En primer lugar esto se debe al uso de productos químicos para obtener monómeros activos y en segundo lugar debido a la expresión de secuencias no nativas. De esta manera, pareció imposible utilizar un organismo de grado alimenticio para expresar y secretar AFP monomérico activo en una forma simple y eficiente proporcionando un procedimiento industrialmente aceptable que se puede aplicar en la producción de alimentos. En un intento para superar los problemas poseídos expresando AFP de Tipo I en levadura, se intentó expresar AFP de Tipo lll a partir de Gada Oceánica en levadura. El AFP de Tipo lll son proteínas globulares pequeñas y se considera que por esta razón pueden ser más adecuadas para la expresión en levadura que AFP de Tipo I a-helicoidal. Se encontró que AFP de Tipo ll l en la sangre de pez polar tal como Gada Oceánica (Macrozoarces americanus) y Lobo de Mar (Davies and Hew, 1990). El fraccionamiento de la sangre del Gada Oceánica ha sido descrita como que revela la presencia de por lo menos 12 diferentes variedades de AFP de Tipo l ll (Figura 1 , Hew et al, 1984, Davies and Hew, 1990). Estos péptidos son altamente homólogos, compartiendo por los menos 60% de identidad de aminoácido y en mutagénesis in vitro ha demostrado un conjunto de residuos de superficie comunes a todas las variantes de AFP de Gada Oceánica, las cuales ST requieren para la unión a hielo (Chao et al, 1994) . La carga negativa de ácido Glutámico (Glu) en las posiciones 23 y 36 parece estar involucrada en la estabilidad térmica y la actividad histerética térmica del polipéptido. Li et al, 1991 ). La Asparagina (Asn) en la posición 14, Threonina (Thr) en 18 y Glutamina (Gln) en 44, los siguientes tres aminoácidos conservados, también parecen ser residuos clave en la actividad de unión de hielo de APF de Tipo l l l (Chao et al, 1994). Se ha manejado expresar la variante H PLC-1 de
AFP de Ti po l l l de Gada Oceánica en levadura , pero no fueron capaces de obtener la sec reción de un monómero suficientemente activo de A FP de Ti po l l l . Esto obviamente no resolvió los problemas antes mencionados . Ade más, se determi nó que H PLC-1 AFP de Ti po l l l producido a través de levadura exhibió una acti vi dad específica inesperadamente baja cuando se comparó con la preparación de AFP aislado de sangre de Gada Oceánica. Esta baja actividad posiblemente se puede deber a la flexión incorrecta del polipéptido o debido a una actividad específica inherentemente más baja de la variante de HPLC-1 . Ciertamente no se ve prometedor continuar esta línea de búsqueda para producir más AFP activo que aquellos encontrados en Winter Flounder.
También se fraccionó AFP derivado de sangre de Gada Oceánica a las varias fracciones de H PLC y se analizó su actividad de recristalización con el fin de averiguar qué fracción diferente a H PLC-1 potencialmente puede ser útil para la solicitud deseada. HPLC 12 pareció ser la única fracción de las fracciones de AFP 12 de Tipo l l l activas en la inhibición de recristalización a las concentraciones probadas. De esta manera, se determinó que H PLC-12 puede ser de interés si se manera para superar los problemas en la producción recombinante del mismo que se han encontrado para AFP de Tipo I y H PLC-1 del AFP de Tipo l l l . Muy inesperadamente en vista de los experimentos anteriores tanto con AFP de Tipo I como con AFP de Tipo l l l , se encontró subsecuentemente que la expresión de levadura de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido determinada para AFP de Tipo ll l H PLC-12 condujo a un producto que se expresó y se secretó como un monómero y no exhibió actividad reducida. De esta manera, un proceso de producción eminentemente adecuado utilizando tecnología de ADN recombinante para producir AFP activo puro, fue disponible. En realidad lo que además se descubrió fue que HPLC-12 recombinante secretó a través de levadura como un monómero tal que puede exhibir la actividad de péptido anticongelante alta de una mezcla de AFP aislado de la sangre de Gada Oceánica. Esta actividad anticongelante casi es del doble de aquella de AFP de Tipo I de Winter Flounder. Además, el producto es así más activo en ensayos de recristalización y mucho más adecuado para aplicaciones deseadas que los otros AFP. La composición de aminoácido, secuencias y secuencias de ácido nucleico de varios AFP de Tipo lll de existencia natural ya son conocidos. Davies and Hew (1990) dieron una revisión de lo mismo y se refieren a artículos de Li et al de 1985 y Hew et al. de 1988 para secuencias de HPLC- 1 ,4,5-7,9, 11 y 12 según determinado para Gada Oceánica con base en las clonas de ADNc de ADN genómico de pez en fagos. En Protein Science en 1994 Chao, H et al. se describe cómo una isoforma de AFP de Tipo l l l H PLC-12 es sintéticamente sintetizada y expresada en E. coli para dos estudios de RMN dimensionales para ayudar a entender las relaciones de estructura/función en proteínas anticongelantes y para definir los motivos para la unión de hielo. El ácido nucleico es subsecuentemente mutado con el fin de producir el polipéptido de AFP de Tipo l l l mutante, tales mutantes siendo mutantes de prolina. El valor de histéresis térmica de HPLC-1 2 recombinante no mutado se comparó con AFP aislado de Gada Oceánica, es decir, AFP de Tipo l l l . Los perfiles de actividad fueron descritos como siendo indistinguibles dentro de los límites de errores normales. No se mencionó ninguna comparación con otros tipos de AFP. No se dio ninguna indicación de un valor anormalmente alto de histéresis térmica, en realidad no se presentó ningún valor. No se estableció nada con respecto a ningún efecto en las propiedades de recristalización. Por la presente se señala que las actividades de histéresis térmica no se unieron a las propiedades de recristalización. Los valores de histéresis térmica son indicativos de resistencia a la unión y no dan una medida de la actividad anticongelante como un ensayo de recristalización. Los ejemplos son conocidos de proteínas para exhibir altos valores de histéresis, pero no afectan la recristalización y viceversa, lo cual ilustra la falta de correlación. La alta actividad de AFP de HPLC-12 recombinante fue totalmente inesperada en vista de los resultados obtenidos para HPLC-1 recombinante y en vista de lo que se ha descrito en publicaciones con respecto a AFP. Los valores de la histéresis térmica de las fracciones AFP de Tipo lll según obtenidas a través de fraccionamiento de columna Sephadex de AFP de Tipo ll l de Gada Oceánica derivados de la sangre se dan en el artículo de Hew et al 1984 en la Tabla 1 que son los valores para AFP Flounder (=Tipo-l) AFP de Cuervo Marino (=Tipo-ll). Estos valores fueron derivados para fracciones derivadas de sangre de las especies relevantes, no a través de tecnología de ADN recombinante . Esto pareció ser solamente diferentes ligeras en las actividades entre los AFP con el más activo siendo QAE-A. El QAE-A fue uno de las cinco variantes distintas que pueden ser separadas en una columna de QA E Sephadex y subsecuentemente se mostró que se deriva de H PLC-12. Sin embargo, las diferencias se describen como siendo tan ligeras que caen dentro de la desviación debido a las variaciones de medición. Las diferencias en valores de histéresis térmica fueron claramente descartadas por ser ¡rrelevantes por Hew et al y otros pos sí mismos en el mismo artículo. Establecen "La Mayoría de AFP de Gada Oceánica exhibió histéresis térmica comparable con aquella encontrada para otros AFGP y AFP conocidos". En la última literatura no se mencionan los valores de histéresis térmica para los varios tipos o comparaciones entre el Tipo I y el Tipo l l l . No se enseña ni se sugiere nada con respecto a los efectos de recristalización de las varias fracciones. Por lo tanto, no es esperó que ningún AFP de Tipo l l l individual pudiera exhibir una actividad específica superior para la inhibición de crecimiento de cristal de hielo que la AFP de Winter Flounder. Tampoco se describió ni se sugirió que HPLC-12 exhibe una actividad mucho mayor que cualquier péptido AFP de Tipo I u otro péptido AFP de Tipo lll . Para probar si la actividad de AFP de HPLC-12 de Tipo l ll fue más alta, se fraccionó la preparación de AFP de Gada Oceánica derivada de la sangre a través de HPLC y se probaron los componentes de péptido individuales para su capacidad para inhibir el crecimiento de cristal de hielo. Se determinó que la variante HPLC-12 tuvo una actividad específica más alta. Los otros componentes no mostraron ninguna actividad detectable a una concentración equivalente a 100 mg de AFP de Tipo lll de pez por mi. De esta manera, se encontró un método para preparar un polipéptido de grado alimenticio puro exhibiendo una actividad de AFP casi del doble de aquella de AFP de Tipo I. Ya que ésta puede ser secretada como un monómero en contraste al AFP de Tipo I, esto es ideal para la producción a gran escala, requiriendo un lote menor de procesamiento corriente abajo que el AFP de Tipo I producido a través de tecnología recombinante. Además, la expresión como un monómero significa un producto casi idéntico al péptido de existencia natural en la sangre del Gada Oceánica, que puede ser producido. Tal producto será más fácilmente admitido para utilizarse en productos alimenticios debido a su estrecha semejanza con el AFP de existencia natural en el organismo de grado alimenticio nativo, el Gada Oceánica. El objeto de la invención ahora nos permite producir por primera vez a gran escala a un bajo costo y a una gran facilidad AFP de Tipo lll recombinante del tipo HPLC-12, que tiene una actividad específica inherentemente mayor que el AFP de Tipo I Winter Flounder. Los péptidos anticongelantes del tipo-lll de acuerdo con la invención son los candidatos más prometedores para la aplicación en productos alimenticios destinados para ser congelados tales como helados y masa congelada y otros productos para hornear congelados, debido a sus actividades inhibidoras de recristalización altamente específicas. Una ventaja adicional se encuentra en el hec ho de que la secreción del producto de expresión como polipéptido activo, de preferencia como un monómero, ahora puede ocurrir in situ en el procedimiento de producción de alimentos, eliminando así el requerimiento de agregar el AFP como tal . Ahora se ha hecho posible producir productos de fermentación utilizando una levadura capaz de secretar un polipéptido sustancialmente correspondiendo a H PLC-12 de AFP de Tipo l l l en procesos de fermentación, por lo que la producción in situ del polipéptido sustancialmente correspondiendo al HPLC-12 de AFP de Tipo l l l ocurre sin requerir pasos adicionales tales como purificación del polipéptido y su adición subsecuente en el procedimiento de producción de alimentos. También el desarrollo de plantas, fruta o vegetales y animales transgénicos o sus partes con propiedades de congelación mejores debido a la expresión in situ de un polipéptido sustancialmente corresponde a HPLC-12 de AFP de Tipo lll, ahora son posibles.
2, DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El objeto de la invención está dirigida a un proceso para preparar un producto mejorado, la mejora reside en la modificación de procedimientos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencia en el tamaño y características de forma del hielo en particular en el recrecimiento, por ejemplo, reduciendo así el daño de congelación potencial, por ejemplo, evitando o inhibiendo la recristalización de hielo del producto después de congelación,, el proceso comprende agregar un polipéptido o proteína con una secuencia de aminoácido sustancialmente correspondiente aquella a HPLC-12 de AFP de Tipo lll exhibiendo actividad de AFP mayor que el AFP de Tipo I de Winter Flounder al producto no mejorado o a un ingrediente o mezcla normalmente utilizado para preparar el producto no mejorado, la adición del polipéptido recombinante o proteína ocurriendo en una cantidad suficiente para afectar el crecimiento de cristal de hielo. El producto puede ser un producto alimenticio o un material biológico. El material biológico puede ser, por ejemplo, un órgano o tejido animal o puede ser material de planta. En particular, se puede agregar polipéptido recombinante. De preferencia, el polipéptido será de un estado de grado alimenticio con el fin de proporcionar el producto final con un estado de grado alimenticio. Se prefiere un procedimiento, de acuerdo con la invención, en donde el producto es un producto alimenticio. Una modalidad específica del polipéptido adecuado es un AFP de levadura como se ilustra en los ejemplos. Adecuadamente, un procedimiento de producción, de acuerdo con la invención, de un producto mejorado exhibiendo propiedades de congelación mejoradas puede comprender la adición de un AFP obtenido en una nueva producción de polipéptido, que también cae dentro del alcance de la invención y se aclara en cualquier parte en la descripción. El término "un polipéptido o proteína con una secuencia de aminoácido sustancialmente correspondiendo a aquella de HPLC-12 AFP de Tipo 111" comprende una secuencia de aminoácido igual a la secuencia de aminoácido de HPLC-12 aislada de Gada Oceánica y también comprende una secuencia de aminoácido que difiere por uno o dos aminoácidos de la secuencia de aminoácido conocida, pero sigue codificando un polipéptido con la misma actividad de AFP como la proteína nativa. Las mutaciones o diferencias no pueden ser en aminoácidos conocidos que son esenciales para la actividad del polipéptido. Los residuos de prolina son de preferencia no eliminados o reemplazados. De preferencia, cualesquiera diferencias en la secuencia de aminoácidos son mutaciones silenciosas por lo que las sustituciones son sustituciones conservadoras que no alteran el perfil de hidropatía del polipéptido y de esta manera presumiblemente no tienen influencias en forma severa en la estructura del polipéptido y la actividad, es decir, un aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica, de preferencia sólo es intercambiada por otro aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica y un aminoácido con una cadena lateral hidrofílica, solamente es reemplazado por otro aminoácido con una cadena lateral hidrofílica. La homología de aminoácido entre H PLC-12 y HPLC-1 es menor que 60%. Una secuencia de aminoácido que exhibe homología por arriba de 60%, de preferencia más de 70%, y de mayor preferencia más de 80%, puede esperarse que sea representativa de un polipéptido que exhiba propiedades similares a HPLC-12 y de esta manera también se considera sustancialmente que corresponde a HPLC-1 2. Además, el polipéptido codificado por la secuencia de aminoácido debe exhibir por lo menos la actividad AFP de AFP de Tipo I de Winter Flounder y de preferencia por lo menos la actividad de AFP de HPLC-12 nativo. La actividad de AFP puede ser determinada realizando comparaciones con ensayos de recristalización utilizando una serie de diluciones del polipéptido para ser determinado y cantidades iguales y diluciones de AFP de Tipo I y/o HPLC-12 nativo según obtenido de sangre de Gada Oceánica. La manera en la cual el análisis de recristalización puede ser realizado y evaluado se ilustra en los Ejemplos. Un polipéptido que exhibe cualquiera o un número de las características antes mencionadas puede ser considerado que corresponde sustancialmente a HPLC-12. Un proceso para preparar un producto mejorado, la mejor residiendo en propiedades mejoradas debido a la modificación de procesos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencias en las características de tamaño y forma del hielo, en particular en el recrecimiento, de esta manera, por ejemplo, reduciendo al mínimo el daño de congelación potencial, por ejemplo, evitando o inhibiendo la recristalización de hielo del producto después de congelación, el proceso comprende además de un organismo huésped capaz de expresión de un polipéptido recombinante de grado alimenticio o proteína con una secuencia de aminoácido secuencialmente correspondiendo a aquella de HPLC-12 de AFP de Tipo lll al producto no mejorado como tal o a un gradiente o mezcla normalmente utilizado para preparar el producto no mejorado y subsecuentemente someter el organismo huésped a condiciones de manera que la secuencia de ácido nucleico que codifica HPLC-12 de AFP de Tipo ll l se expresa en el producto o ingrediente o mezcla realizando un procedimiento de producción de polipéptido de acuerdo con la invención como se describe en cualquier parte en la descripción además de los pasos normalmente tomados para preparar el producto no mejorado también cae dentro del alcance de la presente invención. El producto adecuadamente puede ser un producto alimenticio o un material biológico. El material biológico puede ser, por ejemplo, un órgano o tejido animal o puede ser un material de planta. Se puede agregar un polipéptido recombinante en particular. De preferencia, el polipéptido será de un estado de grado alimenticio con el fin de proporcionar el producto final con un estado de grado alimenticio. Se prefiere un proceso en donde el producto que sea mejorado es un producto alimenticio. Una modalidad específica de un polipéptido adecuado para un proceso de acuerdo con la invención es un AFP de levadura como se ilustra en los Ejemplos. El organismo huésped puede ser ya sea destruido o dañado durante o después del proceso de producción con el fin de liberar el polipéptido o proteína de AFP hacia la mezcla o ingrediente del producto o hacia el producto per se. Tal destrucción o daño puede ocurrir en un número de formas conocidas por aquellos expertos en la técnica, por lo que se debe tener cuidado de no realizar el proceso bajo condiciones demasiado adversas para evitar la pérdida de la actividad de AFP del polipéptido o proteína. Alternativamente, un organismo huésped capaz de secretar el polipéptido o proteína AFP en el ingrediente o mezcla o producto alimenticio como tal debe utilizado en el proceso de producción. Por ejemplo, una levadura de horneo puede ser el organismo huésped en un proceso para la producción de un producto alimenticio tal como un producto de pastelería. El proceso de producción puede ser realizado tan usual con la única diferencia de la adición de una levadura diferente, es decir, una levadura que comprenda una construcción de ADN capaz de expresión y secreción de un polipéptido o proteína sustancialmente correspondiendo a HPLC-12 de AFP de Tipo ll l en la masa antes de o durante el horneo permitiendo así la producción de la masa o producto horneado con propiedades de congelación mejoradas. Se utilizan procesos análogos en donde la bacteria tal como bacteria de ácido láctico es utilizada para formar modalidades adecuadas de la invención. Los procesos de fabricación de queso y yogurt u otros procesos de producción de alimentos que requieren fermentación caen dentro del tipo de procesos cubiertos por la invención. Ventajosamente, un proceso de producción para mejorar los productos de acuerdo con la invención será realizado sin requerir la adición de proteasas o productos químicos después del polipéptido o proteína recombinante con la secuencia de aminoácido correspondiendo sustancialmente a HPLC-12 de AFP de Tipo l l l se haya expresado o secretado para obtener el polipéptido o proteína de AFP como producto monomérico. El uso de un polipéptido o proteína con la secuencia de aminoácido correspondiendo sustancialmente a HPLC-12 de AFP de Tipo lll en cualquiera de las modalidades descritas anteriormente como aditivo en un producto para mejorar el producto, dicha mejora residiendo en propiedades mejoradas de modificación de los procesos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencia en las características de tamaño y forma del hielo en particular en el recrecimiento, reduciendo así, por ejemplo, el daño de congelación potencial por ejemplo, evitando o inhibiendo la recristalización de hielo del producto después de congelación, el uso ocurriendo en una forma conocida per se para AFP para obtener una actividad anticongelante específica más alta que la que se puede obtener con AFP Winter Flounder, cae dentro de la invención. De preferencia, el producto será un producto alimenticio. El producto puede ser adecuadamente un material biológico. La proteína o polipéptido pueden ser una proteína o polipéptido recombinantes.
