ES2349072T3 - Lactobacilus de una bacteriocina anti-listeria. - Google Patents

Abstract

Cepa Lactobacillus sakei 2512 depositada en la Colección Nacional de los Cultivos de Microorganismos (CNCM) bajo el número I-2479.

Description

La presente invención se refiere a una bacteriocina de Lactobacillus sakei y más particularmente de Lactobacillus sakei 2512, a un secuencia nucleotídica que codifica esta bacteriocina, y a la utilización industrial de esta bacteriocina como agente activo contra floras patógenas o indeseables en la preparación de productos alimentarios.

Las bacterias lácticas se utilizan intensivamente en las fermentaciones alimentarias con el fin, no solamente de mejorar el sabor y la textura de los alimentos, sino sobre todo de prolongar su duración de conservación. Numerosas bacterias lácticas tienen en efecto la facultad de inhibir el crecimiento de ciertas bacterias gram-positivas, entres ellas las cepas patógenas como Listeria monocytogenes, gracias a la secreción de moléculas antagonistas, entre las cuales se encuentran unos compuestos peptídicos. Estos compuestos peptídicos, denominados bacteriocinas, presentan por lo tanto un potencial interesante para la conservación cualitativa y sanitaria de productos alimentarios fermentados.

A título representativo de estas bacteriocinas, se pueden citar principalmente las que forman la subclase de polipéptidos denominados bacteriocinas anti-Listeria, bacteriocinas de la clase IIa (Ennahar S. et al., 2000, FEMS Microbiol. Rev., 24:85-106) y cistibióticos (Jack R. et al., 1995, Microbiol. Rev., 59(2):171-200). Recientemente, se ha hecho constancia de la utilización potencial de una de estas bacteriocinas de la clase IIa, la divercina V41, para impedir el crecimiento de Listeria monocytogenes en el salmón ahumado (Duffes F. et al., 1999, J. Food Prot., 62(12):1394-1403).

Las secuencias de estos polipéptidos presentan fuertes similitudes en sus extremos N-terminales, en particular con la presencia de un puente disulfuro. El extremo C-terminal hidrófobo es mucho más variable, sin embargo algunas de estas bacteriocinas, denominadas de tipo pediocina (pediocina PA-1, enterocina A y divercina V41), se caracterizan por un tamaño superior a 40 residuos y la presencia de un segundo puente disulfuro en el extremo C-terminal.

Los autores de la presente invención han puesto de manifiesto una nueva bacteriocina de clase IIa producida a partir de una cepa específica de Lactobacillus sakei, que se ha revelado particularmente eficaz para inhibir el crecimiento de Listeria, más particularmente de Listeria monocytogenes.

De acuerdo con Tagg J.R, et al., Bacteriol. Rev., 40; 722-756 (1976), el término “Bacteriocina” en el sentido de la invención se refiere a un polipéptido producido mediante síntesis ribosómica a partir de microorganismos capaz de inhibir específicamente el crecimiento de otras bacterias.

La presente invención tiene por lo tanto como primer objeto un polipéptido que procede de la cepa lactobacillus sakei 2512, dotado de una actividad bacteriocinas.

La cepa Lactobacillus sakei 2512 ha sido depositada el 25 de mayo de 2000 en la Colección Nacional de los Cultivos de Microorganismos en la que que fue registrada con el número de depósito I-2479.

La bacteriocina objeto de la presente invención se denominó Sakacina G. Se trata de un polipéptido que posee una masa molecular del orden de 3700 a 3900 y preferiblemente de aproximadamente 3834 Da determinada par espectrometría de masas. Posee un espectro de inhibición bacteriana muy emparentado con el de las bacteriocinas de clase IIa. Es por esto por lo que se ha revelado particularmente eficaz contra las cepas de Lactobacillus sakei distintas de Lactobacillus sakei 2512, Pediococcus cerevisiae, el conjunto de cepas Listeria y contra los Enterococcus faecalis y durans. Por el contrario, se ha revelado inactiva contra otras especies de Lactobacillus como por ejemplo Lactobacillus debrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, y una cepa de Enterococcus faecium.

Igual que las bacteriocinas anti-Listeria de tipo pediocina, la sakacina G posee en su estructura peptídica ventajosamente dos puentes disulfuros.

Un análisis de los determinantes genéticos de varias bacteriocinas de clase IIa ha mostrado que los genes implicados en su producción, transporte e inmunidad están organizados en una o más estructuras de tipo operón. Estos operones tienen una localización frecuentemente plasmídica y poseen generalmente por lo menos dos genes que codifican unas proteínas, homologas a un vehículo de ABC y una proteína accesoria, probablemente implicada la exportación de bacteriocinas.

