JPS60188057A - 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法 - Google Patents
高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法Info
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- JPS60188057A JPS60188057A JP59044061A JP4406184A JPS60188057A JP S60188057 A JPS60188057 A JP S60188057A JP 59044061 A JP59044061 A JP 59044061A JP 4406184 A JP4406184 A JP 4406184A JP S60188057 A JPS60188057 A JP S60188057A
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- aspergillus
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/04—Fungi
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Soy Sauces And Products Related Thereto (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナ
ーゼ生産能を有する新規な麹菌及びその育種法に関する
。
ーゼ生産能を有する新規な麹菌及びその育種法に関する
。
醤油は、アミノ酸の旨味を主体とする調味料であるため
に、醤油の醸造において、窒素の利用率を向上してアミ
ノ酸の生成量を多くすること、及びグルタミン酸の生成
量を向上することは重要なことであり、これらのことは
醤油の醸造において考慮されている。したがって、醤油
の醸造では、強力なプロテアーゼ及びグルタミナーゼを
生産しうるＳ菌を育種することは極めて重要なことであ
る。
に、醤油の醸造において、窒素の利用率を向上してアミ
ノ酸の生成量を多くすること、及びグルタミン酸の生成
量を向上することは重要なことであり、これらのことは
醤油の醸造において考慮されている。したがって、醤油
の醸造では、強力なプロテアーゼ及びグルタミナーゼを
生産しうるＳ菌を育種することは極めて重要なことであ
る。
これまでに醤油の醸造に使用されていた麹菌には、５０
０〜６５０ Ｕ／９のｓｌいプロテアーゼ生産能を有す
る菌株のグルタミナーゼ生産能は００２５〜ｌ・５ Ｕ
／９のように低いか、または３゜０〜ｓ 、 ｏ 騎の
高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株のプロテアーゼ
生産能は１００〜４００ Ｕ／９のように低いという傾
向があった。
０〜６５０ Ｕ／９のｓｌいプロテアーゼ生産能を有す
る菌株のグルタミナーゼ生産能は００２５〜ｌ・５ Ｕ
／９のように低いか、または３゜０〜ｓ 、 ｏ 騎の
高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株のプロテアーゼ
生産能は１００〜４００ Ｕ／９のように低いという傾
向があった。
このために、これまでの醤油の醸造では、プロテアーゼ
生産能の高い菌株を使用すると、醤油原料の可溶性窒素
の溶解利用率は向上するが、グルタミナーゼ生産能が低
いために諸法液汁におけるグルタミン酸の生成が少なく
、旨味の豊富な醤油が得難い傾向があり、またグルタミ
ナーゼ生産能θ高い菌株を使用すると、プロテアーゼ生
産能が低いために醤油原料の可溶性窒素の溶解利用率を
向上することができない。
生産能の高い菌株を使用すると、醤油原料の可溶性窒素
の溶解利用率は向上するが、グルタミナーゼ生産能が低
いために諸法液汁におけるグルタミン酸の生成が少なく
、旨味の豊富な醤油が得難い傾向があり、またグルタミ
ナーゼ生産能θ高い菌株を使用すると、プロテアーゼ生
産能が低いために醤油原料の可溶性窒素の溶解利用率を
向上することができない。
これまでに、プロテアーゼ生産能及びグルタミナーゼ生
産能の高い優秀な麹菌を得るために、麹菌の菌株を人工
変異処理することが試みられたが（特開昭５７−１７４
０８７号公報）、麹菌の人工変異処理によって麹菌のプ
ロテアーゼ生産能またはグルタミナーゼ生産能のどちら
か一方だけを向上した菌株を得ることはできるが、双方
の生産能を共に向」ニした菌株を得ることは非常に困難
であった。
産能の高い優秀な麹菌を得るために、麹菌の菌株を人工
変異処理することが試みられたが（特開昭５７−１７４
０８７号公報）、麹菌の人工変異処理によって麹菌のプ
ロテアーゼ生産能またはグルタミナーゼ生産能のどちら
か一方だけを向上した菌株を得ることはできるが、双方
の生産能を共に向」ニした菌株を得ることは非常に困難
であった。
本発明者らは、麹菌のプロテアーゼ生産能及びグルタミ
ナーゼ生産能の双方の向上した菌株を得ることを企図し
て、多くの検討を行なった結果、アスペルギルス属に属
する菌株であって、プロテアーゼ生産能の高い菌株と、
グルタミナーゼ生産能の高い菌株をプロトプラスト融合
し、得られた融合細胞を冒張再生Ｉ８地において培養す
ると、プロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双
方の扁い融合２倍体株が得られること、ここで得られた
融合２倍体株を親株として人工変異処理を行なうと、親
株に比べてプロテアーゼ生産能及びグルタミナーゼ生産
能の双方が高い菌株を育種をしうろこと、およびこの人
工変異処理によって得られた菌株の甲に高いプロテアー
ゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株の
あることを見出し、これらの知見にもとづいて本発明に
到達したのである。
ナーゼ生産能の双方の向上した菌株を得ることを企図し
て、多くの検討を行なった結果、アスペルギルス属に属
する菌株であって、プロテアーゼ生産能の高い菌株と、
グルタミナーゼ生産能の高い菌株をプロトプラスト融合
し、得られた融合細胞を冒張再生Ｉ８地において培養す
ると、プロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双
方の扁い融合２倍体株が得られること、ここで得られた
融合２倍体株を親株として人工変異処理を行なうと、親
株に比べてプロテアーゼ生産能及びグルタミナーゼ生産
能の双方が高い菌株を育種をしうろこと、およびこの人
工変異処理によって得られた菌株の甲に高いプロテアー
ゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株の
あることを見出し、これらの知見にもとづいて本発明に
到達したのである。
本発明の目的は、プロテアーゼ生産能およびグルタミナ
ーゼ生産能の双方のＭ素生産能の商い麹菌を提供するこ
とにある。
ーゼ生産能の双方のＭ素生産能の商い麹菌を提供するこ
とにある。
本発明は、アスペルギルス属に属する菌株であって、高
いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を
有することを特徴とする麹菌であり、また本発明のもう
１つの発明は、アスペルギルス属に属する菌株であって
、プロテアーゼ生産能の高い菌株及びグルタミナーゼ生
産能の高い菌株のそれぞれの培養細胞からプロトプラス
トを得ること、これらをプロトプラスト融合して、融合
細胞を得ること、該融合細胞を皿張再生培地において培
養し、得られた培養物からプロテアーゼ生産能及びグル
タミナーゼ生産能の双方の酵素生産能の高められた融合
２倍体株を得ること、ここに得られた融合２倍体株を人
工変異処理をすることを特徴とするアスペルギルス属に