La modalidad preferida del proceso o uso para mejorar los productos es un proceso o uso, en donde el producto es un producto destinado para ser congelado. Para productos alimenticios, un ejemplo adecuado es el helado. Como se indicó anteriormente, también son de interés una masa o producto de horneo. Los productos alimenticios que comprenden un polipéptido o proteína recombinante de grado alimenticio con una secuencia de aminoácido que corresponde sustancialmente a HPLC-12 de AFP de Tipo lll en cualquiera de las modalidades descritas anteriormente como aditivo en el producto alimenticio para la mejora del producto, dicha mejora residiendo en las propiedades mejoradas de la modificación de los procesos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencia en las características de tamaño y forma del hielo, en particular en el recrecimiento, reduciendo así al mínimo el daño de congelación potencial por ejemplo, evitando o inhibiendo la recristalización de hielo del producto después de la congelación, caen dentro del alcance de la invención. El producto alimenticio no comprende organismos comestibles de existencia natural como el Gada Oceánica que comprende meramente secuencias que codifican un polipéptido o proteína que tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a la secuencia de aminoácido de HPLC-12 de Gada Oceánica en la forma y número en el cual ocurren por naturaleza en el Gada Oceánica. Una categoría adecuada de productos, de acuerdo con la invención, es un producto no animal. Otra categoría adecuada es la categoría de productos hechos por el hombre. Los productos de planta también son ejemplos adecuados de productos de acuerdo con la invención. Los productos alimenticios, de acuerdo con la invención, pueden ser obtenidos a través de un proceso o utilizarse para mejorar un producto en cualquiera de las modalidades descritas anteriormente. En particular, un producto alimenticio que comprende un organismo huésped recombinante de grado alimenticio que tiene una tolerancia de congelamiento mejorada, la mejora residiendo en las propiedades mejoradas de modificación de procesos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencia en las características de tamaño y forma del hielo en particular en el recrecimiento, por ejemplo, reduciendo así al mínimo el daño de congelación potencial, por ejemplo, evitando o inhibiendo la recristalización del hielo del producto después de la congelación, el organismo huésped de grado conteniendo y/o estando rodeado por un polipéptido o proteína recombinante de grado alimenticio con una secuencia de aminoácido que corresponde sustancialmente a HPLC-12 de AFP de Tipo lll en cualquiera de las modalidades descritas anteriormente y/o capaz de expresar y/o secretar el polipéptido o proteína antes de la congelación, también se reclama. Tal organismo huésped recombinante de grado alimenticio recombinante también cae dentro del alcance de protección de la invención. Ya que un organismo huésped recombinante de grado alimenticio recombinante capaz de expresar por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica AFP, la secuencia de ácido nucleico estando compuesta en una construcción de ADN, la construcción de ADN no estando presente en el organismo huésped nativo y la construcción de ADN comprendiendo en el orden dado: (a) un promotor activo, fuerte, opcionalmente inducible, en el organismo huésped, (b) un codón de inicio ATG, que puede estar presente en una secuencia de señal de ADN opcional capaz de secretar la proteína producida por el organismo huésped durante la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP de (c) más adelante, la secuencia de señal puede ser homologa o heteróloga a la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP y está en el marco de lectura con el codón de inicio de ATG. (c) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido correspondiendo sustancialmente a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo l ll, la secuencia de ácido nucleico en el marco de lectura con el codón de inicio de ATG, y opcionalmente (d) un codón de tope unido al extremo 3* de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP. Las modalidades adecuadas del organismo huésped recombinante se describen se describen a continuación en el proceso para la producción de polipéptido y estos organismos como tales con reclamados. El objeto de la invención además está dirigido a un proceso para producir polipéptidos o proteínas recombinantes exhibiendo crecimiento de cristal de hielo y actividad de modificación de forma, péptidos anticongelantes recombinantes así llamados (AFP) exhibiendo una actividad anticongelante específica mayor que aquella de AFP de Winter Flounder, por 1 ) cultivando un organismo huésped de grado alimenticio bajo condiciones por lo que la expresión de por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica AFP ocurre o es inducida, la secuencia de ácido nucleico estando comprendida en una construcción de ADN, la construcción de ADN no está presente en el organismo huésped nativo y la construcción de ADN comprendiendo en el orden dado: (a) un promotor activo, fuerte, opcionalmente inducible, en el organismo huésped, 21
(b) un codón de inicio ATG, que puede estar presente en una secuencia de señal de ADN opcional capaz de secretar la proteína producida por el organismo huésped durante la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP de (c) más adelante, la secuencia de señal puede ser homologa o heteróloga a la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP y está en el marco de lectura con el codón de inicio de ATG. (c) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido correspondiendo sustancialmente a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo lll , la secuencia de ácido nucleico en el marco de lectura con el codón de inicio de ATG, y opcionalmente (d) un codón de tope unido al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP. El proceso puede comprender adicionalmente en forma opcional recoger el producto expresado de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP obtenida de la misma a través del procesamiento adicional en una forma conocida per se. Con el fin de obtener la secreción del producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido sustancialmente correspondiendo a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo lll, la construcción de ADN puede comprender además una secuencia de señal para el organismo huésped permitiendo la secreción por el organismo durante la cultivación del huésped. El organismo huésped es adecuadamente un microorganismo. Los microorganismos de grado alimenticio adecuado son hongos tales como levadura y bacterias tales como bacterias de ácido láctico. Las células de levadura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces fragilis Saccharomyces lactis son ejemplos de una célula huésped de levadura adecuada. Un experto en la técnica de los procesos de fermentación en la producción de alimentos sabrá qué células de levadura son adecuadas y qué sistemas de transformación y de expresión están disponibles (Romanos et al, Campbell y Duffus). La bacteria de ácido láctico Lactobacillus, Streptococcus y Bifidobacterium también son ejemplos de organismos huéspedes bacterianos adecuados de los cuales se conocen muchas cepas y para los cuales existen sistemas adecuados de transformación y de expresión como cualquier experto en la técnica del trabajo de ADN recombinante de bacterias asociadas con productos lácteos conocidos (Gasson, 1993). La FDA tiene una lista de organismos de grado alimenticio, la cual está disponible al público. Un experto en la técnica está al pendiente de los organismos que son considerados de grado alimenticio, es decir, tienen GRAS (generalmente reconocidos como seguros). En organismos particulares asociados con fermentación de productos alimenticios y producción de productos lácteos, son adecuados. La frase "una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido sustancialmente que corresponde a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo III" comprende cualquier ácido nucleico que codifica exactamente la secuencia de aminoácido de HPLC-12 nativo de Gada Oceánica. La secuencia de aminoácido puede diferir debido a la degeneración del código genético, es decir, el hecho de que diferentes codones de ácido nucleico codifican al mismo aminoácido. Además, una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido que difiere por uno o dos aminoácidos de la secuencia de aminoácido conocida, pero sigue codificando un polipéptido con la misma actividad de AFP como la proteína nativa, también es incluida dentro del alcance de la invención. Las mutaciones o diferencias no pueden ser en aminoácidos conocidos como esenciales para la actividad del polipéptido. Los residuos de prolina, de preferencia, por lo tanto, no son eliminados o reemplazados, de preferencia, cualesquiera diferencias en la secuencia de aminoácido son mutaciones silenciosas, por lo que las sustituciones son sustituciones conservadoras que no alteran el perfil de hidropatía del polipéptido y de esta manera presumiblemente no tienen influencia con severidad en la estructura del polipéptido y la actividad, es decir, un aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica, de preferencia sólo es intercambiado para otro aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica, y