La clonación del fragmento nucleotídico que contiene el gen de la sakacina G ha revelado la existencia de tres marcos abiertos de lectura completos skgA1 (SEC ID n° 1), skgA2 (SEC ID n°3) y skgDc (SEC ID n° 13) (que incluye el cuadro de lectura truncado skgD (SEC ID n° 7)) y un cuadro truncado skgl (SEC ID n° 5) cuya representación esquemática está recogida en la figura 1. El fragmento nucleotídico es un doble hebra cuya monocadena 5’-3’ está representada en la secuencia ID n°15.

Los productos de los genes skgA1 y skgA2, denominados pre-bacteriocinas, pueden sufrir una maduración en el curso de la cual sus péptidos líderes respectivos son escindidos entre les residuos 18 y 19, liberando así la sakacina G activa (residuos 19-55).

El fragmento nucleotídico monocatenario 5'-3' que comprende skgA1, skgA2, skgD y skgl figura en la SEC ID n°9.

La presente invención tiene por lo tanto asimismo por objeto un polipéptido aislado que corresponde a una bacteriocina, caracterizado porque comprende la secuencia ID n° 2 y/o la secuencia ID n° 4. La secuencia de la bacteriocina madura corresponde a la secuencia ID n°12 y está comprendida en las secuencias ID n°2 y ID n°4.

El marco de lectura denominado skgl codifica una proteína de 52 residuos. La comparación de esta secuencia con las de los bancos de datos muestra fuertes similitudes de Skgl con las proteínas denominada de inmunidad. Codifica aparentemente la proteína de inmunidad que protege la bacteria productora de la sakacina G.

La presente invención se extiende asimismo a un polipéptido aislado que comprende la secuencia ID n°6 que corresponde al marco de lectura skgl.

En lo que se refiere al último gen skgDc, este codifica una proteína que presenta una homología con proteínas de la familia de los vehículos de ABC, y más particularmente del vehículo de la pediocina PA-1. El gen skgDc codifica aparentemente el vehículo de ABC específico de la sakacina G.

La presente invención se extiende asimismo al polipéptido aislado que comprende la secuencia ID n° 8 que corresponde al gen denominado skgD y al polipéptido aislado que comprende la secuencia ID n°14 que corresponde al gen denominado skgDc.

Se entiende que están asimismo comprendidas las secuencias homólogas, definidas como:

i) las secuencias similares a al menos 70% de la secuencia SEC ID n°2, n°4, n°6, n°8, n°12 o n°14; o

ii) las secuencias codificadas por una secuencia de ácido nucleico homóloga, tal como se define a continuación, es decir, una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la secuencia SEC ID n° 1, n° 3, n° 5, n° 7, n° 9, n° 13 o n° 15 o su secuencia complementaria, en condiciones rigurosas de hibridación.

Más aún, el término "similares" se refiere a la perfecta semejanza o identidad entre los aminoácidos de las secuencias homólogas comparadas pero también a la semejanza no perfecta que se califica de similitud. Esta búsqueda de similitudes en una secuencia polipeptídica tiene en cuenta las sustituciones conservativas que son sustituciones de aminoácidos de la misma clase, tales como sustituciones de aminoácidos en las cadenas laterales no cargadas (tales como asparagina, glutamina, serina, treonina, y tirosina), de aminoácidos con cadenas laterales básicas (tales como lisina, arginina e histidina), de aminoácidos con cadenas laterales ácidas (tales como ácido aspártico y ácido glutámico); de aminoácidos con cadenas laterales apolares (tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y cisteína).

Más generalmente, mediante la expresión “secuencia de aminoácidos homóloga”, se entiende por lo tanto cualquier secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia SEC ID n° 2, n° 4, n° 6, n° 8, n° 12 o n° 14 por sustitución, deleción y/o inserción de un aminoácido o de un número reducido de aminoácidos, en particular por sustitución de aminoácidos naturales por aminoácidos no naturales o pseudo-aminoácidos en posiciones tales que estas modificaciones no llegan significativamente a alcanzar la actividad biológica del polipéptido aislado y preferentemente de la sakacina G.

Preferentemente, tal secuencia de aminoácidos homóloga es similar a al menos 85% de la secuencia SEC ID n° 2, n° 4, n° 6, n° 8, n° 12 o n° 14, preferentemente al menos 95%.

