JP7416715B2 - ペプチド-核酸複合体 - Google Patents
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Description
本願は、2018年11月7日に、日本に出願された特願2018-209874号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
先ず、ピューロマイシンを有するリンカーとmRNAとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてmRNAからペプチドを合成し、合成されたペプチドとこれをコードするmRNAとがピューロマイシンを介して結合している複合体(mRNA-リンカー-ペプチド複合体)が生じる(非特許文献1参照)。
次いで、このmRNA-リンカー-ペプチド複合体のライブラリーを製造した後、製造したmRNA-リンカー-ペプチド複合体を逆転写酵素により逆転写し、cDNAを合成することにより、mRNA/cDNA-リンカー-ペプチド複合体のライブラリーを製造する。
次いで、このmRNA/cDNA-リンカー-ペプチド複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつペプチドを選択し、選択したmRNA/cDNA-リンカー-ペプチド複合体中のcDNAの塩基配列を解析することによりペプチドを同定する(非特許文献2参照)。
また、ベンジルグアニン修飾DNAを用いる方法では、20kDaのSNAPタグを介してタンパク質にDNAを連結するため、提示されたタンパク質の立体構造や機能が損なわれる恐れがある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ペプチド-核酸複合体を製造する新規な製造方法、当該製造方法により製造されるペプチド-核酸複合体、並びに当該製造方法に使用可能な核酸、及びキットを提供することを課題とする。
[1]ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド-核酸複合体の製造方法であって、(A1)トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、(B1)前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、(C1)前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体を形成させる工程と、を含む、ペプチド-核酸複合体の製造方法。
[2]前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[1]に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[3]前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[1]に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[4]前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[1]に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[5]前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、[1]~[4]のいずれか一つに記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[6]ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド-核酸複合体の製造方法であって、(A2)トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、(B2)前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、(C2)前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体を形成させる工程と、を含む、ペプチド-核酸複合体の製造方法。
[7]前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[6]に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[8]前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置されている、[6]に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[9]前記核酸が、さらに、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有しており、前記工程(B2)の後、且つ前記工程(C2)の前に、さらに、(D2)前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程、を含む、[6]~[8]のいずれか一つに記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[10]前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、[6]~[9]のいずれか一つに記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
[11](a)ペプチドと、(b)前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、(c)トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとN末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、前記(c)の配列が、前記(a)のペプチドと前記(b)の核酸との間に位置する、前記ペプチド-核酸複合体。
[12]前記(b)の核酸が、前記(a)のペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフ又は前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、[11]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[13]前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[12]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[14]前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[12]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[15]前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[12]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[16]前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフをコードする配列であり、前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[12]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[17]前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフをコードする配列であり、前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置されている、[12]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[18]前記(b)の核酸が、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列をさらに含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有している、[16]又は[17]に記載の核酸-ペプチド複合体。
[19][11]~[18]のいずれか一つに記載のペプチド-核酸複合体が固定化された固相担体。
[20][19]に記載の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイ。
[21]前記反応槽1個当たり、1種類の前記ペプチド-核酸複合体を含む、[20]に記載のペプチドアレイ。
[22]トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸。
[23]5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[22]に記載の核酸。
[24]5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[22]に記載の核酸。
[25]前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[22]に記載の核酸。
[26]トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸。
[27]5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[26]に記載の核酸。
[28]5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置されている、[26]に記載の核酸。
[29]前記核酸は、さらに、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、[26]~[28]のいずれか一つに記載の核酸。
[30][22]~[29]のいずれか一つに記載の核酸が固定化された固相担体。
[31]下記(a)~(d)を含む、ペプチド-核酸複合体の作製キット。
(a)任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸
(b)前記(a)の核酸における、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
(c)核酸増幅試薬
(d)無細胞タンパク質合成反応液
[32]前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[31]に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
[33]前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[31]に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
[34]前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、[31]に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
[35]下記(a)~(d)を含む、ペプチド-核酸複合体の作製キット。
(a)任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸
(b)前記(a)の核酸における、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
(c)核酸増幅試薬
(d)無細胞タンパク質合成反応液
[36]前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、[35]に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
[37]前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイトが、この順で、配置されている、[35]に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