属する菌株であって、高いプロテアーゼ生産能及び高い
グルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法である。
いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を
有することを特徴とする麹菌であり、また本発明のもう
１つの発明は、アスペルギルス属に属する菌株であって
、プロテアーゼ生産能の高い菌株及びグルタミナーゼ生
産能の高い菌株のそれぞれの培養細胞からプロトプラス
トを得ること、これらをプロトプラスト融合して、融合
細胞を得ること、該融合細胞を皿張再生培地において培
養し、得られた培養物からプロテアーゼ生産能及びグル
タミナーゼ生産能の双方の酵素生産能の高められた融合
２倍体株を得ること、ここに得られた融合２倍体株を人
工変異処理をすることを特徴とするアスペルギルス属に
属する菌株であって、高いプロテアーゼ生産能及び高い
グルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法である。
本発明の、アスペルギルス属に属する菌株であって、高
いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を
有する麹菌は、以下に述べる方法によって育種される１
゜たとえば、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株を親
株とした場合は、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株
が育種され、またアスペルギルス・オリゼーに属する菌
株を親株とした場合は、アスペルギルス−オリゼーに属
する菌株が育種され、さらにアスペルギルス・ニガーに
属する菌株を親株とした場合は、アスペルギルス・ニガ
ーに属する菌株が育種されるのである。
いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を
有する麹菌は、以下に述べる方法によって育種される１
゜たとえば、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株を親
株とした場合は、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株
が育種され、またアスペルギルス・オリゼーに属する菌
株を親株とした場合は、アスペルギルス−オリゼーに属
する菌株が育種され、さらにアスペルギルス・ニガーに
属する菌株を親株とした場合は、アスペルギルス・ニガ
ーに属する菌株が育種されるのである。
また興なる種同志を親株として育種することもできる。
本発明の麹菌を育種するに際して、先ずアスペルギルス
属に属する菌株であって、高いプロテアーゼ生産能を有
する菌株の分生胞子が栄養培地において培養され、これ
とは別に、アスペルギルス属に属する菌株であって、高
いグルタミナーゼ生産能を有する菌株の分生胞子が栄養
培地において培養される。
属に属する菌株であって、高いプロテアーゼ生産能を有
する菌株の分生胞子が栄養培地において培養され、これ
とは別に、アスペルギルス属に属する菌株であって、高
いグルタミナーゼ生産能を有する菌株の分生胞子が栄養
培地において培養される。
アスペルギルス属に属する菌株であって、高いプロテア
ーゼ生産能を育する菌株（親株）としては、アスペルギ
ルス属に属していて、高いプロテアーゼ生産能を裔する
菌株であれば、いかなるものであっても、これをイ史月
Ｊすることができる。したがって、醤油、味噌または清
酒の醸造に使用する麹菌の中から、プロテアーゼ生産能
の高い菌株を検索することによって、上記の親株を容易
に入手することができるが、たとえば、アスペルギルス
・ソーヤＡＴＣＣ４２２４９、アスペルギルス・ソーヤ
ＡＴＣＣ４２２５０、アスペルギルス−ソーヤＡＴＣＣ
４２２５１及びアスペルギルス・オリゼー４６０（ＦＥ
ＲＭ −Ｐ Ｎｏ、 １１４９ ）の各菌株を使用する
ことができるが、これらの変種または変異株を使用する
こともできる。
ーゼ生産能を育する菌株（親株）としては、アスペルギ
ルス属に属していて、高いプロテアーゼ生産能を裔する
菌株であれば、いかなるものであっても、これをイ史月
Ｊすることができる。したがって、醤油、味噌または清
酒の醸造に使用する麹菌の中から、プロテアーゼ生産能
の高い菌株を検索することによって、上記の親株を容易
に入手することができるが、たとえば、アスペルギルス
・ソーヤＡＴＣＣ４２２４９、アスペルギルス・ソーヤ
ＡＴＣＣ４２２５０、アスペルギルス−ソーヤＡＴＣＣ
４２２５１及びアスペルギルス・オリゼー４６０（ＦＥ
ＲＭ −Ｐ Ｎｏ、 １１４９ ）の各菌株を使用する
ことができるが、これらの変種または変異株を使用する
こともできる。
またアスペルギルス腐に属する菌株であって、高いグル
タミナーゼ生産能を有する菌株（親株）としては、アス
ペルギルス属に属していて、高いグルタミナーゼ生産能
を有する菌株であれば、いがなるものであっても、これ
を使用することができる。したがって醤４１１、味噌ま
たは清酒の醸造に使用する麹菌の中からグルタミナーゼ
生産能の高い菌株を検索することによって、上記の親株
を容易に入手することができるが、たとえば、アスペル
ギルス・ソーヤ２６２ （ＦＥＲＭ Ｐ −２１２８）
、アスペルギルス・ソーヤ２１６５ （ＦＩＥＲＭ
Ｐ −７２８０）及びアスペルギルス・オリゼー（ＪＡ
Ｍ ２６３８ ）の各菌株を使用することもできる。
タミナーゼ生産能を有する菌株（親株）としては、アス
ペルギルス属に属していて、高いグルタミナーゼ生産能
を有する菌株であれば、いがなるものであっても、これ
を使用することができる。したがって醤４１１、味噌ま
たは清酒の醸造に使用する麹菌の中からグルタミナーゼ
生産能の高い菌株を検索することによって、上記の親株
を容易に入手することができるが、たとえば、アスペル
ギルス・ソーヤ２６２ （ＦＥＲＭ Ｐ −２１２８）
、アスペルギルス・ソーヤ２１６５ （ＦＩＥＲＭ
Ｐ −７２８０）及びアスペルギルス・オリゼー（ＪＡ
Ｍ ２６３８ ）の各菌株を使用することもできる。
上記の菌株（親株）の分生胞子を培養する栄養培地は、
麹菌が必要とする栄養源を含む培地であれば、いかなる
培地であってもこれを使用することができるが、たとえ
ば、ツアペック（Ｃｚａｐｅｋ ）培地に、０．５％の
酵母エキス及び０．２％のカザミノ酸を加え、ｐＨを６
゜０に調整したものを、水で１０倍に希釈した培地（以
下において「ツアペック変形培地」と略記する）、他の
合成培地、半合成培地あるいは天然培地を使用すること
ができる。
麹菌が必要とする栄養源を含む培地であれば、いかなる
培地であってもこれを使用することができるが、たとえ
ば、ツアペック（Ｃｚａｐｅｋ ）培地に、０．５％の
酵母エキス及び０．２％のカザミノ酸を加え、ｐＨを６
゜０に調整したものを、水で１０倍に希釈した培地（以
下において「ツアペック変形培地」と略記する）、他の
合成培地、半合成培地あるいは天然培地を使用すること
ができる。
合成培地における炭素源としては、グルコース、廿〜り
七ロープ飢 ＠妥緬ン１１τは旙酸アゝノ手二つム、硝
酸アンモニウム等を使用することができ、また天然培地
における炭素源としては、割砕小麦、麦皮等、窒素源と
しては、スキムミルク、脱脂大豆等を使用することがで
きる。さらに上記の培地に、リン酸、カリウム、マグネ
シウム、カルシウム等の無機塩類を加えることができ、
さらになお、菌の生育に必要なアミノ酸、ビタミン等を
必要に応じて培地に添加することもできる。
七ロープ飢 ＠妥緬ン１１τは旙酸アゝノ手二つム、硝
酸アンモニウム等を使用することができ、また天然培地
における炭素源としては、割砕小麦、麦皮等、窒素源と
しては、スキムミルク、脱脂大豆等を使用することがで
