JPWO2017047704A1 - 結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグ、および、その利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施の形態のプロテインタグは、結晶構造を有する物質に結合するものであり、当該プロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメイン(換言すれば、変異型の氷結合ドメイン)を備えている。
モチーフ:−TCTXSXXCXXAX− ・・・・(配列番号1)
(上記モチーフにおいて、Tはスレオニンを示し、Cはシステインを示し、Sはセリンを示し、Aはアラニンを示し、Xは任意のアミノ酸を示す。)。
−ANTCTGSTDCNTAQTCTNSKDCFEA− (配列番号2);
−NAVTCTNSQHCVKANTCTGSTDCNTAQTCTNSKDCFEANTCTDSTNCY− (配列番号3)。
モチーフ:−TCTXSXXCXXAX−
(上記モチーフにおいて、Tはスレオニンを示し、Cはシステインを示し、Sはセリンを示し、Aはアラニンを示し、Xは任意のアミノ酸を示す)。
上述したプロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に生じる変異の種類に応じて、結合する物質が変化する。このことは、様々な変異が生じた様々なプロテインタグ(換言すれば、プロテインタグのライブラリ)の中には、所望の物質に対して結合し得るプロテインタグが含まれている可能性があることを示している。
モチーフ:−TCTXSXXCXXAX−
(上記モチーフにおいて、Tはスレオニンを示し、Cはシステインを示し、Sはセリンを示し、Aはアラニンを示し、Xは任意のアミノ酸を示す。)。
本実施の形態の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキットは、上述した結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法の実施に利用され得るキットである。
モチーフ:−TCTXSXXCXXAX−
(上記モチーフにおいて、Tはスレオニンを示し、Cはシステインを示し、Sはセリンを示し、Aはアラニンを示し、Xは任意のアミノ酸を示す。)。
本実施の形態の結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグの製造方法は、ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージ(換言すれば、ファージライブラリ)と、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴としている。
モチーフ:−TCTXSXXCXXAX−
(上記モチーフにおいて、Tはスレオニンを示し、Cはシステインを示し、Sはセリンを示し、Aはアラニンを示し、Xは任意のアミノ酸を示す。)。
〔1−1.ビオチン化タンパク質の発現ベクターの構築〕
ビオチンにて修飾されたタンパク質を作製するために、まず、ビオチン化タンパク質の発現ベクターの構築を行なった。
P1:
5’‐GCTCAGAAAATCGAATGGCACGAACACCACCACCACCACCACTGAACTA‐3’(配列番号11)、
P2:
5’‐CTCGAAGATGTCGTTCAGACCGCCACCCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTC‐3’(配列番号12)。
大腸菌K−12株(Escherichia coli K12, ATCC 700926)のゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチドプライマーP3、および、オリゴヌクレオチドプライマーP4を用いてPCRを行なうことにより、アスベスト結合タンパク質であるH−NS(データベース名:GenBank, アクセッションNo.:AAC74319)のアミノ末端から数えて第60番目〜90番目のアミノ酸をコードする遺伝子を増幅した。オリゴヌクレオチドプライマーP3、および、オリゴヌクレオチドプライマーP4の具体的な塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
P3:
5’‐CATATGCAATATCGCGAAATGCTGATC‐3’(配列番号13)、
P4:
5’‐GGATCCAAACAACGTTTAGCTTTGGTGCC‐3’(配列番号14)。
不凍タンパク質として、Tenebiro molitorの不凍タンパク質(Tenebiro molitor Antifreeze protein:TmAFP、データベース名:GenBank,アクセッションナンバー:AAB70750)を用いた。
TmAFPのアミノ末端から数えて第37番目〜61番目のアミノ酸領域に関して、アミノ末端から数えて第39、41、51および53番目の4つのスレオニン(T)をリシン(K)に置換したタンパク質(T39K/T41K/T51K/T53K(配列番号6))を「TmAFP37−61−KKKK」と命名した。
P5:
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’(配列番号15)、
P6:
5’‐TTTACATTTCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCTTTACATTTATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’(配列番号16)。
TmAFPのアミノ末端から数えて第37番目〜61番目のアミノ酸領域に関して、アミノ末端から数えて第39、41、51および53番目の4つのスレオニン(T)のうち、39、41および51番目の3つのスレオニン(T)のみをリシン(K)に置換したタンパク質(T39K/T41K/T51K(配列番号7))を「TmAFP37−61−KKK」と命名した。
P5:
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’(配列番号15)、
P7:
5’‐GGTACATTTCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCTTTACATTTATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’(配列番号17)。
TmAFPのアミノ末端から数えて第37番目〜61番目のアミノ酸領域に関して、第39、41、51および53番目の4つのスレオニン(T)をグルタミン酸(E)に置換したタンパク質(T39E/T41E/T51E/T53E(配列番号8))を「TmAFP37−61−EEEE」と命名した。
P5:
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’(配列番号15)、
P8:
5’‐TTCACATTCCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCTTCACATTCATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’(配列番号18)。
TmAFPのアミノ末端から数えて第37番目〜61番目のアミノ酸領域に関して、第39、41、51および53番目の4つのスレオニン(T)をヒスチジン(H)に置換したタンパク質(T39H/T41H/T51H/T53H(配列番号9))を「TmAFP37−61−HHHH」と命名した。
P5:
5’‐AATAGCAAAGATTGTTTTGAAGCCGGTGGTGGTGGTAGCGGTGGCGGTCTGAACGACATCTTCG‐3’(配列番号15)、
P9:
5’‐GTGACAGTGCTGTGCGGTATTACAATCGGTGCTACCGTGACAGTGATTTGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG‐3’(配列番号19)。
TmAFPのアミノ末端から第24番目〜71番目のアミノ酸領域(配列番号3)では、第27、29、39、41、51、53、63および65番目のスレオニン(T)が氷の結晶への結合に関与していると考えられている。
5’‐GGAATTCCATATGAATGCAGTGACCTGTACCAATAGCCAGCATTGTGTTGGTGCCAATAAATGTAAAGGTAGCAC
CGATTGTAATACCGCACAGAAATGTAAAAATAGCGGTGATTGCTTTGAAGCCAATACCTGCACCGATAGCACCAATTGTTATGGTAGTGCGGCCGCAAGAGC‐3’(配列番号20)。
〔2−1.アスベスト結合タンパク質H−NS60−90の発現および精製〕
ビオチン化されたH−NS60−90の発現には、宿主として、大腸菌BL21(DE3)(Novagen社)にビオチンリガーゼ発現ベクターであるpBirAcmが導入されたBL21(DE3)pBirAcmを用いた。
以下では、TmAFP37−61−KKKKの大腸菌での発現とその精製方法について述べるが、他の改変型TmAFPの大腸菌での発現とその精製方法も同様に行なった。
タンパク質の蛍光修飾は、ビオチン−ストレプトアビジンの相互作用を用いて、蛍光標識されたストレプトアビジンにビオチン化されたタンパク質を結合させることによって行った。なお、当該方法であれば、1分子の蛍光標識されたストレプトアビジンに対して、4分子のビオチン化されたタンパク質を結合させることができ、より強固に対象物質に結合し得るタンパク質複合体を作製することができる。以下では、ビオチン化されたH−NS60−90に蛍光標識する方法について述べるが、他のビオチン化された改変型TmAFPについても、同様の方法にしたがって蛍光標識を行なった。
被検物としてアモサイト(茶石綿)(JAWE231)を、1mg/mLとなるように緩衝液C[0.3M リン酸緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Tween80]に懸濁した。
被検物としてクリソタイル(白石綿)(JAWE111)を、1mg/mLとなるように緩衝液C[0.3M リン酸緩衝液(pH8.0)、0.3M NaCl、0.5% Tween80]に懸濁した。
被検物として酸化チタン(T-8141、シグマ社製)を、1mg/mLとなるように緩衝液D[0.3M リン酸緩衝液(pH7.0)、0.3M NaCl、0.5% Tween80]に懸濁した。
結合特異性の評価方法について、以下に説明する。
〔8−1.試験結果1(TmAFPのスレオニンをリシンへ置換した置換体を用いたアスベストの検出)〕
図1に、ビオチンで標識されたH−NS60−90と蛍光色素CF488Aで標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト(具体的には、アモサイト)に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図1に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に蛍光が観察され、従来の報告どおり、H−NS60−90が、アモサイトに対する結合能を有していることが明らかになった。
図3に、ビオチンで標識されたTmAFP37−61−KKKと蛍光色素Cy3で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト(具体的には、アモサイト)に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図3に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に強い蛍光が観察され、TmAFP37−61−KKKが、アモサイトに対する強い結合能を有していることが明らかになった。
図4に、ビオチンで標識されたTmAFP24−71−KKKKと蛍光色素Cy3で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト(具体的には、アモサイト)に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図4に示すように、角閃石系アスベストであるアモサイト上に強い蛍光が観察され、TmAFP24−71−KKKKが、アモサイトに対する強い結合能を有していることが明らかになった。