[38]前記(a)の核酸は、さらに、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、[35]~[37]のいずれか一つに記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを意味する。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、DNAとRNAとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド(天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド(例えば、ホスホロチエート骨格)等)とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている1文字コードで記載される。本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、5’側から3’側に向かって記載される。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等と記載されるか、あるいはそれらの1文字コードで記載される場合がある。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」のアミノ酸配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている1文字コード又は3文字コードで記載される。本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」のアミノ酸配列は、特に明示しない限り、N末端側からC末端側に向かって記載される。
「ソルターゼ」として同定される酵素は、様々なグラム陽性菌から単離されている。天然には、これらの酵素は、細胞壁ソーティング反応を触媒する。細胞壁ソーティング反応では、ソルターゼ認識モチーフを有する表面タンパク質が切断され、タンパク質のC末端が、ペプチドグリカンのペンタグリシン架橋に共有結合される。ソルターゼを有するグラム陽性菌としては、アクチノマイセス(Actinomyces)属、バチルス(Bacillus)属、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属、セルロモナス(Cellulomonas)属、クロストリジウム(Clostridium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ノカルディア(Nocardia)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びストレプトミセス(Streptomyces)属等に属する細菌が挙げられる。ソルターゼは、グラム陽性菌ゲノム由来の61のソルターゼの配列アラインメント及び系統樹解析に基づいて、A、B、C、及びDと称する4クラスに分類されている(Dramsi S,Trieu-Cuot P,Bierne H,Sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positive bacteria.Res Microbiol.156(3):289-97,2005)。これらのクラスは、ソルターゼが、Comfort及びClubb(Comfort D,Clubb RT.A comparative genome analysis identifies distinct sorting pathways in gram-positive bacteria.Infect Immun. 72(5):2710-22,2004)によっても分類された以下のサブファミリー:クラスA(サブファミリー1)、クラスB(サブファミリー2)、クラスC(サブファミリー3)、クラスD(サブファミリー4及び5)に対応する。前述した参照文献は、多数のソルターゼ及び認識モチーフを開示している。
≪第1の態様≫
一実施形態において、本発明は、ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド-核酸複合体の製造方法を提供する。前記製造方法は、(A1)トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、(B1)前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、(C1)前記キメラタンパク質の前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体を形成させる工程と、を含む。
図1A~図1Cに基づき、本態様にかかる製造方法の第1実施形態の概略を説明する。
まず、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加された核酸100(以下、「NS付加核酸100」という場合がある。)を準備する(図1A;工程(A1))。NS付加核酸100は、任意のペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む。NS付加核酸100では、5’側から3’側に向かって、第1のコード配列、第3のコード配列、及び第2のコード配列が、この順で、配置されている。また、NS付加核酸100において、これらのコード配列は、前記第1のコード配列から翻訳される前記ペプチドのドメインと、第2のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第3のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得るように配置されている。
次に、NS付加核酸100から、無細胞タンパク質合成系を用いて、キメラタンパク質101を合成する(図1B;工程(B1))。キメラタンパク質101は、ペプチド10のドメイン、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22、及びトランスペプチダーゼ20のドメインを含んでいる。キメラタンパク質101において、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22は、ペプチド10のドメインのC末端側に位置している。キメラタンパク質101では、N末端側からC末端側に向かって、ペプチド10、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22、及びトランスペプチダーゼ20が、この順で配置されている。
次に、キメラタンパク質101のトランスペプチダーゼ20のドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体102を形成させる(図1C;工程(C1))。このようにして、ペプチド-核酸複合体を製造することができる。
以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
工程(A1)は、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程である。
トランスペプチダーゼは、特に限定されないが、ソルターゼが好ましい。ソルターゼは、ソルターゼ認識モチーフを認識して切断し、前記切断後のソルターゼ認識モチーフのC末端に、ソルターゼN末端基質モチーフのN末端を結合し得るものであれば、特に制限なく使用することができる。公知のソルターゼとしては、ソルターゼA、ソルターゼB、ソルターゼC、及びソルターゼDが知られている。本実施形態の製造方法では、これらのいずれのソルターゼも用いることができる。これらのソルターゼの塩基配列及びアミノ酸配列は、GenBank等の公知のデータベースから入手可能である。
ソルターゼのN末端基質モチーフとしては、例えば、1個以上のグリシン((G)n)又はアラニン((A)n)(nは1以上の整数)が挙げられる。中でも、ソルターゼのN末端基質モチーフは、1個以上のグリシンが好ましい。N末端基質モチーフにおけるグリシン残基の数は、1~10が好ましく、1~8がより好ましく、1~6又は1~5がさらに好ましい。
ソルターゼAの認識モチーフとしては、例えば、XAPXBXC又はXAPXBXCGのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、XAは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはメチオニンであり;XBは、任意のアミノ酸であり;XCは、トレオニン、セリン若しくはアラニンであり;Pは、プロリンであり;Gは、グリシンである。好ましい態様において、XAは、ロイシンであり;XCは、トレオニンであり;XBは、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アラニン、グルタミン、リシン又はメチオニンであり得る。例えば、ソルターゼAの認識モチーフの具体例としては、LPXTG(配列番号1)(LPATG(配列番号2)、LPNTG(配列番号3)など)、LPXAG(配列番号4)(LPNAG(配列番号5)など)、LPXTA(配列番号6)(LPNTA(配列番号7)など)、LGXTG(配列番号8)(LGATG(配列番号9)など)、IPXTG(配列番号10)(IPNTG(配列番号11)、IPETG(配列番号12)など)(Xは任意のアミノ酸を表す。)等が挙げられる。これらの中でも、ソルターゼAの認識モチーフとしては、LPXTG(配列番号1)が好ましい。
例えば、黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼAと比較して、LPETG(配列番号14)モチーフへの結合活性が最大140倍増大した黄色ブドウ球菌のソルターゼAの改変体が見出されており(Chen, I., et al., PNAS 108(28):11399-11404,2011)、そのようなソルターゼAを用いてもよい。例えば、ソルターゼAの改変体は、黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼAに対して、P94S若しくはP94R、E106G、F122Y、K154R、D160N、D165A、G174S、K190E、及びK196Tからなる群より選択される少なくとも1個の変異を有するものであってもよい。中でも、P94S若しくはP94R、D160N、D165A、G174S、及びK196Tからなる群より選択される少なくとも1個の変異を有するものが好ましく、前記の全ての変異を有するものがより好ましい。
ソルターゼBの認識モチーフは、NPXATXBのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、XAは、グルタミン又はリシンであり;XBは、アスパラギン又はグリシンであり;Nは、アスパラギンであり;Pは、プロリンであり;Tは、トレオニンである。ソルターゼBの認識モチーフの具体例としては、例えば、NPQTN(配列番号18)、NPKTG(配列番号19)、NSKTA(配列番号20)、NPQTG(配列番号21)、NAKTN(配列番号22)、及びNPQSS(配列番号23)等が挙げられる。
また、ソルターゼは、古細菌(Archea)(例えば、メタン生成菌(Methanobacterium thermoautotrophicum))由来のものであってもよい。
ブテラーゼのN末端基質モチーフとしては、例えば、XEXFが挙げられる。前記において、XEは、任意のアミノ酸であり;XFは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。ブテラーゼの認識モチーフは、例えば、XDHVのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、XDは、アスパラギン若しくはアスパラギン酸であり;Hは、ヒスチジンであり;Vは、バリンである。
ブテラーゼは、野生型のタンパク質に制限されず、トランスペプチダーゼ活性を有する限り、改変体であってもよい。ブテラーゼの改変体は、野生型ブテラーゼ又はその触媒ドメインのアミノ酸配列に対して、80%以上(例えば、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、又は99%以上)の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。あるいは、ブテラーゼの改変体は、野生型ブテラーゼのアミノ酸配列において、1個又は複数個(例えば、2~15個:2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、若しくは15個)のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。
