JP2002507889A

JP2002507889A - Ｔｅｎｅｂｒｉｏ不凍タンパク質

Info

Publication number: JP2002507889A
Application number: JP50517499A
Authority: JP
Inventors: エイ．グラハム，ローリー; リオウ，イー−チェーン; ケイ．ウォーカー，バージニア; エル．デイビス，ピーター
Original assignee: Queens University at Kingston
Current assignee: Queens University at Kingston
Priority date: 1997-06-26
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2002-03-12
Also published as: AU8097098A; WO1999000493A1; EP0990032A1; US7531626B2; US20060116506A1; US20020165383A1; US6747130B2; AU747466B2; CA2296005C; US6392024B1; CA2296005A1

Abstract

(57)【要約】魚類不凍タンパク質の100倍までの比活性を有する熱履歴（不凍）タンパク質（THP）が、ゴミムシダマシ甲虫であるTenebrio molitorから単離および精製されている。cDNAクローニングおよび細菌中でのタンパク質の生成をもたらすタンパク質の内部配列決定により、8.4〜10.7kDa THPの正体および活性が確認された。これらは、主に、sys-thr-xaa-ser-xaa-xaa-cys-xaa-xaa-ala-xaa-thrという12アミノ酸の反復から構成される、ThrおよびCysがリッチなタンパク質である。55マイクログラム/mLの濃度では、THPは、凝固点を融点より1.6℃下に低下させ、そして約１mg/mL-の濃度では、THPまたはその改変体は、Tenebrio幼虫に見出される5.5℃の熱履歴を説明し得る。THPは、吸着阻害機構により機能し、そして曲がったプリズム面を有する卵形の氷晶を生じる。

Description

【発明の詳細な説明】 Tenebrio不凍タンパク質関連出願の引用本出願は、1997年６月2日に出願された米国特許出願第08/882,907号の一部継続出願である。発明の背景現代では、冷蔵、特に凍結は、生物学的材料の保存の通常の、そして好ましい手段になってきている。冷蔵は、サンプルのいくつかの重要な特性を保存するが、他の特性は緩慢だが有意な速度で悪化し続ける。凍結保存は、この悪化の大部分を停止させ得るが、凍結と融解との組合せは、他の重要な特性を破壊する他の変化を導入する。現代の世界では、凍結食品は、ヒトの食餌の頼みの綱となってきた。要求の厳しい消費者の好みに十分な、高品質の製品を確実にするため、特に凍結野菜、そしてアイスクリームのような凍結デザートは、食品加工業者による広範囲な調査の対象である。氷の再結晶化が、凍結食品の味覚およびテクスチャーに対してかなりの負の影響を有し得ることが現在公知である。無霜フリーザーの出現は、この状況を悪化させた。これは、輸送の間の温度変動とさらに伝統的に関連した。零度より低い温度以外の温度、または持続した凍結温度での比較的短い期間の後、多くの凍結食品は、ヒトの消費にはあまり好ましくなくなるか、または悪化して全体に適切でなくなる。再結晶化に伴う損傷を軽減するために種々の技術が実施されているが、制限された成功しか達成されておらず、顕著な問題が残っている。しばしば、凍結食品の加工の改変は、その品質、色、匂い、および/またはテクスチャーに強烈に影響を与える。さらに、さらなる加工は、非常に高価でそして時間がかかり得、この技術を不経済にする。類似の困難性が、食料品に添加物を取り込ませることに付随している。生物製剤（例えば、治療薬物、血漿、組織培養における使用のための哺乳動物細胞など）については、不凍剤は大量の損傷を生じ得る。例えば、凍結プロセス自体が、大部分の真核生物細胞を殺傷し、そして１回でさえも凍結および融解のサイクルに供した細胞は、大いに減少した生存率を示す。生存細胞の機能の損傷はまた、器官移植についての付随した欠点を有する、組織低温保存法において一般的である。同様に、植物に対する霜または他の凍結損傷は、農業において深刻な問題を提示する。最終的に、要求される厳密な温度条件下で維持されないならば、薬物が無効になるかまたは危険にさえなり得る。タンパク質媒介熱履歴（以下で定義されるように、TH）の最初の記載は、Tene rbio molitor血液リンパにおいて、約30年前に注目され（Grimstoneら，Philos ．Trans．B 253.343(1968)）、これらの熱履歴タンパク質（THP）を精製する多数の試みは、血液リンパの活性を説明する十分なTHを有する精製画分を得ることができなかった（Grimstoneら，(1968);PatersonおよびDuman，J．Exp．Zool．2 10:361(1979);SchneppenheimおよびTheede Comp．Biochem．Physiol．67B:561(1 980);Tomchaneyら，Biochemistry 21:716(1982);PatersonおよびDuman J．Exp． Zool．219:381(1982);ならびに（Horwathら，Eur．J．Entomol．93:419(1996)））。これらのタンパク質の均質性は証明されておらず、これらはアミノ酸組成が互いに異なり、本明細書で報告する組成物とも異なる。保存食品の保存および生物製剤の生存率を含む、低温での有機物質の保存特性を改良するのに適切な新規な技術および組成物についての必要性が存在する。理想的には、これらの技術および組成物は安価であり、依然として完全に安全であり、そしてヒトによる消費またはインビボでの治療での使用に適切である。非有機系（例えば、徐氷処置）における凝固点を低下させるかまたは凍結を阻害するのに適切な新規な技術および組成物についての必要性もまた存在する。本発明は、これらおよび他の必要性を満たす。発明の要旨通常の黄色ゴミムシダマシ甲虫であるTenebrlio molitorは、温帯地域における保存穀物の凍結耐性害虫である。幼虫は、−12℃の平均温度まで過冷され得る（JohnstonおよびLee，Cryobiol．27.562(1990)）。凍結に対する防御の第２の方針は、それらの血液リンパの熱履歴（TH）活性であり、この活性は、昆虫がそれらの凝固点を氷または氷晶核形成物の存在下で低下させるのを可能にする。この活性は、氷を含有する溶液の凝固点と融点との間の温度差（℃）として定量される。Tenebrio血液リンパにおけるTHの値は、測定方法および昆虫を飼育する条件に従って、１℃〜10℃の範囲である（HansenおよびBaust，Biochim．Biophys ．Acta 957:217(1988);ならびにPattersonおよびDuman，J.Exp.Biol．74:37(197 8)）。本発明は、Tenebrio幼虫における熱履歴を担うタンパク質をコードする核酸分子を提供する。核酸配列決定は、12個の連続するアミノ酸のモチーフの少なくとも１反復を有する熱履歴タンパク質（THP）を予測する。この反復モチーフは、システインおよびトレオニンがリッチである（配列番号１）。反復モチーフに加えて、本発明のクラスのTHPのN末端は、16アミノ酸のモチーフ（配列番号３）である。別の実施態様では、本発明は、本発明の核酸に由来する組換えタンパク質を提供する。このタンパク質は、７〜13kDaの計算分子量、約８〜10のpI、および１m gタンパク質/mLで約1.5℃よりも大きなTH活性を有すると特徴付けられる。本発明はまた、本発明のタンパク質に対して惹起された抗体、および本発明のタンパク質に結合する抗体を提供する。本発明は、免疫学的に反応性の条件下で配列番号４を含む不凍タンパク質に特異的に免疫反応性な抗体を提供する。本発明はまた、免疫学的に反応性の条件下で、請求項１に記載の核酸によりコードされるタンパク質を含む不凍タンパク質に特異的に免疫反応性な抗体を提供する。本発明のさらなる実施態様では、形質転換された酵母、細菌、および他のトランスジェニック生物が提供される。多くの凍結食料品は、持続した凝固温度以下の温度または凍結-融解サイクルの反復に起因した氷晶の形成を被る。本発明のT HPの存在は、より長期の貯蔵寿命を提供し、これらの食料品をより口に合うようにする。トランスジェニック動物および植物は、凝固温度以下の温度でより良好に生存すると想像される。本発明は、その生物またはその祖先に、ストリンジェントな条件下で配列番号２もしくは５に特異的にハイブリダイズする外因性核酸配列、または請求項１に記載の核酸が導入された生物を提供し、そしてこの生物は、外因性核酸を不凍タンパク質に翻訳する。生物から外部に発現される不凍タンパク質に翻訳される外因性核酸配列を有する生物もまた提供される。好ましい実施態様では、生物は魚類である。さらに好ましい実施態様では、生物は、海水環境に保持される魚類であるか、または魚類はSalmonidae科のメンバーである。他の好ましい実施態様では、生物は、植物、真菌、酵母、または細菌であり得る。別の実施熊様では、生物が酵母である場合、酵母は、Torulopsis holmil、Saccharomyces fragilis、S accharomyces cerevisiae、Saccharomyces lactis、およびCandida pseudotropi calisからなる群より選択され得る。別の実施態様では、生物が細菌である場合、細菌は、Escherichia coli、Streptococcus cremoris、Streptococcus lactis 、Streptococcus thermophilus、Leuconostoc citrovorum、Leuconostoc mesent eroides、Lactobacillus acidphilis、Lactobacillus lactis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、およびBifidobacterium longumからなる群より選択され得る。THP配列で形質転換される植物は、ブドウ、脂肪種子植物（例えば、カノラ）、穀物、柑橘類、およびサトウキビを含み得る。本発明は、水溶液の凝固点を低下させるための方法であって、水溶液への不凍タンパク質の添加を含む方法を提供する。好ましい実施態様では、この方法は、水溶液への、請求項１に記載の核酸によりコードされる不凍タンパク質の添加を含む。別の好ましい実施態様では、水溶液は、生物に適用され；不凍タンパク質は、組換え手段により生成され：不凍タンパク質は、請求項１３または請求項１４に記載の抗体に特異的に結合し得；不凍タンパク質は、YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択され；そして／または不凍タンパク質は、配列番号２または５に記載の核酸に特異的にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる。さらに、水溶液への本発明のTHPの添加は、輸送中の生物または他の生物製剤をより良好に保存し得ることが意図される。本発明の性質および利点のさらなる理解は、明細書の残りの部分、図面、および請求の範囲を参照することにより理解され得る。図面の簡単な説明そしてフェニルチオカルバミドを含まない血液リンパ緩衝液で溶出した、希釈Te nebrio血液リンパのクロマトグラムである（本文を参照のこと）。図２は、合わされ、そして0.05％トリフルオロ酢酸中の0.4％アセトニトリル／分の勾配を用いるC18分析用カラム（Vidac）での逆相HPLCによりクロマトグラフィーされた、ゲル排除クロマトグラフィー由来の選択された活性画分のクロマトグラムである。図３は、凍結乾燥され、そして50μLの0.1M NH₄HCO₃（pH8.0）中に再懸濁された逆相HPLC画分の15％ SDS-PAGEである。ゲルを、Silver Stain Plus Kit（Bio- Rad）を用いて染色した。およその分子量を、MALDI質量分析法により決定した。図４は、Tenebrio血液リンパの熱履歴活性の双曲線的性質を示す、グラフである。図５１〜IVは、Tenebrio THP（ＩおよびII）および魚類不凍タンパク質（III およびIV）の存在下で成長させた氷晶のマイクロ写真である。図６は、イソ型の組換え体THP（YL-1、YL-2、YL-4、YL-3、および5-15は、それぞれ、配列番号10、12、14、16、および18である）のアラインメントチャートである。ヌクレオチドが全てのcDNA配列において保存される位置（コンセンサス＝配列番号20）を、アスタリスク（^*）により印をつける。完全なアミノ酸配列を、YL-1（配列番号11）のみについて示す。YL-1において見出される残基と同じ他のイソ型の残基（YL-2、YL-4、YL-3、および5-15は、それぞれ、配列番号13、 15、17、および19である）を、ピリオド（.）により示す。差違を、見出される場所において太字により示す。cDNA配列およびタンパク質配列の両方におけるギャップを、ダッシュ（-------）により示す。発明の詳細な説明本発明は、新規なクラスの不凍タンパク質（THP）をコードする単離された核酸配列に関する。天然のTHP遺伝子を得るための手順は、一般的にTenebrio moli tor由来の遺伝子ライブラリーを構築または入手すること、所望の遺伝子を検出および単離すること、それをクローニングすること、ならびに適切な宿主細胞中でそれを発現させること、および、次いで発現したタンパク質を精製することを含む。天然のタンパク質は、改変なしで使用され得るか、またはTH活性に影響を与えることなしに種々の方法で改変され得る。精製されたタンパク質のアミノ酸組成および推定成熟配列は非常に類似している。THPは、特にCys（18〜19％）およびThr（20〜26％）に富み、そしていくつかの疎水性アミノ酸、特にLeuおよびIleが不足している。全体の親水性は、およそ55％であり（Wishardら、Comput．Appl．Biosci．10:121(1994)）、これは魚 ci．4:460(1995)）よりもはるかに高い。成熟THPの一次構造は非常に変わっており（図４）、そしていかなる公知の配列とも類似していない。最初の20アミノ酸は、不規則な間隔で間隔があいている６つのCys（Cx₅Cx₂Cx₃Cx₂Cx₂C；配列番号２２）を含み、そしてこの配列は、タンパク質の末端まで続く最初の一連の12アミノ酸反復と重複する。Cysはこの領域を通じて6残基間隔で反復し、これはコンセンサス配列CTxSxxCxxAxT（配列番号１）を有する。N末端Cys間隔は、亜鉛結合モチーフと共通したいくつかのエレメントを有する（KlugおよびSchwabe，FASEB J．9:597(1995)）。しかし、10mM EDTAまたは10mMフェナントロリンに対して大量に透析し、続いてキレート剤を含まない調製液（22℃で１時間インキュベート）に、2mM ZnCl₂（または2mM CaCl₂ ）を添加しても活性に影響はなく、このことはTH活性において二価金属イオンの役割は存在しないことを示唆する。少なくともいくつかのCys残基が、ジスルフィド架橋に関与する。なぜなら、10mMジチオスレイトールとともに37℃で20分間インキュベートすると、すべての活性が消失するからである。一方、還元剤の非存在下では、同じ条件下では活性は失われない。N-エチルマレイミドは、TH活性に効果がない。このことは、遊離のCysが存在する場合、これらは、活性を損失することなく改変され得ることを示唆する。 THP改変体間の長さの違いは、多数の12アミノ酸反復を示し、各々の反復が、機能的なドメインを形成し得ることを示唆する。THP反復は短いが、これらの反復は独立して折り畳まれて鎖を形成し得る。この鎖は、タンパク質の実際の分子量および見かけの分子量の間の矛盾（下記参照）を非対称性に起因するものとして、説明し得る。 Tenebrio THPと魚類AFPとの間に構造的な類似性は存在しない。魚類のII型AFP は、10個のCysを含み、Cysの間隔においていかなる反復構造も規則性も示さない。魚類のI型AFPおよび不凍糖タンパク質は、反復エレメントを形成するが、どちらもCysを含まない（DaviesおよびHew、FASEB J．4:2460(1990)）。しかし、Ten ebrio THPにおいて最も豊富な残基であるThrもまた、魚類AFPのI型およびIII型の氷表面への結合において中心的な役割を演じていると考えられているアミノ酸であることは興味深い（WenおよびLaursen、J．Biol．Chem．267:14102(1992)；およびChaoら、Prot．Sci．3:1760(1994)）。しかし、魚類不凍タンパク質と同様に、Tenebrio THPは、吸着阻害機構によって作用するようである。約1℃の熱履歴を産生するために十分なTHPの存在下の氷晶は、非平衡凝固点を超えるまでは成長を止める。この点において、氷晶は、氷晶核形成物から突然現れてa-軸に沿った氷の硬い塊を形成する。低い熱履歴活性において、氷の前面は広く、滑らかである。しかし、高い熱履歴値においては、氷の前面はもはや滑らかではない。対照的に、魚類AFPの存在下で一旦凝固点を超えると、無数の針状の氷がC-軸に沿って、およびC-軸に平行に突然現れる。さらに、魚類AFP（DeVries、Annu．Rev．Physiol．45:245(1983)）に類似して、TH活性とTHP濃度との関係は、双曲線型である。しかし、THPの存在下で形成した氷晶は、それらの表面に明白な湾曲を有するという点で変わっている。対照的に、魚類AFPのI型およびIII型によって生成される水晶は、平坦な、明確な面を有する六方晶系の両錐である。精製された、発現されたTHPタンパク質は、直接的に水溶液に添加されて凝固点を低下させるか、または別の実施熊様において、不凍タンパク質を発現する形質転換生物は、冷菓のような、凍結して保存する品目に添加され得る。なお別の実施態様において、形質転換された生物（例えば魚類、植物、および酵母）は、細胞外にTHPタンパク質を発現する必要はないが、THP遺伝子および細胞内タンパク質の存在は、凝固温度で生き残る能力の増加をその生物に与える。例えば、形質転換された生物は、塩水魚類であり得る。