La homología se determina generalmente utilizando un programa informático de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 17710 University Avenue, Madison, WI 53705). Unas secuencias de aminoácidos similares se alinean para obtener el máximo grado de homología (es decir, identidad o similitud, tal como se ha definido anteriormente). Para este fin, puede ser necesario introducir de manera artificial unos espacios (“huecos”) en la secuencia. Una vez que se consigue el alineamiento óptimo, el grado de homología se establece por el registro de todas las posiciones para las cuales los aminoácidos de las dos secuencias comparadas son idénticos, con respecto al número total de posiciones.

La actividad biológica del polipéptido aislado y en particular de la sakacina G se refiere a su capacidad de inhibir el crecimiento de cepas bacterianas indeseables y/o patógenas, preferentemente de bacterias Listeria, más particularmente de bacterias Listeria monocytogenes.

La presente invención tiene asimismo por objeto un ácido nucleico aislado, que codifica un polipéptido, tal como se ha definido anteriormente.

Más precisamente, la presente invención tiene por objeto un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia ID n°1 y/o la secuencia ID n°3.

Se determinó la secuencia nucleotídica completa de la región implicada en la expresión de la sakacina G (3055 pb). Se trata de un ADN de bicatenario cuya hebra 5’-3’ se representa en la secuencia ID n° 15. La hebra 3’-5’ se presenta en la figura 2. La presente invención se refiere asimismo a un ácido nucleico que comprende dicha secuencia.

Como se ha descrito precedentemente, esta secuencia posee tres marcos abiertos de lectura completos skgA1, skgA2 y skgDc y uno truncado, skgl. Los genes supuestos skgA 1 (SEC ID n° 1), skgA2 (SEC ID n°3) y skgl (SEC ID n° 5) están orientados en sentido inverso con respecto a skgDc (SEC ID n°13).

Se reivindican asimismo en el marco de la presente invención, el ácido nucleico que comprende la secuencia ID n°5, el ácido nucleico que comprende la secuencia ID n° 13 y el ácido nucleico que comprende la secuencia ID n°7.

Se entiende que están asimismo comprendidas las secuencias homólogas, definidas como:

i) las secuencias similares a al menos 70% de la secuencia SEC ID n°1, n°3, n°5,

n°7, n°9, n°13 o n°15; o

ii) las secuencias que se hibridan con la secuencia SEC ID n° 1, n° 3, n° 5, n° 7, n° 9, n° 13 o n° 15 o sus secuencias complementarias, en condiciones rigurosas de hibridación, o

iii) las secuencias que codifican el polipéptido denominado sakacina G, tal como se

ha definido anteriormente.

Preferentemente, una secuencia nucleotídica homóloga según la invención es similar a al menos 75% de las secuencias SEC ID n° 1, n° 3, n° 5, n° 7, n° 9, n° 13 o n° 15, preferiblemente incluso a al menos 85%, o al menos 90%.

Preferentemente, dicha secuencia nucleotídica homóloga se híbrida específicamente con las secuencias complementarias de las secuencias SEC ID n° 1, n° 3, n°5, n°7, n°9, n°13 o n°15 en condiciones rigurosas. Los parámetros que definen las condiciones de rigurosidad dependen de la temperatura (Tm) a la cual se separan 50% de las hebras apareadas.

Para las secuencias que comprenden más de 30 bases, Tm se define por la relación (Sambrook et al., 1989, NY.: Cold Spring Harbor Laboratory):

Tm = 81,5 + 0,41(% de G+C) + 16,6 Log(concentración en cationes) -0,63%(% de formamida)(600/número de bases)

Para las secuencias de longitud inferior a 30 bases, Tm está definida por la relación:

Tm = 4(C+G)+2(A+T)

En unas condiciones de rigurosidad apropiadas, en las cuales las secuencias específicas no se hibridan, la temperatura de hibridación puede ser preferentemente de 5 a 10°C por debajo de Tm, y los tampones de hibridación utilizados son preferentemente unas disoluciones de fuerza iónica elevada, tal como, por ejemplo, una disolución 6xSSC.

La expresión “secuencias similares” usada anteriormente se refiere a la semejanza perfecta o identidad entre los nucleótidos comparados, pero también a la semejanza no perfecta que se califica de similitud. Esta búsqueda de similitudes en las secuencias nucleicas distingue por ejemplo las purinas y las pirimidinas.