NS付加核酸は、5’末端及び3’末端のいずれか一方に、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸である。図1Aに示すNS付加核酸100では、核酸30aの5’末端に、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加されている。図1Aにおいて、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21は、(X1)n(nは1以上)のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、前記X1は、グリシン又はアラニンであることが好ましく、グリシンであることがより好ましい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ1である場合、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21は、XEXF(XEは、任意のアミノ酸であり、XFは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである)で表されてもよい。
第1のコード配列は、DNAライブラリー等の複数種類のDNAの混合物由来のものであってもよい。第1のコード配列は、例えば、変異DNAライブラリー由来のものであり得る。変異DNAライブラリーとしては、Error-prone PCR(エラープローンPCR)を利用したライブラリー、Gene assembly mutagenesisを利用したライブラリー、Random insertion and deletion mutagenesisを利用したライブラリー、DNA shufflingを利用したライブラリー、Family shufflingを利用したライブラリー、Staggered Extension Process in vitro recombinationを利用したライブラリー、ITCHY Hybrid protein libraries、SCRATCHY Hybrid Protein Libraries、Sequence Homology-independent Protein Recombinationを利用したライブラリー、ホスホロアミダイト法による混合塩基合成を利用したライブラリー等が挙げられる。
第3のコード配列は、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
プロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、SP6プロモーター、T3プロモーター等が挙げられる。前記ORFは、プロモーターの制御下で発現されるように、プロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。
トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に付加すればよい。例えば、フォワードプライマーの5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21を付加してもよく、リバースプライマーの5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21を付加してもよい。
また、クリックケミストリ―に限定されず、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を介して、活性化剤及び架橋化剤等により、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21と核酸30aとを結合してもよい。さらに、臭素又ヨウ素を用いた求核置換反応、アルデヒド/ケトンとヒドラジドとの反応、プロペルギルエステルとアミノ基との反応、光架橋反応等を用いてもよい。
核酸を固相担体に固定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、アビジン-ビオチン結合を利用する方法;核酸をアミノ基、ホルミル基、SH基、などの官能基で修飾し、固相担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法;金-チオール結合を利用する方法等を用いることができる。中でも、アビジン-ビオチン結合を利用する方法が好適に用いられる。
核酸30aをPCR法により増幅する場合、増幅後の核酸30aが固相担体に固定化されるように、一方のプライマーが固相担体に固定化されたプライマーセットを用いてもよい。例えば、フォワードプライマーの5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加されている場合、リバースプライマーの5’末端を固相担体に固定化することができる。あるいは、リバースプライマーの5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加されている場合、フォワードプライマーの5’末端を固相担体に固定化することができる。プライマーを固相担体に固定化する方法としては、上記で挙げた方法と同様の方法を用いることができる。
PCRは、エマルションPCRであってもよい。例えば、一方のプライマーがビーズに固定化されたプライマーセットを用いて、PCR法により核酸30aを増幅する場合、エマルションPCRを行うことができる。エマルションPCRは、1分子の鋳型核酸又はプライマーを固定化した1個のビーズをエマルション内に区画化し、エマルション内で、プライマーを用いてPCRを行う手法である。一方のプライマーがビーズに固定化されている場合、1個のビーズごとに1個のエマルション内に区画化し、エマルション内でPCRを行うことにより、ビーズ表面に1種類の核酸を増幅及び固定することができる。また、プライマーがビーズに固定化されていない場合、1分子の鋳型核酸を、1個のエマルション内に区画化し、エマルション内でPCRを行ってもよい。これにより、エマルション内で同一種類の核酸を増幅することができる。
エマルション粒子の数は前記水性成分の体積からエマルション1個の体積を割ることにより算出される。よって、エマルション1個あたり平均1分子以下の鋳型核酸が含まれるようにW/O型エマルションを調製するためには、全体におけるエマルションの数以下の分子数の核酸30aを用意すればよい。
ただし、1個のビーズにつき、1種類のNS付加核酸100を提示させる方法は、エマルションPCRに限定されない。例えば、1分子の核酸30a及び1個のビーズを、1個の反応槽内に区画化し、PCR反応を行う方法を用いてもよい。
工程(B1)は、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程である。
キメラタンパク質101は、核酸30aから転写・翻訳されるタンパク質である。キメラタンパク質101は、ペプチド10のドメインと、トランスペプチダーゼ20のドメインと、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22と、を含んでいる。キメラタンパク質101において、N末端側からC末端側に向かって、ペプチド10のドメイン、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22、及びトランスペプチダーゼ20のドメインは、この順で配置されている。
図1Bにおいて、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22は、ZX1(Zはトランスペプチダーゼ認識モチーフにおけるC末端アミノ酸残基を除く配列を示し、X1はトランスペプチダーゼ認識モチーフにおけるC末端アミノ酸残基を示す。)のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、前記X1は、グリシン又はアラニンであることが好ましく、グリシンであることがより好ましい。Zとしては、上記のソルダーゼ認識モチーフとして例示した配列からC末端アミノ酸残基を除いた配列が挙げられ、具体的には、LPXT(配列番号31)(LPAT(配列番号32)、LPNT(配列番号33)など)、LPXA(配列番号34)(LPNA(配列番号35)など)、LPXT(配列番号36)(LPNT(配列番号37)など)、LGXT(配列番号38)(LGAT(配列番号39)など)、IPXT(配列番号40)(IPNT(配列番号41)、IPET(配列番号42)など)(Xは任意のアミノ酸を表す。)等が例示される。トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22は、XDHV(XDは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり;Hは、ヒスチジン;Vは、バリンである。)で表されてもよい。
キメラタンパク質101は、無細胞タンパク質合成系を用いて、NS付加核酸100から合成される。
無細胞タンパク質合成系とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の(或いは遺伝子工学的手法で得られた)リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸(DNAやmRNA)からそれがコードするmRNAやタンパク質をin vitroで合成可能な系である。無細胞タンパク質合成系では、一般的に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。前記細胞抽出液には、一般的に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、tRNA、RNAポリメラーゼ、アミノアシルtRNA合成酵素などの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、前記細胞抽出液に、各種アミノ酸;ATP、GTPなどのエネルギー源;クレアチンリン酸などのタンパク質合成に必要なその他の物質を添加する。また、別途用意したリボソーム、各種因子、及び/又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
広く利用されている無細胞タンパク質合成系としては、例えば、大腸菌S30抽出液の系(原核細胞の系)、コムギ胚芽抽出液の系(真核細胞の系)、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系(真核細胞の系)等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系に必要な試薬は、キットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。
NS付加核酸100がビーズに固定化されていない場合も、1分子のNS付加核酸100を、1個のエマルション粒子内に区画化し、前記エマルション内で無細胞タンパク質合成系によるキメラタンパク質101の合成を行ってもよい。この場合も、1個のエマルション粒子内に、1種類のNS付加核酸100と、前記NS付加核酸100から合成されたキメラタンパク質101とを共存させることができる。
エマルションの作製方法、及びエマルション粒子の大きさ等は、上記「[工程(A1)]」で例示したものと同様とすることができる。
ただし、1区画に、1種類のNS付加核酸100及び前記核酸から合成されたキメラタンパク質101を共存させる方法は、エマルション内での無細胞タンパク質合成に限定されない。例えば、1種類のNS付加核酸100を提示する1個のビーズを、1個の反応槽内に区画化し、無細胞タンパク質合成を行う方法を用いてもよい。
工程(C1)は、工程(B1)で合成されたキメラタンパク質のトランスペプチダーゼドメインのペプチド転移反応により、ペプチド-核酸複合体を形成させる工程である。
次いで、ペプチド転移反応により、前記タンパク質Aにおける配列22’のC末端には、NS付加核酸100のトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端が結合される。これにより、ペプチド10と前記ペプチドをコードする核酸30aとを含む、ペプチド-核酸複合体102が形成される。同時に、ペプチド転移反応生成物103が形成される。
キメラタンパク質101中のトランスペプチダーゼ20のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ZとX1との間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22が、配列22’と配列22”とに分割される。配列22’は、Zからなる配列であり、配列22”は、X1からなる配列である。次いで、配列22’のC末端のアミノ酸残基と、NS付加核酸100のトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端アミノ酸X1との間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド-核酸複合体102及びペプチド転移反応生成物103が生成される。