un aminoácido con una cadena lateral hidrofílica solamente es reemplazado por otro aminoácido con una cadena lateral hidrofílica. La homología de aminoácido entre HPLC-12 y HPLC-1 es menor que 60%. Una secuencia de aminoácido que exhibe una homología por arriba de 60%, de preferencia mayor que 70% y de mayor preferencia más de 80% puede esperarse que sea representativa de un polipéptido que exhiba propiedades similares de HPLC-12 y de esta manera se considera sustancialmente que corresponde a HPLC-12. La frase "sustancialmente que corresponde a" de esta manera incluye secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácido que exhiben más de 60% de homología a la secuencia de aminoácido de HPLC-12 nativo. Además, el polipéptido codificado a través de la secuencia de aminoácido debe exhibir por lo menos la actividad de AFP del AFP de Tipo I de Winter Flounder y de preferencia por lo menos la actividad de AFP de HPLC-12. La actividad de AFP puede ser determinada realizando comparaciones con ensayos de recristalización utilizando una serie de diluciones del polipéptido que será determinado y APF de Tipo I y/o HPLC-12 nativo según obtenido de la sangre de Gada Oceánica en las mismas diluciones como el polipéptido que será probado, es decir, la comparación del mismo w/v de polipéptido o proteína. La forma en la cual el ensayo de recristalización se realiza y se evalúa se ilustra en los Ejemplos. Un polipéptido que exhibe cualquiera o un número de características antes mencionadas puede ser considerado que corresponde sustancialmente a HPLC-12. En una modalidad preferida de la invención, la construcción de ADN y las condiciones de cultivación del organismo huésped son tales que éste secreta un polipéptido monomérico con una secuencia de aminoácido secuencialmente que corresponde a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo l l l . La construcción de ADN de esta manera, de preferencia, no expresará un dímero o multímero de una secuencia de aminoácido secuencialmente que corresponde a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo lll. La producción de dímeros o multímeros requerirá los pasos de procesamiento corriente abajo adicionales o puede prohibir la secreción de un polipéptido activo. De preferencia, la construcción de ADN, por lo tanto, comprenderá una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido sustancialmente que corresponde a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo lll en la forma monomérica. Naturalmente, la construcción de ADN puede comprender copias múltiples de la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido sustancialmente que corresponde a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo lll en la forma monomérica en grupo. Una modalidad adicional preferida de la invención implica una construcción de ADN en la cual la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácido sustancialmente que corresponde a HPLC-12 de AFP de Tipo l ll comprende los codones preferidos del organismo huésped del procedimiento. Esto se prefiere en vista del hecho de que la eficiencia de traslación se incrementa evitando ciertos codones, en particular, organismos huésped. Los usos de codón preferidos difieren en procariotes, en levadura y plantas del uso de codón encontrado en Winter Flounder. Por ejemplo, los codones GCA, GCG y GCT conjuntamente representan más del 65% de los codones de alanina de genes conocidos de E. coli, S. Cerevisiae y Z. mays, mientras que representan menos del 25% de los codones de alanina de un pez tal como el Winter Flounder. Similarmente, éste es el caso para codones de treonina ACA, ACG y ACT (PCT/US90/02626). El uso del codón, según preferido por bacterias de ácido láctico y levadura puede ser derivado de la literatura específica para estos grupos de microorganismos. Un experto en la técnica de tecnología de ADN recombinante con estos organismos de expresión particulares conocerá qué codones son preferidos. Cuando el organismo huésped es una levadura, una modalidad preferida de la construcción de ADN comprenderá la presecuencia de ADN del factor a-coincidente de S. cerevisiae como secuencia de señal. También puede comprenden en una modalidad adicional la prosecuencia del factor a-coincidente de S. cerevisiae entre la presecuencia y la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP, por lo que la presecuencia, la prosecuencia y la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP están en el mismo marco de lectura. Alternativamente, cuando el organismo huésped es una levadura, una modalidad preferida de la construcción de ADN comprender á la secuencia de señal invertasa de S. cerevisiae que precede a la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP. Cuando el organismo huésped es una levadura, una modalidad preferida de la construcción de ADN comprenderá el promotor GAL 7 inducible o un promotor GAPDH constitutivo de Saccharomyces cerevisiae. Para otros organismos huésped, son bien conocidos promotores adecuados para la inclusión en la construcción de ADN . Las siguientes referencias son citadas para proporcionar ejemplos de posibles sistemas de transformación o elementos del mismo: para levadura Campbell and Duffus, para plantas PCT/US90/0626 y van den Elzen et al (1985) y para animales Hanahan, (1988). Anterior al objeto de la presente invención, no se aisló ni se purificó sustancialmente ningún polipéptido o proteína recombinante de grado alimenticio sustancialmente equivalente a H PLC- 2 de AFP de Tipo l l l exhibiendo tal alta actividad de AFP. Por primera vez, se produjo un polipéptido o proteína recombi nante de grado alimenticio sustancialmente aislado, sustancialmente equivalente a HPLC-12 de AFP de Tipo l ll exhibiendo actividad de AFP mayor que aquella de Winter Flounder. La invención cubre un polipéptido o proteína recombinante de grado alimenticio sustancialmente puro y aislado exhibiendo propiedades mejoradas de modificación de procesos de crecimiento de cristal de hielo que tienen influencia en las características de tamaño y forma del hielo, en particular en recrecimiento, reduciendo así al mínimo, por ejemplo, el daño de congelación potencial, por ejemplo, evitando o inhibiendo la recristalización de hielo después de la congelación, los así llamados péptidos anticongelantes recombinantes (AFP) exhibiendo una actividad AFP mayor que aquella de una cantidad igual de AFP de Tipo I de Winter Flounder, el polipéptido o proteína teniendo una secuencia de aminoácido sustancialmente que corresponde a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de Tipo lll. Tales polipéptidos recombinantes y en particular, los polipéptidos o proteínas recombinantes que exhiben la actividad modificada anterior tal como actividad inhibidora de crecimiento de cristal de hielo, los así llamados péptidos anticongelantes recombinantes (AFP) exhibiendo una actividad anticongelante específica mayor que aquella de AFP de Winter Flounder, preparados a través de un proceso de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes de la invención, también caen dentro del alcance de la invención.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 CEPAS Y CONDICIONES DE CRECIM I ENTO
La cepa E. coli JM109 (endAl, recAl, syrA96, thi, hsdR17, rk, mk* relAI supE44, Yanisch-Perron, et al, 1985) se utilizó para la amplificación de plásmidos. Se utilizó la cepa S. cerevisiae SU50 (MA Ta, cir°, Ieu2, his4, canl; Verbakel, 1991 ) para la transformación de los plásmidos de integración de copias múltiples. Se seleccionaron los transformantes de E. coli en placas de agar Luria conteniendo 100 µg de ampicilina mi-1 Sambrook et al (1989). Las cepas de levadura se mantuvieron en placas de YNB selectivas (0.67% de Base de Nitrógeno de Levadura Difco si n aminoácidos, 2% de glucosa, 2% de agar) suplementado con los aminoácidos esenciales (histidina 20 µg/ml , uracilo 20µg/ml). El mismo medio líquido se utilizó para los precultivos, los cuales se desarrollaron durante 48 horas a 30°C y se diluyeron en 1 : 10 en un medio YP (1 % de extracto de levadura Difco, 2% de peptona difco) conteniendo 5% de galactosa para la inducción del promotor GA L F.
PLASMI DOS
Los detalles relevantes de los plásmidos que contienen AFP-l l l se dan en la tabla 1 .
TRANSFORMACIÓN
La transformación de JM109 fue de acuerdo con Chung et al. , (1989). La transformación de las cepas de levadura se realizó mediante electroforación, principalmente como se describió por Becker et al (1991 ). Los transformantes fueron recuperados en placas de YN B selectivas. Un experto en la técnica se dará cuenta de que son posibles varios métodos de transformación. Las alternativas dependen de los organismos que serán transformados y están bien documentadas en los varios libros tales como Sambrook et al (1989) y Campbell and Duffus (1988).
PROCEDIMIENTOS BIOLOGIC O S MOLE CU L ARES
Se aplicaron, según recomendado por el proveedor, enzimas de restricción y enzimas de modificación de ADN. Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de Applied Biosystems 380A ADN y se purificaron a través de procedimientos normales.
PURI FICACIÓN DE AFP-l ll
El AFP-l ll de Gada Oceánica, Macrozoarces americanus, se purificó de la sangre del pez capturado en las aguas de la costa de Newfoundland. Se preparó la muestra de AFP-lll mediante centrifugación y el suero del pez coagulado como se describe por Hew et al, (1984).