Una secuencia nucleotídica homóloga a los marcos abiertos de lectura representados en SEC ID n° 1, n° 3, n° 5, n° 7, n° 9, n° 13 o n° 15 incluye por lo tanto cualquier secuencia nucleotídica que difiere de las secuencias SEC ID n°1, n°3, n°5, n° 7, n°9, n°13 o n°15 por mutación, inserción, deleción o sustitución de una o más bases,

o por la degeneración del código genético, en tanto que codifica un polipéptido que presenta la actividad biológica de la sakacina G, tal como se define más adelante.

Entre tales secuencias homólogas, están comprendidas las secuencias de los genes de bacterias distintas de Lactobacillus, que codifican la sakacina G.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser sintetizados mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. Los polipéptidos de la invención pueden por ejemplo ser sintetizados mediante las técnicas de la química de síntesis, tales como la síntesis de Merrifield que es ventajosa por razones de pureza, de especificidad antigénica, de ausencia de productos secundarios no deseados y por su facilidad de producción.

La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de producción de un polipéptido recombinante en el cual un vector que comprende un ácido nucleico según la presente invención se transfiere a una célula hospedante que se cultiva en condiciones que permitan la expresión de un polipéptido según la presente invención o de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico según la presente invención.

La bacteriocina recombinante puede asimismo ser producida mediante un procedimiento, en el cual un vector que contiene un ácido nucleico que comprende une secuencia nucleotídica según la invención y preferentemente las secuencias SEC ID n° 1 y/o n° 3 o una secuencia homóloga se transfiere a una célula hospedante que se cultiva en condiciones que permitan la expresión del polipéptido correspondiente. La proteína producida puede ser recuperada y purificada a continuación. Los procedimientos de purificación utilizados son conocidos por los expertos en la materia. El polipéptido recombinante obtenido puede ser purificado a partir de lisados y de extractos celulares, de sobrenadante del medio de cultivo, mediante los métodos utilizados individualmente o en combinación, tales como el fraccionamiento, los métodos de cromatografía, las técnicas de inmunoafinidad con ayuda de anticuerpos mono-o policlonales específicos, etc.

La secuencia de ácido nucleico de interés, que codifica la sakacina G, puede ser insertada en un vector de expresión, en el cual está unida de manera operativa a unos elementos que permiten la regulación de su expresión, tales como en particular unos promotores, activadores y/o terminadores de la transcripción. Las señales que controlan la expresión de las secuencias nucleotídicas (promotores, activadores, secuencias de terminación) se seleccionan en función del hospedante celular utilizado. A este efecto, las secuencias nucleotídicas según la invención pueden ser insertadas en unos vectores de replicación autónoma en el seno del hospedante seleccionado o de los vectores que integran el hospedante seleccionado. Tales vectores se preparan según los métodos corrientemente utilizados por los expertos en la materia, y los clones que resultan pueden ser introducidos en un hospedante adecuado mediante unos métodos estándares, tales como por ejemplo electroporación o la precipitación con fosfato de calcio.

Los vectores de clonación y/o de expresión, tales como los descritos anteriormente, que contienen una secuencia nucleotídica definida según la invención forman asimismo parte de la presente invención.

La invención se refiere además a unas células hospedantes transformadas, de manera transitoria o estable, por estos vectores de expresión. Estas células pueden ser obtenidas por introducción en unas células hospedantes, preferentemente procariotas, de una secuencia nucleotídica insertada en un vector tal como se ha definido anteriormente para el cultivo de dichas células en unas condiciones que permitan la replicación y/o la expresión de la secuencia nucleotídica transferida.

Ejemplos de células hospedantes incluyen en particular unas bacterias, tales como Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Escherichia y levaduras.

Las secuencias nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de secuencias de ADN o de ARN, obtenidas por cribado de bancos de secuencias por medio de sondas elaboradas sobre la base de las secuencias SEC ID n°1, n°3, n°5, n°7, n°9, n°13 y/o n°15. Tales bancos pueden ser preparados mediante unas técnicas clásicas de biología molecular, conocidas por el experto en la técnica.

Las secuencias nucleotídicas según la invención pueden ser preparadas asimismo mediante síntesis química, o incluso mediante unos métodos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas por cribado de bancos.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para inhibir el crecimiento de Listeria, más particularmente de Listeria monocytogenes en un entorno que puede ser alimentario o no y que es susceptible de ser contaminado con las Listeria monocytogenes.

Las Listeria monocytogenes son unos microorganismos patógenos que son el origen de graves enfermedades en seres humanos y animales y que pueden en particular ser fácilmente transmisibles por alimentos contaminados, más especialmente por medio de carnes, de productos cárnicos, de productos marinos, de leche y de productos derivados. La presente invención propone por lo tanto un procedimiento para inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes en un alimento susceptible de contener Listeria monocytogenes como contaminante, comprendiendo dicho procedimiento la adición de un polipéptido según la invención en dicho alimento en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento de Listeria monocytogenes.

