JP6925623B2

JP6925623B2 - 結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグ、および、その利用

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Publication number: JP6925623B2
Application number: JP2017539972A
Authority: JP
Inventors: 章夫黒田; 丈典石田
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
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Filing date: 2016-09-15
Publication date: 2021-08-25
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Description

本発明は、結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグ、および、その利用に関する。

人々を取り巻く環境には、様々な物質が存在し、人体にとって無害な物質もあれば、人体にとって有害な物質もある。例えば、アスベストは、従来から、建物の材料として多く用いられてきた。近年、アスベストが人体へ及ぼす影響の大きさが認識されるにつれて、建築物などの材料としてアスベストが用いられているか否か検査する必要が生じている。また、アスベスト以外にも、人々を取り巻く環境には人体に影響を及ぼす多くの物質が存在し、建築物などの材料としてこれらの物質が用いられているか否か検査する必要も生じている。

従来から、アスベストの検出方法として、アスベストに対する結合力を有している結合タンパク質と、標識との複合体をアスベストに結合させ、アスベストに結合している標識を検出することによってアスベストの存在を確認する技術が用いられている（例えば、特許文献１〜３参照）。

例えば、特許文献１には、結合タンパク質として、微生物由来のタンパク質が開示され、標識として、アルカリホスファターゼが開示されている。

特許文献２には、結合タンパク質として、ＧａｔＺタンパク質、Ｌ１タンパク質、Ｌ５タンパク質、Ｓ１タンパク質、Ｓ４タンパク質、および、Ｓ７タンパク質が開示され、標識として、蛍光物質、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ジアホーラーゼ、および、パーオキシダーゼが開示されている。

特許文献３には、結合タンパク質として、Ｈ−ＮＳタンパク質、ＤｋｓＡタンパク質、および、ＧａｔＺタンパク質が開示され、標識として、Ｃｙ３、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８、フルオロセイン、Ａｌｅｘａ４８８、ＡＴＴＯ４８８、ＣＦ４８８Ａ、ＤｙＬｉｇｈｔ５５０、および、ＣＦ５５５が開示されている。

日本国公開特許公報「特開２００９−３１０６２号公報（２００９年２月１２日公開）」日本国公開特許公報「特開２０１０−３２２７１号公報（２０１０年２月１２日公開）」ＷＯ２０１３／０２４８８１Ａ１（２０１３年２月２１日公開）

アスベストなどの被験物質を検出する場所は明るい場所である場合があり、この場合、被験物質への結合力が高い結合タンパク質を用いて、多くの標識（例えば、蛍光によって検出される標識）を被験物質に結合させ、これによって、標識を検出し易くすることが重要となる。

例えば、被験物質の一例であるアスベストを検出する場所の例として、アスベストを用いて建てられた可能性がある建築物の解体現場が挙げられる。この場合、アスベストを検出する場所は、屋外や、明るい室内となり、アスベストへの結合力が高い結合タンパク質を用いて、多くの標識をアスベストに結合させる必要性が増すことになる。

従来の結合タンパク質も被験物質への結合力が高いものではあるが、上述した状況下にあって、被験物質への結合力が更に高い結合タンパク質の発見が望まれていた。

本発明は、前記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、プロテインタグ、および、その利用を提供することにある。

不凍タンパク質は、細胞内で生成する氷結晶の表面に特異的に結合することによって氷結晶の成長を妨げ、これによって、生体が凍結することを防ぐタンパク質である。これまでに、多くの不凍タンパク質と、氷結晶の表面への結合に関与する、これら不凍タンパク質内の氷結合ドメインとが同定されている。氷結合ドメインは、特徴的な平面構造を有していることが知られており、平面構造内の特定のアミノ酸が、氷結晶の表面への結合に関与していることが明らかになっている（例えば、（ｉ）Peter L. Davies, Ice-binding proteins: a remarkable diversity of structures for stopping and starting ice growth ,Trends in Biochemical Science, November 2014, Vo.39, No.11, p548-555、（ｉｉ）Zongchao Jia et. al., Antifreeze proteins: an unusual receptor-ligand interaction ,Trends in Biochemical Science, February 2002, Vo.27, No.2, p101-106、（ｉｉｉ）田中正太郎ら、「不凍タンパク質」、生物物理 43(3)、p130-135(2003)、（ｉｖ）Yih-Cherng Liou et. al., Mimicry of ice structure by surface hydroxyls and water of a beta-helix antifreeze protein, Nature, Vol.406, 20 July 2000, p322-324、を参照）。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、（ｉ）不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている結合ドメイン（換言すれば、変異型の氷結合ドメイン）は、結晶構造を有する様々な物質に結合し得ること、（ｉｉ）変異の種類を変化させることによって、結合ドメインが結合する物質の種類を変化させ得ること、を見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明のプロテインタグは、上記課題を解決するために、結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグであって、上記プロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えていることを特徴としている。

本発明の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法は、上記課題を解決するために、ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージと、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、上記結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴としている。

本発明の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキットは、上記課題を解決するために、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグをコードする遺伝子を含有する、ファージベクターまたはファージミドベクターを備えていることを特徴としている。

本発明の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグの製造方法は、上記課題を解決するために、ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージと、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、上記結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴としている。

本発明であれば、結晶構造を有する物質への結合力が高いプロテインタグを実現することができるという効果を奏する。例えば、本発明のプロテインタグは、被験物質への結合力が高いので、標識として蛍光物質を用いる場合、たとえ明るい環境下であっても感度良く被験物質を検出することができるという効果を奏する。

本発明であれば、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異の種類を変えることによって、所望の物質に結合することができるプロテインタグを作製することができるという効果を奏する。

本発明の実施例における、Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}とアスベストとの結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体とアスベストとの結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体とアスベストとの結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体とアスベストとの結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体と、アスベストまたは様々なＪＦＭ標準繊維状試料との結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体と様々なＪＦＭ標準繊維状試料との結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体とアスベストとの結合を示す図である。本発明の実施例における、ＴｍＡＦＰのアミノ酸置換体と酸化チタンとの結合を示す図である。

本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。また、本明細書中でアミノ酸配列を「−Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３−」と記載した場合、左側に記載される「Ｘ_１」がアミノ末端側のアミノ酸を意図し、右側に記載される「Ｘ_３」がカルボキシル末端側のアミノ酸を意図する。

〔１．プロテインタグ〕
本実施の形態のプロテインタグは、結晶構造を有する物質に結合するものであり、当該プロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメイン（換言すれば、変異型の氷結合ドメイン）を備えている。

本明細書において「結晶構造」とは、原子、イオン、または、分子が、周期性をもって３次元に配列することによって、空間格子を形成している状態を意図する。一方、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインは、特徴的な平面構造を有し、その平面構造内の特定のアミノ酸が特定の距離で周期性をもって配置されており、結晶構造を有する物質に結合するタンパク質の分子骨格として適している。

本発明のプロテインタグでは、結合ドメイン内で、特定のアミノ酸（例えば、変異アミノ酸）が、平面上に特定の距離をおいて配置されることになる。そして、当該距離と、空間格子の幅とが略同一になれば、本発明のプロテインタグは、結晶構造を有する物質に好適に結合することができる。また、本発明のプロテインタグは、変異の種類を適宜選択することによって特定のアミノ酸の間の距離を所望の距離に設定することができる。それ故に、本発明のプロテインタグは、当該距離と略同一の幅の格子空間を形成している所望の物質に結合することができる。

また、本明細書において「プロテインタグ」は、構成成分としてポリペプチドを含むタグ、または、ポリペプチドからなるタグを意図する。本発明のプロテインタグは、（１）結晶構造を有する物質に対して単独で結合した後、所望の標識を用いて検出されるもの（換言すれば、結晶構造を有する物質を検出するための目印）であってもよいし、（２）プロテインタグと標識とを予め連結させた複合体を形成し、当該複合体を、結晶構造を有する物質に結合させた後、標識を検出するものであってもよい。

本実施の形態のプロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異の種類に応じて、結合する物質が変化する。それ故に、プロテインタグが結合する物質は限定されない。

本実施の形態のプロテインタグが結合する物質（換言すれば、結晶構造を有する物質）の一例として、アスベスト（具体的には、アモサイト、クロシドライト、または、クリソタイル）、酸化チタン、炭化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛、金、銀、白金、石英、酸化イリジウム、酸化鉄、および、ハイドロキシアパタイトを挙げることができるが、上述したように、本発明における物質は、これらの物質に限定されない。

