WO2020095985A1 - ペプチド－核酸複合体 - Google Patents

ペプチド－核酸複合体 Download PDF

Info

Publication number
WO2020095985A1
WO2020095985A1 PCT/JP2019/043640 JP2019043640W WO2020095985A1 WO 2020095985 A1 WO2020095985 A1 WO 2020095985A1 JP 2019043640 W JP2019043640 W JP 2019043640W WO 2020095985 A1 WO2020095985 A1 WO 2020095985A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
coding sequence
peptide
transpeptidase
motif
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/043640
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真吾 上野
一木　隆範
Original Assignee
公益財団法人川崎市産業振興財団
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公益財団法人川崎市産業振興財団 filed Critical 公益財団法人川崎市産業振興財団
Priority to JP2020555580A priority Critical patent/JP7416715B2/ja
Priority to US17/291,964 priority patent/US20220010032A1/en
Publication of WO2020095985A1 publication Critical patent/WO2020095985A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/2207—Sortase A (3.4.22.70)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1068—Template (nucleic acid) mediated chemical library synthesis, e.g. chemical and enzymatical DNA-templated organic molecule synthesis, libraries prepared by non ribosomal polypeptide synthesis [NRPS], DNA/RNA-polymerase mediated polypeptide synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)

Definitions

  • the present invention relates to peptide-nucleic acid complexes. Further, the present invention relates to a peptide array provided with an immobilization carrier on which a peptide-nucleic acid complex is immobilized, and a reaction vessel containing the immobilization carrier. The present invention also relates to a method for producing a peptide-nucleic acid complex, a nucleic acid that can be used in the production method, and a kit.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2018-209874 filed in Japan on Nov. 7, 2018, and the content thereof is incorporated herein.
  • a method using a puromycin linker is known as a method for linking a peptide and a polynucleotide encoding the peptide (see Patent Document 1).
  • Puromycin is a peptide synthesis inhibitor having a structure similar to the 3'end of aminoacyl-tRNA, and specifically binds covalently to the C-terminus of a growing peptide on the ribosome under certain conditions.
  • the method of constructing a library of mRNA / cDNA-linker-peptide complex using a puromycin linker and screening a useful protein has the following series of steps. First, a linker having puromycin is linked to mRNA, a peptide is synthesized from the mRNA using a cell-free translation system, and the synthesized peptide and the mRNA encoding the complex are bound via puromycin. A body (mRNA-linker-peptide complex) is produced (see Non-Patent Document 1).
  • a method for producing a peptide-nucleic acid complex comprising a peptide and a nucleic acid encoding the peptide, which comprises (A2) a nucleic acid to which a transpeptidase recognition motif has been added and which encodes the peptide.
  • a peptide-nucleic acid complex preparation kit comprising the following (a) to (d): (A) A cloning site into which a first coding sequence encoding any peptide or a nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted, a second coding sequence encoding transpeptidase, and recognition of the transpeptidase A nucleic acid containing a third coding sequence encoding a motif, and (b) the first coding sequence or the cloning site, the second coding sequence, and the third coding sequence in the nucleic acid of (a) above.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of step (A1) in the method for producing a peptide-nucleic acid complex according to the first embodiment of the present invention.
  • An example of a nucleic acid to which a transpeptidase N-terminal substrate motif is added is shown.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a step (B1) in the method for producing a peptide-nucleic acid complex according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a step (C1) in the method for producing a peptide-nucleic acid complex according to the first embodiment of the present invention.
  • Experimental Example 9 the results of measuring the inhibitory effect of the protein kinase A (PKA) activity by the pentaglycine-added DNA-immobilized magnetic beads are shown.
  • PKA protein kinase A
  • Experimental Example 14 the fluorescence-labeled extracellular vesicles were allowed to react with pentaglycine-added DNA-immobilized magnetic beads, and the results obtained by fluorescence microscopy are shown.
  • fluorescence-labeled extracellular vesicles were allowed to react with pentaglycine-added DNA-immobilized magnetic beads, and the result of detection of fluorescence intensity is shown.
  • the result of having measured the polyphosphate kinase activity in Experimental example 18 is shown after emulsion PCR and emulsion cell-free protein translation.
  • substitution mutation in an amino acid sequence when expressed, it may be expressed by the one-letter code of the original amino acid, the position number by a 1 to 4 digit number, and the one-letter code of the next replaced amino acid.
  • P proline
  • S serine
  • substitution of Pro at amino acid position 94 with Ser Is synonymous with.
  • transpeptidase N-terminal substrate motif means an N-terminal region located at the N-terminal of a peptide and having a specific amino acid sequence that is subjected to transpeptidase-mediated peptide transfer reaction.
  • a peptide having a transpeptidase N-terminal substrate motif is bound to the C-terminal of the transpeptidase recognition motif after cleavage by transpeptidase by the catalytic action of transpeptidase.
  • the term “primer set” means a set of primers used for amplifying a target nucleic acid in a nucleic acid amplification reaction.
  • the primer set includes a forward primer and a reverse primer.
  • the "forward primer” means a primer that anneals to the antisense strand of the template nucleic acid
  • the "reverse primer” means a primer that anneals to the sense strand of the template nucleic acid.
  • Step (A1) is a nucleic acid to which a transpeptidase N-terminal substrate motif is added, the first coding sequence encoding the peptide, the second coding sequence encoding the transpeptidase, and the recognition of the transpeptidase. And a third coding sequence encoding a motif, and the step of preparing a nucleic acid.
  • X A is leucine; X C is threonine; X B can be aspartate, glutamate, alanine, glutamine, lysine or methionine.
  • specific examples of the recognition motif of sortase A include LPXTG (SEQ ID NO: 1) (LPATG (SEQ ID NO: 2), LPNTG (SEQ ID NO: 3), etc.), LPXAG (SEQ ID NO: 4) (LPNAG (SEQ ID NO: 5), etc.
  • sortase A may have a modified recognition motif.
  • a modified form of sortase A whose recognition motif is XPXTG (SEQ ID NO: 15) is described.
  • the body is listed.
  • the transpeptidase used in the production method of the present embodiment may be a modified form of these sortase A.
  • Sortase B may be derived from, for example, S. aureus, B. anthracis, or L. monocytogenes.
  • the recognition motif for sortase B may include the amino acid sequence of NPX A TX B.
  • X A is glutamine or lysine
  • X B is asparagine or glycine
  • N is asparagine
  • P is proline
  • T is threonine.
  • Specific examples of sortase B recognition motifs include, for example, NPQTN (SEQ ID NO: 18), NPKTG (SEQ ID NO: 19), NSKTA (SEQ ID NO: 20), NPQTG (SEQ ID NO: 21), NAKTN (SEQ ID NO: 22), and NPQSS. (SEQ ID NO: 23) and the like.
  • the sortase having a recognition motif of QVPTGV (SEQ ID NO: 25) is described in Barnett and Scott (Barnett, TC and Scott, JR, Journal of Bacteriology, Vol. 184, No.8, p.2181-2191, 2002). ing.
  • Sortases are gram-negative bacteria, for example Colwellia cyclerythraea, Microbulbifer degradans, Bradyrhizowa sewella nea snea, Bradyrhizowa newane densione, Bradyrhizobium sewagenea, Nas. It may be a sortase such as Shewanella putrefaciens. These may have the recognition motif of LP [Q / K] T [A / S] T. In addition, the sortase may be derived from Archea (for example, Methanobacter thermoautotrophicum).
  • the transpeptidase may be buterase.
  • Buterase can be used without particular limitation as long as it can recognize and cleave the buterase recognition motif and can bind the N-terminal of the buterase N-terminal substrate motif to the C-terminal of the cleaved buterase recognition motif. ..
  • buterase 1 As a known buterase, buterase 1 (Nguyen GK et al., Nat Protoc. 2016 Oct; 11 (10): 1977-1988, Japanese Patent Publication No. 2017-515468) is known.
  • the sequence of buterase 1 is GenBank Acc. No. It is available from KF918345.
  • X E is any amino acid
  • X F is leucine, isoleucine, valine or cysteine.
  • Recognition motif of Buteraze may be, for example, those comprising the amino acid sequence of X D HV.
  • X D is asparagine or aspartic acid
  • H is histidine
  • V is valine.
  • Buterase is not limited to the wild-type protein, and may be a variant as long as it has transpeptidase activity.
  • the buterase variant is 80% or more (eg, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, with respect to the amino acid sequence of the wild-type buterase or its catalytic domain.
  • the NS-added nucleic acid is a nucleic acid in which a transpeptidase N-terminal substrate motif is added to either the 5'end or the 3'end.
  • a transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added to the 5 ′ end of the nucleic acid 30a.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is exemplified as a peptide having an amino acid sequence of (X 1 ) n (n is 1 or more).
  • X 1 is preferably glycine or alanine, and more preferably glycine.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is represented by X E X F (X E is any amino acid, X F is leucine, isoleucine, valine or cysteine). You may.
  • the NS-added nucleic acid 100 includes a first coding sequence encoding any peptide, a second coding sequence encoding transpeptidase, and a third coding sequence encoding a transpeptidase recognition motif.
  • the first coding sequence may be any one as long as it encodes the peptide 10 of interest, and may be a wild-type gene, a modified gene, or a silent mutation.
  • the first coding sequence may be derived from a mixture of multiple types of DNA such as a DNA library.
  • the first coding sequence can be, for example, from a mutant DNA library.
  • a mutant DNA library a library using Error-prone PCR (error-prone PCR), a library using Gene assembly mutagenesis, a library using Random insertion and deletion mutagenesis, a library using DNA shuffling.
  • the second coding sequence may be any sequence as long as it encodes transpeptidase 20, and may be a wild-type gene, a modified gene, or one having a silent mutation.
  • the third coding sequence may be any sequence that encodes the transpeptidase recognition motif 22, and may be a wild-type gene, a modified gene, or a silent mutation.
  • the first coding sequence, the third coding sequence, and the second coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side (FIG. 1 (A )reference).
  • these sequences are derived from the domain of peptide 10 translated from the first coding sequence, the domain of transpeptidase 20 translated from the second coding sequence, and the third coding sequence in NS-added nucleic acid 100.
  • a chimeric protein 101 comprising a transpeptidase recognition motif 22 to be translated, wherein the transpeptidase recognition motif 22 is arranged so that a chimeric protein located at the C-terminal side of the domain of peptide 10 can be expressed ( See FIG. 1B). That is, the first coding sequence, the third coding sequence, and the second coding sequence are 5'to 3'side in one ORF with or without an arbitrary base sequence. To the in-frame in the above order.
  • the NS-added nucleic acid 100 may have another base sequence in addition to the first coding sequence, the second coding sequence and the third coding sequence.
  • the other base sequence include a control sequence that controls transcription and / or translation of the ORF containing the first coding sequence, the second coding sequence and the third coding sequence.
  • control sequences include promoters, terminators, transcription promoting sequences, translation promoting sequences, Shine-Dalgarno sequences and the like.
  • a control sequence capable of controlling the transcription and / or translation of the ORF can be appropriately selected according to the cell-free protein synthesis system used in the step (B1) described below.
  • the promoter include T7 promoter, SP6 promoter, T3 promoter and the like.
  • the ORF is preferably operably linked to a promoter so that it is expressed under the control of the promoter.
  • the NS-added nucleic acid 100 has a sequence encoding an arbitrary spacer between the first coding sequence and the third coding sequence and / or between the third coding sequence and the second coding sequence. May have. For example, it may have a sequence encoding any spacer between the second coding sequence and the third coding sequence.
  • the transpeptidase 20 can easily bind to the transpeptidase recognition motif 22.
  • the method for adding the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 to the nucleic acid 30a is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a nucleic acid 30a to which the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added by amplifying the nucleic acid 30a by a PCR method or the like using a primer to which the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added (NS-added nucleic acid 100) can be obtained.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 may be added to either the forward primer or the reverse primer.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 may be added to the 5 ′ end of the forward primer, and the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 may be added to the 5 ′ end of the reverse primer.
  • the method for adding the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 to the primer is not particularly limited, and a known method can be used.
  • various methods used in click chemistry can be used. Examples of such a method include a method by the Huisgen reaction (a nucleic acid-azide and peptide-alkyne combination may be used, or a nucleic acid-alkyne and peptide-azide combination may be used); copper-free cyclooctyne , DBCO, BARAC, etc .; and the like.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 and the nucleic acid 30a may be bound to each other via an amino group, a carboxyl group, a thiol group or the like by an activator or a cross-linking agent. ..
  • a nucleophilic substitution reaction using bromine or iodine, a reaction between an aldehyde / ketone and a hydrazide, a reaction between a propargyl ester and an amino group, a photocrosslinking reaction and the like may be used.
  • a method using an avidin-biotin bond a nucleic acid is modified with a functional group such as an amino group, a formyl group, and an SH group, and a solid phase carrier is a silane coupling agent having an amino group, a formyl group, an epoxy group, or the like.
  • a method using a surface-treated product; a method using a gold-thiol bond, or the like can be used. Among them, the method utilizing the avidin-biotin bond is preferably used.
  • a primer set in which one of the primers is immobilized on the solid phase carrier may be used so that the amplified nucleic acid 30a is immobilized on the solid phase carrier.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added to the 5'end of the forward primer
  • the 5'end of the reverse primer can be immobilized on a solid phase carrier.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added to the 5'end of the reverse primer
  • the 5'end of the forward primer can be immobilized on a solid phase carrier.
  • the method for immobilizing the primer on the solid phase carrier the same methods as those mentioned above can be used.
  • the PCR may be emulsion PCR.
  • emulsion PCR is a technique in which one bead having one molecule of template nucleic acid or a primer immobilized thereon is partitioned into an emulsion and PCR is performed using the primer in the emulsion.
  • one primer is immobilized on beads
  • one bead is amplified and immobilized on the bead surface by compartmentalizing each bead into one emulsion and performing PCR in the emulsion.
  • one molecule of template nucleic acid may be compartmentalized in one emulsion and PCR may be performed in the emulsion. As a result, the same type of nucleic acid can be amplified in the emulsion.
  • the type of emulsion used in the emulsion PCR is not particularly limited, but it is preferable to use a water-in-oil (W / O) emulsion because it is easy to prepare and the subsequent operations are simple.
  • the emulsion may be prepared by a conventional method. For example, an oil component and an emulsifier are mixed with an aqueous component containing a nucleic acid 30a, a primer set immobilized on beads, a reagent necessary for nucleic acid amplification such as DNA polymerase, and the mixture is stirred. By doing so, a W / O type emulsion can be obtained.
  • the size of the emulsion particles is not particularly limited as long as it can contain one molecule of the nucleic acid 30a and one bead.
  • the average particle size of the emulsion particles is, for example, preferably 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, more preferably 5 ⁇ m to 50 ⁇ m, particularly preferably 10 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the average particle size of the emulsion particles may be a size capable of encapsulating one molecule of template nucleic acid, and can be, for example, 1 nm or more, for example 10 nm or more, or for example 50 nm or more. ..
  • the upper limit of the average particle size can be, for example, 100 ⁇ m or less, for example 50 ⁇ m or less, or for example 30 ⁇ m or less.
  • the number of emulsion particles is calculated by dividing the volume of one emulsion from the volume of the aqueous component. Therefore, in order to prepare a W / O type emulsion so that an average of 1 molecule or less of template nucleic acid is contained per emulsion, it is sufficient to prepare the nucleic acid 30a having the number of molecules equal to or less than the number of emulsions in the whole.
  • Examples of emulsifiers used for preparing an emulsion include ABIL (registered trademark) WE09, ABIL (registered trademark) WS08, and ABIL (registered trademark) EM90 manufactured by Goldschmidt.
  • ABIL registered trademark
  • WE09 ABIL
  • WS08 ABIL
  • EM90 registered trademark
  • oily component used for preparing an emulsion mineral oil (mineral oil) is usually used.
  • the emulsion may be broken and the beads to which the NS-added nucleic acid 100 is immobilized may be recovered. After collection, the beads may be washed with an appropriate washing buffer or the like. Even when the NS-added nucleic acid 100 is not immobilized on the beads, the emulsion may be broken and the NS-added nucleic acid 100 may be recovered in the same manner.
  • Step (B1) is a chimera containing the peptide domain, the transpeptidase domain, and the transpeptidase recognition motif from a nucleic acid to which a transpeptidase N-terminal substrate motif is added, using a cell-free protein synthesis system. This is the step of synthesizing a protein.
  • the chimeric protein 101 is a protein transcribed / translated from the nucleic acid 30a.
  • the chimeric protein 101 contains a domain of peptide 10, a domain of transpeptidase 20, and a transpeptidase recognition motif 22.
  • the domain of the peptide 10, the transpeptidase recognition motif 22, and the domain of the transpeptidase 20 are arranged in this order from the N-terminal side to the C-terminal side. In FIG.
  • the transpeptidase recognition motif 22 is ZX 1 (Z represents a sequence excluding the C-terminal amino acid residue in the transpeptidase recognition motif, and X 1 represents the C-terminal amino acid residue in the transpeptidase recognition motif). It is exemplified as a peptide having an amino acid sequence.
  • X 1 is preferably glycine or alanine, and more preferably glycine.
  • Z examples include a sequence in which the C-terminal amino acid residue is removed from the sequence exemplified as the above-mentioned solderase recognition motif, and specifically, LPXT (SEQ ID NO: 31) (LPAT (SEQ ID NO: 32), LPNT (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 33) etc.), LPXA (SEQ ID NO: 34) (LPNA (SEQ ID NO: 35) etc.), LPXT (SEQ ID NO: 36) (LPNT (SEQ ID NO: 37) etc.), LGXT (SEQ ID NO: 38) (LGAT (SEQ ID NO: 39)) Etc.), IPXT (SEQ ID NO: 40) (IPNT (SEQ ID NO: 41), IPET (SEQ ID NO: 42), etc.) (X represents an arbitrary amino acid) and the like.
  • the transpeptidase recognition motif 22 may be represented by X D HV (X D is asparagine or aspartic
  • the chimeric protein 101 is synthesized from the NS-added nucleic acid 100 using a cell-free protein synthesis system.
  • the cell-free protein synthesis system does not use a living cell, but uses a ribosome derived from a living cell (or obtained by a genetic engineering method), a transcription / translation factor, or the like, and a template nucleic acid (DNA or mRNA).
  • a cell extract obtained by purifying a cell lysate as needed is used.
  • the cell extract generally contains various factors necessary for protein synthesis, such as ribosome, various factors such as initiation factor, tRNA, RNA polymerase, and various enzymes such as aminoacyl-tRNA synthetase.
  • factors necessary for protein synthesis such as ribosome, various factors such as initiation factor, tRNA, RNA polymerase, and various enzymes such as aminoacyl-tRNA synthetase.
  • various amino acids such as initiation factor, tRNA, RNA polymerase
  • various enzymes such as aminoacyl-tRNA synthetase.
  • the cell-free protein synthesis system may be a transcription / translation system in which each molecule (factor) required for protein synthesis is reconstituted (for example, Shimizu, Y. et al .: Nature Biotech., 19, 751-755 , 2001).
  • each molecule (factor) required for protein synthesis is reconstituted (for example, Shimizu, Y. et al .: Nature Biotech., 19, 751-755 , 2001).
  • three types of initiation factors, three types of elongation factors, four types of factors involved in termination, and 20 types of aminoacyl that bind each amino acid to tRNA are included in the bacterial protein synthesis system.
  • Genes of 31 kinds of factors consisting of tRNA synthetase and methionyl-tRNA formyltransferase are amplified from the Escherichia coli genome, and these are used to reconstruct the protein synthesis system in vitro.
  • the synthesis of chimeric protein 101 from NS-added nucleic acid 100 using a cell-free protein synthesis system may be performed in an emulsion.
  • the NS-added nucleic acid 100 is immobilized on beads, one bead can be partitioned within one emulsion particle.
  • the step (A1) when one type of NS-added nucleic acid 100 is presented for one bead, one type of NS-added nucleic acid 100 and The synthesized chimeric protein 101 can coexist.
  • NS-added nucleic acid 100 Even when the NS-added nucleic acid 100 is not immobilized on beads, one molecule of the NS-added nucleic acid 100 is partitioned into one emulsion particle, and the chimera protein 101 is synthesized in the emulsion by the cell-free protein synthesis system. You can go. Also in this case, one type of NS-added nucleic acid 100 and the chimeric protein 101 synthesized from the NS-added nucleic acid 100 can coexist in one emulsion particle.
  • the method for producing the emulsion, the size of the emulsion particles, and the like can be the same as those exemplified in the above “[Step (A1)]”.
  • the method of coexisting one type of NS-added nucleic acid 100 and the chimeric protein 101 synthesized from the nucleic acid in one section is not limited to cell-free protein synthesis in an emulsion.
  • a method may be used in which one bead presenting one type of NS-added nucleic acid 100 is compartmentalized in one reaction tank and cell-free protein synthesis is performed.
  • Step (C1) is a step of forming a peptide-nucleic acid complex by a transpeptidation reaction of the transpeptidase domain of the chimeric protein synthesized in step (B1).
  • the chimeric protein 101 synthesized from the NS-added nucleic acid 100 contains the transpeptidase 20 domain and the transpeptidase recognition motif 22. Therefore, the transpeptidase recognition motif 22 in the chimeric protein 101 is recognized by the domain of the transpeptidase 20, is cleaved at a predetermined position in the motif, and is divided into a sequence 22 ′ and a sequence 22 ′′, and a sequence 22 ′ The C-terminus is linked by a thioester bond to a cysteine residue within the domain of transpeptidase 20. This allows protein A containing the domain of peptide 10 and sequence 22 ', and the peptide transfer containing transpeptidase 20 and sequence 22 ".
  • the reaction product 103 and the reaction product 103 are linked by a thioester bond. Then, the N-terminal of the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 of the NS-added nucleic acid 100 is bonded to the C-terminal of the sequence 22 ′ in the protein A by the peptide transfer reaction. As a result, the peptide-nucleic acid complex 102 including the peptide 10 and the nucleic acid 30a encoding the peptide is formed. At the same time, the transpeptidation reaction product 103 is formed.
  • the transpeptidase recognition motif 22 is represented as a sequence consisting of ZX 1 as in FIG. 1B.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is represented by (X 1 ) n.
  • the transpeptidase activity of the domain of transpeptidase 20 in chimeric protein 101 first cleaves the peptide bond between Z and X 1 .
  • the transpeptidase recognition motif 22 is divided into a sequence 22 ′ and a sequence 22 ′′.
  • the sequence 22 ′ is a sequence consisting of Z
  • the sequence 22 ′′ is a sequence consisting of X 1 .
  • the transpeptidase recognition motif 22 is also represented by X D HV (X D is asparagine or aspartic acid; H is histidine; V is valine). Good.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is represented by X E X F (X E is any amino acid; X F is leucine, isoleucine, valine or cysteine). May be done.
  • the transpeptidase activity of the transpeptidase 20 domain in chimeric protein 101 first cleaves the peptide bond between XD and H.
  • transpeptidase recognition motif 22 This splits the transpeptidase recognition motif 22 into X D (corresponding to the above sequence 22 ′) and HV (corresponding to the above sequence 22 ′′).
  • a new peptide bond is formed between the group (X D ) and the N-terminal amino acid sequence X E X F of the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 of the NS-added nucleic acid 100. This results in the peptide-nucleic acid complex 102. And a peptide transfer reaction product 103 is produced.
  • peptide-nucleic acid complex 102 obtained in this step, (a) the peptide 10 and (b) the transpeptidase recognition motif 22 and the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 are bound by the transpeptidation reaction with transpeptidase. The resulting sequence and (c) nucleic acid 30a encoding peptide 10 are included. The sequence (b) is located between the peptide 10 and the nucleic acid 30a.
  • “a sequence generated by binding of a transpeptidase recognition motif and a transpeptidase N-terminal substrate motif” hereinafter, sometimes referred to as “TPR-NS sequence” means transpeptidase recognition by transpeptidase.
  • the TPR-NS sequence may be X D X E X F (X D is asparagine or aspartic acid; X E is any amino acid; X F is leucine or isoleucine. , Valine or cysteine).
  • the transpeptidase 20 domain is located on the C-terminal side of the transpeptidase recognition motif 22, so the transpeptidase 20 domain is removed by a peptide transfer reaction. Therefore, the peptide-nucleic acid complex 102 has a structure in which the peptide 10 is bound to the nucleic acid 30b via the TPR-NS sequence (see FIG. 1C).
  • the step (C1) may be carried out under the condition that the transpeptidase can express the transpeptidase activity, and usually it can be carried out simultaneously with the step (B1).
  • a peptide-nucleic acid complex can be produced without requiring complicated work such as preparation of a linker.
  • the TPR-NS sequence exists between the peptide and the nucleic acid. Since the TPR-NS sequence is usually a short sequence of about 5 to 10 amino acids, it is unlikely that the three-dimensional structure or function of the peptide will be impaired in the peptide-nucleic acid complex. Therefore, the peptide-nucleic acid complex can be suitably used for screening a peptide having a desired function by a peptide array, and a nucleic acid encoding the screened peptide can be easily identified.
  • FIGS. 2A to 2C An outline of a second embodiment of the manufacturing method according to the present aspect will be described with reference to FIGS. 2A to 2C.
  • the second coding sequence coding for the transpeptidase and the first code coding for the peptide are directed from 5 ′ side to 3 ′ side.
  • a nucleic acid 30b in which a sequence and a third coding sequence encoding a transpeptidase recognition motif are arranged in this order to which a transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added hereinafter referred to as "NS-added nucleic acid 200"). (See FIG. 2A).
  • the NS-added nucleic acid 200 has a sequence encoding an arbitrary spacer in either or both of the second coding sequence and the first coding sequence and the first coding sequence and the third coding sequence. May have. For example, it may have a sequence encoding an arbitrary spacer between the second coding sequence and the first coding sequence.
  • the manufacturing method of the present embodiment can be performed in the same manner as in the first embodiment, except that the NS-added nucleic acid 200 is used instead of the NS-added nucleic acid 100 in the first embodiment.
  • a chimeric protein 201 synthesized from an NS-added nucleic acid 200 using a cell-free protein synthesis system has a transpeptidase 20 domain, a peptide 10 domain, and a transpeptidase recognition motif 22 from the N-terminal side to the C-terminal side. Has a configuration arranged in this order (see FIG. 2B).
  • a peptide-nucleic acid complex 202 and a peptide transfer reaction product 203 are produced from the NS-added nucleic acid 200 and the chimeric protein 201 by the peptide transfer reaction by the transpeptidase 20 in the chimeric protein 201.
  • the transpeptidase 20 domain is located on the N-terminal side of the transpeptidase recognition motif 22, and therefore the transpeptidase 20 domain is not removed by the peptide transfer reaction. Therefore, the peptide-nucleic acid complex 202 has a structure in which a chimeric protein containing the transpeptidase 20 and the peptide 10 is bound to the nucleic acid 30b via the TPR-NS sequence (see FIG. 2C).
  • FIGS. 3A to 3C An outline of a third embodiment of the manufacturing method according to the present aspect will be described with reference to FIGS. 3A to 3C.
  • the first coding sequence coding for a peptide and the second coding coding for the transpeptidase are directed from 5 ′ side to 3 ′ side.
  • a nucleic acid 30c in which a sequence and a third coding sequence encoding a transpeptidase recognition motif are arranged in this order to which a transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is added hereinafter referred to as "NS-added nucleic acid 300"). May be used) (see FIG.
  • the NS-added nucleic acid 300 has a sequence encoding an arbitrary spacer in either or both of the first coding sequence and the second coding sequence and the second coding sequence and the third coding sequence. May have. For example, it may have a sequence encoding any spacer between the second coding sequence and the third coding sequence.