この場合、キメラタンパク質101中のトランスペプチダーゼ20のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、XDとHとの間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22は、XD(上記配列22’に対応)とHV(上記配列22”に対応)とに分割される。次いで、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22の切断C末端のアミノ酸残基(XD)と、NS付加核酸100のトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端アミノ酸配列XEXFとの間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド-核酸複合体102及びペプチド転移反応生成物103が生成される。
本明細書において、「トランスペプチダーゼ認識モチーフとトランスペプチダーゼN末端基質モチーフとが、結合して生じる配列」(以下、「TPR-NS配列」という場合がある)とは、トランスペプチダーゼにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフが切断して生じた配列のC末端に、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフのN末端が結合することにより生じる配列を意味する。図1Cの例では、TPR-NS配列は、Z(X1)nで表される配列である。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、通常、TPR-NS配列は、トランスペプチダーゼ認識モチーフと同じ配列を含んでいる。したがって、TPR-NS配列としては、上記ソルターゼ認識モチーフとして挙げた配列と同様のものが挙げられる。
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、TPR-NS配列としては、XDXEXF(XDは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり;XEは、任意のアミノ酸であり;XFは、ロイシン、イソロイシン、バリン又はシステインである。)で表される配列が挙げられる。
本実施形態の製造方法は、上記工程(A1)~(C1)に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は、特に限定されず、例えば、核酸、キメラタンパク質又はペプチド-核酸複合体の回収工程、洗浄工程、精製工程等が例示される。
図2A~図2Cに基づき、本態様にかかる製造方法の第2実施形態の概略を説明する。
本実施形態では、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加された核酸として、5’側から3’側に向かって、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、ペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第3のコード配列と、がこの順で配置された核酸30bに、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加されたもの(以下、「NS付加核酸200」という場合がある。)を用いる(図2A参照)。
NS付加核酸200は、第2のコード配列と第1のコード配列との間、及び第1のコード配列と第3のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第2のコード配列と第1のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、NS付加核酸200から発現されたキメラタンパク質201において、トランスペプチダーゼ20がトランスペプチダーゼ認識モチーフ22に結合しやすくなる。
キメラタンパク質201中のトランスペプチダーゼ20によるペプチド転移反応により、NS付加核酸200及びキメラタンパク質201から、ペプチド-核酸複合体202及びペプチド転移反応生成物203が生成される。
図3A~図3Cに基づき、本態様にかかる製造方法の第3実施形態の概略を説明する。
本実施形態では、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加された核酸として、5’側から3’側に向かって、ペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第3のコード配列と、がこの順で配置された核酸30cに、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21が付加されたもの(以下、「NS付加核酸300」という場合がある。)を用いる(図3A参照)。
NS付加核酸300は、第1のコード配列と第2のコード配列との間、及び第2のコード配列と第3のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第2のコード配列と第3のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、NS付加核酸300から発現されたキメラタンパク質301において、トランスペプチダーゼ20がトランスペプチダーゼ認識モチーフ22に結合しやすくなる。
キメラタンパク質301中のトランスペプチダーゼ20によるペプチド転移反応により、NS付加核酸300及びキメラタンパク質301から、ペプチド-核酸複合体302及びペプチド転移反応生成物303が生成される。
一実施形態において、本発明は、ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド-核酸複合体の製造方法を提供する。前記製造方法は、(A2)トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、(B2)前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、(C2)前記キメラタンパク質の前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体を形成させる工程と、を含む。
図4A~図4Cに基づき、本態様にかかる製造方法の第4実施形態の概略を説明する。
まず、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22が付加された核酸400(以下、「TPR付加核酸400」という場合がある。)を準備する(図4A;工程(A2))。TPR付加核酸400は、任意のペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む。TPR付加核酸400では、5’側から3’側に向かって、第3のコード配列、第1のコード配列、及び第2のコード配列が、この順で、配置されている。また、TPR付加核酸400において、これらのコード配列は、第1のコード配列から翻訳される前記ペプチドのドメインと、第2のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第3のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得るように配置されている。
次に、NS付加核酸400から、無細胞タンパク質合成系を用いて、キメラタンパク質401を合成する(図4B;工程(B2))。キメラタンパク質401は、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21、ペプチド10のドメイン、及びトランスペプチダーゼ20のドメインを含んでいる。キメラタンパク質401において、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21は、ペプチド10のドメインのN末端側に位置している。キメラタンパク質401では、N末端側からC末端側に向かって、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21、ペプチド10、及びトランスペプチダーゼ20が、この順で配置されている。
次に、キメラタンパク質401のトランスペプチダーゼ20のドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体402を形成させる(図4C;工程(C2))。このようにして、ペプチド-核酸複合体を製造することができる。
以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
工程(A2)は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程である。
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22は、XDHV(XDは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり;Hは、ヒスチジンであり;Vは、バリンである。)で表されてもよい。
第3のコード配列は、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
TPR付加核酸400が、第3のコード配列の5’末端に隣接して、第4のコード配列を有するTPR付加核酸400’であることにより、TPR付加核酸400’から発現されるキメラタンパク質401’は、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ41が配置される(図6A参照)。そのため、キメラタンパク質401’においては、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン(M)等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ40で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21をキメラタンパク質のN末端に露出させることができる(図6A参照)。
ただし、1個のビーズにつき、1種類のTPR付加核酸400を提示させる方法は、エマルションPCRに限定されない。例えば、1分子の核酸30d及び1個のビーズを、1個の反応槽内に区画化し、PCR反応を行う方法を用いてもよい。
プライマーがビーズに固定化されていない場合も、1分子の鋳型DNAを、1個のエマルション粒子内に区画化し、エマルションPCRを行ってもよい。
工程(B2)は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程である。
工程(C2)は、工程(B2)で合成されたキメラタンパク質のトランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、ペプチド-核酸複合体を形成させる工程である。
次いで、前記核酸Aにおける配列22’のC末端には、キメラタンパク質401のトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端が結合される。これにより、ペプチド10と、前記ペプチドをコードする核酸30dとを含む、ペプチド-核酸複合体402が形成される。
この場合、キメラタンパク質101中のトランスペプチダーゼ20のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、TPR付加核酸400中のトランスペプチダーゼ認識モチーフ22におけるXDとHとの間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22は、XD(上記配列22’に対応)とHV(上記配列22”に対応)とに分割される。次いで、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22の切断C末端のアミノ酸残基(XD)と、キメラタンパク質401のトランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端アミノ酸配列XEXFとの間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド-核酸複合体102及びペプチド転移反応生成物103が生成される。
本実施形態の製造方法は、上記工程(A2)~(C2)に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は、特に限定されず、例えば、核酸、キメラタンパク質又はペプチド-核酸複合体の回収工程、洗浄工程、精製工程等が例示される。核酸30dが、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含む場合には、下記工程(D2)を含むことが好ましい。