図7に、ビオチンで標識されたTmAFP37−61−EEEEと蛍光色素Cy3で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、アスベスト(具体的には、クリソタイル)に対する結合能を評価した試験の結果を示す。図7に示すように、蛇紋石系アスベストであるクリソタイル上に強い蛍光が観察され、TmAFP37−61−EEEEが、クリソタイルに対する強い結合能を有していることが明らかになった。
図8に、ビオチンで標識されたTmAFP37−61−HHHHと蛍光色素Cy3で標識されたストレプトアビジンとの複合体の、酸化チタンに対する結合能を評価した試験の結果を示す。図8に示すように、酸化チタン上に強い蛍光が観察され、TmAFP37−61−HHHHが、酸化チタンに対する強い結合能を有していることが明らかになった。
〔9−1.ランダム変異が導入された不凍タンパク質をコードする遺伝子の調製〕
不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列にランダムなアミノ酸変異が導入されたタンパク質をコードする遺伝子の調製を行なった。
L1:5’‐GCCCAGCCGGCCATGGCAAAT-3’(配列番号22)、
L2:5’‐CGCACCTGCGGCCGCACTACCACCACCTGAACCACCAC-3’(配列番号23)。
ファージミドベクターpCANTAB5E2の制限酵素サイトであるSifIとNotIとの間の領域に、上記〔9−1〕に記載のランダム変異が導入された変異型TmAFP遺伝子をIn−Fusionクローニングによって挿入し、当該ファージミドベクターを用いて大腸菌TG1株を形質転換した。更に、当該形質転換された大腸菌に、ヘルパーファージを感染させることによって、ランダム変異が導入された変異型TmAFPタンパク質を提示したファージライブラリを作製した。詳細を以下に示す。
L3:5’‐GCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCG-3’(配列番号24)、
L4:5’‐CATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAG-3’(配列番号25)。
ファージライブラリサイズを算出すると、1.22×106であった。アミノ末端から数えて第39、41、51および53番目のスレオニン(T)を縮重コドンであるNNKコドンセット(N=A、T、G、C;K=G、T)で置換しているため、考えられる変異の組み合わせは、(4×4×2)4=1.048×106である。そのため、今回作製したファージライブラリのサイズは、考えられる変異の組み合わせを全てをカバーしていると考えられる。また、構築したファージライブラリから無作為に選んで、TmAFP遺伝子をシークエンス解析したところ、すべて異なる配列であることも確認できた。
上記〔9−2〕で作製したランダム変異が導入されたTmAFPタンパク質を提示したファージライブラリを用いて、アスベスト(アモサイト)または酸化チタンに結合する変異型TmAFPのスクリーニングを行なった。アスベストとしては、アモサイト(茶石綿)(JAWE231)を用い、酸化チタンとしては、酸化チタン(T−8141、シグマ社)を用いた。
L5:5’‐CCATGATTACGAATTCTGGAGCC-3’(配列番号26)、
L6:5’‐CGATCTAAAGTTTTGTCGTCTTTCC-3’(配列番号27)。
6回目のパニング操作の後に得られたアモサイトまたは酸化チタンに結合するファージが提示する変異型TmAFPタンパク質のアミノ酸配列をシークエンス解析により決定した。
Claims (8)
- 結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグであって、
上記プロテインタグは、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えていることを特徴とするプロテインタグ。 - 上記変異は、アミノ酸置換であることを特徴とする請求項1に記載のプロテインタグ。
- 上記変異は、野生型の氷結合ドメイン内のスレオニンが、スレオニンとは別の任意のアミノ酸aに置換されていることを特徴とする請求項2に記載のプロテインタグ。
- 上記野生型の氷結合ドメインには下記のアミノ酸で表されるモチーフが含まれており、
上記置換されるスレオニンは、下記モチーフのアミノ末端から数えて、1番目のスレオニン、および、3番目のスレオニンからなる群より選択される少なくとも1つのスレオニンであることを特徴とする請求項3に記載のプロテインタグ:
モチーフ:−TCTXSXXCXXAX−
(上記モチーフにおいて、Tはスレオニンを示し、Cはシステインを示し、Sはセリンを示し、Aはアラニンを示し、Xは任意のアミノ酸を示す)。 - 野生型の氷結合ドメイン内にアミノ酸aと同じアミノ酸が含まれている場合は、
元来含まれているアミノ酸aと同じアミノ酸が、アミノ酸aとは別の任意のアミノ酸bに置換されていることを特徴とする請求項3または4に記載のプロテインタグ。 - ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージと、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、
上記結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴とする、結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニング方法。 - 不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグをコードする遺伝子を含有する、ファージベクターまたはファージミドベクターを備えていることを特徴とする、結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグのスクリーニングキット。
- ファージディスプレイ法によって、不凍タンパク質由来の氷結合ドメインのアミノ酸配列に変異が生じている、結合ドメインを備えているプロテインタグを提示したファージと、結晶構造を有する目的物質と、を接触させる工程と、
上記結晶構造を有する目的物質に結合したファージを回収する工程と、を含むことを特徴とする、結晶構造を有する目的物質に結合するプロテインタグの製造方法。
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