きる。さらに上記の培地に、リン酸、カリウム、マグネ
シウム、カルシウム等の無機塩類を加えることができ、
さらになお、菌の生育に必要なアミノ酸、ビタミン等を
必要に応じて培地に添加することもできる。
通常の場合、培養は２５〜３５°Ｃの温度において行な
われ、はとんどの発芽胞子の長さく胞子とそこから伸び
る菌糸の長さを合わせたもの）が、もとの胞子（培養開
始時）の外径の５〜１５倍に生育するのに充分な時間（
通常、５〜１５時間）、静置、振どうまたは通気培養等
の好気的条件において培養する。
われ、はとんどの発芽胞子の長さく胞子とそこから伸び
る菌糸の長さを合わせたもの）が、もとの胞子（培養開
始時）の外径の５〜１５倍に生育するのに充分な時間（
通常、５〜１５時間）、静置、振どうまたは通気培養等
の好気的条件において培養する。
またこの培養は、固体培養によることもできる。
固体培養を行なう場合、表皮、小麦などの炭素源、大豆
などの窒素源、その他の有機質あるいは無機質を原料と
し、これらを蒸煮などの殺菌処理をした後に、ｗｌ、ｍ
を接種混合し、２５〜３８℃で、発芽胞子の長さかもと
の胞子外径の５〜１５倍になるように生育するのに充分
な時間、無菌的に培養するのが好ましい。これらの培養
において、発芽胞子の長さが、もとの胞子外径の５倍未
満であると、この後に行なう［ｊのプロトプラストをほ
とんど形成することができず、また１５倍を超えると、
麹菌のプロトプラストの形成率が非常に低くなるので好
ましくない。
などの窒素源、その他の有機質あるいは無機質を原料と
し、これらを蒸煮などの殺菌処理をした後に、ｗｌ、ｍ
を接種混合し、２５〜３８℃で、発芽胞子の長さかもと
の胞子外径の５〜１５倍になるように生育するのに充分
な時間、無菌的に培養するのが好ましい。これらの培養
において、発芽胞子の長さが、もとの胞子外径の５倍未
満であると、この後に行なう［ｊのプロトプラストをほ
とんど形成することができず、また１５倍を超えると、
麹菌のプロトプラストの形成率が非常に低くなるので好
ましくない。
次に、こうして得られた培養細胞からプロトプラストを
得るには、上記各々の発芽胞子について、１０６〜１０
８個／ｍｌ！（・ａ張液）の濃度の発芽胞子ケン温液を
調製し、各調製ケン濁液を等量混合し、遠心分離して集
菌したのち、これに予じめ無菌処理した細胞壁溶解＃紫
を６加し処理するか、又は各々の発芽胞子ケン濁液を遠
心分離して集菌したのち、これを最初、細胞壁溶解酵素
を添加して処理を行い、次いで各処理液を等量混合する
ことにより得られる。
得るには、上記各々の発芽胞子について、１０６〜１０
８個／ｍｌ！（・ａ張液）の濃度の発芽胞子ケン温液を
調製し、各調製ケン濁液を等量混合し、遠心分離して集
菌したのち、これに予じめ無菌処理した細胞壁溶解＃紫
を６加し処理するか、又は各々の発芽胞子ケン濁液を遠
心分離して集菌したのち、これを最初、細胞壁溶解酵素
を添加して処理を行い、次いで各処理液を等量混合する
ことにより得られる。
ここに用いられる細胞！ｉｌ￥溶解酵素としては、麹菌
の細胞壁を溶解する活性を何するものであればいずれで
もよく、セルラーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びキ
チナーゼ等を単独、または混合して用い、或いは一般に
細胞壁溶解酵素として用いられている混合酵素等を用い
ることができる。本発明者らが実験したところ、これら
の酵素のうちβ−１，３−グルカナーゼとキチナーゼを
併用すると、麹菌のプロトプラストの形成率を著しく悶
めることか判明したので、上記２つの酵素を併用するこ
とが好ましい。
の細胞壁を溶解する活性を何するものであればいずれで
もよく、セルラーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びキ
チナーゼ等を単独、または混合して用い、或いは一般に
細胞壁溶解酵素として用いられている混合酵素等を用い
ることができる。本発明者らが実験したところ、これら
の酵素のうちβ−１，３−グルカナーゼとキチナーゼを
併用すると、麹菌のプロトプラストの形成率を著しく悶
めることか判明したので、上記２つの酵素を併用するこ
とが好ましい。
上記キチナーゼとしては、キチナーゼ活性を有する酵素
剤が用いられ、例えば米国ＩＣＮ社製キチナーゼＮｏ、
１００４６６ 、米国シグマ社製キチナーゼ尚Ｃ−６
１３７、生化学工業社販売キチナーゼ・ファンガル（ｆ
ｕｎｇａｌ ） Ｎｏ、 １００２９０等が挙げられる
。
剤が用いられ、例えば米国ＩＣＮ社製キチナーゼＮｏ、
１００４６６ 、米国シグマ社製キチナーゼ尚Ｃ−６
１３７、生化学工業社販売キチナーゼ・ファンガル（ｆ
ｕｎｇａｌ ） Ｎｏ、 １００２９０等が挙げられる
。
またβ−１，３−グルカナーゼとしてはキリンビール社
製、ザイモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ） ５００
０、同６００００及び本発明者らが微生物バチラス・サ
ーキュランスＩＡＭ １１６５及びストレプトマイセス
０１４３ （ＦＥＲＭ Ｐ −７２７６）のそれぞれの
培養液から調製した２つの粗酵素等が挙げられるが、特
に後者の２つの粗酵素が好ましい。
製、ザイモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ ） ５００
０、同６００００及び本発明者らが微生物バチラス・サ
ーキュランスＩＡＭ １１６５及びストレプトマイセス
０１４３ （ＦＥＲＭ Ｐ −７２７６）のそれぞれの
培養液から調製した２つの粗酵素等が挙げられるが、特
に後者の２つの粗酵素が好ましい。
上Ｊ己バチラス・サーキュランスＪＡＭ １１６５から
調製した粗酵素及びストレプトマイセス０１４３株から
調製し）こ粗酵素は以下のようにして得られたものであ
る。
調製した粗酵素及びストレプトマイセス０１４３株から
調製し）こ粗酵素は以下のようにして得られたものであ
る。
〔１〕バチラス・サーキュランスＩＡＭ １１６５から
の粗酵素調製法 肉エキス１％、ポリペプトン１％、麹菌旧１ＩＳＩｌ菌
体２％及び水からなる培地（ｐＨ７，２） Ｉ ｊｌ！
を５１容三角フラスコに入れ、高圧滅菌したものに、麹
菌湿潤菌体を入れない以外は上記と全く同じ培曲で前培
養（３０°Ｃで４８時間）したバチラス・サーキュラン
スＩＡＭ ＋１６５の種菌液１０’ｍＡを接種し、３０
°Ｃで４８時間、振とぅ培養（＋７Ｏｒ−ｐ−ｍ・）し
た。こうして得た培養液から粗酵素を得るには、これを
遠心分離して上清液を分厚取得し、これに硫安を加えて
常法により塩析し、生成した沈澱区分を採取した。これ
を水２５ｍｊ？に溶解し、セロファンチューブに入れ、
１夜５°Ｃで蒸留水を用いて透析処理し、得られた透析
内液を凍結乾燥し、粗酵素（以下、「バチラス・サーキ
ュランス起源の粗酵素」と称す）を得た。
の粗酵素調製法 肉エキス１％、ポリペプトン１％、麹菌旧１ＩＳＩｌ菌
体２％及び水からなる培地（ｐＨ７，２） Ｉ ｊｌ！
を５１容三角フラスコに入れ、高圧滅菌したものに、麹
菌湿潤菌体を入れない以外は上記と全く同じ培曲で前培
養（３０°Ｃで４８時間）したバチラス・サーキュラン
スＩＡＭ ＋１６５の種菌液１０’ｍＡを接種し、３０
°Ｃで４８時間、振とぅ培養（＋７Ｏｒ−ｐ−ｍ・）し
た。こうして得た培養液から粗酵素を得るには、これを
遠心分離して上清液を分厚取得し、これに硫安を加えて
常法により塩析し、生成した沈澱区分を採取した。これ
を水２５ｍｊ？に溶解し、セロファンチューブに入れ、
１夜５°Ｃで蒸留水を用いて透析処理し、得られた透析
内液を凍結乾燥し、粗酵素（以下、「バチラス・サーキ
ュランス起源の粗酵素」と称す）を得た。
〔２〕ストレプトマイセス０１４３からの粗酵素調製法
培地組成 ｌ
ＫＨ２ＰＯ４０，２％
酵母エキス ０６０５ ％
Ｋｃｌｏ、０５ ％
グルコース ０．２５ ％
ＭｇＳＯ４・７１１２０ ０．１ ％
ネオペプトン 帆１ ％