  • the manufacturing method of the present embodiment can be performed in the same manner as in the first embodiment, except that the NS-added nucleic acid 300 is used instead of the NS-added nucleic acid 100 in the first embodiment.
  • a chimeric protein 301 synthesized from an NS-added nucleic acid 300 using a cell-free protein synthesis system has a peptide 10 domain, a transpeptidase 20 domain, and a transpeptidase recognition motif 22 from the N-terminal side to the C-terminal side. Has a configuration arranged in this order (see FIG. 3B).
  • the peptide transfer reaction by the transpeptidase 20 in the chimeric protein 301 produces the peptide-nucleic acid complex 302 and the peptide transfer reaction product 303 from the NS-added nucleic acid 300 and the chimeric protein 301.
  • the transpeptidase 20 domain is located on the N-terminal side of the transpeptidase recognition motif 22, so the transpeptidase 20 domain is not removed by the peptide transfer reaction. Therefore, the peptide-nucleic acid complex 302 has a structure in which a chimeric protein containing the peptide 10 and the transpeptidase 20 is bound to the nucleic acid 30c via the TPR-NS sequence (see FIG. 3C).
  • the nucleic acids 30a, 30b, and 30c in the first to third embodiments according to this aspect are common in that the first coding sequence is located on the 5'side of the third coding sequence. Further, the chimeric proteins 101, 201, 301 expressed from the nucleic acids 30a, 30b, 30c are common in that the domain of the peptide 10 is located on the N-terminal side of the transpeptidase recognition motif 22.
  • the second embodiment or the third embodiment is preferable.
  • the present invention provides a method for producing a peptide-nucleic acid complex, which comprises a peptide and a nucleic acid encoding the peptide.
  • the production method is (A2) a nucleic acid having a transpeptidase recognition motif added thereto, wherein the first coding sequence encodes the peptide, the second coding sequence encodes the transpeptidase, and N of the transpeptidase.
  • Preparing a nucleic acid comprising a third coding sequence encoding a terminal substrate motif and (B2) using the cell-free protein synthesis system to synthesize the peptide from the nucleic acid to which the transpeptidase recognition motif is added.
  • the third coding sequence, the first coding sequence, and the second coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
  • these coding sequences are composed of the peptide domain translated from the first coding sequence, the transpeptidase domain translated from the second coding sequence, and the third coding sequence. It is arranged so that a chimeric protein containing the transpeptidase N-terminal substrate motif to be translated can be expressed.
  • a chimeric protein 401 is synthesized from the NS-added nucleic acid 400 using a cell-free protein synthesis system (FIG. 4B; step (B2)).
  • Step (A2) is a nucleic acid to which a transpeptidase recognition motif is added, the first coding sequence encoding the peptide, the second coding sequence encoding the transpeptidase, and the N-terminal substrate of the transpeptidase. And a third coding sequence encoding a motif, and the step of preparing a nucleic acid.
  • the transpeptidase recognition motif 22 includes those in which Z and X 1 are linked by an ester bond. The same applies to the TPR-added nucleic acid 500 in Embodiment 5 described later.
  • the transpeptidase recognition motif 22 is also represented by X D HV (X D is asparagine or aspartic acid; H is histidine; V is valine). Good.
  • the first coding sequence and the second coding sequence are the same as those described in the first embodiment of the first aspect.
  • the third coding sequence may be any sequence as long as it encodes the transpeptidase N-terminal substrate motif 21, and may be a wild-type gene, a modified gene, or a silent mutation. Good.
  • the TPR-added nucleic acid 400 may have another base sequence in addition to the first coding sequence, the second coding sequence and the third coding sequence.
  • Examples of the other base sequence include a control sequence that controls the transcription and / or translation of the ORF containing the first coding sequence, the second coding sequence and the third coding sequence.
  • Examples of the control sequence include the same sequences as those mentioned in the step (A1) of the first embodiment of the first aspect.
  • the step (B2) can be performed in the same manner as the step (B1) of the first embodiment of the first aspect except that the TPR-added nucleic acid 400 is used instead of the NS-added nucleic acid 100.
  • Step (C2) is a step of forming a peptide-nucleic acid complex by a transpeptidation reaction of the transpeptidase domain of the chimeric protein synthesized in step (B2).
  • the manufacturing method of the present embodiment may include other steps in addition to the steps (A2) to (C2).
  • Other steps are not particularly limited, and examples thereof include a step of recovering a nucleic acid, a chimeric protein or a peptide-nucleic acid complex, a washing step, a purification step, and the like.
  • the nucleic acid 30d contains a fourth coding sequence encoding a protease recognition motif, it preferably contains the following step (D2).
  • the protease 40 may be added from the outside in the step (D2), the coding sequence encoding the protease 40 is included in the nucleic acid 30d, and is expressed as a protein separate from the chimeric protein 401 ′ in the step (B2). You may let me.
  • a peptide-nucleic acid complex can be produced without requiring complicated work such as preparation of a linker.
  • the peptide-nucleic acid complex obtained by the production method of the present embodiment can be suitably used for screening a peptide having a desired function by a peptide array, and a nucleic acid encoding the screened peptide can be easily identified. can do.
  • the TPR-added nucleic acid 500 has a sequence encoding an arbitrary spacer between the third coding sequence and the second coding sequence and / or between the second coding sequence and the first coding sequence. May have. For example, it may have a sequence encoding any spacer between the third coding sequence and the second coding sequence.
  • the transpeptidase 20 can easily bind to the transpeptidase recognition motif 22.
  • a chimeric protein 501 synthesized from a TPR-added nucleic acid 500 using a cell-free protein synthesis system has a transpeptidase N-terminal substrate motif 21, a transpeptidase 20 domain, and a peptide 10 from the N-terminal side to the C-terminal side. Domains have a configuration arranged in this order (see FIG. 5B).
  • the peptide transfer reaction by the transpeptidase 20 in the chimeric protein 501 produces the peptide-nucleic acid complex 502 and the peptide transfer reaction product 503 from the TPR-added nucleic acid 500 and the chimeric protein 501.
  • the manufacturing method of the present embodiment may further include the step (D2) after the step (B2) and before the step (C2). That is, nucleic acid 30e may include a fourth coding sequence that encodes a protease recognition motif 41, adjacent to the 5'end of the third coding sequence (see Figure 6B). In this case, in the chimeric protein 501 'expressed from the TPR-added nucleic acid 500', the protease recognition motif 41 is arranged adjacent to the N-terminal of the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 (see FIG. 6B).
  • the third coding sequence is located on the 5'side of the first coding sequence and the second coding sequence.
  • the chimeric proteins 401 and 501 expressed from the nucleic acids 30d and 30e have in common that the transpeptidase N-terminal substrate motif 21 is located on the N-terminal side of the peptide 10 and the transpeptidase 20.
  • the nucleic acid may further comprise a fourth coding sequence encoding a protease recognition motif, adjacent to the 5'end of the third coding sequence encoding the N-terminal substrate motif of transpeptidase.
  • the nucleic acid encodes sortase as a transpeptidase it may be any of the nucleic acids (1) to (5) exemplified above, but the nucleic acid (1) is preferable.
  • the nucleic acid encodes buterase as a transpeptidase
  • the nucleic acids (2) to (5) are preferable among the above-exemplified nucleic acids.
  • the sequence (c) is a sequence (TPR-NS sequence) generated by the binding of the transpeptidase recognition motif and the N-terminal substrate motif, and was described in the above " ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>". It is similar to the one.
  • the transpeptidase sortase or buterase is preferable, sortase A or buterase 1 is more preferable, and sortase A is further preferable.
  • the TPR-NS sequence can be appropriately selected depending on the type of transpeptidase.
  • the solid phase carrier of the present embodiment may be used by arranging it in a reaction tank as described below, or may be used as a peptide array itself.
  • a specific example of identifying a nucleic acid encoding a desired peptide using the peptide-nucleic acid complex of the present embodiment will be described, but the present invention is not limited thereto.
  • the solid phase carrier may be, for example, beads, and beads having a peptide-nucleic acid complex immobilized thereon may be placed in the reaction tank.
  • the solid phase carrier may be the wall of the reaction vessel. It is preferable to arrange one kind of peptide-nucleic acid complex per reaction tank. For example, when the solid phase carrier is beads, it is preferable to dispose one bead on which one kind of peptide-nucleic acid complex is immobilized in one reaction tank.
  • the magnetic beads Due to the action of the magnetic force of the magnetic beads and the magnetic thin film, the magnetic beads are attracted into the reaction tank and are easily arranged. Furthermore, by moving the magnet in a direction parallel to the substrate as appropriate, the magnetic beads are dispersed and the filling rate in the reaction tank is improved.
  • the strength of the magnetic field applied to the bead arranging substrate by the magnet is preferably 100 to 10000 gauss in order to obtain the desired effect.
  • the magnetization of the magnetic plate remains even after the magnet is removed, the magnetic beads can continue to maintain a stable arrangement.
  • Metals such as nickel, nickel alloys, iron and iron alloys can be preferably used as the material of the magnetic body.
  • the diameter of the reaction tank is preferably almost the same as the diameter of the beads.
  • the filling rate of the beads into the micro reaction vessel depends on the diameter of the micro reaction vessel, the filling rate is higher when the diameter of the reaction vessel is slightly wider than the diameter of the beads.
  • the diameter of the reaction vessel is preferably 1 to 2 times the diameter of the beads.
  • the depth of the reaction tank is preferably 1 to 2 times the diameter of the beads.
  • the reaction tank is preferably hydrophilized. For example, by hydrophilizing the reaction tank by oxygen plasma irradiation or the like, it becomes easy to fill the reaction tank with the liquid in which the beads are dispersed, and the filling rate is improved.
  • the peptide array of this embodiment can be suitably used for identifying a peptide having a desired function and isolating a nucleic acid encoding the peptide.
  • a peptide having a desired function can be identified by carrying out a desired reaction in a reaction tank and identifying a reaction tank showing a desired reaction result. After the reaction tank is specified, the nucleic acid encoding the peptide having the desired function can be obtained by recovering the peptide-nucleic acid complex from the reaction tank.
  • the nucleic acid of the present embodiment is a nucleic acid to which a transpeptidase N-terminal substrate motif is added, and comprises a first coding sequence that encodes a peptide, a second coding sequence that encodes the transpeptidase, and a nucleic acid of the transpeptidase.
  • the nucleic acid of this embodiment may further contain other sequences.
  • other sequences include the same as those described in the above ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>.
  • a sequence encoding an arbitrary spacer may be included between the respective coding sequences. It may also contain a control sequence such as a promoter sequence which controls the expression of the coding sequence.
  • the nucleic acid of the present embodiment has a peptide domain translated from the first coding sequence, a transpeptidase domain translated from the second coding sequence, and a transpeptidase recognition translated from the third coding sequence. It is preferable that a chimeric protein containing the motif can be expressed.
  • each ORF has a control sequence for controlling transcription / translation. Is preferred.
  • the nucleic acid of the present embodiment is a nucleic acid to which a transpeptidase N-terminal substrate motif is added, A nucleic acid (1) having a configuration in which the first coding sequence, the third coding sequence, and the second coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side; A nucleic acid (2) having a configuration in which the second coding sequence, the first coding sequence, and the third coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side; and the 5 ′ side Nucleic acid (3) having a configuration in which the first coding sequence, the second coding sequence, and the third coding sequence are arranged in this order from 3 to 3 ′ side, Is mentioned.
  • nucleic acid of the present embodiment examples include the NS-added nucleic acid 100, the NS-added nucleic acid 200, and the NS-added nucleic acid 300 exemplified in the above “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”.
  • the present invention relates to a nucleic acid having a transpeptidase recognition motif added thereto, the first coding sequence encoding a peptide, the second coding sequence encoding the transpeptidase, and the transpeptidase of And a third coding sequence encoding an N-terminal substrate motif.
  • the nucleic acid of the present embodiment is a nucleic acid to which a transpeptidase recognition motif is added, the first coding sequence encoding a peptide, the second coding sequence encoding the transpeptidase, and the N-terminal of the transpeptidase.
  • a third coding sequence encoding a substrate motif.
  • the nucleic acid of the present embodiment is a chimeric protein containing a domain of a peptide translated from a first coding sequence and a transpeptidase N-terminal substrate motif translated from a third coding sequence, the transpeptidase N-terminal A substrate motif can express a chimeric protein located N-terminal to the peptide domain. That is, the first coding sequence and the third coding sequence are arranged in the same ORF, and the third coding sequence is arranged on the 5 ′ side of the first coding sequence.
  • the second coding sequence may or may not be placed in the same ORF as the first and third coding sequences, but is placed in the same ORF. It is preferable.
  • the nucleic acid of the present embodiment comprises a peptide domain translated from the first coding sequence, a transpeptidase domain translated from the second coding sequence, and a transpeptidase N translated from the third coding sequence.
  • a chimeric protein containing the terminal substrate motif can be expressed.
  • the transpeptidase domain is preferably located on the C-terminal side of the transpeptidase N-terminal substrate motif.
  • the nucleic acid of the present embodiment is a nucleic acid to which a transpeptidase recognition motif is added, A nucleic acid (4) having a configuration in which a third coding sequence, a first coding sequence, and a second coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side; and the 5 ′ side From the 3 ′ side toward the 3 ′ side, the third coding sequence, the second coding sequence, and the first coding sequence are arranged in this order in a nucleic acid (5), Is mentioned.
  • the nucleic acid encodes sortase or buterase as the transpeptidase, it may be any of the nucleic acid (4) and the nucleic acid (5) exemplified above.
  • the nucleic acid of this embodiment may further include a fourth coding sequence adjacent to the 5'end of the third coding sequence and encoding a protease recognition motif.
  • the protease recognition motif translated from the fourth coding sequence is adjacent to the N-terminal side of the transpeptidase N-terminal substrate motif.
  • a recognition motif of a protease having an activity of cleaving the bond between the protease recognition motif and the transpeptidase N-terminal substrate motif can be used.
  • nucleic acid of the present embodiment include the TPR-added nucleic acid 400, the TPR-added nucleic acid 400 ′, the TPR-added nucleic acid 500, and the TPR-added nucleic acid, which are exemplified in the above “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”. 500 '.
  • the nucleic acid to which the transpeptidase N-terminal substrate motif of the above-described embodiment or the nucleic acid to which the transpeptidase recognition motif is added may be immobilized on a solid phase carrier. Therefore, in one embodiment, the present invention also provides a solid phase carrier on which the nucleic acid of the above embodiment is immobilized.
  • the nucleic acid of the present embodiment or the solid phase carrier on which the nucleic acid is immobilized can be suitably used for producing a peptide-nucleic acid complex.
  • the present invention provides a kit for producing a peptide-nucleic acid complex, which comprises the following (a) to (d): (A) A cloning site into which a first coding sequence encoding any peptide or a nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted, a second coding sequence encoding transpeptidase, and recognition of the transpeptidase A nucleic acid comprising a third coding sequence encoding a motif (b) the first coding sequence or the cloning site, the second coding sequence, and the third coding sequence in the nucleic acid of (a) above A primer set capable of amplifying a region of the nucleic acid containing: a primer set, wherein the N-terminal substrate motif of the transpeptidase is added to either one of a forward primer and a reverse primer. d) Cell-free protein synthesis reaction solution
  • the nucleic acid of (a) includes a cloning site into which a first coding sequence encoding any peptide or a nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted, a second coding sequence encoding transpeptidase, and And a third coding sequence encoding a transpeptidase recognition motif.
  • These coding sequences are the same as those described in the above “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”.
  • the cloning site into which the nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted is not particularly limited and may be any restriction enzyme site.
  • the cloning site comprises a peptide domain translated from the first coding sequence and a transfection translated from the third coding sequence when a nucleic acid fragment containing the first coding sequence is inserted into the cloning site.
  • the nucleic acid of (a) may further contain other sequences.
  • other sequences include the same as those described in the above ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>.
  • a sequence encoding an arbitrary spacer may be included between the respective coding sequences. It may also contain a control sequence such as a promoter sequence which controls the expression of the coding sequence.
  • the first coding sequence or cloning site, the third coding sequence, and the second coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
  • nucleic acid of (a) in any one of the nucleic acids 30a, 30b, 30c and the nucleic acids 30a, 30b, 30c exemplified in the above " ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>", And the coding sequence of is replaced with a cloning site.
  • the nucleic acid of (a) may be a plasmid.
  • Escherichia coli-derived plasmids pBI system, pPZP system, pSMA system, pUC system, pBR system, pBluescript system plasmid, etc.
  • Bacillus subtilis-derived plasmids pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids Yep13, Yep24, YCp50.
  • Etc. can be preferably used.
  • the primer set of (b) has a region (hereinafter, referred to as “coding sequence region”) containing the first coding sequence or cloning site, the second coding sequence, and the third coding sequence in the nucleic acid of (a). Yes) is a primer set capable of amplifying.
  • the N-terminal substrate motif of transpeptidase is added to either the forward primer or the reverse primer of the primer.
  • the primer set of (b) is preferably capable of amplifying a region containing a control sequence that controls the transcription and / or translation of these coding sequences together with the coding sequence regions of the nucleic acid of (a).
  • a primer set capable of amplifying the region can be designed based on a known method.
  • the transpeptidase N-terminal substrate motif can be added to the primer by a method similar to the method described above in “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”.
  • the primer set of (b) may be immobilized on a solid phase carrier.
  • the primer set of (b) may be any of the following (i) to (iv).
  • the method for immobilizing the primer on the solid phase carrier may be the same as the method described in the above “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”.
  • the substance having a binding property to the solid phase carrier is not particularly limited and can be appropriately selected according to the type of the solid phase carrier.
  • the solid phase carrier may be modified with streptavidin to bind biotin to the primer.
  • the primer may be modified with a functional group such as an amino group, a formyl group, an SH group
  • the solid phase carrier may be surface-treated with a silane coupling agent having an amino group, a formyl group, an epoxy group, or the like.
  • the nucleic acid amplification reagent (c) is a reagent used in a nucleic acid amplification reaction such as PCR, and is preferably a reagent used in PCR. Specific examples include dNTP and DNA polymerase.
  • the DNA polymerase it is preferable to use a thermostable DNA polymerase such as Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase and Vent DNA polymerase, and a DNA polymerase having a hot start function or proofreading (proofreading) to prevent extension before the start of the test. More preferably, a functional DNA polymerase is used.
  • These reagents are commercially available and are easily available.
  • the cell-free protein synthesis reaction solution (d) is a reaction solution used in the cell-free protein synthesis system.
  • Specific examples thereof include cell extracts containing components necessary for protein synthesis.
  • components necessary for protein synthesis include ribosome; various factors such as initiation factor; tRNA; various enzymes such as RNA polymerase and aminoacyl-tRNA synthetase.
  • Escherichia coli S30 extract system prokaryotic cell system
  • the wheat germ extract system eukaryotic cell system
  • the rabbit reticulocyte lysate system eukaryotic cell system
  • the reagents necessary for these cell-free protein synthesis systems are commercially available as a kit and are easily available.
  • the present invention provides a kit for producing a peptide-nucleic acid complex, which comprises the following (a) to (d): (A) a cloning site into which a first coding sequence encoding any peptide or a nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted, a second coding sequence encoding the transpeptidase, and the transpeptidase A nucleic acid comprising a third coding sequence encoding an N-terminal substrate motif, (b) the first coding sequence or the cloning site, the second coding sequence, and the third coding in the nucleic acid of (a) above.
  • C Nucleic acid amplification reagent
  • D None Cell protein synthesis reaction solution
  • the nucleic acid of (a) has a cloning site into which a first coding sequence encoding an arbitrary peptide or a nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted, a second coding sequence encoding transpeptidase, and And a third coding sequence encoding the N-terminal substrate motif of transpeptidase.
  • These coding sequences are the same as those described in the above “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”.
  • the cloning site into which the nucleic acid fragment containing the first coding sequence can be inserted is not particularly limited and may be any restriction enzyme site.
  • the cloning site comprises a peptide domain translated from the first coding sequence and a transfection translated from the third coding sequence when a nucleic acid fragment containing the first coding sequence is inserted into the cloning site.
  • the nucleic acid of (a) may further contain other sequences.
  • other sequences include the same as those described in the above ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>.
  • a sequence encoding an arbitrary spacer may be included between the respective coding sequences. It may also contain a control sequence such as a promoter sequence which controls the expression of the coding sequence.
  • the third coding sequence, the first coding sequence or cloning site, and the second coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
  • a nucleic acid having a structure in which the third coding sequence, the second coding sequence, and the first coding sequence are arranged in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side, Can be mentioned.
  • the first coding sequence is Examples include those replaced with cloning sites.
  • the nucleic acid of (a) may further include a fourth coding sequence that codes for a protease recognition motif, adjacent to the 5'end of the third coding sequence.
  • the protease recognition motif is the same as that described in the above “ ⁇ Method for producing peptide-nucleic acid complex>”.
  • the nucleic acid of this embodiment may be a plasmid, like the nucleic acid of (a) in the first aspect.
  • the plasmid the same ones as those mentioned in the first aspect can be mentioned.
  • the primer set of (b) is a primer set capable of amplifying a region (coding sequence region) containing the first coding sequence or cloning site, the second coding sequence, and the third coding sequence in the nucleic acid of (a). Is. A transpeptidase recognition motif is added to either one of the forward primer and the reverse primer of the primer.
  • the primer set of (b) may be immobilized on a solid phase carrier.
  • the primer set of (b) may be any of the following (i) to (iv).
  • examples of the method for immobilizing the primer on the solid phase carrier and the substance having the binding property to the solid phase carrier include the same as those mentioned in the first embodiment. ..
  • Azide modified DNA 5 '-[azido] -CGCCAATCCGGATATAGTTC-3' (SEQ ID NO: 29)
  • Alkyne-modified pentaglycine (N) -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (propargyl)-(C) (SEQ ID NO: 43)
  • the structure of the template DNA (SEQ ID NO: 44) used in the following PCR reaction solution is shown in FIG.
  • the template DNA has an ORF containing a polyphosphate kinase gene, a sortase A gene, and a sortase A recognition motif (LPETG (SEQ ID NO: 14)) coding sequence.
  • the sortase A recognition motif (LPETG (SEQ ID NO: 14)) coding sequence is located 3 ′ to the polyphosphate kinase gene.
  • the nucleotide sequence of sortase gene A contained in the template DNA is shown in SEQ ID NO: 30.
  • Nucleic acid-peptide complex containing CP05 or protein kinase inhibitor (PKI) (Synthesis example 3) Synthesis of pentaglycine-added DNA (CP05 gene) As a template DNA, one containing a DNA (Xa motif-CP05) in which a Factor Xa protease recognition motif (SEQ ID NO: 28) coding sequence was ligated to the 5'end of the CP05 peptide gene (SEQ ID NOs: 45, 46) was used.
  • the template DNA (SEQ ID NO: 47) has Xa motif-CP05 in place of the polyphosphate kinase gene in the template DNA shown in FIG.
  • Pentaglycine-added DNA was synthesized in the same manner as in Synthesis Examples 1 and 2 except that the template DNA of CP05 peptide was used.
  • PKI gene As the template DNA, one containing a DNA (Xa motif-PKI) in which a Factor Xa protease recognition motif (SEQ ID NO: 28) coding sequence was ligated to the 5'end of the PKI gene (SEQ ID NOs: 48, 49) was used.
  • the template DNA (SEQ ID NO: 50) has the Xa motif-PKI in place of the polyphosphate kinase gene in the template DNA shown in FIG.
  • Pentaglycine-added DNA was synthesized in the same manner as in Synthesis Examples 1 and 2 except that the template DNA was used.
  • the mixture was stirred at room temperature for 1 hour in the dark.
  • the magnetic beads were then washed 3 times with 100 ⁇ L PBS-T.
  • the magnetic beads were then washed once with 100 ⁇ L PBS.
  • the magnetic beads were suspended in 15 ⁇ L of PBS and observed with a fluorescence microscope (Nikon Eclipse Ti-E, Hamamatsu Photonics EM-CCD camera, B-2A filter, xenon lamp).
  • the fluorescence intensity of the magnetic beads was analyzed by ImageJ from the image captured by the fluorescence microscope.
  • the magnetic bead suspension prepared above was dropped onto a quartz glass chip in which 1 million holes each having a diameter of 4 ⁇ m and a depth of 4 ⁇ m were formed in a 1 cm square, and each well was filled with magnetic beads and a bead dispersion medium.
  • the chip surface was covered with silicone oil (KF96-100cs, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) to seal each well.
  • time-lapse photography was performed with a fluorescence microscope (Nikon Eclipse Ti-E, Hamamatsu Photonics EM-CCD camera, Cy3 filter, xenon lamp) to observe an increase in fluorescence brightness of each well.
  • the analysis of the fluorescence brightness change of each well was performed by ImageJ.
  • FIGS. 12A and 12B The results are shown in FIGS. 12A and 12B.
  • the increase in fluorescence intensity was observed only in the wells filled with the magnetic beads immobilized with the nucleic acid-peptide complex. From these results, it was confirmed that a peptide array can be prepared using the nucleic acid-peptide complex-immobilized magnetic beads prepared by this method.
  • the peptide transfer reaction with sortase A ligates the c-Myc tag-Factor Xa protease recognition motif-CP05-LPETG to the pentaglycine-added DNA to form a peptide-nucleic acid complex.
  • Factor Xa protease is allowed to act on this peptide-nucleic acid complex, it is cleaved at the Factor Xa protease recognition motif.
  • the cMyc tag is cleaved from the peptide-nucleic acid complex.
  • the magnetic bead suspension prepared above was observed with a fluorescence microscope (Nikon Eclipse Ti-E, Hamamatsu Photonics EM-CCD camera, B-2A filter, xenon lamp).
  • the fluorescence intensity of the magnetic beads was analyzed by ImageJ from the captured image.
  • Emulsion PCR A PCR reaction liquid 3 having the following composition and an oil mixed liquid 1 were mixed and stirred to form an emulsion. This was dispensed in 50 ⁇ L aliquots and PCR was performed. PCR conditions were 95 ° C., 5 minutes, (94 ° C., 30 seconds; 55 ° C., 1 minute; 68 ° C., 6 minutes) for 30 cycles, and the temperature was maintained at 10 ° C. after the PCR reaction. The same template DNA as that used in Synthesis Example 2 was used.