形質転換される塩水魚類は、不凍タンパク質を有さないか、十分なレベルの不凍タンパク質を有さない、Salmonidae 科のメンバー、オヒョウ、ギンダラ、または任意の食用の塩水種を含み得る。TH P配列で形質転換される植物は、ブドウ、脂肪種子植物（例えば、カノラ）、穀類、柑橘類、およびサトウキビを含み得る。本明細書中に引用されるすべての出版物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにそれによって明確に参考として援用される。Ｉ．定義用語「抗体」は、分析物（抗原）に特異的に結合し、そして認識する、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされているポリペプチド、またはそのフラグメントをいう。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、 εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これは次には免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA 、IgD、およびIgEとしてそれぞれ定義する。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、テトラマーを含む。各々のテトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各々の対は１つの「軽」鎖（約25kD）および１つの「重」鎖（約50〜70kD）を有する。各々の鎖のN-末端は、抗原の認識を主に担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖（V_D）および可変重鎖（V_H）とは、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれいう。抗体は、例えばインタクトな免疫グロブリンとして、または、種々のペプチダーゼを用いる消化によって作製される、多数の十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合の下の抗体を消化して、F(ab)'₂を産生する。これは、Fabのダイマーであり、それ自体がジスルフィド結合によってV_H-C_H1に連結された軽鎖である。F(ab)'₂は、穏やかな条件下で還元されてヒンジ領域中のジスルフィド結合を開裂し得、それによってF(ab)'₂ダイマーをFab'モノマーに転換する。Fab'モノマーは、本質的にはヒンジ領域の部分を有するFabである（FUNDAMENTAL IMMNOLOGY，第3版.， W. E．Paul，編、Raven Press，N.Y．(1993)を参照のこと）。種々の抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化によって定義されるが、当業者は、このようなフラグメントが化学的または組換えDNA方法論を利用することによって新規に合成され得ることを理解する。従って、本明細書中で使用する用語、抗体は、抗体全体の改変によって産生されるか、または組換えDNA方法論を使用して新規に合成された抗体フラグメント（例えば、単鎖Fv）のいずれの抗体フラグメントもまた含み得る。「不凍タンパク質抗体」は、本発明の不凍タンパク質またはそのサブ配列に特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。用語「不凍タンパク質」は、Tenebrio molitorゴミムシダマシおよび植物のような、いくつかの変温生物（これは、非束一的に水の凝固点を下げるという一般に公知の特性を有する）の体液に見出されるタンパク質をいう。不凍タンパク質はまた、「熱履歴タンパク質」（THP）としても公知である。本明細書中で使用されるように、「不凍タンパク質」または「THP」は、天然に存在する不凍タンパク質に実質的な類似性を有するタンパク質配列を有し、そして天然の不凍タンパク質の特性を保持する、化学的に合成されたおよび組換え的に産生されたポリペプチドを含む。句「コンセンサス配列」は、多くの実際の配列が比較される場合に、各々の位置が最もしばしば見出される残基または塩基を示す、核酸またはアミノ酸の配列をいう。配列番号１は、本発明のタンパク質中に見出される反復モチーフのコンセンサス配列である。句「保存性アミノ酸」は、２つ以上の適切にアラインメントされたTHPモチーフ配列において共通するアミノ酸残基をいう。保存性アミノ酸配列は、ペプチド内またはペプチド間であり得る。例えば、本発明のTHPにおいて、アミノ酸モチーフは６つの保存性アミノ酸のうちの５つからなり得、または言い換えれば、任意の特定のモチーフの６アミノ酸残基のうちの５アミノ酸残基が、１つのTHPアミノ酸配列内、または２つ以上のTHPアミノ酸配列内のいずれかのモチーフの６アミノ酸のうちの５アミノ酸と共通である。用語「連続するアミノ酸モチーフ」は、ポリペプチドまたはタンパク質に存在するアミノ酸の反復パターンをいう。各々の反復中のアミノ酸は同じでなくてもよいが、すべてに共通なパターンが存在するべきである。例えば、本発明のタンパク質のクラスにおいて、反復するアミノ酸モチーフ、cys-thr-xaa-ser-xaa-xa a cys-xaa-xaa-ala-xaa-thr（ここでxaaは任意のアミノ酸）が存在する。用語「甲殻類」とは、この語の共通の定義、すなわちCrustacea綱の主に水生の節足動物（ロブスター、小エビ、カニ、およびフジツボ目甲殻類を含む）をいう。用語「水溶液の凝固点を低下させること」とは、氷晶が形成し、そして成長する水溶液の温度を低下させることをいう。凝固点の低下は、凝固点を減少させるために使用される薬剤および水溶液中のその濃度の両方に依存する。凝固点低下は、最大の低下が特有の濃度において観察されるまで、不凍成分が水溶液に添加されるに従って増大する。さらなる不凍化学薬品（例えば、エチレングリコール）の水溶液への添加は、不凍組成物の不溶性を生じるか、または混合液の凝固点を上昇させるように作用するかのいずれかである。一方、THP濃度の増加に伴う熱履歴の増大は、直線型ではなく双曲線型である。THP濃度の単位増加から生じるTHの増分増加は、THP可溶性の飽和点が接近するに従って、ますますより小さくなる。 THPタンパク質を有する溶液の凝固点は、氷晶核形成物を含む測定される試料が、硬い氷の塊になる温度として定義される。氷晶は、自発的に形成され得るか、または氷晶核形成物から拡大し得る。氷晶核形成物なしでの氷の硬い塊の自発的形成は、代表的にはTHPの「過冷却能」と呼ばれる。氷の形成過程を開始する氷晶核形成物の非存在のために、過冷却はずっと低い温度で起こり得る。目視的に氷晶形成を検査することに加えて、熱履歴アッセイは、溶液の凝固点と融点との間の違いを測定し得る。溶液の融点は、溶液中に１つの氷晶のみが残っている温度である（TH活性のより完全な記載については下記参照）。組換えタンパク質の状況における、句「外部に発現する」とは、タンパク質を合成し、そして細胞外マトリクスに方向付ける、形質転換細胞の能力をいう。細胞外マトリクスは、多細胞生物における細胞間の間質空間、細菌ブロス、または組織培養培地であり得る。細菌の場合、外部発現はまた、細菌のペリプラズムへの組換えタンパク質の発現を含み得る。外部発現は、任意の手段（例えば、分泌および輸送小胞、膜タンパク質としての発現、切断可能なシグナルペプチドの発現など）により得る。本発明の状況における、用語「相同性」、「配列同一性」、および「配列類似性」は、２つのペプチド配列が、例えばプログラムGAPまたはBESTFITによって、デフォルトギャップウェイトを用いて最適にアラインメントされた場合、少なくとも40％の配列同一性、好ましくは少なくとも50％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも60％の配列同一性を共有することを意味する。「アミノ酸配列同一性百分率」とは、最適にアラインメントされた場合に、ほぼ指定された百分率の同じアミノ酸を有する、２つのポリペプチドのアミノ酸配列の比較をいう。例えば、「60％配列同一性」および「60％相同性」とは、最適にアラインメントされた場合に、60％のアミノ酸同一性を有する、２つのポリペプチドのアミノ酸配列の比較をいう。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。例えば、類似の化学的特性（例えば、電荷または極性）を有するアミノ酸の置換が、タンパク質の特性に影響を与えそうでない。例は、グルタミンへのアスパラギンの置換、グルタミン酸へのアスパラギン酸への置換を含む。用語「免疫学的に反応性の条件」とは、抗体が抗原に結合し得る環境をいう。代表的には、これは免疫学的結合アッセイである。用語「単離された」は、核酸またはタンパク質に適用した場合、核酸またはタンパク質が天然状態では結合している他の細胞構成成分を本質的に含まないことを意味する。それは好ましくは均質な状態にあるが、乾燥状態または水溶液のいずれかであり得る。純度および均質性は、代表的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のような分析化学技法を用いて決定される。調製物に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離されたTHP遺伝子は、天然には遺伝子と隣接し、そしてTHP以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で本質的に１本のバンドを生じることを意味する。特に、それは核酸またはタンパク質が少なくとも8 ５％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、そして最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。用語「核酸分子」または「核酸配列」は、１本鎖または２本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーをいう。特に限定されない場合、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、そして天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を含む。他に示されない場合には、特定の核酸配列はまた、暗黙のうちに、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列ならびに明白に示される配列を含む。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することによって達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res．19:5081(1991)；Ohtsukaら、J．Biol．Chem ．260:2605-2608(1985)；Rossoliniら、Mol．Cell．Probes 8:91-98(1994)）。用語核酸は、遺伝子、cDNA、および遺伝子にコードされるmRNAと交換可能に用いられる。句「外因性核酸」は、一般的に、単離され、クローニングされ、そして連結され、または化学的に合成され、そして天然には結合されていない核酸に連結され、そして／またはその核酸またはタンパク質が代表的に天然に見出され得る細胞または細胞環境ではない細胞もしくは細胞環境中に、導入されるか、そして／または発現される核酸を意味する。この用語は、異なる生物またはその核酸が発現される細胞型以外の、細胞型からもともと得られる核酸、およびまたその核酸が発現される細胞株と同じ細胞株から得られる核酸の両方を含む。句「コードする核酸配列」とは、構造RNA（例えば、rRNA）、またはtRNA、あるいは特定のタンパク質もしくはペプチド、またはトランス作用調節因子の結合部位の一次アミノ酸配列をコードする、mRNAについての配列情報を含む核酸をいう。この句は、天然の配列、または特定の宿主細胞におけるコドン優先度に一致させるために導入され得る配列の縮重コドン（すなわち、単一のアミノ酸をコードする異なるコドン）を特異的に含む。用語「組換え手段」とは、タンパク質が単離され、ここでタンパク質をコードするcDNA配列が同定され、そして発現ベクターに挿入される技法をいう。次いでベクターは、細胞に導入され、そしてこの細胞はタンパク質を発現する。組換え手段はまた、異なる供給源からのコードDNAまたはプロモーターDNAの、融合タンパク質の発現、タンパク質の構成的発現、またはタンパク質の誘導性発現のための１つのベクターへの連結を含む。句「特異的または選択的に抗体に結合する」または「特異的に免疫反応性」は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合に、タンパク質の異種集団および他の生物製剤の存在下でタンパク質の存在の決定因である結合反応をいう。従って、示されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体が特定のタンパク質に結合し、そして試料中に存在する他のタンパク質には有意な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的な結合は、特定のタンパク質に対してその特異性について選択された抗体を必要とし得る。例えば、本発明のTHPに対して惹起された抗体、または配列番号４に示される部分コード配列に対して惹起された抗体は、全長タンパク質に特異的に免疫反応性であり、そしておそらく多型性改変体以外の他のタンパク質には免疫反応性でないように選択され得る。以下に記載されるように、種々のイムノアッセイ形式は、特定のタンパク質に特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ELISAイムノアッセイが、日常的に使用されてタンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択する。特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイの形式および条件の記載について、HarlowおよびLane（1988） ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New Yo rk（「Harlow & Lane」）を参照のこと。代表的には、特異的または選択的反応はバックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、そしてより代表的にはバックグラウンドの10〜100倍より多い。用語「特異的にハイブリダイズする」とは、標的配列が全細胞DNAまたはRNAの調製物に存在する場合に、特定の標的DNA配列または標的RNA配列にハイブリダイズするか、二量体形成するか、または結合する核酸プローブをいう。「相補性」または「標的」核酸配列は、核酸プローブに選択的にハイブリダイズする核酸配列をいう。適切なアニーリング条件は、例えば、プローブの長さ、塩基組成、およびミスマッチの数およびそれらのプローブ上の位置に依存し、そしてしばしば経験的に決定されなければならない。核酸プローブ設計およびアニーリング条件の議論については、例えば、SambrookまたはCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience，New Yor k（1987）(「Ausubel」)を参照のこと。核酸ハイブリダイゼーション実験（サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の状況における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、そして異なる実験パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範なガイドは、Tijssen（1993）LABORATORY TECH NIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES第I部第2章「Overview Of Principles Of Hybridization And The Strategy Of Nucleic Acid Probe Assays」，Elsevier，New Yorkに見出される。一般的に、高ストリンジェントハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列についての熱融解点（T_m）よりも約5℃低く選択される。T_mは、規定されたイオン強度およびpH下で、標的配列の50％が完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブについてのT_mに等しいように選択される。サザンブロットおよびノーザンブロットにおけるフィルター上に100より多い相補性残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、ヘパリンを含む50％ホルムアミドで42 ℃であり、一晩のハイブリダイゼーションが行われる。非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、0.15M NaClで、72℃で約15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、0.2×SSC洗浄で、65℃で15分間である（SSC緩衝液の記載については、Sambrook、前出を参照のこと）。しばしば、高いストリンジェンシーでの洗浄は、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低いストリンジェンシーでの洗浄のあとに行われる。（例えば、100ヌクレオチドより多い）二重鎖についての中程度のストリンジェンシーでの洗浄の例は、１×SSCで45℃、1 5分間である。（例えば、100ヌクレオチドより多い）二重鎖についての低いストリンジェンシーでの洗浄の例は、4〜6×SSCで40℃、15分間である。