工程(D2)は、前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程である。工程(D2)は、前記工程(B2)の後、且つ前記工程(C2)の前に行われる。
したがって、キメラタンパク質401’においては、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21のN末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン(M)等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ40で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21がN末端に露出したキメラタンパク質401を得ることができる(図6A参照)。
図5A~図5Cに基づき、本態様にかかる製造方法の第5実施形態の概略を説明する。
本実施形態では、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22が付加された核酸として、5’側から3’側に向かって、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ21をコードする第3のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、ペプチドをコードする第1のコード配列と、がこの順で配置された核酸30eに、トランスペプチダーゼ認識モチーフ22が付加されたもの(以下、「TPR付加核酸500」という場合がある。)を用いる(図5A参照)。
TPR付加核酸500は、第3のコード配列と第2のコード配列との間、及び第2のコード配列と第1のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第3のコード配列と第2のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、TPR付加核酸500から発現されたキメラタンパク質501において、トランスペプチダーゼ20がトランスペプチダーゼ認識モチーフ22に結合しやすくなる。
キメラタンパク質501中のトランスペプチダーゼ20によるペプチド転移反応により、TPR付加核酸500及びキメラタンパク質501から、ペプチド-核酸複合体502及びペプチド転移反応生成物503が生成される。
一実施形態において、本発明は、(a)ペプチドと、(b)前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、(c)トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとN末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、前記(c)の配列が、前記(a)のペプチドと前記(b)の核酸との間に位置する、前記ペプチド-核酸複合体を提供する。前記ペプチド-核酸複合体は、トランスペプチダーゼを前記(a)のペプチドのN末端側若しくはC末端側に又は前記(c)の配列と前記(a)のペプチドの間に含むことができる。
さらに詳細に説明する。
ペプチドは、特に限定されず、任意のペプチドであってよい。ペプチドは、(b)の核酸によってコードされるペプチドである。ペプチドとしては、上記「<ペプチド-核酸複合体の製造方法>」の第1の態様の第1実施形態において例示したものと同様のものが例示される。(a)のペプチドは、キメラタンパク質に含まれるペプチドのドメインであってもよい。当該キメラタンパク質は、前記ペプチド以外のドメインを含み得る。前記キメラタンパク質は、例えば、トランスペプチダーゼのドメインを含んでいてもよい。前記キメラタンパク質としては、N末端側からC末端側に向かって、ペプチドのドメイン、及びトランスペプチダーゼのドメインが、この順で、配置された構成を有するキメラタンパク質;並びにN末端側からC末端側に向かって、トランスペプチダーゼのドメイン、及びペプチドのドメインが、この順で、配置された構成を有するキメラタンパク質等が挙げられる。前記トランスペプチダーゼとしては、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼA又はブテラーゼ1がより好ましく、ソルターゼAがさらに好ましい。
核酸は、前記(a)のペプチドをコードする核酸である。核酸は、前記(a)のペプチドをコードするものであればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。また、上記「ペプチド-核酸複合体の製造方法>」で例示したようなDNAライブラリー等の複数種類のDNAの混合物由来のものであってもよい。
また、核酸の例としては、5’側から3’側に向かって、トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列、任意のペプチドをコードする第1のコード配列、及びトランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(4);並びに5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(5)が挙げられる。これらの場合、核酸は、トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列をさらに含んでいてもよい。
核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼをコードする場合、前記に例示した核酸(1)~(5)のいずれであってもよいが、核酸(1)であることが好ましい。核酸がトランスペプチダーゼとしてブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸の中でも、核酸(2)~(5)であることが好ましい。
(c)の配列は、トランスペプチダーゼの認識モチーフとN末端基質モチーフとが、結合して生じる配列(TPR-NS配列)であり、上記「<ペプチド-核酸複合体の製造方法>」において説明したものと同様である。トランスペプチダーゼとしては、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼA又はブテラーゼ1がより好ましく、ソルターゼAがさらに好ましい。TPR-NS配列は、トランスペプチダーゼの種類により適宜選択することができる。例えば、トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、TPR-NS配列の好ましい具体例としては、LPXT(G)n(nは1以上の整数である。)が挙げられる。前記nとしては、1~10が好ましく、1~8がより好ましく、1~6又は1~5がさらに好ましい。あるいは、上記ソルターゼ認識モチーフとして挙げた配列と同様のものが挙げられる。
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、TPR-NS配列としては、XDXEXF(XDは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり;XEは、任意のアミノ酸であり;XFは、ロイシン、イソロイシン、バリン又はシステインである。)で表される配列が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、前記実施形態のペプチド-核酸複合体が固定化された固相担体を提供する。
固相担体としては、特に限定されないが、上記「<ペプチド-核酸複合体の製造方法>」で挙げたものと同様のものが挙げられる。中でも、固相担体としては、ビーズが好ましく、磁気ビーズがより好ましい。固相担体がビーズである場合、1個のビーズには、1種類のペプチド-核酸複合体が固定化されていることが好ましい。
本実施形態の固相担体は、後述のように反応槽に配置して用いてもよく、それ自体をペプチドアレイとして用いてもよい。以下に、本実施形態のペプチド-核酸複合体を用いて、所望のペプチドをコードする核酸を同定する具体例を記載するが、これに限定されない。
ペプチド-核酸複合体に、標識物質を結合させた特定物質を接触させる。例えば、ペプチド-核酸複合体を含む溶液に、標識物質を結合させた特定物質を添加して撹拌する。標識物質としては、公知の物質を特に制限なく用いることができ、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素;ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-D-ガラクトシダーゼ等の酵素;ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物;32P、131I、125I等の放射性同位体などを用いることができる。
固相担体としてのビーズに固定化したペプチド-核酸複合体と、酵素基質と、を含有するエマルションを調製する。エマルションは、例えば、内水相の水中油中水(W/O/W)型エマルジョンとすることができる。1個のエマルション粒子に、平均1個以下のビーズが内包されるように、エマルション粒子の大きさを調整する。次いで、エマルション内で酵素反応を行い、酵素反応を認めるエマルションを特定し、当該エマルションに内包されるペプチド-核酸複合体を回収する。酵素反応により蛍光が生ずる反応系とすれば、酵素反応の検出及びペプチド-核酸複合体の回収には、フローサイトメトリーを好適に利用することができる。
一実施形態において、本発明は、前記実施形態の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイを提供する。
また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズは安定した配置を保持し続けることが可能となる。
かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができる。
≪第1の態様≫
一実施形態において、本発明は、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を提供する。
第2のコード配列は、前記第1のコード配列及び第3のコード配列と同一のORF内に配置されていてもよく、配置されていなくてもよいが、同一のORF内に配置されていることが好ましい。すなわち、本実施形態の核酸は、第1のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第2のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第3のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得ることが好ましい。
第2のコード配列が、前記第1のコード配列及び第3のコード配列と同一のORF内に配置されていない場合、各ORFは、それぞれ転写・翻訳を制御する制御配列を有していることが好ましい。
5’側から3’側に向かって、第1のコード配列、第3のコード配列、及び第2のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(1);
5’側から3’側に向かって、第2のコード配列、第1のコード配列、及び第3のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(2);並びに
5’側から3’側に向かって、第1のコード配列、第2のコード配列、及び第3のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(3)、
が挙げられる。
核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼをコードする場合、前記に例示した核酸(1)~(3)のいずれであってもよいが、核酸(1)であることが好ましい。核酸がトランスペプチダーゼとしてブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸の中でも、核酸(2)又は核酸(3)であることが好ましい。
一実施形態において、本発明は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を提供する。
第2のコード配列は、前記第1のコード配列及び第3のコード配列と同一のORF内に配置されていてもよく、配置されていなくてもよいが、同一のORF内に配置されていることが好ましい。すなわち、本実施形態の核酸は、第1のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第2のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第3のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼN末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得ることが好ましい。当該キメラタンパク質において、トランスペプチダーゼのドメインは、トランスペプチダーゼN末端基質モチーフのC末端側に位置していることが好ましい。