Abstract

ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法。ペプチドをコードする第１コード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２コード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３コード配列と、を含む、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸を準備する工程と、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ付加核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、前記トランスペプチダーゼドメインにより、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、を含む。

Description

ペプチド－核酸複合体
　本発明は、ペプチド－核酸複合体に関する。さらに、ペプチド－核酸複合体を固定化した固定化担体、及び前記固定化担体を含む反応槽を備えたペプチドアレイに関する。また、ペプチド-核酸複合体の製造方法、前記製造方法に使用可能な核酸、及びキットに関する。
　本願は、２０１８年１１月７日に、日本に出願された特願２０１８－２０９８７４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　新規機能性ペプチドは、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。
　新規機能性ペプチドの取得に際しては、ペプチドの構造情報から人知によりデザインするペプチド工学的手法が主流であった。しかし、より有用なペプチドを取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、ペプチドのランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。
　進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型－表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、ペプチド（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－ペプチド連結体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。
　ペプチドとこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する方法としては、ピューロマイシンリンカーを用いる方法が知られている（特許文献１参照）。ピューロマイシンは、アミノアシル－ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するペプチド合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のペプチドのＣ末端に特異的に共有結合する。
　ピューロマイシンリンカーを用いてｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド複合体のライブラリーを構築し、有用タンパク質をスクリーニングする方法は、以下の一連の工程を有する。
　先ず、ピューロマイシンを有するリンカーとｍＲＮＡとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからペプチドを合成し、合成されたペプチドとこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ－リンカー－ペプチド複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
　次いで、このｍＲＮＡ－リンカー－ペプチド複合体のライブラリーを製造した後、製造したｍＲＮＡ－リンカー－ペプチド複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド複合体のライブラリーを製造する。
　次いで、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつペプチドを選択し、選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりペプチドを同定する（非特許文献２参照）。
　上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ－リンカー－ペプチド複合体のライブラリーを基板上に固定したペプチドアレイは、網羅的解析により、短期間で機能性タンパク質又は機能性ペプチドを取得するためのツールとして重要である。
　また、ｃＤＮＡ－ペプチド複合体を作製する方法としては、ベンジルグアニン修飾ＤＮＡからＳＮＡＰタグ融合ペプチドを無細胞合成することで、ベンジルグアニンとＳＮＡＰタグとの共有結合を介して、ｃＤＮＡとペプチドとを結合させる方法も知られている（非特許文献３，４）。
特許第４３１８７２１号公報
Nemoto N et al., In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 1997 Sep 8;414(2):405-8. Yamaguchi J et al., cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Res. 2009 Sep;37(16):e108. Diamante L et al., In vitro affinity screening of protein and peptide binders by megavalent bead surface display. Protein Eng Des Sel. 2013Oct;26(10):713-24. Mankowska SA et al., A Shorter Route to Antibody Binders via Quantitative in vitro Bead-Display Screening and Consensus Analysis. Sci Rep. 2016 Nov 7;6:36391.
　しかしながら、ピューロマイシンリンカーを用いる方法では、ピューロマイシンリンカーの調製が煩雑であるという問題がある。
　また、ベンジルグアニン修飾ＤＮＡを用いる方法では、２０ｋＤａのＳＮＡＰタグを介してタンパク質にＤＮＡを連結するため、提示されたタンパク質の立体構造や機能が損なわれる恐れがある。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ペプチド－核酸複合体を製造する新規な製造方法、当該製造方法により製造されるペプチド－核酸複合体、並びに当該製造方法に使用可能な核酸、及びキットを提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法であって、（Ａ１）トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ１）前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ１）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、を含む、ペプチド－核酸複合体の製造方法。
［２］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［１］に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［３］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１］に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［４］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１］に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［５］前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、［１］～［４］のいずれか一つに記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［６］ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法であって、（Ａ２）トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ２）前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ２）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、を含む、ペプチド－核酸複合体の製造方法。
［７］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［６］に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［８］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、［６］に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［９］前記核酸が、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有しており、前記工程（Ｂ２）の後、且つ前記工程（Ｃ２）の前に、さらに、（Ｄ２）前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程、を含む、［６］～［８］のいずれか一つに記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［１０］前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、［６］～［９］のいずれか一つに記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
［１１］（ａ）ペプチドと、（ｂ）前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、（ｃ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、前記（ｃ）の配列が、前記（ａ）のペプチドと前記（ｂ）の核酸との間に位置する、前記ペプチド－核酸複合体。
［１２］前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）のペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフ又は前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、［１１］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１３］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１４］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１５］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１６］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１７］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１８］前記（ｂ）の核酸が、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列をさらに含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有している、［１６］又は［１７］に記載の核酸－ペプチド複合体。
［１９］［１１］～［１８］のいずれか一つに記載のペプチド－核酸複合体が固定化された固相担体。
［２０］［１９］に記載の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイ。
［２１］前記反応槽１個当たり、１種類の前記ペプチド－核酸複合体を含む、［２０］に記載のペプチドアレイ。
［２２］トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
［２３］５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［２２］に記載の核酸。
［２４］５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［２２］に記載の核酸。
［２５］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［２２］に記載の核酸。
［２６］トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
［２７］５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［２６］に記載の核酸。
［２８］５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、［２６］に記載の核酸。
［２９］前記核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、［２６］～［２８］のいずれか一つに記載の核酸。
［３０］［２２］～［２９］のいずれか一つに記載の核酸が固定化された固相担体。
［３１］下記（ａ）～（ｄ）を含む、ペプチド－核酸複合体の作製キット。
　（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
　（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
　（ｃ）核酸増幅試薬
　（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
［３２］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［３１］に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
［３３］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［３１］に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
［３４］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［３１］に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
［３５］下記（ａ）～（ｄ）を含む、ペプチド－核酸複合体の作製キット。
　（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
　（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
　（ｃ）核酸増幅試薬
　（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
［３６］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［３５］に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
［３７］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイトが、この順で、配置されている、［３５］に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
［３８］前記（ａ）の核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、［３５］～［３７］のいずれか一つに記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
　本発明によれば、ペプチド－核酸複合体を製造する新規な製造方法、当該製造方法により製造されるペプチド－核酸複合体、並びに当該製造方法に使用可能な核酸、及びキットが提供される。
本発明の第１実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ａ１）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸の一例を示す。 本発明の第１実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ１）の一例を説明する図である。 本発明の第１実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ１）の一例を説明する図である。 本発明の第２実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ａ１）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸の一例を示す。 本発明の第２実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ１）の一例を説明する図である。 本発明の第２実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ１）の一例を説明する図である。 本発明の第３実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ａ１）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸の一例を示す。 本発明の第３実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ１）の一例を説明する図である。 本発明の第３実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ１）の一例を説明する図である。 本発明の第４実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ａ２）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸の一例を示す。 本発明の第４実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ２）の一例を説明する図である。 本発明の第４実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ２）の一例を説明する図である。 本発明の第５実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ａ２）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸の一例を示す。 本発明の第５実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ２）の一例を説明する図である。 本発明の第５実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ２）の一例を説明する図である。 本発明の第４実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｄ２）の一例を説明する図である。 本発明の第５実施形態にかかるペプチド－核酸複合体の製造方法における工程（Ｄ２）の一例を説明する図である。 合成例１で合成したペンタグリシンが付加されたＤＮＡプライマーのポリアクリルアミド電気泳動の写真である。 合成例２でＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡの構造を示す。 実験例２で無細胞タンパク質翻訳を行った、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズのポリリン酸キナーゼ活性の測定結果を示す。 実験例６で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの抗体染色を行った結果を示す。 実験例６で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの抗体染色を行った結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。 実施例で作製したペプチドアレイの蛍光顕微鏡写真を示す。 実施例で作製したペプチドアレイの各ウェルの蛍光強度の推移を示す。 実験例９で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズによるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性の阻害効果を測定した結果を示す。 実験例１４で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズに、蛍光標識細胞外小胞を反応させて、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。 実験例１４で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズに、蛍光標識細胞外小胞を反応させて、蛍光強度を検出した結果を示す。 エマルションＰＣＲ及びエマルション無細胞タンパク質翻訳後に、実験例１８で、ポリリン酸キナーゼ活性を測定した結果を示す。
［定義］
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを意味する。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、５’側から３’側に向かって記載される。
　本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等と記載されるか、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
　本明細書において、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
　本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。
　本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」のアミノ酸配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コード又は３文字コードで記載される。本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」のアミノ酸配列は、特に明示しない限り、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載される。
　本明細書において、アミノ酸配列における置換変異を表す場合、元のアミノ酸の一文字表記、続いて１～４桁の数字による位置番号、次に置換されたアミノ酸の一文字表記により表現することがある。例えば、アミノ酸番号９４位においてプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換される変異が生じている場合、「Ｐ９４Ｓ」と表され、これは、「アミノ酸番号９４位のＰｒｏのＳｅｒへの置換」と同義である。
　本明細書において、「トランスペプチダーゼ」という用語は、ペプチド結合の切断を触媒し、直接又は複数の反応中間体を経て、新規のペプチド結合を形成することができる酵素を意味する。トランスペプチダーゼは、特定のアミノ酸配列を有するトランスペプチダーゼ認識モチーフを認識し、トランスペプチダーゼ認識モチーフ内のペプチド結合を切断し、前記切断後のトランスペプチダーゼ認識モチーフのＣ末端と、特定のアミノ酸配列を有するトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端との間で新たなペプチド結合を形成する触媒活性を有する。トランスペプチダーゼの好ましい例としては、ソルターゼ又はブテラーゼが挙げられる。
　本明細書において、「ソルターゼ」という用語は、トランスペプチダーゼ活性を有する原核生物の一群の酵素群及びその改変体を意味する。ソルターゼは、特定のアミノ酸配列を有するソルターゼ認識モチーフを認識し、ソルターゼ認識モチーフ内のペプチド結合を切断し、前記切断後のソルターゼ認識モチーフのＣ末端と、特定のアミノ酸配列を有するソルターゼＮ末端基質モチーフのＮ末端との間で新たなペプチド結合を形成する触媒活性を有する。
　「ソルターゼ」として同定される酵素は、様々なグラム陽性菌から単離されている。天然には、これらの酵素は、細胞壁ソーティング反応を触媒する。細胞壁ソーティング反応では、ソルターゼ認識モチーフを有する表面タンパク質が切断され、タンパク質のＣ末端が、ペプチドグリカンのペンタグリシン架橋に共有結合される。ソルターゼを有するグラム陽性菌としては、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等に属する細菌が挙げられる。ソルターゼは、グラム陽性菌ゲノム由来の６１のソルターゼの配列アラインメント及び系統樹解析に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称する４クラスに分類されている（Dramsi S,Trieu-Cuot P,Bierne H,Sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positive bacteria.Res Microbiol.156(3):289-97,2005）。これらのクラスは、ソルターゼが、Ｃｏｍｆｏｒｔ及びＣｌｕｂｂ（Comfort D,Clubb RT.A comparative genome analysis identifies distinct sorting pathways in gram-positive bacteria.Infect Immun. 72(5):2710-22,2004）によっても分類された以下のサブファミリー：クラスＡ（サブファミリー１）、クラスＢ（サブファミリー２）、クラスＣ（サブファミリー３）、クラスＤ（サブファミリー４及び５）に対応する。前述した参照文献は、多数のソルターゼ及び認識モチーフを開示している。
　本明細書において、「ブテラーゼ」という用語は、トランスペプチダーゼ活性を有する、クリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ　ｔｅｒｎａｔｅａ）から単離された酵素（Nguyen GK et al., Nat Protoc. 2016 Oct;11(10):1977-1988、特表２０１７－５１５４６８号公報）、及びそのホモログ（オーソログ及びパラログを含む）、並びにそれらの改変体を意味する。
　本明細書において、「トランスペプチダーゼ認識モチーフ」という用語は、トランスペプチダーゼにより認識される特定のアミノ酸配列を有する領域を意味する。トランスペプチダーゼ認識モチーフは、トランスペプチダーゼにより認識されてモチーフ内のペプチド結合が切断される。トランスペプチダーゼ認識モチーフは、トランスペプチダーゼの種類により異なったものであり得る。本明細書において、ソルターゼのトランスペプチダーゼ認識モチーフは、ソルターゼ認識モチーフとも記載する。本明細書において、ブテラーゼのトランスペプチダーゼ認識モチーフは、ブテラーゼ認識モチーフとも記載する。
　本明細書において、「トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ」という用語は、ペプチドのＮ末端に位置し、トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応に供される特定のアミノ酸配列を有するＮ末端領域を意味する。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフを有するペプチドは、トランスペプチダーゼの触媒作用により、トランスペプチダーゼによる切断後のトランスペプチダーゼ認識モチーフのＣ末端に結合される。
　本明細書において、「５’末端に隣接する」又は「３’末端に隣接する」という用語は、ある塩基配列の５’末端又は３’末端に、他のヌクレオチド残基を介することなく、対象の塩基配列が連結されていることを意味する。すなわち、「配列Ａの５’末端に配列Ｂが隣接する」場合、配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端とが、他の配列を介することなく、直接連結されている。同様に、本明細書において、「Ｎ末端に隣接する」又は「Ｃ末端に隣接する」という用語は、あるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に、他のアミノ酸残基を介することなく、対象のアミノ酸配列が連結されていることを意味する。
　本明細書において、「５’側に位置する」又は「３’側に位置する」という用語は、ある塩基配列の５’側又は３’側に、他のヌクレオチド残基を介して又は他のヌクレオチド残基を介することなく、対象の塩基配列が配置されていることを意味する。すなわち、「配列Ａの５’側に配列Ｂが位置する」場合、５’側から３’側に向かって、配列Ｂ、配列Ａの順に配置されており、配列Ａと配列Ｂとの間に、他のヌクレオチド残基が介在していてもよく、介在していなくてもよい。配列Ａと配列Ｂとの間に、他のヌクレオチド残基がする場合、当該介在するヌクレオチド残基の数及び種類は限定されず、例えば、スペーサーコード配列、タンパク質コード配列、他のＯＲＦ等が介在していてもよい。同様に、本明細書において、「Ｎ末端側に位置する」又は「Ｃ末端側に位置する」という用語は、あるアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側に、他のアミノ酸残基を介して又は他のアミノ酸残基を介することなく、対象のアミノ酸配列が配置されていることを意味する。
　本明細書において、ポリヌクレオチド又は核酸に関して用いる「機能的に連結」という用語は、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチド又は核酸がプロモーターに機能的に連結するとは、当該ポリヌクレオチド又は核酸が、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
　本明細書において、ポリペプチド又は核酸に関して用いる「タンパク質を発現し得る」という用語は、ポリヌクレオチド又は核酸に、無細胞タンパク質合成系を適用した場合に、該ポリヌクレオチド又は核酸から該タンパク質が合成され得る状態にあることを意味する。
　本明細書において、「サイレント変異」という用語は、コードするタンパク質のアミノ酸配列が変化しない遺伝子変異を指す。
　本明細書において、アミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
　本明細書において、「キメラタンパク質」という用語は、由来が異なる２種以上のペプチドを含むタンパク質を意味する。
　本明細書において、「プライマーセット」という用語は、核酸増幅反応において、目的の核酸を増幅するために用いられる１組のプライマーを意味する。核酸増幅反応がＰＣＲにより行われる場合、プライマーセットには、フォワードプライマー及びリバースプライマーが含まれる。「フォワードプライマー」とは、鋳型核酸のアンチセンス鎖にアニーリングするプライマーを意味し、「リバースプライマー」とは、鋳型核酸のセンス鎖にアニーリングするプライマーを意味する。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞
≪第１の態様≫
　一実施形態において、本発明は、ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法を提供する。前記製造方法は、（Ａ１）トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ１）前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ１）前記キメラタンパク質の前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、を含む。
〔第１実施形態〕
　図１Ａ～図１Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第１実施形態の概略を説明する。
　まず、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸１００（以下、「ＮＳ付加核酸１００」という場合がある。）を準備する（図１Ａ；工程（Ａ１））。ＮＳ付加核酸１００は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。ＮＳ付加核酸１００では、５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている。また、ＮＳ付加核酸１００において、これらのコード配列は、前記第１のコード配列から翻訳される前記ペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得るように配置されている。
　次に、ＮＳ付加核酸１００から、無細胞タンパク質合成系を用いて、キメラタンパク質１０１を合成する（図１Ｂ；工程（Ｂ１））。キメラタンパク質１０１は、ペプチド１０のドメイン、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインを含んでいる。キメラタンパク質１０１において、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ペプチド１０のドメインのＣ末端側に位置している。キメラタンパク質１０１では、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチド１０、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２、及びトランスペプチダーゼ２０が、この順で配置されている。