CROMATOGRAFÍA DE I NTERCAMBIO CATIONICO
Se realizó la cromatografía de intercambio catiónico en una columna Mono S (HR5/, Pharmacia Biotech) en el sistema SMART (Pharmacia Biotech). El regulador de pH de la muestra fue 10 mM Na2H P?4/NaH2P?4, (Merc k) pH 6.0 y la elución se realizó con un gradiente lineal de NaCI de 0-0.5 M (Merck), con un flujo de 100µl/min . Los péptidos se detectaron utilizando el Monitor de Pico µ (Pharmacia 5 Biotech) a 214 y 280 nm . Las fracciones fueron recogidas verificando la señal de 214 nm utilizando el recolector de fracción de sistema SMART integrado, la temperatur a del sistemas se fijó a 1 5°C.
i o CROMATOGRAFÍA EN LIQUI DO DE ALTO RENDIM IEN TO DE FASE I NVERSA
Se realizó la cromatografía en líquido de alto rendi miento de fase inversa (RP-H PLC) uti l izando una
columna de µ RPC C4/C18 SC2.1 /10 (Pharmacia Biotech) en el sistema SMART (Pharmacia Biotech). La muestra se aplicó a la columna en 0.06% de ácido Trifluoroacético (TFA, Merck) en agua Milli Q (Solvente A) y se eluyó utilizando 80% de Acetonitrilo (Merck), 0.054% de TFA en
agua Milli Q (Solvente B). El gradiente normal utilizado se programó como sigue: 0 minutos 100% de solvente A, 5 minutos 100% de solvente A, 10 minutos 65% de solvente A, 50 minutos 40% de solvente A, 55 minutos 0% de solvente A, 57.5 minutos 0% de solvente A y a 58 minutos 100% de
solvente a en un flujo de 100µl/min. Los péptidos se detectaron con el Monitor de Pico µ (Pharmaci a Biotech) a tres longitudes de onda 214, 256 y 280 nm . Los picos se recogieron verificando la señal de 214 mm uti lizando el colector de fracción de sistema SMART integrado, la temperatura del sistema se fijó a 20°C. Se separaron las isoformas de AFP-l l l 1 , 2 y 2 a través de un gradiente modificado: 0 mi nutos 100% de solvente A, 10 minutos 60% de solvente A, 35 minutos 55% de solvente A, 36 minutos 45% de solvente A, 45 minutos 45% de solvente A, 46 minutos 0% de solvente A, 50 mi nutos 0% de solvente A, 50.1 minutos 100% de solvente A y 60 minutos 100% de solvente A. Los reguladores de pH y los detalles del sistema SMART son iguales a aquellos utilizados en el gradiente normal .
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRI LAM I DA DE SULFATO DE DODECI L-SU LFATO DE SODIO
Se realizaron geles de 16% de pol iacrilamida (Novex) en una celda de electroforesis Xcell (Novex) de acuerdo con el protocolo del proveedor. El regulador de pH de la muestra fue de Novex y consistió de 3.0 mi de TRIS-HCI 3.0 M, 2.4 mi de Glicerol , 0.8 g de SDS, 1 .5 mi de 0.1 % de Azul de Coomassie G, 0.5 mi de 0.1 % de Rojo Fenol y 5% de ß-mercaptoetanol, el volumen final se ajustó a 10 mi con agua destilada, pH = 8.45). También se operó el regulador de pH de Novex y contuvo 12.1 gramos de TRIS, 1 7.9 gramos de Tricina y 1 gramo de SDS en un volumen total de 1 litro de agua destilada, el valor de pH fue de aproximadamente 8.3. El gel se coloreó utilizando 10% de Azul Brillante de Coomosassie R250 (Bio-Rad) disuelto en una solución de 40% de Etanol (Merck), 10% de Acido Acético (Merck) y 50% de agua destilada, esta solución se calentó en un horno de microondas durante 45 minutos, después los geles se tiñeron durante 1 5 minutos en un agitador giratorio. Los geles fueron desteñidos con una solución de 1 0% de Etanol (Merck), 7.5% de Acido Acético (Merck) y 82.5% de agua destilada. En el caso de determinación de peso molecular, se utilizaron marcadores preteñidos MARK 12 (Novex).
TI NCIÓN WESTERN
Se tiñeron los geles de Tricina Novex utilizando un medio de transferencia de trans-tinción (Bio-Rad) en el módulo de tinción de transferencia western (Novex) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Después de la tinción, la membrana se bloqueó con 5% de leche descremada en 150 mM de NaCI, 50 mM de Tris/HCI pH 7.4 y después se incubó en 1 % de leche descremada en 1 50 mM de NaCI, 50 mM de Tris/HCI, 0.1 % de Tween 20, pH 7.4 y un antisuero monoclonal contra péptidos anticongelantes de Gada Oceánica. Se obtuvieron dos anticuerpos diferentes (donaciones de M. M Gani, Unilever Research, Colworth House Laboratory), uno para la determinación de los grupos S y el otro para la determinación del grupo Q. La incubación se realizó durante la noche a temperatura ambiente bajo agitación moderada. Se removieron los anticuerpos no absorbidos a través de lavado con el regulador de pH de incubación (3 x 5 minutos). La membrana se incubó con el segundo anticuerpo (IgG anti-ratón de cabra (H + L), Conjugado de Fosfatasa Alcalina; BioRad, Richmond) durante 2 horas a temperatura ambiente. La enzima se desarrolló utilizando BCIP/NBT (Biorad).
DIGESTIÓN TRI PTICA
Para la digestión tríptica, la muestra disuelta en 0.1 M de NH4HCO3, regulador de pH 8.3. Tripsina (TPCK tratada, Worthington, Millipore Corporation) se agregó en una relación de enzima:sustrato de 1 :100. Después de 30 minutos, el pH se verificó y se agregó una vez más la misma cantidad de tripsina. La incubación se realizó durante la noche a 37°C. La digestión se detuvo a través de la adición de TFA para producir un valor de pH de 2. Los péptidos se separaron por medio de RP-HPLC en el sistema SMART (Pharmacia).
ANALISI S P E LA SECUENCIA D E AM_I N OAC J P O N -T E RM I NAL
Se realizó el análisis de la secuencia de aminoácido n-terminal en un Secuenciador de Proteína LF 3000 (Beckman) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Los derivados de PTH de los aminoácidos fueron analizados en un sistema automático de RP-HPLC, sistema Gold (Beckman).
DETERMINACIÓN DE PROTEINA A TRAVÉS DE ANÁLISIS DE
AMINOÁCIDO
Las muestras de AFP-lll fueron hidrolizadas en 6 M de HCl conteniendo 1% de Fenol bajo vacío a 100°C durante
24 horas y después se secó. Los análisis se realizaron en un analizador de aminoácido Alfa plus serie 2 (Pharmacia Biotech) utilizando el protocolo del proveedor.
ENSAYO DE RECRISTALIZACION
Las muestras que serán probadas para la actividad de AFP-lll se mezclaron con polvo de sacarosa para dar un 30% en volumen de solución de sacarosa. Una proporción de esta solución se colocó en un portaobjetos de microscopio, se cubrió con un cubreobjetos para evitar la evaporación y se fijó en una etapa fría de Linkam THMS, se conectó con un sistema de enfriamiento Linkam CS 196 y se controló a través de un controlador de Linkam TMS 91 . Esta solución se enfrió triturada a -40°C (Ü 99°C/ min.) y subsecuentemente se calentó a -6°C. El crecimiento de los cristales de hielo se examinó microscópicamente durante el curso de 30 minutos de incubación a -6°C. Para el ensayo de péptidos purificados mediante HPLC, las muestras de la columna HPLC conteniendo las isoformas de AFP-l ll purificadas se secaron en un Concentrador Speed Vac (Savant) dos veces, después de un paso de rehidratación en agua Milli Q. Después del segundo paso de secado, las muestras fueron solubilizadas en 100 µl de agua Milli Q y el pH se verificó para asegurarse que en todo el TFA del sistema regulador de RP-HPLC se removió. Las muestras fueron diluidas a un valor de absorbancia de 0.700 a ?=214 nm, esto es equivalente a una solución de AFP-lll de pez aproximadamente de 0.1 µg/ml . Para estar seguro de que las muestras contuvieron una cantidad igual de AFP-lll, estas últimas fueron verificadas a través de análisis de aminoácido. Cuando se utilizaron muestras purificadas, isoformas AFP-l l l , se verificó su pureza a través de análisis de secuencia de aminoácido terminal .
F E RM E N T A C I ON DE I NTERM ITE NT E DE ALI MEN TAC ION.
Procedimiento de inoculación: un cultivo del transformante apropiado se desarrolló en 25 mi de medio míni mo y se cultivó durante la noche a 30°C y 300 rpm. El cultivo se transfirió subsecuentemente a un matraz de agitación de 1000 mi conteniendo 500 mi de YP conteniendo 2% de glucosa y se cultivó durante la noche a 30°C y 300 rpm. Este cultivo se utilizó como inoculo para el experimento intermitente de alimentación. Se utilizó el siguiente medio intermitente: 1 10 g de glucosa.1 H2O desarrollada hasta 500 g con agua desmineralizada. 25 g de Truxoy, 50 g de extracto de levadura (Ohly), 10.5 g de K2H PO4, 5 mi de 1 000 X una solución de vitamina Egli , 50 mi de metales huella 100 X Egli (Egli, 1980), 0.25 g de L-Histidina. HCI (Sigma), 3 g de MgS?4- , 2 g de antiespumante a 4500 g con agua desmineralizada. La solución de glucosa se esterilizó con calor y la solución de vitamina se esterilizó mediante un filtro, en forma separada. Todos los otros componentes fueron calentados en forma esterilizada en el fermentador. La temperatura se reguló a 30°C y el pH a un valor de 5.0. El termentador se inoculó y las células fueron cultivadas a un flujo de aire de 2 l/min y a una velocidad de agitador de 600 rpm. Después de 18 horas, se inició la fase de alimentación. El siguiente medio de alimentación fue utilizado: 1100 g de glucosa.1 H2O hecho a 1750 g con agua desmineralizada. 62.5 de extracto de levadura (Ohly), 30 g de K2HPO4, 5 mi de una solución de vitamina 1000 X Egli, 50 mi de metales huella de 100 X Egli (Egli, 1980), 6.25 g de L-Histidina.HCI (Sigma), 6.25 g de MgS?4.7H2O, 2 g de antiespumante para 850 g con agua desmineralizada. La bomba de alimentación se reguló a un valor RQ constante (relación de moles de CO2 producidos y moles de O2 consumidos) de 1.05, basado en herramientas de software como se describe por Keulers (1993). El cultivo se cultivo después de 37 horas.