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける関連のないプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比の２倍（またはそれより多い）のシグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。核酸がコードするポリペプチドが実質的に同一である場合に、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸はなお、実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝コードによって許容される最大のコドンの縮重を使用して作製される場合に生じる。用語「熱履歴活性」または「TH活性」とは、氷を含有する溶液の凝固点および融点の間の温度差（℃）を変化させる能力をいう。好ましくは、TH活性は、Laws onおよびSemler（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9919(1991)）によって示された手順に従い、ナノリットル浸透圧計中の、氷晶形成の観察によって計測される。あるいは、TH活性は、deVries、METHODS IN ENZYMOLOGY、127巻、Packer(編) 、Academic Press、New York(1986)において記載される方法またはそのバリエーションに従って、決定され得る。例えば、本発明において、血リンパ由来のネイティブTenebrio molitor THP約 1mg/mLのTH活性は、約５℃より大きい。本発明の組換えTHP約1mg/mLのTH活性は、約５℃以下である。より好ましくは、TH活性は、約３℃よりも低い。最も好ましくは、TH活性は、1.5〜3℃の間である。ネイティブTHPと組換えTHPのTH活性の間の差は、細菌由来の組換えタンパク質のTHPの少なくとも一部の不完全なフォールディングに起因するとの仮説がたてられている。適切にフォールディングされる場合、組換えTHPのTH活性は、ネイティブTHPの活性と類似であることが予想される。ＩＩ．THPをコードする核酸Ａ．一般的技術本発明の核酸組成物（RNA、cDNA、ゲノムDNA、または遺伝的組換え体のハイブリッドのいずれか）は、天然の供給源から単離され得るか、またはインビトロにおいて合成され得る。請求の範囲の核酸は、形質転換細胞においてか、形質転換細胞溶解物においてか、または部分精製された形態においてか、または実質的に精製された形態において存在し得る。不凍タンパク質をコードする遺伝子の核酸操作技術（例えば、ライブラリーの作成、発現ベクターへのサブクローニング、プローブの標識化、ＤＮＡハイブリダイゼーションなど）は、一般的にSambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATO RY MANUAL（第2版）、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(1989)(「 Sambrook」)において記載され、これは本明細書において参考として援用される。核酸およびタンパク質は、本明細書において、当該分野において周知の任意の多数の手段によって検出および定量される。これらとしては、スペクトロメトリ、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ハイパーディフュージョンクロマトグラフィーなど、および種々の免疫学的方法（例えば、液体またはゲル沈降素反応、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイなど）のような分析的生化学的方法が挙げられる。サザン分析、ノザン分析、ゲル電気泳動、うな周知の方法によって進められる核酸の検出。Ｂ．THPをコードする核酸の単離全DNAまたはmRNAを単離する方法は、当業者にとって周知である。例えば、核酸を単離および精製する方法は、LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULA RBIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES、第1部、Theory and Nucleic Acid Preparation、P．Tijssen編、Elsevier，N.Y.(1993)(「Tijss en」）の第3章に詳述される。１．DNAライブラリーの調製およびスクリーニング本発明の不凍タンパク質をコードするDNA配列を単離するための種々の方法が存在する。例えば、DNAは、ゲノムまたはcDNAライブラリーから、本発明において開示される配列またはサブ配列（配列番号２または５）に対して相補的な配列を有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを使用して、単離され得る。そのようなプローブは直接ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、THPイソ型をコードするDNAを単離するために使用され得る。あるいはプローブは、PCRのような増幅技術における使用のために設計され得、そしてTHPをコードするDNAは、PCR のような方法を使用して単離され得る（下記を参照のこと）。 cDNAライブラリーを調製するために、mRNAは、Tenebrio幼虫(Carolina Biolog ical Supplyまたは地域のペットショップもしくはエサ屋)もしくは組織培養において増殖した胚細胞、幼虫細胞またはおそらく成体細胞より単離される。cDNAは、当該分野において周知の手順に従い、mRNAより逆転写され、そしてベクター中に挿入される。ベクターは、組換え宿主中に、増殖、スクリーニングおよびクローニングのためにトランスフェクトされる。cDNAライブラリーの作成およびスクリーニングのための方法は、周知である。GublerおよびHoffman、Gene 25:263(1 983)ならびにSambrookらを参照のこと。ゲノムライブラリーを作成するために、全DNAを昆虫細胞より、周知の方法によって抽出し（Sambrookらを参照のこと）、次に機械的にせん断するか、または酵素的に消化して、DNAフラグメント（例えば、約12〜20kbの）を得る。フラグメントは次に勾配遠心分離によって、所望されないサイズから分離され、そして、バクテリオファージλまたは他のベクター中に挿入される。これらのベクター（例えば、ファージ）は、インビトロにおいて、Sambrookらにおいて記載されるようにパッケージングされる。組換えファージは、BentonおよびDavis、Science 、196：180（1977）に記載されるようにプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、一般的に、GrunsteinらPro c．Natl．Acad．Sci．USA 72:3961(1975)において記載されるように行われる。 THPをコードするDNAは、cDNAまたはゲノムライブラリーのいずれかにおいて、例えば、配列番号２または５の核酸プローブとハイブリダイズする能力によって同定される。一旦同定されると、これらのDNA領域は、当業者に精通した標準的な方法によって単離される。あるいは、不凍タンパク質をコードするRNAは、ノザンブロットにおいて核酸プローブとハイブリダイズするその能力によって同定され得る。Sambrookらを参照のこと。プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、BeaucageおよびCarruthers によって最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル方法に従い、Ne edham-VanDevanterら（Nucleic Acids Res．12:6159(1984)）に記載されるように自動化合成機を用い、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、Pe arsonおよびRegnier（J．Chrom．255:137-149(1983)）に記載されるように、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換HPLCのいずれかによる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、MaxamおよびGilbert(Methods in Enzymolo gy，65:499(1980))の化学的分解方法を使用して確認され得る。当業者にとって公知の他の方法はまた、不凍タンパク質をコードするDNAを単離するために使用され得る。特定のタンパク質分子をコードするDNAの単離について使用され得る他の技術の記載は、SambrookおよびAusbelを参照のこと。２．THPをコードする核酸の増幅頻繁に、ハイブリダイゼーションおよびそれに続くサブクローニングの前に、核酸試料を増幅することが所望される。当業者は、どのような増幅方法が使用されようとも、定量的結果が所望される場合、増幅される核酸の相対的頻度を維持または制御する方法を使用するように注意が払われなければならないことを理解する。適切な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCRP ROTOCOLS、A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS、Innisら、Academic Press、Inc、N.Y.、( 1990)、(「Innis」))、リガーゼ連鎖反応（LCR）(WuおよびWallace、Genomics、 4:560(1989)、(「Wu」)、Landegrenら、Science、241：1077（1988）、（「Land egren」）およびBarringerら、Gene、89:117(1990)、(「Barringer」)；転写増幅(Kwohら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86.1173(1989)(「Kwoh」))；および、自己維持的配列複製（Guatelliら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1874(1990) ）(「Guatelli))が挙げられるが、これらに限定されない。上記の全ての方法は、不凍タンパク質をコードするDNAを調製するために使用され得る。PCR技術において、増幅されるべきDNA領域の2つの境界に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが、合成される。次に、ポリメラーゼ連鎖反応は、２つのプライマーを用いて行われる（Innisを参照のこと）。本発明において、反復モチーフの存在のために、増幅産物にコードされるTHP配列の長さは、使用される鋳型に依存する。NおよびC末端が独特であるために（すなわち、反復モチーフとは異なるヌクレオチド配列）、全長THPコード配列を増幅するために、配列番号６および７のプライマーが使用され得る。 PCRは、種々のプロトコールにおいて、THPの部分配列をコードする核酸を単離するために使用され得る。これらのプロトコールにおいて、THPの部分配列をコードするDNA配列を増幅するための適切なプライマーよびプローブは、本明細書において列挙されるDNA配列の分析から生成される。例えば、配列番号６、７，８、および９のオリゴヌクレオチドは、PCRプロトコールにおいて、THPをコードするDNAの領域を増幅するために使用され得る。一旦のそのような領域が、PCR増幅されると、これらは配列決定され得、そして、標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、得られた配列から調製され得る。これらのプローブは、次に、DNA ライブラリーから完全なTHPをコードするDNAを単離するために使用され得る。配列番号２および５は、天然に存在するTenebrio molitor THP cDNAのイソ型を表す。これらは完全なDNA遺伝子配列ではない。しかし、配列番号２または５の部分不凍剤の核酸配列は、当業者にとって周知の標準的な方法に従い完成され得る。好ましいDNA単離のアプローチは、RACEである。手短には、この技術は、ランダムな5'プライマーおよび規定された3'プライマー（5’RACE）、またはランダムな3'プライマーおよび規定された5'プライマー（3’RACE）を用いてcDNA 配列を増幅するために、PCRを用いることを含む。この増幅された配列は、次に、ベクターにサブクローン化され、ここで次に標準的な方法を用いて配列決定される。RACE法は、当業者に周知であり、そしてRACEを行うキットは、市販されている（例えば、5’RACE System、GIBCO BRL、Grand Island、New York、USA）。３．THPをコードするインサートの細菌へのクローニング上記のように、ゲノムDNAを調製およびスクリーニングするために、全DNAは断片化され、そしてバクテリオファージ中に挿入される。一旦、目的の不凍剤核酸配列を含むインサートが同定されると（PCR、ハイブリダイゼーションなどによる）、これらは、λファージベクターから切り出され、拡大のために細菌ベクターに挿入される。代表的には、適切な細菌ベクターは、当業者に公知であり、そして市販されている。最も適切なベクターは、使用するべき細菌、インサートのサイズ、目的のインサートを含有する細菌の検出方法および実施者の好みに依存し得る。インサートを含有するベクターを用いて形質転換された細菌のコロニーの同定を単純化するために、多くのベクターは、酵素（特にβガラクトシダーゼ）のコード配列内に位置する、制限酵素部位または他のスプライシング部位を有する。インサートがベクターの制限部位またはスプライス部位に首尾良く挿入された場合、コードされる酵素は不活化される。ベクターを用いる細菌の形質転換後（下記を参照のこと）、イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）(βガラクトシダーゼの基質)の存在下において増殖するコロニーは白く現れるが、インサートを取り込まなかった細菌由来のコロニーは、青く現れる。従って、インサートのベクターへのライゲーションの頻度が低い場合、多くのインサートを含まないコロニーに対して、インサートを含む数個のコロニーを選び得る。次にベクターは、Escherichia coliの改変体に導入される。外来DNAを細菌細胞に導入するために使用される方法は、当業者にとって公知であるが、最も頻繁に使用されるものは、エレクトロポーレーションおよびコンピテント細胞の熱ショックである。最も代表的には、コンピテントE．coliは、市販されている（例えば、Invitrogen、San Diego、CAより）。あるいは、細菌は、当該分野において周知の技術によって、コンピテントとされて、外来DNAを取り込み得る（例えば、Sambrookらを参照のこと）。目的のインサートを含むベクターを細菌に導入するために、コンピテント細菌は、熱ショックプロセスを受ける。手短には、細菌は、氷水浴中に保たれ、そしてDNAが添加された後、細菌の温度は40〜50℃に上昇される（好ましくは42℃）。細菌は、氷浴にもどされ、次に培養される。DN Aを細菌に導入するより詳細な記載について、Sambrookらを参照のこと（これは、本明細書において参考として援用される）。細菌培養物は、増殖され、次にアガー上にプレートされる。代表的には、ベクターは、形質転換細菌に抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードする。従って，ベクターを取り込んだ細菌は、生存して、抗生物質の染みこんだアガープレートにおいてコロニーを形成する。生存コロニーは、ブロスをインキュベートし、そして形質転換した細胞の大規模培養物へと拡大するために使用され得る。プラスミドおよび他のベクターは、細菌溶解物から、当該分野で周知の方法によって精製され得る。多くの市販業者は、小環状DNA（プラスミド）を総細菌DNA から精製するためのキットを販売する。これらのキットは、簡便に使用され、そして製造業者の説明書に従うことにより、収量は通常高い。４．THP DNAの配列決定新規に単離されたDNAの配列決定は、本発明のTHP核酸を同定して、特徴付ける。この核酸はTHP種または対立遺伝子改変体、本発明の不凍タンパク質をコードする。タンパク質が、配列番号６および配列番号７によって同定されるTenebrio molitor THPに対して、少なくとも60％アミノ酸配列同一性を有する場合、タンパク質は、THPタンパク質のイソ型であると考慮され得る。 THPコード配列は、配列決定され得るが、それらはまだベクター中のインサートとして存在するか、またはベクターから放出され単離されたインサートとして存在する。THPをコードするインサートは、制限酵素によってベクターから不出放出され得るか、またはPCRによって増幅され得る。どのインサートが不凍剤全長コード配列を含むのか見出すためのインサートの配列決定のために、N末端またはC末端に基づくプライマー（例えば、配列番号８および配列番号９）、あるいは最初のλファージにおける挿入部位は、プライマーとして使用され得る。最も好ましくは、さらなるプライマーは、重複する配列を提供するために合成され al）。しかし、他のキットおよび方法は、利用可能であり、そして当業者にとって公知である。上記の細菌クローニングに代えて、cDNAライブラリー由来のポジティブλファージプラークが、ヘルパーファージ（例えば、R408(Stratagene)）を用いるインビボ切り出しに供され得る。2本鎖DNAは、次に精製され、そして配列決定され得るか、またはλファージ由来のプライマーを用いてPCRによって増幅され得る。Ｃ．核酸ハイブリダイゼーション技術本明細書において開示するハイブリダイゼーション技術は、本発明の不凍タンパク質（異なるＴＨＰ種および対立遺伝子改変体を含む）をコードする遺伝子および遺伝子産物（すなわち、mRNA）を同定、単離、および特徴付けするために使用され得る。核酸ハイブリダイズ技術を用いる特異的DNAおよびRNA測定のための種々の方法は、当業者にとって公知である。NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION、A PRACTICAL A PPROACH、Hames，B.D.