Las bacteriocinas según la invención son utilizadas preferentemente en cualquier sistema alimentario en una cantidad comprendida entre 1 y 100000 unidades arbitrarias (UA) de bacteriocinas par gramo de alimento.

Una UA de bacteriocinas se define como 5 µl de la dilución más elevada de sobrenadante de cultivo que conduce a una zona definida de inhibición del crecimiento con respecto a una cepa de control de una bacteria gram-positiva en un medio de agar.

Aunque los alimentos sean los más implicados por una contaminación por Listeria monocytogenes, los productos veterinarios y médicos pueden estar contaminados asimismo por este tipo de bacterias, incluso los productos cosméticos o productos relacionados.

Las bacteriocinas según la presente invención, y principalmente la sakacina G, son por lo tanto asimismo útiles para inhibir el crecimiento de este tipo agentes patógenos en estos productos.

La presente invención tiene así por objeto el uso de una bacteriocina según la presente invención como agente activo contra floras patógenas o indeseables en particular en la preparación de productos alimentarios y más precisamente para inhibir el crecimiento y la propagación de Listeria, más particularmente de Listeria monocytogenes, en los productos alimentarios.

El polipéptido puede ser incorporado tal cual en el producto alimentario considerado o incluso puede ser introducido en él a partir de la cepa Lactobacillus Sakei 2512.

La presente invención tiene así igualmente por objeto la utilización de la cepa Lactobacillus Sakei 2512 en un producto alimentario para generar un polipéptido bacteriocina según la invención.

La invención se refiere asimismo a una composición de bacteriocina, caracterizada porque comprende al menos un polipéptido según la presente invención, es decir, procedente de la cepa Lactobacillus Sakei 2512 o que comprende la secuencia SEC ID n° 2, o n°4, o n°12, o n°14 o la cepa Lactobacillus Sakei 2512.

La invención se extiende asimismo a la utilización de la cepa Lactobacillus sakei 2512 destinada a producir un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, para inhibir el crecimiento y la propagación de Listeria, más particularmente de Listeria monocytogenes, en unos productos alimentarios así como las composiciones que comprende dicha cepa.

Los ejemplos y las figuras siguientes se presentan a título ilustrativo y no limitativo de la presente invención.

FIGURA:

Figura 1: Representación esquemática del locus genético implicado en la producción de la sakacina G. Figura 2: Hebra complementaria 3’-5’ que corresponde a la secuencia nucleotídica completa de la región implicada en la expresión de la sakacina G y cuya hebra 5’-3’ está presentada en la SEC ID n°15.

MATERIALES Y MÉTODOS

•

Cepas bacterianas y medio de cultivo. Lactobacillus sakei 2512 se cultiva a 30°C en medio MRS (DIFCO Laboratories) esterilizado durante 12 minutos a 110°C. Las cepas indicadoras se cultivan en medio BHI (“brain-heart infusión”; D1FCO Laboratories) a 37°C.

•

Ensayo de actividad. Medio BHI, de agar-agar a 10 g/l, e inoculado al 1% por un precultivo de cepa indicadora en fase estacionaria antes de ser vertido en caja de Petri. Cincuenta microlitros de disolución de sakacina G se depositan en unos pocillos cavados con sacabocados en la gelosa enfriada. La actividad de bacteriocina se traduce por la aparición de zonas de inhibición alrededor de los pocillos después de incubación durante una noche a 37°C.

•

Análisis proteico. La sakacina G se analiza en espectrometría de masas en un aparato Perkin-Elmer Sciex API 165 equipado con una fuente de ionización por pulverización fónica. Después de la liofilización, la fracción de HPLC activa se recoge con una disolución de acetonitrilo/agua (1:1) que contiene 0,1% de ácido fórmico, y después se inyecta por infusión a un caudal de 5 µl/min.

La concentración proteica se determina mediante el método con ácido bizincconínico por medio del kit BCA (Sigma) según las instrucciones del fabricante.

Las comparaciones de secuencias proteicas se realizan gracias al programa BLAST (1), accesible a partir del servidor ExPASy del “Swis Institute of Bioinformatics”.

• Clonación molecular y transformación. Los plásmidos se extraen y se purifican a partir de cepas de Escherichia coli y de Lactobacillus sakei 2512 según los métodos descritos anteriormente por Sambrook et al., 1989, NY: Cold Spring Harbor Laboratory y Muriana y Klaenhammer, 1987, Appl. Environ. Microbiol., 53:553-560 respectivamente.