Ｎａｃｌ ０．０５ ％
ＮａＮＯ３０゜１ ％
麹菌湿潤菌体 ２゜１ ％
蒸留水 １．ＯＪ
ｐＨ５・０
上記組成の培地１（ｐＨ５゜０）に、これと同一組成の
培地にて前培養したストレプトマイセス０１４３ （Ｆ
ＥＲＭ Ｐ −７２７６）の種菌ｉ１０ｍＪを接種し、
３０’Ｃで培養液のｐＨが７．０に上昇する迄（７日間
）、振とう培養（＋７Ｏｒ、、ｐ、、ｍ、 ） シた。
培地にて前培養したストレプトマイセス０１４３ （Ｆ
ＥＲＭ Ｐ −７２７６）の種菌ｉ１０ｍＪを接種し、
３０’Ｃで培養液のｐＨが７．０に上昇する迄（７日間
）、振とう培養（＋７Ｏｒ、、ｐ、、ｍ、 ） シた。
以下、上記バチラス・サーキュランスの培養液から粗酵
素を得る方法と全く同様にして、培養液から粗Ｍ素（以
下、「ストレプトマイセス！ｊ＋３［の粗酵素」と称す
）を得た。
素を得る方法と全く同様にして、培養液から粗Ｍ素（以
下、「ストレプトマイセス！ｊ＋３［の粗酵素」と称す
）を得た。
尚、上Ｊｄで得られる２つの粗酵素は、β−１，３−グ
ルカンを基質として、常法によりβ−１，３−グルカナ
ーゼ活性の葡無を調べた結果、強力に基質を分解するこ
とが確認され、β−１，３−グルカナーゼとして使用で
きることが判明した。
ルカンを基質として、常法によりβ−１，３−グルカナ
ーゼ活性の葡無を調べた結果、強力に基質を分解するこ
とが確認され、β−１，３−グルカナーゼとして使用で
きることが判明した。
また、洗イ龜し、ホモゲナイズされた麹菌湿潤菌体を含
む寒天平板培地に上記の両組酵素は作用し、透明なハロ
ーを形成することから、該粗酵素はいずれも麹菌菌体の
細胞壁を溶解することも確認された。
む寒天平板培地に上記の両組酵素は作用し、透明なハロ
ーを形成することから、該粗酵素はいずれも麹菌菌体の
細胞壁を溶解することも確認された。
次に、麹菌の発芽胞子と細胞壁溶解酵素との処理条件に
ついて説明する。すなわち、細胞壁溶解酵素の使用潤度
は、麹菌発芽胞子の細胞壁を溶解し、完全なプロトプラ
ストを得るのに充分な濃度とすることが好ましく、例え
ばバチラス・サーキュランス起源の粗酵素の場合、１０
−１０−５Ｏ／１ｒＬｉｌ。
ついて説明する。すなわち、細胞壁溶解酵素の使用潤度
は、麹菌発芽胞子の細胞壁を溶解し、完全なプロトプラ
ストを得るのに充分な濃度とすることが好ましく、例え
ばバチラス・サーキュランス起源の粗酵素の場合、１０
−１０−５Ｏ／１ｒＬｉｌ。
好ましくは２５〜３５ ｍｇ／ ｒＭである。またキチ
ナーゼを併用する場合、その使用潤度は１〜ＩＱＩＪ７
／ｒＩＬ１１好ましくは３〜５縛／ｍｌである。酵素処
理の時間は麹菌の細胞壁を溶解し、プロトプラストを得
るのに充分な時間とすることが必要で、通常３０分〜６
時間が好ましい。またｐＨは６゜０〜７．０、特に６．
５が好ましい。
ナーゼを併用する場合、その使用潤度は１〜ＩＱＩＪ７
／ｒＩＬ１１好ましくは３〜５縛／ｍｌである。酵素処
理の時間は麹菌の細胞壁を溶解し、プロトプラストを得
るのに充分な時間とすることが必要で、通常３０分〜６
時間が好ましい。またｐＨは６゜０〜７．０、特に６．
５が好ましい。
次いで、酵素処理が終了したら、菌体を保護する励漆液
、例えば０．７〜１．５Ｍソルビトール或いはＯ６５〜
１．０ Ｍ塩化カリウム溶液等で、菌体を洗５続し、麹
菌の細胞壁が溶解除去されたプロトプラストを得る。
、例えば０．７〜１．５Ｍソルビトール或いはＯ６５〜
１．０ Ｍ塩化カリウム溶液等で、菌体を洗５続し、麹
菌の細胞壁が溶解除去されたプロトプラストを得る。
次に、ここで得られたプロトプラストの融合処理及び融
合プロトプラストの再生は、例えば、Ａｎｎｅ等の方法
ＣＪ、Ｇｅｎ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋ ９２＋４１３
（＋９７６ ） 〕に準じて行うことができる。
合プロトプラストの再生は、例えば、Ａｎｎｅ等の方法
ＣＪ、Ｇｅｎ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋ ９２＋４１３
（＋９７６ ） 〕に準じて行うことができる。
即ち、０．７〜１．５ Ｍ・ソルビトール、５〜１００
ｍＭ ＨＣａ Ｃ１，！及び３０〜８０ＩＩＩＭグリ
シンを含む１５〜３３％ポリエチレングリコール６００
０（ｐＨ７゜５）中に、上記で得られた高プロテアーゼ
生産株と高グルタミナーゼ生産株のそれぞれの洗滌プロ
トプラストを添加混合し、２０〜３ｏ°ｃで１５〜４５
分処理することによりプロトプラスト融合細胞を得るこ
とができる。
ｍＭ ＨＣａ Ｃ１，！及び３０〜８０ＩＩＩＭグリ
シンを含む１５〜３３％ポリエチレングリコール６００
０（ｐＨ７゜５）中に、上記で得られた高プロテアーゼ
生産株と高グルタミナーゼ生産株のそれぞれの洗滌プロ
トプラストを添加混合し、２０〜３ｏ°ｃで１５〜４５
分処理することによりプロトプラスト融合細胞を得るこ
とができる。
次に、こうして得られたプロトプラスト融合細胞の再生
は、プロトプラストを保護しつつ細胞壁を再生すること
が可能な高張再生培地、例えば０．７〜１゜５Ｍのソル
ビトールを含む米麹汁（又は麦芽汁）に寒天２％を含有
させた高張再生培地培Ｉｔｌｉ （ＴＩＨ６，５）及び
、０．７〜ｌ。５Ｍのソルビットを含むツアペック液体
培地に寒天２％を含有させた高張最小再生寒天培地（ｐ
Ｈ６，５）に上記で得られたプロトプラスト融合細胞を
移し、２５″ｃ〜３５６Ｃで２〜１０日間培養する方法
により行なわれる。こうして、プロトプラストの融合細
胞は、その周囲に細胞壁が再生し、培地上で生育して再
生コロニーを形成する。
は、プロトプラストを保護しつつ細胞壁を再生すること
が可能な高張再生培地、例えば０．７〜１゜５Ｍのソル
ビトールを含む米麹汁（又は麦芽汁）に寒天２％を含有
させた高張再生培地培Ｉｔｌｉ （ＴＩＨ６，５）及び
、０．７〜ｌ。５Ｍのソルビットを含むツアペック液体
培地に寒天２％を含有させた高張最小再生寒天培地（ｐ
Ｈ６，５）に上記で得られたプロトプラスト融合細胞を
移し、２５″ｃ〜３５６Ｃで２〜１０日間培養する方法
により行なわれる。こうして、プロトプラストの融合細
胞は、その周囲に細胞壁が再生し、培地上で生育して再
生コロニーを形成する。
次に、こうして得られた再生コロニーから、プロトプラ
スト融合細胞の選別は、予じめその親株である高プロテ
アーゼ生産株と、親株である高グルタミナーゼ生産株の
洗滌プロトプラストについて、それぞれ融合細胞の場合
と同様に再生させ、得られた再生コロニーの形態学的性
質（色相、色彩、明度、光沢、形状、大きさ等）及び生
理学的性質等の特徴を把握しておくことによって、それ
らとは異なる特徴を備えた再生コロニーとして、選別採
取することができる。
スト融合細胞の選別は、予じめその親株である高プロテ
アーゼ生産株と、親株である高グルタミナーゼ生産株の
洗滌プロトプラストについて、それぞれ融合細胞の場合
と同様に再生させ、得られた再生コロニーの形態学的性
質（色相、色彩、明度、光沢、形状、大きさ等）及び生
理学的性質等の特徴を把握しておくことによって、それ
らとは異なる特徴を備えた再生コロニーとして、選別採
取することができる。
尚、上記高プロテアーゼ生産株と高グルタミナーゼ生産
株のそれぞれの親株の分生胞子に、人工変異処理（Ｘ線
、紫外線等の照射、ニトロソグアニジン、エチルメチル
サルフィート等の化学変異処理）を施して、それぞれ親
株の分生胞子に特徴ある色や各種の栄養要求性、例えば
アラニン、メチオニン等のアミノ酸要求性、ビオチン、
ニコチン酸、パラアミノ安息香酸等の要求性を付与した
変異株を得、この変異株を親株として上記と同様に酵素
処理、プロトプラスト融合処理を行ない、次いで再生し
、再生コロニーとすると、親株である変異株は特徴ある
色を曹し、この色を有しないプロトプラスト融合細胞を
明確に区別し、採取することができる。また栄養要求変
異株のプロトプラストは再生の際、特定の栄養源が存在