本実施の形態のプロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えている。

不凍タンパク質は、類似した立体構造を有する氷結合ドメインを有しており、本発明では、当該類似した立体構造を有する氷結合ドメインの変異体を用い得る。それ故に、氷結合ドメインが由来する不凍タンパク質は、特に限定されず、任意の不凍タンパク質であり得る。下記の表に不凍タンパク質の一例を挙げるが、本発明は、これらの不凍タンパク質に限定されない。

不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異は、特に限定されず、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、または、アミノ酸付加の何れであってもよい。結合ドメインにおいて、野生型の氷結合ドメインの立体構造（換言すれば、平面構造）をより良く保ち、かつ、物質に対する結合ドメインの結合力をより強くするという観点から、上述した変異の中では、アミノ酸置換が好ましい。

上記変異において、氷結合ドメインのアミノ酸配列に対して変異が生じるアミノ酸の数は、特に限定されず、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または、１０個以上であってもよい。上記変異において、氷結合ドメインのアミノ酸配列に対して変異が生じるアミノ酸の数の上限値は、特に限定されず、例えば、２０個、１８個、１６個、１４個、１２個、または、１０個であり得る。

不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されている、アミノ酸置換であることが好ましい。当該構成であれば、より効率良く、プロテインタグの結合特異性（換言すれば、プロテインタグが結合する物質の種類、および／または、特定の物質に対する結合力の強さ）を変化させることができるとともに、物質に対するプロテインタグの結合力を高くすることができる。なお、置換されるスレオニンの数が複数個である場合、各スレオニンは、同一のアミノ酸に置換されてもよいし、異なるアミノ酸に置換されてもよい。プロテインタグの結合特異性をより高めるという観点からは、各スレオニンは、同一のアミノ酸に置換されることが好ましい。

上記アミノ酸ａは、スレオニン以外の任意のアミノ酸であればよく、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または、プロリンであり得る。アミノ酸ａを適宜選択することによって、プロテインタグの結合特異性を変化させることができる。

例えば、アミノ酸ａとしてリシンを選択すれば、アスベスト（例えば、アモサイト、若しくは、クロシドライト）、または、炭化ケイ素ウィスカーに対する結合特異性が高いプロテインタグを実現することができる。アミノ酸ａとしてグルタミン酸を選択すれば、アスベスト（例えば、クリソタイル）に対する結合特異性が高いプロテインタグを実現することができる。アミノ酸ａとしてヒスチジンを選択すれば、酸化チタンに対する結合特異性が高いプロテインタグを実現することができる。勿論、本発明におけるアミノ酸ａは、これらの例に限定されない。

アミノ酸ａとして様々なアミノ酸を有するプロテインタグのライブラリを作製し、当該ライブラリと所望の物質とを接触させ、所望の物質に結合しているプロテインタグを同定することにより（換言すれば、物質に結合しているプロテインタグのアミノ酸ａが何れのアミノ酸であるか同定することにより）、所望の物質に結合し得るプロテインタグを見出すことができる。このことからも、本発明におけるアミノ酸ａが限定されないことは、明らかであろう。また、後述する「スクリーニング方法」および「スクリーニングキット」の欄によって、本発明におけるアミノ酸ａが限定されないことが、更に明らかになるであろう。

本実施の形態のプロテインタグでは、野生型の氷結合ドメインに下記のアミノ酸で表されるモチーフが含まれており、置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであってもよい：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ− ・・・・（配列番号１）
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。）。

野生型の氷結合ドメインを構成する上記モチーフの数は、１個であってもよいし、複数個（例えば、２個以上、３個以上、4個以上、または、５個以上）であってもよい。また、野生型の氷結合ドメインは、上記モチーフを含むドメインであってもよいし、上記モチーフからなるドメインであってもよい。

「上記モチーフを含むドメイン」とは、氷結合ドメインを構成する全アミノ酸の数をｘ個、氷結合ドメインに含まれる上記モチーフを構成する全アミノ酸の数をｙ個とした時に、「ｙ÷ｘ×１００」（％）の値が、３０％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０（％）以上、より好ましくは７０（％）以上、より好ましくは８０（％）以上、より好ましくは９０（％）以上、より好ましくは９５（％）以上、最も好ましくは９８（％）以上である、ドメインを意図する。「ｙ÷ｘ×１００」（％）の値の上限値は、特に限定されず、例えば９８（％）または１００（％）であり得る。

より具体的に、野生型の氷結合ドメインは、以下の配列番号２または３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むもの、または、以下の配列番号２または３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドからなるもの、であってもよい。つまり、
−ＡＮＴＣＴＧＳＴＤＣＮＴＡＱＴＣＴＮＳＫＤＣＦＥＡ− （配列番号２）；
−ＮＡＶＴＣＴＮＳＱＨＣＶＫＡＮＴＣＴＧＳＴＤＣＮＴＡＱＴＣＴＮＳＫＤＣＦＥＡＮＴＣＴＤＳＴＮＣＹ− （配列番号３）。

なお、不凍タンパク質の一例としてＴｍＡＦＰ（塩基配列：配列番号４、アミノ酸配列：配列番号５）が知られている。ＴｍＡＦＰでは、まず、配列番号４の塩基配列にしたがってタンパク質が生成された後、当該タンパク質のアミの末端から数えて第１番目〜第２８番目のアミノ酸に対応するシグナル配列が切断・除去されて、成熟したＴｍＡＦＰが形成される。

配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、成熟したＴｍＡＦＰ（アミノ末端にメチオニンを付加）のアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸からなる領域であり、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、成熟したＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第２４番目〜７１番目のアミノ酸からなる領域である。

上述した配列番号２に示すアミノ酸配列の場合、変異型の氷結合ドメインでは、例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ末端から数えて、３番目、５番目、１５番目、または、１７番目のスレオニンのうちの少なくとも１つを置換してもよい。

上述した配列番号３に示すアミノ酸配列の場合、変異型の氷結合ドメインでは、例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列のアミノ末端から数えて、１６番目、１８番目、２８番目、または、３０番目のスレオニンのうちの少なくとも１つを置換してもよい。

野生型の氷結合ドメイン内にアミノ酸ａと同じアミノ酸が含まれている場合は、変異型の氷結合ドメインでは、野生型の氷結合ドメインに元来含まれているアミノ酸ａと同じアミノ酸が、アミノ酸ａとは別の任意のアミノ酸ｂに置換されていることが好ましい。

上述したように、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されている、アミノ酸置換であることが好ましい。この場合、置換後のアミノ酸ａが、プロテインタグと物質との結合において、重要な役割を担うことになる。変異型の氷結合ドメイン内に不要なアミノ酸ａが存在すると、当該不要なアミノ酸ａが、プロテインタグの結合特異性に影響を与える場合がある。しかしながら、上記構成であれば、変異型の氷結合ドメイン内に不要なアミノ酸ａが存在しないので、重要な役割を担うアミノ酸ａが正常に機能し、プロテインタグの結合特異性を上げることができる。

アミノ酸ｂは、アミノ酸ａと異なるアミノ酸であればよく、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または、プロリンであり得る。

プロテインタグの結合特異性に対して不要な影響を与えない、換言すれば、プロテインタグの結合特異性を上げるという観点からは、アミノ酸ｂは、タンパク質の立体構造に影響を与えることが少ないアミノ酸（例えば、グリシン、または、アラニン）であることが好ましい。

本実施の形態のプロテインタグは、以下のように構成することもできる。

本実施の形態のプロテインタグでは、上記変異は、アミノ酸置換であることが好ましい。

本実施の形態のプロテインタグでは、上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されていることが好ましい。

本実施の形態のプロテインタグでは、上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが含まれており、上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであることが好ましい：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す）。

本実施の形態のプロテインタグでは、野生型の氷結合ドメイン内にアミノ酸ａと同じアミノ酸が含まれている場合は、元来含まれているアミノ酸ａと同じアミノ酸が、アミノ酸ａとは別の任意のアミノ酸ｂに置換されていることが好ましい。

〔２．結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法〕
上述したプロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異の種類に応じて、結合する物質が変化する。このことは、様々な変異が生じた様々なプロテインタグ（換言すれば、プロテインタグのライブラリ）の中には、所望の物質に対して結合し得るプロテインタグが含まれている可能性があることを示している。

そこで、本実施の形態の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージ（換言すれば、ファージライブラリ）と、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴としている。

本実施の形態のスクリーニング方法では、ファージと結晶構造を有する目的物質とを接触させる工程によって、特定のプロテインタグを提示しているファージが目的物質に特異的に結合し、ファージを回収する工程によって、目的物質に特異的に結合しているファージのみを選択的に回収する。そして、回収されたファージが提示しているプロテインタグを同定することによって（換言すれば、回収されたファージが提示しているプロテインタグのアミノ酸配列、または、塩基配列を解読することによって）、目的物質に特異的に結合するプロテインタグを同定することができる。

ファージディスプレイ法自体は、すでに確立された技術であるので、本実施の形態のスクリーニング方法は、基本的に、周知のファージディスプレイ法に基づいて行うことができる。

上記ファージは、様々な変異が生じた様々なプロテインタグを提示したファージの集団である、ファージライブラリであることが好ましい。当該構成であれば、所望の物質に結合し得るプロテインタグを、効率よく入手することができる。なお、プロテインタグの詳細については既に説明したので、ここでは説明を省略する。

ファージディスプレイ法に用いるベクターとしては、特に限定されず、ファージベクター、または、ファージミドベクターを用いることができる。より具体的に、ベクターとしては、繊維状ｆｄファージ（Ｍ１３ファージ）、λファージ、Ｔ４ファージ、または、Ｔ７ファージを用いることができるが、勿論、本発明は、これらに限定されない。

上記ベクターには、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグをコードする遺伝子が挿入される。なお、ベクターへの遺伝子の挿入は、周知の遺伝子工学の手法にしたがって行い得るので、ここでは、その説明を省略する。

本実施の形態のスクリーニング方法は、以下のように構成することも可能であるが、本発明は、勿論これらに限定されない。

本実施の形態のスクリーニング方法では、上記変異は、アミノ酸置換であることが好ましい。

本実施の形態のスクリーニング方法では、上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されていることが好ましい。

本実施の形態のスクリーニング方法では、上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが含まれており、上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであることが好ましい：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。）。

本実施の形態のスクリーニング方法では、野生型の氷結合ドメイン内にアミノ酸ａと同じアミノ酸が含まれている場合は、元来含まれているアミノ酸ａと同じアミノ酸が、アミノ酸ａとは別の任意のアミノ酸ｂに置換されていることが好ましい。

〔３．結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキット〕
本実施の形態の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキットは、上述した結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法の実施に利用され得るキットである。

つまり、本実施の形態の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキットは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグをコードする遺伝子を含有する、ファージベクターまたはファージミドベクターを備えていることを特徴としている。

プロテインタグの詳細については既に説明したので、ここでは説明を省略する。また、当該プロテインタグをコードする遺伝子は、プロテインタグをコードしていればよく、プロテインタグを構成する各アミノ酸に対応するコドンは、特に限定されない。

ベクターとしては、特に限定されず、ファージベクター、または、ファージミドベクターを用いることができる。より具体的に、ベクターとしては、繊維状ｆｄファージ（Ｍ１３ファージ）、λファージ、Ｔ４ファージ、または、Ｔ７ファージを用いることができるが、勿論、本発明は、これらに限定されない。

本実施の形態のスクリーニングキットは、以下のように構成することも可能であるが、本発明は、勿論これらに限定されない。

本実施の形態のスクリーニングキットでは、上記変異は、アミノ酸置換であることが好ましい。

本実施の形態のスクリーニングキットでは、上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されていることが好ましい。

本実施の形態のスクリーニングキットでは、上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが含まれており、上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであることが好ましい：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。）。

本実施の形態のスクリーニングキットでは、野生型の氷結合ドメイン内にアミノ酸ａと同じアミノ酸が含まれている場合は、元来含まれているアミノ酸ａと同じアミノ酸が、アミノ酸ａとは別の任意のアミノ酸ｂに置換されていることが好ましい。

〔４．結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグの製造方法〕
本実施の形態の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグの製造方法は、ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージ（換言すれば、ファージライブラリ）と、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴としている。

本実施の形態の製造方法では、ファージと結晶構造を有する目的物質とを接触させる工程によって、特定のプロテインタグを提示しているファージが目的物質に特異的に結合し、ファージを回収する工程によって、目的物質に特異的に結合しているファージのみを選択的に回収する。そして、回収されたファージが提示しているプロテインタグを同定することによって（換言すれば、回収されたファージが提示しているプロテインタグのアミノ酸配列、または、塩基配列を解読することによって）、目的物質に特異的に結合するプロテインタグを同定することができる。

ファージディスプレイ法自体は、すでに確立された技術であるので、本実施の形態の製造方法は、基本的に、周知のファージディスプレイ法に基づいて行うことができる。

本実施の形態の製造方法は、以下のように構成することも可能であるが、本発明は、勿論これらに限定されない。

本実施の形態の製造方法では、上記変異は、アミノ酸置換であることが好ましい。

本実施の形態の製造方法では、上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されていることが好ましい。

本実施の形態の製造方法では、上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが含まれており、上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであることが好ましい：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す。）。

本実施の形態の製造方法では、野生型の氷結合ドメイン内にアミノ酸ａと同じアミノ酸が含まれている場合は、元来含まれているアミノ酸ａと同じアミノ酸が、アミノ酸ａとは別の任意のアミノ酸ｂに置換されていることが好ましい。

本実施の形態の製造方法は、結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程の後に、ファージによって提示されているプロテインタグのアミノ酸配列、および／または、塩基配列を解読する工程を有していてもよい。当該構成であれば、化学的なポリペプチド合成法、または、細胞を用いた組み換えタンパク質の発現法によって、プロテインタグをより容易に製造することができる。

本実施の形態の製造方法は、ファージによって提示されているプロテインタグのアミノ酸配列、および／または、塩基配列を解読する工程の後に、解読されたプロテインタグのアミノ酸配列、および／または、塩基配列にしたがって、プロテインタグを作製する工程、および／または、プロテインタグをコードするポリヌクレオチドを作製する工程を有していてもよい。当該構成であれば、化学的なポリペプチド合成法、または、細胞を用いた組み換えタンパク質の発現法によって、プロテインタグをより容易に製造することができる。

〔１．タンパク質発現ベクターの構築〕
〔１−１．ビオチン化タンパク質の発現ベクターの構築〕
ビオチンにて修飾されたタンパク質を作製するために、まず、ビオチン化タンパク質の発現ベクターの構築を行なった。

タンパク質発現ベクターであるｐＥＴ２１−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２を用いてインバースＰＣＲを行なうことにより、ｐＥＴ２１−ｂ内のＨｉｓＴａｇの上流に、目的のタンパク質をビオチン化するためのビオチン化Ｔａｇを挿入した。オリゴヌクレオチドプライマーＰ１、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ２の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
Ｐ１：
5’‐GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACACCACCACCACCACCACTGAACTA‐3’（配列番号１１）、
Ｐ２：
5’‐CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC‐3’（配列番号１２）。

インバースＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。ビオチン化タンパク質の発現ベクターを「ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

〔１−２．アスベスト結合タンパク質であるＨ−ＮＳ_{６０−９０}の発現ベクターの構築〕
大腸菌Ｋ−１２株（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ１２，ＡＴＣＣ７００９２６）のゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ３、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ４を用いてＰＣＲを行なうことにより、アスベスト結合タンパク質であるＨ−ＮＳ（データベース名：ＧｅｎＢａｎｋ，アクセッションＮｏ．：ＡＡＣ７４３１９）のアミノ末端から数えて第６０番目〜９０番目のアミノ酸をコードする遺伝子を増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーＰ３、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ４の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
Ｐ３：
5’‐CATATGCAATATCGCGAAATGCTGATC‐3’（配列番号１３）、
Ｐ４：
5’‐GGATCCAAACAACGTTTAGCTTTGGTGCC‐3’（配列番号１４）。

ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓＮｅｏＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。

ＰＣＲ反応における増幅産物、および、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃの各々を、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにより３７℃で１時間処理した後、アガロースゲル電気泳動に供した。アガロースゲル電気泳動によって分離された増幅産物、および、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃの各々をアガロースゲルから切り出し、切り出された増幅産物、および、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを混合した後、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、１６℃、３０分間ライゲーションした。

当該ライゲーション産物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体から、増幅産物が挿入されたｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを抽出し、これを「ｐＥＴ−Ｈ−ＮＳ_{６０-９０}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