Ejemplo 1 Construcción de un gen sintético que codifica un AFP de tipo lll
Una secuencia de nucleótido que codifica el péptido anticongelante de HPLC I, optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae se construyó como sigue: un juego de 12 oligonucleótidos fue sintetizado (invafpl, invafp2, invafp3, invafp4, invafpd, invafpß, invafp7, invafpß, invafp?, invafplO, invafpl 1 y invafp12) comprendiendo principalmente la secuencia de ADN de AFP maduro expresado preferencialmente utilizando codones de S. cerevisiae. El gen sintético se diseñó para contener regiones de estructura de cadena individual de 5' compatibles con Pstl y Hind 111 generaron extremos pegajosos (Figura. 2). Para el ensamble del gen de AFP sintético, se disolvieron 50 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos en 12µl de agua, se incubaron durante 2 minutos a 95°C, y se colocaron directamente sobre hielo. Después de este paso de desnaturización, los ologinucleótidos fueron fosforilados en un volumen final de 20µl , conteniendo 2.5mM de ATP, 5 mM de DTT y aproximadamente 10 U de cinasa de polinucleótido, durante 40 minutos a 37°C, seguido por una desnaturalización de 2 minutos a 95°C y la colocación sobre hielo. Se mezclaron 10 µl de cada oligonucleótido fosforilado con su oligonucleótido de ADN más complementario para obtener una formación doble. Después de dos minutos de incubación a 95°C para la desnaturalización, cada dúplex se enfrío lentamente a 30°C. Otra vez se vaciaron 10µl de 6 mezclas dúplex y encubaron en un volumen final de 100µl, conteniendo 50mM Tris/HCI, pH 7.5, 8 mM MgCI2, 8mM DTT, y 40µg/ml de gelatina de 10U de ligasa de ADN, durante 2 horas a 20°C. La mezcla de ligación se precipitó después, se volvió a disolver en 30µl de regulador de TE. Se colocaron 15 µl de la mezcla en un gel de agarosa al 2%, y la banda de ADN del tamaño esperado (aproximadamente 224 pares de base) de cortó del gel y finalmente se purificó a través de un procedimiento de Limpieza de Gen I I , como es recomendado por el proveedor. El fragmento de ADN obtenido después se ligó a un vector linearizado Pstl/Hindlll pTZ19R (Pharmacia) y se transformó a E. coli JM 109 a través de procedimientos normales. El ADN de plásmido de los diversos transformantes se aisló a través del método de minipreparación de lisis alcalina ligeramente modificado y se analizó a través de análisis de restricción con varias enzimas. La secuencia del inserto contenido en un plásmido, se confirmó a través de secuenciación de didesoxi Sanger del doble plásmido de estructura de cadena (Sanger et al, 1977). Esta construcción de intermediario, conteniendo la región de codificación del cásete de AFP-lll sintético se denominó pUR7700 (Fig. 3)
Ejemplo 2 Construcción de vectores de expresión de levadura conteniendo un gen sintético que codifica HPLC-1 de AFP-lll
El gen sintético de AFP-lll sintético llevado por pUR7700 no contiene ninguna de la información requerida para la expresión de este péptido en levadura. Para obtener la expresión y la secreción de este gen, se deben hacer construcciones conteniendo funciones translacionales del gen AFP-lll con una secuencia de señal de secreción adecuada, y esta secuencias de fusión se llevan bajo el control de un promotor de gen de levadura. Las secuencias de señal de secreción adecuadas pueden ser seleccionadas a partir de una variedad de genes que codifican proteínas eficientemente secretadas por levadura, por ejemplo, invertasa codificada por SUC2 o un factor a-coincidente, codificado por MFa1 y MFa2. Para obtener una fusión adecuada con la secuencia de señal de invertasa, se generó un fragmento de PCR conteniendo la secuencia de señal de invertasa, parte del promotor GAL7 y un sitio de enzima de restricción adecuado para asegurar una fusión de marco de la secuencia de señal de invertasa con el gen AFP-ll l sintético. Para obtener este fragmento, se diseñó un iniciador de PCR, invafp14, con la siguiente secuencia:
Nhel Bapúil 3 ' CCA AAA CGT CGG TTT TAT AGA CGATCG CCTAGGGC 5 ' invafpl4 K Este iniciador se utilizó como el iniciador 3' en la reacción de PCR en combinación con el iniciador 5' PG7 05 AF (Verbakel, 1991 ) el cual se hibridiza con la secuencia encontrada en el promotor GAL7. Utilizando el ADN de plásmido de pUR2778 como plantilla (Figura 4, van Gorcom et al, 1991 ), la reacción generó un fragmento de aproximadamente 243 bp. Este fragmento se eluyó a partir de gel de agarosa y se purificó a través del procedimiento de limpieza de gel de acuerdo con las extrusiones de los fabricantes. El fragmento purificado se digirió secuencialmente con Sacl y BamHl y el fragmento resultante de aproximadamente 88 bp se ligó a los sitios apropiados en el plásmido pTZ19R. La mezcla de ligación se introdujo a E. coli JM109 a través de la transformación y el ADN de plásmido se aisló de un transformante y se secuenció para confirmar la identidad del inserto clonado. Este plásmido fue designado como pUR7701 (Fig. 5). Para obtener una fusión de marco de la secuencia de señal de invertasa con el gen de AFP-l l l sintético pUR7700 se digirió con Nhei y Hindl ll y el fragmento de aproximadamente 196 bp se aisló y se ligó con el fragmento de aproximadamente 2911 bp formado por la digestión de pUR7701 con Nhei y Hindll. El plásmido resultante se denominó pUR7702 (Figura 6).
En una forma similar, se generó un fragmento de PCR conteniendo la secuencia de señal pre-pro de factor a coincidente utilizando el iniciador MFaAFPIII como el iniciador 3':
Nhel
3' CTA TTT TCT CTC CGA CTT CGATCGCC 5' MFaAFPIII
D K R E A E A
Un fragmento de PCR conteniendo una parte del promotor de GAL7, y todas las secuencias de codificación de factor a-coincidente pre-pro se generó a partir de PUR2660 (WO 94/03617) de la plantilla de AD? utilizando MFaAFPHI y PG705 AF como iniciadores. pUR2660 contiene la secuencia de factor a.conincidente pre-pro bajo el control del promotor GAL7. El fragmento de aproximadamente 462 bp resultante se purificó como se describió anteriormente y fue digerido con Sacl y ?hel. El fragmento de aproximadamente 292 bp así obtenido se ligó al fragmento de aproximadamente 3025 bp obtenido a través de la digestión pUR7702 con Sacl y ?hel. El AD? de plásmido de varios transformantes de E. coli JM109 obtenido a partir de esta ligación se secuenció para confirmar que el fragmento correcto fue clonado. Uno de estos plásmidos se designó como pUR7703 (Fig.7).
Para construir plásmidos capaces de expresar el cásete de AFP-lll en levadura, se introdujeron fusiones de secuencia de señal-gen sintéticas a una variedad de vectores de expresión de levadura, como sigue: El fragmento de Sacl/Hindll l de aproximadamente
278 bp de pUR7702 y del fragmento pU R7703, de aproximadamente 448 bp Sacl/Hindl l l pUR7703, el cual lleva la invertasa y las fusiones de a-coincidente a AFP-lll respectivamente, fueron clonados independientemente utilizando técnicas normales a vectores de expresión de levadura también digeridos con Sacl y Hindl ll . Estos vectores de expresión llevan tanto el promotor GAL7 de GAL7 de manera que la inserción de los genes en el sitio Sacl permite la transcripción directa de GAL7 de los genes insertados. Se hizo pUR7704 (Fig. 8) a través de la inserción del cásete de AFP-l ll de secuencia de señal de invertasa a partir de pUR7702 a un vector de integración de ADN ribosomal de copias múltiples, pUR2778 y pUR7706 (Figura 9), es pUR2778 conteniendo el cásete de AFP-l ll del factor a-coincidente, derivado de pUR7703, insertado entre los sitios Sacl y Hindlll.