しないと生育出来ないので、特定の栄養源が存在しなく
ても生育できるプロトプラスト融合細胞を容易に区別し
採取することができる。このように両親株に色及び栄養
要求性等のマーカーを付しておくと、目的とする融合細
胞の分離操作が極めて容易となる。
株のそれぞれの親株の分生胞子に、人工変異処理（Ｘ線
、紫外線等の照射、ニトロソグアニジン、エチルメチル
サルフィート等の化学変異処理）を施して、それぞれ親
株の分生胞子に特徴ある色や各種の栄養要求性、例えば
アラニン、メチオニン等のアミノ酸要求性、ビオチン、
ニコチン酸、パラアミノ安息香酸等の要求性を付与した
変異株を得、この変異株を親株として上記と同様に酵素
処理、プロトプラスト融合処理を行ない、次いで再生し
、再生コロニーとすると、親株である変異株は特徴ある
色を曹し、この色を有しないプロトプラスト融合細胞を
明確に区別し、採取することができる。また栄養要求変
異株のプロトプラストは再生の際、特定の栄養源が存在
しないと生育出来ないので、特定の栄養源が存在しなく
ても生育できるプロトプラスト融合細胞を容易に区別し
採取することができる。このように両親株に色及び栄養
要求性等のマーカーを付しておくと、目的とする融合細
胞の分離操作が極めて容易となる。
上記で得られる篩プロテアーゼ生産株の変異株としては
、例えば分生胞子が白色で、パラアミノ安息香酸要求性
の付与されたアスペルギルス・ソーヤＷ２−９１ （Ｆ
ＥＢＭ Ｐ −７２７７）が挙げられ、また高グルタミ
ナーゼ生産株の変異株としては、例えば分生胞子が黄色
で、ニコチン酸要求性の付与されたアスペルギルス・ソ
ーヤＭＩ２−２−６１（ＦＥＲＭ Ｐ −７２８１）等
が挙げられる。
、例えば分生胞子が白色で、パラアミノ安息香酸要求性
の付与されたアスペルギルス・ソーヤＷ２−９１ （Ｆ
ＥＢＭ Ｐ −７２７７）が挙げられ、また高グルタミ
ナーゼ生産株の変異株としては、例えば分生胞子が黄色
で、ニコチン酸要求性の付与されたアスペルギルス・ソ
ーヤＭＩ２−２−６１（ＦＥＲＭ Ｐ −７２８１）等
が挙げられる。
次に、こうして高張再生培地で再生したプロトプラスト
融合株は、ヘテロカリオンである場合が多いので親株に
戻り易く、不安定である。そこで。
融合株は、ヘテロカリオンである場合が多いので親株に
戻り易く、不安定である。そこで。
これらへテロカリオン株の分生胞子に、小円等の方法（
Ａｇｒｉｃ−Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 、 ２７ 、７５
８ （１９６３） ）に従って、紫外線照射（距離３９
ｃｍ、１〜５分）を施し、検冗することによって、安定
な融合２倍体株を得ることができる。
Ａｇｒｉｃ−Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 、 ２７ 、７５
８ （１９６３） ）に従って、紫外線照射（距離３９
ｃｍ、１〜５分）を施し、検冗することによって、安定
な融合２倍体株を得ることができる。
アスペルギルス−ソーヤＤ−７８はこうして得た高プロ
テアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナーゼ生産能を有
する安定な融合２倍体株であり、工業技術院微生物工業
技術研究所（以下、微工研と略記する）に、微工研菌寄
第７２７９号として寄託されている。
テアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナーゼ生産能を有
する安定な融合２倍体株であり、工業技術院微生物工業
技術研究所（以下、微工研と略記する）に、微工研菌寄
第７２７９号として寄託されている。
次に上記で得られた融合２倍体株を親株として人工変異
処理を行なう。
処理を行なう。
本発明において、プロトプラスト融合により得られた融
合２倍体株を、人工変異処理することは極めて重要であ
って、他の、たきえは吻合融合により得られた融合２倍
体株や、市販されている種麹菌に、紫外線照射等の変異
処理を施しても、該変異処理によってプロテアーゼ生産
能とグルタミナーゼ生産能の双方が同時に、２倍体親株
に比べて高い菌株を育種することはできない。
合２倍体株を、人工変異処理することは極めて重要であ
って、他の、たきえは吻合融合により得られた融合２倍
体株や、市販されている種麹菌に、紫外線照射等の変異
処理を施しても、該変異処理によってプロテアーゼ生産
能とグルタミナーゼ生産能の双方が同時に、２倍体親株
に比べて高い菌株を育種することはできない。
しかし、プロトプラスト融合により得られた融合２倍体
株を人工変異処理するときは、プロテアーゼ生産能とグ
ルタミナーゼ生産能の双方が同時に、該２倍体親株に比
べて大幅に増強された菌株を高い頻度において育種する
ことができる。
株を人工変異処理するときは、プロテアーゼ生産能とグ
ルタミナーゼ生産能の双方が同時に、該２倍体親株に比
べて大幅に増強された菌株を高い頻度において育種する
ことができる。
人工変異処理の手段としては、麹菌の上記融合２倍体株
に対して周知の突然変異処理、たとえば紫外線照射、Ｘ
線照射、放射線照射、エチルメタンスルホン酸（以下、
ＥＭＳと略記する）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（以下、ＭＮＮＧと略記する）などの
突然変異誘起剤との接触処理を行なう。
に対して周知の突然変異処理、たとえば紫外線照射、Ｘ
線照射、放射線照射、エチルメタンスルホン酸（以下、
ＥＭＳと略記する）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（以下、ＭＮＮＧと略記する）などの
突然変異誘起剤との接触処理を行なう。
たとえば、紫外線照射による方法としては、上記融合２
倍体株を米麹汁スラント培地、麦芽汁スラント培地など
の寒天栄養スラント培地に接種し、麹菌の生育適温の２
５〜３５℃で、２〜７日間培養して分生胞子を得、この
胞子懸濁液に２０〜５０ｃｍの距離から紫外線を、生ｇ
、率が５％以下、好ましくは０・０１−１％になるのに
充分な時間、たとえば３〜６０分間照射し、次いで得ら
れた胞子を米麹汁平板培地、麦芽汁寒天平板培地などの
寒天栄養平板培地に塗沫し、２５〜３５″Ｃで２〜７日
間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌することにより
得る。
倍体株を米麹汁スラント培地、麦芽汁スラント培地など
の寒天栄養スラント培地に接種し、麹菌の生育適温の２
５〜３５℃で、２〜７日間培養して分生胞子を得、この
胞子懸濁液に２０〜５０ｃｍの距離から紫外線を、生ｇ
、率が５％以下、好ましくは０・０１−１％になるのに
充分な時間、たとえば３〜６０分間照射し、次いで得ら
れた胞子を米麹汁平板培地、麦芽汁寒天平板培地などの
寒天栄養平板培地に塗沫し、２５〜３５″Ｃで２〜７日
間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌することにより
得る。
また突然変異誘起剤としてＥＭＳを用いる方法としては
、上記融合２倍体株を寒天栄養スラント培地（７％マル
ツスラント培地）に接種し、３０°Ｃで４日間培養して
分生胞子を得、このスラントに胞子分散剤、０．０５％
ソルゲンＴＷ −６０溶液ｇ ｉｄを注入して胞子懸濁
液３ ｎｉｌを得、これにＥＭＳ１５０μｌを加えて、
ＥＭＳの最終濃度を２％とし、３０’Ｃｓ’時間反応さ
せ、生存率４〜１０％の反応液を得、この反応液１ ｍ
ｌに、反応停止剤、６％Ｎ ａ ２ Ｓ２０３溶液９
ｍ４を加え、１５分放置して反応を止め、これを寒天栄
養平板培地に塗沫し、２５〜３５°Ｃで２〜７日間培養
し、生じた大きなコロニーを釣菌することにより得られ
る。
、上記融合２倍体株を寒天栄養スラント培地（７％マル
ツスラント培地）に接種し、３０°Ｃで４日間培養して