およびHiggins,S.J.編、IRL Press、1985；GallおよびPar due、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 63:378(1969)；Johnら、Nature 223:582(196 9)；およびSambrookらを参照のこと。ハイブリダイゼーション様式の選択は、重要ではない。例えば、サンプル中の不凍タンパク質をコードするDNAの存在または不存在を評価する１つの方法は、サザン転写を含む。手短には、消化されたゲノムDNAは、緩衝液中のアガローススラブゲル上を泳動して、そして膜に転写される。ハイブリダイゼーションは核酸プローブを使用して行われる。本発明THPのために、核酸プローブは、タンパク質のクラス中で保存された核酸配列に基づいて設計され得る。好ましくは、核酸プローブは、20塩基以上の長さである。(Sambrookら、核酸ハイブリダイゼーションにおける使用のための核酸プローブ配列の選択の方法について、を参照のこと）。本発明において、好ましいプローブは、配列番号２または５または任意のイソ型のコード領域全体として同定される配列である。ハイブリダイズした部分の可視化は、不凍タンパク質をコードするDNAの存在または不存在の定量的決定を可能にする。同様に、ノザン転写は、不凍タンパク質をコードするmRNAの検出のために使用され得る。手短には、mRNAは、所定の細胞サンプルから、種々の抽出方法の１つ（例えば、酸グアニジニウム-フェノール-クロロホルム）を用いて単離される。次にmRNAは、電気泳動され、mRNA種を分離し、そしてmRNAはゲルから膜に転写される。サザン転写の場合のように、標識化プローブは、THP mRNAの存在または不存在を同定するために使用される。サンドイッチアッセイは、核酸配列の検出および単離のための商業的に有用なハイブリダイゼーションアッセイである。そのようなアッセイは、固相に共有結合的に固定化された「捕獲」核酸、および溶液中の標識された「シグナル」核酸を使用する。臨床サンプルは、標的核酸を提供する。「捕獲」核酸および「シグナル」核酸プローブは、標的核酸とハイブリダイズして「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。効果的であるために、シグナル核酸は、捕獲核酸とハイブリダイズし得ない。代表的には、標識化シグナル核酸は、ハイブリダイゼーションを検出するために使用される。相補的核酸またはシグナル核酸は、いくつかの方法のいずれかで標識され、代表的には、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得る。最も一般的な検出方法は、³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、または³² P標識プローブ等を用いるオートラジオグラフィーまたはオートフルオログラフィーの使用である。他の標識としては、標識化抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識リガンドについての特異的結合対メンバーとして作用し得る抗体が挙げられる。次に、検出は、使用した標識に依存する。ハイブリダイゼーション複合体の検出は、シグナルを生成する複合体が、標的ポリヌクレオチドもしくは核酸とプローブポリヌクレオチドもしくは核酸との二本鎖へ結合することを必要とし得る。代表的には、このような結合は、リガンド結合体化プローブと、シグナルと結合体化した抗リガンドとの間のようなリガンドおよび抗リガンド相互作用を介して生じる。標識はまた、ハイブリダイゼーション複合体の間接的検出を可能にし得る。例えば、標識がハプテンまたは抗原である場合、サンプルは、抗体を使用して検出され得る。これらの系において、シグナルは、蛍光分子もしくは酵素分子を抗体に結合させることによって、またはいくつかの場合には、放射性標識に結合させることによって（Tijssenを参照のこと）生成される。ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増幅する核酸増幅系の使用により増強され得る。分子プローブとして使用するための、またはその後のサブクローニングのための核酸フラグメントを生成するための、配列の増幅に適したインビトロ増幅技術は、公知である。このようなインビトロ増幅法（PCR、LCR、Qβレプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼ媒介技術（例えば、NASBA^TM）を含む）を介して当業者を導くために十分な技術の例は、Berge r、Sambrook、およびAusubel、ならびにMullisら、米国特許第4,683,202号；Arn heim&Levison、C&EN 36(1990);Lomellら、J．Clin．Chem.，35:1826(1989);Van Brunt，Biotechnology 8:291-294(1990);Wu & Wallace，Gene 4:560(1989);Sook nanan & Malek，Biotechnology 13:563(1995);Innis;Kwoh;Guatelli;Landegren; およびBarringerに見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改善された方法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載される。当該分野で最近記載された他の方法は、核酸配列に基づく増幅（NASBA^TM、Cangene，Mi ssissauga，Ontario）およびQβレプリカーゼ系である。これらの系は、変異体を直接同定するために使用され得、そこではPCRまたはLCRプライマーが、選択された配列が存在する場合にのみ、延長または連結されるように設計されている。あるいは、選択された配列は、一般に、例えば、非特異的PCRプライマーを使用して増幅され得、そしてその増幅された標的領域は、変異の指標である特異的配列について後にプローブされる。プローブとして使用（例えば、インビトロ増幅法において、診断法における遺伝子プローブとして、またはインヒビター成分として（以下を参照のこと））するためのオリゴヌクレオチドは、代表的には、BeaucageおよびCaruthersによって記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って、例えば、Needha m-VanDevanterに記載されるような自動化合成機を使用して化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、必要であれば、代表的には、天然のアクリルアミドゲル電気泳動によって、またはPearson&Regnierに記載されるような陰イオン交換HPLCによって行われる。台成オリゴヌクレオチドの配列は、Maxam & Gilb ertの化学分解法を使用して確認され得る。核酸ハイブリダイゼーションアッセイもまた、アレイに基づくフォーマットで行われ得ることが理解される。このアプローチにおいて、多重の異なる「プローブ」核酸を有するアレイは、標的核酸に対してハイブリダイズされる。この様式で、多数の異なるハイブリダイゼーション反応が、本質的に「並行に」行われ得る。これは、非常に多数の反応物質の迅速な、本質的に同時の評価を提供する。アレイに基づく形式でハイブリダイゼーション反応を行う方法は、当業者に周知である（例えば、Jacksonら、Nature Biotechnology 14:1685(1996)、およびChe eら、Science 274:610(1995)を参照のこと）。タンパク質をコードする遺伝子の発現のレベルを決定するための代替の手段は、インサイチュハイブリダイゼーションである。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知であり、そしてAngererら、Methods Enzymol.，152:649 （1987）に一般的に記載される。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞または組織は、固体支持体、代表的にはガラススライド、に固定される。DNAがプローブされる場合、細胞は、熱またはアルカリで変性される。次いで、細胞は、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを可能にするような温和な温度で、ハイブリダイゼーション溶液と接触させられる。プローブは、好ましくは、ラジオアイソトープまたは蛍光レポーターで標識されている。Ｄ．ＴＨＰの発現不凍タンパク質遺伝子のコード領域が同定された後で、天然の、または合成の不凍剤コード核酸の発現が、不凍タンパク質遺伝子のコード領域をプロモーター（これは、構成性または誘導性のいずれかである）に作動可能に連結し、構築物を発現ベクター中に組み込み、そしてベクターを適切な宿主細胞中に導入することによって達成され得る。代表的なベクターは、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、転写開始配列および翻訳開始配列、ならびに特定の核酸の発現の調節のために有用なプロモーターを含む。ベクターは、必要に応じて、少なくとも１つの独立したターミネーター配列を含む一般的な発現カセット、真核生物もしくは原核生物、またはその両方（例えば、シャトルベクター）においてカセットの複製を可能にする配列、ならびに原核生物系および真核生物系の両方についての選択マーカーを含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または好ましくはその両方における複製および組込みのために適切である。Giliman&Smith，Gen e 8:81(1979);Robertsら、Nature 328:731(1987);Berger & Kimmel，GUIDE TO M OLECULAR CLONING TECHNIQUES，METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol 152，Academ ic Press，Inc.，San Diego，CA(「Berger」)；Schneiderら、Protein Expr．Pu rif．6435:10(1995);SambrookおよびAusubelを参照のこと。生物学的試薬および実験装置の製造業者からの製品情報もまた、公知の生物学的方法において有用な情報を提供する。このような製造業者には、SIGMA chemical company(Saint Lou is，MO)，R&D systems(Minneapolis，MN)，Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ) ，CLONTECH Laboratories，Inc．(Palo Alto，CA)，Aldrich Chemical Company( Milwaukee，WI)，GIBCO BRL Life Technologies，Inc．(Galthersburg，MD)，Fl uka Chemical-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、およびApplied Biosystems(Forster City，CA)、ならびに当業者に公知の多くのその他の商業的供給元が含まれる。本発明の方法において使用される核酸（例えば、プロモーターおよびベクター）は、天然の供給源から単離され得るか、ATCCもしくはGenBankライブラリーのような供給源から得られ得るか、または合成方法によって調製され得る。合成核酸は、種々の液相および固相法によって、調製され得る。亜リン酸トリエステル、ホスホトリエステル、およびH-ホスホネート化学による核酸の固相合成のための手順の詳細な説明は、広範に利用可能である。例えば、Itakura、米国特許第4 ,401,796号；Carruthersら、米国特許第4,458,066号および同第4,500,707号；Be aucage&Carruthers；Matteucci;Carruthersら、Genetic Engineering 4:1(1982) ;Jones，第2章，Atkinsonら、第3章、およびSproatら、第4章、OLIGON UCLEOTID E SYNTHESIS:A PRACTICAL APPROACH，Gait(編)、IRL Press，Washing ton D．C ．(1984);Froehlerら、Tetrahedron Lett．27:469(1986);Froehler ら、Nucleic Acids Res．14:5399(1986);Sinhaら、Tetrahedron Lett．24:5843(1983);およびSinhaら、Nucl．Acids．Res．12:4539-4557（1984）(これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。核酸を細菌細胞中に導入する周知の方法はいくつか存在し、これらのいずれも本発明において使用され得る（Sambrookらを参照のこと）。これらには、レシピエントの細胞を、DNA、DEAEデキストランを含む細菌のプロトプラストと融合させること、ウイルスベクターを用いる感染などが含まれ得る。核酸の細菌宿主へのインビトロ送達は、培養において増殖する任意の細胞に対してであり得る。細胞と遺伝子操作された核酸構築物との間の接触は、インビトロで行われた場合、生物学的に適合性の培地において行われる。核酸の濃度は、特定の適用に依存して広範に変化するが、一般に、約１μMと約10mMとの間である。核酸での細胞の処置は、一般に、生理学的な温度（約37℃）で、約１〜48時間の時間に、好ましくは約２〜４時間の時間に行われる。外因性の核酸を発現するために使用され得る細菌株には、Escherichia coli、 Streptococcus cremoria、Streptococcus lactis、Streptococcus thermophillu s、Leuconostc citrovorum、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacilus acidop hilus、Lactobacillus lactis、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium br eve、およびBifidobacterium longumが含まれる。細菌発現系に加えて、本発明のTHPは、他の系、特に酵母およびバキュロウイルスにおいて発現され得るが、哺乳動物および植物においてもまた発現され得る。系は、他の系で成功しなかったこと、THPを適切に折り畳む能力、およびTHPの最終的な使用に依存して使用される。例えば、THPを、パン生地粉酵母（bread d ough yeast）を凍結から保護するために使用する場合（米国特許第5,118,792号を参照のこと）、酵母系が使用される。外因性の核酸を発現するために使用され得る酵母株には、Torulopsis holmil、Saccharomyces fragilis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces lactis、およびCandida pseudotropicalisが含まれる。凝固温度を通して生存し得る植物が所望される場合、トランスジェニック技術が、トランスジェニック植物を作製するために使用され得る。さらに、以下に記載されるように、動物（昆虫、魚類、および甲殻類を含む）におけるTHPについての用途が存在し得る。しかし、当然に、使用される系は、THPに、Tenebri o幼虫において見出された活性に匹敵する熱履歴活性を与えるべきである。代替の発現系の例として、国際公開第WO96/11586号（米国特許出願第08/321,9 91号、1994年10月12日出願）（これは、本明細書中で参考として援用される）は、発酵した冷凍食品（特に冷凍ヨーグルト）における氷の再結晶化を防止するためにAFPを分泌する、魚AFP形質転換Lactobacillus bulgaricusおよびStreptococ cus thermophilusの使用を記載する。１．組換えベクターの調製単離された配列を上記の技術において使用するために、細胞の形質転換に適切である組換えDNAベクターが調製される。広範な種々の動物および植物細胞を形質転換するための技術は、周知であり、そして技術的および科学的文献に記載される。例えば、植物細胞については、Weisingら、Ann．Rev．Genet．22:421(198 8)を、そして動物および細菌細胞についてはSambrookを参照のこと。所望の不凍タンパク質をコードするDNA配列、例えば、全長THPをコードするcD NA配列は、好ましくは、トランスジェニック高等生物の細胞または意図された組織中の遺伝子からの配列の転写を指向する転写開始調節配列および翻訳開始調節配列と組み合わされる。プロモーターおよびエンハンサーのような広範な種々の周知の転写調節エレメントはまた、本発明のTHPを発現するように選択されたベクターに含められ得る。その天然の状態において本発明のTHPを指向するプロモーターは、本明細書中に記載される不凍タンパク質遺伝子に対応するゲノムクローンの５’配列を分析することによって同定され得る。プロモーター配列に特徴的な配列は、プロモーターを同定するために使用され得る。真核生物遺伝子発現を制御する配列は、広範に研究されている。例えば、プロモーター配列エレメントは、転写開始部位の上流の通常20〜30塩基対に存在するTATAボックスコンセンサス配列（TATAAT）を含む。ほとんどの場合、TATAボックスは、正確な転写開始のために必要とされる。本発明の組換え発現カセットの構築において、本発明のTHPに関連するか、またはTHPに対して異種であるかのいずれかのプロモーターフラグメントが利用され得、それはトランスジェニック生物の全ての組織において遺伝子の発現を指向する。このようなプロモーターは、本明細書において、「構成性」プロモーターと呼ばれ、そして発生または細胞分化のほとんどの環境条件および状態の下で活性である。