　次に、キメラタンパク質１０１のトランスペプチダーゼ２０のドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体１０２を形成させる（図１Ｃ；工程（Ｃ１））。このようにして、ペプチド－核酸複合体を製造することができる。
　以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
［工程（Ａ１）］
　工程（Ａ１）は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程である。
（トランスペプチダーゼ）
　トランスペプチダーゼは、特に限定されないが、ソルターゼが好ましい。ソルターゼは、ソルターゼ認識モチーフを認識して切断し、前記切断後のソルターゼ認識モチーフのＣ末端に、ソルターゼＮ末端基質モチーフのＮ末端を結合し得るものであれば、特に制限なく使用することができる。公知のソルターゼとしては、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、及びソルターゼＤが知られている。本実施形態の製造方法では、これらのいずれのソルターゼも用いることができる。これらのソルターゼの塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから入手可能である。
　ソルターゼのＮ末端基質モチーフとしては、例えば、１個以上のグリシン（（Ｇ）ｎ）又はアラニン（（Ａ）ｎ）（ｎは１以上の整数）が挙げられる。中でも、ソルターゼのＮ末端基質モチーフは、１個以上のグリシンが好ましい。Ｎ末端基質モチーフにおけるグリシン残基の数は、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～６又は１～５がさらに好ましい。
　ソルターゼＡは、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又は化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）由来のものであってもよい。例えば、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿１８７３３２．１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＤ４８４３７から入手可能である。
　ソルターゼＡの認識モチーフとしては、例えば、ＸＡＰＸＢＸＣ又はＸＡＰＸＢＸＣＧのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、ＸＡは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはメチオニンであり；ＸＢは、任意のアミノ酸であり；ＸＣは、トレオニン、セリン若しくはアラニンであり；Ｐは、プロリンであり；Ｇは、グリシンである。好ましい態様において、ＸＡは、ロイシンであり；ＸＣは、トレオニンであり；ＸＢは、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アラニン、グルタミン、リシン又はメチオニンであり得る。例えば、ソルターゼＡの認識モチーフの具体例としては、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ＬＰＡＴＧ（配列番号２）、ＬＰＮＴＧ（配列番号３）など）、ＬＰＸＡＧ（配列番号４）（ＬＰＮＡＧ（配列番号５）など）、ＬＰＸＴＡ（配列番号６）（ＬＰＮＴＡ（配列番号７）など）、ＬＧＸＴＧ（配列番号８）（ＬＧＡＴＧ（配列番号９）など）、ＩＰＸＴＧ（配列番号１０）（ＩＰＮＴＧ（配列番号１１）、ＩＰＥＴＧ（配列番号１２）など）（Ｘは任意のアミノ酸を表す。）等が挙げられる。これらの中でも、ソルターゼＡの認識モチーフとしては、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）が好ましい。
　ソルターゼＡは、野生型のタンパク質に制限されず、トランスペプチダーゼ活性を有する限り、改変体であってもよい。例えば、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの改変体は、１２０位にＨｉｓ、１８４位にＣｙｓ、及び１９７位にＡｒｇを含み、認識モチーフは、ＴＬＸＴＣ（配列番号１３）であってもよい。ソルターゼＡの改変体は、野生型ソルターゼＡ又はその触媒ドメインのアミノ酸配列に対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。あるいは、ソルターゼＡの改変体は、野生型ソルターゼＡのアミノ酸配列において、１個又は複数個（例えば、２～１５個：２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、若しくは１５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。
　例えば、黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼＡと比較して、ＬＰＥＴＧ（配列番号１４）モチーフへの結合活性が最大１４０倍増大した黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの改変体が見出されており（Chen, I., et al., PNAS 108(28):11399-11404,2011）、そのようなソルターゼＡを用いてもよい。例えば、ソルターゼＡの改変体は、黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼＡに対して、Ｐ９４Ｓ若しくはＰ９４Ｒ、Ｅ１０６Ｇ、Ｆ１２２Ｙ、Ｋ１５４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｇ１７４Ｓ、Ｋ１９０Ｅ、及びＫ１９６Ｔからなる群より選択される少なくとも１個の変異を有するものであってもよい。中でも、Ｐ９４Ｓ若しくはＰ９４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｇ１７４Ｓ、及びＫ１９６Ｔからなる群より選択される少なくとも１個の変異を有するものが好ましく、前記の全ての変異を有するものがより好ましい。
　また、ソルターゼＡは、認識モチーフが改変されたものであってもよい。例えば、Ｐｉｏｔｕｋｈら（J Am Chem Soc. 2011 Nov 9; 133(44): 17536-9）には、認識モチーフがＸＰＸＴＧ（配列番号１５）であるソルターゼＡの改変体が記載されている。Ｄｏｒｒら（Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Sep 16; 111(37): 13343-8.）には、認識モチーフがＬＡＸＴＧ（配列番号１６）又はＬＰＸＳＧ（配列番号１７）であるソルターゼＡの改変体が記載されている。本実施形態の製造方法で用いるトランスペプチダーゼは、これらのソルターゼＡの改変体であってもよい。
　ソルターゼＢは、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、又はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）由来のものであってもよい。
　ソルターゼＢの認識モチーフは、ＮＰＸＡＴＸＢのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、ＸＡは、グルタミン又はリシンであり；ＸＢは、アスパラギン又はグリシンであり；Ｎは、アスパラギンであり；Ｐは、プロリンであり；Ｔは、トレオニンである。ソルターゼＢの認識モチーフの具体例としては、例えば、ＮＰＱＴＮ（配列番号１８）、ＮＰＫＴＧ（配列番号１９）、ＮＳＫＴＡ（配列番号２０）、ＮＰＱＴＧ（配列番号２１）、ＮＡＫＴＮ（配列番号２２）、及びＮＰＱＳＳ（配列番号２３）等が挙げられる。
　ソルターゼＣは、認識モチーフとしてＬＰＸＴＧ（配列番号１)を使用し得る。ソルターゼＣは、共通配列ＮＡ－［Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｈ］－ＴＧ（配列番号２４）を有するモチーフを認識すると推定される（Comfort D and Clubb RT. Infect Immun.,72(5):2710-22,2004）。
　ソルターゼＤは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、トロフェリマ・ウィッペリ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｌｅｉ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａ）、及びビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｈｕｍ）等に由来するものであってもよい。ソルターゼＤの認識モチーフとしては、ＬＰＸＴＡ（配列番号６）又はＬＡＸＴＧ（配列番号１６）が挙げられる。
　ＱＶＰＴＧＶ（配列番号２５）の認識モチーフを有するソルターゼについては、Ｂａｒｎｅｔｔ及びＳｃｏｔｔ（Barnett, TC and Scott, JR, Journal of Bacteriology, Vol. 184, No.8, p.2181-2191, 2002）に記載されている。
　ソルターゼは、グラム陰性菌、例えば、コルウェリア・サイクレリスラエ（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ　ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ミクロブルビファー・デグラダンス（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ　ｄｅｇｒａｄａｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、及びシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）等のソルターゼであってもよい。これらは、ＬＰ［Ｑ／Ｋ］Ｔ［Ａ／Ｓ］Ｔの認識モチーフを有し得る。
　また、ソルターゼは、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）（例えば、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ））由来のものであってもよい。
　トランスペプチダーゼは、ブテラーゼであってもよい。ブテラーゼは、ブテラーゼ認識モチーフを認識して切断し、前記切断後のブテラーゼ認識モチーフのＣ末端に、ブテラーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端を結合し得るものであれば、特に制限なく使用することができる。公知のブテラーゼとしては、ブテラーゼ１（Nguyen GK et al., Nat Protoc. 2016 Oct;11(10):1977-1988、特表２０１７－５１５４６８号公報）が知られている。ブテラーゼ１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＫＦ９１８３４５から入手可能である。
　ブテラーゼのＮ末端基質モチーフとしては、例えば、ＸＥＸＦが挙げられる。前記において、ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。ブテラーゼの認識モチーフは、例えば、ＸＤＨＶのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、ＸＤは、アスパラギン若しくはアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。
　ブテラーゼは、野生型のタンパク質に制限されず、トランスペプチダーゼ活性を有する限り、改変体であってもよい。ブテラーゼの改変体は、野生型ブテラーゼ又はその触媒ドメインのアミノ酸配列に対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。あるいは、ブテラーゼの改変体は、野生型ブテラーゼのアミノ酸配列において、１個又は複数個（例えば、２～１５個：２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、若しくは１５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。
　これらの中でも、トランスペプチダーゼは、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼＡ（野生型及び改変型を包含する）又はブテラーゼ１（野生型及び改変型を包含する）がより好ましく、ソルターゼＡがさらに好ましい。
（トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸：ＮＳ付加核酸）
　ＮＳ付加核酸は、５’末端及び３’末端のいずれか一方に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸である。図１Ａに示すＮＳ付加核酸１００では、核酸３０ａの５’末端に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されている。図１Ａにおいて、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、（Ｘ１）ｎ（ｎは１以上）のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、前記Ｘ１は、グリシン又はアラニンであることが好ましく、グリシンであることがより好ましい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ１である場合、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ＸＥＸＦ（ＸＥは、任意のアミノ酸であり、ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである）で表されてもよい。
　ＮＳ付加核酸１００は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。
　第１のコード配列がコードするペプチドは、特に限定されず、任意のペプチドであってよい。ペプチドとしては、例えば、生理活性ペプチド及び機能性ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。生理活性ペプチド及び機能性ペプチドとしては、例えば、酵素、酵素阻害分子、酵素活性化分子、ホルモン、レセプター、サイトカイン、抗体、抗原、アプタマー、蛍光タンパク質、アジュバント、毒素、リガンド、接着性ペプチド、キレート形成性ペプチド、膜透過性ペプチド、ドミナントネガティブペプチド、及び抗菌性ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。第１のコード配列は、目的のペプチド１０をコードするものであればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
　第１のコード配列は、ＤＮＡライブラリー等の複数種類のＤＮＡの混合物由来のものであってもよい。第１のコード配列は、例えば、変異ＤＮＡライブラリー由来のものであり得る。変異ＤＮＡライブラリーとしては、Ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ　ＰＣＲ（エラープローンＰＣＲ）を利用したライブラリー、Ｇｅｎｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、Ｒａｎｄｏｍ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、ＤＮＡ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｆａｍｉｌｙ　ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー、ＩＴＣＨＹ　Ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＳＣＲＡＴＣＨＹ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー、ホスホロアミダイト法による混合塩基合成を利用したライブラリー等が挙げられる。
　第２のコード配列は、トランスペプチダーゼ２０をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
　第３のコード配列は、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
　ＮＳ付加核酸１００では、５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている（図１（Ａ）参照）。また、これらの配列は、ＮＳ付加核酸１００において、第１のコード配列から翻訳されるペプチド１０のドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ２０のドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２と、を含むキメラタンパク質１０１であって、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、ペプチド１０のドメインのＣ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得るように配置されている（図１Ｂ参照）。すなわち、第１のコード配列と、第３のコード配列と、第２のコード配列とは、１つのＯＲＦ内で、任意の塩基配列を介して、又は介さないで、５’側から３’側に向かって前記の順でインフレームに連結されている。
　ＮＳ付加核酸１００は、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列に加えて、他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、例えば、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列を含むＯＲＦの転写及び／又は翻訳を制御する制御配列が挙げられる。そのような制御配列としては、プロモーター、ターミネーター、転写促進配列、翻訳促進配列、シャイン・ダルガノ配列等が挙げられる。制御配列は、後述する工程（Ｂ１）で用いる無細胞タンパク質合成系に応じて、前記ＯＲＦの転写及び／又は翻訳を制御可能なものを適宜選択することができる。
　プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等が挙げられる。前記ＯＲＦは、プロモーターの制御下で発現されるように、プロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。
　ＮＳ付加核酸１００は、第１のコード配列と第３のコード配列との間、及び第３のコード配列と第２のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第２のコード配列と第３のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＮＳ付加核酸１００から発現されたキメラタンパク質１０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
　核酸３０ａに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されたプライマーを用いて、ＰＣＲ法等で、核酸３０ａを増幅することにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸３０ａ（ＮＳ付加核酸１００）を得ることができる。
　トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に付加すればよい。例えば、フォワードプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加してもよく、リバースプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加してもよい。
　プライマーに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、クリックケミストリ―で用いられる各種方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応による方法（核酸－アジド及びペプチド－アルキンの組合せを用いてもよく、核酸－アルキン及びペプチド－アジドの組合せを用いてもよい）；銅フリーのシクロオクチン、ＤＢＣＯ、又はＢＡＲＡＣ等を用いる方法；等が挙げられる。
　また、クリックケミストリ―に限定されず、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を介して、活性化剤及び架橋化剤等により、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１と核酸３０ａとを結合してもよい。さらに、臭素又ヨウ素を用いた求核置換反応、アルデヒド／ケトンとヒドラジドとの反応、プロペルギルエステルとアミノ基との反応、光架橋反応等を用いてもよい。
　また、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１の核酸３０ａへの付加は、核酸３０ａの末端官能基に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を結合する方法で行ってもよい。例えば、ＰＣＲ法等により、核酸３０ａを増幅した後、核酸３０ａの末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加してもよい。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法は、上記と同様の方法を用いることができる。
　本工程で準備されるＮＳ付加核酸１００は、固相担体に固定化されていてもよい。固相担体としては、特に限定されず、例えば、ビーズ（磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等）、マイクロウェルプレート等が挙げられる。中でも、回収や任意位置への配置が容易であることから、固相担体としては磁気ビーズが好ましい。
　核酸を固相担体に固定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、アビジン－ビオチン結合を利用する方法；核酸をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法；金-チオール結合を利用する方法等を用いることができる。中でも、アビジン－ビオチン結合を利用する方法が好適に用いられる。
　核酸３０ａをＰＣＲ法により増幅する場合、増幅後の核酸３０ａが固相担体に固定化されるように、一方のプライマーが固相担体に固定化されたプライマーセットを用いてもよい。例えば、フォワードプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されている場合、リバースプライマーの５’末端を固相担体に固定化することができる。あるいは、リバースプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されている場合、フォワードプライマーの５’末端を固相担体に固定化することができる。プライマーを固相担体に固定化する方法としては、上記で挙げた方法と同様の方法を用いることができる。
（エマルションＰＣＲ）
　ＰＣＲは、エマルションＰＣＲであってもよい。例えば、一方のプライマーがビーズに固定化されたプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により核酸３０ａを増幅する場合、エマルションＰＣＲを行うことができる。エマルションＰＣＲは、１分子の鋳型核酸又はプライマーを固定化した１個のビーズをエマルション内に区画化し、エマルション内で、プライマーを用いてＰＣＲを行う手法である。一方のプライマーがビーズに固定化されている場合、１個のビーズごとに１個のエマルション内に区画化し、エマルション内でＰＣＲを行うことにより、ビーズ表面に１種類の核酸を増幅及び固定することができる。また、プライマーがビーズに固定化されていない場合、１分子の鋳型核酸を、１個のエマルション内に区画化し、エマルション内でＰＣＲを行ってもよい。これにより、エマルション内で同一種類の核酸を増幅することができる。
　エマルションＰＣＲで用いるエマルションの種類は特に限定されないが、調製が容易であること及び以降の操作が簡易になること等の理由から油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルションを用いることが好ましい。エマルションは、常法により調製すればよく、例えば、核酸３０ａ、ビーズに固定化されたプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸増幅に必要な試薬を含む水性成分に、油性成分、乳化剤を混合し、撹拌することによりＷ／Ｏ型エマルションを得ることができる。これにより、１分子の核酸３０ａ及び１個のビーズを、１個のエマルション粒子内に区画化することができる。エマルションの調製には、例えば、攪拌処理（磁気攪拌子、プロペラ式などの使用）、ホモジナイズ（ホモジナイザー、乳鉢などの使用）、超音波処理（ソニケーターなどの使用）などを利用できる。
　エマルション粒子の大きさは特に限定されず、１分子の核酸３０ａ及び１個のビーズを内包できる大きさであればよい。エマルション粒子の平均粒径は、例えば、１μｍ～１００μｍが好ましく、５μｍ～５０μｍがより好ましく、１０μｍ～３０μｍが特に好ましい。プライマーがビーズに固定されていない場合、エマルション粒子の平均粒径は、１分子の鋳型核酸を内包できる大きさであればよく、例えば１ｎｍ以上、例えば１０ｎｍ以上、又は例えば５０ｎｍ以上であることができる。平均粒径の上限は、上記と同様に、例えば１００μｍ以下、例えば５０μｍ以下、又は例えば３０μｍ以下であることができる。
　エマルション粒子の数は前記水性成分の体積からエマルション１個の体積を割ることにより算出される。よって、エマルション１個あたり平均１分子以下の鋳型核酸が含まれるようにＷ／Ｏ型エマルションを調製するためには、全体におけるエマルションの数以下の分子数の核酸３０ａを用意すればよい。
　エマルションの調製に用いられる乳化剤としては、例えば、ゴールドシュミット社製ＡＢＩＬ（登録商標）ＷＥ０９、ＡＢＩＬ（登録商標）ＷＳ０８、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０等が挙げられる。エマルションの調製に用いられる油性成分としては、通常、ミネラルオイル（鉱物油）が用いられる。
　エマルションＰＣＲ後は、エマルションを破壊し、ＮＳ付加核酸１００が固定化されたビーズを回収してもよい。回収後は、適切な洗浄バッファー等を用いて、ビーズを洗浄してもよい。ＮＳ付加核酸１００がビーズに固定化されていない場合も、同様に、エマルションを破壊し、ＮＳ付加核酸１００を回収してもよい。
　本実施形態の製造方法では、１個のビーズにつき、１種類のＮＳ付加核酸１００を提示させられることから、ビーズに固定化したプライマーを用いたエマルションＰＣＲにより、ＮＳ付加核酸１００を準備することが好ましい。
　ただし、１個のビーズにつき、１種類のＮＳ付加核酸１００を提示させる方法は、エマルションＰＣＲに限定されない。例えば、１分子の核酸３０ａ及び１個のビーズを、１個の反応槽内に区画化し、ＰＣＲ反応を行う方法を用いてもよい。
［工程（Ｂ１）］
　工程（Ｂ１）は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程である。
（キメラタンパク質）
　キメラタンパク質１０１は、核酸３０ａから転写・翻訳されるタンパク質である。キメラタンパク質１０１は、ペプチド１０のドメインと、トランスペプチダーゼ２０のドメインと、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２と、を含んでいる。キメラタンパク質１０１において、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチド１０のドメイン、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインは、この順で配置されている。
　図１Ｂにおいて、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＺＸ１（Ｚはトランスペプチダーゼ認識モチーフにおけるＣ末端アミノ酸残基を除く配列を示し、Ｘ１はトランスペプチダーゼ認識モチーフにおけるＣ末端アミノ酸残基を示す。）のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、前記Ｘ１は、グリシン又はアラニンであることが好ましく、グリシンであることがより好ましい。Ｚとしては、上記のソルダーゼ認識モチーフとして例示した配列からＣ末端アミノ酸残基を除いた配列が挙げられ、具体的には、ＬＰＸＴ（配列番号３１）（ＬＰＡＴ（配列番号３２）、ＬＰＮＴ（配列番号３３）など）、ＬＰＸＡ（配列番号３４）（ＬＰＮＡ（配列番号３５）など）、ＬＰＸＴ（配列番号３６）（ＬＰＮＴ（配列番号３７）など）、ＬＧＸＴ（配列番号３８）（ＬＧＡＴ（配列番号３９）など）、ＩＰＸＴ（配列番号４０）（ＩＰＮＴ（配列番号４１）、ＩＰＥＴ（配列番号４２）など）（Ｘは任意のアミノ酸を表す。）等が例示される。トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジン；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。
（無細胞タンパク質合成系）
　キメラタンパク質１０１は、無細胞タンパク質合成系を用いて、ＮＳ付加核酸１００から合成される。
　無細胞タンパク質合成系とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（ＤＮＡやｍＲＮＡ）からそれがコードするｍＲＮＡやタンパク質をｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成可能な系である。無細胞タンパク質合成系では、一般的に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。前記細胞抽出液には、一般的に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、ｔＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、前記細胞抽出液に、各種アミノ酸；ＡＴＰ、ＧＴＰなどのエネルギー源；クレアチンリン酸などのタンパク質合成に必要なその他の物質を添加する。また、別途用意したリボソーム、各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
　広く利用されている無細胞タンパク質合成系としては、例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液の系（原核細胞の系）、コムギ胚芽抽出液の系（真核細胞の系）、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系（真核細胞の系）等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系に必要な試薬は、キットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。
　無細胞タンパク質合成系は、タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系であってもよい（例えば、Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。再構成した無細胞タンパク質合成系では、細菌のタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をｔＲＮＡに結合させる２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びメチオニルｔＲＮＡホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をｉｎ　ｖｉｔｒｏで再構成している。
　無細胞タンパク質合成系を用いた、ＮＳ付加核酸１００からのキメラタンパク質１０１の合成は、エマルション中で行ってもよい。ＮＳ付加核酸１００がビーズに固定化されている場合、１個のビーズを、１個のエマルション粒子内に区画化することができる。前記工程（Ａ１）において、１個のビーズにつき、１種類のＮＳ付加核酸１００が提示されている場合、１個のエマルション粒子内に、１種類のＮＳ付加核酸１００と、前記ＮＳ付加核酸１００から合成されたキメラタンパク質１０１とを共存させることができる。
　ＮＳ付加核酸１００がビーズに固定化されていない場合も、１分子のＮＳ付加核酸１００を、１個のエマルション粒子内に区画化し、前記エマルション内で無細胞タンパク質合成系によるキメラタンパク質１０１の合成を行ってもよい。この場合も、１個のエマルション粒子内に、１種類のＮＳ付加核酸１００と、前記ＮＳ付加核酸１００から合成されたキメラタンパク質１０１とを共存させることができる。
　エマルションの作製方法、及びエマルション粒子の大きさ等は、上記「［工程（Ａ１）］」で例示したものと同様とすることができる。
　本実施形態の製造方法では、１区画に、１種類のＮＳ付加核酸１００及び前記核酸から合成されたキメラタンパク質１０１を共存させられることから、エマルション内で、無細胞タンパク質合成を行うことが好ましい。