第2のコード配列が、前記第1のコード配列及び第3のコード配列と同一のORF内に配置されていない場合、各ORFは、それぞれ転写・翻訳を制御する制御配列を有していることが好ましい。
5’側から3’側に向かって、第3のコード配列、第1のコード配列、及び第2のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(4);並びに
5’側から3’側に向かって、第3のコード配列、第2のコード配列、及び第1のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸(5)、
が挙げられる。
核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼ又はブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸(4)及び核酸(5)のいずれであってもよい。
≪第1の態様≫
一実施形態において、本発明は、下記(a)~(d)を含む、ペプチド-核酸複合体の作製キットを提供する。
(a)任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸
(b)前記(a)の核酸における、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列を含む前記核酸の領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
(c)核酸増幅試薬
(d)無細胞タンパク質合成反応液
(a)の核酸は、任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸である。これらのコード配列については、上記「<ペプチド-核酸複合体の製造方法>」で説明したものと同様である。
(b)のプライマーセットは、(a)の核酸における、第1のコード配列若しくはクローニングサイト、第2のコード配列、及び第3のコード配列を含む領域(以下、「コード配列領域」という場合がある。)を増幅可能なプライマーセットである。当該プライマーのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方には、トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフが付加されている。
(i)5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加されたフォワードプライマーと、5’末端が固相担体に固定化されたリバースプライマーとのセット
(ii)5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加されたフォワードプライマーと、5’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたリバースプライマーとのセット
(iii)5’末端が固相担体に固定化されたフォワードプライマーと、5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
(iv)5’末端が固相担体に結合性を有する物質が付加されたフォワードプライマーと、5’末端にトランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
(c)の核酸増幅試薬は、PCR等の核酸増幅反応に用いられる試薬であり、好ましくはPCRに用いられる試薬である。具体的には、dNTP及びDNAポリメラーゼが挙げられる。DNAポリメラーゼとしては、Taq DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ等の熱安定性DNAポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つDNAポリメラーゼや、プルーフリーディング(校正)機能を持つDNAポリメラーゼを使用することがより好ましい。これらの試薬は市販されており、容易に入手可能である。
(d)の無細胞タンパク質合成反応液は、無細胞タンパク質合成系に用いられる反応液である。具体例としては、タンパク質合成に必要な成分を含む細胞抽出液等が挙げられる。タンパク質合成に必要な成分としては、例えば、リボソーム;開始因子などの各種因子;tRNA;RNAポリメラーゼ、アミノアシルtRNA合成酵素などの各種酵素等が挙げられる。例えば、大腸菌S30抽出液の系(原核細胞の系)、コムギ胚芽抽出液の系(真核細胞の系)、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系(真核細胞の系)等が好適に挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系に必要な試薬は、キットとしても市販されており、容易に入手可能である。
一実施形態において、本発明は、下記(a)~(d)を含む、ペプチド-核酸複合体の作製キットを提供する。
(a)任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸
(b)前記(a)の核酸における、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
(c)核酸増幅試薬
(d)無細胞タンパク質合成反応液
(a)の核酸は、任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸である。これらのコード配列については、上記「<ペプチド-核酸複合体の製造方法>」で説明したものと同様である。
(b)のプライマーセットは、(a)の核酸における、第1のコード配列若しくはクローニングサイト、第2のコード配列、及び第3のコード配列を含む領域(コード配列領域)を増幅可能なプライマーセットである。当該プライマーのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方には、トランスペプチダーゼの認識モチーフが付加されている。
(i)5’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたフォワードプライマーと、5’末端が固相担体に固定化されたリバースプライマーとのセット
(ii)5’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたフォワードプライマーと、5’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたリバースプライマーとのセット
(iii)5’末端が固相担体に固定化されたフォワードプライマーと、5’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット、
(iv)5’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたフォワードプライマーと、5’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
(c)の核酸増幅試薬、及び(d)の無細胞タンパク質合成反応液は、前記第1の態様におけるものと同様である。
[合成例1]ペンタグリシンが付加されたDNAプライマーの合成
下記組成の反応液を調製し、室温で10分間反応後、Micro Bio-SpinTM 6(Promega)を用いてゲルろ過精製した。精製物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ペンタグリシンが付加されたDNA(ペンタグリシン標識DNA)のバンドを確認した(図7)。
2μM アジド修飾DNA
200μM アルキン修飾ペンタグリシン
100μM アスコルビン酸ナトリウム
20μM 硫酸銅(II)
50% Tert-ブチルアルコール
アルキン修飾ペンタグリシン:(N)-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(propargyl)-(C)(配列番号43)
下記組成のPCR反応液1及び2を調製し、30サイクル(98℃,10秒;55℃,5秒/72℃,2分)でPCRを行った。PCR産物をQIAquick(登録商標) PCR purification column(QIAGEN)を用いて精製した。PCR反応液1を用いたPCRにより、ペンタグリシンが付加されたDNA(以下、「ぺンタグリシン付加DNA」という)が得られた。PCR反応液2を用いたPCRにより、ペンタグリシンが付加されていないDNA(以下、「ペンタグリシン非付加DNAという)が得られた。
下記PCR反応液で用いた鋳型DNA(配列番号44)の構成を図8に示す。図8に示すように、鋳型DNAは、ポリリン酸キナーゼ遺伝子とソルターゼA遺伝子とソルターゼA認識モチーフ(LPETG(配列番号14))コード配列とを含むORFを有している。鋳型DNAにおいて、ソルターゼA認識モチーフ(LPETG(配列番号14))コード配列は、ポリリン酸キナーゼ遺伝子の3’側に位置している。鋳型DNAに含まれるソルターゼ遺伝子Aの塩基配列を配列番号30に示す。
20pg/μL 鋳型DNA
0.3μM ペンタグリシン付加DNAプライマー
0.3μM ビオチン標識DNAプライマー
0.2μM each dNTP Mix
0.025U/μL PrimeSTAR(登録商標) HS polymerase(タカラバイオ)
1xPrimeSTAR(登録商標) buffer(タカラバイオ)
20pg/μL 鋳型DNA
0.3μM ペンタグリシン非付加DNAプライマー
0.3μM ビオチン標識DNAプライマー
0.2μM each dNTP Mix
0.025U/μL PrimeSTAR(登録商標) HS polymerase(タカラバイオ)
1xPrimeSTAR(登録商標) buffer(タカラバイオ)
ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ(MS300/streptavidin,JSR)15μLの上清を除去し、30μLの結合バッファー(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,1M NaCl,0.05%(w/v)Tween20,pH7.4)で洗浄した。1pmolのペンタグリシン付加DNA又はペンタグリシン非付加DNAを溶解した30μLの結合バッファーに、磁気ビーズを懸濁し、室温で30分間撹拌した。次いで、磁気ビーズを100μLの結合バッファーで3回洗浄した後、磁気ビーズを30μLの結合バッファーに懸濁した。
ペンタグリシン付加DNA又はペンタグリシン非付加DNAを固定化した磁気ビーズ 10μLの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液(PUREfrex(登録商標) 1.0,ジーンフロンティア)10μLに懸濁した。37℃で3時間撹拌した後、磁気ビーズを100μLの結合バッファーで3回洗浄した。次いで、磁気ビーズを100μLの50mM Tris-HCl(pH7.5)で3回洗浄した後、10μLの50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁した。
無細胞タンパク質翻訳の処理を行った磁気ビーズ 10μL、酵素反応溶液(1mM ヘキサメタリン酸,0.1mM ADP,5mM MgSO4,50mM Tris-HCl,pH7.5)25μL、及びATP蛍光検出試薬(ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit,BioVision,Inc.)25μLを混合し、ポリリン酸キナーゼの触媒反応の結果生じるATPに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて経時的に測定した。
以上の結果より、ソルターゼAN末端基質モチーフが付加されたDNA(任意遺伝子、ソルターゼA遺伝子、及びソルターゼA認識モチーフを含む)を無細胞タンパク質翻訳することにより、任意遺伝子DNAに当該任意遺伝子から翻訳されたタンパク質を連結できることが実証された。
[合成例3]ペンタグリシン付加されたDNAの合成(CP05遺伝子)
鋳型DNAとして、CP05ペプチド遺伝子(配列番号45、46)の5’末端にFactor Xaプロテアーゼ認識モチーフ(配列番号28)コード配列を連結したDNA(Xaモチーフ-CP05)を含むものを用いた。当該鋳型DNA(配列番号47)は、図8に示す鋳型DNAにおいて、ポリリン酸キナーゼ遺伝子に代えて、Xaモチーフ-CP05を有する。CP05ペプチドの