植物の構成性プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス (CaMV)35S転写開始領域、Agrobacterium tumafaciensのT-DNAに由来する1'または2'−プロモーター、ならびに当業者に公知の種々の植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が含まれる。あるいは、プロモーターは、特定の組織において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向し得（組織特異的プロモーター）るか、またはそうでなければより厳密な環境制御の下にあり得る（誘導性プロモーター）。発生制御の下にある組織特異的植物プロモーターの例には、特定の組織（例えば、果実、種子、または花）においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。トマト由来の組織特異的E8プロモーターは、所望の遺伝子産物が果実に位置するように、遺伝子発現を指向させるために特に有用である。他の適切なプロモーターには、胚貯蔵（embr yonic storage）タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターによる転写をもたらし得る環境条件の例には、嫌気性条件、上昇した温度、または光の存在が含まれる。適切なポリペプチド発現が所望される場合、コード領域の３’末端のポリアデニル化領域が含まれるべきである。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子に、種々の他の植物遺伝子に、またはT-DNAに由来し得る。本発明の遺伝子に由来する配列（例えば、プロモーターまたはコード領域）を含むベクターは、代表的には、形質転換した細胞に選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含む。例えば、マーカーは、抗生物質耐性、特に、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、またはハイグロマイシンに対する耐性をコードし得る。植物は、ウイルスベクター（例えば、タバコモザイクウイルスのような）を使用して、本発明のTHPタンパク質を発現するように形質転換され得る。ベクターの選択および構築、ならびに広範な種々の植物細胞を形質転換するための技術は、周知であり、例えば、Hamamotoら、米国特許第5,618,699号を参照のこと。２．トランスジェニック生物の産生本発明のDNA構築物は、種々の従来的な技術によって宿主のゲノム中に導入され得る。例えば、植物において、DNA構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよび微量注入のような技術を使用して植物細胞のゲノムDN A中に直接導入され得るか、またはDNA構築物は、DNA微粒子銃のような衝撃法を使用して植物組織に直接導入され得る。上記のように、本発明のTHP配列を含有するタバコモザイクウイルスのような植物ウイルスベクターは、植物を接種するために使用され得る。あるいは、DNA構築物は、適切なT-DNA隣接領域と組み合わされ得、そして従来のAgrobacterium tumefaciens宿主ベクター中に導入され得る。Agrobacterium tumeraciens宿主の病原性機能は、細胞が細菌に感染した場合、構築物および隣接するマ一カーの植物細胞DNA中への挿入を指向する。 Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換技術（武装解除（disarming）およびバイナリーベクターの使用を含む）は、科学的文献に十分に記載されている。例えば、Horschら、Science 233:496(1984)、およびFraleyら、Proc．Nat'l．Acad ．Sci．USA 80:4803(1983)を参照のこと。上記の形質転換技術のいずれかによって誘導された形質転換植物細胞は、培養されて、形質転換遺伝子型（従って、凍結に対する増大した耐性のような所望の表現型）を有する植物全体を再生することができる。本発明の形質転換植物はまた、実質的な量の不凍タンパク質を発現するための「生きた工場」として利用され得る。このような植物再生技術は、組織培養増殖培地における特定の植物ホルモンの操作に依存し、代表的には、所望のヌクレオチド配列とともに導入される殺生剤および／または除草剤マーカーに依存する。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evansら、PROTOPLASTS ISOLATION AND CULTURE，HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURE，124-176頁，Macmillian Publishing Company，New York， 1983;およびBinding，REGENERATION OF PLANTS，PLANT PROTOPLASTS、21-73，CR C Press，Boca Raton，1985に記載される。再生はまた、植物のカルス、外稙片、器官またはその部分から得られ得る。このような再生技術は、Kleeら、Ann．R ev．of Plant Phys．38:467(1987)に、一般的に記載される。トランスジェニック植物または動物（例えば、海水魚）を産生するために、微量注入技術が、当該分野で公知であり、そして科学的文献および特許文献に十分に記載されている。ポリエチレングリコール沈降を使用しての、DNA構築物の細胞中への導入は、Paszkowskiら、EMBO J．3.2717(1984)に記載される。エレクトロポレーション技術は、Frommら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:5824(1985) に記載される。衝撃法形質転換技術は、Kleinら、Nature 327:70(1987)に記載される。 III．本発明のTHPのクラスの検出および特徴付け以下に記載するアッセイによって、本発明のTHPは、最終幼虫齢Tenebrio moli tor血液リンパから単離された熱履歴タンパク質と特徴を共有する。これらのアッセイを使用して、他の新規のTHPが、本発明の範囲に入るのに十分なほど、プロトタイプタンパク質YL-1からYL-4に関連するか否かを規定する。アッセイはまた、細菌ブロス、組織培養液、ならびに植物および動物組織中に存在するTHPを検出および定量するために使用され得る。Ａ．THPの検出発現されたTHPは、種々の方法によって検出または定量され得る。好ましい方法は、機能的活性アッセイおよび特異的抗体を利用する免疫学的アッセイの使用を包含する。１．抗体ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。例えば、Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene ，NY．(1991);Stitesら（編）BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY（第７版）Lange Medical Publications，Los Altos，CAおよびそこで引用される文献（「Sites」）Goding，MONOCLINAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE（第2版）Academic Press，New York，NY(1986);Kohler & Milstein，Nature 256:495(1975);およびHaHowおよびLaneを参照のこと。このような技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製が含まれる。Huseら、Science 246:1275（1989）(「Huse」）；およびWardら、Nat ure 341:544（1989）を参照のこと。例えば、免疫親和性精製における使用のための抗体を大量に産生するために、多数の免疫原が使用され得る。Tenebrio molitor由来、または本発明に記載される形質転換細胞に由来するTHPは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のための好ましい免疫原である。他の生物に由来する天然に存在する不凍タンパク質はまた、純粋なまたは不純な形態のいずれかにおいて使用され得る。本明細書中に記載される不凍タンパク質配列のフラグメントを使用して作製された合成ペプチドはまた、そのタンパク質に対する抗体の産生のための免疫原として使用され得る。ペプチドは、単独で、または別の組成物と結合体化して使用され得る。ポリクローナル抗体の産生の方法は、当業者にとって公知である。簡単には、免疫原は、上記のようにアジュバントと混合され、動物が免疫化される。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験出血を採取し、そして免疫原に対する反応性の力価を決定することによってモニターされる。免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られた場合、動物から血液を採取し、そして抗血清を調製する。タンパク質に反応性である抗体を富化するために、所望であれば、抗血清のさらなる画分化をし得る。（HarlowおよびLane、前出を参照のこと。）免疫親和性精製またはイムノアッセイに使用するための大量のモノクローナル抗体は、当業者に慣用的な種々の技術によって得られ得る。簡単には、所望の不凍タンパク質で免疫した動物由来の脾臓細胞を、一般的にはミエローマ細胞との融合によって不死化する（Kohler & Milstein，Eur．J．Immunol．6:511（1976 ）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。不死化の代替の方法には、エプスタインバーウイルス、ガン遺伝子、レトロウイルス、または当該分野で周知の他の方法での形質転換が含まれる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、THPに対する所望の特異性および親和性を有する抗体の産生についてスクリーニングされる。このような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の生成は、種々の技術によって増強され得る。この技術としては、脊椎動物宿主の腹腔への注入が挙げられる。あるいは、当業者は、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするDNA配列を、Huseに概説される一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。 THPの濃度は、種々の免疫アッセイ法によって測定され得る。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順一般の総説については、Stitesを参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、ENZYME IMMUNOASSAY，E．T．Maggio編、CRC．Press ，Boca Raton，Florida(1980);Tijssen;ならびにHarlowおよびLaneに広範に総説される（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）任意のいくつかの構成において行われ得る。例えば、不凍タンパク質についてのイムノアッセイにおける使用のための抗血清を産生するために、YL-1、YL-2、YL-3、YL-4、またはそのフラグメントが、本明細書中に記載されるように単離される。マウスまたはウサギの近交系を、上記の不凍剤イソ型または配列番号４のポリペプチドを用いて、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）および標準的な免疫化プロトコルを使用して、免疫化する。あるいは、本明細書中で開示される配列に由来し、そしてキャリアタンパク質と結合体化した合成ペプチドが免疫原として使用され得る。ポリクローナル血清が回収され、そしてイムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定したTHPを用いる固相イムノアッセイ）においてTHPに対して力価測定される。 10⁴M^-1以上のK_aを有するポリクローナル血清が選択され、他の生物由来の相同タンパク質および／または非不凍タンパク質に対するその交差反応性について、競合結合イムノアッセイを使用して試験される。特異的モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体および抗血清は、通常、少なくとも約0.1mM、より通常には少なくとも約１μM、好ましくは少なくとも約0.1μM以下、そして最も好ましくは0.01μM以下のK_Dで結合する。２．免疫学的結合アッセイ好ましくは実施態様において、THPは、任意の多くの十分に認知されている免疫学的結合アッセイを使用して検出および／または定量される（例えば、米国特許第4,366,241号；同第4,376,110号；同第4,517,288号；および同第4,837,168号を参照のこと）。一般的なイムノアッセイの総説については、METHODS IN CELL BIOLOGY第37版：Antibodies in Cell Biology，Asai編、Academic Press，Inc. ，New York(1993);およびStitesもまた参照のこと。免疫学的結合アッセイ（またはイムノアッセイ）は、分析物（本発明の場合、THPまたはそのフラグメント）に特異的に結合し、そしてしばしば固定化するために、代表的には、「捕捉剤」を利用する。捕捉剤は、分析物に特異的に結合する部分である。好ましい実施態様において、捕捉剤は、THPに特異的に結合する抗体である。抗体（抗THP）は、当業者に周知の多くの手段のいずれかによって、そして上記のように産生され得る。イムノアッセイはまた、捕捉剤と分析物とで形成された結合複合体に特異的に結合し、そして標識するために標識化剤をしばしば利用する。標識剤は、それ自体、抗体／分析物複合体を含む部分の１つであり得る。従って、標識剤は、標識されたTHPポリペプチドまたは標識された抗THP抗体であり得る。あるいは、標識化剤は、抗体／THP複合体に特異的に結合する別の抗体のような第３の部分であり得る。好ましい実施態様では、標識化剤は、標識を有する第二のTHP抗体である。あるいは、第二のTHP抗体は標識を欠き得るが、しかし、順に、第二の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識化された第三の抗体によって結合され得る。第二の抗体は、検出可能部分（例えば、ビオチン）で修飾され得る。この検出可能部分には、第三の標識化分子（例えば、酵素標識化ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る。免疫グロブリン定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）はまた、標識剤として使用され得る。これらのタンパク質は、連鎖球菌細菌の細胞壁の通常の構成要素である。これらは、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫反応性を示す（一般に、Kronval ら、J．Immunol．111:1401-1406(1973)、およびAkerstromら、J．Immunol．135: 2589-2542(1985)を参照のこと）。アッセイを通じて、インキュベーションおよび／または洗浄工程は、それぞれ試薬を組み合わせた後に必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒から数時間まで、好ましくは、約５分から約24時間まで、変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ形式、分析物、溶液容積、濃度などに依存する。通常、アッセイは、室温で行われるが、ある範囲の温度（例えば、４℃から 40℃）にわたって実施され得る。ａ．非競合的アッセイ形式 THPを検出するための免疫アッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合的免疫アッセイは、捕捉分析物（この場合、THP）の量が直接的に測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、例えば、捕捉剤（抗THP抗体）が、それらが固定化された固体基材に直接的に結合され得る。これらの固定化抗体は、次いで、試験サンプルに存在するタンパク質を捕捉する。このように固定化されたTHPが、次いで、標識化剤（例えば、標識を有する第二のTHP抗体）によって結合される。あるいは、第二のTHP抗体は、標識を欠き得るが、しかし、順に、第二の抗体が由来する種の抗体に特異的な標識化された第三の抗体によって結合され得る。第二の抗体は、検出可能部分（例えば、ビオチン）で修飾され得る。この検出可能部分には、第三の標識化分子（例えば、酵素標識化ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る。ｂ．競合的アッセイ形式競合的アッセイでは、サンプルに存在する分析物（THP）の量は、サンプルに存在する分析物によって捕捉剤（抗THP抗体）から置換された（または競合して取り除かれた）、添加された（外因性）分析物（THP）の量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイでは、既知量の、この場合、 THPをサンプルに添加し、次いでこのサンプルを捕捉剤、この場合、THPに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体に結合されたTHPの量は、サンプルに存在するTHPの濃度に反比例する。特に好ましい実施態様では、抗体は、固体基材上に固定化される。