　ただし、１区画に、１種類のＮＳ付加核酸１００及び前記核酸から合成されたキメラタンパク質１０１を共存させる方法は、エマルション内での無細胞タンパク質合成に限定されない。例えば、１種類のＮＳ付加核酸１００を提示する１個のビーズを、１個の反応槽内に区画化し、無細胞タンパク質合成を行う方法を用いてもよい。
［工程（Ｃ１）］
　工程（Ｃ１）は、工程（Ｂ１）で合成されたキメラタンパク質のトランスペプチダーゼドメインのペプチド転移反応により、ペプチド－核酸複合体を形成させる工程である。
　前記工程（Ｂ１）において、ＮＳ付加核酸１００から合成されたキメラタンパク質１０１は、トランスペプチダーゼ２０のドメインとトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２とを含んでいる。そのため、キメラタンパク質１０１内のトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、トランスペプチダーゼ２０のドメインにより認識され、モチーフ内の所定箇所で切断され、配列２２’と配列２２”とに分割されるとともに、配列２２’のＣ末端が、トランスペプチダーゼ２０のドメイン内のシステイン残基とチオエステル結合で連結される。これにより、ペプチド１０のドメイン及び配列２２’を含むタンパク質Ａと、トランスペプチダーゼ２０及び配列２２”を含むペプチド転移反応生成物１０３とが、チオエステル結合で連結した状態となる。
　次いで、ペプチド転移反応により、前記タンパク質Ａにおける配列２２’のＣ末端には、ＮＳ付加核酸１００のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端が結合される。これにより、ペプチド１０と前記ペプチドをコードする核酸３０ａとを含む、ペプチド－核酸複合体１０２が形成される。同時に、ペプチド転移反応生成物１０３が形成される。
　図１Ｃの例では、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、図１Ｂと同様にＺＸ１からなる配列として表されている。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、（Ｘ１）ｎで表されている。
　キメラタンパク質１０１中のトランスペプチダーゼ２０のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ＺとＸ１との間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、配列２２’と配列２２”とに分割される。配列２２’は、Ｚからなる配列であり、配列２２”は、Ｘ１からなる配列である。次いで、配列２２’のＣ末端のアミノ酸残基と、ＮＳ付加核酸１００のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸Ｘ１との間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド－核酸複合体１０２及びペプチド転移反応生成物１０３が生成される。
　トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ１である場合、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ＸＥＸＦ（ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。）で表されてもよい。
　この場合、キメラタンパク質１０１中のトランスペプチダーゼ２０のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ＸＤとＨとの間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤ（上記配列２２’に対応）とＨＶ（上記配列２２”に対応）とに分割される。次いで、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２の切断Ｃ末端のアミノ酸残基（ＸＤ）と、ＮＳ付加核酸１００のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸配列ＸＥＸＦとの間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド－核酸複合体１０２及びペプチド転移反応生成物１０３が生成される。
　本工程により得られるペプチド－核酸複合体１０２は、（ａ）ペプチド１０と、（ｂ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２とトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１とが、結合して生じる配列と、（ｃ）ペプチド１０をコードする核酸３０ａと、を含んでいる。また、前記（ｂ）の配列は、ペプチド１０と核酸３０ａとの間に位置している。
　本明細書において、「トランスペプチダーゼ認識モチーフとトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列」（以下、「ＴＰＲ－ＮＳ配列」という場合がある）とは、トランスペプチダーゼにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフが切断して生じた配列のＣ末端に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端が結合することにより生じる配列を意味する。図１Ｃの例では、ＴＰＲ－ＮＳ配列は、Ｚ（Ｘ１）ｎで表される配列である。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、通常、ＴＰＲ－ＮＳ配列は、トランスペプチダーゼ認識モチーフと同じ配列を含んでいる。したがって、ＴＰＲ－ＮＳ配列としては、上記ソルターゼ認識モチーフとして挙げた配列と同様のものが挙げられる。
　トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、ＴＰＲ－ＮＳ配列としては、ＸＤＸＥＸＦ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン又はシステインである。）で表される配列が挙げられる。
　キメラタンパク質１０１では、トランスペプチダーゼ２０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＣ末端側に位置しているため、ペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ２０のドメインが除去される。そのため、ペプチド－核酸複合体１０２は、ペプチド１０が、ＴＰＲ－ＮＳ配列を介して、核酸３０ｂに結合した構造を有している（図１Ｃ参照）。
　工程（Ｃ１）は、トランスペプチダーゼがトランスペプチダーゼ活性を発現し得る条件下で行えばよく、通常、前記工程（Ｂ１）と同時に行うことができる。
［他の工程］
　本実施形態の製造方法は、上記工程（Ａ１）～（Ｃ１）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は、特に限定されず、例えば、核酸、キメラタンパク質又はペプチド－核酸複合体の回収工程、洗浄工程、精製工程等が例示される。
　本実施形態の製造方法によれば、リンカーの調製等の煩雑な作業を要することなく、ペプチド－核酸複合体を製造することができる。また、本実施形態の製造方法により得られたペプチド－核酸複合体では、ペプチドと核酸との間にＴＰＲ－ＮＳ配列が存在する。ＴＰＲ－ＮＳ配列は、通常、５～１０アミノ酸程度の短い配列であるため、ペプチド－核酸複合体において、ペプチドの立体構造や機能が損なわれる可能性は低い。したがって、ペプチド－核酸複合体は、ペプチドアレイにより所望の機能を有するペプチドをスクリーニングするために好適に用いることができ、且つスクリーニングされたペプチドをコードする核酸を簡易に同定することができる。
〔第２実施形態〕
　図２Ａ～図２Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第２実施形態の概略を説明する。
　本実施形態では、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸として、５’側から３’側に向かって、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３のコード配列と、がこの順で配置された核酸３０ｂに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されたもの（以下、「ＮＳ付加核酸２００」という場合がある。）を用いる（図２Ａ参照）。
　ＮＳ付加核酸２００は、第２のコード配列と第１のコード配列との間、及び第１のコード配列と第３のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第２のコード配列と第１のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＮＳ付加核酸２００から発現されたキメラタンパク質２０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
　本実施形態の製造方法は、前記第１実施形態におけるＮＳ付加核酸１００に代えて、ＮＳ付加核酸２００を用いること以外は、前記第１実施形態と同様に行うことができる。
　無細胞タンパク質合成系を用いて、ＮＳ付加核酸２００から合成されたキメラタンパク質２０１は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼ２０のドメイン、ペプチド１０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、この順で配置された構成を有している（図２Ｂ参照）。
　キメラタンパク質２０１中のトランスペプチダーゼ２０によるペプチド転移反応により、ＮＳ付加核酸２００及びキメラタンパク質２０１から、ペプチド－核酸複合体２０２及びペプチド転移反応生成物２０３が生成される。
　キメラタンパク質２０１では、トランスペプチダーゼ２０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＮ末端側に位置しているため、ペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ２０のドメインが除去されることがない。そのため、ペプチド－核酸複合体２０２は、トランスペプチダーゼ２０及びペプチド１０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ－ＮＳ配列を介して、核酸３０ｂに結合した構造を有している（図２Ｃ参照）。
〔第３実施形態〕
　図３Ａ～図３Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第３実施形態の概略を説明する。
　本実施形態では、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸として、５’側から３’側に向かって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３のコード配列と、がこの順で配置された核酸３０ｃに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されたもの（以下、「ＮＳ付加核酸３００」という場合がある。）を用いる（図３Ａ参照）。
　ＮＳ付加核酸３００は、第１のコード配列と第２のコード配列との間、及び第２のコード配列と第３のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第２のコード配列と第３のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＮＳ付加核酸３００から発現されたキメラタンパク質３０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
　本実施形態の製造方法は、前記第１実施形態におけるＮＳ付加核酸１００に代えて、ＮＳ付加核酸３００を用いること以外は、前記第１実施形態と同様に行うことができる。
　無細胞タンパク質合成系を用いて、ＮＳ付加核酸３００から合成されたキメラタンパク質３０１は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチド１０のドメイン、トランスペプチダーゼ２０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、この順で配置された構成を有している（図３Ｂ参照）。
　キメラタンパク質３０１中のトランスペプチダーゼ２０によるペプチド転移反応により、ＮＳ付加核酸３００及びキメラタンパク質３０１から、ペプチド－核酸複合体３０２及びペプチド転移反応生成物３０３が生成される。
　キメラタンパク質３０１では、トランスペプチダーゼ２０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＮ末端側に位置しているため、ペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ２０のドメインが除去されることがない。そのため、ペプチド－核酸複合体３０２は、ペプチド１０及びトランスペプチダーゼ２０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ－ＮＳ配列を介して、核酸３０ｃに結合した構造を有している（図３Ｃ参照）。
　本態様にかかる上記第１～第３の実施形態における核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃは、第１のコード配列が、第３のコード配列の５’側に位置している点で共通する。また、核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃから発現されるキメラタンパク質１０１，２０１，３０１は、ペプチド１０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＮ末端側に位置している点で共通する。
　トランスペプチダーゼとして、Ｃ末端に位置するトランスペプチダーゼ認識モチーフに対して適合性が高いトランスペプチダーゼ（例えば、ブテラーゼ１）を用いる場合、第２の実施形態又は第３の実施形態が好ましい。
≪第２の態様≫
　一実施形態において、本発明は、ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法を提供する。前記製造方法は、（Ａ２）トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ２）前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ２）前記キメラタンパク質の前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、を含む。
〔第４実施形態〕
　図４Ａ～図４Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第４実施形態の概略を説明する。
　まず、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加された核酸４００（以下、「ＴＰＲ付加核酸４００」という場合がある。）を準備する（図４Ａ；工程（Ａ２））。ＴＰＲ付加核酸４００は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。ＴＰＲ付加核酸４００では、５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている。また、ＴＰＲ付加核酸４００において、これらのコード配列は、第１のコード配列から翻訳される前記ペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得るように配置されている。
　次に、ＮＳ付加核酸４００から、無細胞タンパク質合成系を用いて、キメラタンパク質４０１を合成する（図４Ｂ；工程（Ｂ２））。キメラタンパク質４０１は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、ペプチド１０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインを含んでいる。キメラタンパク質４０１において、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ペプチド１０のドメインのＮ末端側に位置している。キメラタンパク質４０１では、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、ペプチド１０、及びトランスペプチダーゼ２０が、この順で配置されている。
　次に、キメラタンパク質４０１のトランスペプチダーゼ２０のドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体４０２を形成させる（図４Ｃ；工程（Ｃ２））。このようにして、ペプチド－核酸複合体を製造することができる。
　以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
［工程（Ａ２）］
　工程（Ａ２）は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程である。
　工程（Ａ２）は、ＮＳ付加核酸１００に代えてＴＰＲ付加核酸４００を用いること以外は、前記第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）と同様に行うことができる。
　ＴＰＲ付加核酸は、５’末端及び３’末端のいずれか一方に、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸である。図４Ａに示すＴＰＲ付加核酸４００では、核酸３０ｄの５’末端に、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加されている。図４Ａにおいて、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＺＸ１のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。ＺＸ１の説明は、前記第１の態様の第１実施形態において説明したとおりである。また、本実施形態において、ＺとＸ１との間の結合は、エステル結合であってもよい（Williamson DJ et al., Nat Protoc. 2014 Feb;9(2):253-62.）。したがって、ＴＰＲ付加核酸４００において、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＺとＸ１との間がエステル結合で連結されたものを包含する。後述の実施形態５におけるＴＰＲ付加核酸５００についても同様である。
　トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。
　第１のコード配列及び第２のコード配列は、前記第１の態様の第１実施形態で説明したものと同様である。
　第３のコード配列は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
　ＴＰＲ付加核酸４００では、５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている（図４Ａ参照）。また、これらの配列は、ＴＰＲ付加核酸４００において、第１のコード配列から翻訳されるペプチド１０のドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ２０のドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１と、を含むキメラタンパク質４０１であって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が、ペプチド１０のドメインのＮ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得るように配置されている（図４Ｂ参照）。すなわち、第３のコード配列と、第１のコード配列と、第２のコード配列とは、１つのＯＲＦ内で、任意の塩基配列を介して、又は介さないで、５’側から３’側に向かって前記の順でインフレームに連結されている。
　ＴＰＲ付加核酸４００は、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列に加えて、他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、例えば、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列を含むＯＲＦの転写及び／又は翻訳を制御する制御配列が挙げられる。制御配列としては、前記第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）で挙げたものと同様のものが挙げられる。
　ＴＰＲ付加核酸４００は、第１のコード配列と第３のコード配列との間、及び第３のコード配列と第２のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第１のコード配列と第２のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＴＰＲ付加核酸４００から発現されたキメラタンパク質４０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
　ＴＰＲ付加核酸４００は、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１をコードする第４のコード配列を含む、ＴＰＲ付加核酸４００’であってもよい（図６Ａ参照）。プロテアーゼ認識モチーフ４１には、プロテアーゼ認識モチーフ４１とトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１との間の結合を切断する活性を有するプロテアーゼの認識モチーフを用いる。例えば、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が（Ｇ）ｎ（ｎは１以上の整数）で表される配列である場合、プロテアーゼ認識モチーフ４１としては、ＴＥＶプロテアーゼの認識モチーフ（ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２７））、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼの認識モチーフ（Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号２８））等を用いることができる。
　ＴＰＲ付加核酸４００が、第３のコード配列の５’末端に隣接して、第４のコード配列を有するＴＰＲ付加核酸４００’であることにより、ＴＰＲ付加核酸４００’から発現されるキメラタンパク質４０１’は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１が配置される（図６Ａ参照）。そのため、キメラタンパク質４０１’においては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン（Ｍ）等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ４０で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１をキメラタンパク質のＮ末端に露出させることができる（図６Ａ参照）。
　核酸３０ｄに、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２を付加する方法は、特に限定されず、第１の態様の第１実施例の工程（Ａ１）において、核酸３０ａにトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法として例示した方法と同様の方法を用いることができる。
　本工程で準備されるＴＰＲ付加核酸４００は、固相担体に固定化されていてもよく、固定化されていなくてもよいが、固相担体に固定化されていることが好ましい。固相担体としては、特に限定されず、第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）で例示したものと同様のものが挙げられる。核酸を固相担体に固定化する方法についても、第１の態様の第１実施例の工程（Ａ１）で例示したものと同様のものが挙げられる。
　本実施形態の製造方法でも、第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）と同様に、１個のビーズにつき、１種類のＴＰＲ付加核酸４００を提示させられることから、少なくとも一方のプライマーがビーズに固定化されたプライマーセットを用いたエマルションＰＣＲにより、ＴＰＲ付加核酸４００を準備することが好ましい。
　ただし、１個のビーズにつき、１種類のＴＰＲ付加核酸４００を提示させる方法は、エマルションＰＣＲに限定されない。例えば、１分子の核酸３０ｄ及び１個のビーズを、１個の反応槽内に区画化し、ＰＣＲ反応を行う方法を用いてもよい。
　プライマーがビーズに固定化されていない場合も、１分子の鋳型ＤＮＡを、１個のエマルション粒子内に区画化し、エマルションＰＣＲを行ってもよい。
［工程（Ｂ２）］
　工程（Ｂ２）は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程である。
　工程（Ｂ２）は、ＮＳ付加核酸１００に代えて、ＴＰＲ付加核酸４００を用いること以外は、第１の態様の第１実施形態の工程（Ｂ１）と同様に行うことができる。
　本実施形態において、キメラタンパク質４０１は、核酸３０ｄから転写及び翻訳されるタンパク質である。キメラタンパク質４０１は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１と、ペプチド１０のドメインと、トランスペプチダーゼ２０のドメインと、を含んでいる。キメラタンパク質４０１では、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、ペプチド１０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインが、この順で配置されている（図４Ｂ参照）。
　無細胞合成系において、任意のアミノ酸を結合させた開始ｔＲＮＡを用いることで、Ｎ末端に任意のアミノ酸を有するタンパク質を合成することができる。例えば、グリシンを結合させた開始ｔＲＮＡを用いることで、Ｎ末端がグリシンのタンパク質を合成することができる（例えば、Goto Y and Suga H, J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1;国際公開第２００７／０５８３７６号）。
［工程（Ｃ２）］
　工程（Ｃ２）は、工程（Ｂ２）で合成されたキメラタンパク質のトランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、ペプチド－核酸複合体を形成させる工程である。
　工程（Ｃ２）は、ＮＳ付加核酸１００に代えてＴＰＲ付加核酸４００を用い、キメラタンパク質１０１に代えてキメラタンパク質４０１を用いること以外は、第１の態様の第１実施形態の工程（Ｃ１）と同様に行うことができる。
　前記工程（Ｂ２）において、ＴＰＲ付加核酸４００から合成されたキメラタンパク質４０１は、トランスペプチダーゼ２０のドメインとトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１とを含んでいる。一方、ＴＰＲ付加核酸４００は、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２を含んでいる。そのため、ＴＰＲ付加核酸４００内のトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、トランスペプチダーゼ２０のドメインにより認識され、モチーフ内の所定箇所で切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、配列２２’と配列２２”とに分割されるとともに、配列２２’のＣ末端が、トランスペプチダーゼ２０のドメイン内のシステイン残基とチオエステル結合で連結される。これにより、配列２２’を含む核酸Ａ及びキメラタンパク質４０１がチオエステル結合で連結した状態となる。また、配列２２”を含むペプチド転移反応生成物４０３が生成される。
　次いで、前記核酸Ａにおける配列２２’のＣ末端には、キメラタンパク質４０１のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端が結合される。これにより、ペプチド１０と、前記ペプチドをコードする核酸３０ｄとを含む、ペプチド－核酸複合体４０２が形成される。
　トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ１である場合、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ＸＥＸＦ（ＸＥは、任意のアミノ酸であり、ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。）で表されてもよい。
　この場合、キメラタンパク質１０１中のトランスペプチダーゼ２０のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ＴＰＲ付加核酸４００中のトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２におけるＸＤとＨとの間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤ（上記配列２２’に対応）とＨＶ（上記配列２２”に対応）とに分割される。次いで、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２の切断Ｃ末端のアミノ酸残基（ＸＤ）と、キメラタンパク質４０１のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸配列ＸＥＸＦとの間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド－核酸複合体１０２及びペプチド転移反応生成物１０３が生成される。
　本工程により得られるペプチド－核酸複合体４０２は、トランスペプチダーゼ２０及びペプチド１０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ－ＮＳ配列を介して、核酸３０ｄに結合した構造を有している（図４Ｃ参照）。
［他の工程］
　本実施形態の製造方法は、上記工程（Ａ２）～（Ｃ２）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は、特に限定されず、例えば、核酸、キメラタンパク質又はペプチド－核酸複合体の回収工程、洗浄工程、精製工程等が例示される。核酸３０ｄが、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含む場合には、下記工程（Ｄ２）を含むことが好ましい。
（工程（Ｄ２））
　工程（Ｄ２）は、前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程である。工程（Ｄ２）は、前記工程（Ｂ２）の後、且つ前記工程（Ｃ２）の前に行われる。
　核酸３０ｄが、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含む場合、当該核酸３０ｄから発現されるキメラタンパク質４０１’は、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に隣接して、第４のコード配列から翻訳されるプロテアーゼ認識モチーフ４１を含む（図６Ａ参照）。そのため、プロテアーゼ認識モチーフ４１のＣ末端アミノ酸残基とトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断する活性を有するプロテアーゼ４０を用いて、キメラタンパク質４０１’を処理することにより、前記ペプチド結合を切断することができる。
　したがって、キメラタンパク質４０１’においては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン（Ｍ）等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ４０で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１がＮ末端に露出したキメラタンパク質４０１を得ることができる（図６Ａ参照）。
　プロテアーゼ４０は、工程（Ｄ２）において、外部から添加してもよく、プロテアーゼ４０をコードするコード配列を核酸３０ｄに含ませ、前記工程（Ｂ２）において、キメラタンパク質４０１’とは別個のタンパク質として発現させてもよい。
　本実施形態の製造方法によれば、リンカーの調製等の煩雑な作業を要することなく、ペプチド－核酸複合体を製造することができる。本実施形態の製造方法により得られるペプチド－核酸複合体は、ペプチドアレイにより所望の機能を有するペプチドをスクリーニングするために好適に用いることができ、且つスクリーニングされたペプチドをコードする核酸を簡易に同定することができる。
〔第５実施形態〕
　図５Ａ～図５Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第５実施形態の概略を説明する。
　本実施形態では、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加された核酸として、５’側から３’側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１をコードする第３のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、ペプチドをコードする第１のコード配列と、がこの順で配置された核酸３０ｅに、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加されたもの（以下、「ＴＰＲ付加核酸５００」という場合がある。）を用いる（図５Ａ参照）。