〔１−３．改変型ＴｍＡＦＰの発現ベクターの構築〕
不凍タンパク質として、Ｔｅｎｅｂｉｒｏｍｏｌｉｔｏｒの不凍タンパク質（ＴｅｎｅｂｉｒｏｍｏｌｉｔｏｒＡｎｔｉｆｒｅｅｚｅｐｒｏｔｅｉｎ：ＴｍＡＦＰ、データベース名：ＧｅｎＢａｎｋ，アクセッションナンバー：ＡＡＢ７０７５０）を用いた。

ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域（配列番号２）では、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目のスレオニン（Ｔ）が氷の結晶への結合に関与していると考えられている。そこで、まず、ＴｍＡＦＰの第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域に関して、上記の４つのスレオニン（Ｔ）を別のアミノ酸に置換した複数の改変型ＴｍＡＦＰの発現ベクターの構築を行なった。

（発現ベクターの構築１）
ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域に関して、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目の４つのスレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に置換したタンパク質（Ｔ３９Ｋ／Ｔ４１Ｋ／Ｔ５１Ｋ／Ｔ５３Ｋ（配列番号６））を「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}」と命名した。

このタンパク質の発現ベクターの構築では、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ６を用いたインバースＰＣＲを行なうことで、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ内のビオチン化Ｔａｇの上流にＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}をコードする遺伝子を挿入した。オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ６の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
Ｐ５：
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’（配列番号１５）、
Ｐ６：
5’‐TTTACATTTCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCTTTACATTTATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’（配列番号１６）。

インバースＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。このＴｍＡＦＰリシン置換体の発現ベクターを「ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

（発現ベクターの構築２）
ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域に関して、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目の４つのスレオニン（Ｔ）のうち、３９、４１および５１番目の３つのスレオニン（Ｔ）のみをリシン（Ｋ）に置換したタンパク質（Ｔ３９Ｋ／Ｔ４１Ｋ／Ｔ５１Ｋ（配列番号７））を「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}」と命名した。

このタンパク質の発現ベクターの構築では、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ７を用いたインバースＰＣＲを行なうことで、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ内のビオチン化Ｔａｇの上流にＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}をコードする遺伝子を挿入した。オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ７の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
Ｐ５：
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’（配列番号１５）、
Ｐ７：
5’‐GGTACATTTCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCTTTACATTTATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’（配列番号１７）。

インバースＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。このＴｍＡＦＰのリシン置換体の発現ベクターを「ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

（発現ベクターの構築３）
ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域に関して、第３９、４１、５１および５３番目の４つのスレオニン（Ｔ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換したタンパク質（Ｔ３９Ｅ／Ｔ４１Ｅ／Ｔ５１Ｅ／Ｔ５３Ｅ（配列番号８））を「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}」と命名した。

このタンパク質の発現ベクターの構築では、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ８を用いたインバースＰＣＲを行なうことで、ｐＥＴ２１-ＡｖｉＴａｇ-Ｃのビオチン化Ｔａｇの上流にＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}をコードする遺伝子を挿入した。オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ８の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
Ｐ５：
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’（配列番号１５）、
Ｐ８：
5’‐TTCACATTCCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCTTCACATTCATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’（配列番号１８）。

インバースＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。このＴｍＡＦＰグルタミン酸置換体の発現ベクターを「ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

（発現ベクターの構築４）
ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域に関して、第３９、４１、５１および５３番目の４つのスレオニン（Ｔ）をヒスチジン（Ｈ）に置換したタンパク質（Ｔ３９Ｈ／Ｔ４１Ｈ／Ｔ５１Ｈ／Ｔ５３Ｈ（配列番号９））を「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}」と命名した。

このタンパク質の発現ベクターの構築では、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ９を用いたインバースＰＣＲを行なうことで、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃのビオチン化Ｔａｇの上流にＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}をコードする遺伝子を挿入した。オリゴヌクレオチドプライマーＰ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＰ９の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
Ｐ５：
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’（配列番号１５）、
Ｐ９：
5’‐GTGACAGTGCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCGTGACAGTGATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’（配列番号１９）。

インバースＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った。このＴｍＡＦＰヒスチジン酸置換体の発現ベクターを「ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

（発現ベクターの構築５）
ＴｍＡＦＰのアミノ末端から第２４番目〜７１番目のアミノ酸領域（配列番号３）では、第２７、２９、３９、４１、５１、５３、６３および６５番目のスレオニン（Ｔ）が氷の結晶への結合に関与していると考えられている。

そこで、ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第２４番目〜７１番目のアミノ酸領域に関して、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目のスレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に置換し、さらに第３６および５６番目のリシン（Ｋ）をグリシン（Ｇ）に置換したタンパク質（Ｔ３９Ｋ／Ｔ４１Ｋ／Ｔ５１Ｋ／Ｔ５３Ｋ／Ｋ３６Ｇ／Ｋ５６Ｇ（配列番号１０））を「ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}」と命名した。

このタンパク質の発現ベクターの構築を行なった。まず、上記のタンパク質をコードする遺伝子の両端に、ＮｄｅＩとＮｏｔＩの制限酵素サイトを導入した遺伝子断片を設計し、この遺伝子断片を人工遺伝子合成サービス（ＧｅｎｅＡｒｔＳｔｒｉｎｇｓＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔｓ、ライフテクノロジー社）を利用して合成した。当該遺伝子断片の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
5’‐GGAATTCCATATGAATGCAGTGACCTGTACCAATAGCCAGCATTGTGTTGGTGCCAATAAATGTAAAGGTAGCAC
CGATTGTAATACCGCACAGAAATGTAAAAATAGCGGTGATTGCTTTGAAGCCAATACCTGCACCGATAGCACCAATTGTTATGGTAGTGCGGCCGCAAGAGC‐3’（配列番号２０）。

上述した遺伝子断片、および、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩにより３７℃で１時間処理した後、アガロースゲル電気泳動を行に供した。アガロースゲル電気泳動によって分離された遺伝子断片、および、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃの各々をアガロースゲルから切り出し、切り出された遺伝子断片、および、ｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを混合した後、ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、１６℃、３０分間ライゲーションした。

当該ライゲーション産物を用いて、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体から、遺伝子断片が挿入されたｐＥＴ２１−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを抽出し、これを「ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃ」と命名した。

〔２．タンパク質の大腸菌での発現、および、タンパク質の精製〕
〔２−１．アスベスト結合タンパク質Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}の発現および精製〕
ビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}の発現には、宿主として、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にビオチンリガーゼ発現ベクターであるｐＢｉｒＡｃｍが導入されたＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＢｉｒＡｃｍを用いた。

ｐＥＴ−Ｈ−ＮＳ_{６０-９０}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃプラスミドを用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＢｉｒＡｃｍを、カルベニシリン（終濃度５０ｍｇ／Ｌ）とクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）とを添加した２×ＹＴ培地を用いて、３７℃にて一晩培養した。

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＢｉｒＡｃｍの培養液を、２００ｍＬのＴＹＨ培地［トリプトン：２０ｇ／Ｌ、酵母エキス：１０ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ：１１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム：１ｇ／Ｌ、グルコース：０．５％、水酸化カリウムを用いてｐＨ７．２〜７．４に調整］にカルベニシリン（終濃度５０ｍｇ／Ｌ）とクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）とを添加した培地に対して、１％（ｖ／ｖ）植菌した。

ＯＤ_６００が０．６になるまで３７℃で培養した後、培地に対してＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（終濃度０．５ｍＭ）とＤ−ビオチン（終濃度１００μＭ）とを添加し、２８℃で４時間培養を行なった。

その後、培養液を遠心分離することで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＢｉｒＡｃｍを回収した。得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＢｉｒＡｃｍに１０ｍＬの緩衝液Ａ１［０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．０５ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール］を加えて懸濁した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＢｉｒＡｃｍを超音波によって破砕した。

得られた細胞破砕液をＨｉｓｔｒａｐＦＦｃｏｌｕｍｎ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に供し、カルボキシル末端にヒスチジンを有するビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}を当該カラムに吸着させた後、緩衝液Ｂ１［０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．０５ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５Ｍイミダゾール］を用いて、カラムからビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}を溶出させた。

取得したビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}について、ポリアクリルアミド電気泳動により精製度を確認したところ、精製度は９５％以上であった。

〔２−２．改変型ＴｍＡＦＰの大腸菌での発現および精製〕
以下では、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}の大腸菌での発現とその精製方法について述べるが、他の改変型ＴｍＡＦＰの大腸菌での発現とその精製方法も同様に行なった。

ビオチン化された改変型ＴｍＡＦＰの発現には、宿主として、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ社）にビオチンリガーゼ発現ベクターであるｐＢｉｒＡｃｍを導入したＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍを用いた。

ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを用いて形質転換した大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍを、カルベニシリン（終濃度５０ｍｇ／Ｌ）とクロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）とを添加したＴＹＨ培地を用いて、３７℃にて一晩培養した。

大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍの培養液を、５ｍＬのＭａｇｉｃＭｅｄｉａＥ．ｃｏｌｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジー社製）に、Ｄ−ビオチン（終濃度１００μＭ）、カルベニシリン（終濃度５０ｍｇ／Ｌ）、および、クロラムフェニコール（３０ｍｇ／Ｌ）を添加した培地に対して、２．５％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃で２８〜３８時間培養を行った。

その後、培養液を遠心分離することで、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍを回収した。得られた大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍに２ｍＬの緩衝液Ａ２［０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール］を加えて懸濁した後、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍを超音波により破砕した。

得られた細胞破砕液をＨｉｓＳｐｉｎＴｒａｐＴＡＬＯＮ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に供し、カルボキシル末端にヒスチジンを有するビオチン化ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}を当該カラムに吸着させた後、緩衝液Ｂ２［０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、０．０５ＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．２Ｍイミダゾール］を用いて、カラムからビオチン化ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}を溶出させた。

取得したビオチン化ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}について、ポリアクリルアミド電気泳動により精製度を確認したところ、精製度は９５％以上であった。なお、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}の発現には、ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}の発現には、ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}の発現には、ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}の発現には、ｐＥＴ２１−ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}−ＡｖｉＴａｇ−Ｃを、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅＴ７ｐＢｉｒＡｃｍに導入して得られた形質転換体を用い、精製は上記と同様な方法で行なった。

取得したビオチン化ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}、ビオチン化ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}、ビオチン化ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}、および、ビオチン化ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}の精製度は、全て９５％以上であった。

〔３．タンパク質の蛍光標識〕
タンパク質の蛍光修飾は、ビオチン−ストレプトアビジンの相互作用を用いて、蛍光標識されたストレプトアビジンにビオチン化されたタンパク質を結合させることによって行った。なお、当該方法であれば、１分子の蛍光標識されたストレプトアビジンに対して、４分子のビオチン化されたタンパク質を結合させることができ、より強固に対象物質に結合し得るタンパク質複合体を作製することができる。以下では、ビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}に蛍光標識する方法について述べるが、他のビオチン化された改変型ＴｍＡＦＰについても、同様の方法にしたがって蛍光標識を行なった。

６０．６μＬの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）緩衝液に、６０．６ｐｍｏｌの蛍光標識されたストレプトアビジンと、１２１２ｐｍｏｌのビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}とを加えて混合し、室温で１時間のインキュベートを行なった。この操作により、ビオチン化されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}と、蛍光標識されたストレプトアビジンとによって複合体を形成させることで、Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}に蛍光標識を行なった。なお、この複合体では、ストレプトアビジンの働きにより、Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}が４量体となっている。つまり、この複合体では、４つのＨ−ＮＳ_{６０−９０}が重合した４量体タンパク質が、蛍光色素によって標識されている。

蛍光色素ＣＦ４８８Ａで標識したストレプトアビジン（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）とＨ−ＮＳ_{６０−９０}との複合体を、「Ｈ−ＮＳ_{６０-９０}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＣＦ４８８Ａ」と命名し、上記ストレプトアビジンとＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}との複合体を、「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＣＦ４８８Ａ」と命名した。

蛍光色素Ｃｙ３で標識したストレプトアビジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}との複合体を、「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３」と命名し、上記ストレプトアビジンとＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}との複合体を、「ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３」と命名し、上記ストレプトアビジンとＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}との複合体を、「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３」と命名し、上記ストレプトアビジンとＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}との複合体を、「ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３」と命名した。

〔４．蛍光標識したタンパク質を用いたアモサイトの蛍光顕微鏡観察〕
被検物としてアモサイト（茶石綿）（ＪＡＷＥ２３１）を、１ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液Ｃ［０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０］に懸濁した。

蛍光色素ＣＦ４８８Ａで標識されたタンパク質（例えば、Ｈ−ＮＳ_{６０-９０}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＣＦ４８８Ａ、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＣＦ４８８Ａ）を、緩衝液Ｃで１００ｎＭとなるように希釈した。

蛍光色素Ｃｙ３で標識されたタンパク質（例えば、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３）を、緩衝液Ｃで４０ｎＭとなるように希釈した。

アモサイトを含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを、１：１の割合で混合し、蛍光標識されたタンパク質をアモサイトに結合させた。

アモサイトを含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを混合した混合液３〜５μＬをＳＬＩＤＥＧＬＡＳＳ（白縁磨１ｍｍ厚）上に滴下し、当該混合液の上にカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製、１８×１８ｍｍ）を載せて、観察用のプレパラートを作製した。

作製したプレパラートを、位相差／蛍光顕微鏡にて観察した。まず、位相差顕微鏡のモードにて観察を行ない、アモサイト繊維を確認した後に、蛍光顕微鏡のモードに切り換えて、位相差顕微鏡のモードにて観察した視野と同じ視野を観察した。なお、蛍光色素ＣＦ４８８Ａの観察には、位相差／蛍光顕微鏡としてＰｒｉｍｏＳｔａｒｉＬＥＤ（カールツァイス社製）を使用し、フィルタセット０９（ビームスプリッター：ＦＴ５１０，励起フィルター：ＢＰ４５０-４９０、蛍光フィルター：ＬＰ５１５）を用いた。画像の取り込みには、顕微鏡デジタルカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）を使用した。また、蛍光色素Ｃｙ３の観察には、位相差／蛍光顕微鏡として落射蛍光顕微鏡ＢＸ−６０（オリンパス社製）を使用し、Ｕ−ＭＮＧキューブ（ダイクロイックミラー：ＤＭ５７０、励起フィルター：ＢＰ５３０−５５０、吸収フィルター：ＢＡ５９０）を用いた。画像の取り込みには、顕微鏡デジタルカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）を使用した。

〔５．蛍光標識したタンパク質を用いたクリソタイルの蛍光顕微鏡観察〕
被検物としてクリソタイル（白石綿）（ＪＡＷＥ１１１）を、１ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液Ｃ［０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０］に懸濁した。

蛍光色素Ｃｙ３で標識されたＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}（ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３）を、緩衝液Ｃで１５．２ｎＭとなるように希釈した。

クリソタイルを含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを、１：１の割合で混合し、蛍光標識されたタンパク質をクリソタイルに結合させた。

クリソタイルを含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを混合した混合液３〜５μＬをＳＬＩＤＥＧＬＡＳＳ（白縁磨１ｍｍ厚）上に滴下し、当該混合液の上にカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製、１８×１８ｍｍ）を載せて、観察用のプレパラートを作製した。

作製したプレパラートを、位相差／蛍光顕微鏡にて観察した。まず、位相差顕微鏡のモードにて観察を行ない、クリソタイル繊維を確認した後に、蛍光顕微鏡のモードに切り換えて、位相差顕微鏡のモードにて観察した視野と同じ視野を観察した。なお、蛍光色素Ｃｙ３の観察には、位相差／蛍光顕微鏡として落射蛍光顕微鏡ＢＸ−６０（オリンパス社製）を使用し、Ｕ−ＭＮＧキューブ（ダイクロイックミラー：ＤＭ５７０、励起フィルター：ＢＰ５３０−５５０、吸収フィルター：ＢＡ５９０）を用いた。画像の取り込みには、顕微鏡デジタルカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）を使用した。

〔６．蛍光標識したタンパク質を用いた酸化チタンの蛍光顕微鏡観察〕
被検物として酸化チタン（Ｔ-８１４１、シグマ社製）を、１ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液Ｄ［０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３ＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０］に懸濁した。

蛍光色素Ｃｙ３で標識されたＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}（ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３）を、緩衝液Ｃで４０ｎＭとなるように希釈した。

酸化チタンを含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを、１：１の割合で混合し、蛍光標識されたタンパク質を酸化チタンに結合させた。

酸化チタンを含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを混合した混合液３〜５μＬをＳＬＩＤＥＧＬＡＳＳ（白縁磨１ｍｍ厚）上に滴下し、当該混合液の上にカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製、１８×１８ｍｍ）を載せて、観察用のプレパラートを作製した。