抗体に結合されたTHPの量は、THP／抗体複合体に存在するTHPの量を測定すること、または代わりに残存する非複合体化THPの量を測定することのいずれかによって、決定され得る。THPの量は、標識化THP分子を提供することによって検出され得る。ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合的アッセイである。このアッセイでは、既知の分析物（この場合、THP）を、固体基材に固定化する。既知量の抗T HP抗体をサンプルに添加し、次いで、サンプルを固定化THPと接触させる。この場合、固定化THPに結合された抗THP抗体の量は、サンプルに存在するTHPの量に反比例する。再度、固定化抗体の量は、抗体の固定化画分または溶液中に残存する抗体の画分のいずれかを検出することによって検出され得る。検出は、抗体が標識化されている場合直接的であり得、または上記のように抗体に特異的に結合する標識化部分を続いて添加することによって間接的であり得る。競合的結合形式での免疫アッセイは、当業者が、新規なTHPが、本発明の請求の範囲に入るように、本願発明のTHPに十分に関連しているかどうかを決定するために、交差反応性決定のために用いられ得る。例えば、配列番号４のTHPフラグメントを、固体基材に固定化され得る。タンパク質を、抗血清の固定化抗原への結合と競合するアッセイに添加する。タンパク質が固定化THPへの抗血清の結合と競合する能力を、固体支持体をコートするために使用されるような同じTHP による結合と比較する。上記タンパク質についての交差反応性％を標準的な計算を用いて算定する。配列番号４のTHPと約10％未満の交差反応性を有するこれらの抗血清を選択し、そしてプールする。必要に応じて、交差反応性抗体を、プールされた抗血清から、上記タンパク質を用いる免疫吸着によって取り除く。免疫吸着され、プールされた抗血清は、第二のタンパク質が本発明の不凍タンパク質であるか否かを分析するために、上記のように、競合的結合免疫アッセイにおいて使用され得る。競合的結合免疫アッセイにおいて、抗血清を発達させるために使用されるタンパク質、すなわち、免疫原は、抗体結合反応において、第二の特徴づけされていないタンパク質またはペプチドと競合する。２つのタンパク質は広範な濃度でそれぞれアッセイされ、そして固定化タンパク質への抗血清の結合の50％を阻害するのに必要とされる各タンパク質の量が決定される。必要とされる第二のタンパク質の量が、必要とされる特徴付けられた免疫原（例えば、配列番号２、配列番号４、またはそれらの免疫原性フラグメント）の量の10倍未満である場合、第二のタンパク質は、その特徴付けられた（不凍タンパク質）免疫原に対して生成された抗体に特異的に結合するといわれる。ｃ．他のアッセイ形式ウエスタンブロット（免疫ブロット）分析は、サンプル中の不凍タンパク質の存在を検出および定量するために使用され得る。技術は、一般的に、分子量に基づいてゲル電気泳動によりサンプルタンパク質を分離する工程、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に転写する工程、およびサンプルをTHPに特異的に結合する抗体とインキュベートする工程を包含する。抗THP抗体は、固体支持体上でTHPに特異的に結合する。これらの抗体は、直接的に標識化され得るか、または代わりに、抗不凍タンパク質に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化ヒツジ抗マウス抗体）を用いて続いて検出され得る。本明細書で請求されているタンパク質のクラスの新規な形態を同定するための核酸プローブを用いることに加えて、発現ライブラリーをプローブするために、抗体を使用することが可能である。これは、周知の技術である（YoungおよびDav is、Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 80:1194(1982)を参照のこと）。一般に、cDNA 発現ライブラリーは市販のキットから、または容易に利用可能な成分を用いて調製され得る。ファージベクターは好ましいが、しかし、種々の他のベクターがタンパク質の発現のために利用可能である。このようなベクターは、酵母、動物細胞およびXenopus卵母細胞を包含するが、これらに限定されない。当業者は、標的タンパク質に富む供給源からmRNAを選択し、そして次いでベクターに連結され、免疫スクリーニングのためにライブラリー宿主細胞に形質転換され得るcDNAを作製する。スクリーニングは、細胞上で特異的タンパク質に結合されたか、または固体支持体（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）上に固定化された抗体の結合および可視化を包含する。ポジティブクローンは、均一までの精製について選択され、そして単離されたcDNAは、次いで、所望の宿主細胞における発現のために調製される。この技術の良好な一般的な概説は、Methods of Cell Bi ology、Vol．37「Andibodies in Cell Biology」Assai編、1993において見出され得る。本発明のTHP（システインが豊富であり、仮定では多くのジスルフィド架橋を含む）と同様のタンパク質に対して抗体が生成される場合、試験タンパク質は、選択的結合について十分に試験するために、必要に応じて変性され、そして、同様のサイズのタンパク質に対して試験タンパク質を測定することが最良であり得る。例えば、抗血清が、プロトタイプのTHPのフラグメントに対して生成されたとしても、プロトタイプの全長THPに対して全長THPを試験する。このことは試験を簡素化し、そして競合的免疫アッセイからの結果の決定においてコンフォメーションの問題および分子量／モル濃度を考慮する必要性を回避する。他のアッセイ形式は、リポソーム免疫アッセイ（LIA）（特定の分子（例えば、抗体）に結合し、そしてカプセル化試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する）を包含する。放出された化学物質は、次いで、標準的な技術に従って検出される（Monroeら、Amer．Clin．Prod．Rev．5:34(1986 )を参照のこと）。Ｂ．THPの精製本発明のポリペプチドは、種々の供給源（例えば、仮性血液リンパ（larval h emolymph）、組織培養培地、トランスジェニック植物および動物、酵母、および細菌）から、標準的な技術によって実質的に純粋に精製され得る。標準的な精製手順（硫酸アンモニウムのような物質を用いる選択的沈澱；カラムクロマトグラフィー、免疫精製方法などを包含する）については、例えば、Scopes，Protein Purification:Principles And Practice，Springer-Verlag:New York(1982)，米国特許第4,673,641号、Ausubel、およびSambrook（これらは全て本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。１．細菌培養物からのTHPの精製分泌タンパク質の場合、目的のタンパク質は、以下に詳述する細胞溶解方法の手段をとる必要がなく細菌が増殖しているブロスから単離され、そして精製され得る。２．細菌細胞質およびペリプラズムからのTHPの精製 E．coliにおけるTHPの発現後、タンパク質は、細菌のペリプラズム、細胞質、または封入体において見出され得る。細菌のペリプラズム画分は、当業者に公知の他の方法に加えて、冷浸透圧性ショックによって単離され得る（Ausubel、およびTrayerおよびBuckley、J．Biol．Chem．245(18):4842(1970)を参照のこと）。ペリプラズムおよび細胞質からタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成する。ペレットを、20％スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、そしてペレットを氷冷した５mM MgSO₄中に再懸濁し、そして約10分間、氷浴中に置く。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、保存する。あるいは、細菌を、音波処理によって溶解し得る。上清中に存在するタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離され得る。３．封入体の精製組換えタンパク質が形質転換細菌によって大量に発現される（代表的には、プロモーター誘導後）が；しかし、発現は構成性であり得る場合、タンパク質は、不溶性凝集体を形成し得る。凝集タンパク質（以降、封入体と称する）の精製は、細菌細胞の破壊（これは、ン性界面活性剤の緩衝液中のインキュベーションによるが、これに限定されない）による、封入体の抽出、分離、および／または精製を包含する。細胞懸濁液は、Polytronグラインダー（Brinkman Instruments，Westbury，N.Y.）を用いて破砕され得る。あるいは、細胞は、氷上で超音波処理され得る。細菌の溶解の代替方法は、AusubelおよびSambrookに記載され、そして当業者に明らかである。細胞懸濁液を遠心分離し、そして封入体を含有するペレットを緩衝液（例えば、非イオン性界面活性剤）中に再懸濁する。洗浄工程を繰り返して、できるだけ多くの細胞破砕片を取り除くことが必要とされ得る。残存する封入体ペレットは、適切な緩衝液（例えば、20mMリン酸ナトリウム、pH6.8、150mM NaCl）中に再懸濁され得る。他の適切な緩衝液は、当業者に明らかである。洗浄工程後、封入体を、DTTのような還元剤と共に、強い水素受容体および強い水素供与体の両方である溶媒（またはこれらの特性のそれぞれ１つを有する溶媒の組み合わせ）を添加することによって可溶化する。封入体を形成したタンパク質は、次いで、適合性の緩衝液を用いて希釈または透析することにより再生され得る。適切な溶媒は、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％（容量／容量基準）、および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）を包含するが、これらに限定されない。凝集体形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒（例えば、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、70％ギ酸）は、タンパク質の不可逆的な変性の可能性（これは、免疫原性および／または活性の損失を伴う）のために、本手順において使用するために不適切である。塩酸グアニジンおよび同様の薬剤が変性剤であるが、この変性は、不可逆的ではなく、そして再生は、変性剤を除去（例えば、透析による）するかまたは希釈することにより起こり得、免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成を生じさせる。可溶化後、タンパク質は、標準的な分離技術によって、他の細菌タンパク質から分離され得る。４．標準的なタンパク質分離技術ａ．可溶性分画初期工程としてしばしば、そしてタンパク質混合物が複雑である場合、初期の塩または有機溶媒の分画は、目的の組換えタンパク質から望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質）の多くを分離し得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分量を有効に減少させることによって、タンパク質を沈澱させる。タンパク質は、次いでそれらの可溶性に基づいて沈澱する。タンパク質がより疎水性であれば、これはより低い濃度の硫酸アンモニウムで沈澱し易くなる。代表的プロトコルは、得られる硫酸アンモニウム濃度が20〜30％の間になるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することである。これは、タンパク質のうち最も疎水性であるものを沈澱させる。この沈殿物を捨て（目的のタンパク質が疎水性でない場合）、そして硫酸アンモニウムを、目的のタンパク質を沈澱させることが知られる濃度に上清に添加する。次いで、沈殿物を緩衝液中に可溶化し、そして必要であれば、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって、過剰の塩を除去する。タンパク質の可溶性に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈澱）は、当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用され得る。ｂ．サイズ差次的濾過目的のタンパク質のサイズが公知であるか、またはcDNA配列から概算され得る場合、より大きなサイズおよびより小さなサイズのタンパク質が、異なる孔サイズの膜（例えば、AmiconまたはMillipore膜）による限外濾過によって除去され得る。最初の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質の分子量より小さな分子カットオフを有する孔サイズを有する膜によって限外濾過する。次いで、限外濾過の保持物質を、目的のタンパク質の分子量より大きな分子カットオフを有する膜に対して限外濾過する。組換えタンパク質は、膜を透過して濾液に排出される。次いで、濾液は、以下に記載のようにクロマトグラフィーにかけられ得る。ｃ．カラムクロマトグラフィータンパク質は、それらのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて分離され得る。さらに、タンパク質に対して惹起された抗体は、カラムマトリックスに結合体化され得、そしてタンパク質は免疫精製され得る。これらの方法の全ては当該分野において周知である。Scopes，R.K.、Pr otein Purification:Principles and Practice，第２版、Springer Verlag(1987 )を参照のこと。クロマトグラフィー技術が、任意の規模で、そして多くの異なる製造者（例えば、Pharmacia Biotech）からの装置を用いて実施され得ることは、当業者に明らかである。好ましい実施態様では、E．coli上清からのTHPの精製は、ゲル濾過によって一部達成され、そしてタンパク質濃度は、多くの技術（例えば、Bradford，Anal． Biochem．72.248-257(1976)）に従って決定される。ｄ．アミノ酸配列本発明のTHPのアミノ酸配列は、例えば、エドマン分解（当該分野で周知である技術）によって決定され得る。エドマン分解によって、THPの中間部を配列決定した。これは、THPのバルクを構成することが見出された12の連続するアミノ酸の反復モチーフに及ぶ。このモチーフ（配列番号１）は、各イソ型において、少なくとも５回、より好ましくは５〜12回繰り返される。中間部配列決定に加えて、Ｎ末端配列決定は、当該分野で公知の技術によって実施され得る。しかし、ネイティブなTHP26において、そして組換えTHPイソ型のうち３つにおける類推によって、N末端はブロックされていた。核酸配列決定によって、N末端を、グルタミンであると決定した。これは、N末端配列決定がピログルタミン（環状化グルタミン）によりブロックされることと一致する。本発明のTHPのクラスの推定Ｎ末端は、配列番号４として同定する。ｅ．分子量／等電点タンパク質の分子量は、多くの異なる方法によって決定され得る。これら全ては当業者に公知である。いくつかの決定方法は、以下を包含する：SDSゲル電気泳動、未変性ゲル電気泳動、分子排除クロマトグラフィー、ゾーン遠心分離、質量分析、および配列決定からの算定。異なる技術の結果間の相違は、技術に固有の要因に起因し得る。例えば、未変性ゲル電気泳動、分子排除クロマトグラフィー、およびゾーン遠心分離は、タンパク質のサイズ、形状、および正味の電荷のような要因に依存する。本発明のタンパク質は、システインが豊富であり、多くのジスルフィド結合（分子内および分子間の両方）を形成することが予測される。SDSゲル電気泳動は、SDSのタンパク質中に存在するアミノ酸への結合に依存する。いくつかのアミノ酸は、他より強くSDSを結合し、従って、タンパク質は、アミノ酸組成に依存して異なって移動する。本発明では、本明細書中に開示されたTHPが、モチーフの繰り返し単位であるので、異なるアミノ酸の相対数は非常に低く、SDSゲル電気泳動による分子量において大きな相違を生じ得た。配列からの算定分子量は、タンパク質に存在するアミノ酸の頻度を利用し、アミノ酸の分子量にその頻度を乗算する。タンパク質がグリコシル化されている場合、算定分子量は、これを反映せず、質量分析が必要な代替法であり得る。本発明では、分子排除クロマトグラフィーによるTHPのクラスの見かけ分子量が、17〜19kDの間であり；SDSゲル電気泳動によっては、22〜30kDであった。質量分析では、タンパク質のクラスの分子量は、７〜12、好ましくは８〜11、そして最も好ましくは約8.4〜11.7kDの間であることが見出された。これは、分子量がアミノ酸配列決定から算定されたときに得られた結果と一致した。アミノ酸配列および質量分析による分子量を比較することによって、分子量における差異は、異なる数のモチーフ反復に大きく起因すると思われる。タンパク質の等電点は、未変性ゲル（またはディスク）電気泳動、等電点電気泳動によって決定され得るか、または、好ましい方法では、タンパク質のアミノ酸含量を与えられた計算によって決定され得る。本発明のタンパク質のクラスは、約８から10の計算pIを有する。 f.機能性アッセイ本発明のTHP種およびイソ型は、少なくとも２つの機能性特性（例えば、熱履歴および氷晶の固有の形成）によって同定および特徴づけられ得る： (1)熱履歴本発明のタンパク質は、熱履歴アッセイにおいて公知の魚類不凍タンパク質よりも約100倍高い活性である。熱履歴は、溶液凍結温度および溶液融解温度との間の差異として定義される。凝固点は、抑制できない氷の増大が、種氷晶から生じる温度として解釈される。融点は、水晶が融解することなく安定に保持され得る、最も高い温度として解釈される。TH活性は、当該分野で周知の方法(例えば、Chakrabartty & Hew、Eur．J．Biochem．