分生胞子を得、このスラントに胞子分散剤、０．０５％
ソルゲンＴＷ −６０溶液ｇ ｉｄを注入して胞子懸濁
液３ ｎｉｌを得、これにＥＭＳ１５０μｌを加えて、
ＥＭＳの最終濃度を２％とし、３０’Ｃｓ’時間反応さ
せ、生存率４〜１０％の反応液を得、この反応液１ ｍ
ｌに、反応停止剤、６％Ｎ ａ ２ Ｓ２０３溶液９
ｍ４を加え、１５分放置して反応を止め、これを寒天栄
養平板培地に塗沫し、２５〜３５°Ｃで２〜７日間培養
し、生じた大きなコロニーを釣菌することにより得られ
る。
また突然変異誘起剤としてＭＮＮＧを用いる方法として
は、１ｍ、９／４の濃度のＭＮＮＧ １０ ｍＡ！ ４
．ｍ、融合２倍体株の胞子懸濁液を、胞子数が１０’個
／ｒｒＬｌになるように加え、３０″Ｃで５〜１５分間
反応させ、この反応液を上記と同様に寒天栄養平板培地
に塗床し、２５〜３５℃で２〜７日間培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌することにより得られる。
は、１ｍ、９／４の濃度のＭＮＮＧ １０ ｍＡ！ ４
．ｍ、融合２倍体株の胞子懸濁液を、胞子数が１０’個
／ｒｒＬｌになるように加え、３０″Ｃで５〜１５分間
反応させ、この反応液を上記と同様に寒天栄養平板培地
に塗床し、２５〜３５℃で２〜７日間培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌することにより得られる。
アスペルギルス・ソーヤＤ −７８Ｍは、こうして得ら
れた高プロテアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナーゼ
生産能を有する、多くの麹菌の中から選ばれた１菌株で
、微工研にＦＥＲＭ Ｐ −７５２３として寄託されて
いる。
れた高プロテアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナーゼ
生産能を有する、多くの麹菌の中から選ばれた１菌株で
、微工研にＦＥＲＭ Ｐ −７５２３として寄託されて
いる。
本発明の利点は次のとおりである。
従来一般に採用されていた紫外線照射等の変異処理によ
る変異株の分離は、極めて偶然性が高く、スクリーニン
グに膨大な労力を要するなど効率が極めて悪く、たまた
ま酵素生産性に優れた変異株が得られても、逆に生育が
悪くなったり、直ちに復帰突然変異を起したりして実用
に供し得ないものが多かった。
る変異株の分離は、極めて偶然性が高く、スクリーニン
グに膨大な労力を要するなど効率が極めて悪く、たまた
ま酵素生産性に優れた変異株が得られても、逆に生育が
悪くなったり、直ちに復帰突然変異を起したりして実用
に供し得ないものが多かった。
そして、変異処理による変異株の育種法で最も大きな欠
点は、取得される変異株は、プロテアーゼ生産能あるい
はグルタミナーゼ生産能のうち一方については１島くて
も、他方は逆に（ＩＬい場合が多く、両方とも制い菌株
を取得することは困難であったことである。
点は、取得される変異株は、プロテアーゼ生産能あるい
はグルタミナーゼ生産能のうち一方については１島くて
も、他方は逆に（ＩＬい場合が多く、両方とも制い菌株
を取得することは困難であったことである。
これに対して、本発明は、プロトプラスト融合により得
られた融合２倍体株に人工変異処理するものであるから
、プロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双方が
同時に、該２倍体親株に比べて大幅に増強された菌株を
高頻度に育成することができる。
られた融合２倍体株に人工変異処理するものであるから
、プロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双方が
同時に、該２倍体親株に比べて大幅に増強された菌株を
高頻度に育成することができる。
そして本発明で育成した麹菌を醤油麹原料に接種、培養
して麹をつくり、この麹を用いて仕込を行ない醤油を製
造すると、醤油原料は端る良く分解されて、窒素利用率
が著しく向上するばかりか、グルタミン酸が著しく増加
するので、非常に旨味の強い醤油が得られるという、産
業上画期的な効果を奏する。
して麹をつくり、この麹を用いて仕込を行ない醤油を製
造すると、醤油原料は端る良く分解されて、窒素利用率
が著しく向上するばかりか、グルタミン酸が著しく増加
するので、非常に旨味の強い醤油が得られるという、産
業上画期的な効果を奏する。
以下において、実施例を示して本発明を更に詳細に説明
するが、本発明は実施例に限定されるものではなく、技
術の開示の１つと考えられるべきである。
するが、本発明は実施例に限定されるものではなく、技
術の開示の１つと考えられるべきである。
実施例 １
分生胞子が白色で、パラアミノ安息香酸要求性を有する
アスペルギルス−ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌ １ｕｓ
ｓｏｙａ） Ｗ２ ９１ （ＦＥＲＭ Ｐ ７２７７）
株を高プロテアーゼ生産株として使用し、この菌株の分
生胞子を米麹汁スラント培地に接種し、３０℃の温度に
おいて６６時間培養し、得られた培地から、常法によっ
て、分生胞子を採取した。得られた分生散して５×１０
個／ｍｌの胞子ケン濁液を調製した。
アスペルギルス−ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌ １ｕｓ
ｓｏｙａ） Ｗ２ ９１ （ＦＥＲＭ Ｐ ７２７７）
株を高プロテアーゼ生産株として使用し、この菌株の分
生胞子を米麹汁スラント培地に接種し、３０℃の温度に
おいて６６時間培養し、得られた培地から、常法によっ
て、分生胞子を採取した。得られた分生散して５×１０
個／ｍｌの胞子ケン濁液を調製した。
ここに得られた胞子ケン濁液１ ｍ、５を、１５０ｍ、
／びカザミノ酸０．２％を加え、ｐＨを６．０に調整し
たものを水で１０倍に希釈した培地）ａｏｍ、ｇに接種
し、３０℃の温度において１２時時間上う培養して、発
芽胞子の長さかもとの胞子外径の１０倍の発芽胞子（１
″旨養細胞）を得た。
／びカザミノ酸０．２％を加え、ｐＨを６．０に調整し
たものを水で１０倍に希釈した培地）ａｏｍ、ｇに接種
し、３０℃の温度において１２時時間上う培養して、発
芽胞子の長さかもとの胞子外径の１０倍の発芽胞子（１
″旨養細胞）を得た。
ここに得られた発芽胞子ケン濁液を、４５００ Ｇにお
いて２０分間遠心分離して、発芽胞子を集め、これを水
で充分に洗脇し、水切りした後、細胞壁溶解酵素液〔バ
チラス・サーキュランス起源の粗酵素を３０ ｍ９ ／
ｌ ｍｌ ＆びキチナーゼ（米国ＩＣＮ社製）を５
ＴＬＩ！／ ］ ７ＡＪの割合で溶解して得られたもの
）Ｉｍｉ！と混合し、この混合液を２７°Ｃの彪度で２
時間ゆるやかに振とうして、酵素処理を行なって、アス
ペルギルス・ソーヤＷ２−９１ （ＦＥＲＭｐ −７２
７７）株のプロトプラストを得た。
いて２０分間遠心分離して、発芽胞子を集め、これを水
で充分に洗脇し、水切りした後、細胞壁溶解酵素液〔バ
チラス・サーキュランス起源の粗酵素を３０ ｍ９ ／
ｌ ｍｌ ＆びキチナーゼ（米国ＩＣＮ社製）を５
ＴＬＩ！／ ］ ７ＡＪの割合で溶解して得られたもの
）Ｉｍｉ！と混合し、この混合液を２７°Ｃの彪度で２
時間ゆるやかに振とうして、酵素処理を行なって、アス
ペルギルス・ソーヤＷ２−９１ （ＦＥＲＭｐ −７２
７７）株のプロトプラストを得た。
ここに得られたプロトプラストをＧ−３規格のガラスフ
ィルターで分離し、これを０．８Ｍソルビトール溶液で
３回洗滌し、得られた洗練プロトプラストを０．８Ｍソ
ルビトール溶液１ ｍＪに移し、ケン濁してプロトプラ
ストのケン濁液を得た。
ィルターで分離し、これを０．８Ｍソルビトール溶液で
３回洗滌し、得られた洗練プロトプラストを０．８Ｍソ
ルビトール溶液１ ｍＪに移し、ケン濁してプロトプラ
ストのケン濁液を得た。
これとは別に、分生胞子が黄色で、ニコチン酸Ｐ −７