Ejemplo 3 Expresión de AFP-lll en S. cerevisiae
Se linearizaron los plásmidos pUR7704 y pUR7706 a través de la digestión de Hpal, la cual activó la integración de los plásmidos a la región de ADNr de levadura, después subsecuente e independientemente introducidos a la cepa de S. cerevisiae SU50 a través de electroporación. Los transformantes fueron seleccionados a través de su capacidad para desarrollarse en ausencia de leucina. Para lograr la expresión de los genes AFP-lll clonados, los transformantes llevando pUR7704 o pUR7706, fueron primero desarrollados durante 40 horas en un medio mínimo líquido a 30°C, después subsecuentemente se diluyeron 1:10 en el medio de inducción recientemente preparado (Extracto de levadura 1%, peptona Difco 2%, galactosa 5%) y se incubaron a 30°C durante 48 horas más. Al término de este período, se probaron las muestras del sobrenadante del cultivo para su capacidad para inhibir el crecimiento de cristales de hielo. El crecimiento de los cristales de hielo fue examinado microscópicamente durante el curso de una incubación de 30 minutos a -6°C. Esto fue claramente demostrable de que las muestras del sobrenadante derivadas de levaduras llevando el gen AFP-lll sintético tuvieron un efecto inhibidor en el crecimiento de cristal de hielo cuando se comparó con muestras similares de control, preparadas a partir de los sobrenadantes de levaduras no transformadas o de levaduras llevando el vector de expresión pero careciendo del gen de AFP-l ll sintético. Sin embargo, la actividad de inhibición de recristalización del material producido de levadura fue significativamente menor que aquél de una cantidad equivalente de la preparación de AFP de pez. Para un análisis adicional del péptido anticongelante producido, se centrifugaron muestras de 10 mi del cultivo inducido de los transformantes pUR7704 y pUR7706 durante 5 minutos a 4000 rpm y las células y los sobrenadantes se cogieron y se almacenaron a -20°C. Se utilizó electrofóresis en gel de poliacrilamida de SDS de desnaturalización para separar las proteínas, y se detectó el AFP a través de tinción western utilizando un anticuerpo monoclonal específico anti-AFP. La presencia de una banda con un peso molecular aparente de 6.5 kD en las muestras del sobrenadante del transformante de levadura llevando pUR7704 y pUR7706 claramente mostró que estos transformantes son capaces de la producción de AFP-l ll. El péptido se purificó a través de HPLC de fase inversa y se determinó la secuencia N-terminal. Esta secuencia demostró que el péptido HPLC-1 fue correctamente procesado y secretado por la levadura.
Ejemplo 4 Identificación del subtipo de péptido
Anticongelante de Gada Oceánica más activa
Se purificaron isoformas AFP-ll l utilizando un procedimiento de dos pasos. Primero se cargó la muestra sobre una columna mono S de intercambio catiónico y se eluyó utilizando el gradiente descrito. El patrón de elución se muestra en la Figura 10. Un pico no retrasado (pico Q) y cuatro picos eluídos (S1 a S4) fueron aislados de la columna. S1 representa la proteína con la capacidad de unión más baja a la columna de intercambio de cationes mono S bajo estas condiciones, y S4 contiene la proteína con la capacidad de unión más alta a la columna. Los picos fueron recogidos y cargados sobre una columna de RP-HPLC utilizando el gradiente descrito. El cromatograma del material total se muestra en la Figura 1 1 . Los picos son las isoformas de AFP-lll y se numeran de 1 a 12 de acuerdo con su comportamiento sobre esta columna utilizando las condiciones especificadas. Las isoformas AFP-lll se eluyeron entre 25 y 45 minutos. Los cromatogramas RP-HPLC de las fracciones de Q y S1 a S4 se muestran en las Figuras 12 a 16. Las fracciones cada una produce diferentes isoformas AFP-lll y la isoforma AFP se contuvo en cada pico, se resume en la Tabla 2. Las fracciones recogidas de las columnas Mono S y RP-HPLC fueron probadas con antisuero con anti-AFP-l ll de ratón y todas las isoformas de S1 a S4 dieron una reacción positiva al antisuero de tipo S, la isoforma 12 del grupo Q reaccionó positivamente al antisuero tipo Q. La secuencia de aminoácido N-terminal se determinó de cinco de las isoformas (Tabla 3). El pico HPLC 7 de AFP-lll se contaminó con lisozima de pez, pero las otras secuencias de aminoácido identificadas pudieron ser relacionadas con las secuencias conocidas de las isoformas AFP-ll l . Las cantidades iguales de las proteínas purificas fueron probadas para actividad anticongelante. Como se ve a partir del ensayo de inhibición de recristalización, solamente la isoforma HPLC-12 de AFP-ll l mostró una actividad significativa anticongelante. Para confirmar este hallazgo, se reconstituyeron isoformas de AFP-ll l de gada oceánica en presencia y ausencia de la isoforma de H PLC-12. La preparación de péptido completamente reconstruido mantuvo la actividad de la preparación de pez crudo, mientras que la preparación carente de la isoforma de HPLC-12 mostró una actividad anticongelante enormemente reducida según evidenciado por el análisis de recristalización. Utilizando una digestión tríptica de la isoforma 12, la secuencia de aminoácido total de esta isoforma fue determinada. La secuencia se encontró que fue idéntica a aquella descrita en la literatura (Davies y Chow, 1990).
Ejemplo 5 Construcción de un gen sintético que codifica la variante HPLC-12 de AFP de tipo ll l
Una secuencia de nucleótido que codifica el péptido anticongelante HPLC-12, unida a la secuencia de señal de invertasa y con un uso de codón optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, se construyó como sigue: se sintetizó un juego de 15 oligonucleótidos (H PLC12.1 , HPLC12.2, HPLC12.3, HPLC12.4, HPLC12.5, HPLC12.6, HPLC12.7, HPLC12.7, HPLC12.8, HPLC12.9, HPLC12.10, HPLC12.11 , HPLC12.12, HPLC12.13, HPLC12.14 y HPLC12.15), comprendiendo principalmente la secuencia de ADN de AFP maduro expresada preferencialmente codones de S. cerevisiae. El gen sintético se diseñó para contener regiones de estructura de cadena individual compatibles con extremos pegajosos que generaron H indl ll (Figura 1 7). Para el ensamble de gen de HPLC-12 sintético, se disolvieron 50 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos en 12 µl de agua, se incubaron durante 2 minutos a 95°C, y se colocaron directamente sobre hielo. Después de este paso de desnaturalización, los oligonucleótidos fueron fosforilados en un volumen final de 20µl, conteniendo 2.5 mM de ATP, 5 mM de DTT y aproximadamente 10 U de cinasa de polinucleótido durante 40 minutos, 37°C, seguido por una desnaturalización de 2 minutos a 95°C y colocación sobre hielos. Se mezclaron 10µl de cada oligonucleótido fosforilado con su oligonucleótido de ADN más complementario para obtener la formación dúplex. Después de dos minutos de incubación a 95°C para desnaturalización, cada dúplex se enfrío lentamente a 30°C. Otra vez, se vaciaron y se incubaron 10 mi de todas las mezclas dúplex en un volumen final de 100µl , conteniendo 50 mM Tris/HCI, pH 7.5, 8 mM MgCI2, 8 mM DTT, y 40µg/ml gelatina y 10U de ADN de ligasa durante dos horas a 20°C. La mezcla de ligación después se precipitó, se volvió a disolver en 30µl de regulador de TE. Se colocaron 15 µl de la mezcla sobre un gel de agarosa al 2%, y la banda de ADN del tamaño esperado (aproximadamente 291 pares de bases) se cortó del gel y finalmente se purificó a través del procedimiento de Limpieza de Gen I I , como fue recomendado por el proveedor. Este fragmento se ligó con un fragmento de vector derivado de un vector de integración de copias múltiples pUR2778 a través de la digestión de Sacl y Hindlll. La secuencia del inserto se confirmó y el plásmido resultante se denominó pUR7718 (Figura 18). El plásmido pUR7718 se linearizó a través de la digestión con Hpal la cual activó la integración del plásmido a la región de ADNr de levadura y después se introdujo subsecuentemente a la cepa S. cerevisiae a través de electroporación. Los transformantes resultantes fueron seleccionados a través de su capacidad para desarrollarse en ausencia de leucina. Para obtener la expresión del gen HPLC-12 clonado, se desarrollaron primero transformantes llevando pUR7718 durante 40 horas en un medio mínimo líquido a 30°C, después subsecuentemente diluido 1:10 en el medio de incubación recientemente preparado (Extracto de levadura 1%, peptona Difco 2%, galactosa 5%) y se incubó a 30°C durante 48 horas más. Al término de este periodo, las muestras del sobrenadante del cultivo fueron probadas para su capacidad para inhibir el crecimiento de cristales de hielo. Los resultados (ensayo de recristalización) claramente muestran que los sobrenadantes de cultivo tuvieron altos niveles de actividad anticongelante. La comparación de estos resultados con aquellos obtenidos para la expresión de levadura de la variante HPLC-1 mostraron que el sobrenadante del transformante, el cual produjo el nivel más bajo de actividad anticongelante de H PLC-12 excedió aquella del transformante del mejor transformante de HPLC-1 . Se llevó a cabo una fermentación de i ntermitente de alimentación con un transformante SU50 llevando pUR7718. Al término de la fase de alimentación, las células fueron cosechadas a través de la centrifugación en una centrifugación en una centrífuga de Jouan LR 5.22 utilizando depósitos de 11, durante 30 minutos a 4650 rpm (7200 g). El sobrenadante se probó para la actividad anticongelante a través de la prueba de inhibición de recristalización en hielo. El sobrenadante no di luido claramente evita el desarrollo de cristales, lo cual demuestra que la presencia de altos niveles de péptido anticongelante activo en el sobrenadante de cultivo. Una tinción western del sobrenadante de esta fermentación mostró que el material AFPII I-H PLC1 2 fue secretado. El peso molecular aparente del H PLC-12 producido de levadura fue equivalente a aquél del H PLC-1 2 producido de pez. La purificación y secuenciación del aminoácido del péptido producido de levadura confirmaron que este material fue indistinguible del péptido H P LC-1 2 producido por Gada oceánica.