202:1057(1991)を参照のこと)によって、ナノリッター浸透圧計（Clifton Technical Physics，Martford，NY）で測定され得る。開始氷晶は、通常、直径20〜50μmである。使用される緩衝液は、代表的には、100mMのNH₄HCO₃(pH7.9)であるが、類似の浸透圧の他の緩衝液も使用され得る。あるいは、TH活性は、細菌性ブロス、組織培養液、または血リンパ中で測定され得る。浸透圧計は、独立しているが連結された可変温度コントロールを有する熱電気冷却モジュールである。この装置は、ディープフリーズモードによって、０℃〜９℃の範囲から-40℃までの温度調節を可能にする。冷却モジュールは、顕微鏡ステージ（このステージで、氷晶の増大および融解挙動が、直接観察され得る）でセットアップされ得る。サンプルホルダーは、複数の小さなサンプル孔（直径約0.35mm）を含む、約7mm×7mm×0.75mmの体積を有する小プレートであり得る。一滴の液浸オイル（例えば、Cargilleの液浸オイルＢ）が、サンプル孔が満たされるようにサンプルホルダーの下側に置かれ得る。次いで、１〜５nLのサンプルが、毛細管によって、オイルで満たされた孔の中央まで送達される。 TH活性を測定するために、サンプルを、最初に-40℃まで急速に冷却することによって凍結し、次いでそれらを融点温度まで暖める。一旦、融点に達すると、サンプルを、凍結温度に達するまで、10〜15秒あたり約0.02℃(10ミリオスモルまたはｍオスモル)で冷却する。単位「オスモル」から「℃」への変換は、1.00 オスモルが1.86℃に相当する。ほとんどの例では、THPサンプルの凝固点に達する場合、サンプル内の氷晶は、自発的にそして迅速に増大する。これは、全体サンプルの凍結へと導く。あるいは、小さな氷晶は、溶液の表面上で凍結され得、そして溶液の温度は、凍結温度より低い温度まで直ちに低下する。有核の氷晶が、増大し始める場合の凍結より低い温度が、凝固点抑制または熱履歴測定である（PattersonおよびDum an，J．Exp．Zool．210:361(1979);およびWuら、J．Comp．Physiol．B 161:271( 1991)を参照のこと）。溶液の熱履歴活性は、不凍タンパク質の濃度に依存し、タンパク質の濃度が高くなると、溶液によって示される活性が高くなる。しかし、THPの増加濃度は、TH活性において漸増的により小さな増加を生じ、そして最大に近づく。言い換えると、THP濃度とTHとの間の関係は、双曲線的であり、直線的ではない。本発明のタンパク質は、好ましくは、約1mg/mLで、1.0℃を超える、より好ましくは約1mg/mLで1.5℃を超える、そして最も好ましくは約1mg/mLで約1.5〜3.0 ℃の間の熱履歴値を有する。 (2)水晶の固有の形成既知の魚類不凍タンパク質よりも約100倍高い比活性を有することに加えて、本発明のタンパク質は、種々の形状の氷晶を生成する。顕微鏡分析下で、魚類不凍タンパク質は、平たく十分に規定された面を有する六方両錐である氷晶を生成する。言い換えれば、本発明のTHPは、曲線的な縁を、好ましくは楕円形状で非平面を、好ましくは凸面を有する結晶を形成する。 IV.不凍タンパク質および関連遺伝子の使用タンパク質またはTHPをコードする遺伝子が、氷晶の増大を抑制する途上で使用され得る。不凍タンパク質の使用の包括的な総説については、米国特許第5,11 8,792号を参照のこと。本発明のTHPは、タンパク質形態で導入され得るか、またはタンパク質を産生するための、適切な強力プロモーターの制御下において、細胞において不凍タンパク質を発現することによって達成され得るはずであるレベルで、内因的に発現される遺伝子として導入され得る。THPの適切な濃度は、使用に依存して変化するが、代表的には10億あたり約１部から千あたり約１部の範囲(すなわち、１μg/L〜1g/L)にある。本発明の１つの実施態様において、タンパク質は、食糧に導入される。これは、多くの種々の局面を有する。１つは、植物食糧への導入であり、これは、植物全体へ導入、従って、氷点下の気候条件からの損傷に対してある程度の一般的抵抗性を与えるか、または植物部分（例えば、果実または野菜の一部分）へ導入して凍結の際のこれらの特定の植物器官へ特に損傷を最低限にするかのいずれかである。例示的な植物部分は、茎、根、葉、花、葉柄、果皮、種子、植物性組織、塊茎などである。凍結野菜（例えば、セロリ、ジャガイモ、アスパラガス、エンドウマメ、ニンジン、マメ、ブロッコリ、トウモロコシ、およびホウレンソウ）の組織、味覚、および有用な保存期間は、改良され得る。同様に、果実（イチゴ、ブルーベリー、キイチゴ、柑橘類の果実、バナナ、ブドウ、キウイ、モモ、パイナップル、西洋スモモ、サクランボ、トマトおよびマンゴを含む）の組織、味覚、および保存期間は、増強される。植物および他の産物へのこの導入は、標的生物への適切な核酸の遺伝子導入によって最も容易に達成され得る。食品加工が開始される前、または収穫および加工が開始された後の核酸の発現（構成的なあるいは誘導性のいずれかの）は、食糧を効果的に保護するために有意に高いレベル（例えば、質量で植物タンパク質全体の0.5%までであるが、より好ましくは約0.1%まで）のポリペプチドへと導き得る。発現はまた、組織特異的基準であり得る。例えば、果実における成熟遺伝子への連結は、産生植物からの収穫後でさえ発現を生じ得る。ポリペプチドはまた、凍結されることが予測される食物に添加され得る。多くの凍結食物は、冷却状態で消費されることが意図され、例えば、これらとしては、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、アイスミルク、シャーベット、アイスキャンディー、フローズンホイップクリーム、フローズンクリームパイ、フローズンプリンなどが挙げられる。詳細には、組織および味覚は、凍結融解サイクル（これは、ほとんどの家庭用の霜のないフリーザーにおいて、または凍結状態で維持される保存によって生じる）の間の大きな氷晶の形成によって、悪影響を受ける。この氷晶増大プロセスは、不凍ポリペプチドの添加によって、全体として防止されるか、または少なくとも最小化され得る。精製された不凍タンパク質は、食糧の至る所に組み込まれるか、または代わりに表面（ここで、凝結および結晶形成は、最も容易に生じることが予想される）に適用され得る。別の実施態様において、本発明のTHPをコードする遺伝子は、微生物（これは、食糧に添加される場合、凍結から食糧または微生物を保護する）を形質転換するために使用される。例えば、細菌（例えば、Streptococus thermophilusおよびLactobacillus bulgaricus）が、乳製品(フローズンヨーグルトとして販売されることが意図される)へ添加され得る。ヨーグルトを製造するために乳製品を発酵させることに加えて、細菌によって発現されるTHPは、家庭用フリーザー凍結融解サイクルから製品を保護し、そしてより口当たりの良い製品を製造する。別の使用は、THPをコードする核酸によって、パン生地酵母を形質転換することである。酵母へのこの遺伝子の組み込みおよび発現、ならびに凍結パン生地におけるこれら酵母の使用によって、パン生地は、融解の際自然に発酵する。なぜなら、酵母の生存度は、融解の際に高いままであるからである。これらの不凍ポリペプチドの存在下では貯蔵から集積する損傷はより少なく、そして融解されたサンプルは、高い生存度を持続するので、より長い貯蔵時間が可能となるか、または多分、貯蔵のために必要とされるアリコートがより少なくなるかのいずれかになる。食物フリーザーに特異的ではない、種々の実施態様が存在する。１つは、気候性凍結条件から植物を保護するためのTHPの使用である。THPが、導入された遺伝子の発現によって、細胞質へ内部に組み込まれるか、あるいはタンパク質が、植物へ外部適用され得るかのいずれかであり得る。外部適用は、植物へのタンパク質の直接的な適用あるいはタンパク質を分泌する生物の植物上への外部沈着のいずれかによって達成され得る。導入のためのこれらの同じ代替は、同様、他の使用にもあてはまる。植物に加えて、本発明のTHPを使用して、トランスジェニック動物(氷点下温度に耐え得る魚を含む)を産生し得ることが想到される。いくらかの極地方の魚は不凍タンパク質を確かに合成するが、ほとんどの魚は、水温が０℃未満に下がる環境下では、生存しない。しかし、THPをコードする外因性核酸を含むトランスジェニック魚は、氷点下の塩水で耐えることができ、おそらく一部は生育され得る。特に、飼育場において生育されている塩水魚、大部分は特にサケである。サケに加えて、飼育されるトランスジェニックテナガエビ類は、THP遺伝子の潜在的なレシピエントである。上記の実施態様に加えて、本発明のTHPを使用して、低温耐性生物内の内因性T HP遺伝子の発現を調節し得ることが想到される。不凍タンパク質遺伝子産物の発現は、例えば、引き続く単離物(内因性不凍タンパク質)を調製する方法として増加され得る。逆に、内因性不凍剤遺伝子発現をダウンレギュレートすることによって、そうでなければ低温耐性の有害生物が、あまり悪化しない表現型に変換され得る。内因性遺伝子の発現を改変する方法は、当業者に周知である。代表的には、このような方法は、調節されるべき特定の遺伝子の発現を制御する調節配列の全てまたは一部を改変または置換する工程を包含する。特定の実施態様において、１つ以上のTHPの上流の調節配列(例えば、ネイティブプロモーター)が改変される。このことは、代表的に、ネイティブな調節配列に異種核酸を導入するために相同組換えを使用することによって達成される。１つ以上のTHP遺伝子産物の発現をダウンレギュレートするために、リーディングフレームを改変するかまたはプロモーターを破壊するかのいずれかの簡単な変異が適切である。THP遺伝子産物の発現をアップレギュレートするために、ネイティブなプロモーターは、転写物を正常レベルより高く誘導する異種プロモーターで置換され得る。特定の好ましい実施態様において、問題の構造遺伝子または上流配列を含む核酸配列は、異種組換え構築物を標的化するために利用される。配列番号２および５に提供される構造遺伝子配列情報、または配列番号10、12、14および16に提供される上流もしくは下流配列情報を利用することによって、当業者は慣用的な実験のみで相同組換え構築物を作製し得る。内因性遺伝子の発現を改変する相同組換えの使用は、米国特許第5,272,071号、WO91/09955、WO93/09222、WO96/29411、WO95/31560、およびWO91/12650において詳細に記載される。マイコバクテリアにおける相同組換えは、Azadら、Proc.N atl.Acad.Sci.USA 93:4787(1996)；Baulardら、J.Bacteriol.178:3091(1996)；およびPelicicら.,Mol.Microbiol.20:919(1996)に記載される。動物における相同組換えは、Moynahanら.,Hum.Mol.Genet.5(7):875(1996)、および植物における相同組換えは、Offringaら.,EMBO J.9(10):3077(1990)に記載されている。別の実施態様は、器官、組織、または他の生物学的サンプルを取り囲む水溶液への不凍タンパク質の導入である。１つの特定の使用は、移植手術または保存目的のための病院への輸送の間に使用することである。不凍タンパク質は、氷点下の温度での短期または長期の保存を可能にし、それによって固有の代謝または分解を最小化させるが、氷晶の成長に由来する細胞損傷を実質的に減少させるはずである。他の医療的に重要な温度感受性生物学的サンプルは、血液および血液製品、治療剤、タンパク質薬物、生物学的アッセイ試薬およびワクチンである。さらに別の実施態様は、凍結保存のために予定したおいた細胞またはそれらの抽出物への不凍タンパク質の導入である。例えば、THPを含む細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および最も特に動物細胞は、凍結融解プロセスに起因して固有の特徴を最小限に失うかまたは全く失うことなく細胞または組織の生存性を上昇させる。亜細胞サンプルまたは細胞性抽出物は、凍結、特に保存の延長に対して類似の感受性を有し得る。代表的な例は、インビトロタンパク質翻訳系、酵素調製物、および特に感受性膜成分(例えば、クロロプラスト、またはミトコンドリア膜調製物)を含むサンプルである。特に、オルガネラを含むサンプルは、これらの不凍ポリペプチドの添加の際に凍結損傷に対して、耐性の増加を示し得る。軟動物組織は、本発明のポリペプチドの存在下での凍結の際に、損傷をあまり示さず、そしてこのポリペプチドの添加は、凍結および引き続く融解の際に細胞の完全性が重要であるかまたは所望される状況(例えば、組織培養物寄託に関して)において有用である。従って、凍結貯蔵(例えば、細胞または組織の寄託機関)を目的とされたサンプルは、それらに添加されるタンパク質を慣用的に有し得る。これらの細胞型の間において、しばしば保存されるものは、細菌、真菌(酵母を含む)、および特に高等真核生物細胞(例えば、ハイブリドーマ株または組織培養細胞株など)の遺伝的改変体である。本発明にはまた、当業者に周知の安定化剤および他の添加剤とともにTHPの混合物に基づいた組成物および使用が含まれる。これらの化合物は、腐敗の阻害、酸化の阻害、変色の防止、微生物増殖の阻害、乳化物の安定化などのために存在し得る。本発明においてまた、凝固点の抑制または非有機系における凍結の阻害のため (例えば、除氷処置における使用のため)に適切なTHPに基づいた組成物が含まれる。本明細書中に記載された実施例および実施態様は、例示のみの目的であり、これらに鑑みて種々の改変または変更が、当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲内ならびに添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。実施例以下の実施例は、例示のために提供され、本願発明を制限することを意図しない。実施例１：Tenebrio molitor幼虫由来のTHP 以下の実施例は、Tenebrio molitorの血液リンパからのTHPの単離を詳述する。Tenebrio molitor幼虫は、暗中で生育させた以外は、以前に記載のように(Gra hamら.,Insect.Biochem.Molec.Biol.26:127(1996)を参照のこと)生育させた。血液リンパ(600μl)を100の推定終齢幼虫の切断された前脚での滲出液から得、そして氷冷血液リンパ緩衝液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、および1mMフェニルチオカルバミド)中で１：１に希釈した。 1.6cm)上にロードし、そしてフェニルチオカルバミドを含まない血液リンパ緩衝液を用いて溶出した。選択された活性な画分を合わせ、C18分析カラム(Vidac)において、0.05％トリフルオロ酢酸において0.4％アセトニトリル/分の勾配を使用して、逆相HPLCによってクロマトグラフィーにかけた。画分を凍結乾燥し、そして標準的な手順に従って、TH測定のために、50μlの0.1M NH₄HCO₃(PH8.0)で再懸濁した(ChakrabarrtyおよびHew、Eur.J.Biochem.202:1057(1991)を参照のこと) 。氷晶形態は、白黒フィルムを使用して撮影され、そして結晶ｃおよびａの軸は、直交偏光(cross-polarized light)を使用して同定した(Hobbs、Ice Physics,C larendon Press,London(1974))。活性な画分を15％SDS−PAGEによって分離し、そしてSilver Stain Plus Kit(Bio-Rad)を使用して染色した。およその分子量をMALDI質量分析計によって決定した。２つの活性な、良好に分離されたHPLC画分を、アミノ酸分析、Ｎ末端配列決定およびエレクトロスプレーイオン化質量分析に供した。１つの画分を還元して、アルキル化し、そしてエンドプロテアーゼLys-Cを使用して切断した。逆相HPLCによる切断産物の分離に従って、最も良好に分離されたフラグメントを、自動化エドマン分解によって配列決定した。希釈された幼虫Tenebrio血液リンパがゲル排除クロマトグラフィーによって分画された場合、約19および17kDの見かけの分子量を有するTH活性の２つの重複するピークが存在した(図１)。先立つピークをHPLCによって分析した場合、活性なタンパク質は、16％アセトニトリルと22％アセトニトリルとの間で溶出し(図２) 、そしてより豊富であるが、不活性なタンパク質は、勾配の後期に溶出した。質量分析(図３)によって、不活性なタンパク質(12.2kDa〜12.4kDa)は、SDS−PAGE において分子量に従って移動したが、その一方で、より小さなTHタンパク質(7.3 kDa〜10.7kDa)は、22〜30kDaの範囲の見かけの分子量を有する拡散性のバンドとして変則的に移動したことが示された。HPLC画分の26および27に対応する(図２) 最も高いTH活性を有する画分を、それらのアミノ酸含有量について分析した。２つの画分の組成は類似し、そしてともに、Thrおよび短い側鎖を有する他のアミノ酸(Gly、Ala、Ser)が豊富であった。全体的に、タンパク質は、中程度に親水性であった(Wishardら.,Comput.Appl.Biosci.10:121(1994))。55μg/mlのTHP26(画分26)のTH活性および21μg/mlのTHP27のTH活性は、それぞれ、1.6℃および1.1℃ であり、10〜30mg/mlの魚類AFPで得られた最大値に近接していた(DaviesおよびH ew、FASEB J.4:2460(1990))。 THP26およびTHP27の両方が、Ｎ末端がブロックされていた。エンドプロテイナーゼLys-C消化物から遊離されたTHP26からの内部フラグメントが配列決定され、そしてそのアミノ酸含量(20残基のうち７Thrを含む)は、全体的なアミノ酸組成と一致した。この配列に対する縮重プライマーをベクタープライマーとともに使用して、Tenebrioc DNAライブラリーをスクリーニングするためにPCR産物を産生した。実施例２：THPコード遺伝子についてのcDNAライブラリースクリーニング本発明のTHPの他のイソ型を単離するために、プローブ(配列番号２および５) 、PCRプライマー(配列番号６および７)ならびに配列決定プライマー(配列番号８および９)についてのオリゴヌクレオチドを、TH陽性クローン(YL-1〜4)を配列決定することによって決定されたコンセンサス配列に基づいて設計した。 