２８１）株を高グルタミナーゼ生産株として使用し、こ
の菌株の分生胞子を前記のアスペルギルス・ソーヤＷ２
−９１株と同様に処理して、アスペルギルス・ソーヤＭ
１２−２−６１ （ＦＥＲＭ Ｐ −７２８１）株の
プロトプラストがケシ濁された０６８Ｍソルビトール俗
液を溶液。
２８１）株を高グルタミナーゼ生産株として使用し、こ
の菌株の分生胞子を前記のアスペルギルス・ソーヤＷ２
−９１株と同様に処理して、アスペルギルス・ソーヤＭ
１２−２−６１ （ＦＥＲＭ Ｐ −７２８１）株の
プロトプラストがケシ濁された０６８Ｍソルビトール俗
液を溶液。
次にこのプロトプラストのケン濁された０、８ Ｍソル
ビトール ーヤＷ２ − ９１ （ ＦＥＲＭ Ｐ − ７２７７
） （高プロテアーゼ生産株）がケン濁された０．８
Ｍソルビトール溶液を加え、よく混合した扱、混合ケン
隔液を、２０°Ｃの温度において、７００（、で１５分
間遠心分離して、アスペルギルス・ソーヤＷ２ − ９
１株（高プロテアーゼ生産株）とアスペルギルス・ソー
ヤＭ’！２ー２ー６１株（高グルタミナーゼ生産株）の
混合プロトプラストのペレットを得た。
ビトール ーヤＷ２ − ９１ （ ＦＥＲＭ Ｐ − ７２７７
） （高プロテアーゼ生産株）がケン濁された０．８
Ｍソルビトール溶液を加え、よく混合した扱、混合ケン
隔液を、２０°Ｃの温度において、７００（、で１５分
間遠心分離して、アスペルギルス・ソーヤＷ２ − ９
１株（高プロテアーゼ生産株）とアスペルギルス・ソー
ヤＭ’！２ー２ー６１株（高グルタミナーゼ生産株）の
混合プロトプラストのペレットを得た。
ここに得られた混合プロトプラストのペレットを０＋８
Ｍソルビトール、１０ ｍＭ ＣａＣＩ４及び５０ １
１．Ｍグリシンを含む２０％ポリエチレングリコール６
０００ （ｐＨ ： ７．５）溶液１ ｒｎ１４と混合
し、２５６ｃの温度において３０分間、プロトプラスト
融合反応を行なわせて、プロトプラスト融合細胞を得た
。
Ｍソルビトール、１０ ｍＭ ＣａＣＩ４及び５０ １
１．Ｍグリシンを含む２０％ポリエチレングリコール６
０００ （ｐＨ ： ７．５）溶液１ ｒｎ１４と混合
し、２５６ｃの温度において３０分間、プロトプラスト
融合反応を行なわせて、プロトプラスト融合細胞を得た
。
ここに得られたプロトプラスト融合細胞に、０・８Ｍソ
ルビトール溶液を加えて、適当な濃度のケンｉｌｌｉ１
％とし、これを予めシャーレ内に流し固めた高張最小再
生寒天培地（０．、８Ｍソルビトールを含むツアペック
寒天培地（寒天２％）〕に播種し、その上に、寒天が０
．５％である以外は全く同じ高張最小再生寒天培地を流
し込んで固化して重層し、３０℃の温度において５日間
培養して、プロトプラスト融合細胞の再生コロニーを得
た。
ルビトール溶液を加えて、適当な濃度のケンｉｌｌｉ１
％とし、これを予めシャーレ内に流し固めた高張最小再
生寒天培地（０．、８Ｍソルビトールを含むツアペック
寒天培地（寒天２％）〕に播種し、その上に、寒天が０
．５％である以外は全く同じ高張最小再生寒天培地を流
し込んで固化して重層し、３０℃の温度において５日間
培養して、プロトプラスト融合細胞の再生コロニーを得
た。
ここに得られた再生株を米麹汁スラント培地に接種し、
３０６Ｃの温度において４日間培養して、緑色、黄色、
白色の胞子をもつヘテロカリオン株の胞子を得た。ここ
に得られたヘテロカリオン株の胞子に、３９ｃ．ｍの距
離から紫外線を１分間照射し、得られた胞子を再び最小
寒天平板培地に塗布し、３０°Ｃの温度において４日間
培養して、緑色の胞子のみからなり、安定なコロニーを
生成しうる菌株を得た。この菌株の中から高いプロテア
ーゼ生産能と＋’；６いグルタミナーゼ生産能の双方を
有する融合２倍体株のアスペルギルス・ソーヤＤ −７
８（Ｆｌ三ＲＭ Ｐ − ７２７９ ）株を得た。
３０６Ｃの温度において４日間培養して、緑色、黄色、
白色の胞子をもつヘテロカリオン株の胞子を得た。ここ
に得られたヘテロカリオン株の胞子に、３９ｃ．ｍの距
離から紫外線を１分間照射し、得られた胞子を再び最小
寒天平板培地に塗布し、３０°Ｃの温度において４日間
培養して、緑色の胞子のみからなり、安定なコロニーを
生成しうる菌株を得た。この菌株の中から高いプロテア
ーゼ生産能と＋’；６いグルタミナーゼ生産能の双方を
有する融合２倍体株のアスペルギルス・ソーヤＤ −７
８（Ｆｌ三ＲＭ Ｐ − ７２７９ ）株を得た。
このようにして得られた融合２倍体株を米麹汁スラント
培地に接種し、３０６Ｃの温度において４日間培養して
、胞子を着生させ、この胞子ケン濁液に、３９ｃｍの距
離から紫外線を１０分間照射し、得られた１１６射液を
再び米麹汁寒天平板培地に塗布し、３０°Ｃの温度にお
いて４日間培養して分生胞子を着生させ、この中から本
発明の目的とする直いプロテアーゼ生産能及び高いグル
タミナーゼ生産能を存する菌株のアスペルギルス・ソー
ヤＤ−７８Ｍ （ ＦＥＲＮＩ Ｐ − ７５２３ ）
を選抜した。
培地に接種し、３０６Ｃの温度において４日間培養して
、胞子を着生させ、この胞子ケン濁液に、３９ｃｍの距
離から紫外線を１０分間照射し、得られた１１６射液を
再び米麹汁寒天平板培地に塗布し、３０°Ｃの温度にお
いて４日間培養して分生胞子を着生させ、この中から本
発明の目的とする直いプロテアーゼ生産能及び高いグル
タミナーゼ生産能を存する菌株のアスペルギルス・ソー
ヤＤ−７８Ｍ （ ＦＥＲＮＩ Ｐ − ７５２３ ）
を選抜した。
ここに得られた本発明の菌株と、その育種の過程で使用
した親株の酵素生産能を調べた。その結果を第１表に示
す。
した親株の酵素生産能を調べた。その結果を第１表に示
す。
（以下余白）
第１表 麹菌の酵素生産能
注１）第１表における酵素活性は、次のようにしてめら
れた。
れた。
脱脂大豆３０ｇとにり熱割砕／ＪＸ麦３０ｇを原料にし
て、直径１５ｃｍのシャーレ内で、通常の醤油麹と同じ
方法で製麹し、得られた醤油麹にｌＯ＠ｆｆｉの水を加
えて、２時間抽出し、得られた抽出液のプロテアーゼ活
性がアンソン−萩原法を用いて測定された。第１表のプ
ロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１１１モルのチ
ロシンを庄成する活性を１７１１位として表示した。
て、直径１５ｃｍのシャーレ内で、通常の醤油麹と同じ
方法で製麹し、得られた醤油麹にｌＯ＠ｆｆｉの水を加
えて、２時間抽出し、得られた抽出液のプロテアーゼ活
性がアンソン−萩原法を用いて測定された。第１表のプ
ロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１１１モルのチ
ロシンを庄成する活性を１７１１位として表示した。
またグルタミナーゼ活性は、前記の抽出残渣をホモジナ
イズして得られた液とし一グルタミンを３０℃において
１時間振とう反応させ、濾過した後、濾液のグルタミン
酸量を？Ｉｔ！ｌ冗してめた。第１表のグルタミナーゼ
活性は、麹１ｇ当り１分間に１１１モルのグルタミン酸
量を生成する活性を１単位として表示した。
イズして得られた液とし一グルタミンを３０℃において
１時間振とう反応させ、濾過した後、濾液のグルタミン
酸量を？Ｉｔ！ｌ冗してめた。第１表のグルタミナーゼ
活性は、麹１ｇ当り１分間に１１１モルのグルタミン酸
量を生成する活性を１単位として表示した。
第１表の結果から、融合２倍体株を親株として、人工変
異処理を行なうと、プロテアーゼ生産能とグルタミナー
ゼ生産能の双方が同時に、該融合２倍体株（親株）に比
べて大幅に向上した菌株を前回（することができたこと
がわかる。
異処理を行なうと、プロテアーゼ生産能とグルタミナー
ゼ生産能の双方が同時に、該融合２倍体株（親株）に比
べて大幅に向上した菌株を前回（することができたこと
がわかる。
出願人 キッコーマン株式会社
イ七理人 弁理士 津 １） 昭
手続補正書（自発）
昭和５９年３月３０日