作製したプレパラートを、位相差／蛍光顕微鏡にて観察した。まず、位相差顕微鏡のモードにて観察を行ない、酸化チタン粒子を確認した後に、蛍光顕微鏡のモードに切り換えて、位相差顕微鏡のモードにて観察した視野と同じ視野を観察した。なお、蛍光色素Ｃｙ３の観察には、位相差／蛍光顕微鏡として落射蛍光顕微鏡ＢＸ−６０（オリンパス社製）を使用し、Ｕ−ＭＮＧキューブ（ダイクロイックミラー：ＤＭ５７０、励起フィルター：ＢＰ５３０−５５０、吸収フィルター：ＢＡ５９０）を用いた。画像の取り込みには、顕微鏡デジタルカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）を使用した。

〔７．結合特異性の評価〕
結合特異性の評価方法について、以下に説明する。

アスベストとして、アモサイト（茶石綿）（ＪＡＷＥ２３１）、または、クロシドライト（青石綿）（ＪＡＷＥ３３１）を用いた。非アスベスト繊維として、ＪＦＭ標準繊維状試料を用いた。具体的には、ＪＦＭ標準繊維状試料として、グラスウール（ＧＷ１）、ロックウール（ＲＷ１）、微細ガラス繊維（ＭＧ１）、耐火性繊維（ＲＦ１）、耐火性繊維（ＲＦ２）、ケイ酸アルミニウム繊維（ＲＦ３）、チタン酸カリウム繊維（ＰＴ１）、炭化ケイ素ウィスカー（ＳＣ１）、酸化チタンウィスカー（ＴＯ１）、または、ワラストナイト（ＷＯ１）を用いた。

評価方法は、蛍光標識されたタンパク質（例えば、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}）と被験物とを緩衝液中で混合した後、位相差／蛍光顕微鏡にて観察し、被験物上に蛍光が検出できれば「タンパク質は被験物に結合する」と判定し、被験物上に蛍光が検出されなければ「タンパク質は被験物に結合しない」と判定した。

具体的に、被験物として、アモサイト（茶石綿）（ＪＡＷＥ２３１）、クロシドライト（青石綿）（ＪＡＷＥ３３１）、微細ガラス繊維（ＭＧ１）、耐火性繊維（ＲＦ１）、耐火性繊維（ＲＦ２）、ケイ酸アルミニウム繊維（ＲＦ３）、チタン酸カリウム繊維（ＰＴ１）、炭化ケイ素ウィスカー（ＳＣ１）、酸化チタンウィスカー（ＴＯ１）、または、ワラストナイト（ＷＯ１）を用いる場合、これらの被験物の濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように、これらの被験物を緩衝液Ｃ［０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３ＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０］に懸濁した。

被験物として、グラスウール（ＧＷ１）、または、ロックウール（ＲＷ１）を用いる場合、これらの被験物の濃度が５ｍｇ／ｍＬとなるように、これらの被験物を緩衝液Ｃに懸濁した。

蛍光色素Ｃｙ３で標識したＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}（ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ３）について、４０ｎＭの濃度となるように、緩衝液Ｃで希釈した。

被験物を含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを、１：１の割合で混合し、蛍光標識されたタンパク質を被験物に結合させた。

被験物を含む溶液と蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とを混合した混合液３〜５μＬをＳＬＩＤＥＧＬＡＳＳ（白縁磨１ｍｍ厚）上に滴下し、当該混合液の上にカバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ製、１８×１８ｍｍ）を載せて、観察用のプレパラートを作製した。

作製したプレパラートを、位相差／蛍光顕微鏡にて観察した。まず、位相差顕微鏡のモードにて観察を行ない、被験物を確認した後に、蛍光顕微鏡のモードに切り換えて、位相差顕微鏡のモードにて観察した視野と同じ視野を観察した。被験物上に蛍光が検出できれば、「タンパク質は被験物に結合する」と判定し、被験物上に蛍光が検出されなければ、「タンパク質は被験物に結合しない」判定した。なお、蛍光色素Ｃｙ３の観察には、位相差／蛍光顕微鏡として落射蛍光顕微鏡ＢＸ−６０（オリンパス社製）を使用し、Ｕ−ＭＮＧキューブ（ダイクロイックミラー：ＤＭ５７０、励起フィルター：ＢＰ５３０−５５０、吸収フィルター：ＢＡ５９０）を用いた。画像の取り込みには、顕微鏡デジタルカメラＤＰ−７０（オリンパス社製）を使用した。

〔８．試験結果〕
〔８−１．試験結果１（ＴｍＡＦＰのスレオニンをリシンへ置換した置換体を用いたアスベストの検出）〕
図１に、ビオチンで標識されたＨ−ＮＳ_{６０−９０}と蛍光色素ＣＦ４８８Ａで標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト（具体的には、アモサイト）に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図１に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に蛍光が観察され、従来の報告どおり、Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}が、アモサイトに対する結合能を有していることが明らかになった。

図２に、ビオチンで標識されたＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}と蛍光色素ＣＦ４８８Ａで標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト（具体的には、アモサイト）に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図２に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に強い蛍光が観察され、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫＫ}が、アモサイトに対する強い結合能を有していることが明らかになった。

Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}を用いた場合と、ＴｍＡＦＰのリシン置換体を用いた場合とを比較すると、ＴｍＡＦＰのリシン置換体を用いた場合の方が、アモサイト上により強い蛍光が観察された。そこで、Ｈ−ＮＳ_{６０−９０}を用いた場合にアモサイト上で観察される蛍光強度と、ＴｍＡＦＰのリシン置換体を用いた場合にアモサイト上で観察される蛍光強度とを、輝度を比較することで評価した。具体的には、図１および図２の画像について、画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．４６ｖ）（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を用いて、アモサイトの平均輝度を算出した。その結果、図１におけるアモサイトの平均輝度は、３０．９０９であり、図２におけるアモサイトの平均輝度は、６６．７７３であった。すなわち、本願発明の方が、従来の方法よりも、蛍光強度が約２倍（≒６６．７７３／３０．９０９）高いことが分かった。この蛍光強度の向上によって、明るい環境下（例えば、野外）でのアスベストの検査において、アスベストをより観察し易くなり、本発明は、有用性が高いと考えられる。

以上のことから、氷の表面に適応した平面性の高い構造を有する不凍タンパク質を改変することで、結晶構造を有する所望の物質に対する結合性を有するタグを作製することに成功した。

〔８−２．試験結果２（ＴｍＡＦＰの３つのスレオニンをリシンへ置換した置換体を用いたアスベストの検出）〕
図３に、ビオチンで標識されたＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}と蛍光色素Ｃｙ３で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト（具体的には、アモサイト）に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図３に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に強い蛍光が観察され、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}が、アモサイトに対する強い結合能を有していることが明らかになった。

すわなち、不凍タンパク質の氷の結晶への結合に関与していると考えられる４つのスレオニンのうちの、３つだけを置換したＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＫＫＫ}であっても、アスベストへ結合し得ることが明らかになった。

〔８−３．試験結果３（ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}を用いたアスベストの検出と、結合の特異性）〕
図４に、ビオチンで標識されたＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}と蛍光色素Ｃｙ３で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト（具体的には、アモサイト）に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図４に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に強い蛍光が観察され、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}が、アモサイトに対する強い結合能を有していることが明らかになった。

また、図５および図６に示すように、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}は、同じ角閃石系アスベストであるクロシドライトにも結合した。一方、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}は、アスベストではないＪＦＭ標準繊維状試料では、炭化ケイ素ウィスカー（ＳＣ１）には結合が観察されたものの、他のＪＦＭ標準繊維状試料には結合が見られなかった。すなわち、ＴｍＡＦＰ_{２４−７１−ＫＫＫＫ}は、角閃石系アスベストに非常に特異的に結合すると考えられる。

〔８−４．試験結果４（ＴｍＡＦＰのスレオニンをグルタミン酸へ置換した置換体を用いたアスベストの検出）〕
図７に、ビオチンで標識されたＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}と蛍光色素Ｃｙ３で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト（具体的には、クリソタイル）に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図７に示すように、蛇紋石系アスベストであるクリソタイル上に強い蛍光が観察され、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＥＥＥＥ}が、クリソタイルに対する強い結合能を有していることが明らかになった。

このことは、スレオニンを置換するアミノ酸を変えれば、結合対象を変化させ得ることを示している。

〔８−５．試験結果５（ＴｍＡＦＰのスレオニンをヒスチジンに置換した置換体を用いた酸化チタンの検出）〕
図８に、ビオチンで標識されたＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}と蛍光色素Ｃｙ３で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、酸化チタンに対する結合能を評価した試験の結果を示す。図８に示すように、酸化チタン上に強い蛍光が観察され、ＴｍＡＦＰ_{３７−６１−ＨＨＨＨ}が、酸化チタンに対する強い結合能を有していることが明らかになった。