Las enzimas de restricción y de modificación del ADN se utilizan según las indicaciones del proveedor (GibcoBRL). Las electroforesis en gel de agarosa, analítica y preparativa, se llevan a cabo en tampón Tris/borato/EDTA (pH 8,3) según los métodos descritos por Sambrook et al., 1989, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. Los fragmentos de ADN digeridos se purifican a partir de geles de agarosa utilizando el kit “Prep-a-Gene” (Bio-Rad). Las clonaciones en los plásmidos pGEM-T (Promega) y pZER02 (Invitragen) se realizan según las recomendaciones de los proveedores. La transferencia Southern se realiza en una membrana de nylon (Hybond-N+, Amersham) según Sambrook et al., 1989, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. La transferencia está seguida de una hibridación con una sonda radioactiva obtenida mediante marcado con 32P con la ayuda del kit “Random primers DNA labelling system” (Gibco-BRL). Las bacterias E. coli se hacen competentes y se transforman según el método de Hanahan, 1983. J. Mol. Biol. 166:557-80.

La Taq-polimerasa (Gibco-BRL) se utiliza según las recomendaciones del proveedor. La amplificación del fragmento de ADN que codifica la sakacina G se realizó con la ayuda de un aparato “Geneamp 9700®” (Perkin-Elmer) según las condiciones siguientes: 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, hibridación a 45°C durante 30 s y elongación a 72°C durante 1 min. seguido de un ciclo suplementario de elongación a 72°C durante 5 min.

El fragmento de ADN que lleva el locus de sakacina G se secuencia con la ayuda de un secuenciador automático ASI Prism 310® (Perkin-Elmer) utilizando el kit de secuenciación “Big-dye terminator®” (Perkin-Elmer) y los cebadores nucleotídicos apropiados.

EJEMPLO 1:

Aislamiento y purificación de la sakacina G

Un cultivo de 16 horas de Lactobacillus sakei 25I2 (100 ml) se centrifuga a 6000 g durante 15 minutos. El sobrenadante del cultivo se calienta a continuación a 70°C durante 20 minutos. El sobrenadante enfriado se diluya a continuación con 1 volumen de agua (el pH de la disolución diluida debe ser inferior a 6, mediante adición de HCl 1M si es necesario) antes pasarlo sobre una columna (2,5 x 18 cm) que contiene una resina intercambiadora de cationes (carboxi-metil-celulosa; Cellufine C-200, Amicon) equilibrada con agua. Después de los lavados sucesivos con agua (100 ml) y luego con una disolución de NaCl 0,1M (150 ml), la sakacina G se eluye con una disolución de NaCl 0,5M (200 ml). El pH de todas las disoluciones debe ser inferior a 6. La fracción activa se deposita a continuación en un cartucho de extracción en fase sólida (Sep-pak plus C18, Waters) equilibrada en agua. Después de unos lavados sucesivos con 5 ml de disoluciones de acetato de amonio 20 mM que contiene 0, 10, 20 y 30% de acetonitrilo, la sakacina G se eluye con 10 ml de acetato de amonio 20 mM que contiene 80% de acetonitrilo. Después de la liofilización, el extracto se solubiliza en 1 ml de disolución acuosa de acetonitrilo al 40% y después se inyecta en una columna HPLC analítica de fase inversa en C8 (Kromasil, 5 pm, 100 Å, 4,6 x 250 mm, A.L.T.). La HPLC se realiza en un aparato que comprende una bomba Perkin-Elmer serie 200 LC conectada a un detector Perkin-Elmer 785A. El cromatograma en absorción se registra a 220 nm. La separación se realiza a un caudal de 0,8 ml/min según el gradiente siguiente: Disolvente A = agua/ácido trifluoroacético al 0,1%; disolvente B = acetonitrilo/agua/ácido trifluoroacético al 0,07%. Después de un lavado de 5 minutos con 20% de disolvente B, la elución se realiza mediante un gradiente de 20 de 40% de disolvente B en 10 minutos y después por 40 a 55% de disolvente B en 20 minutos.

La fracción que corresponde al pico de 23 minutos que se ha revelado activa contra Listeria ivanovii BUG 496 se analiza mediante espectrometría de masas en ionización por “pulverización iónica”. La molécula aparece pura en al menos 95% y posee una masa molecular de 3834,32 ± 0,31 Da. La cantidad de sakacina G así purificada se estima en 120 µg a partir de 100 ml de cultivo. El rendimiento de la purificación se estima en 55% de actividad encontrada. Una parte de la secuencia primaria de la sakacina G se determina mediante microsecuenciación y se establecen dos oligonucleótidos degenerados a partir de esta secuencia.