特許庁長官 若 杉 和 夫 殿
１ 事件の表示 昭和５９年特：／Ｆ、願第４４０６１
号２ 発明の名称 商いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能
を有するｓｍ及びその育種法３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 千葉県野田市野田３３９番地 （４４７）キッコーマン株式会社 代表者 茂 木 克 己 ４４入’；ｔ！ｌｊ人 ５ 補正の対象 明 細 書 ６ 補正の内容 別紙のとおり （タイプ印書した明細書）
号２ 発明の名称 商いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能
を有するｓｍ及びその育種法３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 千葉県野田市野田３３９番地 （４４７）キッコーマン株式会社 代表者 茂 木 克 己 ４４入’；ｔ！ｌｊ人 ５ 補正の対象 明 細 書 ６ 補正の内容 別紙のとおり （タイプ印書した明細書）
Claims (8)
- （１）アスペルギルス属に属する菌株であって、高いプ
ロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有す
ることを特徴とする麹菌。 - （２）アスペルギルス属に属する菌株が、アスペルギル
ス・ソーヤに属する菌株であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の麹菌。 - （３）アスペルギルス属に属する菌株が、アスペルギル
ス・万すゼーに属する菌株であることを特徴とする特ｒ
［請求の範囲第１項に記載の麹菌。 - （４）アスペルギルス・ソーヤに属する菌株が、アスペ
ルギルス・ソーヤＩ）−７８Ｍあることを特徴とする特
許請求の範囲第２項に記載の麹菌。 - （５）アスペルギルス属に属する菌株であって、高いプ
ロテアーゼ生産能を何する菌株を培養し、得られた培養
細胞からプロトプラストを得ること、アスペルギルス属
に属する菌株であって、高いグルタミナーゼ生産能を有
する菌株を培養し、得られた培養細胞からプロトプラス
トを得ること、これらをプロトプラスト融合させて融合
細胞を得ること、融合細胞を高張再生培地において培養
し、得られた培養物から高いプロテアーゼ生産能及び高
いグルタミナーゼ生産能を有する融合２倍体株を選抜す
ること、およびここに選抜された高いプロテアーゼ生産
能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する融合２倍体株
を人工変異処理をすることを特徴とするアスペルギルス
属に属する菌株であって、高いプロテアーゼ生産能及び
高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法。 - （６）アスペルギルス属に属する菌株が、アスペルギル
ス・ソーヤに属する菌株であることを特徴とする特許請
求の範囲第５項に記載の麹菌の育種法。 - （７）アスペルギルス属に属する菌株が、アスペルギル
ス・オリゼーに属する菌株であることを特徴とする特許
請求の範囲第５項に記載の麹菌の育種法。 - （８）麹菌がアスペルギルス・ンーヤＩ）−７羽である
ことを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の麹菌の
育種法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044061A JPS60188057A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59044061A JPS60188057A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188057A true JPS60188057A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH0368672B2 JPH0368672B2 (ja) | 1991-10-29 |
Family
ID=12681105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59044061A Granted JPS60188057A (ja) | 1984-03-09 | 1984-03-09 | 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188057A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0368672B2 (ja) * | 1984-03-09 | 1991-10-29 | Kikkoman Corp | |
| EP2420561A4 (en) * | 2009-04-17 | 2014-01-22 | Kikkoman Corp | YELLOW CELLS WITH GENOMIC DUPLICATION OF LARGE SCALE |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57174087A (en) * | 1981-04-21 | 1982-10-26 | Higeta Shoyu Kk | Breeding method of koji mold |
| JPS6075280A (ja) * | 1983-09-30 | 1985-04-27 | Kikkoman Corp | プロトプラスト融合による麹菌の製造法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60188057A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Kikkoman Corp | 高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法 |
-
1984
- 1984-03-09 JP JP59044061A patent/JPS60188057A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57174087A (en) * | 1981-04-21 | 1982-10-26 | Higeta Shoyu Kk | Breeding method of koji mold |
| JPS6075280A (ja) * | 1983-09-30 | 1985-04-27 | Kikkoman Corp | プロトプラスト融合による麹菌の製造法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0368672B2 (ja) * | 1984-03-09 | 1991-10-29 | Kikkoman Corp | |
| EP2420561A4 (en) * | 2009-04-17 | 2014-01-22 | Kikkoman Corp | YELLOW CELLS WITH GENOMIC DUPLICATION OF LARGE SCALE |
| US8900647B2 (en) | 2009-04-17 | 2014-12-02 | Kikkoman Corporation | Koji mold having large-scale genomic duplication |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0368672B2 (ja) | 1991-10-29 |
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