　ＴＰＲ付加核酸５００は、第３のコード配列と第２のコード配列との間、及び第２のコード配列と第１のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第３のコード配列と第２のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＴＰＲ付加核酸５００から発現されたキメラタンパク質５０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
　本実施形態の製造方法は、前記第４実施形態におけるＴＰＲ付加核酸４００に代えて、ＴＰＲ付加核酸５００を用いること以外は、前記第４実施形態と同様に行うことができる。
　無細胞タンパク質合成系を用いて、ＴＰＲ付加核酸５００から合成されたキメラタンパク質５０１は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、トランスペプチダーゼ２０のドメイン、及びペプチド１０のドメインが、この順で配置された構成を有している（図５Ｂ参照）。
　キメラタンパク質５０１中のトランスペプチダーゼ２０によるペプチド転移反応により、ＴＰＲ付加核酸５００及びキメラタンパク質５０１から、ペプチド－核酸複合体５０２及びペプチド転移反応生成物５０３が生成される。
　ペプチド－核酸複合体５０２は、ペプチド１０及びトランスペプチダーゼ２０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ－ＮＳ配列を介して、核酸３０ｅに結合した構造を有している（図５Ｃ参照）。
　本実施形態の製造方法は、前記第４実施形態と同様に、工程（Ｂ２）の後、且つ工程（Ｃ２）の前に、さらに、工程（Ｄ２）を含んでいてもよい。すなわち、核酸３０ｅは、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１をコードする第４のコード配列を含んでいてもよい（図６Ｂ参照）。この場合、ＴＰＲ付加核酸５００’から発現されるキメラタンパク質５０１’は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１が配置される（図６Ｂ参照）。そのため、キメラタンパク質５０１’においては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン（Ｍ）等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ４０で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１がＮ末端に露出したキメラタンパク質５０１を得ることができる（図６Ｂ参照）。
　第２の態様にかかる上記第４～第５の実施形態における核酸３０ｄ，３０ｅは、第３のコード配列が、第１のコード配列及び第２のコード配列の５’側に位置している点で共通する。また、核酸３０ｄ，３０ｅから発現されるキメラタンパク質４０１，５０１は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が、ペプチド１０及びトランスペプチダーゼ２０のＮ末端側に位置している点で共通する。
＜ペプチド－核酸複合体＞
　一実施形態において、本発明は、（ａ）ペプチドと、（ｂ）前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、（ｃ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、前記（ｃ）の配列が、前記（ａ）のペプチドと前記（ｂ）の核酸との間に位置する、前記ペプチド－核酸複合体を提供する。前記ペプチド－核酸複合体は、トランスペプチダーゼを前記（ａ）のペプチドのＮ末端側若しくはＣ末端側に又は前記（ｃ）の配列と前記（ａ）のペプチドの間に含むことができる。
　さらに詳細に説明する。
［（ａ）ペプチド］
　ペプチドは、特に限定されず、任意のペプチドであってよい。ペプチドは、（ｂ）の核酸によってコードされるペプチドである。ペプチドとしては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」の第１の態様の第１実施形態において例示したものと同様のものが例示される。（ａ）のペプチドは、キメラタンパク質に含まれるペプチドのドメインであってもよい。当該キメラタンパク質は、前記ペプチド以外のドメインを含み得る。前記キメラタンパク質は、例えば、トランスペプチダーゼのドメインを含んでいてもよい。前記キメラタンパク質としては、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチドのドメイン、及びトランスペプチダーゼのドメインが、この順で、配置された構成を有するキメラタンパク質；並びにＮ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼのドメイン、及びペプチドのドメインが、この順で、配置された構成を有するキメラタンパク質等が挙げられる。前記トランスペプチダーゼとしては、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼＡ又はブテラーゼ１がより好ましく、ソルターゼＡがさらに好ましい。
［（ｂ）核酸］
　核酸は、前記（ａ）のペプチドをコードする核酸である。核酸は、前記（ａ）のペプチドをコードするものであればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。また、上記「ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示したようなＤＮＡライブラリー等の複数種類のＤＮＡの混合物由来のものであってもよい。
　核酸は、前記ペプチドコード配列に加えて他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、例えば、トランスペプチダーゼをコードする配列、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列、及びトランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列が挙げられる。核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、任意のペプチドをコードする第１のコード配列、トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（１）；５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（２）；並びに５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（３）が挙げられる。
　また、核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列、任意のペプチドをコードする第１のコード配列、及びトランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（４）；並びに５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（５）が挙げられる。これらの場合、核酸は、トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列をさらに含んでいてもよい。
　核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼをコードする場合、前記に例示した核酸（１）～（５）のいずれであってもよいが、核酸（１）であることが好ましい。核酸がトランスペプチダーゼとしてブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸の中でも、核酸（２）～（５）であることが好ましい。
　核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
　核酸の具体例としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示した核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ，３０ｅが挙げられる（図１～５参照）。
［（ｃ）ＴＰＲ－ＮＳ配列］
　（ｃ）の配列は、トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列（ＴＰＲ－ＮＳ配列）であり、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」において説明したものと同様である。トランスペプチダーゼとしては、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼＡ又はブテラーゼ１がより好ましく、ソルターゼＡがさらに好ましい。ＴＰＲ－ＮＳ配列は、トランスペプチダーゼの種類により適宜選択することができる。例えば、トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、ＴＰＲ－ＮＳ配列の好ましい具体例としては、ＬＰＸＴ（Ｇ）ｎ（ｎは１以上の整数である。）が挙げられる。前記ｎとしては、１～１０が好ましく、１～８がより好ましく、１～６又は１～５がさらに好ましい。あるいは、上記ソルターゼ認識モチーフとして挙げた配列と同様のものが挙げられる。
　トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、ＴＰＲ－ＮＳ配列としては、ＸＤＸＥＸＦ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン又はシステインである。）で表される配列が挙げられる。
　本実施形態のペプチド－核酸複合体は、（ａ）のペプチドと、（ｂ）の核酸との間に、（ｃ）の配列が位置していることを特徴とする。本実施形態のペプチド－核酸複合体は、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で説明した方法により製造することができる。本実施形態のペプチド－核酸複合体の具体例としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示したペプチド－核酸複合体１０２，２０２，３０２，４０２，５０２が挙げられる（図１～５参照）。
　本実施形態のペプチド－核酸複合体は、ペプチドと当該ペプチドをコードする核酸とが複合体を形成しているため、所望の機能を有するペプチドを同定した後、当該ペプチドをコードする核酸を容易に取得することができる。
＜ペプチド－核酸複合体が固定化された固相担体＞
　一実施形態において、本発明は、前記実施形態のペプチド－核酸複合体が固定化された固相担体を提供する。
　固相担体としては、特に限定されないが、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。中でも、固相担体としては、ビーズが好ましく、磁気ビーズがより好ましい。固相担体がビーズである場合、１個のビーズには、１種類のペプチド－核酸複合体が固定化されていることが好ましい。
　ペプチド－核酸複合体を固相担体に固定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。ペプチド－核酸複合体は、核酸の５’末端又は３’末端が、固相担体に固定化されていることが好ましい。固定化方法としては、例えば、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。中でも、アビジン－ビオチン結合を利用する方法が好適に用いられる。
（使用例）
　本実施形態の固相担体は、後述のように反応槽に配置して用いてもよく、それ自体をペプチドアレイとして用いてもよい。以下に、本実施形態のペプチド－核酸複合体を用いて、所望のペプチドをコードする核酸を同定する具体例を記載するが、これに限定されない。
・特定物質に対して結合性親和性の高いペプチドのスクリーニング例
　ペプチド－核酸複合体に、標識物質を結合させた特定物質を接触させる。例えば、ペプチド－核酸複合体を含む溶液に、標識物質を結合させた特定物質を添加して撹拌する。標識物質としては、公知の物質を特に制限なく用いることができ、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ等の酵素；ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物；３２Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ等の放射性同位体などを用いることができる。
　次いで、ペプチドと特定物質との結合を標識物質に基づいて検出し、結合親和性の高いペプチドを含むペプチド－核酸複合体を回収する。固相担体がビーズである場合、標識物質の検出及びペプチド－核酸複合体の回収には、フローサイトメトリーを好適に利用することができる。
・特定の酵素活性を有するペプチドのスクリーニング例
　固相担体としてのビーズに固定化したペプチド－核酸複合体と、酵素基質と、を含有するエマルションを調製する。エマルションは、例えば、内水相の水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンとすることができる。１個のエマルション粒子に、平均１個以下のビーズが内包されるように、エマルション粒子の大きさを調整する。次いで、エマルション内で酵素反応を行い、酵素反応を認めるエマルションを特定し、当該エマルションに内包されるペプチド－核酸複合体を回収する。酵素反応により蛍光が生ずる反応系とすれば、酵素反応の検出及びペプチド－核酸複合体の回収には、フローサイトメトリーを好適に利用することができる。
＜ペプチドアレイ＞
　一実施形態において、本発明は、前記実施形態の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイを提供する。
　本実施形態において、固相担体は、例えば、ビーズであってもよく、ペプチド－核酸複合体が固定化されたビーズが反応槽に配置されてもよい。あるいは、固相担体は、反応槽の壁面であってもよい。反応槽１個当たりには、１種類のペプチド－核酸複合体が配置されるようにすることが好ましい。例えば、固相担体がビーズである場合、１種類のペプチド－核酸複合体を固定化した１個のビーズを、１個の反応槽に配置することが好ましい。
　ビーズを配置する反応槽は、例えば、ビーズ配置用反応槽を設けたマイクロウェルプレート等のビーズ配置用基板であってもよい。ビーズが磁気ビーズである場合、ビーズ配置用基板は、磁気ビーズ配置用基板であることが好ましく、前記磁気ビーズ配置用基板に用いられる基板材料下に、磁性体板が配設されていることがより好ましい。かかる構造の磁気ビーズ配置用基板を用いることにより、反応槽内に磁気ビーズを容易にかつ高い精度で配置することができる。具体的には、該ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、該基板上にＤＮＡを固定した磁気ビーズを分散させた分散液を滴下する。磁気ビーズ及び磁性体薄膜による磁力の作用により、反応槽内へ磁気ビーズが誘引されることにより配置されやすくなる。さらに磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで磁気ビーズが分散し、反応槽内への充填率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００～１００００ガウスである。
　また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズは安定した配置を保持し続けることが可能となる。
　かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができる。
　反応槽１個当たり、ビーズ１個を配置する観点から、反応槽の直径はビーズの直径とほぼ同じであることが好ましい。しかしながら、ビーズの微小反応槽への充填率は該微小反応槽の直径に依存するため、反応槽の直径がビーズの直径よりも若干広い方が充填率が高い。さらに、反応槽の直径はビーズの直径の１～２倍であることが好ましい。また、反応槽１個当たり、ビーズ１個を配置する観点から、反応槽の深さは、ビーズの直径の１～２倍であることが好ましい。反応槽は、親水化されていることが好ましい。例えば、該反応槽を酸素プラズマ照射などにより親水化処理することにより、ビーズを分散させた液を反応槽内部に充填することが容易になり、充填率が向上する。
　本実施形態のペプチドアレイは、所望の機能を有するペプチドを同定し、当該ペプチドをコードする核酸を単離するために好適に用いることができる。所望の機能を有するペプチドの同定は、反応槽中で、所望の反応を行い、所望の反応結果を示す反応槽を特定することにより行うことができる。反応槽を特定した後は、当該反応槽から、ペプチド－核酸複合体を回収することにより、所望の機能を有するペプチドをコードする核酸を取得することができる。
＜核酸＞
≪第１の態様≫
　一実施形態において、本発明は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を提供する。
　本実施形態の核酸は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
　本実施形態の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
　本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼ認識モチーフが、ペプチドドメインのＣ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る。すなわち、第１のコード配列と、第３のコード配列は、同じＯＲＦ内に配置されており、第３のコード配列は、第１のコード配列の３’側に配置されている。
　第２のコード配列は、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていてもよく、配置されていなくてもよいが、同一のＯＲＦ内に配置されていることが好ましい。すなわち、本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得ることが好ましい。
　第２のコード配列が、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていない場合、各ＯＲＦは、それぞれ転写・翻訳を制御する制御配列を有していることが好ましい。
　本実施形態の核酸としては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、
　５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（１）；
　５’側から３’側に向かって、第２のコード配列、第１のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（２）；並びに
　５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第２のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（３）、
　が挙げられる。
　核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼをコードする場合、前記に例示した核酸（１）～（３）のいずれであってもよいが、核酸（１）であることが好ましい。核酸がトランスペプチダーゼとしてブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸の中でも、核酸（２）又は核酸（３）であることが好ましい。
　本実施形態の核酸の好適な具体例としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示した、ＮＳ付加核酸１００、ＮＳ付加核酸２００、及びＮＳ付加核酸３００が挙げられる。
≪第２の態様≫
　一実施形態において、本発明は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を提供する。
　本実施形態の核酸は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
　本実施形態の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
　本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが、ペプチドドメインのＮ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る。すなわち、第１のコード配列と、第３のコード配列は、同じＯＲＦ内に配置されており、第３のコード配列は、第１のコード配列の５’側に配置されている。
　第２のコード配列は、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていてもよく、配置されていなくてもよいが、同一のＯＲＦ内に配置されていることが好ましい。すなわち、本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得ることが好ましい。当該キメラタンパク質において、トランスペプチダーゼのドメインは、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＣ末端側に位置していることが好ましい。
　第２のコード配列が、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていない場合、各ＯＲＦは、それぞれ転写・翻訳を制御する制御配列を有していることが好ましい。
　本実施形態の核酸としては、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
　５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（４）；並びに
　５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第２のコード配列、及び第１のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（５）、
　が挙げられる。
　核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼ又はブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸（４）及び核酸（５）のいずれであってもよい。
　本実施形態の核酸は、さらに、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含んでいてもよい。この場合、前記のキメラタンパク質において、第４のコード配列から翻訳されるプロテアーゼ認識モチーフは、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端側に隣接する。プロテアーゼ認識モチーフは、当該プロテアーゼ認識モチーフとトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有するプロテアーゼの認識モチーフを用いることができる。
　本実施形態の核酸の好適な具体例としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示した、ＴＰＲ付加核酸４００、ＴＰＲ付加核酸４００’、ＴＰＲ付加核酸５００、及びＴＰＲ付加核酸５００’が挙げられる。
　上記実施形態のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸、又はトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸は、固相担体に固定化されたものであってもよい。したがって、一実施形態において、本発明は、上記実施形態の核酸が固定化された固相担体もまた提供する。
　本実施形態の核酸は、又は前記核酸が固定化された固相担体は、ペプチド－核酸複合体の製造に、好適に用いることができる。
＜キット＞
≪第１の態様≫
　一実施形態において、本発明は、下記（ａ）～（ｄ）を含む、ペプチド－核酸複合体の作製キットを提供する。
　（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
　（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む前記核酸の領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
　（ｃ）核酸増幅試薬
　（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
（（ａ）核酸）
　（ａ）の核酸は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸である。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
　第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトは、特に限定されず、任意の制限酵素サイトであってよい。前記クローニングサイトは、当該クローニングサイトに第１のコード配列を含む核酸断片が挿入された場合に、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼ認識モチーフが、ペプチドドメインのＣ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る位置に配置される。すなわち、クローニングサイトは、第３のコード配列と同じＯＲＦ内であって、第３のコード配列の５’側に配置される。
　（ａ）の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
　（ａ）の核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸；５’側から３’側に向かって、第２のコード配列、第１のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸；並びに５’側から３’側に向かって、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第２のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸、が挙げられる。
　（ａ）の核酸の好ましい具体例としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示した、核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃ、並びに核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃのいずれかにおいて、第１のコード配列をクローニングサイトで置き換えたもの等が挙げられる。
　（ａ）の核酸は、プラスミドであってもよい。例えば、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（Ｙｅｐ１３、Ｙｅｐ２４、ＹＣｐ５０等）等を好適に使用できる。
（（ｂ）プライマーセット）
　（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）の核酸における、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第２のコード配列、及び第３のコード配列を含む領域（以下、「コード配列領域」という場合がある。）を増幅可能なプライマーセットである。当該プライマーのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方には、トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている。
　（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）の核酸におけるコード配列領域と合わせて、これらのコード配列の転写及び／又は翻訳を制御する制御配列を含む領域を増幅できることが好ましい。当該領域を増幅可能なプライマーセットは、公知の方法に基づいて、設計することができる。プライマーへのトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフの付加は、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げた方法と同様の方法で行うことができる。
　本実施形態のキットにおいて、（ｂ）のプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方が、固相担体に固定化されていてもよい。この場合、（ｂ）のプライマーセットは、下記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかであり得る。
　（ｉ）５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端が固相担体に固定化されたリバースプライマーとのセット
　（ｉｉ）５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたリバースプライマーとのセット
　（ｉｉｉ）５’末端が固相担体に固定化されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
　（ｉｖ）５’末端が固相担体に結合性を有する物質が付加されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
　前記（ｉ）及び（ｉｉｉ）において、プライマーを固相担体に固定化する方法としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げた方法と同様の方法を挙げるができる。前記（ｉｉ）及び（ｉｖ）において、固相担体に結合性を有する物質は、特に限定されず、固相担体の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、アビジン－ビオチン結合を利用する場合、固相担体をストレプトアビジン修飾し、プライマーにビオチンを結合してもよい。また、プライマーをアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理してもよい。
（（ｃ）核酸増幅試薬）
　（ｃ）の核酸増幅試薬は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応に用いられる試薬であり、好ましくはＰＣＲに用いられる試薬である。具体的には、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼや、プルーフリーディング（校正）機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。これらの試薬は市販されており、容易に入手可能である。
（（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液）
　（ｄ）の無細胞タンパク質合成反応液は、無細胞タンパク質合成系に用いられる反応液である。具体例としては、タンパク質合成に必要な成分を含む細胞抽出液等が挙げられる。タンパク質合成に必要な成分としては、例えば、リボソーム；開始因子などの各種因子；ｔＲＮＡ；ＲＮＡポリメラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などの各種酵素等が挙げられる。例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液の系（原核細胞の系）、コムギ胚芽抽出液の系（真核細胞の系）、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系（真核細胞の系）等が好適に挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系に必要な試薬は、キットとしても市販されており、容易に入手可能である。
≪第２の態様≫
　一実施形態において、本発明は、下記（ａ）～（ｄ）を含む、ペプチド－核酸複合体の作製キットを提供する。
　（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
　（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
　（ｃ）核酸増幅試薬
　（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
（（ａ）核酸）
　（ａ）の核酸は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸である。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
　第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトは、特に限定されず、任意の制限酵素サイトであってよい。前記クローニングサイトは、当該クローニングサイトに第１のコード配列を含む核酸断片が挿入された場合に、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが、ペプチドドメインのＮ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る位置に配置される。すなわち、クローニングサイトは、第３のコード配列と同じＯＲＦ内であって、第３のコード配列の３’側に配置される。
　（ａ）の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
　（ａ）の核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸；５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第２のコード配列、及び第１のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸、が挙げられる。
　（ａ）の核酸の好ましい具体例としては、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で例示した、核酸３０ｄ，３０ｅ、並びに核酸３０ｄ，３０ｅのいずれかにおいて、第１のコード配列をクローニングサイトで置き換えたもの等が挙げられる。