前記鋳型DNAを用いたこと以外は、前記合成例1及び合成例2と同様に、ペンタグリシン付加されたDNAを合成した。
鋳型DNAとして、PKI遺伝子(配列番号48、49)の5’末端にFactor Xaプロテアーゼ認識モチーフ(配列番号28)コード配列を連結したDNA(Xaモチーフ-PKI)を含むものを用いた。当該鋳型DNA(配列番号50)は、図8に示す鋳型DNAにおいて、ポリリン酸キナーゼ遺伝子に代えて、Xaモチーフ-PKIを有する。
前記鋳型DNAを用いたこと以外は、前記合成例1及び合成例2と同様に、ペンタグリシン付加されたDNAを合成した。
前記合成例3又は合成例4で合成したペンタグリシン付加されたDNAを用いたこと以外は、前記実験例2と同様に、ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズ、及びペンタグリシン非付加DNA固定化磁気ビーズを作製した。
ペンタグリシン付加DNA又はペンタグリシン非付加DNAを固定化した磁気ビーズ 15μLの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液(PUREfrex(登録商標) 1.0,ジーンフロンティア)15μLに懸濁した。37℃で3時間撹拌した後、磁気ビーズを100μLのPBS-Tで5回洗浄した。次いで、磁気ビーズを100μLのPBS-Tに懸濁した。
磁気ビーズ懸濁液25μLの分散媒を除去し、磁気ビーズを下記(a)~(c)のいずれかの溶液に懸濁した。
(a)PBS-Tで希釈したFITC標識抗cMyc抗体溶液(abcam#ab117599) 15μL。
(b)PBS-Tで希釈したFITC標識抗IsotypeControl抗体溶液(abcam#ab91356) 15μL。
(c)PBS-Tのみ 15μL。
図10及び図11の結果より、ペンタグリシン付加DNA固定化ビーズでは、ビーズに固定されたcMycタグコード配列を含むDNAに、cMycタグを含むタンパク質が連結していると推測された。そのため、FITC標識抗cMyc抗体を反応させることにより、蛍光強度が大きく増強したと考えられた。
前記実験例2で作製した核酸-ペプチド複合体固定化磁気ビーズを用いて、ペプチドアレイの作製を行った。実験例2で無細胞タンパク質翻訳処理した後の磁気ビーズ5μLを、酵素反応溶液(3.3mM ヘキサメタリン酸,0.33mM ADP,16.7mM MgSO4)9μL、及びATP蛍光検出試薬(ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit,BioVision,Inc.)15μLと混合した。
直径4μm、深さ4μmの穴が1cm角に100万個形成された石英ガラス製チップに、前記で調製した磁気ビーズ懸濁液を滴下し、各ウェルを磁気ビーズ及びビーズ分散媒で満たした。チップ表面を、シリコーンオイル(信越化学,KF96-100cs)で被覆して各ウェルを密閉した。その後、蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse Ti-E,浜松ホトニクスEM-CCDカメラ,Cy3フィルター,キセノンランプ)でタイムラプス撮影を行い、各ウェルの蛍光輝度上昇を観察した。各ウェルの蛍光輝度変化の解析は、ImageJで行った。
[実験例7]ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズの作製
前記合成例4で合成したペンタグリシン付加DNA(PKI遺伝子含有)を用いたこと以外は、前記実験例2と同様に、ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズを作製した。陰性対照磁気ビーズとして、前記合成例3で合成したペンタグリシン付加DNA(CD05遺伝子含有)を用いて、前記実験例2と同様に、ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズを作製した。
15μLのペンタグリシン付加DNA(PKI遺伝子含有)固定化磁気ビーズ若しくは15μLのペンタグリシン付加DNA(CD05遺伝子含有)固定化磁気ビーズの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液(PUREfrex(登録商標) 1.0,ジーンフロンティア)15μLに懸濁した。37℃で3時間撹拌した後、磁気ビーズを100μLの結合バッファーで5回洗浄した。次いで、磁気ビーズを100μLの1×PKAバッファー(40mM Tris-HCl(pH7.5),20mM MgCl2,0.1mg/mL BSA)で5回洗浄した。次いで、磁気ビーズを3μLの1×PKAバッファーに懸濁した。
無細胞タンパク質翻訳処理した後の磁気ビーズ3μL、キナーゼ反応液7μL、及び2×RT検出液(Fluorospark(登録商標),富士フィルム和光)15μLを混合した。次いで、プロテインキナーゼAの触媒反応の結果生じるADPに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて測定した。
<キナーゼ反応液>
0.06mU/μL Protein kinase A(SignalChem, #p51-10G)
5μM ATP
100μM Kemptide (Promega, V5601)
3.6×PKA buffer
30℃、60分
励起光:540BP20nm
蛍光:590BP20nm
一方、陰性対照磁気ビーズでは、反応時間の経過とともに、蛍光強度が上昇した。陰性対照磁気ビーズの蛍光強度は、PKIを添加しないPKA反応液とほぼ同等の上昇を示した。
これらの結果から、PKIを含む核酸-ペプチド複合体固定化ビーズでは、PKI核酸-PKIペプチドの複合体が形成されていることが確認された。
[実験例10]ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズの作製
前記合成例3で合成したペンタグリシン付加DNA(CP05遺伝子含有)を用いたこと以外は、前記実験例2と同様に、ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズ及びペンタグリシン非付加DNA固定化磁気ビーズを作製した。
15μLのペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液(PUREfrex(登録商標) 1.0,ジーンフロンティア)15μLに懸濁した。37℃で3時間撹拌した後、磁気ビーズを100μLの結合バッファーで5回洗浄した。次いで、磁気ビーズを100μLのFactor Xaバッファー(20mM Tris-HCl(pH7.5),100mM NaCl)で1回洗浄した。次いで、磁気ビーズをFactor Xaバッファーに懸濁した。
磁気ビーズ懸濁液30μLに、Factor Xaプロテアーゼ(Promega)1μLを添加し、25℃で17時間攪拌した。
実験例11の無細胞タンパク質翻訳処理により、ペンタグリシン付加DNAから、cMycタグ-Factor Xaプロテアーゼ認識モチーフ-CP05-LPETG-ソルターゼAのキメラタンパク質が翻訳される。次いで、ソルターゼAによるペプチド転移反応により、ペンタグリシン付加DNAに、cMycタグ-Factor Xaプロテアーゼ認識モチーフ-CP05-LPETGが連結されて、ペプチド-核酸複合体が形成される。このペプチド-核酸複合体に、Factor Xaプロテアーゼを作用させると、Factor Xaプロテアーゼ認識モチーフで切断される。その結果、ペプチド-核酸複合体からcMycタグが切り離される。
ヒト血漿150μLを遠心(1500×g,10分,25℃)し、上清を回収した。回収した上清を心(3000×g,10分,25℃)し、上清を回収した。回収した上清をさらに遠心(3000×g,10分,25℃)し、上清を回収した。次いで、回収した上清をExosome spin Column(Thermo Fischer Scientific)で精製した。次いで、精製サンプルを限外濾過カラム(MWCO 100K)で100μLに濃縮した。これに、PKH67(Sigma-Aldrich)を添加(終濃度2μM)し、遮光下、室温で、10分間反応させた。反応後、反応液をExosome Spin Column (Thermo Fischer Scientific)で精製した。精製したサンプルを蛍光標識EVとして用いた。
実験例12でFactor Xaプロテアーゼ処理した磁気ビーズを100μLのPBS-Tで5回洗浄した。次いで、磁気ビーズを15μLのPBS-Tに懸濁した。磁気ビーズ懸濁液から7.5μLの分散媒を除去し、実験例13で調製した蛍光標識EVサンプル50μLに、懸濁した。次いで、遮光下、室温で、1時間攪拌した。次いで、磁気ビーズを100μLのPBSで4回洗浄した。次いで、磁気ビーズを15μLのPBSに懸濁した。
図14A及び図14Bに示すように、ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズでは、DNA非固定化磁気ビーズ及びペンタグリシン非付加DNA固定化磁気ビーズと比較して、高い蛍光強度を示した。この結果は、ペンタグリシン付加DNA固定化磁気ビーズでは、CP05を提示するペプチドー核酸複合体が形成されていることを示す。
[実験例15]プライマー固定化ビーズの調製
ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ(MS300/streptavidin,JSR)240μLの上清を除去し、1200μLの結合バッファー(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,1M NaCl,0.05%(w/v)Tween20,pH7.4)で洗浄した。48pmolのビオチン標識DNAプライマーを溶解した、480μLの結合バッファーに、磁気ビーズを懸濁し、室温で1時間撹拌した。次いで、磁気ビーズを1200μLの結合バッファーで1回洗浄した。次いで、磁気ビーズを240μLの1×buffer for KOD Plus polymerase(東洋紡)で2回洗浄した。次いで、磁気ビーズを240μLの1×buffer for KOD Plus polymerase(東洋紡)に懸濁した。
下記組成のPCR反応液3とオイル混合液1とを混合し、攪拌してエマルションを形成した。これを50μLずつ分注してPCRを行った。PCR条件は、95℃,5分、(94℃,30秒;55℃,1分;68℃,6分)で30サイクルとし、PCR反応後は、10℃で維持した。鋳型DNAは、前記合成例2と同じものを用いた。
プライマー結合磁気ビーズ 2.4e8粒子
鋳型DNA 1.2e8分子
ペンタグリシン付加DNAプライマー 180 pmol
DNAプライマー 180 pmol
2mM dNTP Mix 30μL
25mM MgSO4 18μL
10×KOD plus buffer(東洋紡) 30μL
1U/μL KOD plus polymerase(東洋紡) 12μL
Nuclease Free Water, up to 300μL
合計 300μL
TEGOSOFT DEC(Evonik) 540μL
ミネラルオイル(ナカライテスク) 204μL
ABIL WE09(Evonik) 756μL
合計 1500μL
下記組成の無細胞タンパク質翻訳液及びオイル混合液2を混合し、攪拌してエマルションを形成した。37℃で、3時間反応した。陰性対照実験として、DNA未固定の磁気ビーズを用いて、同様の処理を行った。
エマルションPCRを行った磁気ビーズ5e6粒子をPUREfrex1.0反応溶液63μLに懸濁したものを無細胞タンパク質翻訳液として用いた。
TEGOSOFT DEC(Evonik) 113μL
ミネラルオイル(ナカライテスク) 43μL
ABIL WE09(Evonik) 159μL
合計 315μL
無細胞タンパク質翻訳の処理を行った磁気ビーズ6μL、酵素反応溶液(3.3mMヘキサメタリン酸,0.33mM ADP,16.7mM MgSO4)9μL、及びATP蛍光検出試薬(ATP Colorimetric/Fluorometric Assay Kit,BioVision,Inc.)15μLを混合し、ポリリン酸キナーゼの触媒反応の結果生じるATPに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて経時的に測定した。
以上の結果より、エマルションPCR及びエマルション無細胞タンパク質翻訳を用いた場合も、上記実験例1及び実験例2と同様に、任意遺伝子DNAに当該任意遺伝子から翻訳されたタンパク質を連結できることが実証された。
20 トランスペプチダーゼ
21 トランスペプチダーゼN末端基質モチーフ
22 トランスペプチダーゼ認識モチーフ
22’ トランスペプチダーゼ認識モチーフの切断により生じる配列
22’ トランスペプチダーゼ認識モチーフの切断により生じる配列
30a,30b,30c,30d,30e 核酸
40 プロテアーゼ