〔９．ＴｍＡＦＰファージライブラリの作製、および、プロテインタグのスクリーニング（アモサイト、酸化チタン）〕
〔９−１．ランダム変異が導入された不凍タンパク質をコードする遺伝子の調製〕
不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列にランダムなアミノ酸変異が導入されたタンパク質をコードする遺伝子の調製を行なった。

不凍タンパク質として、Ｔｅｎｅｂｉｒｏｍｏｌｉｔｏｒの不凍タンパク質（ＴｅｎｅｂｉｒｏｍｏｌｉｔｏｒＡｎｔｉｆｒｅｅｚｅｐｒｏｔｅｉｎ：ＴｍＡＦＰ、データベース名：ＧｅｎＢａｎｋ，アクセッションナンバー：ＡＡＢ７０７５０）を用いた。

ＴｍＡＦＰのアミノ末端から数えて第３７番目〜６１番目のアミノ酸領域（配列番号２）では、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目のスレオニン（Ｔ）が氷の結晶への結合に関与していると考えられている。そこで、この４つのスレオニン（Ｔ）を、ランダムなアミノ酸変異に置換した変異型タンパク質をコードする、変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子を設計した。

具体的には、上記の４つのスレオニン（Ｔ）をコードするコドンを、縮重コドンであるＮＮＫコドンセット（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ）に置換した、変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子を調製した。鋳型として配列番号２１にて示されるヌクレオチドを用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドプライマーＬ１およびオリゴヌクレオチドプライマーＬ２を用いてＰＣＲを行うことで、ランダム変異が導入された変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子を調製した。なお、ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用い、同社のプロトコールに従って行った：
Ｌ１：5’‐GCCCAGCCGGCCATGGCAAAT-3’（配列番号２２）、
Ｌ２：5’‐CGCACCTGCGGCCGCACTACCACCACCTGAACCACCAC-3’（配列番号２３）。

〔９−２．ランダム変異が導入されたＴｍＡＦＰを提示したファージライブラリの作製〕
ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ２の制限酵素サイトであるＳｉｆＩとＮｏｔＩとの間の領域に、上記〔９−１〕に記載のランダム変異が導入された変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングによって挿入し、当該ファージミドベクターを用いて大腸菌ＴＧ１株を形質転換した。更に、当該形質転換された大腸菌に、ヘルパーファージを感染させることによって、ランダム変異が導入された変異型ＴｍＡＦＰタンパク質を提示したファージライブラリを作製した。詳細を以下に示す。

まずｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ２にランダム変異が導入された変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子の挿入を行なった。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングでは、線状化したベクターに目的遺伝子をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応させることで、ベクターに目的遺伝子を挿入した。

具体的には、鋳型としてｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ２を用い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドプライマーＬ３およびオリゴヌクレオチドプライマーＬ４を用いてインバースＰＣＲを行うことで、線状化されたベクターを調製した。当該線状化されたｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ２に、上記の〔９−１〕で調製したランダム変異が導入された変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングにより挿入した：
Ｌ３：5’‐GCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCG-3’（配列番号２４）、
Ｌ４：5’‐CATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAG-3’（配列番号２５）。

Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングは、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ社）を用い、同社のプロトコールに従って行なった。この操作によって得られたランダム変異が導入された変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子が挿入されたファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ２を用いて、エレクトロポレーション（１７００Ｖ、２００Ω、２５μＦ）によって、大腸菌ＴＧ１株を形質転換した。

次に、形質転換された大腸菌ＴＧ１株にヘルパーファージを感染させることによって、ファージライブラリを作製した。

具体的には、形質転換された大腸菌ＴＧ１株を、２％の濃度にてグルコースを含有する２×ＹＴ（２×ＹＴＧ）液体培地１０ｍＬ中で、３７℃の条件下で、１時間振盪培養した。培養液に、カルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）と、４×１０^１０ｐｆｕのｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（New England Biolabs社）とを添加した後、当該培養液を、３７℃の条件下で１時間振盪した。その後、培養液を遠心分離（１０００ｇ、４℃、１０分間）に供し、培養液から上清を取り除くことで、余分なヘルパーファージを除去した。

遠心分離によって得られた沈殿物（大腸菌）を１０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に再懸濁し、当該懸濁物にカルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）とを加えた後、大腸菌を３７℃の条件下で１７時間培養した。

その後、培養物を遠心分離（１０００ｇ、４℃、２０分間）に供して大腸菌を沈殿させ、１０ｍＬの上清（ファージ画分）を回収した。当該１０ｍＬの上清に、２ｍＬの２．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０％ポリエチレングリコールを加えて懸濁し、当該懸濁物を氷中で１時間静置することによって、ファージを沈殿させた。

その後、遠心分離（１００００ｇ、４℃、２０分間）によって上清を取り除き、沈殿物（ファージ）を３ｍＬのＰＢＳに懸濁することによって、ファージを精製した。さらにファージを精製するために、上記懸濁液に対して遠心分離（１１６００ｇ、４℃、３分間）を２回行なった後、２．５ｍＬの上清（ファージ画分）を回収し、当該上清と２．５ｍＬの８０％グリセロールとを混合することによって、ファージライブラリ溶液を調製した。このファージライブラリ溶液は、使用するまで−２０℃の条件下で保存した。

＜試験結果＞
ファージライブラリサイズを算出すると、１．２２×１０^６であった。アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目のスレオニン（Ｔ）を縮重コドンであるＮＮＫコドンセット（Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ；Ｋ＝Ｇ、Ｔ）で置換しているため、考えられる変異の組み合わせは、（４×４×２）^４＝１．０４８×１０^６である。そのため、今回作製したファージライブラリのサイズは、考えられる変異の組み合わせを全てをカバーしていると考えられる。また、構築したファージライブラリから無作為に選んで、ＴｍＡＦＰ遺伝子をシークエンス解析したところ、すべて異なる配列であることも確認できた。

〔９−３．バイオパニングによる、アスベスト（アモサイト）または酸化チタンに結合する変異型ＴｍＡＦＰの取得〕
上記〔９−２〕で作製したランダム変異が導入されたＴｍＡＦＰタンパク質を提示したファージライブラリを用いて、アスベスト（アモサイト）または酸化チタンに結合する変異型ＴｍＡＦＰのスクリーニングを行なった。アスベストとしては、アモサイト（茶石綿）（ＪＡＷＥ２３１）を用い、酸化チタンとしては、酸化チタン（Ｔ−８１４１、シグマ社）を用いた。

具体的に、一回のバイオパニングの操作方法は、以下の方法にて行なった。アモサイト粒子１ｍｇまたは酸化チタン粒子１０ｍｇを２ｍＬのマイクロチューブ内で２ｍＬの緩衝液Ａ［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．３ＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）］に懸濁し、当該懸濁液を遠心分離（１１６００ｇ、４℃、３分間）に供して、アモサイト粒子または酸化チタン粒子を沈殿させた。

この沈殿物に、５．０×１０^９粒子に調整したファージライブラリの希釈液（上記〔９−２〕で作製したファージライブラリ溶液を緩衝液Ａで希釈したもの）を加えて懸濁し、当該懸濁液を３０分間撹拌した。その後、懸濁液を遠心分離（１１６００ｇ、４℃、３分間）に供し、上清を取り除くことによって、未結合のファージを取り除いた。

遠心分離によって得られた沈殿物に５００μＬの緩衝液Ａを加えて懸濁し、当該懸濁液の全量を新しい２ｍＬのマイクロチューブに移した。その後、懸濁液を遠心分離（１１６００ｇ、４℃、３分間）に供し、上清を取り除き、沈殿物に５００μＬの緩衝液Ａを添加して、沈殿物を洗浄した。この洗浄操作を５回繰り返して、アモサイト粒子または酸化チタン粒子に対して親和性を持たないファージを取り除いた。

洗浄操作の５回目では、遠心分離によって得られた沈殿物に緩衝液Ａを添加した後、懸濁し、当該懸濁液の全量を新しい１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。その後、懸濁液を遠心分離（１１６００ｇ、４℃、３分間）に供し、上清を取り除き、沈殿物を５００μＬの２×ＹＴ液体培地に懸濁した。当該２×ＹＴ液体培地４９０μＬと１０ｍＬの大腸菌ＴＧ１株培養液（２×ＹＴＧ培地で対数増殖期まで培養したもの）とを混合し、３７℃で１時間振盪することによって、ファージを大腸菌ＴＧ１株に感染させた。