　（ａ）の核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含んでいてもよい。プロテアーゼ認識モチーフは、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
　本実施形態の核酸は、第１の態様における（ａ）の核酸と同様に、プラスミドであってもよい。プラスミドとしては、第１の態様において挙げたものと同様のものが挙げられる。
（（ｂ）プライマーセット）
　（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）の核酸における、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第２のコード配列、及び第３のコード配列を含む領域（コード配列領域）を増幅可能なプライマーセットである。当該プライマーのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方には、トランスペプチダーゼの認識モチーフが付加されている。
　（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）におけるコード配列領域と合わせて、これらのコード配列の転写・翻訳を制御する制御配列を含む領域を増幅できることが好ましい。当該領域を増幅可能なプライマーセットは、公知の方法に基づいて、設計することができる。プライマーへのトランスペプチダーゼ認識モチーフの付加は、上記「＜ペプチド－核酸複合体の製造方法＞」で挙げた方法と同様の方法で行うことができる。
　本実施形態のキットにおいて、（ｂ）のプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方が、固相担体に固定化されていてもよい。この場合、（ｂ）のプライマーセットは、下記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかであり得る。
　（ｉ）５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端が固相担体に固定化されたリバースプライマーとのセット
　（ｉｉ）５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたリバースプライマーとのセット
　（ｉｉｉ）５’末端が固相担体に固定化されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット、
　（ｉｖ）５’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
　前記（ｉ）～（ｉｖ）において、プライマーを固相担体に固定化する方法、及び固相担体に結合性を有する物質としては、前記第１の態様において挙げたものと同様のものが挙げられる。
（（ｃ）核酸増幅試薬、（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液）
　（ｃ）の核酸増幅試薬、及び（ｄ）の無細胞タンパク質合成反応液は、前記第１の態様におけるものと同様である。
　本実施形態のキットは、ペプチド－核酸複合体の製造に、好適に用いることができる。
　本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明の実施態様は、これら実施例の記載に限定されるものではない。
１．ポリリン酸キナーゼを含む核酸－ペプチド複合体
［合成例１］ペンタグリシンが付加されたＤＮＡプライマーの合成
　下記組成の反応液を調製し、室温で１０分間反応後、Ｍｉｃｒｏ　Ｂｉｏ－ＳｐｉｎＴＭ　６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲルろ過精製した。精製物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ペンタグリシンが付加されたＤＮＡ（ペンタグリシン標識ＤＮＡ）のバンドを確認した（図７）。
＜反応液の組成＞
　２μＭ　アジド修飾ＤＮＡ
　２００μＭ　アルキン修飾ペンタグリシン
　１００μＭ　アスコルビン酸ナトリウム
　２０μＭ　硫酸銅（ＩＩ）
　５０％　Ｔｅｒｔ－ブチルアルコール
　アジド修飾ＤＮＡ：５’－［アジド］－CGCCAATCCGGATATAGTTC－３’（配列番号２９）
　アルキン修飾ペンタグリシン：(N)-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(propargyl)-(C)（配列番号４３）
［合成例２］ペンタグリシン付加されたＤＮＡの合成
　下記組成のＰＣＲ反応液１及び２を調製し、３０サイクル（９８℃，１０秒；５５℃，５秒／７２℃，２分）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）　ＰＣＲ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応液１を用いたＰＣＲにより、ペンタグリシンが付加されたＤＮＡ（以下、「ぺンタグリシン付加ＤＮＡ」という）が得られた。ＰＣＲ反応液２を用いたＰＣＲにより、ペンタグリシンが付加されていないＤＮＡ（以下、「ペンタグリシン非付加ＤＮＡという）が得られた。
　下記ＰＣＲ反応液で用いた鋳型ＤＮＡ（配列番号４４）の構成を図８に示す。図８に示すように、鋳型ＤＮＡは、ポリリン酸キナーゼ遺伝子とソルターゼＡ遺伝子とソルターゼＡ認識モチーフ（ＬＰＥＴＧ（配列番号１４））コード配列とを含むＯＲＦを有している。鋳型ＤＮＡにおいて、ソルターゼＡ認識モチーフ（ＬＰＥＴＧ（配列番号１４））コード配列は、ポリリン酸キナーゼ遺伝子の３’側に位置している。鋳型ＤＮＡに含まれるソルターゼ遺伝子Ａの塩基配列を配列番号３０に示す。
＜ＰＣＲ反応液１の組成＞
　２０ｐｇ／μＬ　鋳型ＤＮＡ
　０．３μＭ　ペンタグリシン付加ＤＮＡプライマー
　０．３μＭ　ビオチン標識ＤＮＡプライマー
　０．２μＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ
　０．０２５Ｕ／μＬ　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＨＳ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）
　１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）
＜ＰＣＲ反応液２の組成＞
　２０ｐｇ／μＬ　鋳型ＤＮＡ
　０．３μＭ　ペンタグリシン非付加ＤＮＡプライマー
　０．３μＭ　ビオチン標識ＤＮＡプライマー
　０．２μＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ
　０．０２５Ｕ／μＬ　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ＨＳ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）
　１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）　ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）
［実験例１］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
　ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（ＭＳ３００／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＪＳＲ）１５μＬの上清を除去し、３０μＬの結合バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１Ｍ　ＮａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）で洗浄した。１ｐｍｏｌのペンタグリシン付加ＤＮＡ又はペンタグリシン非付加ＤＮＡを溶解した３０μＬの結合バッファーに、磁気ビーズを懸濁し、室温で３０分間撹拌した。次いで、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで３回洗浄した後、磁気ビーズを３０μＬの結合バッファーに懸濁した。
［実験例２］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
　ペンタグリシン付加ＤＮＡ又はペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズ　１０μＬの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）　１．０，ジーンフロンティア）１０μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで３回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で３回洗浄した後、１０μＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁した。
［実験例３］ポリリン酸キナーゼ活性測定
　無細胞タンパク質翻訳の処理を行った磁気ビーズ　１０μＬ、酵素反応溶液（１ｍＭ　ヘキサメタリン酸，０．１ｍＭ　ＡＤＰ，５ｍＭ　ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５）２５μＬ、及びＡＴＰ蛍光検出試薬（ＡＴＰ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）２５μＬを混合し、ポリリン酸キナーゼの触媒反応の結果生じるＡＴＰに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて経時的に測定した。
　結果を図９に示す。ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ポリリン酸キナーゼ活性が確認された。この結果は、ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ペンタグリシン付加ＤＮＡから無細胞翻訳されたポリリン酸キナーゼが、ビーズに固定化されていること示している。一方、ペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ビーズへの非特異的吸着によるものと思われる僅かなポリリン酸キナーゼ活性しか確認されなかった。
　以上の結果より、ソルターゼＡＮ末端基質モチーフが付加されたＤＮＡ（任意遺伝子、ソルターゼＡ遺伝子、及びソルターゼＡ認識モチーフを含む）を無細胞タンパク質翻訳することにより、任意遺伝子ＤＮＡに当該任意遺伝子から翻訳されたタンパク質を連結できることが実証された。
２．ＣＰ０５又はプロテインキナーゼインヒビター（ＰＫＩ）を含む核酸－ペプチド複合体
［合成例３］ペンタグリシン付加されたＤＮＡの合成（ＣＰ０５遺伝子）
　鋳型ＤＮＡとして、ＣＰ０５ペプチド遺伝子（配列番号４５、４６）の５’末端にＦａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ（配列番号２８）コード配列を連結したＤＮＡ（Ｘａモチーフ－ＣＰ０５）を含むものを用いた。当該鋳型ＤＮＡ（配列番号４７）は、図８に示す鋳型ＤＮＡにおいて、ポリリン酸キナーゼ遺伝子に代えて、Ｘａモチーフ－ＣＰ０５を有する。ＣＰ０５ペプチドの
　前記鋳型ＤＮＡを用いたこと以外は、前記合成例１及び合成例２と同様に、ペンタグリシン付加されたＤＮＡを合成した。
［合成例４］ペンタグリシン付加されたＤＮＡの合成（ＰＫＩ遺伝子）
　鋳型ＤＮＡとして、ＰＫＩ遺伝子（配列番号４８、４９）の５’末端にＦａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ（配列番号２８）コード配列を連結したＤＮＡ（Ｘａモチーフ－ＰＫＩ）を含むものを用いた。当該鋳型ＤＮＡ（配列番号５０）は、図８に示す鋳型ＤＮＡにおいて、ポリリン酸キナーゼ遺伝子に代えて、Ｘａモチーフ－ＰＫＩを有する。
　前記鋳型ＤＮＡを用いたこと以外は、前記合成例１及び合成例２と同様に、ペンタグリシン付加されたＤＮＡを合成した。
［実験例４］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
　前記合成例３又は合成例４で合成したペンタグリシン付加されたＤＮＡを用いたこと以外は、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズ、及びペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。
［実験例５］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
　ペンタグリシン付加ＤＮＡ又はペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズ　１５μＬの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）　１．０，ジーンフロンティア）１５μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ－Ｔに懸濁した。
［実験例６］抗体染色
　磁気ビーズ懸濁液２５μＬの分散媒を除去し、磁気ビーズを下記（ａ）～（ｃ）のいずれかの溶液に懸濁した。
　（ａ）ＰＢＳ－Ｔで希釈したＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体溶液（ａｂｃａｍ＃ａｂ１１７５９９）　１５μＬ。
　（ｂ）ＰＢＳ－Ｔで希釈したＦＩＴＣ標識抗ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ抗体溶液（ａｂｃａｍ＃ａｂ９１３５６）　１５μＬ。
　（ｃ）ＰＢＳ－Ｔのみ　１５μＬ。
　磁気ビーズを懸濁後、遮光下、室温で、１時間撹拌した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１５μＬのＰＢＳに懸濁し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｔｉ－Ｅ，浜松ホトニクスＥＭ－ＣＣＤカメラ，Ｂ－２Ａフィルター，キセノンランプ）で観察した。蛍光顕微鏡の撮像画像から、磁気ビーズの蛍光強度をＩｍａｇｅＪで解析した。
　結果を図１０及び図１１に示す。図１０に示すように、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化ビーズでは、ＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体を反応させた場合、蛍光強度が増強した。一方、ペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化ビーズでも、ＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体を反応させた場合に、蛍光強度が若干増強したが、増強の程度は、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化ビーズと比較して小さかった。図１１は、各磁気ビーズの蛍光顕微鏡写真を示す。
　図１０及び図１１の結果より、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化ビーズでは、ビーズに固定されたｃＭｙｃタグコード配列を含むＤＮＡに、ｃＭｙｃタグを含むタンパク質が連結していると推測された。そのため、ＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体を反応させることにより、蛍光強度が大きく増強したと考えられた。
３．ペプチドアレイの作製
　前記実験例２で作製した核酸－ペプチド複合体固定化磁気ビーズを用いて、ペプチドアレイの作製を行った。実験例２で無細胞タンパク質翻訳処理した後の磁気ビーズ５μＬを、酵素反応溶液（３．３ｍＭ　ヘキサメタリン酸，０．３３ｍＭ　ＡＤＰ，１６．７ｍＭ　ＭｇＳＯ４）９μＬ、及びＡＴＰ蛍光検出試薬（ＡＴＰ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）１５μＬと混合した。
　直径４μｍ、深さ４μｍの穴が１ｃｍ角に１００万個形成された石英ガラス製チップに、前記で調製した磁気ビーズ懸濁液を滴下し、各ウェルを磁気ビーズ及びビーズ分散媒で満たした。チップ表面を、シリコーンオイル（信越化学，ＫＦ９６－１００ｃｓ）で被覆して各ウェルを密閉した。その後、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｔｉ－Ｅ，浜松ホトニクスＥＭ－ＣＣＤカメラ，Ｃｙ３フィルター，キセノンランプ）でタイムラプス撮影を行い、各ウェルの蛍光輝度上昇を観察した。各ウェルの蛍光輝度変化の解析は、ＩｍａｇｅＪで行った。
　結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。蛍光輝度の上昇は、核酸－ペプチド複合体固定化磁気ビーズが充填されたウェルでのみ観察された。この結果により、本方法で作製した核酸－ペプチド複合体固定化磁気ビーズを用いて、ペプチドアレイが作製できることが確認された。
４．ＰＫＩを含む核酸－ペプチド複合体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害活性
［実験例７］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
　前記合成例４で合成したペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＰＫＩ遺伝子含有）を用いたこと以外は、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。陰性対照磁気ビーズとして、前記合成例３で合成したペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＣＤ０５遺伝子含有）を用いて、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。
［実験例８］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
　１５μＬのペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＰＫＩ遺伝子含有）固定化磁気ビーズ若しくは１５μＬのペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＣＤ０５遺伝子含有）固定化磁気ビーズの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）　１．０，ジーンフロンティア）１５μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬの１×ＰＫＡバッファー（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）で５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを３μＬの１×ＰＫＡバッファーに懸濁した。
［実験例９］ＰＫＡ阻害活性測定
　無細胞タンパク質翻訳処理した後の磁気ビーズ３μＬ、キナーゼ反応液７μＬ、及び２×ＲＴ検出液（Ｆｌｕｏｒｏｓｐａｒｋ（登録商標），富士フィルム和光）１５μＬを混合した。次いで、プロテインキナーゼＡの触媒反応の結果生じるＡＤＰに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて測定した。
　キナーゼ反応液の組成を以下に示す。
＜キナーゼ反応液＞
０．０６ｍＵ／μＬ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ａ（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ，　＃ｐ５１－１０Ｇ）
５μＭ　ＡＴＰ
１００μＭ　Ｋｅｍｐｔｉｄｅ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｖ５６０１）
３．６×ＰＫＡ　ｂｕｆｆｅｒ
　蛍光シグナルの測定条件を以下に示す。
　３０℃、６０分
　励起光：５４０ＢＰ２０ｎｍ
　蛍光：５９０ＢＰ２０ｎｍ
　結果を図１３に示す。ＰＫＩを含む核酸－ペプチド複合体固定化ビーズでは、蛍光強度が低いまま維持された。ＰＫＩを含む核酸－ペプチド複合体固定化ビーズでは、陽性対照として、ＰＫＡ反応液に、１０μＭのＰＫＩを添加した場合とほぼ同じ蛍光強度に維持された。
　一方、陰性対照磁気ビーズでは、反応時間の経過とともに、蛍光強度が上昇した。陰性対照磁気ビーズの蛍光強度は、ＰＫＩを添加しないＰＫＡ反応液とほぼ同等の上昇を示した。
　これらの結果から、ＰＫＩを含む核酸－ペプチド複合体固定化ビーズでは、ＰＫＩ核酸－ＰＫＩペプチドの複合体が形成されていることが確認された。
５．ＣＰ０５を含む核酸－ペプチド複合体のエクソソーム結合活性
［実験例１０］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
　前記合成例３で合成したペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＣＰ０５遺伝子含有）を用いたこと以外は、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズ及びペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。
［実験例１１］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
　１５μＬのペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）　１．０，ジーンフロンティア）１５μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＦａｃｔｏｒ　Ｘａバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ　ＮａＣｌ）で１回洗浄した。次いで、磁気ビーズをＦａｃｔｏｒ　Ｘａバッファーに懸濁した。
［実験例１２］Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ処理
　磁気ビーズ懸濁液３０μＬに、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μＬを添加し、２５℃で１７時間攪拌した。
　実験例１１の無細胞タンパク質翻訳処理により、ペンタグリシン付加ＤＮＡから、ｃＭｙｃタグ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ－ＣＰ０５－ＬＰＥＴＧ－ソルターゼＡのキメラタンパク質が翻訳される。次いで、ソルターゼＡによるペプチド転移反応により、ペンタグリシン付加ＤＮＡに、ｃＭｙｃタグ－Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ－ＣＰ０５－ＬＰＥＴＧが連結されて、ペプチド－核酸複合体が形成される。このペプチド－核酸複合体に、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼを作用させると、Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ認識モチーフで切断される。その結果、ペプチド－核酸複合体からｃＭｙｃタグが切り離される。
［実験例１３］蛍光標識細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）の調製
　ヒト血漿１５０μＬを遠心（１５００×ｇ，１０分，２５℃）し、上清を回収した。回収した上清を心（３０００×ｇ，１０分，２５℃）し、上清を回収した。回収した上清をさらに遠心（３０００×ｇ，１０分，２５℃）し、上清を回収した。次いで、回収した上清をＥｘｏｓｏｍｅ　ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。次いで、精製サンプルを限外濾過カラム（ＭＷＣＯ　１００Ｋ）で１００μＬに濃縮した。これに、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加（終濃度２μＭ）し、遮光下、室温で、１０分間反応させた。反応後、反応液をＥｘｏｓｏｍｅ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。精製したサンプルを蛍光標識ＥＶとして用いた。
［実験例１４］蛍光標識ＥＶサンプルとの反応及び蛍光顕微鏡観察
　実験例１２でＦａｃｔｏｒ　Ｘａプロテアーゼ処理した磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ－Ｔで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１５μＬのＰＢＳ－Ｔに懸濁した。磁気ビーズ懸濁液から７．５μＬの分散媒を除去し、実験例１３で調製した蛍光標識ＥＶサンプル５０μＬに、懸濁した。次いで、遮光下、室温で、１時間攪拌した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１５μＬのＰＢＳに懸濁した。
　上記で調製した磁気ビーズ懸濁液を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　Ｔｉ－Ｅ，浜松ホトニクスＥＭ－ＣＣＤカメラ，Ｂ－２Ａフィルター，キセノンランプ）で観察した。撮像画像から、磁気ビーズの蛍光強度をＩｍａｇｅＪで解析した。
　結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。ＣＰ０５は、ＥＶの表面抗原であるＣＤ６３に対する結合性を有する。そのため、ＣＰ０５を提示するペプチド－核酸複合体が形成されている場合には、ＣＰ０５に蛍光標識ＥＶが結合し、蛍光が観察されるはずである。
　図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズでは、ＤＮＡ非固定化磁気ビーズ及びペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズと比較して、高い蛍光強度を示した。この結果は、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズでは、ＣＰ０５を提示するペプチドー核酸複合体が形成されていることを示す。
６．エマルションＰＣＲによるペプチド－核酸複合体の作製
［実験例１５］プライマー固定化ビーズの調製
　ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（ＭＳ３００／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＪＳＲ）２４０μＬの上清を除去し、１２００μＬの結合バッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１Ｍ　ＮａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）で洗浄した。４８ｐｍｏｌのビオチン標識ＤＮＡプライマーを溶解した、４８０μＬの結合バッファーに、磁気ビーズを懸濁し、室温で１時間撹拌した。次いで、磁気ビーズを１２００μＬの結合バッファーで１回洗浄した。次いで、磁気ビーズを２４０μＬの１×ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）で２回洗浄した。次いで、磁気ビーズを２４０μＬの１×ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）に懸濁した。
［実験例１６］エマルションＰＣＲ
　下記組成のＰＣＲ反応液３とオイル混合液１とを混合し、攪拌してエマルションを形成した。これを５０μＬずつ分注してＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃，５分、（９４℃，３０秒；５５℃，１分；６８℃，６分）で３０サイクルとし、ＰＣＲ反応後は、１０℃で維持した。鋳型ＤＮＡは、前記合成例２と同じものを用いた。
＜ＰＣＲ反応液３の組成＞
　プライマー結合磁気ビーズ　２．４ｅ８粒子
　鋳型ＤＮＡ　１．２ｅ８分子
　ペンタグリシン付加ＤＮＡプライマー　１８０　ｐｍｏｌ
　ＤＮＡプライマー　１８０　ｐｍｏｌ
　２ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ　３０μＬ
　２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４　１８μＬ
　１０×ＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡）　３０μＬ
　１Ｕ／μＬ　ＫＯＤ　ｐｌｕｓ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）　１２μＬ
　Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ，　ｕｐ　ｔｏ　３００μＬ
　合計　３００μＬ
＜オイル混合液１＞
　ＴＥＧＯＳＯＦＴ　ＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）　５４０μＬ
　ミネラルオイル（ナカライテスク）　２０４μＬ
　ＡＢＩＬ　ＷＥ０９（Ｅｖｏｎｉｋ）　７５６μＬ
　合計　１５００μＬ
　ＰＣＲ後、破砕バッファー（８０％　イソプロパノール，０．６Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２），１％　Ｔｗｅｅｎ２０）７．６ｍＬを加えて混合した。磁石を用いて磁気ビーズを集め、上清を除去した。次いで、磁気ビーズを、ＴＫバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ　ＫＣｌ，０．０１％　Ｔｗｅｅｎ２０）４ｍＬで５回洗浄した。磁気ビーズ上のＰＣＲ産物をＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉで染色し、二本鎖ＤＮＡ結合磁気ビーズをＦＡＣＳ（ＢＤ，ＦＡＣＳＡｒｅａ使用）で分取した。
［実験例１７］エマルション無細胞タンパク質翻訳
　下記組成の無細胞タンパク質翻訳液及びオイル混合液２を混合し、攪拌してエマルションを形成した。３７℃で、３時間反応した。陰性対照実験として、ＤＮＡ未固定の磁気ビーズを用いて、同様の処理を行った。
＜無細胞タンパク質翻訳液＞
　エマルションＰＣＲを行った磁気ビーズ５ｅ６粒子をＰＵＲＥｆｒｅｘ１．０反応溶液６３μＬに懸濁したものを無細胞タンパク質翻訳液として用いた。
＜オイル混合液２＞
　ＴＥＧＯＳＯＦＴ　ＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）　１１３μＬ
　ミネラルオイル（ナカライテスク）　４３μＬ
　ＡＢＩＬ　ＷＥ０９（Ｅｖｏｎｉｋ）　１５９μＬ
　合計　３１５μＬ
　無細胞タンパク質翻訳反応後、破砕バッファー７５０μＬを加えて混合した。磁石を用いて磁気ビーズを集め、上清を除去した。磁気ビーズを、破砕バッファー１．９ｍＬで３回洗浄した。次いで、磁気ビーズを、洗浄バッファー２５０μＬで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２５０μＬで１回洗浄した。次いで、磁気ビーズを、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）６μＬに懸濁した。
［実験例１８］ポリリン酸キナーゼ活性測定
　無細胞タンパク質翻訳の処理を行った磁気ビーズ６μＬ、酵素反応溶液（３．３ｍＭヘキサメタリン酸，０．３３ｍＭ　ＡＤＰ，１６．７ｍＭ　ＭｇＳＯ４）９μＬ、及びＡＴＰ蛍光検出試薬（ＡＴＰ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）１５μＬを混合し、ポリリン酸キナーゼの触媒反応の結果生じるＡＴＰに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて経時的に測定した。
　結果を図１５に示す。ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ポリリン酸キナーゼ活性が確認された。この結果は、ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ペンタグリシン付加ＤＮＡから無細胞翻訳されたポリリン酸キナーゼが、ビーズに固定化されていること示している。一方、ペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ビーズへの非特異的吸着によるものと思われる僅かなポリリン酸キナーゼ活性しか確認されなかった。
　以上の結果より、エマルションＰＣＲ及びエマルション無細胞タンパク質翻訳を用いた場合も、上記実験例１及び実験例２と同様に、任意遺伝子ＤＮＡに当該任意遺伝子から翻訳されたタンパク質を連結できることが実証された。
　１０　　ペプチド
　２０　　トランスペプチダーゼ
　２１　　トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ
　２２　　トランスペプチダーゼ認識モチーフ
　２２’　　トランスペプチダーゼ認識モチーフの切断により生じる配列
　２２’　　トランスペプチダーゼ認識モチーフの切断により生じる配列
　３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ，３０ｅ　　核酸
　４０　　プロテアーゼ
　１００，２００，３００　　トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸（ＮＳ付加核酸）
　１０１，２０１，３０１，４０１，４０１’，５０１，５０１’　　キメラタンパク質
　１０２，２０２，３０２，４０２，５０２　　ペプチド－核酸複合体
　１０３，２０３，３０３，４０３，５０３　　ペプチド転移反応生成物
　４００，４００’，５００，５００’　　トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸（ＴＰＲ付加核酸）