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Descripción de la Figuras
La Figura 1. Isoformas de AFP de tipo lll. Las regiones en cajas representan regiones de identidad y los aminoácidos sobreados son aquellos identificados como importantes para las propiedades anticongelantes de los péptidos.
Figura 2. Gen sintético que codifica HPLC-I de AFP de tipo lll. Figura 3. Representación esquemática de la construcción de pUR7700, un plásmido que lleva el gen a FPA-l ll sintético. Figura 4. Mapa de restricción del vector de expresión de levadura pUR2778. Figura 5. Representación esquemática de la construcción de pUR7701 , un plásmido que lleva la secuencia de señal de invertasa. Figura 6. Representación esquemática de la construcción de pUR7702, un plásmido que lleva el gen a AFP-lll sintético ligado en marco a la secuencia de señal de invertasa. Figura 7. Representación esquemática de la construcción de pUR7703, un plásmido que lleva el gen AFP-l ll sintético fusionado en el marco con la secuencia de señal de secreción pre-pro de factor coincidente. Figura 8. Representación esquemática de la construcción del plásmido pUR7704, un vector de integración de ADNr de copias múltiples llevando el gen
AFP-lll sintético ligado en marco a la secuencia de señal de invertasa. Figura 9. Representación esquemática de la construcción del plásmido pUR7706, un vector de integración de ADNr de copias múltiples que lleva el gen AFP-lll sintético ligado en marco a la secuencia de señal de factor coincidente pre-pro. Figura 10. Patrón de elución de péptidos anticongelantes de Gada Oceánica a partir de una columna Mono S. Figura 11. Cromatograma de péptidos anticongelantes separados a través de HPLC de fase inversa. Figura 12. Cromatograma de péptidos anticongelantes de Mono S S1 separados a través de HPLC. Figura 13. Cromatograma de péptidos anticongelantes S de mono S2 separados a través de HPLC de fase inversa. Figura 14. Cromatograma de péptidos anticongelantes S de mono S3 separados a través de HPLC de fase inversa. Figura 15. Cromatograma de péptidos anticongelantes S de mono S4 separados a través de HPLC de fase inversa. Figura 16. Cromatograma de péptidos anticongelantes S de mono S1 separados a través de HPLC de fase inversa.
Figura 1 7. Gen sintético que codifica la proteína de fusión de secuencia de señal de invertasa de HPLC12 de AFP de tipo l l l . Figura 18. Representación esquemática del plásmido pU R7718.
Tabla 1 . AFP-l ll conteniendo plásmidos
Nombre del Plásmido Características relevantes. pU R7700 pTZ19 llevando el gen si ntético de HPLC-1 .
pU R7701 pTZ19 llevando la secuencia de señal de invertasa
pUR7702 pTZ19 llevando el gen de fusión de fusión de HPLC-1 de secuencia de señal de invertasa - pU R7703 pTZ19 llevando el gen de fusión de HPLC-1 la secuencia de señal a de factor coincidente
pUR7704 Vector de expresión de levadura que lleva el gen de fusión de HPLC1 de secuencia de señal de invertasa.
pUR7706 Vector de expresión de levadura que lleva el gen de fusión de HPLC-1 de secuencia de señal a-de factor coincidente.
pUR7718 Vector de expresión de levadura que lleva el gen de fusión de H PLC-12 de secuencia de señal de invertasa
Tabla 2: Fracciones Mono S conteniendo isoformas AFP-ll l
Tabla 3 : Secuencia de aminoácido N-terminal de isoformas AFP-l l l . Lisozima de Gada Oceánica, el péptido inicialmente denominado como isoforma 7 de AFP3:
20
Lys-Val-Phe-Asp-Arg-?-Glu-Trp-Ala-Arg-Val-Leu-Lys-Ala-Asn-Gly-Met-Asp-G1 y-Tyr 21 30 40 Arg-Gly-lle-Ser-Leu-Ala-Asn-Trp-Val-?-Leu-Ser-Lys-Trp-Glu-Ser-?-Tyr-?-Thr
I soformas número 9: 10 20 Ser-GIn-Ser-Val-Val-Ala-Thr-Tyr-Leu-lle-Pro-Met-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Pro-Ala-Met Isoforma número 12: 1 10 Asn-GIn-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-GIn-Leu-lle-Pro-lle-Asn-Thr-Ala-Leu
Tabla 4 : Secuencia de aminoácido de péptidos trípticos de isoforma AFPI I I número 12.
Péptido no 1 : N-términos 1 -23 1 1 O 20
Asn-GIn-Ala-Ser-Val-Val-Ala-Asn-GIn-Leu-lle-Pro-lle-Asn-Thr-Ala-Leu-Thr-Leu-Val- 23 Met-Met-Arg Péptido no 2: 24 a 39 1 10 Ser-Glu-Val-Val-Thr-Pro-Val-Gly-lle-Pro-Ala-Glu-Asp-lle-Pro-Arg Péptido no 3:40 a 47 1 Leu-Val-Ser-Met-GIn-Val-Asn-Arg Péptido no 4:48 a 61 1 10 Ala-Val-Pro-Leu-Gly-Thr-Thr-Leu-Met-Pro-Asp-Met-Val-Lys Péptido no 5: 62 a 66 1 Gly-Tyr-Pro-Pro-Ala
Claims (15)
1 . Un procedimiento para la producción de polipéptidos o proteínas recombinantes: a) cultivando un organismo huésped de grado alimenticio bajo condiciones mediante las cuales la expresión de por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica AFP ocurre o es inducida, la secuencia de ácido nucleico comprendiendo una construcción de ADN, la construcción de ADN no está presente en el organismo huésped nativo y la construcción de ADN comprende en el orden dado: (i) un promotor activo, fuerte, operacionalmente inducible en el organismo huésped, (ii) un codón de inicio de ATG, que puede estar presente en la secuencia de señal de ADN opcional capaz de secretar la proteína producida por el organismo huésped durante la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica a AFP de (iii) más adelante, la secuencia de señal puede ser homologa o heróloga a la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP y está en el marco de lectura con el codón de inicio de ATG, (iii) por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica que una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 80% de homología a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de tipo l l l , la secuencia de ácido nucleico en el marco de lectura con el codón de i nicio ATG , y opcionalmente (iv) un codón de tope unido al extre mo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP, y opcionalmente, b) recoger el producto expresado de la secuencia de ácido nucleico que codifica AFP obtenido del mismo.
2. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la construcción de ADN comprende una secuencia de señal para el organismo huésped capaz de la secreción del producto de expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 80% de homología con aquélla de HPLC-12 de proteína de AFP de tipo l l l a través del huésped durante la cultivación del huésped .
3. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el organismo huésped es un microorganismo.
4. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el organismo huésped es una levadura.
5. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia de señal de ADN es la pre-secuencia de ADN del factor a-coincidente de S. cerevisiae.
6. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el promotor es un promotor GAL 7 inducible o un promotor GAPDH constitutivo de Saccharomyces cerevisiae.
7. Un organismo huésped de recombinante de grado alimenticio que se obtiene a través del procedimiento la reivindicación 1.
8. Un polipéptido proteína de grado alimenticio recombinante sustancialmente puro y aislado que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 80% de homología a aquella de HPLC-12 de proteína de AFP de tipo lll .
9. Un producto alimenticio material biológico que comprende un polipéptido proteína con la secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 80% de homología a HPLC-12 de AFP de tipo lll y/o un organismo huésped capaz de la expresión de una proteína o polipéptido recombinante con una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos un 80% de homología con aquella de H PLC-12 de AFP de tipo l ll , el producto alimenticio o material biológico no siendo un organismo comestible natural que comprende el polipéptido o proteína en dicha forma o cantidad.
10. Un producto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el producto es un producto destinado para ser congelado.
11. Un producto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el producto es helado.
12. Un producto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el producto es un producto de masa congelada o de horneado congelada.
13. Un producto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el material biológico es un órgano o tejido animal o una planta.
14. Un producto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido o proteína es un polipéptido o proteína recombinante.
15. Un producto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido o proteína es un polipéptido o proteína de grado alimenticio.
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|---|---|---|---|
| EP95201842 | 1995-07-05 | ||
| EP95201842.2 | 1995-07-05 | ||
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Publications (2)
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