培養液に、カルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）と、４×１０^１０ｐｆｕのｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（New England Biolabs社）とを添加し、３７℃で１時間振盪した。その後、培養液を遠心分離（１０００ｇ、４℃、１０分間）に供し、上清を取り除くことによって余分なヘルパーファージを除去した。

遠心分離によって得られた沈殿物を１０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に再懸濁し、当該懸濁液にカルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）とカナマイシン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）とを加え、３７℃の条件下で１７時間培養を行なった。その後、培養物を遠心分離（１０００ｇ、４℃、２０分間）に供し、大腸菌を沈殿させ、１０ｍＬの上清（ファージ画分）を回収した。１０ｍＬの上清に、２ｍＬの２．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０％ポリエチレングリコールを加えて懸濁し、当該懸濁液を氷中で１時間静置することでファージを沈殿させた。その後、懸濁液を遠心分離（１００００ｇ、４℃、２０分間）に供して、上清を取り除き、沈殿したファージを１ｍＬのＰＢＳに懸濁することによってファージを精製した。

さらにファージを精製するために、ファージの懸濁液を、遠心分離（１１６００ｇ、４℃、３分間）に２回供した後、９５０μＬの上清（ファージ画分）を回収し、当該上清と９５０μＬの８０％グリセロールとを混合し、次のバイオパニングで使用するまで−２０℃で保存した。以上の一連の操作が、一回のバイオパニングである。以後、２回目以降のバイオパニングも同じように行なった。最終的に、アモサイトおよび酸化チタンの両方とも、バイオパニングは合計で６回行なった。

６回目のパニング操作の後に得られた酸化チタンまたはアモサイトに結合するファージが提示する変異型ＴｍＡＦＰ遺伝子の塩基配列を決定した。

まず、後述するオリゴヌクレオチドプライマーＬ５、および、オリゴヌクレオチドプライマーＬ６を用いてＰＣＲを行うことによって、ＴｍＡＦＰ遺伝子を増幅した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて行い、同社のプロトコールに従って行った。ＰＣＲによって増幅されたＴｍＡＦＰ遺伝子の増幅産物は、２％アガロースゲルを用いた電気泳動によって分離して長さを確かめた後で、アガロースゲルから精製した。精製後の増幅産物を鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーＬ６を用いて、ダイデオキシターミネイト法によってＴｍＡＦＰ遺伝子の塩基配列を決定した（CEQ DTCS Quick start kit、ベックマン社）。増幅産物の泳動およびデータ解析には、キャピラリーシーケンサー（CEQ8000、ベックマン社）を用いた：
Ｌ５：5’‐CCATGATTACGAATTCTGGAGCC-3’（配列番号２６）、
Ｌ６：5’‐CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC-3’（配列番号２７）。

＜試験結果＞
６回目のパニング操作の後に得られたアモサイトまたは酸化チタンに結合するファージが提示する変異型ＴｍＡＦＰタンパク質のアミノ酸配列をシークエンス解析により決定した。

アモサイトに結合する変異型ＴｍＡＦＰタンパク質のアミノ酸配列の情報（特に、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目のアミノ酸の情報）を、以下の表２に示し、酸化チタンに結合する変異型ＴｍＡＦＰタンパク質のアミノ酸配列の情報（特に、アミノ末端から数えて第３９、４１、５１および５３番目のアミノ酸の情報）を、以下の表３に示す。

上記の結果から、本発明を用いれば、結合する物質（例えば、アスベスト、または酸化チタン等）ごとに、適したプロテインタグを製造することが可能になることが明らかになった。

本発明は、結晶構造を有する物質の検出などに利用することができる。

Claims

結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグであって、
上記プロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に３個以上の変異が生じている、結合ドメインを備えており、
上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、リシン、グルタミン酸、ヒスチジン、アラニン、バリン、システイン、アスパラギン、アルギニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グリシン、チロシン、または、フェニルアラニンに置換されているアミノ酸置換であり、
上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが２個以上含まれており、
上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであり：
モチーフ：−ＴＣＴＸ_１ＳＸ_２Ｘ_３ＣＸ_４Ｘ_５ＡＸ_６−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘ_１は、グリシンまたはアスパラギンを示し、Ｘ_２は、スレオニン、リシンまたはグルタミンを示し、Ｘ_３は、アスパラギン酸またはヒスチジンを示し、Ｘ_４は、アスパラギン、フェニルアラニンまたはバリンを示し、Ｘ_５は、スレオニン、グルタミン酸またはリシンを示し、Ｘ_６は、グルタミンまたはアスパラギンを示す）、
上記結晶構造を有する物質は、氷以外の物質であることを特徴とするプロテインタグ。
ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に３個以上の変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージと、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、
上記結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含み、
上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されているアミノ酸置換であり、
上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが２個以上含まれており、
上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであり：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す）、
上記結晶構造を有する目的物質は、アスベスト、酸化チタン、炭化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛、金、銀、白金、石英、酸化イリジウム、酸化鉄、または、ハイドロキシアパタイトであることを特徴とする、結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法。
不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に３個以上の変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグをコードする遺伝子を含有する、ファージベクターまたはファージミドベクターを備えている、結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキットであって、
上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸ａに置換されているアミノ酸置換であり、
上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが２個以上含まれており、
上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであり：
モチーフ：−ＴＣＴＸＳＸＸＣＸＸＡＸ−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘは任意のアミノ酸を示す）、
上記結晶構造を有する目的物質は、アスベスト、酸化チタン、炭化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛、金、銀、白金、石英、酸化イリジウム、酸化鉄、または、ハイドロキシアパタイトであることを特徴とするスクリーニングキット。
ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に３個以上の変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージと、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、
上記結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含み、
上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、リシン、グルタミン酸、ヒスチジン、アラニン、バリン、システイン、アスパラギン、アルギニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グリシン、チロシン、または、フェニルアラニンに置換されているアミノ酸置換であり、
上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが２個以上含まれており、
上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンであり：
モチーフ：−ＴＣＴＸ_１ＳＸ_２Ｘ_３ＣＸ_４Ｘ_５ＡＸ_６−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘ_１は、グリシンまたはアスパラギンを示し、Ｘ_２は、スレオニン、リシンまたはグルタミンを示し、Ｘ_３は、アスパラギン酸またはヒスチジンを示し、Ｘ_４は、アスパラギン、フェニルアラニンまたはバリンを示し、Ｘ_５は、スレオニン、グルタミン酸またはリシンを示し、Ｘ_６は、グルタミンまたはアスパラギンを示す）、
上記結晶構造を有する目的物質は、氷以外の物質であることを特徴とする、結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグの製造方法。
上記結晶構造を有する物質は、アスベスト、酸化チタン、炭化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛、金、銀、白金、石英、酸化イリジウム、酸化鉄、または、ハイドロキシアパタイトであることを特徴とする請求項１に記載のプロテインタグ。
上記結晶構造を有する目的物質は、アスベスト、酸化チタン、炭化ケイ素ウィスカー、酸化亜鉛、金、銀、白金、石英、酸化イリジウム、酸化鉄、または、ハイドロキシアパタイトであることを特徴とする請求項４に記載のプロテインタグの製造方法。
不凍タンパク質由来の野生型の氷結合ドメイン内の３個以上のスレオニンをリシン、グルタミン酸、ヒスチジン、アラニン、バリン、システイン、アスパラギン、アルギニン、イソロイシン、プロリン、セリン、グリシン、チロシン、または、フェニルアラニンに置換することを包含し、
上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが２個以上含まれており、
上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、１番目のスレオニン、および、３番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも１つのスレオニンである、氷以外の結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグの製造方法：
モチーフ：−ＴＣＴＸ_１ＳＸ_２Ｘ_３ＣＸ_４Ｘ_５ＡＸ_６−
（上記モチーフにおいて、Ｔはスレオニンを示し、Ｃはシステインを示し、Ｓはセリンを示し、Ａはアラニンを示し、Ｘ_１は、グリシンまたはアスパラギンを示し、Ｘ_２は、スレオニン、リシンまたはグルタミンを示し、Ｘ_３は、アスパラギン酸またはヒスチジンを示し、Ｘ_４は、アスパラギン、フェニルアラニンまたはバリンを示し、Ｘ_５は、スレオニン、グルタミン酸またはリシンを示し、Ｘ_６は、グルタミンまたはアスパラギンを示す）。