EJEMPLO 2:

Clonación del locus genético implicado en la producción de la sakacina G

Por genética inversa, se eligieron dos oligonucleólidos degenerados SakG01 (5’ AARTATTATGGNAAYGGNGT 3’) (SEC ID n° 10) y SakG02S (5’ ACATGATGNCCNCCRTTNGC 3’) (SEC ID n°11) con el fin de amplificar el fragmento de ADN correspondiente al gen estructural de la sakacina G madura (SEC ID n° 15) por reacción en cadena de polimerización en cadena (PCR). El producto amplificado así obtenido, de un tamaño aproximado de 100 pb se clonó en el plásmido pGEM-T para formar el plásmido pJMBYC01. El fragmento de restricción PvuII de 560 pb procedente de pJMBYC01, que incluía el fragmento insertado, sirvió de sonda de hibridación, durante una transferencia de tipo Southern, para localizar el gen estructural en el genoma de Lactobacillus sakei 2512. A partir de un extracto plasmídico de Lb. sakei 2512 digerido por las enzimas de restricción Hindlll y EcoRI, la sonda reveló unos fragmentos de tamaños respectivos de aproximadamente 2,1 y 9 kpb. El fragmento HindIll de 2,1 kpb se purificó y después se insertó en el vector pZERO2 para dar el plásmido pJMBYCO2. La presencia del gen estructural de la sakacina G en pJMBYCO2 se demostró mediante la amplificación por PCR con los cebadores SakG01 y SakG02 y después mediante secuenciación nucleotídica del fragmento insertado en pJMBYCO2. Se utilizó una estrategia próxima con el fin de determinar la secuencia completa del gen skgD. El extracto plasmídico de Lb. sakei 2512 se digerió por XbaI. El producto de digestión se insertó en el plásmido pBluescript SK+. Los clones portadores de la secuencia de interés se revelaron por medio de una sonda radioactiva preparada por PCR realizada en el plásmido pJMBYCO2 con la ayuda de los oligonucleótidos SakG03 (5’ CCTTGGTCAGGCTATCG 3’) (SEC ID n° 16) y SakG04 (5’ ATCACCTTTTTGAATTACCC 3’) (SEC ID n°17).

El análisis de la secuencia nucleotídica completa de la región (de 3051 pb) reveló la existencia de tres marcos abiertos de lectura completos skgA1 y skgA2 y skgDc y uno truncado, skgl. Los genes supuestos skgA1, skgA2 y skgl están orientados en sentido inverso con relación a skgD.

Cada uno de los marcos de lectura abiertos va precedido de un sitio potencial de fijación de ribosomas. Los genes skgA1 y skgA2 codifican ambos dos proteínas de 55 residuos de aminoácidos cuyas secuencias 19-55 son totalmente idénticas. La secuencia 19-52 correspondiente a la secuencia de la sakacina G obtenida por microsecuenciación. Hay que destacar la presencia de 4 residuos de cisteína en las posiciones 9, 14 y 24 y C-terminal. Además, la masa molecular calculada de este péptido, de 3838,2 Da que difiere de la masa molecular medida (3834,32 Da) de 4 Da muestra la presencia de dos puentes disulfuros en la sakacina G, como ya se demostró para otras bacteriocinas anti-Listeria.

Las secuencias 1-18 de las proteínas SkgA1 y SkgA2 difieren sólo de 3 residuos y presentan grandes homologías con los péptidos “leader” de las bacteriocinas de clase II, que están implicadas en el transporte de estos péptidos por los vehículos de ABC específicos. En particular el motivo GG terminal es característico de estas secuencias líderes y constituye el sitio de maduración de estas bacteriocinas. La comparación de las secuencias nucleotídicas de los genes skgA1 y skgA2 muestra asimismo una identidad de secuencia de más de 95% para la parte de los genes que codifica la bacteriocina madura.

El marco abierto de lectura incompleto denominado skgl codifica una proteína de 52 residuos. La comparación de esta secuencia con las de los bancos de datos muestra grandes homologías de Skgl con las proteínas denominadas de inmunidad Lccl y Mesl. Se demostró la implicación de Mesl en la protección frente a la mesentericina Y105. Se puede suponer que skgl codifica la proteína de inmunidad para la sakacina G.