100,200,300 トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸(NS付加核酸)
101,201,301,401,401’,501,501’ キメラタンパク質
102,202,302,402,502 ペプチド-核酸複合体
103,203,303,403,503 ペプチド転移反応生成物
400,400’,500,500’ トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸(TPR付加核酸)
Claims (37)
- ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド-核酸複合体の製造方法であって、
(A1)トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、
前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、
(B1)前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、
(C1)前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体を形成させる工程と、
を含む、ペプチド-核酸複合体の製造方法。 - 前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、請求項1に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- 前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、請求項1に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- 前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、請求項1に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- 前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、請求項1~4のいずれか一項に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド-核酸複合体の製造方法であって、
(A2)トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
前記ペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、
(B2)前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、
(C2)前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド-核酸複合体を形成させる工程と、
を含む、ペプチド-核酸複合体の製造方法。 - 前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、請求項6に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- 前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置されている、請求項6に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- 前記核酸が、さらに、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有しており、
前記工程(B2)の後、且つ前記工程(C2)の前に、さらに、
(D2)前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程、
を含む、請求項6~8のいずれか一項に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。 - 前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、請求項6~9のいずれか一項に記載のペプチド-核酸複合体の製造方法。
- (a)ペプチドと、
(b)前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、
(c)トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとN末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、
前記(b)の核酸が、前記(a)のペプチドをコードする第1のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフ又は前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含み、
前記(c)の配列が、前記(a)のペプチドと前記(b)の核酸との間に位置する、
ペプチド-核酸複合体。 - 前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、
請求項11に記載のペプチド-核酸複合体。 - 前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、
請求項11に記載のペプチド-核酸複合体。 - 前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、
請求項11に記載のペプチド-核酸複合体。 - 前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフをコードする配列であり、
前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、
請求項11に記載のペプチド-核酸複合体。 - 前記第3のコード配列が、前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフをコードする配列であり、
前記(b)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置されている、
請求項11に記載のペプチド-核酸複合体。 - 前記(b)の核酸が、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列をさらに含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有している、
請求項15又は16に記載のペプチド-核酸複合体。 - 請求項11~17のいずれか一項に記載のペプチド-核酸複合体が固定化された固相担体。
- 請求項18に記載の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイ。
- 前記反応槽1個当たり、1種類の前記ペプチド-核酸複合体を含む、請求項19に記載のペプチドアレイ。
- トランスペプチダーゼN末端基質モチーフが付加された核酸であって、
ペプチドをコードする第1のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸。 - 5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、請求項21に記載の核酸。
- 5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、請求項21に記載の核酸。
- 前記核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、請求項21に記載の核酸。
- トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
ペプチドをコードする第1のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む、核酸。 - 5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、請求項25に記載の核酸。
- 5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列が、この順で、配置されている、請求項25に記載の核酸。
- 前記核酸は、さらに、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、
請求項25~27のいずれか一項に記載の核酸。 - 請求項21~28のいずれか一項に記載の核酸が固定化された固相担体。
- 下記(a)~(d)を含む、ペプチド-核酸複合体の作製キット。
(a)任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸
(b)前記(a)の核酸における、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
(c)核酸増幅試薬
(d)無細胞タンパク質合成反応液 - 前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第3のコード配列、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、請求項30に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
- 前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第2のコード配列、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、請求項30に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
- 前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列が、この順で、配置されている、請求項30に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
- 下記(a)~(d)を含む、ペプチド-核酸複合体の作製キット。
(a)任意のペプチドをコードする第1のコード配列若しくは前記第1のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第2のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのN末端基質モチーフをコードする第3のコード配列と、を含む核酸
(b)前記(a)の核酸における、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第2のコード配列、及び前記第3のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフが付加されている、プライマーセット
(c)核酸増幅試薬
(d)無細胞タンパク質合成反応液 - 前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第2のコード配列が、この順で、配置されている、請求項34に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
- 前記(a)の核酸において、5’側から3’側に向かって、前記第3のコード配列、前記第2のコード配列、及び前記第1のコード配列若しくは前記クローニングサイトが、この順で、配置されている、請求項34に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
- 前記(a)の核酸は、さらに、前記第3のコード配列の5’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第4のコード配列を含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼN末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、
請求項34~36のいずれか一項に記載のペプチド-核酸複合体の作製キット。
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Patent Citations (5)
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J. Org. Chem.,2007年,Vol.72,pp.3909-3912 |
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