Tenebrio molitor幼虫の脂肪体λ-Zap cDNAライブラリー(Grahamら、Insect B iochem.Molec.Biol.26:127(1996))のアリコートを5'末端から停止コドンまでのY L-1の核酸配列(配列番号２１)を使用してスクリーニングした。約１×10⁵プラークを、上記に列挙した配列を使用して、標準的な方法論に従って中程度のストリンジェンシーにてスクリーニングした。単離された陽性プラークは、製造業者の説明書によって、R408ヘルパーファージ(Stratagene)を使用して、インビボ切り出しに供した。得られた二重鎖DNAを精製して、ベクタープライマーT7およびT3 、ならびに配列番号８および９を使用して上記のように配列決定した。核酸配列決定からの推定翻訳物は、20残基のうち18残基までが配列決定されたペプチドフラグメントと適合した。最初の28アミノ酸は、-3位〜-1位におけるCy sでの分泌シグナルペプチドを表した(von Heijne,Nucl.ACids Res.１４:4683(19 86))。３つの改変体のＮ末端アミノ酸は、Glnであると推測された。これは、Ｎ末端Glnが環状化によってピログルタミン酸に変換されたＮ末端ブロックと一致した。第４の改変体の切断部位は、はっきりとは推定されなかった。実施例３：サブクローニングおよびタンパク質発現 PCRリンカー−プライマー(配列番号６および７)を設計して、THPコード領域を増幅し、そして成熟タンパク質の推定Ｎ末端残基の前にMetコドンを導入した。得られたフラグメントをpET-20b(+)ベクター(Novagen)に連結して、そしてE.col i BL21(DE3)に形質転換した。発現をイソプロピルβ-D-チオガラタトピラノシドを使用して誘導し、細胞を遠心分離によって採取し、そして10mM Tris−HCl(pH8 .0),１mM EDTA,0.1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド中で超音波処理した。清透化された上清を、G75ゲル排除クロマトグラフィーカラム上にロードした。活性な画分をプールし、凍結乾燥し、50mMTris-HCl(pH8.0)中で再懸濁し、そして同じ緩衝液に対して一晩透析した。実施例４：クローニングされたTHPに由来する機能的活性クローニングされた配列が、THPをコードするということを証明するために、従来のシグナル切断部位(YL-2、図６)を有する４つのcDNAのうち最も短いcDNAを、E.coliにおいて発現させた。TH活性を細胞溶解物の上清において検出し、これによってタンパク質のいくつかは、活性を示すために十分良好に折り畳みし得ることが示された。部分的に精製された組換えTHPは、5.3℃というTHを示し、そしてTenebrio血液リンパにおいてTHPからのその特性において区別不可能であった。その活性は、還元によって取り除かれるが、キレート化によっては影響を及ぼされなかった。また、希釈血液リンパの存在(図4-I)および組換えタンパク質の存在(図4-II)において形成された氷晶は、同一であった。これらの観察によって、このTHPおよびそのイソ型は、昆虫におけるTH活性の全てを占め得ることが示唆される。さらに、血液リンパおよび全体の抽出物の広範な分析は、これらのイソ型に関連しないTHPの証明を全く示さない。本明細書中に記載された実施例および実施態様は、例示のみの目的であり、これらに鑑みて種々の改変または変更が、当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲内ならびに添付の請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年１０月１５日（１９９９．１０．１５）【補正内容】請求の範囲１．不凍タンパク質をコードする単離された核酸であって、該タンパク質は以下： (1)約７〜約13kDaの計算分子量を有する； (2)１mg/mLで約1.5℃よりも大きな熱履歴活性を有する；および (3)配列番号３に示すモチーフをコードする核酸サブ配列を有する、と規定される、単離された核酸。２．コードされる前記タンパク質の前記計算分子量が、約８〜約12kDaである、請求項１に記載の単離された核酸。３．前記熱履歴活性が、１mg/mLにて２℃よりも大きい、請求項１または２に記載の単離された核酸。４．コードされる前記タンパク質が、配列番号11、13、15、および17からなる群より選択される不凍タンパク質に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された核酸。５．コードされる前記タンパク質が、配列番号11、13、15、および17からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸。６．ストリンジェントな条件下で配列番号２に特異的にハイブリダイズする、単離された核酸。７．ストリンジェントな条件下で、成熟YL-2熱履歴タンパク質（配列番号12のヌクレオチド105〜359）をコードする核酸に特異的にハイブリダイズする、単離された核酸。８．前記ストリンジェントな条件が、65℃にて15分間の0.2×SSCでの洗浄である、請求項６または７に記載の単離された核酸。９．精製されたTenebrio molitor不凍タンパク質からの12個の連続するアミノ酸のモチーフの少なくとも１反復を有し、そして配列番号３に示されるアミノ酸モチーフを有するタンパク質をコードする単離された核酸であって、該タンパク質は、配列番号11、13、15、および17からなる群より選択される不凍タンパク質に対する抗体に特異的に結合する、単離された核酸。１０．単離された不凍タンパク質であって、該タンパク質は： (i)配列番号１を含む12個の連続するアミノ酸のモチーフの少なくとも１反復を有する； (ii)約7.0〜約13.0kDaの計算分子量を有する； (iii)約8.0〜約10.0のpIを有する； (iv)１mg/mLで約1.5℃より大きい熱履歴活性を有する； (v)Ｎ末端に配列番号３に示されるアミノ酸モチーフを有する；および (vi)(a)配列番号11、13、15、および17からなる群より選択される不凍タンパク質に対して惹起された抗体に特異的に結合するか；または (b)配列番号11、13、15、および17からなる群より選択される不凍タンパク質に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有する、単離された不凍タンパク質。１１．反復モチーフの数が、５〜12である、請求項１０に記載の単離された不凍タンパク質。１２．前記熱履歴活性が、１mg/mLの濃度で約2.0℃よりも大きい、請求項１０または１１に記載の単離された不凍タンパク質。１３．前記タンパク質が、配列番号11、13、15、および17からなる群より選択される、請求項１０に記載の単離された不凍タンパク質。１４．配列番号２に特異的にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、単離された不凍タンパク質。１５．組換え手段により生成される、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の単離された不凍タンパク質。１６．免疫学的に反応性の条件下で、配列番号４のアミノ酸配列に特異的に免疫反応性な、抗体。１７．生物であって、該生物またはその祖先に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む発現ベクターが導入された、生物。１８．前記単離された核酸の配列が、前記生物から外部に発現される不凍タンパク質に翻訳される、請求項１７に記載の生物。１９．前記生物が、魚類である、請求項１７に記載の生物。２０．前記魚類が、Salmonidae科のメンバーである、請求項１９に記載の生物。２１．前記生物が、甲殻類である、請求項１７に記載の生物。２２．前記生物が、Natantia亜目のメンバーである、請求項２１に記載の生物。２３．前記生物が、Palaemonetes属およびPeneus属からなる群より選択される、請求項２２に記載の生物。２４．前記生物が、Homarus属のメンバーである、請求項２１に記載の生物。２５．前記生物が、植物である、請求項１７に記載の生物。２６．前記生物が、真菌である、請求項１７または１８に記載の生物。２７．前記真菌が、酵母である、請求項２６に記載の生物。２８．前記酵母が、Torulopsis holmil、Saccharomyces fragilis、Saccharomyc es cerevisiae、Saccharomyces lactis、およびCandida pseudotropicalisからなる群より選択される、請求項２７に記載の生物。２９．前記生物が、細菌である、請求項１７または１８に記載の生物。３０．前記細菌が、Streptococcus cremoris、Streptococcus lactis．Streptoc occus thermophilus、Leuconostoc citrovorum、Leuconostoc mesenteroides、L actobacillus acidophilis、Lactobacillus lactos、Bifidobacterium bifudum 、Bifidobacterium breve、およびBifidobacterium longumからなる群より選択される、請求項２９に記載の生物。３１．水溶液の凝固点を低下させる方法であって、該方法は、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の不凍タンパク質を該水溶液に添加する工程を包含する、方法。３２．前記水溶液が、生物に適用される、請求項３１に記載の方法。３３．発現ベクターであって、プロモーターに作動可能に連結された、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。３４．前記プロモーターが、ネイティブな状態では、ＴＨＰプロモーターである、請求項３３に記載の発現ベクター。３５．前記プロモーターが、異種性である、請求項３３に記載の発現ベクター。３６．前記プロモーターが、構成性である、請求項３５に記載の発現ベクター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ // Ｃ０９Ｋ 5/08 Ｃ０９Ｋ 5/00 Ｄ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者リオウ，イー−チェーンカナダ国ケイ７エム２ダブリュー８オンタリオ，キングストン，マックファーソンアベニュー 15，アパートメント 18―102 (72)発明者ウォーカー，バージニアケイ. カナダ国ケイ０エイチ２ティー０オンタリオ，シデンハム，アール．アール. ナンバー１ (72)発明者デイビス，ピーターエル. カナダ国ケイ７エム２エム８オンタリオ，キングストン，ディッケンズドライブ 100

Claims

【特許請求の範囲】１．不凍タンパク質をコードする単離された核酸であって、該タンパク質は以下： (1)７〜13kDaの計算分子量を有する； (2)約１mg/mLで約1.5℃よりも大きな熱履歴活性を有する；および (3)(a)YL-1、YL-2、YL-3、またはYL-4からなる群より選択される不凍タンパク質に対して惹起された抗体に特異的に結合する；または (b)YL-1、YL-2、YL-3、またはYL-4からなる群より選択される不凍タンパク質に対して少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有する；または (c)配列番号１のコンセンサス配列の少なくとも１つの反復単位を含むアミノ酸配列を有すると規定される、単離された核酸。２．コードされる前記タンパク質の前記計算分子量が、約８〜約12kDaである、請求項１に記載の単離された核酸。３．前記熱履歴活性が、１mg/mLにて２℃よりも大きい、請求項１に記載の単離された核酸。４．コードされる前記タンパク質が、YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される不凍タンパク質に対して少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項１に記載の単離された核酸。５．コードされる前記タンパク質が、YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸。６．コードされる前記タンパク質が、配列番号１の６つのうちの少なくとも５つの保存されたアミノ酸の約５〜12個の反復単位からなる、請求項１に記載の単離された核酸。７．ストリンジェントな条件下で配列番号２に特異的にハイブリダイズする、単離された核酸。８．精製されたTenebrio molitor不凍タンパク質からの12個の連続するアミノ酸のモチーフの少なくとも１反復をコードする単離された核酸であって、YL-1、YL -2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される不凍タンパク質に対する抗体に特異的に結合する、単離された核酸。９．単離された不凍タンパク質であって、該タンパク質は： (i)配列番号１を含む12個の連続するアミノ酸のモチーフの少なくとも１反復を有する； (ii)約7.0〜約13.0kDaの計算分子量を有する； (iii)約8.0〜約10.0のpIを有する； (iv)１mg/mLで約1.5℃より大きい熱履歴活性を有する； (v)(a)Ｎ末端に配列番号３に示されるアミノ酸モチーフを有する；または (b)YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される不凍タンパク質に対して惹起された抗体に特異的に結合するか；もしくは (c)YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される不凍タンパク質に対して60％のアミノ酸配列同一性を有する、単離された不凍タンパク質。１０．反復モチーフの数が、５〜12である、請求項９に記載の単離された不凍タンパク質。１１．前記熱履歴活性が、約１mg/mLの濃度で約2.0℃よりも大きい、請求項９に記載の単離された不凍タンパク質。１２．前記タンパク質が、YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される、請求項９に記載の単離された不凍タンパク質。１３．免疫学的に反応性の条件下で、不凍タンパク質に特異的に免疫反応性な抗体であって、該タンパク質は、配列番号１のモチーフを含む少なくとも１反復の配列を有する、抗体。１４．前記不凍タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１３に記載の抗体。１５．生物であって、該生物またはその祖先に、請求項１に記載の単離された核酸が導入された、生物。１６．前記単離された核酸の配列が、前記生物から外部に発現される不凍タンパク質に翻訳される、請求項１５に記載の生物。１７．前記生物が、魚類である、請求項１５に記載の生物。１８．前記魚類が、Salmonidae科のメンバーである、請求項１８に記載の生物。１９．前記生物が、甲殻類である、請求項１５に記載の生物。２０．前記生物が、Natantia亜目のメンバーである、請求項１９に記載の生物。２１．前記生物が、Palaemonetes属およびPeneus属からなる群より選択される、請求項２０に記載の生物。２２．前記生物が、Homarus属のメンバーである、請求項１９に記載の生物。２３．前記生物が、植物である、請求項１５に記載の生物。２４．前記生物が、真菌である、請求項１５に記載の生物。２５．前記真菌が、酵母である、請求項２４に記載の生物。２６．前記酵母が、Torulopsis holmil、Saccharomyces fragilis、Saccharomyc es cerevisiae、Saccharomycea lactis、およびCandida pseudotropicalisからなる群より選択される、請求項２５に記載の生物。２７．前記生物が、細菌である、請求項１５に記載の生物。２８．前記細菌が、Streptococcus cremoris、Streptococcus lactis、Streptoc occus thermophilus、Leuconostoc citrovorum、Leuconostoc mesenteroides、L actobacillus acidophilis、Lactobacillus lactis、Bifidobacterium bifidum 、Bifidobacterium breve、およびBifidobacterium longumからなる群より選択される、請求項２７に記載の生物。２９．水溶液の凝固点を低下させる方法であって、該方法は、配列番号１の連続するアミノ酸モチーフの１より大きな反復を有する不凍タンパク質を該水溶液に添加する工程を包含する、方法。３０．前記水溶液が、生物に適用される、請求項２９に記載の方法。３１．反復モチーフの数が、約５〜約12である、請求項２９に記載の方法。３２．前記不凍タンパク質が、組換え手段により生成される、請求項２９に記載の方法。３３．前記不凍タンパク質が、YL-1、YL-2、YL-3、またはYL-4に対して指向される抗体にさらに特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。３４．前記不凍タンパク質が、YL-1、YL-2、YL-3、およびYL-4からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。３５．前記不凍タンパク質が、配列番号２に特異的にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、請求項３２に記載の方法。３６．プロモーターに作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸を含む、発現ベクター。３７．前記プロモーターが、ネイティブな状態では、THPプロモーターである、請求項３６に記載の発現ベクター。３８．前記プロモーターが、異種性である、請求項３６に記載の発現ベクター。３９．前記プロモーターが、構成性である、請求項３８に記載の発現ベクター。