El último gen skgDc codifica una proteína de 727 aminoácidos. Según los bancos de datos, SkgDc es muy homólogo de las proteínas de la familia de los vehículos de ABC y más particularmente de los vehículos de la pediocina PA-1: PedD o PapD (Marugg et al., Appl. Environ Microbiol. 58, 2360-7; Motiagh et al., 1994, Lett. Appl. Microbiol. 18, 305-12), de la sakacina P: SppT (Huhne et al., 1996, Microbiology, 142, 1437-48), de la sakacina A: SapT (Axelsson y Holek, 1995, J. Bacteriol. 177, 2125-37) y de la mesentericina Y105: MesD (Fremaux et al., 1995, Microbiology 141, 1637-45).

EJEMPLO 3:

Espectro de inhibición

La sensibilidad a la sakacina G de 17 cepas bacterianas ha sido ensayada mediante el método de ensayo en pocillos (véase Materiales y Métodos). Los resultados se presentan en la Tabla 1 siguiente:

TABLA 1

Radio de los halos de inhibición (mm)

Lc. lattis ATCC 11454

0

Ln. paramesenteroides DSM 20288

0

Ln. mesenteroides DSM 20484

0

Ln. mesenteroides DSM 20240

0

Lb. delbrueckii DSM 20081

0

Lb. plantarum DSM 20174

0

Lb. brevis DSM 20054

0

Lb. casei DSM 20011

0

Lb. sakei 2515

1

P. acidilactici ENSAIA 583

0

P. cerevisiae IP 5482

1

E. faecium ENSAIA 631

0

E. faecalis IP 5430

2

E. faecalis ENSAIA 636

1

E. durans ENSAIA 630

2

L. inocua 8811

3

L. ivanovi 496

6

El espectro de inhibición de esta bacteriocina aparece bastante estrecho y limitado

5 a las cepas de Lactobacillus sakei y Pediococus cerevisiae para las bacterias lácticas. Este péptido aparece, tal como las otras bacteriocinas de la clase IIa, activo contra todas las cepas de Listeria ensayadas, así como contra las Enterococus faecalis y durans, pero no contra Enterococcus faecium.

10 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DANISCO A/S

15 <120> Bacteriocina anti-Listeria

<130> BEP070517EP

<160>17 20

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 196 25 <212> ADN

<213> Lactobacillus sake

<220>

<221> CDS 30 <222> (20)..(187)

<400> 1

imagen1

5 <210> 2

<211> 55

<212> PRT

<213> Lactobacillus sake

10 <400> 2

imagen1

<210> 3 15 <211> 196

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

<220>

20 <221> CDS

<222> (20)..(187)

<400> 3

imagen1

<210> 4

<211> 55

<212> PRT

<213> Lactobacillus sake

<400> 4

imagen1

10 <210> 5

<211> 181

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

15 <220>

<221> CDS

<222> (24)..(179)

<400> 5 20

imagen1

<210> 6

<211> 52

<212> PRT

<213> Lactobacillus sake

<400> 6

imagen1

10 <210> 7

<211> 1203

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

15 <220>

<221> CDS

<222> (20)..(1201)

<400> 7 20

imagen1

imagen1

<210> 8

<211> 394

<212> PRT

<213> Lactobacillus sake

<400> 8 <210> 9

imagen1

imagen1

<211> 2042

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

<400> 9

imagen2

imagen1

5

<210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Lactobacillus sake

10

<220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n es a, c, g, ó t

15

<220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n es a, c, g, ó t

<400> 10

20

aartattatg gnaayggngt

20

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

5

<213> Lactobacillus sake

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

10

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

15

<223> n es a, c, g, ó t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

20

<223> n es a, c, g, ó t

<400> 11

acatgatgnc cnccrttngc

20

25

<210> 12

<211> 37

<212> PRT

<213> Lactobacillus sake

30

<400> 12

imagen1

<210> 13 35 <211> 2214

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

<220> 40 <221> CDS

<222> (20)..(2200)

<400> 13

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 14

<211> 727

<212> PRT

<213> Lactobacillus sake

<400> 14

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 15

<211> 3055

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

<400> 15 <210> 16

imagen1

imagen1

<211> 17

<212> ADN

<213> Lactobacillus sake

-28

<400> 16

ccttggtcag gctatcg

17

5 10

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Lactobacillus sake <400> 17 atcacctttt tgaattaccc 20

Claims (1)

1. Reivindicaciones

   1. Cepa Lactobacillus sakei 2512 depositada en la Colección Nacional de los Cultivos de Microorganismos (CNCM) bajo el número I-2479.