Claims (38)

  1. 　ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法であって、
    （Ａ１）トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、
    　前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、
    （Ｂ１）前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、
    （Ｃ１）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、
    　を含む、ペプチド－核酸複合体の製造方法。
  2. 　前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  3. 　前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  4. 　前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  5. 　前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  6. 　ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド－核酸複合体の製造方法であって、
    （Ａ２）トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
    　前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、
    （Ｂ２）前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、
    （Ｃ２）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド－核酸複合体を形成させる工程と、
    　を含む、ペプチド－核酸複合体の製造方法。
  7. 　前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項６に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  8. 　前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、請求項６に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  9. 　前記核酸が、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、
    　前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有しており、
    　前記工程（Ｂ２）の後、且つ前記工程（Ｃ２）の前に、さらに、
    　（Ｄ２）前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程、
    　を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  10. 　前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、請求項６～９のいずれか一項に記載のペプチド－核酸複合体の製造方法。
  11. 　（ａ）ペプチドと、
    　（ｂ）前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、
    　（ｃ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、
    　前記（ｃ）の配列が、前記（ａ）のペプチドと前記（ｂ）の核酸との間に位置する、
    　前記ペプチド－核酸複合体。
  12. 　前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）のペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフ又は前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、請求項１１に記載の核酸－ペプチド複合体。
  13. 　前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
    　前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸－ペプチド複合体。
  14. 　前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
    　前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸－ペプチド複合体。
  15. 　前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
    　前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸－ペプチド複合体。
  16. 　前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、
    　前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸－ペプチド複合体。
  17. 　前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、
    　前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸－ペプチド複合体。
  18. 　前記（ｂ）の核酸が、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列をさらに含み、
    　前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有している、
    　請求項１６又は１７に記載の核酸－ペプチド複合体。
  19. 　請求項１１～１８のいずれか一項に記載のペプチド－核酸複合体が固定化された固相担体。
  20. 　請求項１９に記載の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイ。
  21. 　前記反応槽１個当たり、１種類の前記ペプチド－核酸複合体を含む、請求項２０に記載のペプチドアレイ。
  22. 　トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、
    　ペプチドをコードする第１のコード配列と、
    　前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、
    　前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
  23. 　５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２２に記載の核酸。
  24. 　５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２２に記載の核酸。
  25. 　前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２２に記載の核酸。
  26. 　トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
    　ペプチドをコードする第１のコード配列と、
    　前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、
    　前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
  27. 　５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２６に記載の核酸。
  28. 　５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２６に記載の核酸。
  29. 　前記核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、
    　前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、
    　請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸。
  30. 　請求項２２～２９のいずれか一項に記載の核酸が固定化された固相担体。
  31. 　下記（ａ）～（ｄ）を含む、ペプチド－核酸複合体の作製キット。
    　（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
    　（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
    　（ｃ）核酸増幅試薬
    　（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
  32. 　前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３１に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
  33. 　前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３１に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
  34. 　前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３１に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
  35. 　下記（ａ）～（ｄ）を含む、ペプチド－核酸複合体の作製キット。
    　（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
    　（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
    　（ｃ）核酸増幅試薬
    　（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
  36. 　前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３５に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
  37. 　前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイトが、この順で、配置されている、請求項３５に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
  38. 　前記（ａ）の核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、
    　前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、
    　請求項３５～３７のいずれか一項に記載のペプチド－核酸複合体の作製キット。
PCT/JP2019/043640 2018-11-07 2019-11-07 ペプチド－核酸複合体 WO2020095985A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020555580A JP7416715B2 (ja) 2018-11-07 2019-11-07 ペプチド－核酸複合体
US17/291,964 US20220010032A1 (en) 2018-11-07 2019-11-07 Peptide-nucleic acid complex

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-209874 2018-11-07
JP2018209874 2018-11-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020095985A1 true WO2020095985A1 (ja) 2020-05-14

Family

ID=70612046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/043640 WO2020095985A1 (ja) 2018-11-07 2019-11-07 ペプチド－核酸複合体

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220010032A1 (ja)
JP (1) JP7416715B2 (ja)
WO (1) WO2020095985A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001086A1 (ja) * 2003-06-27 2005-01-06 Genefield, Inc. 固定化mRNA－ピューロマイシン連結体及びその用途
JP2016519118A (ja) * 2013-04-25 2016-06-30 スクリプス コリア アンティボディー インスティテュート 自己切断カセットを含むタンパク質精製方法及びこれの用途
JP2016523978A (ja) * 2013-07-10 2016-08-12 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸−タンパク質複合体に関する組成物及び方法
JP2018015013A (ja) * 2008-07-25 2018-02-01 エックス−ボディ インコーポレイテッド タンパク質スクリーニング法
WO2018168999A1 (ja) * 2017-03-17 2018-09-20 国立研究開発法人理化学研究所 Ｒｎａ分子とペプチドとの複合体の製造方法、及びその利用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001086A1 (ja) * 2003-06-27 2005-01-06 Genefield, Inc. 固定化mRNA－ピューロマイシン連結体及びその用途
JP2018015013A (ja) * 2008-07-25 2018-02-01 エックス−ボディ インコーポレイテッド タンパク質スクリーニング法
JP2016519118A (ja) * 2013-04-25 2016-06-30 スクリプス コリア アンティボディー インスティテュート 自己切断カセットを含むタンパク質精製方法及びこれの用途
JP2016523978A (ja) * 2013-07-10 2016-08-12 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸−タンパク質複合体に関する組成物及び方法
WO2018168999A1 (ja) * 2017-03-17 2018-09-20 国立研究開発法人理化学研究所 Ｒｎａ分子とペプチドとの複合体の製造方法、及びその利用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRITZ, S. ET AL.: "Synthesis of biologically active peptide nucleic acid-peptide conjugates by sortase-mediated ligation", J. ORG. CHEM., vol. 72, 2007, pages 3909 - 3912, XP002459582, ISSN: 0022-3263, DOI: 10.1021/jo062331l *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7416715B2 (ja) 2024-01-17
JPWO2020095985A1 (ja) 2021-10-07
US20220010032A1 (en) 2022-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180284125A1 (en) Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
Kostallas et al. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay
CA2861387A1 (en) High throughput screen for biologically active polypeptides
US20150065382A1 (en) Method for Producing and Identifying Soluble Protein Domains
WO2014189768A1 (en) Devices and methods for display of encoded peptides, polypeptides, and proteins on dna
WO2013136095A1 (en) Peptide arrays
Cengic et al. Surface display of small affinity proteins on Synechocystis sp. strain PCC 6803 mediated by fusion to the major type IV pilin PilA1
US10900059B2 (en) Methods for generating engineered enzymes
JP7416715B2 (ja) ペプチド－核酸複合体
AU2002341204A1 (en) Method for producing and identifying soluble protein domains
JP6041154B2 (ja) 並列反応方法およびスクリーニング方法
JP5049136B2 (ja) Ｎ末端アミノ酸が標識されたタンパク質の効率的な合成方法
JP2017160272A (ja) アゾリン化合物及びアゾール化合物のライブラリー、並びにその製造方法
Malone et al. Chemoselective coupling preserves the substrate integrity of surface-immobilized oligonucleotides for emulsion pcr-based gene library construction
WO2017047704A1 (ja) 結晶構造を有する物質に結合するプロテインタグ、および、その利用
US20240093270A1 (en) Generation and selection of affinity reagents
US20230287490A1 (en) Systems and methods for assaying a plurality of polypeptides
JP2009178067A (ja) 分子ディスプレイ法及びその用途
CN110191950B (zh) 用于识别候选核酸试剂的组合物、方法和系统
WO2023096584A2 (en) Novel crispr/cas13 systems and uses thereof
Lin The Mechanism of Ribosomal Translocation Revealed by Single-molecule FRET and Super-resolution Force Spectroscopy (SURFS)
Di Girolamo First characterization of a class F sortase and establishment of a microreactor-based assay for its directed evolution
WO2015183986A1 (en) Methods for selecting evolved transpeptidases and use thereof for creating protein conjugates
JP2006132980A (ja) タンパク質の固定化方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19882462

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020555580

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19882462

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1